KR20100100083A - 전계효과트랜지스터 바이오센서를 이용한 변이 ｐ53 단백질의 검출방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 변이 p53 단백질 검출용 전계효과트랜지스터(MOSFET, Metal Oxide Semiconductor Field Effect Transistor) 바이오센서 장치 및 상기 장치를 이용한 변이 p53 단백질의 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 기판; 상기 기판 상부에 도핑된 채널; 상기 채널(2)의 각 양측부에 형성되어 있는 소스 전극(3)과 드레인 전극(4); 상기 소스 전극(3)과 드레인 전극(4)의 일측면에 접촉하고 상기 채널(2) 상부에 위치하는 산화층(1); 및 상기 산화층의 상부에 형성되어 있고 p53 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA가 그 표면에 고정되어 있는 게이트 전극(7)을 구비하는 p53 단백질 검출용 전계효과트랜지스터 바이오센서 장치 및 상기 장치를 이용한 변이 p53 단백질의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 정확하고 민감하게 변이 p53 단백질을 검출할 수 있어 발암 모니터링용으로 활용 가능성이 높다.
p53, mutant, 전계효과트랜지스터, MOSFET, FET, 바이오센서

Description

전계효과트랜지스터 바이오센서를 이용한 변이 ｐ53 단백질의 검출방법 {Method for Label-Free Electrical Detection of Mutant p53 Using MOSFET Biosensor}
본 발명은 변이 p53 단백질 검출용 전계효과트랜지스터(MOSFET, Metal Oxide Semiconductor Field Effect Transistor) 바이오센서 장치 및 상기 장치를 이용한 변이 p53 단백질의 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 기판; 상기 기판 상부에 도핑된 채널; 상기 채널(2)의 각 양측부에 형성되어 있는 소스 전극(3)과 드레인 전극(4); 상기 소스 전극(3)과 드레인 전극(4)의 일측면에 접촉하고 상기 채널(2) 상부에 위치하는 산화층(1); 및 상기 산화층의 상부에 형성되어 있고 p53 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA가 그 표면에 고정되어 있는 게이트 전극(7)을 구비하는 p53 단백질 검출용 전계효과트랜지스터 바이오센서 장치 및 상기 장치를 이용한 변이 p53 단백질의 검출방법에 관한 것이다.
p53 유전자는 암에서 흔히 발견되는 변이 유전자이면서, 암 발생 과정에 중요한 인자로 작용하는 유전자 중 하나이다. 암 억제 유전자인 p53은 세포내 DNA에 손상이 발생하면 활성화되어, 염기절단수리(Base Excision Repair, BER) 기작을 유도하고, 세포주기를 지연시켜 손상된 유전자의 복구가 이뤄지는 동안 불완전한 유전자의 복제를 억제하고, 손상된 DNA의 복구에 관여하는 유전자이다. 또한, p53은 세포내 유전자의 손상이 복구될 수 없을 정도로 심각한 경우에는 세포사멸기전을 유도하여 암으로 변이될 가능성이 있는 세포를 미리 제거해주는 기능을 수행한다. p53은 세포내 손상된 유전자가 축적되는 것을 방지하여 손상된 세포가 암으로 발생하는 기전을 억제하는 것으로 알려져 있다.
변이 p53 단백질은 전체 암의 50%가 넘는 암에서 발견되고, 그 중 90% 이상은 DNA 결합 도메인에 변이가 발견된다. p53 단백질이 DNA 결합 도메인의 변이로 DNA에 결합하지 못하여 전사작용을 촉진하는 작용전달인자(trans-acting)로의 기능을 잃게 되면 손상된 세포의 세포분열을 억제하지 못하여, 손상된 세포의 암세포화 가능성이 높아진다. 따라서, 정상 p53과 변이 p53 단백질의 DNA 결합 능력을 모니터링하는 것은 암세포 연구 및 진단 분야에서 그 가치가 상당히 크다고 할 수 있다.
