KR20100097966A - 사이토카인―유래 펩타이드 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 IL-13-유래 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드는 인간 IL-13의 기능과 동일한 기능을 하고 안정성이 천연 IL-13과 비교하여 매우 우수하며, 피부 투과도가 매우 우수하다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물은 Th1-매개 면역 질환, 특히 염증의 예방, 치료 또는 개선하는 데 매우 우수한 효능을 발휘한다. 또한, 본 발명의 조성물은 아토피, 아토피성 피부염, 건선 또는 여드름 치료와 같은 피부 상태(skin conditions)의 개선에 탁월한 효능을 가진다. 따라서 상술한 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성 및 안정성은, 의약, 의약외품 및 화장품에 매우 유리하게 적용될 수 있도록 한다.

인터루킨-13, Th1-매개 면역 질환, 아토피, 건선

Description

사이토카인―유래 펩타이드 및 그의 용도{Cytokine―derived Peptides and Uses Thereof}

본 발명은 IL-13-유래 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

아토피성 피부염, 건선, 지루성 피부염 등을 포함하는 전형적인 아토피성 질환 또는 알레르기성 피부염은 면역관련 질환으로 잘 연구가 되어 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "피부염"은 일반적으로 피부의 염증으로서 정의된다(Stedman's Medical Dictionary, 27th edition, Lippincott Williams & Wilkins(2000)). 본 발명에서 사용되는 용어 "접촉 피부염"은 항원(또는 알러지 유발물질) 또는 자극제에 대한 피부의 염증 반응이다(Stedman's Medical Dictionary, supra). 자극제는 피부에 직접 영향을 끼쳐 직접적인 조직 손상을 유발 하는 한편, 알러지 유발물질은 염증 및 조직 손상을 일으키는 면역 반응을 유도한다. 몇몇 통상적인 자극제는 양모 및 합성 섬유, 비누 및 표백제, 향수 및 화장품, 먼지 및 모래, 담배 연기 및 염소, 석유 또는 용제 등의 물질이다. 전형적으로 알러지 유발물질은 피부를 자극하고 면역 반응을 유발하는 음식, 식물, 또는 동물로부터의 물질들이다. 알러지 유발물질과의 접촉이 반복되면, 그 다음 접촉 피부염은 세포의 태선화 및 침윤을 수반하는 습진으로 발전한다. "아토피성 피부염" 및 "아토피성 습진" 또는 "습진" 및 관련 용어는 상호 혼용하여 사용될 수 있고, 세포 면역 결핍 및 증가된 면역글로불린 항체 E(IgE)에 의해 1차적으로 유발된 복합적 질환을 나타낸다. 또한 피부에 대한 자극제인 알러지 유발물질은 각자가 알레르기성 트리거에 대한 단순한 노출보다 더 자주 피부염을 발전시킨다. 불안, 스트레스 및 우울은 모두 습진의 악화에서 역할을 할 수 있다. 또한, 아토피성 습진을 가진 사람들은 호산백혈구 수가 증가된 것으로 판명될 수 있다. 아토피성 피부염(AD)은 유전적 소인 및 환경적 요인 둘 모두에 의해 영향받는 보편적인 다인성 질환으로 AD의 위험을 결정하는 강력한 유전적 소인은 쌍둥이 연구등을 통해 확립되었다. 일란성 쌍둥이에서 서로 간 일치율(pair-wise concordance rate)은 이란성 쌍둥이의 경우 0.23인 것에 비해 0.72였다. 이러한 일치율의 크기는 유전적 소인이 아토피성 피부염의 발생에 결정적임을 제시한다(Schultz Larsen F. Atopic dermatitis: a genetic-epidemiologic study in a population-based twin sample. J Am Acad Dermatol, 28: 719-23(1993)). 어린이가 AD에 걸릴 위험은 한쪽 부모가 아토피성 피부염 (AD, 천식 또는 알레르기성 비염)에 걸린 경우 50%이고 양쪽 부모가 걸린 경우엔 75%이다. 그러므로 유전적 소인이 아토피성 질환에 걸릴 소질에 있어서 우세한 역할을 한다고 생각된다. 이미 상기한 바와 같이 아토피는 Th2- 및 Th1-타입 면역 반응 사이의 불균형으로서, 적어도 부분적으로 Th2 사이토카인(IL-4, IL-12 및 IL-5)에 의해 매개되는 것으로 밝혀졌다(Mosmann TR, Sad S. The expanding universe of T-cell subsets: Th1, Th2 and more. Immunol Today, 17: 138-46(1996); Grewe M, Bruijnzeel-Koomen CA, Schopf E, Thepen T, Langeveld-Wildschut AG, Ruzicka T, et al., A role for Th1 and Th2 cells in the immunopathogenesis of atopic dermatitis. Immunol Today, 19: 359-61(1998)). 그러나 특정논문에서는 Th1-타입 사이토카인 (IFNG)이 알레르기성 면역 반응을 하향-조절하는 것이 아니라 오히려 염증 과정을 악화시키는 것으로 밝혀지기도 하였다(Hansen G, Berry G, DeKruyff RH, Umetsu DT. Allergen-specific Th1 cells fail to counterbalance Th2 cell-induced airway hyperreactivity but cause severe airway inflammation. J Clin Invest, 103: 175-83(1999)). 따라서 AD에서 피부염증 반응은 Th2- 및 Th1-타입 사이토카인 둘 모두에 의해 영향을 받는다고 볼 수 있다.

