KR20100118756A - 면역전자현미경용 생물시료 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역전자현미경용 생물시료 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 a) 세포 또는 조직을 2 ~ 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 침투시켜 고정하는 제1단계; (b) 상기 세포 또는 조직 내로 2 ~ 3M 수크로오스(sucrose)를 침투시켜 블럭을 만들고, -70 ~ -100℃의 온도 상태에서 세절하여 냉동 절편을 제조하는 제2단계; (c) 상기 냉동절편을 슬라이드 글라스 위에 올려 붙인 후 항체를 처리하는 제3단계; (d) 상기 항체처리가 끝난 후 레진으로 포매(embedding)시키고, 열처리하여 중합시키는 제4단계; 및 (e) 중합처리된 상기 세포 또는 조직을 슬라이드 글라스와 분리한 후, 70 ~ 80nm로 세절하는 제5단계를 포함하는 면역전자현미경용 생물시료 제조방법을 제공하는 것이다. 본 발명에 따른 면역전자현미경용 생물시료 제조방법은 항원성을 유지하면서도 세포의 초미세구조를 효과적으로 관찰할 수 있는 매우 유용한 효과가 있다.

면역전자현미경, cryo-EM, 냉동절편, 항원성, 초미세구조

Description

면역전자현미경용 생물시료 제조방법{Method of preparing biological samples for immunoelectron microscopy}

본 발명은 전자현미경용 생물시료 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항원성을 유지하면서도 세포의 초미세구조를 효과적으로 관찰할 수 있어 전자현미경을 이용한 면역세포화학 연구를 효과적으로 할 수 있는 면역전자현미경용 생물시료 제조방법에 관한 것이다.

현대 생물학에 있어서 면역화학법(immunochemistry)은 세포의 기능적, 역할적인 면을 밝혀내는 형태학적으로 중요한 테크닉으로 인정받고 있으며, 이는 광학현미경뿐만 아니라 전자현미경에서도 이용된다.

광학현미경에서 면역화학법은 특정 발현하는 단백질과 기타물질의 검출에 효율적이지만 뚜렷하게 세포 내 어느 구조에 이것이 나타나는지는 알 수 없다. 그러나 전자현미경에서는 고배율로 세포의 초미세구조의 관찰과 함께 이것을 확실히 구별해서 보여줄 수 있다. 그러나 이러한 전자현미경의 장점 이면에는 기술적으로 상 당한 어려움이 따르며, 고정, 탈수 및 열처리 등의 과정에서 수반되는 항원성 감소, 검출하고자 하는 표지된 항체의 침투가 용이하지 않다는 등의 이유로 제한적으로 수행되고 있다. 그렇기 때문에 면역화학법을 하는 전자현미경 이미지 데이터들은 그 구조가 일반적인 전자현미경 이미지보다 상당히 떨어지게 된다.

면역화학법 진행과정은 전포매(pre-embedding)법과 후포매(post-embedding)법으로 나뉜다.

전포매(pre-embedding)법은 조직 자체에 항체를 침투시킨 후 조직을 세절(sectioning : 광학에서는 5 ~ 7㎛, 전자현미경에서는 80nm 안팎)하여 관찰하는 방법으로, 조직의 넓은 부위를 관찰할 수 있으며 항체 처리가 끝난 후 일반 레진으로 포매(embedding)하므로 구조가 좋다. 그러나 항체가 세포막을 뚫고 들어가야 하는 부담이 있으므로 검출된 확률이 크지 않으며 1㎚정도 크기의 아주 작은 금 입자를 써야 하므로 증강(enhance)과정을 거쳐야만 한다. 또한 두 개 이상의 항체를 붙이기가 매우 어렵기 때문에 한 개 이상 검출하기 어렵다.