한편, 최근 바이오센서의 기술은 표지물질을 사용하지 않는 비표지 측정기술 개발에 촛점이 맞추어져 있으며, 대표적으로는 금속 표면에서 발생하는 표면 플라즈몬 공명 현상을 이용하는 방법, 3차원 미세 구조물인 캔틸버러의 휨 현상에 의한 빛의 굴절률 변화를 측정하는 방법(Balle, MK. et al., Ultramicroscopy, 82;1, 2000), 생체분자의 질량 변화에 따른 수정 크리스탈의 공명주파수 변화를 측정하는 방법(Marx, KA., Biomacromolecules, 4;1099, 2003), 반도체 공정에 기반을 둔 전 기장 효과를 측정하는 방법(Yuqing, M. et al., Biotechnol. Adv., 21;527, 2003) 및 전기화학적 측정 방법(Hanahan, G. et al., J. Environ. Monit., 6; 657, 2004) 등이 있다.
전계효과트랜지스터(metal oxide semiconductor field effect transistor, MOSFET) 바이오센서는 소스(source), 게이트(gate) 및 드레인(drain)으로 구성되어 있으며, 전기장 효과에 의해 소스 및 드레인 사이의 채널을 흐르는 전류가 변하는 반도체 특성을 이용한 바이오센서이다. 일반적으로 바이오센서로 쓰이는 전계효과트랜지스터는 n형 또는 p형 반도체 기판 양측부에 소스 전극 및 드레인 전극이 있으며, 소스 및 드레인 전극과 접촉하는 게이트가 형성되어 있다. 게이트는 일반적으로 절연층, 전극층 및 프로브(probe) 생체분자를 붙이기 위한 금속 물질층으로 구성된다. 게이트 전극 표면에서 프로브가 동종 표적물과 반응하면 게이트 주변 전기장에 변화가 일어나며, 게이트 주변 전기장의 변화에 영향을 받아 소스 전극과 드레인 전극 사이의 채널 영역에 흐르는 전류값이 함께 변하고, 이러한 전류의 변화를 측정하여 시료내의 표적물을 검출할 수 있다. 전계효과트랜지스터 센서는 민감도, 특이성, 신속성, 휴대성 및 크기 등에서 잇점이 있기 때문에, H+ 이온 농도를 측정하는 고정 효소 전계효과트랜지스터 센서, DNA 혼성화를 검출하는 DNA-modified 전계효과트랜지스터 센서 및 세포 밖 전위 또는 세포 대사기전을 검출하는 cell-based 전계효과트랜지스터 센서 등에 관한 연구가 활발하다. 최근에는 높은 민감도를 갖는 nanowire 전계효과트랜지스터 센서가 각광받고 있는 추세이다.
이에, 본발명자들은 보다 정확하고 민감한 변이 p53 단백질의 검출방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, p53 DNA 결합 도메인에 특이적인 염기서열을 갖는 DNA와 전계효과트랜지스터를 이용하여, 기존의 방법보다 정확하고 빠르게 변이 p53 단백질을 검출할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 주된 목적은 p53 단백질 검출용 전계효과트랜지스터 바이오센서 장치 및 이를 이용한 변이 p53 단백질의 검출방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기판; 상기 기판 상부에 도핑된 채널; 상기 채널(2)의 각 양측부에 형성되어 있는 소스 전극(3)과 드레인 전극(4); 상기 소스 전극(3)과 드레인 전극(4)의 일측면에 접촉하고 상기 채널(2) 상부에 위치하는 산화층(1); 및 상기 산화층의 상부에 형성되어 있고 p53 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA가 그 표면에 고정되어 있는 게이트 전극(7)을 구비하는 p53 단백질 검출용 전계효과트랜지스터 바이오센서 장치 및 상기 장치를 이용한 변이 p53 단백질의 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 정확하고 민감하게 변이 p53 단백질을 검출할 수 있어 발암 모니터링용으로 활용 가능성이 높다.
일 관점에서, 본 발명은 기판; 상기 기판 상부에 도핑된 채널; 상기 채널(2) 의 각 양측부에 형성되어 있는 소스 전극(3)과 드레인 전극(4); 상기 소스 전극(3)과 드레인 전극(4)의 일측면에 접촉하고 상기 채널(2) 상부에 위치하는 산화층(1); 및 상기 산화층의 상부에 형성되어 있고 p53 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA가 그 표면에 고정되어 있는 게이트 전극(7)을 구비하는 p53 단백질 검출용 전계효과트랜지스터 바이오센서 장치에 관한 것이다.