한편, 형질전환 성장인자 β1 (TGF-β1) 및 인터루킨 10을 포함하는 사이토카인의 경우 Th1- 및 Th2-타입 사이토카인 활성 둘 모두를 블로킹하는 일반적인 면역억제 활성을 가진 것으로 밝혀져 IL-13과 유사한 기능을 수행하는 펩타이드 단편을 확보할 경우 급격한 면역 감지원에 의한 피부염이나 아토피를 조절하는 것이 가능하다(Letterio JJ, Roberts AB. Regulation of immune responses by TGFbeta. Annu Rev Immunol, 16: 137-61(1998); Hobbs K, Negri J, Klinnert M, Rosenwasser LJ, Borish L. Interleukin-10 and transforming growth factor-beta promoter polymorphisms in allergies and asthma. Am J Respir Crit Care Med, 158: 1958- 62(1998)). 또한, 여러 유전자 클러스터 (5q, 6p, 11q13, 12q15-24.1 및 14q)에서 수많은 후보 유전자, 특히 Th1 및 Th2 사이토카인의 생성 또는 활성을 결정하는데 도움을 주는 유전자들이 아토피성 질환에 걸리기 쉽게 만든다고 제안되고 있다(Anderson GG, Morrison JF. Molecular biology and genetics of allergy and asthma. Arch Dis Child, 78: 488-96(1998); Forrest S, Dunn K, Elliott K, Fitzpatrick E, Fullerton J, McCarthy M, et al., Identifying genes predisposing to atopic eczema. J Allergy Clin Immunol, 104: 1066-70(1999); Ono SJ. Molecular genetics of allergic diseases. Annu Rev Immunol, 18: 347-66(2000)).

한편, IL-13은 변형되지 않은 분자량이 대략 12 kDa인 114개의 아미노산으로 된 사이토카인이다. IL-13은 상기 서술한 IL-4와 가장 밀접한 관계가 있는데, 아미노산 수준 상의 서열 상동성이 30％이다. 인간 IL-13 유전자는 IL-4 유전자와 인접한 염색체 5q31 상에 위치한다(McKenzie, A.N. et al., J Immunol, 150(12): 5436- 5444(1993); Minty, A. et al., Nature, 362(6417): 248-50(1993)).

