KR20100112226A - 사과의 낙과 및 적과를 활용한 폴리페놀 화합물 증강 조성물 제조방법 - Google Patents

사과의 낙과 및 적과를 활용한 폴리페놀 화합물 증강 조성물 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사과에 당 분해 효소를 처리하여 사과 폴리페놀 화합물과 세포-세포벽(Cell-Wall) 사이의 알파-1,4 또는 베타-1,4 결합을 끊어주고, 글라이콘 형태의 폴리페놀 화합물을 아글라이콘 형태로 전환되도록 하여 폴리페놀 화합물 함량이 다량 증가된 추출액, 농축액 및 분말상태를 제조하는 것을 특징으로 한다. 상기 처리를 위한 당 분해 효소는 셀룰라아제(cellulase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 펙티나아제(pectinase) 및 베타글루코시다제(beta-glucosidase)로 구성된 군으로부터 선택할 수 있다.
따라서, 사과재배 농가에서 발생하는 낙과와 적과를 활용함으로써 이로 인한 농가의 경제적 피해를 경감하고, 더불어 활성 폴리페놀 화합물의 함량이 다량 증가된 미숙사과 조성물로 관상동맥질환을 예방하는 효과가 있다.
사과, 낙과, 적과, 효소, 폴리페놀, 반응표면분석

Description

사과의 낙과 및 적과를 활용한 폴리페놀 화합물 증강 조성물 제조방법{Method for producing an enrichment of polyphenol materials from unripened and fallen apple}
본 발명은 고농도의 활성 폴리페놀 화합물을 함유하는 미숙사과 조성물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 당 분해 효소를 낙과(落果) 및 적과(摘果)에 첨가하여 사과에서 세포-세포벽(Cell-Wall) 결합을 하고 있는 부분의 폴리페놀 화합물을 다량 분리 추출하고, 또한 폴리페놀 화합물중의 일부 글라이콘(glycon) 배당체 형태의 폴리페놀 화합물을 아글라이콘(aglycon) 형태의 폴리페놀 화합물으로 전환시킴으로써 활성 폴리페놀 화합물의 함량이 다량 증가된 미숙사과 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
사과의 생육과정 중 우박, 태풍, 병충해 등 외부적 요인에 의한 생리적인 낙과(落果)와 적과(摘果) 등을 통한 기계적인 낙과로 말미암아 농가의 경제 피해가 종종 발생한다. 사과의 낙과 피해물량은 매년 예상생산량의 10~20% 수준으로 집계되고 있다. 특히 6월경 애사과가 계란 크기 정도일 무렵에 발생하는 유월낙과는 과실의 생산량에 큰 영향을 끼쳐 그 피해가 더욱 심각하다. 만약 수확을 앞두고 발생 한 피해라면 그나마 낙과를 이용하여 술, 쨈, 식초 등을 만들어 그 손실을 조금이나마 줄일 수 있다. 예전에는 농가에서 낙과 및 적과를 현장에서 폐기처분 하였었는데 최근에 미숙사과의 폴리페놀 화합물이 성숙한 사과보다 더 많이 존재하고 있다는 사실이 알려지면서 이를 활용하기 위한 추출가공공정이 유기용매 추출, 마이크로파(microwave) 추출 및 초임계 추출 등 공정을 주축으로 한 추출 용매의 조성, 추출 온도, 추출 압력 등 조건을 달리한 연구가 많이 이루어지고 있다.
이와 관련하여 전통적인 추출 공정을 통한 한국 공개특허 제1995-0016777호가 제안된다. 그러나 이러한 공정들은 비 세포-세포벽(Non-Cell-Wall) 결합을 하고 있는 폴리페놀 화합물의 추출에 초점을 맞추어 이루어졌을 뿐, 세포-세포벽(Cell-Wall) 결합을 하고 있는 부분의 폴리페놀 화합물의 분리 추출에 대해서는 무시하였기에 이상의 추출 공정을 거친 후, 사과박에는 여전히 많은 양의 폴리페놀 화합물이 존재한다. 따라서 사과 주스 제조 과정을 개선하여 보다 많은 폴리페놀 화합물을 추출하는 것이 새로운 연구 과제로 떠오르고 있다. 이를 위해서 최근에는 세포-세포벽(Cell-Wall) 결합을 하고 있는 폴리페놀 화합물의 추출을 위해서 폴리페놀 화합물질과 식물체 중 세포벽간의 상호 결합 구조에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있다.
