KR20100108107A - A transgenic animal overexpressing tresk gene and a method for preparing the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 TRESK 유전자를 과발현하는 형질전환 동물에 관한 것으로서, 상세하게는 TRESK 유전자를 포함하는 벡터, 상기 TRESK 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 수정란, 및 상기 수정란을 이용한 형질전환 동물에 관한 것이다.The present invention relates to a transgenic animal overexpressing the TRESK gene, and more particularly, to a vector comprising the TRESK gene, a fertilized egg transformed with a vector comprising the TRESK gene, and a transgenic animal using the fertilized egg.
TRESK (TWIK [tandem pore domain weak inward rectifying K+ channel]-related spinal cord K+ channel) 유전자는 2003년 일본 그룹에 의해 사람의 척수에서 클로닝 되었고, 2005년 생쥐의 고환에서 클로닝 된 유전자로서, 현재까지 알려진 TRESK 발현 분포 기관은 척수와 척수후근신경절이다. 이러한 분포 특징에 따라 연구자들은 통증 관련 연구에 많은 관심을 갖고 있는 유전자이나, TRESK 기능 연구는 척수와 척수후근신경절에 편중되어 있고, 뇌의 경우 그 발현량이 매우 적어, 현재까지 TRESK 기능 연구가 제대로 이루어지지 못하고 있는 실정이다.TRESK (TWIK (tandem pore domain weak inward rectifying K + channel) -related spinal cord K + channel) gene was cloned from human spinal cord by Japanese group in 2003 and cloned from testes of mouse in 2005. Known TRESK expression distribution organs are the spinal cord and the spinal cord ganglion. According to these distribution characteristics, researchers are very interested in pain-related studies, but TRESK function research is concentrated on spinal cord and spinal cord ganglion, and its expression is very small in the brain, so TRESK function research has been well conducted until now. It is not supported.
형질전환 동물 모델은 유전자 자체의 기능에 대한 연구 뿐만 아니라, 해당 유전자와 관련된 질환 모델을 연구하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다. TRESK 유전자의 경우 상기 언급한 바와 같이, 개체에서의 발현률이 매우 낮으며, 그 기능 및 질환과의 관련성에 대해 현재까지 명확하게 밝혀지지 않아, 체계적인 연구가 이루지지 못하고 있다. 따라서 TRESK 유전자를 발현하는 세포 수준에서의 연구 뿐만 아니라, 개체 수준에서의 기능 및 효과를 검증하기 위해서는 TRESK 유전자를 발현 또는 저해하는 생체 모델의 수립이 요구된다.The transgenic animal model can be very useful not only for studying the function of the gene itself, but also for studying disease models related to the gene. In the case of the TRESK gene, as mentioned above, the expression rate in the individual is very low, and its function and association with the disease have not been clearly revealed to date, and thus, a systematic study has not been made. Therefore, in order to verify the function and effect at the individual level as well as the study at the cellular level expressing the TRESK gene, it is required to establish a biomodel that expresses or inhibits the TRESK gene.
이에 본 발명자들은, TRESK 유전자를 정상 개체보다 과발현하는 형질전환 동물을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, TRESK 유전자를 벡터에 삽입시키고, 이를 미세조작에 의해 수정란에 도입한 후, 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 TRESK 유전자를 발현하는 형질전환 동물을 안정적으로 수득할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors have made efforts to develop a transgenic animal that overexpresses the TRESK gene than a normal individual. As a result, the TRESK gene is inserted into a vector, introduced into the fertilized egg by micromanipulation, and the fertilized egg is implanted into the uterus of the surrogate mother. By confirming that the transgenic animal expressing the TRESK gene can be obtained stably, the present invention was completed.
본 발명의 목적은 프로모터, 서열번호 1로 구성된 TRESK 유전자, 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는 pcDNA3.1 벡터를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a pcDNA3.1 vector comprising a promoter, a TRESK gene consisting of SEQ ID NO: 1, and a polyadenylation sequence.
본 발명의 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 수정란을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a fertilized egg transformed with the vector.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 수득한 형질전환 동물을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a transgenic animal obtained by implanting the fertilized egg into the uterus of the surrogate mother.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터를 제조하는 단계; 제조된 벡터를 수정란의 핵으로 도입하는 단계; 및 상기 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 형질전환 동물을 수득하는 단계를 포함하는 TRESK를 과발현하는 형질전환 동물의 제조방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to prepare the vector; Introducing the prepared vector into the nucleus of the fertilized egg; And implanting the fertilized egg into the uterus of the surrogate mother to provide a transgenic animal.
따라서, 하나의 양태로서 본 발명은 프로모터, 서열번호 1로 구성된 TRESK 유전자, 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는 pcDNA3.1 벡터를 제공하는 것이다.Accordingly, in one aspect, the present invention provides a pcDNA3.1 vector comprising a promoter, a TRESK gene consisting of SEQ ID NO: 1, and a polyadenylation sequence.