후포매(post-embedding)법은 일단 조직을 세절한 후(두께 80nm) 그리드(grid)위에 올려 항체를 침투시켜 바로 관찰하는 방법으로, 항체가 세포막을 뚫어야 하는 부담 없이 해당 구조 위에 항체를 바로 검출할 수 있어 반응성이 아주 좋다. 그러나 80nm로 조직을 세절하기 위해서는 미리 포매(embedding) 과정을 거쳐야 하는데 이 과정에서 비수용성인 일반 레진이 아니라 수용성 레진을 이용해야 한다. 이러한 수용성 레진들은 비수용성 레진만큼 명확한 구조를 보여주지는 않는다. 그러나 이 후포매(post-embedding)법은 전포매(pre-embedding)법보다 항체 반응성 이 높고 여러 가지 검출할 수 있는 장점이 있으므로 이용 가치가 더 크다.

나아가 화학적으로 고정된 조직의 동결 절편은 면역전자현미경 분석에 있어 매우 적합한 방법으로 알려져 있다.

이러한 냉동 면역전자현미경(Cryo-immuno EM)은 액화질소로 조직을 급속히 얼린 다음 이것을 세절하여 동결 절편을 만든 후 그리드(grid) 위에 올려 항체를 처리하여 관찰하는 방법이다. 이러한 동결 절편의 이용은 이론적으로 면역세포화학적 분석에 있어서 항원성을 유지할 수 있는 가장 이상적인 실험 방법이라 할 수 있다. 화학고정 처리를 거치지 않거나 약하게 처리하므로 고정제에 의하여 항원성이 감소하지 않고 반응성이 좋으며 고정을 통하여 변형된 구조가 아닌 생체 조직 내의 구조와 가깝게 볼 수 있다는 장점이 있으며 후포매(post-embedding)법에 해당된다. 특히 1970년대에 소개된 Tokuyasu법이 많이 이용된다.

Tokuyasu는 수크로오스에 탐침된 전고정 샘플을 바로 얼린 조직을 가지고 하는 Christensen(1971)에 의해 고안된 냉동 절편 원리를 적용하였다. 그렇지만 Tokuyasu법은 조직을 세절하는데 있어서 많은 기술적 어려움이 있고 많은 경험을 필요로 한다. 또한, 온도에 의한 조직 자체의 구조적 손상이 불가피하며 이와 함께 해상력의 저하를 수반하여 연구에 치명적인 오류를 야기한다. 즉, 동결 박절시 냉동 챔버로부터 상온으로 이동시에 절편이 녹거나 급격한 온도 상승에 의하여 구조적 보전을 보장할 수 없게 된다. 또한 냉동 절편은 해동과 전달 매개체의 표면 장력에서 비롯되는 과잉 이완에 의하여 쉽게 손상된다는 문제점이 있었다.

또한, 종래에는 80㎚ 정도의 얇은 조직 절편을 만들기 위해서 -120℃의 온도 까지 낮춰야 했으며, 이로 인해 조직의 접힘, 조직파손 등의 문제점이 있었으며, -120℃의 온도는 너무 낮아 빨리 얼어버려 조직을 채취할 때 순간적으로 이루어져야 하는 어려움이 있었다.

그리고, 측정된 이미지는 구조 자체가 전자의 밀도를 가지지 않고 배경이 밀도를 가지고 있는 네가티브 이미지를 보이기 때문에 구조의 명확성이 상당히 떨어지며 일부 구조 등에서 판단하기 애매모호한 면을 보인다는 문제점이 있었다.

따라서 전자현미경을 이용한 면역세포화학 연구를 위하여 이를 해결할 수 있는 생물시료 준비법의 개발이 시급한 과제로 부상하고 있으며, 항원성을 유지하면서 초미세구조를 관찰할 수 있는 방법을 개발하는 것이 무엇보다 중요하다.