사과박에 잔류된 폴리페놀 화합물들은 대부분 당과 결합한 글라이콘(glycon) 배당체 형태로 존재한다. 특히 이러한 생리활성 성분들은 사과 세포 외벽에 존재하는 펙틴(pectin), 셀룰로스(cellulose), 헤미셀룰로스(hemicellulose), 베타-1,4-글루칸(beta-1,4-glucan) 등과 같은 성분들과 알파-1,4 또는 베타-1,4 결합을 하고 있다. 이 때문에 추출되기 어렵고, 또한 그 가공식품을 섭취한다 하더라도 인체 내에 존재하는 동안 미생물들에 의해 모두 분해, 흡수되는 것은 아니며, 특히 이들을 분해할 수 있는 효소나 미생물이 존재하지 않으면 아글라이콘(aglycon) 형태로 분해되지 못하여 소장에서의 흡수율이 떨어지며 대부분 체외로 배설된다. 따라서 비활성 형태의 글라이콘(glycon) 배당체 화합물로 세포벽과 긴밀히 결합되어 있는 폴리페놀 화합물의 결합을 끊어 아글라이콘(aglycon) 형태의 무배당체 물질로 변환시켜 그 추출효율을 높이는 연구가 필요한 실정이다. 그 중에서 당 분해 효소를 이용하여 비활성 형태의 배당체 화합물과 세포벽간의 알파-1,4 또는 베타-1,4 결합을 끊어주어 사과 폴리페놀 화합물을 분리 추출하는 연구가 현재로선 최적의 연구방안으로 떠오르고 있다. 이에 따라 Soto C. 등은 celluclast을 이용하여 borage seeds에서 폴리페놀 물질을 추출한바가 있으며, Landbo A.K. 와 Meyer A.S. 는 당 분해 효소를 이용하여 포도씨 중의 폴리페놀 물질을 추출·분리하였다. 하지만 이상의 연구들은 주로 추출 공정을 거친 후의 잔류 부산물을 주축으로 하여 이루어졌을 뿐이고, 미숙 과일 또는 채소에 직접 당 분해 효소를 처리 하여 식물 세포벽과 긴밀한 결합을 하고 있는 글라이콘(glycon) 형태의 폴리페놀 화합물을 아글라이콘(aglycon) 형태로 전환시키는 연구들이 거의 이루어지지 않고 있다. 다만, 최근에 한국 공개특허 제2005-0006562호가 근근이 명맥을 이어가고 있을 뿐이다. 그러나 이 특허 역시 성숙된 과일을 이용한 것이며, 버려지는 미숙과를 모델로 하여 행하여 진 것이 아니어서 아쉬운 면이 크다.
종래기술의 문헌정보
[문헌1] 한국 공개특허 제1995-0016777호 “과실의 폴리페놀 혼합물의 제조방법”
[문헌2] 한국 공개특허 제2005-0006562호 “활성형 플라보노이드 화합물의 함량이 증가된 감귤 조성물을 제조하는 방법”
본 발명은 당 분해 효소를 낙과 및 적과에 첨가하여 사과에서 세포-세포벽(Cell-Wall) 결합을 하고 있는 부분의 폴리페놀 화합물을 다량 분리 추출하고, 또한 폴리페놀 화합물중의 일부 글라이콘 배당체 형태의 폴리페놀 화합물을 아글라이콘 형태의 폴리페놀 화합물으로 전환시켜 활성 폴리페놀 화합물의 함량이 다량 증가된 미숙사과 조성물을 제조하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 사과에 당 분해 효소를 처리하여 사과 폴리페놀 화합물과 세포-세포벽(Cell-Wall) 사이의 알파-1,4 또는 베타-1,4 결합을 끊어주고, 글라이콘 형태의 폴리페놀 화합물을 아글라이콘 형태로 전환되도록 하여 폴리페놀 화합물 함량이 다량 증가된 추출액, 농축액 및 분말상태를 제조하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 처리를 위한 당 분해 효소는 셀룰라아제(cellulase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 펙티나아제(pectinase) 및 베타글루코시다제(beta-glucosidase)로 구성된 군으로부터 선택하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 상기처리에서 당 분해 효소는 0.5 내지 10v/w% 첨가하고, 효소 반응 온도는 35 내지 65℃내외로 하며, 효소 반응 pH는 3.0 내지 6.0로 하고, 효소 반응 시간은 6 내지 36시간 정도로 하며, 효소 반응액 추출용매인 에탄올 농도는 은 3 내지 10v/w 정도 더 첨가하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따르면 상기 당 분해 효소의 반응을 최적화시키기 위해 먼 저 미숙사과에 동등한 질량의 증류수를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 효소 반응이 끝난 미숙사과 반응액은 필요에 따라 건조 또는 농축하여 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면 상기 사과박 대신 과일, 채소, 기타 과일박 등에 처리하는 것을 특징으로 한다.