본 발명에서 사용되는 용어, "TRESK (TWIK [tandem pore domain weak inward rectifying K+ channel]-related spinal cord K+ channel) 유전자"란 Gm781, Kcnk18, Tresk-2, K2P18.1 또는 Trik라고도 불리며, 칼륨 채널 서브패밀리 K의 멤버 18 (potassium channel, subfamily K, member 18)인 유전자로서, 마우스의 경우 19 번 염색체에 존재하는 EntrezGene ID 번호가 332396인 유전자이다. 마우스의 TRESK 유전자에 대한 cDNA는 GenBank accession number AY325301로 알려져 있다. 인간의 경우에는 염색체 10q25.3에 존재하며 EntrezGene ID 번호는 338576로 알려져 있다. 이러한 TRESK는 2-공 도메인 칼륨 채널 (2-pore domain potassium channel)의 멤버로 알려져 있으며, 증가된 칼슘 농도에 의해 활성화 되는 것으로 보고 되고 있다. 이러한 TRESK의 발현을 조절함으로써, Ca2+-이동 호르몬 및 신경전달물질 (neurotransmitter)에 반응하여, 뉴런 및 다른 타입의 세포 민감도를 조절할 수 있을 것으로 예상되며, 본 발명의 바람직한 실시 예에서는 이러한 TRESK의 구체적인 기능 및 이와 관련된 질환 모델을 제공하기 위한 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 수정란 및 상기 수정란으로부터 생산된 TRESK를 과발현하는 형질전환 동물 모델을 제조하였다.As used herein, the term "TRESK (TWIK [tandem pore domain weak inward rectifying K + channel] -related spinal cord K + channel) gene" is also called Gm781, Kcnk18, Tresk-2, K 2P 18.1 or Trik, and potassium The gene is member 18 of the channel subfamily K (potassium channel, subfamily K, member 18). In the mouse, the gene is EntrezGene ID number 332396 present on chromosome 19. The cDNA for the TRESK gene in mice is known as GenBank accession number AY325301. In humans it is on chromosome 10q25.3 and the EntrezGene ID number is known as 338576. This TRESK is known to be a member of the 2-pore domain potassium channel and is reported to be activated by increased calcium concentration. By regulating the expression of these TRESKs, it is expected that neurons and other types of cellular sensitivity may be regulated in response to Ca 2+ -transfer hormones and neurotransmitters, and in preferred embodiments of the present invention A vector, transgenic animal model transformed with the vector, and a transgenic animal model overexpressing TRESK produced from the fertilized egg were prepared to provide specific functions and disease models associated therewith.
본 발명에서 용어, "벡터"란 상기 벡터가 도입된 세포에서 목적 유전자를 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 벡터 내에 도입된 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 바람직하게 본 발명은 TRESK 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조할 수 있으며, 상기 제조된 재조합 벡터를 이용하여 이를 수정란에 도입함으로써, 형질전환된 수정란을 제조할 수 있게 된다. As used herein, the term "vector" refers to a gene construct which is an expression vector capable of expressing a gene of interest in a cell into which the vector is introduced, and which includes essential regulatory elements operably linked to express a gene insert introduced into the vector. . Preferably, the present invention can produce a recombinant vector comprising the TRESK gene, by introducing it into the fertilized egg using the prepared recombinant vector, it is possible to produce a transformed fertilized egg.
바람직하게 본 발명에서 사용되는 프로모터는 당업계에서 통상적으로 사용되는 발현벡터를 제조하기 위한 프로모터 서열을 제한 없이 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 프로모터의 예로는 SP6 프로모터, T3 프로모터, 또는 T7 프로모터 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용 가능한 프로모터 서열이 제한되는 것은 아니다. 이러한 프로모터는 필요에 따라 조직 특이적으로 발현시키기 위하여 특정 프로모터를 사용할 수 있다. 예를 들면, TRESK 유전자를 간 조직 특이적으로 발현시키고자 하는 경우, Apo E (Apolipoprotein E) 프로모터, TTR (transthyretin) 프로모터, 또는 알부민 프로모터 등을 사용할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 바람직한 실시 예에서는 동물의 모든 조직에서 과발현을 유도하기 위하여 T7 프로모터를 사용하였다. T7 프로모터는 T7 박테리오파지 (T7 bacteriophage)에서 분리된 서열로서, RNA 중합효소 (RNA polymerase)와 친화성이 매우 좋아 다량의 mRNA를 수득할 수 있다.Preferably the promoter used in the present invention may be used without limitation the promoter sequence for producing an expression vector commonly used in the art. Examples of promoters that can be used include SP6 promoter, T3 promoter, T7 promoter and the like, but the promoter sequences usable in the present invention are not limited by the above examples. Such promoters may use specific promoters for tissue-specific expression as needed. For example, when the TRESK gene is to be specifically expressed in liver tissue, an Apo E (Apolipoprotein E) promoter, a TTR (transthyretin) promoter, an albumin promoter, or the like can be used. In a preferred embodiment of the present invention, the T7 promoter was used to induce overexpression in all tissues of the animal. The T7 promoter is a sequence isolated from T7 bacteriophage, and has a high affinity with RNA polymerase, thereby obtaining a large amount of mRNA.