이에 본 발명자들은 이러한 종래기술의 문제점을 해결하고자 전자현미경을 이용한 면역세포화학 연구를 효과적으로 할 수 있는 생물시료 제조과정에 대한 연구를 거듭하던 중, 본 발명에 따른 방법으로 생물시료를 제조하면 항원성을 유지하면서도 세포의 초미세구조를 효과적으로 관찰할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 항원성을 유지하면서도 세포의 초미세구조를 효과적으로 관찰할 수 있어 전자현미경을 이용한 면역세포화학 연구를 효과적으로 할 수 있는 면역전자현미경용 생물시료 제조방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 a) 세포 또는 조직을 2 ~ 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 침투시켜 고정하는 제1단계; (b) 상기 세포 또는 조직 내로 2 ~ 3M 수크로오스(sucrose)를 침투시켜 블럭을 만들고, -70 ~ -100℃의 온도 상태에서 세절하여 냉동 절편을 제조하는 제2단계; (c) 상기 냉동절편을 슬라이드 글라스 위에 올려 붙인 후 항체를 처리하는 제3단계; (d) 상기 항체처리가 끝난 후 레진으로 포매(embedding)시키고, 열처리하여 중합시키는 제4단계; 및 (e) 중합처리된 상기 세포 또는 조직을 슬라이드 글라스와 분리한 후, 70 ~ 80nm로 세절하는 제5단계를 포함하는 면역전자현미경용 생물시료 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 면역전자현미경용 생물시료 제조방법은 항원성을 유지하면서도 항체의 침투성을 최대로 높일 수 있고, 수용성 레진을 이용하지 않아 막 구조에 대한 유지가 뛰어나며, 생체 내 조직 그대로의 모습을 관찰할 수 있어 세포의 초미세 구조도 잘 관찰할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명에 따른 면역전자현미경용 생물시료 제조방법은 절편을 500㎚ ~ 1㎛의 두께로 세절하므로 조직을 세절하여 절편을 만들 때의 기술적 부담을 상당히 낮출 수 있으며, 항체가 세포막을 뚫고 들어가야 하는 부담이 없이 세포 내부에 바로 항체가 들어가기 때문에 표지가 잘 이루어는 효과가 있다.

또한, 본 발명에 따른 면역전자현미경용 생물시료 제조방법은 조직을 자르는 칼의 손상을 줄일 수 있으며, 잘린 면이 정교하게 잘려 조직 손상을 줄일 수 있는 효과가 있다.

본 발명은 항원성을 유지하면서도 세포의 초미세구조를 보다 더 자세히 관찰할 수 있어 전자현미경을 이용한 면역세포화학 연구를 효과적으로 할 수 있는 신규한 생물시료 제조방법을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명은 a) 세포 또는 조직을 2 ~ 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 침투시켜 고정하는 제1단계; (b) 상기 세포 또는 조직 내로 2 ~ 3M 수크로오스(sucrose)를 침투시켜 블럭을 만들고, -70 ~ -100℃의 온도 상태에서 세절하여 냉동 절편을 제조하는 제2단계; (c) 상기 냉동절편을 슬라이드 글라스 위에 올려 붙인 후 항체를 처리하는 제3단계; (d) 상기 항체처리가 끝난 후 레진으로 포매(embedding)시키고, 열처리하여 중합시키는 제4단계; 및 (e) 중합처 리된 상기 세포 또는 조직을 슬라이드 글라스와 분리한 후, 70 ~ 80nm로 세절하는 제5단계를 포함하는 면역전자현미경용 생물시료 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 면역전자현미경용 생물시료 제조방법의 각 단계별로 보다 상세히 살펴보면 다음과 같다.

제 1 단계: 세포 또는 조직을 고정하는 단계

본 발명에 따른 면역전자현미경용 생물시료를 제조하기 위해서는 우선 조직을 채취(sampling)해야 한다. 이때, 조직은 가급적 작게(특히 TEM 에서는 1×1×1㎜ 정도) 채취하는 것이 좋고, 조직을 채취하고 나서 바로 신속하게 고정액에 담그는 것이 바람직하다. 본 발명은 조직이나 배양 세포 모두에 적용할 수 있으며, 섬유상 세포 또는 부양성 세포 모두 사용이 가능하다.

