KR20100092463A

KR20100092463A - Ｍｃｐ-1 결합형 핵산 및 이의 용도

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Publication number: KR20100092463A
Application number: KR1020107011757A
Authority: KR
Inventors: 웨르너르 퍼르쉬케이; 플로리안 야로슈; 디르크 율베르그; 스벤 클루스만; 클라우스 부크너르; 크리스티안 매쉬
Original assignee: 녹손 파르마 아게
Priority date: 2007-11-30
Filing date: 2008-11-29
Publication date: 2010-08-20
Also published as: RU2542973C2; MX2010005916A; AU2008329070A1; CN101878305A; ZA201002974B; CA2707089A1; WO2009068318A1; BRPI0819845A2; JP2011504736A; AU2008329070B2; EP2229442A1; US20150141496A1; JP5777341B2; RU2010126662A; US20100311816A1

Abstract

본 발명은 MCP-1와 결합가능한 핵산 분자에 관한 것으로, 여기에서 상기 핵산 분자는 만성 질병 또는 만성 장애, 바람직하게는, 만성 호흡기 질환, 만성 신장 질환 및 전신성 홍반성 낭창으로 구성된 군으로부터 선택된 만성 질병 또는 만성 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 약제에 사용하기 위한 용도인 것이다.

Description

ＭＣＰ-1 결합형 핵산 및 이의 용도 {MCP-1 BINDING NUCLEIC ACIDS AND USE THEREOF}

본 발명은 MCP-1에 결합하는 핵산, 각각 약제 및 진단제 제조를 위한 이의 용도에 관한 것이다.

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인간 MCP-1 (단핵세포 화학 주성 단백질; monocyte chemoattractant protein)-1; 일명, MCAF (단핵세포 화학 주성 및 활성 인자;monocyte chemoattracting and activating factor); CCL2; SMC-CF (평활근 세포-콜로니 자극 인자; smooth muscle cell-colony simulating factor); HC-11; LDCF; GDCF; TSG-8; SCYA2; A2; SwissProt accession code, P13500)은 개별적으로 세 그룹으로 특성화되어 있다 (Matsushima 1988; Rollins 1989; Yoshimura 1989). 이는 76개의 아미노산 (amino acids)으로 구성되며, 모든 케모카인 (chemokines)와 같은 헤파린 결합 위치 (heparin binding site)를 갖는다. 이 두 가지의 분자 내 디설피드 (disulfide) 결합은 분자에 안정적이고 단단한 구조를 부여한다. 더군다나, MCP-1은 아미노 말단 (amino terminus)에 피로글루타메이트 (pyroglutamate)을 운반한다. 트레오닌(Thr) 71 위치에, 잠재적인 O-결합된 글리코실레이션 결합 위치 (O-linked glycosylation site)가 위치하고 있다. 추가적인 MCP 계 멤버(member)는 인간 (MCP-2, -3, -4) 및 마우스 (MCP-2, -3, -5)에 모두 존재한다. 상기 인간 단백질은 인간 MCP-1에 70% 상동성이 있다.

MCP-1의 구조는 NMR (Handel 1996) 및 X-레이(ray) (Lubkowski 1997)에 의해서 규명되었다. 상기 MCP-1 단량체 (MCP-1 monomer)는 그리크 키 모티프 (Greek key motif) 내의 3개의 역평형성(antiparallel) 베타-주름형(β-pleated) 시트 내로 이르게 하는 긴 루프(loop)에 아미노-말단 시스테인들이 뒤따르는, 전형적인 케모카인 폴드(fold)를 갖는다. 이 단백질은 3개의 베타 시트 (β-sheet)를 덮고 있는 알파 헬릭스 (α-helix) 내에서 종결된다(PDB 데이터 접근 코드; 1DOK).

MCP-1의 3차원 구조는 서로 상이한 포유동물들로부터 형성됨에도 불구하고, 그 종들은 일반적으로 유지되고, 아미노산 서열은 진화 동안은 특별히 보존되지 않았다. 서열 배열(Sequence alignment) 결과들은 최초 76개의 아미노산 내에서 인간 및 설치류 MCP-1 (또는 소위 JE) 간에 55%의 총체적 서열 유사성을 갖음을 입증하고 있다. 아미노산 서열과는 별개로, 설치류 MCP-1은 인간 MCP-1과 분자 크기 (125 아미노산) 및 글리코실레이션 (glycosylation) 의 정도면에서 서로 상이하다. 설치류 MCP-1은 인간 MCP-1 내에 존재하지 않으며, 시험관 내 생물학적 활성을 위해 요구되지 않은 49-아미노산 카르복시 말단 도메인 (domain)을 함유하고 있다. 인간 MCP-1는 하기와 같이 MCP-1 형태와 동일한 아미노산의 백분율을 공유하고 있다:

- Macaca mulatta (레서스 원숭이-Rhesus monkey) MCP-1 97%

- Sus Scrofa (돼지-Pig) MCP-1 79%

- Equus caballus (말-Horse) 78%

- Canis familiaris (개-Dog) MCP-1 76%

- Oryctolagus cuniculus (토끼-Rabbit) MCP-1 75%

- Bos Taurus (소-Bovine) 72%

- Homo sapiens MCP-3 71%

- Homo sapiens Eotaxin 64%

- Homo sapiens MCP-2 62%

- Mus musculus (마우스-Mouse) MCP-1 55%

- Rattus norvegicus (래트-Rat) MCP-1 55%

이와 같은 높은 단계의 분지 (divergence)인 경우에, 설치류 모델에서의 약리학적 연구를 위한 성공적인 수행을 위하여 설치류 MCP-1의 길항제를 제조하는 것이 필수적일 수 있다.

MCP-1은 단핵세포/대식세포 (monocyte/macrophages), 호염기구 (basophils), 활성화 T 세포 (activated T cells) 및 NK 세포 (NK cells)의 강력한 유인물질이다. 내피세포 (endothelial cells), 상피세포 (epithelial cells), 섬유아세포 (fi broblasts), 각질세포 (keratinocytes), 활액세포 (synovial cells), 사구체간질 세포 (mesangial cells), 골아세포 (osteoblasts), 평활근 세포 (smooth muscle ce lls) 등과 같은 다양한 세포 종류뿐만 아니라, 다수의 종양세포들은 MCP-1을 발현한다(Baggiolini 1994). 이들의 발현은 IL-1베타, TNF-알파, IFN-감마, LPS (lipo polysaccharide), 및 GM-CSF 등과 같은 다양한 종류의 염증 전구성 물질 (pro inflammatory agents)에 의하여 자극된다.

무차별한 케모카인 네트워크 (chemokine network)에서와는 달리, MCP-1은 높은 친화도를 갖고 키모카인 수용체 CCR2와만 결합하는, 그의 수용체로서의 용도면에서 매우 특이적이다. 모든 케모카인 수용체와 같이, CCR2는 GPCR이다 (Dawson 2003). CCR2는 카르복시말단 영역, CCR2a 및 CCR2b를 코드화하는 mRNA의 호환적인 스플라이싱 (alternative splicing)에 의한 2개의 약간 상이한 형태로 발현되는 듯하다 (Charo 1994). 이런 수용체들은 대식세포, 미엘로이드(myeloid) 전구체 세포 및 활성화 T 세포에서 발현된다 (Myers 1995; Qin 1996). HEK-293 세포 내로 감염된 수용체로의 MCP-1의 해리상수 (dissociation constant)는 대식세포에서 측정된 값들과 일치하는 260 pM이었다 (Myers 1995; Van Riper 1993). MCP-1로 감염된 HEK-293 세포들에 대한 CCR2b의 활성화는 90 pM의 농도에서 아데닐 사이클라제 (adenylyl cyclase)를 저해하며, 약간 높은 농도에서는 세포내의 칼슘을 동원하고, 이는 포스파티딜 이노시톨 가수분해 (phosphatidyl inositol hydrolysis)와 무관한 것으로 보인다. 이러한 아데닐 사이클라제의 효과 및 세포내 칼슘 방출은 백일해 독소(pertussis toxin)에 의해 강력하게 저해되며, 이는 신호 전달 (transduction)에서 Gi형 헤테로트리머릭(heterotrimeric) G-단백질과 관련됨을 의미한다 (Myers 1995).