또한 바람직하게 본 발명의 폴리아데닐화 서열은 통상적으로 사용되는 폴리아데닐화 서열, 예를 들면 SV40 폴리아데닐화 서열, 인간 성장호르몬 폴리아데닐화 서열, 마우스 프로타민-1 유전자 폴리아데닐화 서열 (protamine-1 poly A signal), 라지 T 항원 폴리 A 영역 (large T antigen poly A region)으로 부터 유래된 폴리아데닐화 서열, 토끼 β-글로빈 (β-globin)으로부터 유래된 폴리아데닐화 서열 또는 소태아 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 등이 제한 없이 사용될 수 있다.Also preferably the polyadenylation sequence of the present invention is a polyadenylation sequence commonly used, such as the SV40 polyadenylation sequence, human growth hormone polyadenylation sequence, mouse protamine-1 gene polyadenylation sequence (protamine-1 poly A signal), polyadenylation sequence derived from large T antigen poly A region, polyadenylation sequence derived from rabbit β-globin or fetal growth hormone polya Denylated sequences and the like can be used without limitation.
TRESK 유전자가 과발현 되었는지를 확인하기 위하여, 본 발명의 벡터 내에는 단백질 분리 정제 또는 확인용 태그 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 태그 서열의 예로는 GFP, GST (Glutathione S-transferase)-tag, HA, His-tag, Myc-tag, T7-tag 등이 있으나, 상기 예들에 의해 본 발명의 태그 서열이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시 예에서는 His-tag을 사용하여 TRESK의 발현 유무 및 발현량을 확인하였다. 바람직하게 상기 방법으로 제조된 벡터(pcDNA3.1)는 도 1에 개시된 벡터일 수 있다.In order to confirm whether the TRESK gene is overexpressed, the vector of the present invention may further include a tag sequence for protein separation purification or identification. Examples of tag sequences include GFP, glutathione S-transferase (GST) -tag, HA, His-tag, Myc-tag, T7-tag, and the like, but the tag sequences of the present invention are not limited by the above examples. In a preferred embodiment of the present invention using His-tag was confirmed the presence and expression of TRESK. Preferably, the vector (pcDNA3.1) prepared by the above method may be a vector disclosed in FIG. 1.
다른 하나의 양태로서 본 발명은 TRESK 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 수정란을 제공하는 것이다.In another aspect, the present invention provides a fertilized egg transformed with a vector comprising the TRESK gene.
본 발명에 사용되는 수정란은 당업계에서 형질전환을 위해 사용되는 수정란을 제한 없이 사용할 수 있으며, 본 발명의 목적상 상기 수정란은 마우스의 수정란 일 수 있다. 수정란은 4 내지 7주령의 암컷 마우스에 PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin) 및 hCG (human Choirinic Gonadotropin)를 주사하여 생산될 수 있으며, 바람직하게는 7 IU의 PMSG를 복강 주사하고, 48 시간 경과 후 hCG를 주사하여 과배란을 유도하였다. 이어 수정란 생산을 위해 hCG 복강 주사 후 바로 12주령의 수컷 마우스와 교미시켜 질전 (vaginal plug)이 있는 암컷 마우스의 난관으로부터 수정란 (zygote)을 수득하였다.The fertilized egg used in the present invention can be used without limitation the fertilized egg used for transformation in the art, the fertilized egg for the purpose of the present invention may be a fertilized egg of the mouse. Fertilized eggs can be produced by injecting 4-7 week-old female mice with PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin) and hCG (human Choirinic Gonadotropin), preferably intraperitoneally with 7 IU of PMSG and 48 hours later Injection induced hyperovulation. Subsequently, the mice were mated with 12-week-old male mice immediately after hCG intraperitoneal injection for fertilized egg production to obtain zygote from the fallopian tubes of female mice with vaginal plugs.
상기 TRESK 유전자를 포함하는 벡터를 수정란으로 도입하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있다. 유전자를 수정란으로 도입하는 방법의 예는, 1) 수정 직후 전핵 단계에 있는 접합체의 웅성전핵 내에 미세조작 기술로 유 전자를 주입하는 미세주입법 (Microinjection technique), 2) 배아 간세포 (embrynic stem cells)에 유전자를 삽입하고 이를 배반포기의 수정란 내에 이식하는 방법 (Stem cell insertion technique), 3) 레트로바이러스 (retrovirus) 벡터를 이용하여 유전자를 수정란 내에 주입하는 방법 (retrovirus insertion technique), 및 4) 수컷의 정소 내에 유전자를 주입하여 정자에 삽입시키고, 이를 난자와 수정시키는 방법 (sperm-mediated gene transfer technique) 등이 있으나, 상기 예에 의해 벡터를 수정란에 도입하는 방법이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시 예에서는 미세조작에 의해 유전자를 도입하는 미세주입법을 이용하여 TRESK 유전자가 형질전환된 마우스 수정란을 제조하였다. The method of introducing a vector containing the TRESK gene into the fertilized egg may be used without limitation methods known in the art. Examples of methods for introducing genes into fertilized eggs include: 1) Microinjection technique, which injects genes into the male pronucleus of the conjugate at the pronuclear stage immediately after fertilization, and 2) into embryonic stem cells. Inserting the gene and implanting it into the fertilized egg of the blastocyst (Stem cell insertion technique), 3) introducing the gene into the fertilized egg using a retrovirus vector (retrovirus insertion technique), and 4) male testis There is a method of injecting a gene into the sperm by inserting the gene into the sperm, and the method of fertilizing it with an egg (sperm-mediated gene transfer technique). In a preferred embodiment of the present invention, a mouse embryo in which the TRESK gene was transformed was prepared using a microinjection method for introducing a gene by micromanipulation.