IL-13이 초기에는 Th2 CD4+ 림프구 유래된 사이토카인으로서 확인되었지만, 이는 Th1 CD4+ T-세포, CD8+ T 림프구 NK 세포, 및 비-T-세포 집단, 예를 들어 비만 세포, 호염기구, 호산구, 대식 세포, 단핵구 및 기도 평활근 세포에 의해 생성되기도 한다. IL-13은 수많은 질병, 특히 염증 반응에 의해 유발되는 질병과 관련이 있어 왔다. 예를 들어, 재조합 IL-13을 타고난 본래의 비-감작화 설치류의 기도에 투여하면, 기도 염증, 점액 생성 및 기도 과민반응성 (AHR)을 포함한 많은 국면의 천식 표현형이 유발되는 것으로 밝혀졌다(Wills-Karp, M. et al., Science, 282(5397): 2258-2261(1998); Grunig, G. et al., Science, 282(5397): 2261-2263(1998); Venkayya, R., et al., Am J Respir Cell Mol Biol, 26(2): 202-208(2002); Morse, B. et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 282(1): L44-49(2002)). IL-13이 폐에서 특이적으로 과발현된 형질전환 마우스에서 유사한 표현형이 관찰되었다. 이 모델에서는, IL-13에 대한 보다 만성적인 노출로 인해 섬유증이 발생하기도 하였다(Zhu, Z. et al., J Clin Invest, 103(6): 779-788(1999)). IL-13 유전자 상의 수 많은 유전적 다형성이 또한, 알레르기성 질환과 연관이 있어 왔다. 특히, 아미노산 130에서의 아르기닌 잔기를 글루타민으로 치환시킨(Q13OR) IL-13 유전자의 변이체는 기관지 천식, 아토피성 피부염 및 혈청 IgE 수준 상승과 연관이 있어 왔다(Heinzmann, A. et al., Hum Mol Genet, 9(4): 549-559(2000); Howard, T. D. et al., Am J Hum Genet, 70(1): 230-236(2002); Kauppi, P. et al., Genomics, 77(1-2): 35-42(2001); Graves, P. E. et al., J Allergy Clin Immunol, 105(3): 506-513(2000)). 이러한 특별한 IL-13 변이체는 또한, 아미노산 계수치로부터 20개 아미노산 신호 서열을 제외한 몇몇 그룹에 의해 Q11OR 변이체 (아미노산 110에서의 아르기닌 잔기가 글루타민으로 치환된다)로서 지칭된다. IL-13 생성은 또한 알레르기성 천식과 연관이 있으며(van der Pouw Kraan, T. C. et al., Genes Immun, 1(1): 61-65(1999)), IL-13 수준 상승은 아토피성 비염 (건초열), 알레르기성 피부염 (습진) 및 만성 부비동염 이 있는 인간 대 상체에게서 측정되었다.

천식 이외에도, IL-13은 기타 섬유성 질환과 연관이 있어 왔다. 전신성 경화증 환자의 혈청에서 및 기타 형태의 폐 섬유증에 걸린 환자로부터의 기관지폐포성 세정(BAL) 샘플에서는 IL-4 보다 최대 1000배 더 증가된 수준의 IL-13이 측정되었다(Hasegawa, M. et al., J Rheumatol, 24(2): 328-332(1997); Hancock, A. et al., Am J Respir Cell Mol Biol, 18(1): 60-65(1998)).

한편 지연형 과민반응은, 일반적으로 T 세포 및 단핵구 및/ 또는 대식세포에 의한 조직의 부종 및 세포 침윤을 특징으로 하는 세포-매개성 면역반응이다. 일부의 사이토카인 세트는 별도로 지연형 과민반응 및 체액성 면역반응에 관련된다(Cher et al., J. Immunol., 138: 3688(1987); 및 mosmann et al., 1987 and 1989, 상기 참조)). 이들 부류의 반응과 관련된 질환은 관련 세트의 사이토카인의 부적절한 생성에 의해 유발될 수 있어 IL-13에서 기인한 펩타이드를 탐색하여, 발현된 지연성 과민 반응에 의해 유발되는 여러 인자들 특히 TNF-α, IFN-γ 등의 생성을 억제하여 종양성 단핵세포 등의 성장을 억제하는 기능을 탐색할 수 있었다.

본 발명자들은 천연 성장인자 IL(interleukin)-13과 동일한 또는 유사한 기능 또는 작용을 할 수 있으면서도 천연 IL-13 보다 안정성이 우수한 펩타이드를 제조하고자, 다양한 종류의 인간 IL-13-유래 펩타이드를 제조 및 스크리닝하였다. 그 결과, 많은 펩타이드 후보물질 중에서 생리활성(예컨대, 항염증)이 우수할 뿐만 아니라 안정성 및 피부 투과율이 우수한 펩타이드를 선별함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 Th1-매개 면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포 함하는 Th1-매개 면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 천연 성장인자 IL(interleukin)-13과 동일한 또는 유사한 기능 또는 작용을 할 수 있으면서도 천연 IL-13 보다 안정성이 우수한 펩타이드를 제조하고자, 다양한 종류의 인간 IL-13-유래 펩타이드를 제조 및 스크리닝하였다. 그 결과, 많은 펩타이드 후보물질 중에서 생리활성(예컨대, 항염증)이 우수할 뿐만 아니라 안정성 및 피부 투과율이 우수한 펩타이드를 선별하였다.