MCP-1은 염증 조직으로의 대식세포 순항 (recruitment)과 관련된다. 거기서, 내재하는 대식세포는 MCP-1 및 기타의 케모카인, 및 TNF, IL-1베타 및 기타의 사이토카인들을 분비하고, 이들은 부착성 분자 (adhesion molecule)들의 배터리 (battery)를 발현하도록 내피세포들을 활성화한다. 결과적으로 생성된 “끈적한 (sticky)” 내피세포는 혈관 내에서의 단핵세포가 그 표면상에 굴러가도록 한다. 여기서, 단핵세포들은 내피세포 표면에 나타난 MCP-1와 만나게 되며, 이들은 단핵세포의 CCR2와 결합하며 이들을 활성화시킨다. 이는 결국 견고한 포획, 내피세포를 따라 단핵세포의 퍼짐 및 이는 단핵세포가 대식세포로 분화하고 최대 MCP-1 농도를 갖는 부위로 이동하는, 주변조직으로의 이동을 초래한다.

MCP-1은 헤파린-결합, 대부분 기본 및 구조적으로 연관된 분자들의 적은 분자량의 (약 8-14 kDa)계열의 케모카인 계열의 구성원이다. 이들은 염증 조직에 우세하게 형성되며, 백혈구의 순항, 활성화 및 증식을 조절한다 (Baggiolini 1994; Springer 1995; Schall 1994). 케모카인은 호중구(neutrophils), 호산구 (eosino phils), 호염기구 (basophils), 단핵세포(monocyte), 대식세포 (macrophage), 비만 세포 (mast cell), T 및 B 세포들의 화학주성 (chemotaxis)을 선택적으로 유도한다. 이들의 화학주성 효과 (chemotactic effect)에 덧붙여, 이들은 반응성의 세포 (responsive cells)내의 다른 효과, 예를 들면, 세포 모양의 변화, 세포 내의 유리형 칼슘 이온의 농도에서의 일시적인 증가, 탈과립화 (degranulation), 인테그린 (integrins)의 상향조절 (upregulation); 류코트리엔 (leukotrienes), 프로스타글란딘 (prostaglandins), 트롬복산 (thromboxans) 등과 같은 생리활성 지질의 생성 또는 호흡성 방출 (respiratory burst; 병원성 유기물 또는 종양 세포들의 붕괴를 위한 활성 산소종의 방출)에 선택적으로 영향을 미친다. 그러므로, 추가적인 염증 전구성 매개물의 분비, 감염 혹은 염증 부위로의 백혈구 화학주성 (chemotaxis) 및 분출 (extravasation)을 자극함으로써, 케모카인들은 염증성 반응의 에스컬레이션 (escalation)을 촉발한다.

4개의 보존된 시스테인 잔기 (conserved cystein residue) 중 처음 2개의 배열에 기초하여, 케모카인들은 4개의 그룹으로 구분할 수 있다: (1) 시스테인들이 앞뒤 일렬로 배열된 CC 또는 베타-케모카인, (2) 하나의 추가적인 아미노산 잔기에 의해 분리된 CXC 또는 알파-케모카인, (3) 오늘날까지 알려진 바에 의하면 하나의 디설피드 결합만을 갖는 것으로 알려진 림포탁틴 (lymphotactin)을 갖는 XC 또는 감마 케모카인, 및 (4) 오늘날까지 알려진 바에 의하면 오직 클래스 멤버 (class member)로서 멤브레인-결합된 프렉알킨 (membrane-bound fractalkin)을 갖고, 시스테인 사이에 3개의 아미노산 잔기가 위치한 특징 하는 CX3C-케모카인 (Bazan 1997).

CXC 케모카인들, 특히, 아미노 말단에 아미노산 서열 ELR을 갖고 있는 CXC 케모카인들은 호중구에 일차적으로 작용한다. 호중구에 활성을 갖는 CXC 케모카인들의 예로는 IL-8, GRO-알파, GRO-베타, 및 GRO-감마, NAP-2, ENA-78 및 GCP-2을 들 수 있다. CC 케모카인들은 단핵세포 (monocytes), 대식세포 (macrophage), 호산구 (eosinophils), 호염기구 (basophils)와 같은 더 넓은 범위의 백혈구 뿐 만 아니라, T 및 B 임파구 (lymphocytes)에 작용한다 (Oppenheim 1991; Baggiolini 1994; Miller 1992; Jose 1994; Ponath 1996a). 이들의 예로는 I-309; MCP-1, MCP-2. MCP-3, MCP-4, MIP-1알파 및 -베타, RANTES, 및 에오탁신 (eotaxin)을 들 수 있다.

케모카인들은 7개의 트랜스멤브레인-스패닝 (transmembrane-spanning) G 다백질-결합 수용체의 슈퍼패밀리 (superfamily)에 속하는 수용체를 통해 작용한다 (GPCRs; Murphy 200). 일반적으로 말하면, 케모카인과 케모카인 수용체간의 상호작용은 하나의 케모카인이 다수의 케모카인 수용체와 결합할 수 있고, 역으로 단일 케모카인 수용체가 수개의 케모카인과 상호작용할 수 있다는 점에서 불규칙적인 경향이 있다. CC 케모카인을 위한 알려진 일부 수용체들로는 MIP-1알파 및 RANTES와 결합하는 CCR1 (Neote 1993; Gao 1993); MCP-1, MCP-2, MCP-3 및 MCP-4을 포함하는 케모카인과 결합하는 CCR2 (Charo 1994; Myers 1995; Gong 1997; Garcia-Zepeda 1996); 에오탁신 (eotaxin), RANTES, 및 MCP-3을 포함하는 케모카인과 결합하는 CCR3 (Ponath 1996b); MCP-1, MIP-1알파, 및 RANTES에 대한 반응으로 신호전달하는 것으로 밝혀진 CCR4 (Power 1995); 및 MIP-1알파 및 MIP-1-베타, 및 RANTES에 대한 반응으로 신호전달하는 것으로 나타난 CCR5 (Boring 1996; Raport 1996; Samson 1996)을 포함한다.

상기한 바와 같이, MCP 계 (1-4)의 4가지 모든 멤버 (member)들은 모두 CCR2와 결합하는 반면에, MCP-2, MCP-3 및 MCP-4은 CCR1 및 CCR3와도 (Gong 1997; Heath 1997; Uguccioni 1997), 또한 MCP-2의 경우에는, CCR5와도 상호작용할 수 있다 (Ruffing 1998). MCP 계와 높은 상동성을 보이는 또다른 CC 케모카인은 알러젠-도전된 (allergen-challenged), 민감화 (sensitized) 기니 피그로부터 수득한 기관지 폐포성 유출액 (bronchoalveolar lavage fluid)으로부터 최초 분리된 에오탁신 (eotaxin)이다 (Jose 1994). 에오탁신도 역시 CCR2를 활성화할 수 있는 것으로 나타났다 (Martinelli 2001).

본 발명의 근본적인 해결 과제는 MCP-1와 특이적으로 상호작용하는 수단을 제공하고 상기 수단은 만성 질병 (disease) 및 만성 장애 (disorder)를 각각 예방 및/또는 치료하기에 적합한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명의 해결 과제는 MCP-1와 특이적으로 상호작용하는 핵산 (nucleic acid)에 근거한 수단을 제공하고 상기 핵산은 만성 질병 (disease) 및 만성 장애 (disorder)를 각각 예방 및/또는 치료하기에 적합한 것이다.

본 발명의 보다 더 추가적인 해결 과제는 질병의 치료를 위한 진단제를 제조하기 위한 수단을 제공하는 것으로, 상기 질병은 각각 만성 질병 (disease) 및 만성 장애 (disorder)인 것이다.

상술한 문제점과 연관되어, 상기 각각 만성 질병 (disease) 및 만성 장애 (disorder)는 바람직하게는 호흡기 질환, 만성 신장 질환 및 전신성 홍반성 낭창인 것이다.

본원에서 열거되는 상기 또는 기타 해결과제들은 첨부된 독립 항들의 주제에 의해 해결된다. 바람직한 구현예는 종속항들로부터 획득가능하다.

