KR20100104370A - 표피성장인자수용체 다모드 영상용 양자점 기반의 추적자 - Google Patents

표피성장인자수용체 다모드 영상용 양자점 기반의 추적자 Download PDF

Info

Publication number
KR20100104370A
KR20100104370A KR1020090022744A KR20090022744A KR20100104370A KR 20100104370 A KR20100104370 A KR 20100104370A KR 1020090022744 A KR1020090022744 A KR 1020090022744A KR 20090022744 A KR20090022744 A KR 20090022744A KR 20100104370 A KR20100104370 A KR 20100104370A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
quantum dot
growth factor
epidermal growth
tracer
biomolecule
Prior art date
Application number
KR1020090022744A
Other languages
English (en)
Inventor
이경한
정경호
최연성
Original Assignee
성균관대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 성균관대학교산학협력단 filed Critical 성균관대학교산학협력단
Priority to KR1020090022744A priority Critical patent/KR20100104370A/ko
Publication of KR20100104370A publication Critical patent/KR20100104370A/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/534—Production of labelled immunochemicals with radioactive label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Abstract

본 발명은 표피성장인자수용체 다모드 영상용 양자점 기반의 추적자에 관한 것으로 보다 구체적으로, 양자점 표면에 코팅된 생체분자와 특이적으로 결합하는 친화성 물질이 연결된 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol;PEG); 일 말단이 상기 폴리에틸렌글리콜와 컨쥬게이션된 표피성장인자(epidermal growth factor;EGF); 및 상기 생체분자에 표지된 방사성동위원소를 포함하는 것을 특징으로 하는 양자점(quantum dot) 기반의 추적자(tracer), 이를 포함하는 표피성장인자수용체 검출 키트 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 살아있는 개체 내 표피성장인자수용체를 양자점의 형광신호를 이용한 광학영상(optical imaging)과 방사능 신호를 이용한 감마카메라 영상으로 평가하여 다모드 (multimodality) 영상을 제공받을 수 있다.
양자점(quantum dot), 생체분자, 친화성 물질, 표피성장인자(epidermal growth factor;EGF), 표피성장인자수용체, 추적자(tracer), 다모드(multimodality)