폴리페놀 화합물의 주요한 종류인 하이드록실시나믹산(hydroxycinnamic aicd)은 사과에서 많이 발견되지만, 세포벽과 결합되어 있지는 않다. 하이드록실시나믹산의 대표적인 것은 카펙산(caffeic acid)이며 주로 카펙산과 큐닉산(quinic aicd)의 에스테(ester)인 크로제닉산(chlorogenic acid) 형태로 존재한다. 인체내 크로제닉산과 카펙산의 흡수는 주로 대장내 세균의 분해에 의해 이루어지며 인체에 섭취된다. 섭취된 크로제닉산과 카펙산은 각각 최고 30%와 95%정도가 소장에서 흡수된다. 따라서 큐닉산과 에스테르화된 카펙산(크로제닉산)의 흡수율은 카펙산 흡수율의 1/3 정도이다. 체외실험(in vitro)에서 카펙산과 크로제닉산 모두 저밀도지방단백질(LDL)의 산화를 저해한다. 따라서 관상동맥질환을 예방할 수 있을 것으로 기대할 수 있다. 본 발명에서는 당 분해효소를 이용한 미숙사과 폴리페놀 화합물의 분리 추출 연구에서 당 분해효소가 미숙사과에 다량 존재하는 크로제닉산의 에스테르 결합을 끊어 카펙산을 생산하는 결과도 얻을 수가 있었다. 따라서 이러한 당 분해 효소 추출물을 인체가 섭취하였을 때, 크로제닉산 보다 흡수율이 더 탁월한 카펙산의 관상동맥질환 예방 효과를 기대해 볼 수 있을 것으로 사료된다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 아글라이콘 형태의 폴리페놀 화합물은 글라이콘 형태의 폴리페놀 화합물보다 우수한 생리활성을 나타내는 것으로 보고되어 있으며, 사과박에 잔류된 폴리페놀 화합물들은 대부분 당과 알파-1,4 또는 베타-1,4 결합을 통해 글라이콘(glycon) 배당체로 식물체 내에 존재하고 있기에 추출되기 어렵고 또한 그 가공식품을 섭취한다 하더라도 체내에서의 흡수율이 떨어지는 문제점이 발생한다. 이에, 본 발명자들은 식용 가능하며 경제성이 있는 다양한 종류의 당 분해효소를 이용하여 미숙사과 세포벽에 긴밀히 결합되어 있는 글라이콘 형태의 비활성형 폴리페놀 화합물들을 아글라이콘 형태의 활성형 폴리페놀 화합물질로 전환시켜 폴리페놀 화합물질의 함량이 증가된 미숙사과 조성물을 제조하고, 그 제조된 폴리페놀 화합물의 조성을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 사과재배 농가에서 발생하는 낙과와 적과를 활용함으로써 이로 인한 농가의 경제적 피해를 경감하고, 더불어 활성 폴리페놀 화합물의 함량이 다량 증가된 미숙사과 조성물로 관상동맥질환을 예방하는 효과를 기대할 수 있다.
본 발명은 미숙사과에 당 분해 효소를 처리하여 사과 폴리페놀 화합물과 세포-세포벽(Cell-Wall) 사이의 알파-1,4 또는 베타-1,4 결합을 끊어줌으로써 글라이콘 형태의 폴리페놀 화합물을 아글라이콘 형태로 전환시킴으로써 폴리페놀 화합물 함량이 다량 증가된 미숙사과 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면 상기처리에서 당 분해 효소는 셀룰라아제(cellulase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 펙티나아제(pectinase), 및 베타글루코시다제(beta- glucosidase)로 구성된 군으로부터 선택하는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 당 분해 효소로서, 셀룰라아제, 베타글루카나제 및 자일란라제가 주성분인 비스코자임 엘(Viscozyme L, Novozymes Co. 덴마크), 펙티나아제가 주성분인 펙티넥스 5엑스엘(Pectinex 5XL, Novozymes Co. 덴마크) 및 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 펙티나아제가 주성분인 셀루클라스트 1.5엘(Celluclast 1.5L, Novozymes Co. 덴마크) 등을 사용하였지만 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제 및 펙티나아제의 기능을 할 수 있는 시판되는 모든 제품 및 자체 제작된 효소를 사용하여도 무방하다.
본 발명에 따르면, 상기처리에서 당 분해 효소는 0.5 내지 10v/w% 첨가하는 것이 바람직하지만, 1 내지 5v/w% 첨가하는 것이 바람직하고, 3v/w%(4.2FBG/g) 첨가하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 효소 반응 온도는 35 내지 65℃인 것이 바람직하고, 50℃인 것이 가장 바람직하다. 효소 반응 pH로는 3.0 내지 6.0인 것이 바람직하고, pH 3.6 인 것이 가장 바람직하다. 효소 반응 시간으로는 6 내지 36시간인 것이 바람직하고, 12시간인 것이 가장 바람직하다. 또한, 효소 반응액 추출용매인 에탄올 농도가 은 3 내지 10v/w 정도 더 첨가하는 것이 바람직하고, 5v/w 인 것이 가장 바람직하다.
또한, 당 분해 효소의 반응을 최적화시키기 위해 먼저 미숙사과에 동등한 질량의 증류수를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 효소반응 과정에서 산소와의 접촉을 피하고자 질소가 충진된 용기에서 반응을 시키는 것이 바람직하다. 상기 효소 반응이 끝난 미숙사과 반응액은 그대로 사용할 수도 있지만 필요에 따라 건조시켜 사용하거나 에틸아세테이트 층 분리를 진행한 후에 농축하여 사용할 수도 있다.
미숙사과 주스에 함유되어 있는 총 폴리페놀 화합물의 함량은 70.13 내지 76.01mg QAE/100g (큐세틴 양으로 환산, 생체중량), 총 플라보노이드 화합물의 함량은 70.19 내지 73.67mg RE/100g (루틴의 양으로 환산, 생체중량) 정도인 것에 비해 본 발명의 방법에 따른 미숙사과 효소 반응액에 함유되어 있는 총 폴리페놀 화합물의 함량은 102.69 내지 150.5mg QAE/100g (큐세틴 양으로 환산, 생체중량), 총 플라보노이드 화합물의 함량은 122.26 내지 157.47mg RE/100g (루틴의 양으로 환산, 생체중량) 정도로서, 본 발명에 따른 방법은 미숙사과 총 폴리페놀 함량과 총 플라보노이드 함량을 각각 약 2배 정도 더 증가시킬 수 있는 방법임을 알 수 있다.