상기 전계효과트랜지스터의 기판은 단일층상의 규소와 이산화규소로 구성되어 반도체인 규소층 위에 이산화규소층이 단일 층상을 이루어 절연층의 역할을 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 전계효과트랜지스터의 게이트는 APCVD(Atmospheric Pressure Chemical Vapor Deposition), LPCVD(Low Pressure Chemical Vapor Deposition) 및 PECVD(Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition) 방법에 의해 박막이 입혀져 활성화되는데, APCVD 방법은 가스의 소비량이 많고, LPCVD 방법은 높은 온도에서 동작하는 특징이 있어, 낮은 온도에서 동작하고 빠른 증착이 가능한 PECVD 방법이 바람직하다.
전계효과트랜지스터에는 정공을 carrier로 이용하며 게이트 전압이 0V일 때, 채널에 전류가 흐르는 p형 전계효과트랜지스터와 전자를 carrier로 이용하며 게이트 전압이 0.01V 내지 6V일 때, 채널에 전류가 흐르는 n형 전계효과트랜지스터가 있고, 전계효과트랜지스터로 p형과 n형이 모두 이용될 수 있지만, n형 전계효과트랜지스터의 전류구동능력이 p형 전계효과트랜지스터보다 2배이상 높으므로 p53 단백질 검출용 전계효과트랜지스터 바이오센서 장치는 검출 효과를 증진시키기 위하 여 n형 전계효과트랜지스터를 이용하는 것이 바람직하다.
금박막 전극에 DNA를 고정시키는 방법에 있어서는, thiol-modified DNA를 이용하는 방법, 아민기가 도입된 DNA를 이용하는 방법, MUA(11-mercaptoundecanoic acid), 이온 결합성 폴리 L-라이신 및 5'-aminoalkylated DNA를 이용하는 방법, 금표면에 EDC(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidehydrocholride)와 NHSS(N-hydroxysulfosuccinimide)로 유도된 공유 결합성 폴리 L-라이신과 mercaptoalkylated DNA를 이용하는 방법 및 에탄올과 1-mercaptoundecanoic acid 와 1-decanethiol로 활성화된 금표면에 O-(N-succinimidyl)-N,N,N',N'-tetra methyluronium tetrafluoroborate와 N,N-diisopropylethylamine으로 유도된 에스테르기와 5'-aminoalkylated DNA를 이용하는 법 등이 있으며, 이 중 MUA, 이온 결합성 폴리 L-라이신과 5'-aminoalkylated DNA를 이용하는 방법은 DNA가 이온결합을 통해 금표면에 붙어있기 때문에 pH 변화에 따라 DNA가 금표면에서 떨어져나갈 수 있으나, 상기 다른 방법들은 금표면에 DNA가 공유결합으로 결합되어 있어므로 pH 영향을 상대적으로 적게 받는다.
다른 관점에서, 본 발명은 상기 전계효과트랜지스터 바이오센서 장치를 이용하는 것을 특징으로 하는 변이 p53 단백질의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 검출방법은 (a) 상기 전계효과트랜지스터 바이오센서 장치의 게이트 전극에 p53 단백질이 함유된 시료를 점적시킨 다음, 반응시키는 단계; (b) 상기 소스 전극 및 드레인 전극 사이의 채널 영역에 흐르는 전류값을 측 정하는 단계; 및 (c) 상기 측정된 전류값을 이용하여 p53 단백질의 변이 여부를 확인하는 단계를 거치는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 전계효과트랜지스터 표면에 고정된 p53 특이 DNA와 정상 p53 단백질 및 변이 p53 단백질이 결합하는 정도에 따라, 소스와 드레인 사이 채널의 전류값에 변화가 발생되고, 정상 p53 단백질과 변이 p53 단백질의 DNA에 대한 결합력의 차이로 정상 p53 단백질에 대해서는 소스 전극과 드레인 전극 사이의 채널 영역에 흐르는 전류값에 급격한 증가가 발생되나 변이 p53 단백질에 대해서는 전류값의 변화가 나타나지 않는 원리를 이용한 것이다.