본 발명의 해결과제는 독립 항들의 주제에 의해 해결된다. 바람직한 구현예들은 종속항들의 영향을 받는다.

보다 상세하게는, 본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차 구현예기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면으로서, 본 발명의 상기 해결 과제는 MCP-1와 결합가능한 핵산 분자에 의하여 해결되며, 여기에서 상기 핵산 분자는 만성 질병 (disease) 및/또는 만성 장애 (disorder), 바람직하게는, 만성 호흡기 질환, 만성 신장 질환 및 전신성 홍반성 낭창으로 구성된 군으로부터 선택된 만성 질병 (disease) 및/또는 만성 장애 (disorder)의 치료 및/또는 예방을 위한 약제에 사용하기 위한 용도인 것이다.

본 발명의 두 번째 측면의 제 1차 구현예기도 한, 본 발명의 두 번째 측면으로서, 본 발명의 상기 해결 과제는 MCP-1와 결합가능한 핵산 분자에 의하여 해결되며, 여기에서 상기 핵산 분자는 만성 질병 (disease) 및/또는 만성 장애 (disorder), 바람직하게는, 만성 호흡기 질환, 만성 신장 질환 및 전신성 홍반성 낭창으로 구성된 군으로부터 선택된 만성 질병 (disease) 및/또는 만성 장애 (disorder)의 진단을 위한 진단제에 사용하기 위한 용도인 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 1차 구현예기도 한, 본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면으로서, 상기 만성 호흡기 질환은 폐렴(pneumonitis), 폐 및 흉막 염증 (lung and pleura inflammation), 늑막염 (pleuritis), 흉수(pleural effusion), 루푸스 폐렴 (lupus pneumonitis), 만성 미만형 간질성 폐질환(chronic diffuse interstitial lung disease), 폐색전증(pulmonary emboli), 폐출혈 (pulmonary hemorrhage), 위축성 폐 증후군 (shrinking lung syndrome), 폐고혈압 (pulmonary hypertension) 및 만성 폐색성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 1차 및 제 2차 구현예기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 3차 구현예로서, 상기 폐고혈압 (pulmonary hypertension)은 좌측 심장 질환 수반 폐고혈압, 폐질환 및/또는 저산소증 수반 폐고혈압, 혈전성 및/또는 색전성 질환으로 기인한 폐고혈압, 폐 동맥성 고혈압, 바람직하게는 특발성 폐 동맥성 고혈압, 콜라게나제(collagenose)-수반 폐 동맥성 고혈압, 가족성 폐 동맥성 고혈압 (familial pulmonary arterial hypertension), 기타 질환을 수반하는 폐 동맥성 고혈압 및 정맥성 또는 말초성 질환을 수반하는 폐 동맥성 고혈압으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 1차, 제 2차 및 제 3차 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 4차 구현예로서, 상기 만성 폐색성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease)은 폐 정맥성 침범 (pulmo nary vascular involvement)을 수반 또는 수반하지 않는 만성 폐색성 폐 질환이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 1차, 제 2차, 제 3차 및 제 4차 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 5차 구현예로서, 상기 만성 폐색성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease)은 만성 기관지염 및 폐기종으로 구성된 군으로부터 선택된 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 1차 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 6차 구현예로서, 상기 만성 신장 질환은 낭창성신염 (lupus nephritis), 막성 증식성 사구체 신염 (membranoproliferative glomerulonephritis), 막성 사구체 신염 (membranous glomerulonephritis), IgA 신장애(nephropathy), 연쇄상구균 감염후 사구체신염 (post-streptococcal glomeru lonephritis), 급속진행형 사구체신염 (rapidly progressive glomerulonephritis), 신염 증후군 (nephritic syndrome), 국소성 분절성 사구체경화증 (focal segmental glomerulosclerosis), 당뇨병성 신장애(diabetic nephropathy), 신증후군 (nephr otic syndrome), 및 신증후군으로 구성된 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 낭창성신염인 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 1차, 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차 및 제 6차 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 7차 구현예로서, 상기 핵산은 1A형(type 1A) 핵산, 1B형(type 1B) 핵산, 2형(type 2) 핵산, 3형(type 3) 핵산, 4형(type 4) 핵산 및 서열 번호 (SEQ. ID. No.) 87 내지 115중 임의의 핵산 서열을 갖는 핵산을 포함하는 군으로부터 선택되는 핵산인 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 7차 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 8차 구현예로서, 상기 2형 핵산은 5’->3’ 방향으로 1차 스트레치(stretch) 박스(Box) B1A, 2차 스트레치 박스 B2, 및 3차 스트레치 박스 B1B을 포함하고 있으며,

여기에서 상기 1차 스트레치 박스 B1A 및 3차 스트레치 박스 B1B는 선택적으로 상호간에 혼성화될 수 있으며, 이 혼성화에 의해 이중가닥 구조가 형성되며, 여기에서

1차 스트레치 박스 B1A는 ACGCA, CGCA 및 GCA을 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하며,

2차 스트레치 박스 B2는 CSUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGYGGCUC의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,

3차 스트레치 박스 B1B는 UGCGU, UGCG 및 UGC을 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 8차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 9차 구현예로서, 상기 2차 스트레치 박스 B2는 CGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUC의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 8차 및 제 9차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 10차 구현예로서,

(a) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 ACGCA의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 3차 스트레치 박스 B1B는 UGCGU의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는;

(b) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 CGCA의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 3차 스트레치 박스 B1B는 UGCG의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는;

(c) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 GCA의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 3차 스트레치 박스 B1B는 UGC 또는 UGCG의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 8차, 제 9차 및 제 10차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 11차 구현예로서,

상기 1차 스트레치 박스 B1A는 GCA의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 8차, 제 9차, 제 10차 및 제 11차 구현예의 하나의 구현예, 바람직하게는 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 11차 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 12차 구현예로서,

상기 3차 스트레치 박스 B1B는 UGCG의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 8차, 제 9차, 제 10차, 제 11차 및 제 12차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 13차 구현예로서, 상기 핵산은 서열 번호 37, 서열 번호 116, 서열 번호 117 및 서열 번호 278에 따른 핵산 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제1 차, 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차, 제 6차 및 제 7차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 14차 구현예로서, 상기 3형 핵산은 5’->3’ 방향으로 1차 스트레치(stretch) 박스(Box) B1A, 2차 스트레치 박스 B2A, 3차 스트레치 박스 B3, 4차 스트레치 박스 B2B, 5차 스트레치 박스 B4, 6차 스트레치 박스 B5A, 7차 스트레치 박스 B6, 8차 스트레치 박스 B5B및 9차 스트레치 박스 B1B을 포함하고 있으며,

여기에서

상기 1차 스트레치 박스 B1A 및 9차 스트레치 박스 B1B는 선택적으로 상호간에 혼성화될 수 있으며, 이 혼성화에 의해 이중가닥 구조가 형성되며,

상기 2차 스트레치 박스 B2A 및 4차 스트레치 박스 B2B는 선택적으로 상호간에 혼성화될 수 있으며, 이 혼성화에 의해 이중가닥 구조가 형성되며,

상기 6차 스트레치 박스 B5A 및 8차 스트레치 박스 B5B는 선택적으로 상호간에 혼성화될 수 있으며, 이 혼성화에 의해 이중가닥 구조가 형성되며,

여기에서

상기 1차 스트레치 박스 B1A는 GURCUGC, GKSYGC, KBBSC 및 BNGC을 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고,

상기 2차 스트레치 박스 B2A는 GKMGU의 뉴클레오티드 서열을 포함하고,

상기 3차 스트레치 박스 B3는 KRRAR의 뉴클레오티드 서열을 포함하고,

상기 4차 스트레치 박스 B2B는 ACKMC의 뉴클레오티드 서열을 포함하고,

상기 5차 스트레치 박스 B4는 CURYGA, CUWAUGA, CWRMGACW 및 UGCCAGUG을 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고,

상기 6차 스트레치 박스 B5A는 GGY 및 CWGC을 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고,

상기 7차 스트레치 박스 B6는 YAGA, CKAAU 및 CCUUUAU을 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고,

상기 8차 스트레치 박스 B5B는 GCYR 및 GCWG을 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고,