Description

표피성장인자수용체 다모드 영상용 양자점 기반의 추적자 {Quantum Dot Based-Tracer for Multimodal Imaging of Epidermal Growth Factor Receptors}
본 발명은 살아있는 개체 내 표피성장인자수용체를 다모드 영상하기 위한 양자점 기반의 추적자, 이를 포함하는 표피성장인자수용체 검출 키트, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
현재까지 임상에서 적용된 항암제는 암세포의 증식을 억제하는데 초점이 맞춰져 있었다. 그러나 이러한 항암제는 정상세포에도 작용하므로 각종 부작용을 초래하며 계속적인 투여시 약제 내성이 생기는 문제점도 있다. 이에 최근에는 암세포에만 존재하는 특정분자를 표적으로 하여 암세포만 살해하는 이상적인 항암약제가 개발되고 임상시험 중에 있다. 신 항암제의 표적으로는 암세포의 성장에 필요한 성장인자 수용체가 있다. 암세포 성장에 중요한 역할을 하는 표피성장인자수용체를 공략하는 약제가 많은 기대를 모으고 있다.
표피성장인자수용체는 단일 사슬 세포막 당단백질(glycoprotein)로 암의 성장과 침투, 그리고 원격전이에 중요한 생물학적 반응을 조절하는 신호전달경로(signaling pathway)를 매개한다. 표피성장인자수용체는 ErbB1 혹은 HER1 수용체라고도 하며 ErbB2/HER2, ErbB3/HER3, ErbB4/HER4을 포함하는 수용체 티로신 키나제 (receptor tyrosine kinase) 가족에 속한다 (Yarden Y, Sliwkowski M. Untangling the ErbB signaling network. Nat Rev Mol Cell Biol 2001;2:127-137).
표피성장인자수용체의 구조는 세포외 리간드 (ligand) 결합 영역과 짧은 세포막 관통 영역, 그리고 세포내 티로신 키나제 영역으로 구성되어 있으며, 세포외 영역에 표피성장인자리간드가 결합하면 수용체가 이합체(dimmer)를 형성하면서 자가인화(autophosphorylation)되어 활성화된다. 활성화된 수용체는 Src homology-2나 phosphotyrosine 결합영역을 지닌 세포질 단백질에 대한 docking site를 제공한다 (Hynes NE, Lane HA. ErbB receptors and cancer: the complexity of targeted inhibitors. Nat Rev Cancer 2005;5:341-354).
많은 암에는 표지성장인자와 표피성장인자수용체 결합이 증가되거나 표피성장인자수용체 발현이 높거나, 혹은 리간드와는 독립적 활성화 기전을 활용하여 표피성장인자수용체 신호가 항진되어 있다. 이중에서도 표피성장인자수용체의 발현증가가 질병에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는바, 비소세포성 폐암 대부분의 경우 정상세포의 10 배 정도, 유방암의 30-60%는 정상의 100 배까지 발현이 증가되어 있다. 그밖에 대장암, 방광암, 뇌암 등에서도 표피성장인자수용체 증가가 관찰된다. 더구나 표피성장인자수용체 증가는 환자에게 나쁜 예후를 주는 것으로 알려져 있다.
이와 같이 최근, 암의 진행에 있어서 표피성장인자수용체 역할의 중요성과 그 기작에 대한 이해가 늘어나면서 이를 공략하는 두 종류의 유망한 치료약제 종류가 개발되어 임상 환자에 적용되고 있다.
이 두 종류는 표피성장인자수용체의 세포외 영역을 공략하는 항체와 세포내 티로신 키나제 영역을 공략하는 저분자량 ATP-경쟁적 억제제 항암신약이다. 표피성장인자수용체에 대한 항체는 현재 대장암과 두경부암의 치료에 임상적용되고 있고, gefitinib (Irressa)과 erlotinib (Tarceva)로 시판되고 있는 티로신 키나제 억제제는 비소세포성 폐암과 췌장암에 적용되고 있다.
그런데, 이들에 대한 지금까지의 임상적용 결과로는 환자의 일부에만 유의한 치료효과가 관찰되고 있다. 그 이유는 치료제의 표적인 표피성장인자수용체의 양을 확인하지 않고 치료 대상을 선정하였기 때문인 것으로 판단되고 있다. 따라서 표피성장인자수용체를 표적으로 한 암치료 기술이 성공하기 위해서는 표피성장인자수용체의 양을 비관혈적으로 평가할 수 있는 방법이 필요하다.
또한, 종래에는 조직을 채취해서 미세절편을 만들고 면역화학적 염색을 하여 현미경으로 준정량적인 점수를 매기거나 Western blot로 표피성장인자수용체 단백질 밴드의 강도를 측정하였다. 그러나 이들 방법은 침습적인 시술을 요구하기 때문에 환자에게 고통을 줄 뿐아니라 반복적으로 시행할 수 없고 어느 부위의 조직을 채취하는지에 따라 수집오류가 크고 결과의 정량화가 어려운 등 여러가지 단점이 있다.
이에, 표피성장인자수용체를 비침습적으로 영상하는 새로운 기술의 개발이 요구되고 있으며, 이를 위해서는 분자수준 변화를 표적할 수 있는 분자영상기술의 개발이 절실하다.
표피성장인자수용체 영상을 위한 기술의 일환으로 표피성장인자를 리간드로 하는 추적자를 사용할 수 있다. 그러나 이중 123I와 같은 방사성 옥소로 표지하는 추적자는 체내에서 탈옥소화 될 수 있다는 단점이 있다(Cuartero-Plaza A, Martinez-Miralles E, Rosell R, Vadell-Nadal C, Farre M, Real FX. Radiolocalization of squamous lung carcinoma with 131I-labeled epidermal growth factor. Clin Cancer Res 1996;2:13-20). 또한, 표피성장인자에 99mTc을 표지한 추적자도 개발되었고 (Rusckowski M, Qu T, Chang F, Hnatowich DJ. 99mTc labeled 　epidermal growth factor-tumor imaging in mice. J Pept Res 1997;50:393-401, Babaei MH, Almqvist Y, Orlova A, Shafii M, Kairemo K, Tolmachev V. [99mTc] HYNIC-hEGF, a potential agent for imaging of EGF receptors in vivo: preparation and pre-clinical evaluation. Oncol Rep 2005;13:116911-116915) 111In을 표지한 추적자도 개발된 바 있다 (Reilly RM, Kiarash R, Sandhu J, Lee YW, Cameron RG, Hendler A, et al. A comparison of EGF and MAb 528 labeled with 111In for imaging human breast cancer. J Nucl Med 2000;41:903-911). 그러나 방사성동위원소가 표지될 수 있는 표피성장인자의 residue가 여럿 있기 때문에 이들 추적자는 실제로는 여러가지의 비균일한 화학적 구조의 추적자가 될 뿐만 아니라, 각각의 체내 동태나 수용체 결합 성질이 다를 수 있다는 점, 체내에서 혈중 제거율이 지나치게 빨라 높은 암 섭취를 얻을 수 없다는 점, 그리고 현미경학적 수준에서 수용체를 추적할 수 없다는 점 등 여러가지 단점이 있다.