본 발명의 n형 전계효과트랜지스터 바이오센서 장치는 게이트 전압이 0.01V 미만이면 작동하지 않고, 6V를 넘어가면 채널에 흐르는 전류가 선형영역에서 포화영역으로 넘어서게 되어 측정이 불가해지므로 p53 단백질 검출용 전계효과트랜지스터 바이오센서 장치에 인가되는 게이트 전압은 0.01V 내지 6V인 것이 바람직하다.
본 발명은 일양태에서, 정상 p53 단백질의 코어 도메인과 DNA 결합능이 결손된 변이 p53 단백질(R248W)의 코어 도메인을 제작하고, 전계효과트랜지스터 바이오센서의 게이트 전극 표면에 정상 p53 단백질과 특이적으로 결합하는 이중가닥 DNA를 고정시켜, 시료 중 정상 p53 단백질 또는 변이 p53 단백질에 대한 소스와 드레인 사이 채널의 전류값 변화를 분석하였다. 그 결과, 정상 p53 단백질에 반응하여 전류값의 유의한 변화가 측정되었으나, 변이 p53 단백질에 대해서는 전류값의 변화가 나타나지 않았다. 이 결과를 통해 염기서열 특이적인 DNA-단백질 상호작용을 전계효과트랜지스터 바이오센서로 모니터링 할 수 있음을 확인하였다. 상기 결과는 현재 바이오센서로 많이 이용되는 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonace) 바이오센서의 결과와도 일치하였고, 본 발명의 전계효과트랜지스터 타입의 바이오센서를 이용하여 생체분자에 별도의 표지물질을 달지 않고도 전기적으로 DNA와 단백질의 상호작용을 모니터링할 수 있음을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: p53 단백질 결합 DNA의 제작 및 p53 변이유전자로 형질전환된 균주의 제작
p53 단백질과 결합한다고 알려진 GADD45 프로모터의 DNA 염기서열(서열번호 1)과 음성 대조군 DNA 염기서열(서열번호 2), 상기 GADD45 프로모터 DNA 염기서열과 상보적인 DNA 염기서열(서열번호 3) 및 상기 음성 대조군 DNA 염기서열과 상보적인 DNA 염기서열(서열번호 4)를 제작하였다.
서열번호 1: 5'-GTA CAG AAC ATG TCT AAG CAT GCT GGG GAC-3'
서열번호 2: 5'-TTT TCG AGA GCT AGC AAG ACT GAG GAA GCC-3'
서열번호 3: 5'-GTC CCC AGC ATG CTT AGA CAT GTT CTG TAC-3'
서열번호 4: 5'-GGC TTC CTC AGT CTT GCT AGC TCT CGA AAA-3'
p53 단백질 아미노산 서열 중 248번째 아르기닌 코돈 UGG를 트립토판 코돈 CGG로으로 치환하기 위하여 서열번호 5과 서열번호 6으로 표시되는 프라이머로 점돌연변이를 일으키는 PCR을 수행하였다.
서열번호 5: 5'-GGG CGG CAT GAA CTG GAG GCC CAT CCT CA-3'
서열번호 6: 5'-TGA GGA TGG GCC TCC AGT TCA TGC CGC CC-3'
p53의 유전자를 서열번호 7과 서열번호 8로 표시되는 프라이머로 PCR을 수행하여 NdeI 및 BamHI 제한효소자리가 들어간 코어 도메인을 분리하였다.
서열번호 7: 5'-GGA ATT CCA TAT GGC GGC CCC TGC ACC AG-3'
서열번호 8: 5'-CGG GAT CCA ACC CTT TCT TGC GG-3'
PCR 증폭은 Pfu DNA폴리머라제(Bioprogen, 대한민국)을 이용하여 수행하였으며, 증폭된 DNA는 NdeI 및 BamHI 제한 효소를 이용하여 단편으로 잘라낸 후, pER21a 플라스미드(Novagen, 독일)에 6 His가 태깅되도록 삽입하여 발현벡터를 제작하였다. 플라스미드 정제와 DNA 절편의 젤 추출은 DNA purification Kit(Bioneer, 대한민국)로 수행하였다. 상기 제조된 발현벡터를 대장균 Strain Rosetta BL21(DE3) 균주(Novagen, 독일)에 형질전환시켜, p53 변이 단백질을 생산하는 균주를 제작하였다.