또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 수득한 형질전환 동물을 제공하는 것이다.In another aspect, the present invention provides a transgenic animal obtained by implanting the fertilized egg into the uterus of the surrogate mother.
본 발명에서의 "형질전환 동물"이란 외부에서 도입된 유전자를 재조합하여, 이를 동물의 염색체 상에 인공적으로 삽입시킴으로써 그 형질의 일부가 변화된 동물을 의미하며, 동물의 종류는 자연계의 포유류라면 제한 없이 생산 가능하다.In the present invention, the "transformed animal" refers to an animal in which a part of its trait is changed by recombining an externally introduced gene and artificially inserting it on the animal's chromosome. Production is possible.
상기와 같이 제조된 형질전환된 동물은 전반적으로 모든 장기에서 TRESK mRNA 발현량이 증가하였으며, 특히 대뇌 (cerebrum) 및 비장 (spleen)에서의 발현량이 현저히 높았다. 이러한 발현은 mRNA 수준 뿐만 아니라 단백질 수준 모두에서 높은 발현 양상을 나타내었다. The transgenic animals prepared as described above showed an increase in TRESK mRNA expression in all organs, especially in cerebrum and spleen. This expression showed a high expression pattern both at the mRNA level as well as at the protein level.
TRESK가 과발현되는 형질전환된 동물은 정상 개체에 비해 코티졸 (cortisol) 호르몬의 농도가 낮게 유지되며, 포르말린 시험에 의해 유발되는 급성통증 회피반응을 유의적으로 높게 나타냈다. 또한 IL-13 (interleukin-13)이 유의적으로 증가함을 확인하였다. 따라서 이러한 형질전환된 동물은 통증관련 연구, 더욱 바람직하게는 TRESK와 관련된 무감각증 및 급성통증 질환과 같은 통증질환 연구 모델로 유용하게 사용될 수 있다. 또한 알레르기 반응 및 우울증 연구에도 활용될 수 있다.Transformed animals overexpressing TRESK maintained lower levels of the cortisol hormone and significantly higher acute pain avoidance responses induced by the formalin test. In addition, IL-13 (interleukin-13) was confirmed to increase significantly. Therefore, these transformed animals can be usefully used for pain-related studies, more preferably pain disease research models such as insensitivity and acute pain disorders associated with TRESK. It can also be used to study allergic reactions and depression.
또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 TRESK 유전자를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; 제조된 벡터를 수정란의 핵에 도입하는 단계; 및 상기 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 형질전환 동물을 수득하는 단계를 포함하는 TRESK를 과발현하는 형질전환 동물의 제조방법을 제공하는 것이다.In another embodiment, the present invention provides a method for preparing a vector comprising a TRESK gene; Introducing the prepared vector into the nucleus of the fertilized egg; And implanting the fertilized egg into the uterus of the surrogate mother to provide a transgenic animal.
보다 상세하게, 상기 방법은 (a) 프로모터, TRESK 유전자 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 제조한 벡터를 수정란에 도입하는 단계; 및 (c) 상기 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 형질전환 동물을 수득하는 단계를 포함하는 TRESK를 과발현하는 형질전환 동물의 제조방법에 관한 것이다. More specifically, the method comprises the steps of (a) preparing a vector comprising a promoter, a TRESK gene and a polyadenylation sequence; (b) introducing the prepared vector into a fertilized egg; And (c) implanting the fertilized egg into the uterus of the surrogate mother to obtain a transgenic animal.
상기 (a) 단계의 벡터는 TRESK 유전자를 수득하고 상기 유전자를 증폭시킨 후, 벡터에 삽입함으로써 제조될 수 있다. TRESK 유전자는 TRESK mRNA 추출물을 이용하여 역전사 (reverse transcription) 방법으로 하여 제조하거나, cDNA 라이브러리로부터 클로닝하여 수득할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시 예에서는 마우스의 TRESK 유전자를 마우스의 고환으로부터 수득한 후, 이를 역전사 중합효소 연쇄반응 (reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)을 이용하여 다량의 TRESK 유전자를 수득하였다.The vector of step (a) may be prepared by obtaining a TRESK gene, amplifying the gene, and inserting it into the vector. The TRESK gene can be prepared by reverse transcription using TRESK mRNA extract or obtained by cloning from cDNA library. In a preferred embodiment of the present invention, after obtaining the TRESK gene of the mouse from the testes of the mouse, a large amount of the TRESK gene was obtained by using reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR).
상기 (b) 단계에서는 TRESK 유전자 발현에 필요한 부위를 제외한 벡터의 나머지 부분을 제거하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 바람직한 실시예에서는 세 종류의 제한 효소 NruI, DraIII, ScaI으로 절단 한 후, 약 2.6 kb 의 조각을 DNA로 하여 마우스의 수정란에 도입하였다.In the step (b), it is preferable to remove the rest of the vector except for the region required for TRESK gene expression. Therefore, in a preferred embodiment of the present invention, after cutting with three kinds of restriction enzymes NruI, DraIII, ScaI, about 2.6 kb of fragment was used as a DNA and introduced into the fertilized egg of the mouse.