상기 9차 스트레치 박스 B1B는 GCAGCAC, GCRSMC, GSVVM 및 GCNV을 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 14차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 15차 구현예로서, 상기 3차 스트레치 박스 B3는 GAGAA 또는 UAAAA의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 14차 및 제 15차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 16차 구현예로서, 상기 5차 스트레치 박스 B4는 CAGCGACU 또는 CAACGACU의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 14차, 제 15차 및 제 16차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 17차 구현예로서, 상기 5차 스트레치 박스 B4는 CAGCGACU 의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 박스 B3는 UAAAA의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 14차, 제 15차, 및 제 16차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 18차 구현예로서,

상기 5차 스트레치 박스 B4는 CAACGACU의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 박스 B3는 GAGAA의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 14차, 제 15차, 제 16차, 제 17차 및 제 18차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 19차 구현예로서,

상기 7차 스트레치 박스 B6는 UAGA의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 14차, 제 15차, 제 16차, 제 17차, 제 18차 및 제 19차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 20차 구현예로서,

(a) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 GURCUGC의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 9차 스트레치 박스 B1B는 GCAGCAC의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는;

(b) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 GKSYGC의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 9차 스트레치 박스 B1B는 GCRSMC의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는;

(c) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 KBBSC의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 9차 스트레치 박스 B1B는 GSVVM의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는;

(d) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 BNGC의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 9차 스트레치 박스 B1B는 GCNV의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 20차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 21차 구현예로서,

(a) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 GUGCUGC의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 9차 스트레치 박스 B1B는 GCAGCAC의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는;

(b) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 GUGCGC의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 9차 스트레치 박스 B1B는 GCGCAC의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는;

(c) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 KKSSC의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 9차 스트레치 박스 B1B는 GSSMM의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는;

(d) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 SNGC의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 9차 스트레치 박스 B1B는 GCNS의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 21차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 22차 구현예로서,

상기 1차 스트레치 박스 B1A는 GGGC의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 9차 스트레치 박스 B1B는 GCCC의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 14차, 제 15차, 제 16차, 제 17차, 제 18차, 제 19차, 제 20차, 제 21차, 및 제 22차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 23차 구현예로서,

상기 2차 스트레치 박스 B2A는 GKMGU의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 4차 스트레치 박스 B2B는 ACKMC의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 23차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 24차 구현예로서,

상기 2차 스트레치 박스 B2A는 GUAGU의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 4차 스트레치 박스 B2B는 ACUAC의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 14차, 제 15차, 제 16차, 제 17차, 제 18차, 제 19차, 제 20차, 제 21차, 제 22차, 제 23차 및 제 24차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 25차 구현예로서,

(a) 상기 6차 스트레치 박스 B5A는 GGY의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 8차 스트레치 박스 B5B는 GCYR의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는;

(b) 상기 6차 스트레치 박스 B5A는 CWGC의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 8차 스트레치 박스 B5B는 GCWG의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 25차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 26차 구현예로서,

상기 6차 스트레치 박스 B5A는 GGC의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 8차 스트레치 박스 B5B는 GCCG의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 14차, 제 15차, 제 16차, 제 17차, 제 18차, 제 19차, 제 20차, 제 21차, 제 22차, 제 23차, 제 24차, 제 25차 및 제 26차 구현예의 하나의 구현예, 바람직하게는 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 25차 및 제 26차 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 27차 구현예로서,

상기 6차 스트레치 박스 B5A는 제 8차 스트레치 박스 B5B의 뉴클레오티드 GCY와 선택적으로 상호간에 혼성화되는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 14차, 제 15차, 제 16차, 제 17차, 제 18차, 제 19차, 제 20차, 제 21차, 제 22차, 제 23차, 제 24차, 제 25차, 제 26차 및 제 27차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 28차 구현예로서,

상기 핵산은 서열번호 56에 따른 핵산을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 14차, 제 15차, 제 16차, 제 17차, 제 18차, 제 19차, 제 20차, 제 21차, 제 22차, 제 23차, 제 24차, 제 25차, 제 26차 및 제 27차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 29차 구현예로서,

상기 핵산은 서열번호 57 내지 61, 서열번호 67 내지 71 및 서열 번호 73에 따른 핵산을 포함하는 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 1차, 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차, 제 6차 및 제 7차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 30차 구현예로서, 상기 4 형 핵산은 5’->3’ 방향으로 1차 스트레치(stretch) 박스(Box) B1A, 2차 스트레치 박스 B2 및 3차 스트레치 박스 B1B을 포함하고 있으며,

여기에서

상기 1차 스트레치 박스 B1A 및 상기 3차 스트레치 박스 B1B는 선택적으로 상호간에 혼성화될 수 있으며, 이 혼성화에 의해 이중가닥 구조가 형성되며,

상기 1차 스트레치 박스 B1A는 AGCGUGDU, GCGCGAG, CSKSUU, GUGUU, 및 UGUU을 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하며;

상기 2차 스트레치 박스 B2는 AGNDRDGBKGGURGYARGUAAAG, AGGUGGGUGGUAGUAAG UAAAG 및 CAGGUGGGUGGUAGAAUGUAAAGA을 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하며;

상기 3차 스트레치 박스 B1B는 GNCASGCU, CUCGCGUC, GRSMSG, GRCAC, 및 GGCA을 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 30차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 31차 구현예로서,

(a) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 GUGUU의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 3차 스트레치 박스 B1B는 GRCAC의 뉴클레오티드 서열을 포함하고;

(b) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 GCGCGAG의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 3차 스트레치 박스 B1B는 CUCGCGUC의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는;

(c) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 CSKSUU의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 3차 스트레치 박스 B1B는 GRSMSG의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는;

(d) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 UGUU의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 3차 스트레치 박스 B1B는 GGCA의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는;

(e) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 AGCGUGDU의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 3차 스트레치 박스 B1B는 GNCASGCU의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 31차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 32차 구현예로서,

상기 1차 스트레치 박스 B1A는 CSKSUU의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 3차 스트레치 박스 B1B는 GRSMSG의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 32차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 33차 구현예로서,

상기 1차 스트레치 박스 B1A는 CCGCUU의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 3차 스트레치 박스 B1B는 GGGCGG의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 30차, 제 31차, 제 32차, 및 제 33차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 34차 구현예로서,

상기 2차 스트레치 박스 B2는 AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 30차, 제 31차, 제 32차, 제 33차 및 제 34차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 35차 구현예로서,

상기 핵산은 서열번호 80 및 서열번호 81에 따른 핵산 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 1차, 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차, 제 6차 및 제 7차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 36차 구현예로서, 상기 1A 형 핵산은 5‘->3’ 방향으로 1차 스트레치(stretch) 박스(Box) B1A, 2차 스트레치 박스 B2, 3차 스트레치 박스 B3, 4차 스트레치 박스 B4, 5차 스트레치 박스 B5, 6차 스트레치 박스 B6 및 7차 스트레치 박스 B1B을 포함하고 있으며,

여기에서

상기 1차 스트레치 박스 B1A 및 상기 7차 스트레치 박스 B1B는 선택적으로 상호간에 혼성화될 수 있으며, 이 혼성화에 의해 이중가닥 구조가 형성되며,

상기 1차 스트레치 박스 B1A는 AGCRUG의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,

상기 2차 스트레치 박스 B2는 CCCGGW의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,

상기 3차 스트레치 박스 B3는 GUR의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,

상기 4차 스트레치 박스 B4는 RYA의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,

상기 5차 스트레치 박스 B5는 GGGGGRCGCGAYC의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,

상기 6차 스트레치 박스 B6는 UGCAAUAAUG 또는 URYAWUUG의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,

상기 7차 스트레치 박스 B1B는 CRYGCU의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 36차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 37차 구현예로서,

상기 1차 스트레치 박스 B1A는 AGCGUG의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 36차 및 제 37차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 38차 구현예로서,

상기 2차 스트레치 박스 B2는 CCCGGU의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 36차, 제 37차 및 제 38차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 39차 구현예로서,

상기 3차 스트레치 박스 B3는 GUG의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 36차, 제 37차, 제 38차 및 제 39차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 40차 구현예로서,