또한 미숙사과 주스에 함유되어 있는 환원당의 함량은 73.84 내지 74.26mg/g(생체중량) 정도인 것에 비해, 본 발명의 처리방법에 따른 미숙사과 효소 반응액에 함유되어 있는 환원당의 함량은 83.04내지 113.72mg/g(생체중량) 정도인데 이는 미숙사과에 당 분해 효소를 처리하여 폴리페놀 화합물중의 글라이콘(glycon) 배당체 형태의 폴리페놀 화합물을 아글라이콘(aglycon) 형태의 폴리페놀 화합물로 전환시키는 과정에서 많은 양의 배당체가 떨어져나가 환원당 함량을 약 1.5배 정도로 증가시켰음을 알 수 있다.
폴리페놀 화합물 함량과 항산화 능력 사이에는 일정한 범위내에서 정 상관관계가 있다는 것은 이미 밝혀진 바다. 본 발명의 방법에 따른 미숙사과 효소 반응액 의 항산화 능력을 DPPH(IC50)와 FRAP를 통해 측정해본 결과, 효소 처리시 DPPH(IC50)와 FRAP은 각각 4.24내지 5.89mg TE/g(트러럭스 양으로 표시), 75.81내지 116.64mg TE/100g(트러럭스 양으로 표시) 로서 무 처리구인 DPPH(IC50)의 7.98내지 8.17mg TE/g(트러럭스 양으로 표시), FRAP의 47.69내지 50.84mg TE/100g(트러럭스 양으로 표시) 보다 훨씬 강력한 항 산화능력을 보여 본 발명을 통해 획득한 미숙사과 조성물의 우수성을 보여주었다.
또한, 본 발명은 반응표면분석(Response Surface Methodology, RSM)을 통한 미숙사과 효소추출물의 최적화 효소처리조건을 제공한다.
상기처리에서 당 분해 효소를 이용하여 효소의 분해에 영향을 주는 인자들을 하나하나 분석해 본 기초하에서 당 분해 능력이 가장 강력한 효소인 비스코자임 엘(Viscozyme L)을 이용하여 미숙사과 효소처리 최적화 조건을 반응표면분석을 통해 구명하였다.
상기의 방법인 중심합성계획에 의해 효소/기질 농도, 효소 반응 온도 및 용매/기질 농도를 독립변수로 하고, 추출물의 기능 성분 및 특성을 종속변수로 하여 반응표면분석을 실시한 결과, 최적의 효소반응 조건을 얻었는데 결과는 다음과 같다. 즉 효소/기질 농도가 3.78v/w %, 용매/기질 농도가 4.45v/w, 효소 반응 온도가 52.5℃ 일 때, 최적의 미숙사과 조성물을 얻었다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조되는 폴리페놀 화합물의 조성 및 함량이 증가된 미숙사과 조성물을 제공한다.
리그닌(lignin)은 세포벽을 형성하는 주요한 물질로서, 다량의 폴리페놀 화합물과 알파-1,4 또는 베타-1,4 결합을 하고 있다. 그 중에서 페룰릭산과 파라-쿠마릭산은 리그닌의 분해 여부를 증명하는 주요한 척도로 인식되고 있다. 본 발명의 처리방법에 의해 제조된 미숙사과 조성물 중 파라-쿠마릭산 (p-courmaric acid)이 12.89mg/kg(생체중량), 페룰릭산 (Ferulic acid)이 2.40mg/kg(생체중량) 그리고 카페익산(Caffeic acid)이 55.67mg/kg(생체중량) 함유되어 있어 효소 반응을 시키지 않은 미숙사과 조성물의 파라-쿠마릭산(p-courmaric acid)이 1.83mg/kg(생체중량), 페룰릭산 (Ferulic acid)이 0.48mg/kg(생체중량) 및 카펙산(Caffeic acid)이 1.76mg/kg(생체중량) 정도인 것에 비해 각각 7.03배, 5.02배, 31.55배 정도로 상당량 증가시키는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 또한 세포벽을 구성하고 있는 리그닌을 분해하였음을 완벽하게 증명하고 있다. 반면에, 본 발명의 방법에 의해 제조된 미숙사과 조성물 중 페놀산 화합물인 크로제닉산(Chlorogenic acid)이 18.70mg/kg(생체중량)으로 함유되어 있어 효소 반응을 시키지 않은 미숙사과 조성물 중인 129.07mg/kg(생체중량)에 비해 6.9배 감소하였다. 이는 당 분해효소가 미숙사과에 다량 존재하는 크로제닉산의 에스테르 결합을 끊어 카펙산을 생산하였음을 증명한다. 따라서 크로제닉산보다 흡수율이 좋은 카펙산의 항관상동맥질환 예방 효과를 기대해 볼 수도 있다고 사료됨.
그리고 본 발명의 방법에 의해 제조된 미숙사과 조성물 중 플래보노이드 화합물인 큐세틴(Quercetin)이 21.08mg/kg(생체중량), 큐세틴-3-글루코사이드(Q-3-glucoside)가 66.66mg/kg(생체중량)으로 함유되어 있어 효소 반응을 시키지 않은 미숙사과 조성물 중인 4.17mg/kg(생체중량)와 1.49mg/kg(생체중량)에 비해 각각 5.05배와 44.61배 증가시킬 수 있다.