이에, 본원의 발명자들은 표피성장인자를 양자점에 부착하는 동시에 방사성 표지함으로써 체내 동태 개선과 영상 대조도 향상을 통하여 표피성장인자의 발현을 비관혈적으로 영상할 수 있음을 발견하고 본원발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 표피성장인자수용체 다모드 영상용 양자점 기반의 추적자, 이들을 포함하는 표피성장인자수용체 검출 키트 및 이들의 제조방법을 제공하는 것이다.
일 양태로 본 발명은 양자점 표면에 코팅된 생체분자와 결합하는 친화성 물질이 연결된 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol;PEG); 일 말단이 상기 폴리에틸렌글리콜와 컨쥬게이션된 표피성장인자(epidermal growth factor;EGF); 및 상기 생체분자에 표지된 방사성동위원소를 포함하는 것을 특징으로 하는 양자점(quantum dot) 기반의 추적자(tracer)를 제공한다.
상기 양자점은 직경이 수 나노미터에서 수십 나노미터에 이르는 구형의 물질로서, 입자의 크기에 따라서 다른 파장의 형광을 방출하는 특징을 가진다. 양자점은 UV에서 붉은색까지 어느 파장으로도 여기(excitation)가 가능하며, 조절가능한 좁은 방출 스펙트럼을 갖는다. 무기물이므로 화학반응에 안정하고 표면의 처리에 의하여 생체분자와의 결합(컨쥬게이션)이 용이하다. 양자점을 이용하면 장시간에 걸친 레이저광의 조사에도 방출강도의 손실 없이 연속적으로 살아있는 세포의 영상을 얻을 수 있을 뿐만 아니라 장시간 연속적으로 조사하여도 세포로부터 나오는 신 호의 량이 일정하고, 또한 암세포 외 다른 세포에 해를 주지 않고 안정적으로 레이블되어 광안정성이 우수하고 실시간으로 연속적인 모니터링이 가능하다. 양자점은 기존의 fluorophore이 갖고 있는 대부분의 단점을 극복할 수 있고, red 파장을 이용하면 조직 투과력을 높일 수도 있다.
양자점은 입자의 크기에 따라 특정 파장의 형광을 발산하므로 공초점현미경(confocal microscopy)로 추적할 수 있고 광학영상장비(optical imaging device)로 살아있는 개체에서 그 위치를 영상할 수도 있다. 또한, 양자점의 표면에 생체분자가 코팅되어 있으면 생체분자와 특이적 결합을 하는 친화성 물질을 함유한 수용체 표적용 펩티드 리간드를 부착하기도 용이하다.
양자점은 중심(core)과 주로 ZnS 등으로 이루어진 쉘로 구성되며 중심은 나노크기의 Ⅱ~Ⅳ 반도체 입자로 예를 들어, CdSe, CdTe, CdS가 포함된다. 본 발명 실시예에서의 양자점은 카드뮴셀레나이드(Cd/Se) 코어에 황화아연(ZnS) 쉘을 입혔다. 양자점은 다양한 크기가 상품화(Invitrogen 혹은 Evident Technologies)되어 있다.
본 발명에서, 양자점은 표면 처리 후 생체분자와 컨쥬게이션되어 양자점 표면이 생체분자로 코팅될 수 있다. 양자점을 생체에 적용하기 위해서는 수용성을 높이면서 생체분자가 결합할 수 있도록 캡교환(cap exchange) 또는 표면변형(surface modification) 방법으로 표면을 처리하는 과정을 거친다. 전자의 경우 양자점 표면을 dihydroxylipoic acid (DHLA) 등 티올기(thiol)를 포함한 화학물질로 캐핑교환한 다음 여기에 생체분자를 코팅할 수 있으며, 후자의 경우에는 양자점 표면에 양 친매성 폴리머(amphiphilic polymer)를 붙인 다음 그 카르복시기 산(carboxyl acid) 그룹에 N-ethyl-N'-dimethylaminopropyl-carbodiimide (EDC)를 반응시켜 생체분자를 코팅할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 후자의 방법으로 EDC를 이용하여 streptavidin으로 코팅된 양자점을 사용하였다. Avidin 계열 단백질을 코팅할 경우에는 biotin을 컨쥬게이션한 각종 단백질을 양자점에 쉽게 결합시킬 수 있다는 장점이 있다.
본 발명의 도 4는 본 발명의 양자점 기반의 추적자가 살아있는 세포의 표피성장인자수용체에 결합하는 양상을 보여준다. MDA-MB-468 유방암 세포를 공초점 형광현미경으로 관찰한 결과 양자점 기반의 추적자가 세포핵(푸른색)과는 구별되어 세포막에 결합함이 뚜렷하게 확인되었다(붉은색).
또한, 본 발명의 도 5는 양자점 기반의 추적자에 의해 표피성장인자수용체가 활성화되는 양상을 보여준다. MDA-MB-468 사람 유방암 세포를 5 nM 표피성장인자 혹은 양자점 기반의 추적자로 2 분간 자극할 때 총 표피성장인자수용체(total EGFR)와 활성화된 표피성장인자수용체(p-EGFR)를 Western blot 후 chemiluminescence 검출시스템으로 조사한 결과, 양자점 기반의 추적자가 표피성장인자처럼 강한 표피성장인자수용체 활성화 능력이 있음이 확인되었다.
또한, 도 9는 양자점 기반의 추적자의 체외 광학영상 소견을 보여준다. MDA-MB-468 암을 피하이식한 마우스에 꼬리정맥에 정맥주사하고 4 시간 후 주요 장기와 암조직을 적출해서 시행한 광학영상에서 간(위쪽 3번째)과 신장(아래쪽 2번째) 유 사한 정도로 높은 암 섭취(아래쪽 4번째)가 확인되었다.
본 발명에서의 친화성 물질은 생체분자에 친화력을 가지는 물질을 의미한다. 선택된 분자의 특정 작용기 또는 결합 잔기가, 표적 생체분자와 선택적으로 결합하여 화학적으로 부착되는 원리에 의존한다.
친화성 물질은 생체분자와 간접적으로 즉 예를 들어, 스페이서 가지(arm), 그룹, 분자, 브릿지, 운반체, 또는 특이적 인지 파트너의 개입을 통하여, 또는 직접적으로 예를 들어, 스페이서 가지, 그룹, 분자, 브릿지, 운반체, 또는 특이적 인지 파트너 없이 결합할 수 있다. 이온결합, 소수성 상호작용, 리간드-뉴클레오타이드 결합, 킬레이팅제/금속 이온 쌍 또는 특이적 결합으로 결합(interaction)된 상태가 될 수 있다.
하기 예로 든 친화성물질 중 펩티드 또는 단백질은 키메라와 위상적인 구조의 변경, 활성 도메인에 다른 아미노산을 유입, 치환하거나 재배열되었으되 생체분자와 친화력를 이룰 수 있는 것이라면 본 범주에 포함한다.
본 발명의 생체분자 및 상기 생체분자와 결합하는 친화성 물질은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 생체분자 및 생체분자와 특이적으로 결합하는 친화성 물질인 것이 바람직하다.
생체분자 생체분자와 특이적으로 결합하는 친화성 물질