상기 4차 스트레치 박스 B4는 GUA의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 36차, 제 37차, 제 38차, 제 39차 및 제 40차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 41차 구현예로서,

상기 5차 스트레치 박스 B5는 GGGGGGCGCGACC의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 36차, 제 37차, 제 38차, 제 39차, 제 40차 및 제 41차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 42차 구현예로서,

상기 6차 스트레치 박스 B6는 UACAUUUG의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 36차, 제 37차, 제 38차, 제 39차, 제 40차, 제 41차 및 제 42차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 43차 구현예로서,

상기 7차 스트레치 박스 B1B는 CACGCU의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 36차, 제 37차, 제 38차, 제 39차, 제 40차, 제 41차, 제 42차 및 제 43차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 44차 구현예로서,

상기 핵산은 서열번호 21에 따른 핵산 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 1차, 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차, 제 6차 및 제 7차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 45차 구현예로서, 상기 1B 형 핵산은 5‘->3’ 방향으로 1차 스트레치(stretch) 박스(Box) B1A, 2차 스트레치 박스 B2, 3차 스트레치 박스 B3, 4차 스트레치 박스 B4, 5차 스트레치 박스 B5, 6차 스트레치 박스 B6 및 7차 스트레치 박스 B1B을 포함하고 있으며,

여기에서

상기 1차 스트레치 박스 B1A는 AGYRUG의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,

상기 2차 스트레치 박스 B2는 CCAGCU 또는 CCAGY의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,

상기 3차 스트레치 박스 B3는 GUG의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,

상기 4차 스트레치 박스 B4는 AUG의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,

상기 5차 스트레치 박스 B5는 GGGGGGCGCGACC의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,

상기 6차 스트레치 박스 B6는 CAUUUUA 또는 CAUUUA의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,

상기 7차 스트레치 박스 B1B는 CAYRCU의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 45차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 46차 구현예로서,

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 45차 및 제 46차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 47차 구현예로서,

상기 2차 스트레치 박스 B2는 CCAGU의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 45차, 제 46차 및 제 47차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 48차 구현예로서,

상기 6차 스트레치 박스 B6는 CAUUUUA의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 45차, 제 46차, 제 47차 및 제 48차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 49차 구현예로서,

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 45차, 제 46차, 제 47차, 제 48차 및 제 49차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 50차 구현예로서,

상기 핵산 분자는 서열번호 28 및 서열번호 27에 따른 핵산 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 1차 내지 제 50차 구현예 중 어느 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 51차 구현예로서, 상기 MCP-1은 원숭이 MCP-1, 말 MCP-1, 토끼 MCP-1, 소 MCP-1, 개 MCP-1, 돼지 MCP-1 및 인간 MCP-1을 포함하는 군으로부터 선택되는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 1차 내지 제 51차 구현예 중 어느 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 52차 구현예로서, 상기 핵산은 인간 MCP-1와 결합가능한 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 1차 내지 제 52차 구현예 중 어느 하나의 구현예, 바람직하게는 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 52차 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 53차 구현예로서, 상기 MCP-1은 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 갖는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 1차 내지 제 53차 구현예 중 어느 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 54차 구현예로서, 상기 핵산은 변형체 (modification)를 포함하며, 여기에서 상기 변형체는 바람직하게는 고분자량 기이며 및/또는 상기 변형체는 바람직하게는, 동물 또는 인체, 바람직하게는 인체 내의 잔류시간의 측면에 있어서 제 1항 내지 제 54항 중 어느 한 항에 따른 임의의 핵산의 특성을 변형하도록 하는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 1차 내지 제 54차 구현예 중 어느 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 55차 구현예로서, 상기 변형체는 HES기, PEG기, 생분해성 변형체 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 1차 내지 제 55차 구현예 중 어느 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 56차 구현예로서, 상기 변형체는 쇄상 또는 가지상 PEG로 구성되는 PEG 기이며, 상기 PEG 기의 분자량은 바람직하게는, 약 20,000 내지 120,000 Da, 보다 바람직하게는 약 30,000 내지 80,000 Da, 및 가장 바람직하게는 약 40,000 Da인 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 1차 내지 제 55차 구현예 중 어느 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 57차 구현예로서, 상기 변형체는 HES 기이며, 여기에서 상기 HES 기의 바람직한 분자량은 약 10,000 내지 200,000 Da, 보다 바람직하게는 약 30,000 내지 170,000 Da, 및 가장 바람직하게는 약 150,000 Da인 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 54차, 제 55차, 제 56차 및 제 57차 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 58차 구현예로서, 상기 변형체는 링커 (linker)를 통해 핵산이 결합되는 것이고, 여기에서 상기 링커는 일커 또는 생분해성 링커인 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 54차, 제 55차, 제 56차, 제 57차 및 제 58차 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 59차 구현예로서, 상기 변형체는 핵산과 5’-말단 뉴클레오티드 및/또는 3’-말단 뉴클레오티드 및/ 또는 5’-말단 뉴클레오티드 및 3’-말단 뉴클레오티드 사이의 핵산의 뉴클레오티드에 결합되는 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 1차 내지 제 59차 구현예 중 어느 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 60차 구현예로서, 상기 핵산의 또는 이 핵산을 생성하는 뉴클레오티드들은 L-뉴클레오티드인 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 1차 내지 제 60차 구현예 중 어느 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 61차 구현예로서, 상기 핵산은 L-핵산인 것이다.

본 발명의 첫 번째 측면 및 두 번째 측면의 제 1차 내지 제 60차 구현예 중 어느 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 62차 구현예로서, 상기 MCP-1에 결합가능한 핵산의 부위는 L-뉴클레오티드로 구성된 것이다.

본 발명의 세 번째 측면의 제 1차 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면으로서, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면 중 임의의 구현예에 정의되는 바와 같은 핵산 분자 및 임의적인 추가 구성 성분을 포함하는 약학조성물에 의해 해결되며, 상기 추가 구성 성분은 약학적으로 허용 가능한 부형제(excipients), 약학적으로 허용가능한 담체(carriers) 및 약학적으로 활성을 갖는 활성제를 포함하는 군으로부터 선택되며 상기 약학조성물은 만성 질병 또는 만성 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 것이다.

본 발명의 세 번째 측면의 제 1차 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 2차 구현예로서, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면 중 임의의 구현예에 정의되는 바와 같은 핵산 분자, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것이다.

본 발명의 세 번째 측면의 제 1차 및 제 2차 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 3차 구현예로서, 상기 만성 질병 및 만성 장애는 상술한 청구항들 중 임의의 항에 정의된 바와 같다.

본 발명의 세 번째 측면의 제 1차, 제 2차 및 제 3차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 4차 구현예로서, 상기 약학조성물은 제 2차 약학 활성화제를 포함하고, 여기에서 상기 제 2차 약학 활성화제는 면역억제제인 것이다.

본 발명의 세 번째 측면의 제 4차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 5차 구현예로서, 상기 면역억제제는 분리된 투여 단위(dosage unit)로서 상기 약학 조성물 내에 포함되는 것이다.

본 발명의 세 번째 측면의 제 4차 및 제 5차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 6차 구현예로서, 상기 약학 조성물은 단독요법(monotherapy)으로서 면역억제제를 포함하는 약학 조성물보다 적은 양의 면역억제제를 포함하는 것이다.

본 발명의 세 번째 측면의 제 4차, 제 5차 및 제 6차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 7차 구현예로서, 상기 면역억제제의 투여 단위는 단독요법으로 사용시에 면역억제제 투여단위보다 적게 포함하는 것이다.

본 발명의 세 번째 측면의 제 6차 및 제 7차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 8차 구현예로서, 상기 세 번째 측면의 제 6차 및 제 7차 구현예의 면역억제제의 감소는 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상, 바람직하게는 75% 이상인 것이다.

본 발명의 세 번째 측면의 제 4차, 제 5차, 제 6차, 제 7차 및 제 8차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 8차 구현예로서, 상기 면역억제제는 시클로포스파미드(Cyclophosphamide) 및 미코페놀에이트 모페틸 (myc ophenolate mofetil)을 포함하는 군으로부터 선택되는 것이다.