또한 본 발명의 방법x에 의해 제조된 미숙사과 조성물 중 글라이콘 형태의 화합물인 폴로리진(Phloridzen) 이 27.41mg/kg(생체중량)정도 함유되어 있어 효소 반응을 시키지 않은 미숙사과 조성물 중인 54.89mg/kg(생체중량)에 비해 2배 감소되었다. 반면에, 폴로리진 화합물의 아글라이콘 형태인 폴로틴(Phloertin)은 10.90mg/kg(생체중량)정도 함유되어 있는 반면, 효소 반응을 시키지 않은 미숙사과 조성물 중에서는 거의 발견되지 않았다. 이는 효소의 반응을 통하여 폴로리진(Phloridzen)의 배당체가 떨어지며 폴로틴을 생성하였음을 의미하기도 한다.
이와 같이 본 발명의 처리방법에 의해 제조된 미숙사과 폴리페놀 조성물에는 활성 성분들인 페룰릭산, 파라-쿠마릭산, 카페익산, 큐세틴, 큐세틴-3-글루코사이드(Q-3-glucoside), 폴로리진 및 폴로틴이 다량으로 존재하기 때문에 당 분해 효소나 미생물이 인체내에 없더라도 다량의 활성 성분을 손쉽게 흡수할 수 있어 항산화, 항관상동맥질환 등 작용을 함으로써 건강을 증진시킬 수 있을 것으로 기대하고 있다.
상기 식품으로는 기능성 식품, 건강보조 식품 또는 가공 식품과 같은 식품형태인 것이 바람직하며, 상기와 같은 식품에 첨가되는 식품 첨가제의 형태로 제조될 수도 있다. 즉, 본 발명에 따른 식품의 유효성분인 미숙사과 폴리페놀 조성물에는 상기와 같은 사용목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
이하, 본 발명을 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 다만, 아래의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1 : 당 분해 효소의 종류에 따른 미숙사과내 총 폴리페놀 화합물의 함량 변화>
미숙사과 4g에 동량의 증류수를 첨가한 후 일정량의 셀룰라아제, 베타글루카나제 및 자일란라제가 주성분인 비스코자임 엘(Viscozyme L, Novozymes Co. 덴마크), 펙티나아제가 주성분인 펙티넥스 5엑스엘(Pectinex 5XL, Novozymes Co. 덴마크) 및 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제 및 펙티나아제가 주성분인 셀루클라스트 1.5엘(Celluclast 1.5 L, Novozymes Co. 덴마크)을 넣은 후 산소의 산화를 막고자 질소로 산소를 치환해낸 후 반응을 진행하였다. 이상의 당 분해 효소들을 각각 동일한 농도, 반응 온도 및 반응 시간 조건하에서 효소 반응을 유도하였다. 일정한 시간 효소 반응을 유도한 후, 동일한 체적의 에탄올을 첨가하여 효소 반응을 중지시키고, 85℃에서 12시간 폴리페놀 화합물 추출을 진행하였다. 반응액은 원심분리를 거친 후, 상층액 일부를 덜어내어 총 폴리페놀 화합물의 분석을 Folin-Ciocalteu법으로 수행하여 효소를 처리하지 않은 미숙사과와 효소를 처리한 미숙사과의 총 폴리페놀 화합물의 함량을 비교하였다. 그 결과, 효소 반응을 시키지 않은 대조군에 비해 효소 반응을 시켰을 때 총 폴리페놀 화합물의 함량이 현저히 증가하였고, 효소 종류에 따라서도 일정한 차이가 있었으며, 그 중 비스코자임 엘으로 효소 반응을 유도하였을 때 총 폴리페놀 화합물의 함량이 가장 많이 증가하였다(도 1∼5). 따라서 비스코자임 엘의 효과가 가장 높음을 알 수 있었으며, 최종적으로 당 분해효소인 비스코자임 엘을 이용하여 반응표면분석(Response Surface Methodology, RSM)을 통한 미숙사과 효소처리 최적화 조건을 규명하였다.
<실시예 2 : 효소/기질 농도 변화에 따른 미숙사과내 총 폴리페놀 화합물의 함량 변화>
미숙사과 4g에 동량의 증류수를 첨가한 후 비스코자임 엘, 펙티넥스 5엑스엘，및 셀루클라스트 1.5엘 등을 각각 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 및 10v/w%의 농도로, 반응액의 pH 4.5 로 처리하여 50℃에서 12시간 동안 효소 반응을 유도하였다. 이 후의 처리는 상기 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
그 결과, 처리한 효소의 종류와 무관하게 효소의 처리 농도가 증가함에 따라 미숙사과내 총 폴리페놀의 함량이 증가하였으며, 농도별로는 3.0v/w%(3.6 FBG/g) 로 처리하였을 때 함량이 가장 많이 증가하였다. 또한, 상기 실시예 1과 동일하게 같은 농도에서도 비스코자임 엘을 처리하였을 때의 총 폴리페놀의 함량이 가장 많았다(도 1).
<실시예 3 : pH 변화에 따른 미숙사과내 총 폴리페놀 화합물의 함량 변화>
상기 실시예 2를 통해 효소 농도 3.0v/w%(3.6 FBG/g) 로 처리하였을 때 총 폴리페놀의 함량이 가장 많이 증가하였다. 이에, 효소처리 시 pH를 달리함으로써 pH에 따른 효소 최적 반응 정도를 분석하였다. pH를 3.0, 3.7, 4.0, 5.0, 5.5 및 6으로 조절하면서 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 효소 반응을 진행하였다.