본 발명자들은 IL-13등의 기능과 관련 있는 부위를 기초하여 상술한 특성을 나타내는 다수의 사이토카인 관련 펩타이드를 합성하였다. 좀더 자세히 살펴보면, 사이토카인의 수용체 단백질에 대한 결합가능 부위를 예측하고, 이 예측된 부위의 아미노산 서열을 최적화 하여 본 발명의 펩타이드가 제조된다. 수용체 결합가능 예상부위를 검사하여 후보 펩타이드들을 제조하고, 이들 후부 펩타이드들 중에서 가장 항염증 활성이 우수한 펩타이드를 스크리닝 함으로써, 본 발명의 펩타이드가 제공된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 인간 IL-13에서 유래되며, 이는 표 1에 예시되어 있다.

본 명세서에서 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149- 54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).

본 발명에서, 서열목록 제1서열의 펩타이드는 천연 인간 IL-13의 기능을 수행하여 Th1에 기인되는 다양한 사이토카인의 기능을 저하시켜 주며, 대식세포/모노사이트, T-세포 림프구 복제 및 염증성 사이토카인 (TNF-α, INF-γ, IL-6, IL-8 및 IL-12)의 분비를 억제하는 펩타이드로 동정되었다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 면역세포의 성장 촉진능을 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드에 의해 세포 성장 또는 분화가 촉진되는 세포는 조혈모세포(hematopoietic stem cell) 또는 면역세포(immunocyte)이고, 보다 바람직하게는 호중구, 호산구, B 림프구, 호염기구, 단핵구 또는 대식세포이며 가장 바람직하게는 B 림프구이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 친-염증(pro-inflammatory) 사이토카인의 생성을 억제한다(참조: 도 5).

본 발명의 펩타이드는 그 자체로서 천연의 사이토카인보다 안정성이 우수하지만, 아미노산의 변형에 의해 안정성이 더욱 향상될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 펩타이드의 C-말단은 히드록시기(-OH), 아미노기(-NH₂), 아자이드(-NHNH₂)등으로 변형되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 펩타이드의 N-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합되어 있다.

상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 용어 “안정성”은 인 비보 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다. 상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다.

한편, 본 발명은 상술한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 Th1-매개 면역 질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물을 제공한다.

하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 사이토카인-관련 펩타이드는 천연 IL-13과 유사하게 B 림프구의 성장 촉진하는 능력 및 TNF-α/INF-γ 처리에 의해 과발현된 면역관련 물질(예컨대, TNF-α)의 발현 또는 활성을 억제하여 감소시키는 능력을 갖는다(참조: 도 4 및 도 5). 또한, 본 발명에서 상기 면역관련 물질의 발현 또는 활성은 지연형 과민반응 및 체액성 면역반응(humoral immune reponse)을 유발한다.

본 발명의 조성물이 적용되는 Th1-매개 면역 질환은 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 염증 질환, 자가면역질환 또는 이식 거부에 적용된다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 조성물이 적용되는 Th1-매개 면역 질환은 자가면역질환 또는 염증 질환이고, 보다 더 바람직하게는 아토피성 피부염, 건선, 여드름, 아토피성 비염(건초열), 알레르기성 피부염(습진), 만성 부비동염 또는 지루성 피부 염(seborrheic dermatitis)이다(참조: 도 7).

본 발명의 조성물이 적용되는 Th1-매개 면역 질환은 아토피성 피부염, 건선, 여드름, 아토피성 비염(건초열), 알레르기성 피부염(습진), 만성 부비동염, 지루성 피부염(seborrheic dermatitis), 대장염, 염증성 장질환, 타입 1 당뇨병, 타입 2 당뇨병, 류마티스 관절염, 반응성 관절염(Reactive Arthritis), 골관절염, 건선, 공피증, 공다공증, 아테롬성 동맥경화증, 심근염, 심내막염, 심낭염, 낭성 섬유증, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 나병, 매독, 라임 질환(Lyme), 보렐리아증(Borreliosis), 신경성-보렐리아증, 결핵, 사르코이드증(Sarcoidosis), 낭창, 원판성 낭창, 동창성 루프스, 루프스 신염, 전신성 홍반성 루프스, 천식, 황반변성, 포도막염, 과민대장 증후군, 크로씨병, 쇼그랜 증후군, 섬유근통, 만성피로 증후군, 만성피로 면역부전 증후군, 근육통성 뇌척수염, 근위축성 측삭경화증, 파킨스병, 다발경화증, 자폐스펙트럼 장애, 주의력결핍 장애 및 주의력 결핍 과잉행동장애를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명은 상술한 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 상태의 개선용 조성물로도 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발 명의 사이토카인-관련펩타이드의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.

본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 사이토카인-관련펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 사이토카인-관련 펩타이드의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장품 조성물이다.