본 발명의 세 번째 측면의 제 1차, 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차, 제 6차, 제 7차, 제 8차 및 제 9차 구현예의 하나의 구현예, 보다 바람직하게는 세 번째 측면의 제 8차 및 제 9차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 10차 구현예로서, 상기 만성 질병은 낭창성 신염 (lupus nephritis) 및/또는 폐렴 (pneumonitis)인 것이다.

본 발명의 세 번째 측면의 제 1차, 제 2차 및 제 3차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 11차 구현예로서, 상기 약학조성물은 제 2차 약학 활성화제를 포함하고, 여기에서 상기 제 2차 약학 활성화제는 항염증제(anti-inflammatory agent)인 것이다.

본 발명의 세 번째 측면의 제 11차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 12차 구현예로서, 상기 항염증제는 분리된 투여 단위(dosage unit)로서 상기 약학 조성물 내에 포함되는 것이다.

본 발명의 세 번째 측면의 제 11차 및 제 12차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 13차 구현예로서, 상기 약학 조성물은 단독요법(monotherapy)으로서 항염증제를 포함하는 약학 조성물보다 적은 양의 항염증제를 포함하는 것이다.

본 발명의 세 번째 측면의 제 11차, 제 12차 및 제 13차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 14차 구현예로서, 상기 항염증제의 투여 단위는 단독요법으로 사용시에 면역억제제 투여단위보다 적게 포함하는 것이다.

본 발명의 세 번째 측면의 제 13차 및 제 14차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 15차 구현예로서, 상기 세 번째 측면의 제 13차 및 제 14차 구현예의 면역억제제의 감소는 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상, 바람직하게는 75% 이상인 것이다.

본 발명의 세 번째 측면의 제 11차, 제 12차, 제 13차, 제 14차, 및 제 15차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 16차 구현예로서, 상기 항염증제는 덱사메타손(dexamethasone) 및 로플루밀라스트(roflumilast)을 포함하는 군으로부터 선택되는 것이고, 바람직하게는 상기 항염증제는 덱사메타손인 것이다.

본 발명의 세 번째 측면의 제 11차, 제 12차, 제 13차, 제 14차, 제 15차 및 제 16차 구현예, 바람직하게는 세 번째 측면의 제 15차 및 제 16차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면의 제 17차 구현예로서, 상기 만성 질병은 만성 기관 질환 (chronic respiratory disease)이고 보다 바람직하게는, 만성 기도폐쇄성 질환 (COPD)인 것이다.

본 발명의 네 번째 측면의 제 1차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 네 번째 측면으로서, 본 발명의 해결과제는 만성 질병 또는 만성 장애이거나 또는 발달될 위험성이 있는 객체의 치료를 위한 방법상의 사용목적으로 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 1 차 내지 제 62차 구현예중 임의의 구현예에 정의되는 바와 같은 핵산 분자에 의하여 해결되며, 여기에서 상기 방법은 약학적 활성량의 상기 핵산을 상기 객체에 투여함을 포함하는 것이다.

본 발명의 네 번째 측면의 제 2차 구현예로서, 상기 만성 질병 또는 만성 장애는 전술한 청구항 중 임의의 항에 정의된 바와 같은 것이다.

본 발명의 네 번째 측면의 제 1차 및 제 2차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 네 번째 측면의 제 3차 구현예로서, 상기 방법은 추가적으로 면역억제제를 상기 객체에 투여하는 단계를 포함하는 것이다.

본 발명의 네 번째 측면의 제 3차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 네 번째 측면의 제 4차 구현예로서, 치료 과정 중 투여되는 면역억제제의 양은 단독요법으로서, 상기 객체에 투여되어 온 면역억제제의 양보다 적은 것이다.

본 발명의 네 번째 측면의 제 4차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 네 번째 측면의 제 5차 구현예로서, 상기 면역억제제의 양은 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상, 바람직하게는 75% 이상 감소 되는 것이다.

본 발명의 네 번째 측면의 제 1차, 제 2차, 제 3차, 제 4차, 및 제 5차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 네 번째 측면의 제 6차 구현예로서, 상기 면역억제제는 시클로포스파미드(Cyclophosphamide) 및 미코페놀에이트 모페틸(myco phenolate mofetil)을 포함하는 군으로부터 선택되는 것이다.

본 발명의 네 번째 측면의 제 1차, 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차 및 제 6차 구현예의 하나의 구현예, 바람직하게는 네 번째 측면의 제 5차 및 제 6차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 네 번째 측면의 제 7차 구현예로서, 상기 만성 질병은 만성 신장 질환 (chronic kidney disease)이고, 바람직하게는 낭창성 신염(lupus nephritis) 및/또는 폐렴 (pneumonitis)인 것이다.

본 발명의 네 번째 측면의 제 1차 및 제 2차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 네 번째 측면의 제 8차 구현예로서, 상기 방법은 추가적으로 항염증제를 상기 객체에 투여하는 단계를 포함하는 것이다.

본 발명의 네 번째 측면의 제 8차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 네 번째 측면의 제 9차 구현예로서, 치료 과정 중 투여되는 항염증제의 양은 단독요법으로서, 상기 객체에 투여되어 온 면역억제제의 양보다 적은 것이다.

본 발명의 네 번째 측면의 제 9차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 네 번째 측면의 제 10차 구현예로서, 상기 면역억제제의 양은 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상, 바람직하게는 75% 이상 감소 되는 것이다.

본 발명의 네 번째 측면의 제 8차, 제 9차 및 제 10차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 네 번째 측면의 제 11차 구현예로서, 상기 항염증제는 덱사메타손(dexamethasone) 및 로플루밀라스트(roflumilast)를 포함하는 군으로부터 선택되는 것이고, 바람직하게는 상기 항염증제는 덱사메타손인 것이다.

본 발명의 네 번째 측면의 제 8차, 제 9차, 제 10차 및 제 11차 구현예의 하나의 구현예, 바람직하게는 네 번째 측면의 제 10차 및 제 11차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 네 번째 측면의 제 12차 구현예로서, 상기 만성 질병은 만성 기도 질환 (chronic respiratory disease)이고 보다 바람직하게는, 만성 기도폐쇄성 질환 (COPD)인 것이다.

본 발명의 다섯 번째 측면의 제 1차 구현예이기도 한, 다섯 번째 측면으로서, 본 발명의 해결과제는 만성 질병 또는 만성 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 약제를 제조하기 위한, 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 1차 내지 제 62차 구현예 중 임의의 구현예에 정의되는 바와 같은 핵산 분자의 용도(use)에 의하여 해결되는 것이다.

본 발명의 다섯 번째 측면의 제 2차 구현예로서, 상기 질병 또는 장애는 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 1차 내지 제 62차 구현예의 임의의 구현예에 연관되어 정의된 바와 같은 것이다.

본 발명의 다섯 번째 측면의 제 1차 및 제 2차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 다섯 번째 측면의 제 3차 구현예로서, 상기 약제는 인체용 의약품 또는 수의학적 의약품으로 사용하기 위한 용도인 것이다.

본 발명의 여섯 번째 측면의 제 1차 구현예이기도 한, 여섯 번째 측면으로서, 본 발명의 해결과제는 하기 단계를 포함하는 만성 질병 또는 만성 장애를 진단하기 위한 방법에 의하여 해결된다:

(a) 만성 질병 또는 만성 장애로 고통받거나 또는 발전 될 위험성이 있는지 여부를 시험 대상객체로부터 채취한 시료를 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 1차 내지 제 62 차 구현에 중 임의의 구현예에 정의된 바와 같은 핵산 분자와 접촉시키는 단계; 및

(b) MCP-1 및 상기 핵산을 포함하는 복합체가 형성되는지 여부를 직접 또는 간접적으로 탐지하는 단계.

본 발명의 여섯 번째 측면의 제 2차 구현예로서, 상기 만성 질병 또는 만성 장애는 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 1차 내지 제 62차 구현예중 임의의 구현예와 연관되어 정의된 바와 같은 만성질병 또는 만성 장애인 것이다.