우선, 채취한 세포 또는 조직을 인산염 완충액(PB, phosphate buffer)으로 만들어진 2 ~ 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 1 ~ 2시간 동안 약하게 고정시킨다.

제2단계: 냉동절편을 제조하는 단계

고정이 끝난 세포 또는 조직을 1×PBS를 이용하여 세척한 후 스크래퍼(scraper)를 이용하여 긁어낸다. 이때, 세포의 최소 필요량은 단층 셀(monolayer cell) 기준으로 6well dish의 3개 well에 융합된 상태가 적당하다. 모아진 세포는 1.5㎖ effendorf tube에서 3~5000rpm으로 3~5분간 원심분리한 후, 침적된 세포를 남기고 상등액을 버린 후 10% gelatin/PBS 용액을 채운다. 펠렛이 부서지지 않도록 바닥에서 떼어낸 후 37℃에 약 10분간 방치한다. 그리고 다시 5~8000 rpm에서 5~10분간 원심분리 후 즉시 얼음 속에 넣어 30분 정도 방치한다.

이후의 작업은 저온실에서 이루어진다. 해부현미경하에서 튜브의 바닥에 응고된 펠렛 부분만을 잘라낸다. 잘라낸 팁 부분을 두께 약 1㎜이하로 잘라내고 이를 2 내지 3M 수크로오스(sucrose) 용액(냉동 보호제)에 담가 4시간에서 하룻밤(overnight)까지 탐침시켜 수크로오스를 조직 내로 침투시킨다. 이상으로 준비된 펠렛은 냉동핀에 얹고, 초과한 수크로오스 용액을 필터 페이퍼로 제거한다. 이때 수크로오스 용액은 적정량이 남아야 하며 완전히 제거할 경우 섹션 시 블록이 떨어져 나가게 되는 문제점이 생기므로 주의해야 한다. 또한, 냉동핀은 사용 전에 반드시 아세톤에 담가 초음파 세척을 한 후 사용해야 한다.

냉동핀에 고정된 펠렛은 즉시 액체 질소(quid nitrogen)에 담가 급속히 냉동시킨다. 이렇게 준비된 샘플은 즉시 절단이 가능하며 액체 질소 안에서 반영구적으로 보관이 가능하다.

이와 같이 준비된 샘플을 액체 질소(quid nitrogen)로 급속히 냉동시킨 낮은 온도 상태에서 조직을 세절하여 냉동 절편을 제조한다. 이때, 온도는 -70 ~ -100℃ 범위로 금속 냉동시킨다. 또한, 세포 또는 조직을 세절할 때는 500㎚ ~ 1㎛의 두께로 잘라내는 것이 바람직하다.

종래에는 80㎚ 정도의 얇은 조직 절편을 만들었으나 본 발명에서는 비교적 두꺼운 500㎚ ~ 1㎛ 두께로 세절함으로써 절편을 만들 때의 기술적인 어려움을 많 이 줄일 수 있다. 또한, 얇은 두께로 세절할수록 온도를 더 많이 내려야 하는데 본 발명에서는 -80℃만 되어도 세절이 가능하고, 조직 채취시 빨리 조직을 채취해야 하는 부담을 덜 수 있으며, 절편이 두껍기 때문에 조직의 접힘 또는 파손도 줄일 수 있다. 또한, 일반 세포의 두께가 10㎛정도 안팍임을 감안할 때, 500㎚ ~ 1㎛ 두께의 절편에서 항체가 세포막을 뚫고 들어가야 하는 부담을 상당히 제거할 수 있고, 세포 내부에 바로 항체가 들어가므로 표지도 잘 이루어진다.

나아가, 본 발명은 유리칼 또는 다이아몬드 칼을 이용하여 세절하기 때문에 잘린 면이 진동박절기(vibratome)이나 조직용 칼을 이용한 것보다 훨씬 정교하게 잘리므로 잘린 면의 조직 손상이 크지 않다는 장점이 있다.