본 명세서에서 용어 “화장품학적 유효량”은 상술한 본 발명의 조성물의 피부 개선 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해 화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 펩타이드와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명의 사이토카인-관련 펩타이드는 인간 IL-13의 기능과 동일한 기능을 할 수 있다.

(b) 본 발명의 펩타이드는 안정성이 천연 IL-13과 비교하여 매우 우수하며, 피부 투과도가 매우 우수하다.

(c) 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물은 Th1-매개 면역 질환, 특히 염증의 예방, 치료 또는 개선하는 데 매우 우수한 효능을 발휘한다.

(d) 본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물은 아토피, 아토피성 피부염, 건선 또는 여드름 치료와 같은 피부 상태(skin conditions)의 개선에 탁월한 효능을 가진다.

(e) 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성 및 안정성은, 의약, 의약외품 및 화장품에 매우 유리하게 적용될 수 있도록 한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

합성예 1: TQRLSGF의 합성

클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin; CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) 700 mg을 반응용기에 넣고 메틸렌 클로라이드(MC) 10 ml를 가하여 3분간 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF) 10 ml를 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반응기에 10 ml의 디클로로메탄용액을 넣고 Fmoc-Phe-OH (Bachem, Swiss) 200 mmole 및 디이소프로필 에틸아민(DIEA) 400 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2:1)를 DCM(dichloromethane)에 녹여 10분간 반응시키고 과량의 DCM/DMF(1:1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF)를 10 ml 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액(20%의 피페리딘(Piperidine)/DMF) 10 ml를 반응용기에 넣고 10분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10분간 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 각각 3분씩 DMF로 2회, MC로 1회, DMF로 1회 세척하여 Phe-CTL Resin을 제조하였다. 새로운 반응기에 10 ml의 DMF 용액을 넣고 Fmoc-Gly-OH (Bachem, Swiss) 200 mmole, HoBt 200 mmole 및 Bop 200 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 400 mmole DIEA를 분획으로 2번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5분간 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 DMF 용액으로 3회 5분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트(Nihydrin Test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Gly-Phe-CTL Resin을 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 선정된 아미노산 서열에 의거하여 Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Leu, Fmoc-Arg(pbf), Fmoc-Gln(trt), Fmoc-Thr(tBu)의 순으로 연쇄반응을 시켰다. Fmoc-보호기를 탈보호 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 제거하였다. 무수초산과 DIEA, HoBt를 넣어 한시간동안 아세틸화를 수행한 뒤 제조된 펩티딜 레진을 DMF, MC 및 메탄올로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, P2O5 하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한뒤 탈루 용액[트리플로로화 초산(Trifluroacetic acid) 81.5%, 증류수 5%, 티오아니졸(Thioanisole) 5% 을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2 시간 반응을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 TFA 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전 NH2-TQRLSLF-OH 펩타이드 1을 0.81 g 합성하였다(수율: 92.0%). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 분자량 864.7(이론값 : 864.0)를 얻을 수 있었다.

아미노산 서열	분석값(질량분석기)
	분석치	이론치
NH2-TQRLSLF-OH	864.7	864.0

시험예 1: 합성 펩타이드의 조혈모세포 성장 및 면역세포 분화 실험

합성 펩타이드의 조혈모세포 성장과 면역세포로의 분화를 증명하기 위해 BalbC 마우스의 다리로 부터 채취한 조혈모세포를 이용하여 분화 실험을 수행 하였다. 6 주령 BalbC 마우스(중앙실험동물, 한국)를 경추탈골로 치사하여 다리뼈를 채취한 뒤, 종단으로 할개하였다. EMEM(Eagle's minimal essential media, Gibco)를 주사기로 절개된 뼈에 투입하여 세척하고, 조혈모세포를 채취하였다. 채취한 조혈모세포를 10% FBS(fetal bovine serum)가 함유된 EMEM이 들어 있는 250 ml 용량의 조직배양용 플라스크를 이용하여 배양하였다. 배양된 세포주를 0.25% 트립신 용액으로 배양용기 바닥에서 떼어낸 후 원심 분리하여 세포 침전물만을 모았다. 이를 10% FBS가 함유된 EMEM 배양액에 다시 현탁 한 후, 24-웰 조직 배양용 평판에 각 웰 당 4 X 10⁴ 세포가 되도록 넣고, 24시간 동안 37℃, 7% CO2 조건 하에서 배양하였다. FBS가 함유 되지 않은 EMEM 배지로 교체한 뒤 다시 24시간 배양을 하였다. 24시간 뒤 동일한 배양액으로 배지를 교환한 뒤 표준을 잡기 위한 공 시료와 펩타이드들을 물과 10% DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 멸균상태로 용해한 다음, 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 ㎍/ml 및 5 ㎍/ml의 농도로 5일간 위와 동일 조건으로 배양하였다. 배양이 완료된 후 배양 상층액을 제거하고 PBS로 1회 세척하였다. 세척용액을 제거한 뒤 비색 SRB 용액(Sulforhodamine B, Sigma)으로 처리하고 PBS로 충분히 세척을 한 뒤 현미경으로 각 세포를 관찰하여 생존세포의 상태를 관찰하였으며(도 2), 자외선 590 nm에서 흡광도를 측정하여 각 세포의 생존상태를 도 3에 나타내었다.