본 발명의 일곱 번째 측면의 제 1차 구현예이기도 한, 일곱 번째 측면으로서, 본 발명의 해결과제는 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 1차 내지 제 62차 구현예중 임의의 구현예와 연관되어 정의된 바와 같은 만성질병 또는 만성 장애의 진단을 위한 진단제를 제조하기 위한, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 측면의 제 1차 내지 제 62차 구현예중 임의의 구현예와 연관되어 정의된 바와 같은 핵산의 용도에 의하여 해결된다.

하기한 구현예들 및 특성들은 본원, 특히 본원에 첨부되는 청구항에 종속되는 상기 측면들 및 구현예들과 관련되어 개시된 특성 및 구현예들과 연관되어 실현화될 수도 있음은 당업계에 종사하는 자에게 있어 자명할 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어“만성 질병 및 만성 장애” 바람직하게는 만성 호흡기 질환, 만성 신장 질환 및 전신성 홍반성 낭창을 지칭한다. 바람직하게는, 본원에서 사용되는 바와 같은 용어“상기 만성 호흡기 질환”은 폐렴(pneumonitis), 폐 및 흉막 염증 (lung and pleura inflammation), 늑막염 (pleuritis), 흉수(pleural effusion), 루푸스 폐렴 (lupus pneumonitis), 만성 미만형 간질성 폐질환(chronic diffuse interstitial lung disease), 폐색전증(pulmonary emboli), 폐출혈 (pulmonary hemorrhage), 위축성 폐 증후군 (shrinking lung syndrome), 폐고혈압 (pulmonary hypertension) 및 만성 폐색성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease) 및 이들의 조합을 포함하는 것이다. 보다 바람직하게는, 상기 용어 폐고혈압(pulmonary hypertension)은 좌측 심장 질환 수반 폐고혈압, 폐질환 및/또는 저산소증 수반 폐고혈압, 혈전성 및/또는 폐색성 질환으로 기인한 폐고혈압, 폐동맥성 고혈압, 바람직하게는 특발성 폐 동맥성 고혈압, 콜라게나제(collagenose)-수반 폐 동맥성 고혈압, 가족성 폐 동맥성 고혈압 (familial pulmonary arterial hypertension), 기타 질환을 수반하는 폐 동맥성 고혈압 및 정맥성 또는 말초성 질환을 수반하는 폐 동맥성 고혈압을 포함하는 것이다. 추가적으로, 상기 용어 “만성 폐색성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease)”은 폐 정맥성 침범(pulmonary vascular involvement)을 수반 또는 수반하지 않는 만성 폐색성 폐질환을 포함하는 것이다. 최종적으로, 상기 용어 “만성 폐색성 폐질환(chronic obstructive pulmonary desease)”은 만성 기관지염 및 폐기종으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것이다. 또한, 상기 용어, “만성 신장 질환”은 낭창성신염 (lupus nephritis), 막성 증식성 사구체 신염 (membranoproliferative glomerulonephritis), 막성 사구체 신염 (membrano us glomerulonephritis), IgA 신장애(nephropathy), 연쇄상구균 감염 후 사구체신염 (post-streptococcal glomerulonephritis), 급속진행형 사구체신염 (rapidly pro gressive glomerulonephritis), 신염 증후군 (nephritic syndrome), 국소성 분절성 사구체경화증 (focal segmental glomerulosclerosis), 당뇨병성 신장애(diabetic nephropathy), 신증후군 (nephrotic syndrome), 및 신증후군, 바람직하게는 낭창성신염을 포함하는 것이다.

본원에 개시된 바와 같은 본 발명에 의한 핵산의 특징은 상기 핵산이 단독 또는 임의의 조합으로 사용되는 본 발명의 어떠한 측면으로 실현될 수 있다.

인간뿐만 아니라 설치류 MCP-1 (murine MCP-1)은 각각, 서열번호 1 및 2에 따른 아미노산 서열을 갖는 기본 단백질들이다.

MCP-1에 대한 짧고 높은 친화성으로 결합하는 핵산을 동정할 수 있다는 발견은 압타머(aptamers), 즉, 기본 단백질에 배향하는 목표 분자에 결합하는 D-핵산은 이러한 종류의 목표가 그 비가 높으나 비-특이적인 신호-대 잡음 비(signal-to-noise ratio)를 발생한다는 점에서 일반적으로 그 생성이 매우 어렵다는 점을 보고한 이튼 등의 보고 (1997)를 감안하면 놀라운 발견이다. 이 높은 신호-대-잡음 비는 MCP-1과 같은 기본 목표들을 위한 핵산에 의해 보여지는 높은 비-특이적 친화성(high non-specific affinity)에 기인한다.

실시예 1 및 청구항들에 상세하게 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도 다수의 상이한 MCP-1 결합 핵산 분자들을 동정할 수 있었으며, 상기 핵산들의 대부분은 본원에서 박스(box; 본원에서는 이태리체 및 밑줄로 표시함)로 지칭되는 뉴클레오티드의 스트레치(stretches)로서 특징화 될 수 있다. 상기 다양한 MCP-1 결합 핵산 분자들은 각각, 상기 박스 및 몇몇 구조적 특징들 및 요소들에 기초하여 분류될 수 있다. 그러므로 본원에서 정의되는 다양한 분류들은 형(type), 보다 상세하게는, 1A형, 1B형, 2형, 3형 및 4형으로 또한 지칭된다.

본 발명에 따른 핵산 또는 이의 스트레치 또는 이의 일부(들)는 원칙상 상호 혼성화가 가능함도 본 발명의 범위 내이다. 이러한 혼성화가 발생시에, 이중 가닥형(double-stranded) 구조가 생성된다. 이러한 혼성화가 특히, 시험관 내(in vi tro) 및/또는 생체 내(in vivo) 조건하에서 발생되거나 발생되지 않을 수 있음도 당업계에 인지 가능할 것이다. 또한 이러한 혼성화시에, 적어도 염기쌍에 대한 규칙에 기초하여, 이러한 혼성화 및 이중 가닥 구조가 형성될 수 있은 경우에 2개의 스트레치의 전장 길이 전체에 걸쳐 반드시 발생하지는 않는다. 본원에서 바람직하게는 개시한 바대로, 이중-가닥 구조는 하나 이상, 바람직하게는 2개 또는 그 이상의 염기쌍이 염기 쌍, 바람직하게는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍 규칙에 따른 염기 쌍을 이루어지는, 분자 일부 또는 2개 이상의 분리된 가닥(seperated strands) 또는 단일 가닥의 2개의 공간적으로 분리된 스트레치에 의하여 생성된 구조인 것이다. 후그스텐(Hoogsten) 염기 쌍과 같은 기타 염기 쌍은 이러한 이중-가닥 구조로 또는 이 구조를 형성할 수 있음도 당업계에 인지 가능할 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예로서, 본원에서 사용된 배열(arrangement)는 본원에서 개시된 핵산과 연관된 본원에서 개시된 구조적 또는 기능적 특징 또는 요소의 순서 (order) 또는 서열(sequence)을 의미한다.