그 결과, 비스코자임 엘과 펙티넥스 5엑스엘을 처리한 경우는 pH 3.7로 조절 하였을 때의 함량이 가장 많았으며, 셀루클라스트 1.5엘을 처리한 경우는 pH 의 증가에 따라 비슷하거나 약간씩 증가하는 경향을 보였다(도 2). 그리고 비스코자임 엘로 효소반응을 시켰을 때 총 폴리페놀 화합물의 함량이 가장 많이 증가하였다.
<실시예 4 : 효소 처리 시간에 따른 미숙사과내 총 폴리페놀 화합물의 함량 변화>
상기 실시예 1과 동일하게 효소를 각각 3.0v/w%(3.6 FBG/g)로 처리하여 50℃에서 효소 반응을 유도한 뒤 6, 12, 24 및 36 시간째에 효소 반응을 중지시키고, 폴리페놀 화합물의 추출을 실시예 1과 동일한 방법으로 진행하였다.
그 결과, 비스코자임 엘은 효소 반응 후 12시간에 함량이 가장 많았으며, 펙티넥스 5엑스엘와 셀루클라스트 1.5엘 처리한 경우는 효소 반응 후 24시간에 함량이 가장 많았다(도 3). 그리고 비스코자임 엘로 효소반응을 시켰을 때 총 폴리페놀 화합물의 함량이 가장 많이 증가하였다.
<실시예 5 : 효소 처리 온도에 따른 미숙사과내 총 폴리페놀 화합물의 함량 변화>
상기 실시예 1과 동일하게 효소를 각각 3.0v/w%(3.6 FBG/g)로 처리하여 40℃, 45℃, 50℃ 및 55℃에서 효소 반응을 실시하였으며 폴리페놀 화합물의 추출을 실시예 1과 동일한 방법으로 진행하였다.
그 결과, 비스코자임 엘과 셀루클라스트 1.5엘을 처리한 경우 50℃에서 총 폴리페놀 화합물의 함량이 가장 많았으며, 펙티넥스 5엑스엘을 처리한 경우는 55℃에서 총 폴리페놀 화합물의 함량이 가장 많았다(도 4).
<실시예 6 : 용매 대 기질 농도에 따른 미숙사과내 총 폴리페놀 화합물의 함량 변화>
상기 실시예 1과 동일하게 효소를 각각 3.0v/w%(3.6 FBG/g) 로 처리하여 50℃에서 효소 반응을 실시예 1과 동일한 방법으로 실시한 후 추출 용매 대 기질의 농도를 4, 5, 6, 9 및 10으로 하여 폴리페놀 화합물의 추출을 진행하였다.
그 결과, 추출 용매 대 기질의 농도가 6 좌우일 때 총 폴리페놀 화합물의 함량이 가장 많이 추출되었다(도 5).
<실시예 7 : 반응표면분석(Response Surface Methodology, RSM)을 통한 미숙사과 효소추출물의 기능 성분의 효소처리조건 최적화>
본 발명에서는 미숙사과의 세포-세포벽(Cell-Wall) 결합을 하고 있는 부분의 폴리페놀 화합물을 효과적으로 추출하고자 당 분해 효소를 사용하였는데, 여러 가지 효소 중에서 특히 총 폴리페놀 화합물 추출에 제일 효율적인 비스코자임 엘을 사용하였으며, 효소 반응 조건 및 그 추출 공정을 최적화하였다. 이 때, 중심합성계획에 의해 효소 대 기질 농도, 효소 반응 온도 및 용매 대 기질 농도를 독립변수로 하고 추출물의 기능 성분 및 특성을 종속변수로 하여 반응표면분석을 실시하였다. 아래의 [표 1]에서는 18가지 조건별 중심합성계획법에 따른 종속변수의 변화를 나타내는 바, 당 분해 효소 반응에 있어 18가지 조건별 중심합성계획법에 따른 다양한 효소 대 기질 농도(X1), 용매 대 기질 농도(X2) 및 효소 반응 온도(X3)의 조건 하에서 얻어진 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, 환원당 함량, DPPH (IC50) 및 FRAP 함량 변화를 알 수 있다. [표 2]에서는 반응표면분석을 통한 최적 의 반응 조건 수치를 나타내고 있다. 즉 효소 대 기질 농도(X1)가 3.78v/w%, 용매 대 기질 농도(X2)가 4.45v/w, 효소 반응 온도(X3)가 52.5℃ 일 때, 최대의 추출 함량을 보여주고 있다. [표 3]에서는 최적의 반응 조건 하에서의 각 종속변수의 예상 함량과 실제 실시하였을 때의 함량을 보여주고 있다. 결과에서 보여주듯이 반응표면분석을 통해 얻은 회귀식을 근거로 계산된 예상 함량과 실제 분석을 실행한 결과는 거의 일치하였으며, 이는 본 발명의 우수성을 설명한다.