도 2에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 펩타이드의 처리량이 증가할수록 골수에서 분리된 조혈모세포로부터 분화된 면역세포의 생존 상태가 향상되었다. 또한, 도 3에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 펩타이드의 처리량에 의존적으로 면역세포의 생존도가 증가하였다.

시험예 2: 합성 펩타이드의 B 임파구 성장 효과의 검증

본 발명의 펩타이드에 대한 B 임파구의 성장 효과를 검증하였다. Ramos B 임파구(한국세포주 은행, 한국)를 채취한 세포를 10% FBS(fetal bovine serum)가 함유된 EMEM이 들어 있는 250 ml 용량의 조직배양용 플라스크를 이용하여 배양하였다. 배양된 세포주를 0.25% 트립신 용액으로 배양용기 바닥에서 떼어낸 후 원심 분리하여 세포 침전물만을 모았다. 이를 10% FBS가 함유된 EMEM 배양액에 다시 현탁한 후, 24-웰 조직 배양용 평판에 각 웰 당 4 X 10⁴ 세포가 되도록 넣고, 48시간 동안 37℃, 7% CO2 조건 하에서 배양하였다. 배양후 FBS가 함유 되지 않은 EMEM 배지로 2번을 세척하여 교체한 뒤 표준을 잡기 위한 공 시료와 펩타이드들을 물과 10% DMSO (Dimethyl sulfoxide)에 멸균상태로 용해한 다음, 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 ㎍/ml 및 5 ㎍/ml의 농도로 3일 또는 5일 동안 위와 동일 조건으로 배양하였다. 배양이 완료된 후 배양 상층액을 제거하고 PBS로 1회 세척하였다. 세척용액을 제거한 뒤 비색 SRB 용액으로 처리하고 PBS로 충분히 세척을 한 뒤 자외선 590 nm에서 흡광도를 측정하여 각 세포의 3일과 5일째 각각의 생존상태를 도 4a 및 도 4b에 나타냈다. 도 4에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 펩타이드에 의해 B 임파구의 성장이 농도-의존적으로 촉진되었음을 확인할 수 있었다.

시험예 3: 합성 펩타이드의 세포독성의 검증

피부세포의 세포내독성이 있는지의 여부를 확인하기 위하여, 리지노 등의 방법(Rizzino, et al. Cancer Res., 48: 4266(1988))을 참조하여, HaCat 세포(한국세포주은행), NIH3T3 세포(한국세포주은행) 및 B16F10 세포주(한국세포주은행)를 이용한 SRB 비색법을 이용하여 측정하였다. 세포주를 10% FBS(fetal bovine serum)가 함유된 EMEM(Eagle's minimal essential media, Gibco)이 들어 있는 250 ml 용량의 조직 배양용 플라스크를 이용하여 배양하였다. 배양된 세포주를 0.25% 트립신 용액으로 배양용기 바닥에서 떼어낸 후 원심 분리하여 세포 침전물만을 모았다. 이를 FBS가 함유되지 않은 EMEM 배양액에 다시 현탁한 후, 96-웰 조직 배양용 평판에 각웰 당 1 X 10⁵ 세포가 되도록 넣고, 24시간 동안 37℃, 7% CO2 조건 하에서 배양하였다. 24시간 뒤 혈청을 완전히 제외한 동일한 배양액으로 배지를 교환한 뒤 표준을 잡기위한 공 시료와 각각의 펩타이드들을 물과 10% DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 멸균상태로 용해한 다음, 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 ㎍/ml, 10 ㎍/ml 및 100 ㎍/ml의 농도로 72시간을 위와 동일 조건으로 배양하였다. 배양이 완료된 후 배양 상층액을 제거하고 PBS로 1회 세척하였다. 세척용액을 제거한 뒤 비색 SRB 용액으로 처리하고 PBS로 충분히 세척을 한 뒤 현미경으로 각 세포를 관찰하여 생존세포의 상태를 관찰하였으며, 자외선 590 nm에서 흡광도를 측정하여 각 세포의 생존상태를 확인하였다. 각질세포주의 일종인 HaCat 세포, 섬유아세포의 일종인 NIH3T3 세포 및 멜라노사이트의 일종인 B16F10 세포주에 대하여, 저농도에서 고농도까지 투여한 펩타이드에 의한 세포 수의 감소는 전혀 관찰 되지 않았으며, 세포들의 현미경적인 관찰에서도 별다른 변화가 관찰되지 않았다. 이를 통해 본 발명의 펩타이드는 피부 관련 세포의 독성이 전혀 없음을 알 수 있으며, 이는 본 펩타이드를 피부에 처리하여도 피부세포에 큰 영향을 끼치지 않으리라는 것을 알 수 있다.