또한 상기 벡터의 수정란에의 도입방법은 상기 서술한 바와 같이, 미세주입법, 줄기세포 삽입 방법 (stem cell insertion technique), 레트로바이러스를 이용한 삽입 방법 (Retroviral insertion technique), 또는 정자-매개 유전자 전달 방법 (sperm-mediated gene transfer technique)등의 방법을 제한 없이 이용할 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시 예에서는 분리된 유전자를 웅성전핵에 직접 주입하는 미세주입법에 의해 형질전환된 마우스 수정란을 제조하였다. 또한 상기 수정란은 TRESK로 명명한 후 국제기탁기관인 한국생명공학연구소 유전자은행 (Korean Collection for Type Cultures)에 2008년 08월 01일자로 기탁하였다 (KCTC 11374BP).As described above, the method of introducing the vector into the fertilized egg may include a microinjection method, a stem cell insertion technique, a retroviral insertion technique, or a sperm-mediated gene delivery method ( A method such as sperm-mediated gene transfer technique) can be used without limitation, and in a preferred embodiment of the present invention, a mouse embryo that has been transformed by microinjection method of directly injecting an isolated gene into a male pronucleus was prepared. In addition, the fertilized egg was named as TRESK and was deposited on August 01, 2008 to the Korean Collection for Type Cultures, an international depository institution (KCTC 11374BP).
마지막 단계로서, 상기와 같이 형질전환된 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 형질전환 동물을 생산할 수 있다. As a final step, the transformed embryo can be implanted into the uterus of the surrogate mother to produce a transgenic animal.
상기와 같이 제조된 형질전환된 동물은 전반적으로 모든 장기에서 TRESK mRNA 및 단백질의 발현량이 증가하였고, TRESK가 과발현되는 형질전환된 동물은 정상 개체에 비해 코티졸 (cortisol) 호르몬의 농도가 낮게 유지되며, 포르말린 시험에 의해 유발되는 급성통증 회피반응이 유의적으로 높게 나타나고, IL-13 (interleukin-13)이 유의적으로 증가함을 확인하였다.The transgenic animals prepared as described above increased the expression levels of TRESK mRNA and protein in all organs overall, and the transfected animals overexpressing TRESK maintained lower levels of cortisol hormone than normal individuals. The acute pain avoidance response induced by formalin test was significantly higher and IL-13 (interleukin-13) was significantly increased.
바람직하게 본 발명의 형질전환 동물 모델은 통증 모델로 뿐만 아니라 우울증과 관련된 약물을 연구하는 질환 모델로 사용될 수 있다. 특히, 코티졸의 발현량 변화로써 우울증의 후보 약물을 스크리닝 할 수 있는데, 코티졸 (cortisol)은 부신피질에서 분비되는 호르몬으로서, 스트레스 및 우울증을 유발하는 것으로 알려져 있다. 즉, 코티졸 분비 자체는 상기 질환들에 대항하기 위해 분비되는 것이지만, 이 호르몬이 지속적으로 유지되는 경우, 장기적으로는 결국 몸을 손상시키는 기제가 된다. 만성적으로 코티졸이 분비되면 불안과 초조상태가 지속되고, 심해지면 우울증, 정신장애, 수면장애를 야기한다. 이와 관련하여 본 발명의 TRESK 유전자를 발현하는 동물에서 코티졸의 농도가 낮게 유지되는 것을 확인하였는바, 본 발명의 형질전환 동물을 이용하여 코티졸 분비와 관련한 우울증 질환 치료 약물의 스크리닝을 위한 스트레스 및 우울증 질환모델로 사용될 수 있다.Preferably, the transgenic animal model of the present invention can be used not only as a pain model but also as a disease model for studying drugs related to depression. In particular, it is possible to screen for candidate drugs of depression by changing the expression level of cortisol. Cortisol is a hormone secreted by the adrenal cortex and is known to cause stress and depression. That is, cortisol secretion itself is secreted to combat these diseases, but if this hormone is sustained, in the long run it will eventually damage the body. When chronically released cortisol, anxiety and anxiety persist, and worsening causes depression, mental disorders and sleep disorders. In this regard, it was confirmed that the concentration of cortisol is maintained in the animal expressing the TRESK gene of the present invention, stress and depressive diseases for the screening of the drug for the treatment of depression disease associated with cortisol secretion using the transgenic animal of the present invention. Can be used as a model.