스트렙트아비딘(streptavidin),
아비딘 (avidin),
뉴트라비딘(neutravidin)
및
캡트아비딘(captavidin)
 비오틴(biotin; A)
플루오세인 안티-플루오세인
퍼옥시데이즈(peroxidase ) 안티-퍼옥시데이즈
디니트로페놀(DNP) 항-2,4-디니트로페놀(anti-2,4-dinitrophenol )
디곡시제닌 항-디곡시제닌(anti-digoxigenin)
본 발명의 실시예에서는 양자점에 코팅된 생체분자로 스트렙트아비딘(streptavidin)을 사용하였다. 이에, 실시예에서의 양자점은 스트렙트아비딘이 코팅된 반도체 나노입자인 카드뮴셀레나이드/황화아연 (CdSe/ZnS) 계열의 양자점(streptavidin-coated quantum dot, 이하 QD-SA, Invitrogen)을 사용하였다. QD-SA를 사용할 경우에는 첫째, 스트렙트아비딘이 단백질이기 때문에 양자점을 표면에 부착시키기가 용이하고, 둘째는 스트렙트아비딘-비오틴 결합에 의해 양자점 표면에 표피성장인자를 많은 수로 강하게 결합시킨 후 세척과정에 의해 비특이적 결합을 줄일 수 있으며, 셋째는 스트렙트아비딘-바이오틴 결합에 의해 기질이 양자점위에서 일정한 간격을 유지함으로써 표피성장인자수용체가 표피성장인자에 효과적으로 접근하여 분해할 수 있는 공간을 제공해 줄 수 있다는 이점이 있으나(도 1), 본 발명의 양자점 및 생체분자가 이에 한정되지않음은 당연하다.
본 발명에서의 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene Glycol;PEG)은 추적자의 체내 안정성을 높여 파괴를 줄이고 혈중 반감기를 늘리는 등 약리동 태(pharmacokinetics)를 영상에 유리하도록 향상시키고 면역반응 부작용을 최소화하는 장점이 있다.
폴리에틸렌글리콜은 폴리에틸렌글리콜의 일 말단에 있는 친화성물질을 양자점 표면의 생체분자에 강력하게 결합시키고, 동시에 표피성장인자와 양자점 사이의 연결 역할을 하면서 둘 사이의 일정 거리를 유지하도록 하여 표피성장인자가 수용체에 결합하는데 지장을 받지 않게 하는 역할을 한다. 폴리에틸렌글리콜이 표피성장인자의 기능에 지장을 주지 않고 여러가지 결합형태가 생기지 않도록 하기 위해서, 표피성장인자펩티드의 아민기 중에서 말단 아민기하고 단일 결합(모노-컨쥬게이션)시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 양자점의 표면에 5-10 개의 생체분자를 코팅한 경우 비슷한 수의 비오틴-폴리에티렌글리콜을 부착시킬 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 양자점을 전자현미경으로 확인한 결과 추적자의 직경이 양자점과 유사한 15-20 nm 정도 였고 양자점끼리 집결되는 문제가 없었다(도 2). 도 2는 양자점(왼쪽)과 폴리에티렌글리콜을 포함한 본 발명의 추적자(오른쪽)의 투과전자현미경(transmission electron microscopy) 결과를 나타내 이를 보여주고 있다.
본 발명의 양자점 기반의 추적자는 상기 생체분자에 표지된 방사성동위원소를 포함한다.
방사성동위원소의 부착으로 감마카메라를 이용한 체내 영상이 가능하며, 각 장기의 시간별 분포를 정량적으로 평가할 수 있어 표피성장인자수용체 추적자로서 유용하다.
방사성동위원소에는 99mTc-DTPA-, 99m Tc-MAG3-, 99m Tc(CO)3-, 111In-DOTA-, 123I나 131I 혹은 124I, [123I/131I/124I]iodobenzoyl-,3-(4-hydroxy-3-[123I/131I/124I]iodophenyl)propionyl-, [18F]fluoroacyl-, [18F]fluorobenzyl-, 68Ga-NOTA-, 68Ga-DOTA- 등 이 포함될 수 있으나, 바람직하게는 상기 방사성동위원소는 하이드라지노니코티나마이드(hydrazinonicotinamide;HYNIC)를 통해 생체분자에 결합된 99mTc이다.
상기 99mTc 표지는 저렴하고 모든 대형 의료기관에 설치된 감마카메라로 영상을 얻을 수 있다는 장점이 있다.
또한, 상기 Hydrazinonicotinamide (HYNIC)은 양측기능성(bifunctional) 킬레이트제제로서 펩티드나 단백질에 방사성동위원소를 표지하는데 널리 사용된다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 양자점의 표면에 있는 스트렙타비딘에 HYNIC을 결합시킨 다음 99mTc을 반응시켜 표지시켰다.
도 3은 99mTc 표지된 추적자 합성 반응액의 PD-10 컬럼 크로마토그래피 소견을 나타낸 것이다. 0.5 ml 분획의 방사능 계수 히스토그람에서 첫 절정은 99mTc 표지된 추적자에 해당하고 뒤쪽 방사능은 결합하지 않은 유리 99mTc에 해당한다.
또한, 도 7은 정상 마우스의 99mTc 표지된 추적자 혈중 동태를 분석한 결과이다. 99mTc 표지된 추적자를 정맥주사하고 나서 혈중 방사능이 장기분포 속도를 반영하는 T1/2(alpha) 값이 1.2 분이었으며 배출속도를 반영하는 T1/2(beta) 값이 26.6 분이었다. 혈중 배출율 상수 중 K1가 0.598, K2가 0.026 이었다.
도 10은 99mTc 표지된 추적자 체내 감마카메라 영상 결과이다. 본 발명의 실시예에 따라 MDA-MB-468 암이식 마우스에 양자점을 꼬리정맥에 주사하여 4 시간 때 바늘구멍 조준기 부착 감마카메라로 획득한 영상에서 암 섭취가 높은 대조도로 관찰되었고 (왼쪽), EGF 수용체에 대한 항체로 3일간 치료한 동물에서는 암의 섭취가 유의하게 저하되었다(오른쪽).
본 발명의 실시예에 따른 양자점 기반의 방사선동위원소 표지된 추적자의 구조 모식도를 도1에 나타내었다.
본 발명의 추적자는 표피성장인자수용체와 높은 결합 친화도를 가진다. 도 6은 이를 보여주는바, 본 발명 추적자의 표피성장인자수용체 결합 동태를 분석한 결과이다. MDA-MB-468 사람 유방암 세포 (왼쪽)와 A431 사람 폐암세포 (오른쪽)의 1시간 99mTc 표지된 추적자 결합에 의한 방사능이 결합하는 표피성장인자의 농도에 따라 억제되었고 결합 친화도 IC50 값이 각각 66.4 nM과 43.8 nM로 측정되었다.