시험예 4: 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용한 합성 펩타이드의 염증 유발 사이토카인의 감소 측정

합성 펩타이드를 처리하여 염증 유발 사이토카인이 감소되는 것을 보다 직접적으로 확인하기 위해 HaCat 세포(한국세포주은행)에 합성 펩타이드를 처리한 뒤, TNF-α의 RNA 생성을 역전사 중합효소 연쇄반응으로 관찰하였다.

우선, TNF-α의 유도실험은 6-웰의 세포배양접시에 1 X 10⁵개의 Hacat 세포를 접종하여 3일을 배양한 뒤, 세포가 정착된 뒤에 2% 혈청으로 배지를 교환하면서, 대조군에는 용매만을, 양성 대조군에는 TNF-α와 INF-γ를 10 ㎍/ml를 그리고 양성대조군과 같은 농도로 처리한 곳에 합성 펩타이드를 1 ㎍ 및 10 ㎍을 투입한 뒤, 넣고, 6시간을 배양하였다. 이어, 대조군과 유발물질 그리고 유발물질과 펩타이드를 처리한 배양세포로부터 mRNA를 추출하여 TNF-α의 프라이머를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 사용한 프라이머의 뉴클레오타이드 서열은 다음과 같다: 전방향, 5`-GATCTCAAAGACAACCAACTAGTG-3`; 역방향, 5`-CTCCAGCTGGAAGACTCCTCCCAG-3`. 실험 결과, 합성 펩타이드는 IL-13과 동일하게 면역반응에 주요한 역할을 하는 유전자인 TNF-α의 발현을 억제한다는 것을 알 수 있었다(도 5).

시험예 5: 제조된 펩타이드의 열 안정성

합성예를 통해 제조된 펩타이드를 R&D(USA)에서 구입한 표준폼 사이토카인 (IL-13)과 0.11 mg/ml의 농도로 PBS에 녹였다. 준비된 용액을 1 ml씩 유리 바이알에 넣은 후 37℃에서 정치하였다. 37℃에 정치된 용액을 0, 5, 10, 20, 30, 40, 그리고 70일째에 샘플링하여 날짜별로 원심 분리하여 변성된 펩타이드나 단백질을 제거하고 상층액을 취해 HPLC를 이용해 정량을 하였다(도 6). 합성 펩타이드의 경우 천연의 성장인자들보다 잔존량이 높았으며, 이를 시료로 삼아 시험예 1과 동일한 방법으로 세포에 처리한 뒤, 잔존해 있는 활성을 측정함으로써 펩타이드의 열 안정성을 분석하여 모든 경우 성장인자류보다 활성도가 더 높았음을 알 수 있었다.

실시예 1: 나노화 펩타이드의 제조

상기 합성 예에서 얻은 펩타이드를 50 mg을 각 각 정확히 칭량한 뒤 증류수 500 ml로 충분히 교반하여 용해하였다. 배합체 용액을 레시틴 5g, 소듐 올리에이트(sodium oleate) 0.3ml, 에탄올 50ml 그리고 약간의 유상과 함께 혼합한 후, 총량이 1 L가 되도록 증류수로 양을 맞춰 준 다음, 마이크로플루다이저로 고압을 이용하여 유화시켜 사이즈 100 nm 정도의 나노좀을 제조하였다. 제조된 나노좀은 최종 농도가 약 1,000 ppm으로 단독 혹은 복합적으로 화장품 제조용으로 사용되었다.