실시예 2: 변이 p53 단백질 발현과 정제
실시예 1에서 형질전환된 균주를 100μg/mL 농도의 암피실린이 들어간 LB 배지에서 37℃ 및 200rpm 조건으로 배양하였다. 세포 배양액의 농도는 분광광도계를 이용하여 600nm 파장대에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 세포 배양액의 흡광도가 0.6~0.8이 되었을 때, 1mM IPTG와 0.1mM 아연 아세테이트를 첨가하여 15℃에서 12시간~16시간 발현을 유도하였다. 배양된 균주를 8분동안 6000rpm으로 원심분리하고, 컬럼 결합 완충용액(50mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH 8.0)으로 2번 세척한 후, 초음파분쇄기로 세포를 파괴한 다음, 30분동안 12,000rpm으로 원심분리하여 조세포 용해물을 얻었다. 정상 p53 단백질과 변이 p53 단백질을 정제하기 위해, 조세포 용해물을 Ni-NTA 컬럼에 걸고 elution buffer(50mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 500mM Imidazole, pH 8.0)로 용출시켰다. 정제된 단백질은 10% SDS-PAGE를 수행하여 확인하였고, 4℃에서 12시간~16시간 동안 1X PBS (GIBCO, BRL, USA)와 0.1X PBS로 순차적으로 투석하여 염을 제거하고 농축시켰다. 단백질의 농도는 BSA 표준시약을 사용하여 브래드포드 방법으로 측정하였다.
실시예 3: 변이 p53 단백질의 형광 분석을 이용한 검출
금 박막을 piranha 용액(70% H2SO4, 30% H2O2)으로 세척한 후, 증류수와 에탄올로 씻어내었고, DNA를 금박 전극에 고정하기 위해서, 단일가닥 thiol-modified GADD45 프로모터 DNA 염기서열(서열번호 1)과 thiol-modified 대조군 염기서열(서열번호 2)을 각각 0.1X PBS에 10μM 농도로 녹여 BioOdyssey Calligrapher Mini Arrayer(Bio-Rad, USA)로 상기 금박 칩 표면에 스팟팅하였고, 실온에서 90분간 방치한 후, 0.1X PBS로 5분 동안 2번 세척하였다.
0.1X PBS에 10μM 농도로 단일가닥 thiol-modified GADD45 DNA 염기서열(서열번호 1)과 상보적인 Cy5로 표지된 DNA(서열번호 3) 및 대조군 DNA 염기서열(서열번호 2)과 상보적인 DNA 염기서열(서열번호 4)을 준비하고 상기 금박 칩 표면에 고정화된 단일가닥 DNA에 60분 동안 커버슬립 반응을 진행시킨 후 세척하였다.
상기 DNA 칩의 형광 이미지는 fluorescence scanner, GenPix 4200 (Axon, USA)으로 분석하였다. DNA 칩 형광 이미지 분석 결과, 전계효과트랜지스터 바이오센서 측정에 사용될 버퍼용액과 동일한 조건에서 테스트하였을 때 단일가닥의 thiol-modified DNA가 금 박막 표면에 효율적으로 고정화된다는 것과, 또한 상보적인 DNA가 단일가닥 DNA에 선택적으로 결합한다는 것을 동시에 확인하였다.