[표 ] 중심합성계획법에 따른 종속변수의 변화
Figure 112009021294269-PAT00001
[표 ] 반응표면분석을 통한 최적의 반응 조건
Figure 112009021294269-PAT00002
[표 ] 각 종속변수의 예상 함량과 실제 분석결과의 비교
Figure 112009021294269-PAT00003
<실시예 8 : 미숙사과 추출물에 존재하는 폴리페놀 화합물의 분석>
최적 추출 조건인 실시예 7과 동일한 방법으로 효소 반응을 실시한 후 폴리페놀 화합물의 추출을 진행하였다. 추출액을 원심분리 후, 상층액 일부를 덜어내어 고압 액체 크로마토그래피(High-Performance Liquid Chromatography)로 폴리페놀 화합물의 분석을 수행하여 효소를 처리하지 않은 미숙사과와 효소를 처리한 미숙사과의 폴리페놀 화합물의 함량을 비교하였다. 이때, 고압 액체 크로마토그래피를 수행하는 조건은 하기와 같다.
컬럼: ODS-HG5 (250× 4.6 mm I.D)
이동상 용매 A: 3차 증류수에 2% 아세틱산(Acetic acid) 첨가
이동상 용매 B: 50% 아세토나이트릴(Acetonitrile)과 0.5% 아세틱산 (Acetic acid) 첨가
유속: 1.0mL/min
검출: UV 290nm
그 결과, 당 분해 효소인 비스코자임 엘을 처리를 하지 않은 미숙사과 조성물에서는 카펙산, 파라-쿠마릭산, 페룰릭산, 큐세틴, 큐세틴-3-글루코사이드, 폴로리진의 피크가 약하게 나타난 반면, 비스코자임 엘을 처리한 미숙사과 조성물에서는 카펙산, 파라-쿠라릭산, 페룰릭 산, 큐세틴, 큐세틴-3-글루코사이드, 폴로리진의 피크가 아주 강력하게 나타났으며 폴로틴이 추가로 검출되었다(도 6a, 6b). 이는 당 분해 효소인 비스코자임 엘이 세포벽을 구성하고 있는 리그닌을 분해하였음을 증명하고 있다. 또한 효소의 반응을 통하여 폴로리진의 배당체가 떨어지며 폴로틴을 생성하였음을 의미하기도 한다. 그리고 효소처리를 하지 않은 미숙사과 조성물에서는 크로로지닉산의 피크가 아주 강력하게 나타난 반면, 비스코자임 엘을 처리한 미숙사과 조성물에서는 크로로지닉산의 피크가 약하게 나타났다(도 6a, 6b). 이는 당 분해효소가 미숙사과에 다량 존재하는 크로제닉산의 에스테르 결합을 끊어 카펙산을 생산하였음을 증명한다.
< 실시예 9 : 에틸아세테이트 층 분리를 통한 분말상태의 미숙사과 폴리페놀 화합물의 제조>
당 분해 효소를 이용하여 최적화 조건에서 획득한 미숙사과 추출물은 기능성 식품, 건강보조 식품 또는 가공 식품과 같은 식품의 형태로 사용하는 것이 바람직 하며, 식품에 첨가되는 식품 첨가제의 형태로 제조될 수도 있다. 또한, 상기 효소 반응이 끝난 미숙사과 반응액은 필요에 따라 건조시켜 사용하거나 에틸아세테이트 층 분리를 진행한 후에 농축하여 사용할 수도 있다. 도 7은 당 분해 효소인 비스코자임 엘(Viscozyme L)의 처리 공정을 통해 추출된 미숙사과 추출물을 에틸아세테이트 층 분리를 거친 후 동결건조 과정을 통해 얻은 분말상태의 폴리페놀 화합물인 사과조폴리페놀(Apple crude polyphenol, ACP)을 보여주고 있다. Folin-Ciocalteu법을 이용하여 총 폴리페놀 화합물 함량을 분석한 결과 75.82%의 높은 함량을 보여 농축 전 함량인 140.59mg%보다 539.3배 가량 높은 결과를 얻을 수가 있었다.
<실시예 10 : 고압 액체 크로마토그래피를 이용한 Apple crude polyphenol(ACP) 분석>
당 분해 효소인 비스코자임 엘(Viscozyme L)의 처리 공정을 통해 추출된 미숙사과 추출물을 에틸아세테이트 층 분리를 거친 후 동결건조 과정을 통해 얻은 분말상태의 폴리페놀 화합물인 사과조폴리페놀(Apple crude polyphenol, ACP)을 획득한 후 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 주요 폴리페놀 화합물 함량을 분석하여 농축하지 않은 폴리페놀 화합물과 그 함량을 비교하였다. 그 중, 카펙산은 17.75mg/g, 파라-쿠말릭산은 3.78mg/g, 큐세틴-3-글루코사이드은 16.66mg/g, 폴로리진은 8.98mg/g, 폴로틴은 2.69mg/g 로서 동결건조 전에 비해 각각 318.87, 293.03, 249.92, 327.48, 246.42배 증가하였다.
이상에서 살펴 본 본 발명은 기재된 실시예에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양하게 수정 및 변형할 수 있음은 이 기술의 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다. 따라서 그러한 변형예 또는 수정예들은 본 발명의 특허청구범위에 속한다 해야 할 것이다.