본 발명에 따라 냉동 절편을 제조하는 과정을 상세히 살펴보면 다음과 같다.

절편을 제작하기에 앞서서 일단 준비된 블럭의 불필요한 부분을 제거한다. 이때, 블럭의 윗면(block face)을 사다리꼴 형태로 삭정(trimming)함으로써 블럭이 균등한 힘을 받아 세절(section)을 용이하게 하고 연속된 절편(리본, ribbon)을 얻을 수 있도록 한다. 삭정(trimming)한 부위가 너무 넓을 경우에는 절편을 제작하기에 어려우므로 가급적 작게 하는 것이 바람직하다. 그 후, 사다리꼴로 삭정된 블록을 500㎚ ~ 1㎛ 두께로 세절하여 절편을 만든다. 이때, 만들어진 절편을 모으고 전자현미경 하에서의 관찰을 용이하게 하기 위하여 가급적 리본 모양으로 절편을 만든다.

절단된 리본은 나이프면에 그대로 펼쳐지도록 eyelash를 이용하여 조심스럽게 조정한다. 리본이 완성되면 루프를 이용하여 절편을 냉동 챔버(cryo-chmber)로 부터 이동시킨다. 이때, 2.3M 수크로오스를 이용하여 냉동 챔버로부터 상온으로 운반하여 슬라이드 글라스 위에 올려붙인다.

본 발명에서와 같이 가벼운 화학고정(1차 고정)만을 한 후에 액체 질소를 이용한 냉동고정법을 이용하여 고정하게 되면, 항원의 세포 내 위치를 검출하기가 용이하여 면역학적 연구를 효과적으로 수행할 수 있으며, 이 방법에 사용된 시료는 가벼운 고정 상태이지만 유기용매에 노출되지 않으므로 예민한 항원 위치를 보존할 수 있게 된다.

제 3 단계: 항체를 처리하는 단계

제2단계에서 만들어진 냉동 절편을 슬라이드 글라스 위에 올려붙인 후 항체를 처리한다. 이때, 1차 항체를 먼저 처리한 후 발색원(면역금, 형광물질, 효소, 금속 등)이 표지된 2차 항체를 처리한다. 이와 같이, 두 종류 이상의 항체를 사용하여 최종 항체(본 발명에서는 2차 항체)에만 발색원을 표지하는 방법은 항원항체반응을 최대한 증폭시켜주므로 극미량의 항원도 찾아낼 수 있는 높은 감도를 갖는다는 장점이 있다.

여기서, 냉동 절편을 슬라이드 글라스로 이동시킬 때는 수크로오스가 담긴 루프를 이용하는 것이 바람직하다. 냉동 절편을 냉각시키는 냉동 챔버(cryo-chamber)의 온도가 마이너스(-)이므로 물을 사용해서 절편을 이동시키는 경우 주위의 온도로 인해 얼기 때문에 수크로오스가 담긴 루프를 이용하는 것이다. 수크로오스를 사용한다고 해도 장시간 챔버 안에 있으면 얼어버리기 때문에 재빠르게 이동 시키는 것이 중요하다.

본 발명의 일 실시 예에서는 면역금 표지 방법을 사용하였다. 면역금표지는 IgG 혹은 Protein A 등에 결합된 형태의 금입자를 사용했으며, 이는 시료 및 대상 단백질 등의 특성에 맞도록 확인하여 사용하는 것이 좋다.

나아가, 본 발명에 따른 면역전자현미경용 생물시료 제조방법은 상기와 같은 항체 처리가 끝난 후, 글루탈알데하이드(glutaraldehyde) 또는 오스뮴 테트록사이드(OsO4, Osmium tetroxide)로 1 ~ 2시간 정도 후고정하는 단계와 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 염색하는 단계를 더 포함한다. 오스뮴 테트록사이드(OsO4, Osmium tetroxide)는 1gm 으로 시판되는데 용해가 잘 되지 않으므로 최소한 사용하기 1일 전 증류수에 2% 용액으로 만들어 갈색병에 담아서 냉장고에 보관한다.