또한 바람직하게 본 발명의 TRESK 유전자를 발현하는 형질전환 동물은 알레르기 질환모델로써 유용하게 사용될 수 있다. IL-13은 기도 과민성과 관련하여 분비되는 것으로 알려진 사이토카인 (cytokine)으로서, 다양한 세포 타입 (type)에서 분비된다고 알려져 있으며, 특히 알레르기 염증 및 알레르기 질환에 중요한 매개인자로 작용한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 TRESK 유전자를 발현하는 형질전환 동물에서 바람직하게 본발명의 TRESK 유전자를 발현하는 동물에서 알레르기 질 환과 관련된 IL-13의 분비가 증가하는 것을 확인하였는바, 후보 화합물을 상기 형질전환 동물에 처리한 후, IL-13 량의 변화를 확인함으로써, 상기 형질전환 동물을 알레르기 질환과 관련된 물질(촉진제 또는 억제제)을 스크리닝하거나 기관지천식 유도 실험동물 모델로 사용될 수 있다.In addition, preferably, the transgenic animal expressing the TRESK gene of the present invention may be usefully used as an allergic disease model. IL-13 is a cytokine known to be secreted in relation to airway hypersensitivity, and is known to be secreted from various cell types, and is an important mediator of allergic inflammation and allergic disease. In a preferred embodiment of the present invention, it was confirmed that the secretion of IL-13 associated with allergic diseases is increased in transgenic animals expressing the TRESK gene, preferably in an animal expressing the TRESK gene of the present invention. After treatment with the transgenic animals, the transgenic animals can be screened for allergic diseases (promoters or inhibitors) or used as bronchial asthma-induced experimental animal models.
이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by the following examples. However, these examples are only for carrying out the present invention by way of example, but the scope of the present invention is not limited to these examples.
본 발명의 형질전환 동물을 이용하는 경우, 개체 내에서 발현률이 매우 적고, 그 발현 양상 및 발현 분포에 대해 현재까지 명확하게 밝혀지지 않은 TRESK 유전자를 생체 모델인 개체 수준에서의 연구할 수 있다. 나아가 개체 내 여러 조직 또는 기관에서 발생할 수 있는 다양한 질병연구에 사용될 수 있으며, 특히 무감각증을 포함한 통증 관련 연구에 매우 유용할 것으로 기대된다. In the case of using the transgenic animal of the present invention, the expression rate and expression distribution of the TRESK gene in the individual can be studied at the individual level which is a biological model. Furthermore, it can be used for research on various diseases that can occur in various tissues or organs in an individual, and is expected to be very useful for research related to pain including insensitivity.
실시예 1: 유전자의 확보 및 재조합Example 1 Securing and Recombining Genes
TRESK 통로 유전자는 역전사중합효소방법(RT-PCR)에 의하여 마우스 고환으로부터 수득하였다. Taq 중합효소(Taq-polymerase)와 프라이머(primer)를 이용하여 TRESK 유전자(~1.2 kb, 도 1A 및 서열번호 1)를 증폭시키고, pcDNA3.1/V5-His-TOPO 벡터(5,523 bp)에 삽입하여, TRESK/pcDNA3.1/V5-His-TOPO 클론을 제조하였다(도 1B). TRESK 형질전환 마우스 제작을 위한 유전자 준비로 벡터 염기서열을 제거하기 위하여 세 종류의 제한효소(NruI/DraIII/ScaI)로 자른 후 ~2.6 kb의 조각을 미세주입용 DNA로 사용하였다(도 1C).TRESK pathway genes were obtained from mouse testis by reverse transcriptase method (RT-PCR). Amplify the TRESK gene (~ 1.2 kb, Figure 1A and SEQ ID NO: 1) using Taq-polymerase and primers and insert into pcDNA3.1 / V5-His-TOPO vector (5,523 bp) TRESK / pcDNA3.1 / V5-His-TOPO clone was prepared (FIG. 1B). In order to remove the vector sequence as a gene preparation for the production of TRESK transgenic mice, after cutting with three restriction enzymes (NruI / DraIII / ScaI), a fragment of ˜2.6 kb was used as the microinjection DNA (FIG. 1C).
실시예 2: TRESK 유전자 미세주입 및 형질전환 마우스의 생산Example 2: TRESK Gene Microinjection and Production of Transgenic Mice
C57BL/6N, 4~7주령의 암컷 마우스에 7 IU PMSG를 복강 주사하고 48 시간 후 hCG를 주사하여 과배란을 유도하였다. 수정란의 생산을 위해 hCG 복강 주사 후 바로 12주령의 수컷 마우스와 교미시켰다. hCG 복강주사 및 교미 18시간째 자성 마우스의 난관으로부터 접합자(zygote)를 회수하여 미세주입 실험에 사용하였다.C57BL / 6N, 4-7 week old female mice were intraperitoneally injected with 7 IU PMSG and hCG injection 48 hours later to induce hyperovulation. For production of fertilized eggs, mice were mated with 12-week-old male mice immediately after hCG intraperitoneal injection. At 18 h of hCG intraperitoneal injection and mating, zygote was recovered from the fallopian tubes of the magnetic mice and used for microinjection experiments.
미세주입기를 이용하여 준비된 DNA를 접합자의 웅성전핵에 주입 한 후 대리모의 난관에 수정란을 이식하여 형질전환 마우스를 생산하였다. Transgenic mice were produced by injecting DNA prepared using a microinjector into the male pronucleus of the conjugate and implanting fertilized eggs into the fallopian tubes of the surrogate mother.