도 1은 당 분해 효소/기질 농도 변화에 따른 미숙사과 내 총 폴리페놀 화합물의 함량 변화를 나타내는 그래프,
도 2는 당 분해 효소를 이용한 추출공정에서 pH 변화에 따른 미숙사과 내 총 폴리페놀 화합물의 함량 변화를 나타내는 그래프,
도 3은 당 분해 효소 처리 공정에서 효소 반응 시간에 따른 미숙사과 내 총 폴리페놀 화합물의 함량 변화를 나타내는 그래프,
도 4는 당 분해 효소 처리 온도에 따른 미숙사과 내 총 폴리페놀 화합물의 함량 변화를 나타내는 그래프,
도 5는 당 분해 효소 처리 공정에서 용매 대 기질 농도에 따른 미숙사과 내 총 폴리페놀 화합물의 함량 변화를 나타내는 그래프,
도 6은 당 분해 효소인 비스코자임 엘(Viscozyme L)의 처리 공정을 통해 추출된 미숙사과 폴리페놀 화합물의 분석을 고압 액체 크로마토그래피를 이용하여 냐타내는 그래프,
(A) 당 분해 효소인 비스코자임 엘 처리구,
1, 5-하이드록실메틸 푸푸라(5-hydroxymethyl furfural);
2, 프로토카테츄크산(protocatechuic acid);
3, 프로시아니딘 B1 (procyanidin B1);
4, (±)카테친((±)catechin);
5, 크로로직산(Chlorogenic acid);
6, 카펙산(Caffeic acid);
7, (-)-애피카테친((-)-epicatechin);
8, 파라-쿠말릭산(p-courmaric acid);
9, 패룰릭산(Ferulic acid);
10, 큐세틴-3-갈라크토사이드(Q-3-D-galactoside);
11, 큐세틴-3-글루코사이드(Q-3-glucoside);
12, 큐세트린(Quercetrin);
13, 폴로리진(Phloridzen);
14, 큐세틴(Quercetin);
15, 폴로틴(Phloertin);
16, 캠페롤(Kaempferol); UK1-4, UK8-9, 미확인 피크(UK, Un-Known Peak).
(B)효소 무 처리구.
1, 5-하이드록실메틸 푸푸라(5-hydroxymethyl furfural);
2, 프로토카테츄크산(protocatechuic acid);
3, 프로시아니딘 B1 (procyanidin B1);
4, (±)카테친((±)catechin);
5, 크로로직산(Chlorogenic acid);
6, 카펙산(Caffeic acid);
7, (-)-애피카테친((-)-epicatechin);
8, 파라-쿠말릭산(p-courmaric acid);
9, 패룰릭산(Ferulic acid);
10, 큐세틴-3-갈라크토사이드(Q-3-D-galactoside);
11, 큐세틴-3-글루코사이드(Q-3-glucoside);
12, 큐세트린(Quercetrin);
13, 폴로리진(Phloridzen);
14, 큐세틴(Quercetin); UK1, UK3, UK5-8, 미확인 피크(UK, Un-Known Peak).
도 7은 당 분해 효소인 비스코자임 엘(Viscozyme L)의 처리 공정을 통해 추출된 미숙사과 추출물을 에틸아세테이트 층 분리를 거친 후 동결건조 과정을 통해 얻은 분말상태의 사과조폴리페놀(Apple crude polyphenol, ACP)을 나타내는 사진,
도 8은 고압 액체 크로마토그래피를 이용한 사과조 폴리페놀(Apple crude polyphenol, ACP) 분석결과를 나타내는 그래프,
1, 카펙산(Caffeic acid);
2, 파라-쿠말릭산(p-courmaric acid);
3, 큐세틴-3-글루코사이드(Q-3-glucoside);
4, 폴로리진(Phloridzen);
5, 폴로틴(Phloertin).

Claims (5)

  1. 사과에 당 분해 효소를 처리하여 사과 폴리페놀 화합물과 세포-세포벽(Cell-Wall) 사이의 알파-1,4 또는 베타-1,4 결합을 끊어주고, 글라이콘 형태의 폴리페놀 화합물을 아글라이콘 형태로 전환되도록 하여 폴리페놀 화합물 함량이 다량 증가된 추출액, 농축액 및 분말상태를 제조하는 것을 특징으로 하는 사과의 낙과 및 적과를 활용한 폴리페놀 화합물 증강 조성물 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 처리를 위한 당 분해 효소는 셀룰라아제(cellulase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 펙티나아제(pectinase) 및 베타글루코시다제(beta-glucosidase)로 구성된 군으로부터 선택하는 것을 특징으로 하는 사과의 낙과 및 적과를 활용한 폴리페놀 화합물 증강 조성물 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기처리에서 당 분해 효소는 0.5 내지 10v/w% 첨가하고, 효소 반응 온도는 35 내지 65℃로 하며, 효소 반응 pH는 3.0 내지 6.0로 하고, 효소 반응 시간은 6 내지 36시간으로 하며, 효소 반응액 추출용매인 에탄올 농도는 은 3 내지 10v/w 정도 더 첨가하는 것을 특징으로 하는 사과의 낙과 및 적과를 활용한 폴리페놀화합물 증강 조성물 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 당 분해 효소의 반응을 최적화시키기 위해 미숙사과에 동등한 질량의 증류수를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 효소 반응이 끝난 미숙사과 반응액은 필요에 따라 건조 또는 농축하여 사용하는 것을 특징으로 하는 사과의 낙과 및 적과를 활용한 폴리페놀화합물 증강 조성물 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 사과박 대신 과일, 채소, 기타 과일박 등에 처리할 수도 있음을 특징으로 하는 사과의 낙과 및 적과를 활용한 폴리페놀화합물 증강 조성물 제조방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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