제 4 단계: 포매 ( embedding ) 및 중합( polymerization )하는 단계

제 3 단계에서 항체처리가 완료된 세포 또는 조직에 포매제를 침투시켜 포매(embedding)를 진행한다. 포매는 20 ~ 25℃의 온도, 습도 50% 이하에서 진행하는 것이 바람직하다. 본 발명의 포매제로는 비수용성 레진(resin)인 에폭시(epoxy) 수지를 사용 것이 바람직하다. 본 발명의 일실시예에서는, EPON 812, TAAB 812, Polybed 812, Quetol 812 및 EPOK 812 중 선택된 어느 하나의 epon수지에 경화제로서 DDSA(Dodecenyl scuccinio anhydride) 또는 NMA(Nadic methyl anhydride)를 혼합하고, 포매제와 경화제의 반응을 촉진시키는 가속제로서 DMP-30(Tridimethyl amino-methyl phenol)를 혼합한 용액을 포매제로 사용하였다.

상기와 같은 포매 과정이 끝난 조직은 중합(polymerization)시켜 완전히 굳힌다. 이때, 50 ~ 70℃의 온도에서 20 ~ 48시간 동안 중합을 진행시켜 완전히 굳힌다. 또한, 열의 영향을 배제하고자 UV를 이용하여 중합시킬 수도 있다.

제 5 단계: 다시 세절하는 단계

마지막으로, 중합처리까지 끝난 세포 또는 조직을 슬라이드 글라스와 분리한 다음, 이것을 다시 70 ~ 80㎚로 세절하여 전자현미경으로 조직을 관찰한다. 슬라이드 글라스는 포름바(Formvar)로 코팅 처리되어 있으며, 직경 1㎜의 고무링을 고정해 그 안에 조직을 붙이고 여러 처리를 할 수 있도록 한다(도 6 참조). 여기서, 유리 글라스를 이용하는 이유는 유리면이 가장 편평하기 때문이다.

본 발명에 따른 전자현미경 관찰용 생물시료의 제조방법은 항원성을 유지하면서도 항체의 침투성을 최대로 높일 수 있고, 수용성 레진을 이용하지 않아 막구조에 대한 유지가 뛰어나며, 생체 내 조직 그대로의 모습을 관찰할 수 있어 세포의 초미세 구조도 잘 관찰할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 전자현미경 관찰용 생물시료의 제조방법은 500㎚ ~ 1㎛의 두께로 세절하므로 조직을 세절하여 절편을 만들 때의 기술적 부담을 상당히 낮출 수 있으며, 조직의 잘려진 면이 정교하게 잘려 조직 손상을 줄일 수 있고, 항체가 세포막을 뚫고 들어가야 하는 부담이 없이 세포 내부에 바로 항체가 들어가기 때문에 표지가 잘 이루어진다.

이하, 본 발명을 실시예 및 도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실험예 1>

본 발명에 따른 전자현미경 관찰용 생물시료의 제조

본 발명에서는 신경 시넵스들이 모여있는 부위인 망막의 OPL 세포를 가지고 전자현미경 관찰용 생물시료를 제조하였다.

우선, 망막의 OPL 세포를 인산염 완충액(PB, phosphate buffer)으로 만들어진 4% 파라포름알데하이드로 1시간동안 침투시켜 고정하였다. 그리고, 2.3M 수크로오스를 침투시켜 블록을 만든 후, -80℃의 온도에서 세절하여 두께 500㎚ ~ 1㎛의 냉동절편을 만들었다. 여기서, 절편을 자를 때는 다이아몬드칼을 사용하였다.

그 후, 상기 냉동절편을 슬라이드 글라스 위에 올려 붙이고, 항체를 처리하였다. 이때, GFAP 1차 항체를 먼저 처리한 후 10nm 면역금(immuno-gold)이 표지된 2차 항체를 처리하였다.