실시예 4: 변이 p53 단백질의 SPR 분석을 이용한 검출
BIACORE 3000 (BIAcore AB, 영국)과 carboxymethylated dextran CM5 chip (BIAcore AB, 영국)을 사용하여 SPR 분석을 수행하였다. PBS를 전개 용매로 사용하여 sensorgram의 기준을 설정하였다. Neutravidin (Pierce, 미국)을 칩 표면에 고정하기 위해 아세트산(pH 4.5)에 50μg/ml 농도로 녹이고 칩 표면의 덱스트란 카르복실기와 반응시켜 carbodiimide-N-hydroxyl succinimide 커플링 반응이 일어나도 록 하였다. 반응하지 않은 카르복실기는 에탄올라민을 사용하여 불활성화시켰다. 5'말단을 바이오틴으로 표지시킨 500nM의 DNA(서열번호 1)를 neutravidin이 고정된 칩 표면에 5μl/min의 유속으로 6분간 흘려주고, 서열번호 3으로 표시되는 상보적인 염기서열 DNA와 혼성화 반응을 통해 이중가닥 DNA를 상기 칩 위에 고정화하였다. 0.1X PBS로 SPR 장치의 기준을 설정하고, 실시예 3의 정제된 정상 p53 단백질 및 변이 p53 단백질을 1 μM 농도로 5 μl/min의 유속으로 6분간 흘려주면서 SPR을 측정하였다. SPR 분석 결과, 변이 p53 단백질의 경우 정상 p53 단백질보다 약 5,500RU (Resonance Unit) 정도의 낮은 값을 보임으로써 정상 p53 단백질과 비교하였을 때 DNA에 결합력이 소멸되었음을 알 수 있었다.
실시예 5: 변이 p53 단백질의 전계효과트랜지스터 바이오센서를 이용한 검출
CMOS(complementary metal oxide semiconductor)를 이용하여 n-타입 전계효과트랜지스터 센서를 제작하였다. 게이트 전극은 thiol modification을 위해 금박막으로 만들었으며, 상기 게이트 전극 표면을 아세톤, 메탄올 및 증류수로 각각 5분씩 초음파 세척하고, 120W로 120초 동안 O2 plasma 처리하여 게이트 전극을 활성화시킨 후, 5'말단이 thiol로 표지된 염기서열 DNA(서열번호 1)를 0.1X PBS에 100nM 농도로 준비하여 상기 금박막 표면에 90분 동안 반응시켜 고정시켰다. 상기 금박막 표면에 0.1X PBS에 녹인 10μM 6-mercapto-1-hexanol (Sigma Aldrich)을 60분 동안 처리하여 반응을 중지시키고 스페이서로 작용하도록 하였다. 0.1X PBS에 100nM 농도로 준비된 단일가닥 DNA(서열번호 3)을 상기 게이트 전극에 60분간 처리하여 게이트 전극 표면에 이중가닥 DNA가 혼성화 반응을 통해 고정되도록 하였다. p53 단백질 시료를 0.1X PBS에 100nM 농도로 녹여 상기 게이트 전극에 점적한 후, 30분 동안 소스 전극과 드레인 전극 사이의 채널영역에 흐르는 전류값을 측정하였다. 측정은 게이트 전극을 0.1X PBS로 3번씩 세척하고 수행하였으며 모든 전류값의 측정은 습도 50% 상태에서 쉴드 박스의 프로브 스테이션을 세척한 후 측정하였다.
전계효과트랜지스터 전류값을 측정한 결과, 변이 p53 단백질의 전류값이 정상 p53 단백질에서 측정된 값의 13% 수준을 나타내었는데, 이는 변이 p53 단백질의 경우 DNA에 결합하지 못함으로써 전류의 변화가 거의 발생되지 않는 반면, 정상 p53 단백질의 경우 (+)전하를 띠고 있는 p53 단백질이 DNA에 결합하여 DNA의 (-)전하 효과를 상쇄시킴과 동시에 p53 단백질이 (+)전하 효과를 나타냄으로써 전류값이 상승한 것으로 설명될 수 있다.
도 1은 전계효과트랜지스터 바이오센서의 개략도를 나타낸 것으로, (A)는 전계효과트랜지스터 바이오센서 사진을 나타낸 것이고, (B)는 변이 p53 단백질을 검출하는 전계효과트랜지스터의 단면도를 나타낸 것이다.
도 2는 정상 p53 단백질 또는 변이 p53 단백질[R248W]를 발현시키는 pET21a-p53 발현 벡터의 모식도를 나타낸 것으로, (A)는 p53 단백질을 발현하는 pET21a-p53 플라스미드 벡터의 유전자 지도를 나타낸 것이고, (B)는 정상 p53 단백질 또는 변이 p53 단백질(R248W)의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 3 은 변이 p53 단백질을 검출하는 전계효과트랜지스터 바이오센서의 원리에 대한 개념도를 나타낸 것이다.