제형예 1: 유연화장수

상기 실시예 1에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 유연화장수를 일반적인 화장수 제조방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
펩타이드 나노좀	0.001
1,3-부틸렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
PEG 1500	1.0
소듐히알루로네이트	1.0
폴리솔베이트 20	0.5
에탄올	8.0
방부제, 색소	적량
벤조페논-9	0.05
향	미량
정제수	잔량
합계	100

제형예 2: 보습크림

상기 실시예 1에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 영양크림을 일반적인 보습크림 제조방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
펩타이드 나노좀	0.001
메도우폼오일	3.0
세테아릴알콜	1.5
스테아린산	1.5
글리세릴스테아레이트	1.5
유동 파라핀	10.0
밀납	2.0
폴리솔베이트60	0.6
솔비탄 세스퀴올레이트	2.5
스쿠알란	3.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
글리세린	5.0
트리에탄올아민	0.5
토코페릴아세테이트	0.5
방부제, 색소	적량
향	적량
정제수	잔량
합계	100

제형예 3: 보습화장수

상기 실시예 1에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 영양화장수를 일반적인 화장수 제조방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
펩타이드 나노좀	0.002
1,3-부틸렌글리콜	4.0
글리세린	4.0
세테아릴알콜	0.8
글리세릴스테아레이트	1.0
트리에탄올아민	0.13
토코페릴아세테이트	0.3
유동파라핀	5.0
스쿠알란	3.0
마카다미아너트오일	2.0
폴리솔베이트60	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	0.5
카르복시비닐폴리머	1.0
방부제,색소	적량
향	적량
정제수	잔량
합계	100

제형예 4: 에센스

상기 실시예 1에서 제조된 4종의 펩타이드 나노좀 중 적어도 한 종류의 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 에센스를 일반적인 에센스 제조방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
펩타이드 나노좀	0.005
글리세린	10.0
1,3-부틸렌글리콜	5.0
PEG 1500	2.0
알란토인	0.1
DL-판테놀	0.3
EDTA-2Na	0.02
히드록시에틸 셀룰로오스	0.1
소듐히알루로네이트	8.0
카르복시비닐폴리머	0.2
트리에탄올아민	0.18
옥틸도데세스-16	0.4
에탄올	6.0
향, 방부제, 색소	적량
정제수	잔량
합계	100

실시예 2: 제1서열 펩타이드의 아토피 경감효과 분석

실시 예에서 합성한 펩타이드의 아토피 유발 억제 효과를 분석하기 위해 아토피 유발 생쥐(NC/NGA 중앙실험동물 한국)의 등 부위 털을 제모크림을 이용하여 제모한 뒤 집진드기 추출물을 등 윗부분에 도포하여 10일 후에 유발된 아토피 구역에 1 ㎍/㎕의 서열목록 제1서열의 펩타이드를 10 ㎕, 그리고 등 하부에는 대조군으로 PBS 10 ㎕를 각각 0일, 2일 그리고 4일째 투여 하였다. 10일 간의 관찰 기간을 두고 난 뒤 아토피의 감소 상태를 확인하였다. 그림 7은 본 발명의 IL-13-유래 펩타이드에 의한 생쥐의 아토피 경감 효과를 보여주었다.

도 1은 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 펩타이드의 고성능 액상 크로마토그래피 분석 결과를 나타내는 그래프이다.

도 2는 합성 펩타이드를 이용한 조혈모세포의 B 임파구 형성을 나타내는 사진이다.

도 3은 합성 펩타이드를 이용한 면역관련 세포의 성장효과를 나타내는 그래프이다.

도 4는 합성 펩타이드의 B 임파구 성장 효과를 나타내는 그래프이다.

도 5는 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용한 합성 펩타이드의 염증 유발 사이토카인 TNF-α의 감소를 보여주는 결과이다.

도 6은 본 발명의 펩타이드의 열안정성을 비교한 그래프이다.

도 7은 본 발명의 펩타이드를 처리한 마우스 등 피부의 아토피 개선효과에 대한 실험 결과이다.

<110> caregen <120> IL-13-derived peptides <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Thr Gln Arg Leu Ser Gly Phe 1 5

Claims (8)

1. 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 IL-13에서 유래된 것을 특징으로 하는 펩타이드.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 면역세포의 성장 촉진능을 갖는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
4. 제 4 항에 있어서, 상기 면역세포는 B 림프구인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 친-염증(pro-inflammatory) 사이토카인의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
6. 상기 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 Th1-매개 면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 Th1-매개 면역 질환은 염증 질환, 자가면역질환 또는 이식 거부인 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 염증 질환은 아토피성 피부염인 것을 특징으로 하는 조성물.

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