항체처리가 끝난 후, 글루탈알데하이드(glutaraldehyde) 또는 오스뮴 테트록사이드(OsO4, Osmium tetroxide) 후고정을 하고 난 뒤 에폰 수지를 이용하여 25℃의 온도, 습도 50%의 조건에서 포매시켰다. 본 실시예 에서 사용한 에폰 수지는 하기와 같은 조성의 A, B 액을 따로 만든 후 혼합하고, A : B 액의 혼합액에 가속제로 DMP-30를 1.5~2% 비율로 섞어서 사용하였다.

A 액 : Epon 812 100gm + DDSA 112gm

B 액 : Epon 812 100gm + NMA 75gm

포매가 끝난 조직에 60℃의 열을 가하여 중합시키고, 중합된 에폰 블록을 슬라이드 글라스와 분리한 후, 이 블록에 담겨진 조직을 다시 70 ~ 80nm의 두께로 세절하여 전자현미경으로 관찰하였다. 중합과정까지 끝나고 난 뒤의 슬라이드에서 떼어낸 에폰 블럭을 도 6에 나타내었다.

< 실시예 2>

본 발명에 따른 전자현미경 관찰용 생물시료의 제조

본 실시예에서는 뇌(해마) 조직을 이용하여 전자현미경 관찰용 생물시료를 제조하였다. 뇌(해마) 조직을 이용하였다는 점만 다를 뿐, 그 이외에는 실시예 1의 방법과 동일한 방법으로 전자현미경 관찰용 생물시료를 제조하였다.

< 실험예 1>

본 발명에 따른 망막의 OPL 세포의 관찰

본 발명의 전자현미경 관찰용 생물시료의 제조방법에 따라 신경 시넵스들이 모여있는 부위인 망막의 OPL 세포로 표본을 제조한 후, 냉동 면역전자현미경법(Cryo immunocytochemistry)을 실행하여 관찰하였다.

도 1을 통해, 냉동(Cryo) 다이아몬드 칼이 조직이 있는 면과 없는 면 사이를 지나는 부위를 나타내며, 불과 몇 ㎚의 두께로 조직이 사라지며 정교하게 잘린 면 을 확인할 수 있었다. 또한, 다이아몬드 칼날과 유리 칼날의 날카로움은 잘린 면의 세포 미세구조도 잘 유지시켜주는 것을 확인할 수 있었다.

도 2를 통해, 본 발명에 따른 냉동 면역전자현미경법을 실행한 신경 시넵스들이 모여있는 부위(망막의 OPL)를 나타낸 사진으로, 세포의 막구조와 미토콘드리아, 신경 소낭(vesicle)들이 잘 관찰되는 것을 확인할 수 있었다.

< 실험예 2>

본 발명에 따른 뇌(해마) 조직의 관찰

본 발명의 전자현미경 관찰용 생물시료의 제조방법에 따라 신경조직의 신경교세포(glia cell)에서 중간섬유(intermediate filament)에 표지(labeling)되는 GFAP 1차 항체 처리 후 10nm 금이 태그된 2차 항체를 처리한 뇌(해마) 조직으로 표본을 제조한 후, 냉동 면역전자현미경법(Cryo immunocytochemistry)을 실행하여 관찰하였다.

도 3을 통해 신경 교세포의 중간섬유에 붙는 GFAP 1차 항체 처리 후 10㎚ 금이 태그된 2차 항체를 처리한 뇌(해마) 조직을 관찰할 수 있었다.

도 4를 통해 중간섬유 내에 많은 금 입자들이 관찰됨으로써 항원성이 많이 유지되었음을 확인할 수 있었으며, 명확한 미토콘드리아 구조도 관찰할 수 있었다. 또한, 많은 시냅스 소낭(vesicle)들이 관찰되고 있으며 신호의 input과 output을 명확히 확인할 수 있었다. 여기서, 소낭이 많은 쪽이 output이고, 소낭이 없고 접한 면이 짙은 쪽이 input이다.