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
1 산화층
2 채널
3 소스 전극
4 드레인 전극
5 이산화규소층(기판)
6 규소층(기판)
7 DNA가 고정된 금박막 게이트 전극
<110> Korea Research Institute of Biosceince and Biotechnology <120> Method for Label-free electrical detection of mutant p53 using MOSFET biosensor <130> P09-B019 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p53 binding DNA sequence <400> 1 gtacagaaca tgtctaagca tgctggggac 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control DNA sequence <400> 2 ttttcgagag ctagcaagac tgaggaagcc 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p53 binding DNA sequence <400> 3 gtccccagca tgcttagaca tgttctgtac 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control DNA sequence <400> 4 ggcttcctca gtcttgctag ctctcgaaaa 30 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <400> 5 gggcggcatg aactggaggc ccatcctca 29 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <400> 6 tgaggatggg cctccagttc atgccgccc 29 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <400> 7 ggaattccat atggcggccc ctgcaccag 29 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer sequence <400> 8 cgggatccaa ccctttcttg cgg 23

Claims (11)

  1. 기판; 상기 기판 상부에 도핑된 채널; 상기 채널(2)의 각 양측부에 형성되어 있는 소스 전극(3)과 드레인 전극(4); 상기 소스 전극(3)과 드레인 전극(4)의 일측면에 접촉하고 상기 채널(2) 상부에 위치하는 산화층(1); 및 상기 산화층의 상부에 형성되어 있고 p53 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA가 그 표면에 고정되어 있는 게이트 전극(7)을 구비하는 p53 단백질 검출용 전계효과트랜지스터 바이오센서 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 기판은 단일층상의 규소(6)와 이산화규소(5)로 구성된 것을 특징으로 하는 전계효과트랜지스터 바이오센서 장치.
  3. 제1항에 있어서, 상기 전계효과트랜지스터는 n형 전계효과트랜지스터인 것을 특징으로 하는 전계효과트랜지스터 바이오센서 장치.
  4. 제1항에 있어서, 상기 게이트 전극은 금박막 전극인 것을 특징으로 하는 전계효과트랜지스터 바이오센서 장치.
  5. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 게이트 전극은 APCVD(Atmospheric Pressure Chemical Vapor Deposition), LPCVD(Low Pressure Chemical Vapor Deposition) 및 PECVD(Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition)로 이루어진 군에서 선택되는 방법으로 처리하여 활성화된 것을 특징으로 하는 전계효과트랜지스터 바이오센서 장치.
  6. 제1항에 있어서, 상기 DNA는 변이 p53 단백질과는 결합하지 않는 것임을 특징으로 하는 전계효과트랜지스터 바이오센서 장치.
  7. 제1항 또는 제6항에 있어서, 상기 p53 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 전계효과트랜지스터 바이오센서 장치.
  8. 제1항 또는 제6항에 있어서, 상기 p53 단백질과 특이적으로 결합하는 DNA는 thiol기, 아민기, MUA(11-mercaptoundecanoic acid), 폴리 L-라이신, mercaptoalkyl기 및 aminoalkyl기로 구성된 군에서 선택되는 물질로 개질되어 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 전계효과트랜지스터 바이오센서 장치.
  9. 제1항의 전계효과트랜지스터 바이오센서 장치를 이용하는 것을 특징으로 하는 변이 p53 단백질의 검출방법.
  10. 제9항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이 p53 단백질의 검출방법:
    (a) 제1항의 전계효과트랜지스터 바이오센서 장치의 게이트 전극에 p53 단백질이 함유된 시료를 점적시킨 다음, 반응시키는 단계;
    (b) 상기 소스 전극 및 드레인 전극 사이의 채널 영역에 흐르는 전류값을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 측정된 전류값을 이용하여 p53 단백질의 변이 여부를 확인하는 단계.
  11. 제10항에 있어서, 상기 게이트 전극에 인가되는 전압은 0.01V 내지 0.6V인 것을 특징으로 하는 변이 p53 단백질의 검출방법.
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