또한, 도 8은 MDA-MB-468 피하이식한 누우드 마우스의 본발명 추적자 체내 분포 분석한 결과이다. 추적자를 정맥주사하고 4시간 경과 후 장기별 추적자 분포를 측정한 결과, 암의 섭취가 혈중 방사능에 비해서는 3.8배에 달하였고 근육에 비해서는 6.0배에 달하였다. 암의 섭취 비율이 높음을 알 수 있다.
다른 양태로 본 발명은 상기 양자점 기반의 추적자를 포함하는 표피성장인자수용체 검출 키트를 제공한다.
또한, 다른 양태로 본 발명은 상기 양자점 기반의 추적자를 포함하는 암 영상진단용 키트를 제공한다.
또한, 다른 양태로 본 발명은 생체분자로 코팅된 양자점을 준비하는 단계; 표피성장인자의 일 말단에 친화성 물질이 연결된 폴리에틸렌글리콜을 컨쥬게이션시키는 단계; 상기 친화성 물질과 양자점에 코팅된 생체분자를 반응시키는 단계; 및 상기 생체분자에 하이드라지노니코티나마이드(hydrazinonicotinamide;HYNIC)를 결합시키고 방사성동위원소를 표지시키는 단계;를 포함하는 양자점 기반의 추적자 제조방법을 제공한다.
양자점에 의한 광학신호와 방사성동위원소에 의한 감마신호로 표피성장인자수용체와 결합하는 본 추적자를 검출하고 영상할 수 있다. 따라서, 본 추적자는 현 재 국내외에 널리 보급되어 있는 광학영상장비와 감마카메라기기로 영상할 수 있는 다모드(multimodality) 추적자인바 적용범위가 넓고 시장수요가 많을 것으로 예상된다.
또한, 본 발명의 추적자는 몸 속 암조직의 표피성장인자수용체를 공략하는 항암신약 개발과 치료효과 평가 등에 이용될 수 있다.
뿐만 아니라, 표지성장인자수용체 비관혈적 정량을 위한 도구로 이용하여 관련 생물학 분야 발전에 기여할 수 있고, 전임상시험 단계에서 동물 암의 표피성장인자수용체 발현 평가용 도구로 이용하여 신약 개발기간 단축을 통한 제약산업 비용절감을 기대할 수 있으며, 표피성장인자수용체 공략 항암신약의 치료대상 선정과 치료효과 평가 등에 이용하여 암정복 보건의료 사업에 기여할 것으로 기대된다.
제조예 1: 단일 biotin-PEG가 부착된 표피성장인자와 HYNIC- 99m Tc가 결합된 양자점의 합성
사람 표피성장인자펩티드에 biotin-PEG를 붙이고 이를 양자점에 코팅된 스트렙트아비딘(streptavidin)에 결합시킨 다음 양자점에 또 HYNIC을 부착하고 여기에 99mTc를 표지하는 순서로 진행된다.
먼저, Cd/Se 코어 바깥에 ZnS 쉘을 입힌 양자점을 Invitrogen(Paisley, UK)에서 구입하여, 폴리머로 처리한 표면 처리 후 스크렙트아비딘과 컨쥬게이션시켜 표면을 코팅하였다. 그 다음, 표피성장인자 100㎍ (10㎕)과 biotin-PEG 100 ㎍ (1㎕)을 (몰비 1:1) 100 mM sodium acetate 버퍼 (pH 5.5) 89㎕에 섞고 실온에서 밤새 반응시켜 표피성장인자를 말단 아민기에 단일 PEGylation한다. 산물의 정제를 위해서 반응액을 차단분자량 (molecular cutoff) 7000 용량의 protein desalting spin 컬럼에 2분간 원심분리하여 결합하지 않은 EGF와 biotin-PEG 제거한다. 다음 과정에서는 합성한 EGF-PEG-biotin 50㎕를 1 μM스트렙트아비딘이 코팅된 양자점 30㎕과 섞어 (몰비 90:1) 실온에서 30 분간 streptavidin- biotin 결합이 일어나도록 반응시킨다. 마지막 과정에서는 EGF-PEG-biotin이 부착된 양자점에 코팅된 스트렙트아비딘을 1 mg/ml hydrazinonicotinamide (HYNIC) 20㎕과 섞어 실온에서 밤새 교반하여 반응한 다음 2분간 spin 컬럼 원심분리로 결합하지 않은 HYNIC를 제거한다. N2 가스로 20 분간 정화시킨 멸균 증류수 2.5 ml 에 tricine 50 mg을 녹여 114 mM tricine 버퍼를 만든다(①). Tricine 버퍼 1.5 ml에 1 N NaOH 를 19.5 ㎕ 넣어 pH 7.1로 맞추고 N2로 20 분간 정화시킨다. 50 mg SnCl2·H2O를 N2로 20 분간 정화시킨 0.1N HCl 1 ml에 녹인 후, 이 용액 18㎕를 tricine buffer에 넣고 다시 N2로 20 분간 정화시켜 tin-tricine 용액을 만든다. Tricine 버퍼(①) 150㎕에 99mTc 100㎕ (370 MBq)를 섞고 N2로 15 분간 정화한 후 정제된 HINIC를 부착시킨 PEG-EGF-양자점 100㎕ 와 tin-tricine 용액 12.7㎕를 넣고 25℃에서 1시간 방사성표지 시킨다. 반응을 마친 화합물을 PD-10 컬럼에 걸고 PBS를 통과시키면서 0.5 ml씩 분획을 튜우 브에 모은 다음 각 분획의 방사능 계수를 측정하여 첫 절정에 해당하는 99mTc 표지 양자점을 표지 되지 않은 99mTc과 분리 정제하여 사용하며 약 20%의 방사성 표지효율을 얻었다(도 3).
실시예 1: PEG-EGF 양자점의 암세포 EGF 수용체 결합 소견
표지성장인자수용체를 다량 발현하는 MDA-MB-468 사람 유방암 세포를 Histobond Adhesion Microscope Slides (Marienfeld, Germany)에 배양하여 일부는 FITC가 부착된 항 표지성장인자수용체 항체와 반응시킨 다음 공초점 형광현미경(Radiance 2100 confocal laser scanning microscopy (Bio-Rad Inc., USA))으로 관찰하고 일부 세포는 양자점 기반의 양자점 기반의 99mTc-HYNIC PEG-표피성장인자 추적자와 37℃에서 30 분간 반응시킨 다음 적절한 방출필터를 이용하여 관찰하였다, 그 결과 양자점 기반의 양자점 기반의 99mTc-HYNIC PEG-표피성장인자 추적자가 암세포 표면에 결합하는 모습이 확인되었다(도 4).
실시예 2: 양자점 기반의 99m Tc-HYNIC PEG-표피성장인자 추적자 결합에 의한 EGF 수용체 활성화 능력