정상 마우스와 교배하여 F1을 얻고, 생산된 자손은 발가락을 절단하여 게놈 DNA를 분리한 후, CMV 프라이머(5'-GGATAGCGGTTTGACTCACGG-3')와 TRESK 프라이머를 이용하여 연쇄중합효소반응을 실시한 후 유전자의 삽입을 확인하였다(도 1D). F1 was obtained by crossing with normal mice, and the produced offspring were isolated from genomic DNA by cutting their toes, followed by chain polymerase reaction using CMV primers (5'-GGATAGCGGTTTGACTCACGG-3 ') and TRESK primers. Insertion was confirmed (FIG. 1D).
형질전환 마우스의 수정란은 TRESK로 명명한 후 부다페스트 조약에 의거하여 국제기탁기관인 한국생명공학연구소 유전자은행 (Korean Collection for Type Cultures)에 2008년 08월 01일자로 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC 11374BP를 수여받았다.The fertilized egg of transgenic mice was named TRESK and was deposited on August 01, 2008 by the Korean Collection for Type Cultures, an international depository institution under the Budapest Treaty, and received the accession number KCTC 11374BP. .
실시예 3: 형질전환 마우스에서 TRESK 유전자 및 단백질의 과발현 확인Example 3: Confirmation of Overexpression of TRESK Gene and Protein in Transgenic Mice
형질전환 마우스의 각 기관별 TRESK mRNA 발현을 연쇄중합효소반응을 이용하여 GAPDH 유전자 발현에 비교하여 나타내었다 (도2A 및 2B). 대뇌(cerebrum), 소뇌(cerebellum), 척수(spinal cord, SC), 척수후근신경절(dorsal root ganglion), 흉선(thymus), 심장(heart), 간(liver), 허파(lung), 위(stomach), 비장(spleen), 신장(kidney), 고환(testis), 난소(ovary), 근육(muscle)에서 TRESK 유전자 발현량을 비교한 결과 전반적으로 모든 장기에서 TRESK 발현량이 증가함을 확인하였으며, 특히, 대뇌와 비장에서의 발현량은 현저하게 높아졌음을 확인하였다. 단백질로서 발현량을 함께 조사한 결과, 형질전환동물에서 TRESK 단백질 역시 대뇌, 소뇌, 척수, 척수후근신경절, 허파, 흉선, 비장 및 고환에서 증가하였다. TRESK mRNA expression of each organ of the transgenic mouse was shown in comparison with GAPDH gene expression using a chain polymerase reaction (FIGS. 2A and 2B). Cerebrum, cerebellum, spinal cord (SC), dorsal root ganglion, thymus, heart, liver, lung, stomach Comparison of TRESK gene expression in the spleen, kidney, testis, ovary, and muscle revealed that TRESK expression increased in all organs. The expression levels in cerebral and spleen were markedly increased. As a result of the expression level, the TRESK protein was also increased in the cerebrum, cerebellum, spinal cord, spinal cord ganglion, lung, thymus, spleen and testes.
실시예 4: TRESK 형질전환 마우스의 특징Example 4: Characteristics of TRESK Transgenic Mice
TRESK 형질전환 마우스는 정상 마우스에 비해 코티졸 호르몬 농도가 낮게 유지되는 것을 확인하였다(도3A).TRESK transgenic mice were found to maintain lower cortisol hormone concentrations compared to normal mice (FIG. 3A).
포르말린 시험은 통증유발 시험 모델 중 급성 통증 및 촉진성 통증 상태를 보여주는 특징적인 실험모델이다. 촉진성 상태는 국소적 조직 손상 후에 지속적인 구심성 자극에 의해 2차적으로 발생하며 아주 낮은 구심성 자극에도 불구하고 통증이 강화되어 있는 상태이다. 이러한 포르말린 통증모델의 장점은 급성 통증과 촉진성 통증 상태를 하나의 개체 (동물)에서 관찰 할 수 있다는 점이다. The formalin test is a characteristic experimental model showing acute pain and palpable pain states among pain-induced test models. The palpable state is secondary to sustained afferent stimulation after local tissue injury and is intensified with pain despite very low afferent stimulation. The advantage of this formalin pain model is that acute and palpable pain conditions can be observed in one individual (animal).
TRESK의 발현이 통증 감각과 어떠한 관련이 있는 지를 확인하기 위하여 TRESK 형질전환동물을 이용하여 포르말린 시험을 실시하였다. 오른쪽 뒷다리에 5% 포르말린을 주입한 후 60분 동안 통증에 의해 유발되는 발의 떨림과 들림 등 행위검사를 조사하였다. TRESK 형질전환동물에서 포르말린에 의해 나타나는 통증은 급성통증을 나타나는 일차 시기에서 통증회피반응이 유의적으로 높게 나타났다(도 3B).Formalin testing was performed using TRESK transgenic animals to determine how expression of TRESK was associated with pain sensation. After injecting 5% formalin into the right hind limb, behavioral tests such as tremor and foot movement caused by pain were examined for 60 minutes. In TRESK transgenic animals Pain caused by formalin was significantly higher in the avoidance of pain in the first phase of acute pain (FIG. 3B).