도 5를 통해 금 입자의 양으로 보아 항원성이 잘 유지되어 있음을 관찰할 수 있었으며, 고배율상에서 중간섬유 구조가 잘 관찰되는 것을 확인할 수 있었다.

따라서 본 발명자들은 상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 면역전자현미경용 생물시료 제조방법을 이용해 표본을 제조하고, 이를 면역전자현미경으로 관찰할 경우 세포의 구조적인 손실과 세포의 구조를 관찰할 때 흐리거나 디테일한 관찰이 쉽지 않았던 종래의 면역화학법에 비해 항원성을 잘 유지할 수 있으면서도 세포의 초미세구조, 특히 신경의 시냅스 구조를 디테일하게 관찰할 수 있음을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 다이아몬드 칼이 지나는 부위를 나타내는 현미경 사진이다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 냉동 면역전자현미경법을 실행한 신경 시넵스들이 모여있는 부위(망막의 OPL)를 나타내는 현미경 사진이다.

도 3은 본 발명의 다른 실시예에 따른 신경조직의 신경교세포(glia cell)에서 중간 섬유(intermediate filament)에 표지되는 GFAP 1차 항체 처리 후 10nm 금이 태그된 2차 항체를 처리한 뇌(해마) 조직을 나타내는 현미경 사진이다.

도 4는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 뇌(해마) 조직에서의 신경의 시냅스 구조와 신경교세포(glia cell)에서 중간 섬유(intermediate filament)에 표지되는 GFAP 1차 항체 처리 후 10nm 금이 태그된 2차 항체를 처리한 현미경 사진이다.

도 5는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 고배율상에서 면역금으로 태그된 중간 섬유(intermediate filament)의 구조를 나타내는 현미경 사진이다.

도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 에폰 중합까지 끝나고 난 뒤의 슬라이드에서 떼어낸 에폰 블럭을 나타낸 사진이다.

Claims (7)

1. (a) 세포 또는 조직을 2 ~ 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 침투시켜 고정하는 제1단계;

   (b) 상기 세포 또는 조직 내로 2 ~ 3M 수크로오스(sucrose)를 침투시켜 블럭을 만들고, -70 ~ -100℃의 온도 상태에서 세절하여 냉동 절편을 제조하는 제2단계;

   (c) 상기 냉동절편을 슬라이드 글라스 위에 올려 붙인 후 항체를 처리하는 제3단계;

   (d) 상기 항체처리가 끝난 후 레진으로 포매(embedding)시키고, 열처리하여 중합시키는 제4단계; 및

   (e) 중합처리된 상기 세포 또는 조직을 슬라이드 글라스와 분리한 후, 70 ~ 80nm로 세절하는 제5단계

   를 포함하는 면역전자현미경용 생물시료 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 제2단계에서 세절하는 두께는 500㎚ ~ 1㎛ 인 것을 특징으로 하는 면역전자현미경용 생물시료 제조방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 제2단계의 세절은 유리칼 또는 다이아몬드칼을 이용하는 것을 특징으로 하는 면역전자현미경용 생물시료 제조방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 제3단계 이후에 글루탈알데하이드(glutaraldehyde) 또는 오스뮴 테트록사이드(OsO4)로 후고정하는 단계를 더 포함하는 면역전자현미경용 생물시료 제조방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 제3단계 이후에 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 염색하는 단계를 더 포함하는 면역전자현미경용 생물시료 제조방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 레진은 비수용성인 에폭시 수지를 사용하는 것을 특징으로 하는 면역전자현미경용 생물시료 제조방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 슬라이드 글라스는 포름바(Formvar) 코팅처리 되어 있으며, 조직을 붙여 처리하기 위한 영역을 형성하는 고무링이 구비된 것을 특징으로 하는 면역전자현미경용 생물시료 제조방법.

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