MDA-MB-468 유방암 세포를 5 nM EGF 또는 양자점 기반의 양자점 기반의 99mTc-HYNIC PEG-표피성장인자 추적자로 2 분간 자극한 다음 PBS로 세척하고 PRO-PREPTM 단백질 적출 용액 (iNtRON Biotechnology, Inc.)에 4℃에서 15 분간 용해시켰다. 14,000rpm에서 10 분간 원심분리하여 얻은 상층액은 단백질 농도 분석 시험한 후 샘플을 100℃ 에 5분간 처리한 다음 10% SDS-PAGE 겔에 전기영동한 뒤 nitrocellulose 막에 옮기고 총 표피성장인자수용체에 대한 항체 또는 활성화된 표피성장인자수용체에 대한 항체와 반응시킨 뒤에 항-마우스 이차 항체와 반응시키고 chemiluminescence 검출시스템으로 수용체 밴드를 관찰하였다. 그 결과 양자점 기반의 양자점 기반의 99mTc-HYNIC PEG-표피성장인자 추적자가 표피성장인자수용체를 강력하게 활성화함을 확인하였다(도 5).
실시예 3: 암세포의 표피성장인자수용체를 표적하는 세포 결합동태 분석
양자점 기반의 양자점 기반의 99mTc-HYNIC PEG-표피성장인자 추적자의 표피성장인자수용체 결합동태를 측정하기 위해 A431 폐암세포와 MDA-MB-468 유방암 세포에 79 kBq의 양자점 기반의 양자점 기반의 99mTc-HYNIC PEG-표피성장인자 추적자를 첨가하고 37℃에서 1시간 반응한 다음 PBS로 세척하고 고에너지 감마선 계측기로 세포에 결합한 방사능양을 정량하였다. 그 결과, 표피성장인자수용체에 대한 항체 100μM 를 처리한 경우 추적자의 세포 결합이 대조군의 10% 이하로 억제되어 표적 결합 특이도가 90%가 넘음을 확인하였다. 여러 농도의 표피성장인자로 수용체 결합 에 대한 경합을 시킨 결과 표피성장인자농도에 비례하여 양자점 기반의 양자점 기반의 99mTc-HYNIC PEG-표피성장인자 추적자 결합이 감소되었고 결합 친화도를 반영하는 IC50 값이 각각 44 nM과 66 nM로 높게 측정되었다 (도 6).
실시예 4: 프로브의 혈중 약리동태와 암모델 마우스 체내분포 측정
정상 ICR 마우스에 양자점 기반의 양자점 기반의 99mTc-HYNIC PEG-표피성장인자 추적자를 꼬리정맥에 주사하여 2 분에서 4 시간 사이에 정맥혈을 반복적으로 채취하여 고에너지 감마선 계측기로 혈중 방사능양을 정량한 결과 T1/2(alpha) 값이 1.2 분, T1/2(beta) 값이 26.6 분이었고, K1 값이 0.598, K2 값이 0.026 이었다(도 7).
MDA-MB-468 사람 유방암을 어깨에 피하이식한 Balb/C 누우드 마우스에 양자점 기반의 양자점 기반의 99mTc-HYNIC PEG-표피성장인자 추적자를 꼬리정맥에 주사하고 4시간에 걸쳐 그 분포를 측정한 결과 4시간 때 암 섭취가 0.99±0.69 % injected-dose/gram-tissue 였고 혈중 방사능의 3배 이상, 근육에 비해 5배 이상의 높은 섭취를 보였다 (도 8).
실시예 5: 동물모델의 광학영상장비를 이용한 암 영상
MDA-MB-468 암을 피하이식한 마우스에 양자점 기반의 99mTc-HYNIC PEG-표피성 장인자 추적자를 꼬리정맥에 주사하여 2 시간과 3시간 때 광학영상장비(Xenogen Spectra imaging system)를 이용하여 형광영상을 얻은 결과 암조직의 양자점 섭취를 영상할 수 있었고 2 시간에 비하여 3 시간째에 더 증가하는 양상이었다. 4 시간 때 마우스를 희생하고 주요 장기와 암조직을 적출해서 체외 광학영상을 시행한 결과 높은 암 섭취가 확인되어 간과 신장 섭취와 유사하였으며 근육 섭취는 낮았다 (도 9).
실시예 6: 동물모델에서 감마 카메라를 이용한 암 영상
MDA-MB-468 암이식 마우스에 양자점 기반의 99mTc-HYNIC PEG-표피성장인자 추적자를 꼬리정맥에 주사하여 4 시간이 되었을 때 2 mm 직경의 바늘구멍 조준기를 부착한 감마카메라(Monad XLT, Trionix Research Laboratory)로 140 keV 중심의 15% 에너지 창으로 15 분 영상을 획득하였다. 그 결과 연조직 배후 방사능은 낮으면서 암 섭취가 높은 대조도로 관찰되었다. 일부 동물에서 표피성장인자수용체에 대한 항체로 3일간 치료한 뒤에 양자점 기반의 99mTc-HYNIC PEG-표피성장인자 추적자를 주사하고 감마카메라 영상을 얻은 결과 암의 섭취가 유의하게 저하됨을 관찰하였다 (도 10).
이상 바람직한 실시예에 근거하여 본 발명을 설명하였지만, 이러한 실시예는 본 발명을 제한하려는 것이 아니라 예시하는 것이다. 본 발명이 속하는 분야의 통 상의 기술자에게는 본 발명의 기술사상을 벗어남이 없이 전술한 실시예에 대한 다양한 변경이나 조절 등이 가능할 것이다. 그러므로, 본 발명의 보호범위는 후술하는 청구범위에 의해서만 한정될 것이며, 전술한 실시예에 의하여 제한적으로 해석되어서는 안 될 것이다.
도 1은 양자점 기반의 추적자의 구조를 보여주는 모식도이다.
도 2는 양자점(왼쪽)과 양자점 기반의 추적자(오른쪽)의 투과전자현미경(transmission electron microscopy) 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 양자점 기반의 추적자 합성 반응액의 PD-10 컬럼 크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 양자점 기반의 추적자가 살아있는 세포의 표피성장인자수용체에 결합한 결과를 나타내는 것이다.
도 5는 양자점 기반의 추적자에 의한 표피성장인자수용체를 활성화 양상을 나타내는 것이다.
도 6은 양자점 기반의 추적자의 표피성장인자수용체 결합 동태를 분석한 것이다.
도 7은 정상 마우스의 양자점 기반의 추적자 혈중 동태를 분석한 것이다.
도 8은 MDA-MB-468 피하 이식한 누드 마우스의 양자점 기반의 추적자 체내 분포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 양자점 기반의 추적자의 체외 광학영상 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 양자점 기반의 추적자 체내 감마카메라 영상 결과를 나타낸 것이다.