싸이토카인 변화를 측정한 결과, TRESK 형질전환동물에서 면역조절 싸이토카인인 IL-13 (interleukin-13)이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 3C). As a result of measuring cytokine changes, it was confirmed that IL-13 (interleukin-13), an immunoregulatory cytokine, was significantly increased in TRESK transgenic animals (FIG. 3C).
그 밖의 TRESK 형질전환동물에 있어서 사료섭취량 및 체중변화 등은 정상 쥐와 유의한 차가 없었다.In other TRESK transgenic animals, there were no significant differences in feed intake and body weight.
이상의 TRESK 형질전환 동물의 특징을 살펴본 결과 TRESK는 감각 및 운동 신경흥분작용, 특히 급성통증에 관여 되어 있을 것으로 예상된다. 또한 알레르기 반응 및 우울증 연구에도 활용될 수 있을 것으로 기대된다. Based on the above characteristics of TRESK transgenic animals, TRESK is expected to be involved in sensory and motor neurostimulation, especially acute pain. It is also expected to be used for allergic reactions and depression studies.
도 1은 본 발명의 형질전환 마우스를 생산하기 위하여 사용된 TRESK 유전자의 염기서열(A), TRESK와 pcDNA3.1/V5-His-TOPO의 클론 형성(B), 제한효소를 이용한 미세 주입 용 TRESK 유전자 준비(C) 및 미세조작에 의한 유전자의 수정란 내 주입과 산자생산 그리고 TRESK 형질전환 마우스의 확인(D)을 도식화한 그림이다.Figure 1 shows the nucleotide sequence of the TRESK gene (A), TRESK and pcDNA3.1 / V5-His-TOPO clone formation (B), TRESK for microinjection using restriction enzymes This is a schematic diagram of the injection, fertility production and identification of TRESK transgenic mice (D).
도 2는 형질전환 마우스의 TRESK mRNA 및 단백질의 발현량을 역전사중합효소반응과 웨스턴 블럿 분석 (Western blotting assay)(도 2B)를 통하여 확인하였다. mRNA 및 단백질의 발현량은 GAPDH와 베타액틴 (β-actin)의 기준량과 비교하였다.Figure 2 was confirmed by the expression of TRESK mRNA and protein of transgenic mice by reverse transcriptase and Western blotting assay (Fig. 2B). Expression levels of mRNA and protein were compared with reference levels of GAPDH and beta-actin.
도 3은 TRESK 형질전환 마우스에서의 코티졸 (cortisol) 농도, 통증 회피반응 및 싸이토카인(cytokine) 농도 변화를 정상 마우스와 비교한 결과이다. 3 shows the results of comparing cortisol concentration, pain avoidance response and cytokine concentration change in TRESK transgenic mice compared with normal mice.
<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY
<120> A TRANSGENIC ANIMAL OVEREXPRESSING TRESK GENE AND A METHOD FOR
PREPARING THE SAME
<130> PA090053/KR
<160> 2
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1185
<212> DNA
<213> mouse tresk gene
<400> 1
atggaggctg aggagccacc tgaggccagg agatgctgtc ccgaggccct ggggaaggcc 60
aggggatgct gccccgaagc cctgggcaag cttctgcccg gcctctgctt cctttgctgc 120
ctggtgacct atgcgctggt gggtgctgct ctcttctccg ctgtcgaggg ccgccctgac 180
ccagaagcag aggagaaccc tgagttgaag aagttcctgg acgatctgtg caacatcctg 240
aaatgtaacc tgacagtggt tgaaggtagc aggaagaact tgtgtgagca tctgcaacac 300
ctcaagcccc agtggctcaa ggcgccccag gactggtcct tcctgagcgc tctcttcttc 360
tgctgcacag tgttcagcac agtgggttat ggccacatgt accctgtcac caggctcggt 420
aagttcctgt gcatgctgta tgcgctcttt ggaatccctc taatgttcct ggtcctcaca 480
gacataggag atatcctggc caccatctta tccagggctt acagtcggtt ccaggctctc 540
ctttgcctcc cccacgatat cttcaaatgg cgctccctcc cgctctgccg gaagcagcct 600
gacagcaaac cggtggagga agccatccct cagattgtca ttgatgctgg tgtggatgaa 660
ctcctaaacc cgcagcccag caaggacccc ccctctccga gctgcaatgt ggagctgttt 720
gagagattag ttgcccgtga gaaaaagaac aagctacaac cacccacgcg tcccgtggag 780
aggagcaact cctgtcccga gctggtgctg gggcgactgt cctgttctat tctcagcaat 840
ctggatgaag tgggccagca ggtggagagg ctggacatcc ctctccccgt catcgccctg 900
gtcgtctttg catacatctc ctgcgcggct gctatcctcc ccttctggga gaccgagcta 960
ggcttcgagg atgctttcta cttctgcttt gtgacactga ccaccatcgg gtttggggac 1020
atcgtgctgg tgcaccctca tttcttcctc ttcttctcca tctacatcat cgtgggcatg 1080
gagatcctgt tcattgcctt caagctgatg cagaaccggc tcctgcacac ctacaaaacc 1140
ctcatgctgt ttgtttgcca aagggaagtt tcgctacctt ggtaa 1185
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for CMV promoter
<400> 2
ggatagcggt ttgactcacg g 21
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