Claims (7)

  1. 양자점 표면에 코팅된 생체분자와 결합하는 친화성 물질이 연결된 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol;PEG); 일 말단이 상기 폴리에틸렌글리콜와 컨쥬게이션된 표피성장인자(epidermal growth factor;EGF); 및 상기 생체분자에 표지된 방사성동위원소를 포함하는 것을 특징으로 하는 양자점(quantum dot) 기반의 추적자(tracer).
  2. 제1항에 있어서, 상기 양자점은 카드뮴셀레나이드(Cd/Se) 코어에 황화아연(ZnS) 쉘을 입힌 것을 특징으로 하는 양자점 기반의 추적자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 방사성동위원소는 하이드라지노니코티나마이드(hydrazinonicotinamide;HYNIC)를 통해 생체분자에 결합된 99mTc인 것을 특징으로 하는 양자점 기반의 추적자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 생체분자 및 상기 생체분자와 결합하는 친화성 물질은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 생체분자 및 생체분자와 특이적으로 결합하는 친화성 물질인 것을 특징으로 하는 양자점 기반의 추적자.
    생체분자 생체분자와 결합하는 친화성 물질
    스트렙트아비딘(streptavidin),
    아비딘 (avidin),
    뉴트라비딘(neutravidin)
    및
    캡트아비딘(captavidin)
     비오틴(biotin; A)     플루오세인 안티-플루오세인 퍼옥시데이즈(peroxidase ) 안티-퍼옥시데이즈 디니트로페놀(DNP) 항-2,4-디니트로페놀(anti-2,4-dinitrophenol ) 디곡시제닌 항-디곡시제닌(anti-digoxigenin)
  5. 제1항에 따른 양자점 기반의 추적자를 포함하는 표피성장인자수용체 검출 키트.
  6. 제1항에 따른 양자점 기반의 추적자를 포함하는 암 영상진단용 키트.
  7. 생체분자로 코팅된 양자점을 준비하는 단계;
    표피성장인자의 일 말단에 친화성 물질이 연결된 폴리에틸렌글리콜을 컨쥬게이션시키는 단계;
    상기 친화성 물질과 양자점에 코팅된 생체분자를 반응시키는 단계; 및
    상기 생체분자에 하이드라지노니코티나마이드(hydrazinonicotinamide;HYNIC)를 결합시키고 방사성동위원소를 표지시키는 단계;
    를 포함하는 양자점 기반의 추적자 제조방법.
KR1020090022744A 2009-03-17 2009-03-17 표피성장인자수용체 다모드 영상용 양자점 기반의 추적자 KR20100104370A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090022744A KR20100104370A (ko) 2009-03-17 2009-03-17 표피성장인자수용체 다모드 영상용 양자점 기반의 추적자

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090022744A KR20100104370A (ko) 2009-03-17 2009-03-17 표피성장인자수용체 다모드 영상용 양자점 기반의 추적자

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20100104370A true KR20100104370A (ko) 2010-09-29

Family

ID=43008623

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020090022744A KR20100104370A (ko) 2009-03-17 2009-03-17 표피성장인자수용체 다모드 영상용 양자점 기반의 추적자

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20100104370A (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4090356A4 (en) * 2020-01-17 2024-04-10 Univ Sydney ORAL PEPTIDE ADMINISTRATION

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4090356A4 (en) * 2020-01-17 2024-04-10 Univ Sydney ORAL PEPTIDE ADMINISTRATION

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cai et al. Multimodality imaging of the HER-kinase axis in cancer
Cai et al. Preparation of peptide-conjugated quantum dots for tumor vasculature-targeted imaging
Barrett et al. In vivo diagnosis of epidermal growth factor receptor expression using molecular imaging with a cocktail of optically labeled monoclonal antibodies
Vu et al. Quantum dots for quantitative imaging: from single molecules to tissue
Humblet et al. High-affinity near-infrared fluorescent small-molecule contrast agents for in vivo imaging of prostate-specific membrane antigen
Lee et al. Affibody molecules for in vivo characterization of HER2-positive tumors by near-infrared imaging
JP6412918B2 (ja) マルチモーダルシリカ系ナノ粒子
US20210145985A1 (en) Method of imaging in vivo tissues using nanoparticles comprising a reference dye and a sensor dye
Boonstra et al. Preclinical uPAR-targeted multimodal imaging of locoregional oral cancer
WO2017161195A1 (en) Ca ix-target nir dyes and their uses
Pereira et al. Imaging of human epidermal growth factor receptors for patient selection and response monitoring–From PET imaging and beyond
US20190134239A1 (en) Pre-targeting strategies for molecular imaging and/or radioimmunotherapy
Yun et al. A high-affinity repebody for molecular imaging of EGFR-expressing malignant tumors
He et al. Recent progress in the molecular imaging of therapeutic monoclonal antibodies
Guan et al. Polyethylene glycol-conjugated HER2-targeted peptides as a nuclear imaging probe for HER2-overexpressed gastric cancer detection in vivo
Tsuboi et al. Recombinant protein (luciferase-IgG binding domain) conjugated quantum dots for BRET-coupled near-infrared imaging of epidermal growth factor receptors
Li et al. ImmunoPET/NIRF/Cerenkov multimodality imaging of ICAM-1 in pancreatic ductal adenocarcinoma
JP2012530725A (ja) ソリシジン由来ペプチドならびにｔｒｐｖ−６がんの検出および薬剤送達のための方法
Zhou et al. Targeted fluorescent imaging of a novel FITC-labeled PSMA ligand in prostate cancer
Jia et al. ICG-dimeric her2-specific affibody conjugates for tumor imaging and photothermal therapy for her2-positive tumors
Hoppmann et al. 177 Lu–DO3A–HSA–Z EGFR: 1907: characterization as a potential radiopharmaceutical for radionuclide therapy of EGFR-expressing head and neck carcinomas
Luca et al. Peptide ligands specifically targeting HER2 Receptor and the role played by a synthetic model system of the receptor extracellular domain: Hypothesized future perspectives
Tsuboi et al. In Vitro and In Vivo Fluorescence Imaging of Antibody–Drug Conjugate-Induced Tumor Apoptosis Using Annexin V–EGFP Conjugated Quantum Dots
Tanaka et al. Application of infrared‐based molecular imaging to a mouse model with head and neck cancer
KR20100104370A (ko) 표피성장인자수용체 다모드 영상용 양자점 기반의 추적자

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application