본 발명에 따른 핵산이 핵산분자임도 본 발명의 범위 내이다. 역으로 지시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어인 핵산 (nucleic acid) 및 핵산 분자(nucleic acid molecule)은 동의어로 사용된다. 본 발명의 하나의 구현예로서, 상기 핵산 및 상기 핵산 분자는 상기 핵산 분자를 형성하는 모든 연속적 뉴클레오티드들은 하나 또는 1개 이상의 공유결합에 의해 연계 또는 연결됨을 특징으로 하는 핵산을 포함하는 것이다. 보다 상세하게는, 상기 뉴클레오티드 각각은 2개의 다른 뉴클레오티드와, 바람직하게는 포스포디에스테르(phosphodiester) 결합 또는 기타 결합을 통하여 연계 또는 연결되어 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치를 형성한다. 그러나, 이러한 배열(arrangement)에서 상기 2개의 말단 뉴클레오티드, 즉, 바람직하게는 5’말단 및 3’말단에서의 뉴클레오티드가 이러한 배열이 선형(linear)이고 원형 배열이 아니고 원형 분자라기보다는 선형이라는 전제하에서만 단일 뉴클레오티드에 각각 연계되는 것이다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 핵산 및 상기 핵산 분자는 2개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하고, 여기에서 연속 뉴클레오티드의 개개 그룹내에서 개개 뉴클레오티드는 2개 이상의 다른 뉴클레오티드와 포스포디에스테르 (phosphodiester) 결합 또는 기타 결합을 통하여 연계 또는 연결되어 연속적인 뉴클레오티드의 스트레치를 형성한다. 그러나, 이러한 배열에서, 상기 2개의 말단성 뉴클레오티드들은, 즉, 바람직하게는 5’말단 및 3’말단에서의 뉴클레오티드가 각각 단일 뉴클레오티드에만 연결된다. 그러나, 이러한 구현예로서, 상기 연속적 뉴클레오티드의 2개의 그룹은 1개 군의 1개의 뉴클레오티드 및 또 다른 또는 기타 그룹의 1개의 뉴클레오티드와 공유결합, 바람직하게는 상기 2개 뉴클레오티드중 1개의 당(sugar)기와 상기 2개 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드(nucleosides)의 것의 포스포르(phosphor) 기 사이에 형성된 공유결합을 통하여 서로 연계(link) 또는 연결(connect)되지 않는 것이다. 본 발명의 호환적인 구현예로서, 그러나 상기 연속적인 뉴클레오티드의 2개 그룹은 1개 군의 1개의 뉴클레오티드 및 또 다른 또는 기타 그룹의 1개의 뉴클레오티드와 공유결합, 바람직하게는 상기 2개 뉴클레오티드중 1개의 당(sugar)기와 상기 2개 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 (nucleosides)의 것의 포스포르(phosphor) 기 사이에 형성된 공유결합을 통하여 서로 연계(link) 또는 연결(connect)되는 것이다. 바람직하게는, 연속적인 뉴클레오티드의 2개 이상의 그룹은 어떠한 공유 결합을 통하여 연계되지 않는 것이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 구현예로서, 2개 이상의 그룹은 포스포디에스테르(phosphodiester) 결합과 상이한 공유 결합을 통하여 연계되는 것이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 구현예로서, 2개 이상의 그룹은 포스포디에스테르(phosphodiester) 결합인 공유 결합을 통하여 연계되는 것이다.

본 발명에 따른 핵산들은 또한 본원에 개시된 특정 서열들과 실질적으로 상동성(homologous)을 갖는 핵산들도 포함할 것이다. 본원에서 정의되는 용어 “실질적으로 상동성(substantially homologous)”은 최소한 75%, 바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90% 및 가장 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명에 따른 핵산에 존재하는 상동성을 갖는 뉴클레오티드의 실제적인 백분율은 핵산에 존재하는 뉴클레오티드의 전체 갯수에 의존할 것이다. 상기 백분율 변형체(percent modification)는 핵산에 존재하는 뉴클레오티드의 전체 갯수에 기초한 것일 수 있다.

상기 상동성은 당업자에게 널리 알려진 바와 같이 결정될 수 있다. 보다 상세하게는, 서열 비교 알고리즘(sequence comparison algorithm)은 비교용 서열 (reference sequence)과 관련된 시험용 서열(test sequence)에 대한 백분율 서열 동일성(percent sequence identity)을 계산하는 것이다. 상기 시험용 서열은 바람직하게는, 또 다른 핵산 분자에 대하여 상동성인지, 만약 그렇다면, 어느 정도까지 인지 여부를 시험되거나 시험될 서열 또는 핵산 분자이며, 상기 또 다른 핵산 분자는 또한 비교용 서열(reference sequence)이라고도 지칭된다. 하나의 구현예로서, 상기 비교용 서열은 본원에 개시된 바와 같은 핵산 분자, 보다 바람직하게는 서열번호 10 내지 129; 서열번호 132 내지 256; 서열번호 278 내지 282 중의 어느 하나에 따른 서열을 갖는 핵산 분자이다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 예를 들어, 스미스 및 워터맨 (Smith 및 Waterman, 1981)의 국부적 상동성 알고리즘법(local homology algorithm)에 의해, 니들맨 및 운츠 (Needleman 및 Wunsch, 1970)의 상동성 정렬 알고리즘법(homology alignment algorithm)에 의해, 피어슨 및 립맨 (Pearson 및 Lipman, 1988)의 유사 방법을 위한 조사에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행법 (computerized implementations)(위스콘 제네틱 소프트웨어 패키지의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) 또는 시각적 조사(visual inspection)에 의해서 수행될 수 있다.

백분율 서열 동일성(percent sequence identity)을 결정하기에 적합한 알고리즘의 하나의 예로서는 기본 국소 정렬 조사 도구 분석법(basic local alignment search tool; 이하 “BLAST”이라 명명함)에 사용되는 알고리즘, 예를 들어, 알쯔슐 등의 문헌(Altschul et al. 1990 및 Altschul et al, 1997)에 개시된 알고리즘이다. BLAST 분석법을 수행하기 위한 소프트웨어는 내셔널 센터 포 바이오테크놀러지 인포메이션(National Center for biotechnology Information; 이하 “NCBI”이라 명명함)을 통하여 공중에서 입수 가능하다. NCBI에서 입수가능한 스포트웨어, 예들 들어, BLASTN(뉴클레오티드 서열용) 및 BLASTP(아미노산 서열용)를 이용하여 서열 동일성(sequence identity)을 결정하는데 사용되는 디폴트 함수(default parameters)는 맥기니스 등의 문헌(McGinnis et al, 2004)에 개시되어 있다.

본원에 기재된 용어 “발명적 핵산(inventive nucleic acid)” 또는 본 발명에 따른 핵산(nucleic acid according to the present invention)은 본원에 개시된 핵산 또는 이들의 일부를 포함하는 핵산들, 바람직하게는 상기 핵산 또는 상기 핵산의 일부들이 MCP-1의 결합과 관련되는 정도까지를 또한 포함하는 것이다. 바람직하게 본원에 개시된 바와 같은 용어 발명적 핵산은 또한 MCP-2, MCP-3, MCP-4 및 에오탁신(eotaxin)을 포함하는 군으로부터 선택되는 임의의 분자와 결합하기에 적합한 핵산을 구현예로서 포함할 것이다. 당업계에 종사하는 자들에게 있어서 본 발명에 따른 개개 핵산들은 하나 또는 그 이상의 그러한 분자들과 결합함은 자명할 것이다. 그러한 핵산은, 하나의 구현예로서, 본원에 개시된 상기 핵산 분자 중 하나, 또는 그의 유도체(derivatives) 및/ 또는 그의 대사산물 (metabolites)이며, 여기에서 상기 유도체 및/ 또는 대사산물은 바람직하게는 본원에 개시된 핵산 분자와 상응하는 절단형 (truncated) 핵산이다. 절단 (truncation)은 본원에서 개시된 상기 핵산의 어느 한쪽 또는 양쪽 말단과 연관될 수 있다. 또한, 절단 (truncation)은 핵산의 뉴클레오티드 내 서열 (inner sequence)과 관련될 수 있다, 즉, 5’ 및 3’ 말단 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오티드(들)와 관련될 수 있다. 게다가, 절단은 본원에서 개시된 핵산 서열로부터 최소한 하나의 뉴클레오티드의 결실 (deletion)을 포함할 것이다. 절단은 발명적 핵산의 하나 이상의 스트레치와 관련될 수 있으며, 여기에서 상기 스트레치는 최소한 하나의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 본 발명에 따르는 핵산의 결합, 바람직하게는 MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4 및 에오탁신을 포함하는 군으로부터 선택된 분자와의 결합은 당업자들에게 통상적인 실험법, 또는 본원에 개시된, 바람직하게는 실시예 부분에 개시된 방법을 사용 또는 적용함으로서 측정될 수 있다. 반대로 명백하게 지시되지 않는 한, 본 발명에 따른 핵산의 MCP-1에 또는 MCP-1과의 결합이 본원에서 지칭될 때마다 이는 또한 본 발명에 따른 핵산의 MCP-2, MCP-3, MCP-4 및 에오탁신을 포함하는 군으로부터 선택된 임의의 분자에 또는 분자와 결합하는 것에도 적용된다.

본 발명에 따른 핵산은 D핵산 또는 L핵산일 수 있다. 바람직하게는, 상기 발명적 핵산은 L핵산이다. 추가적으로, 상기 핵산의 하나 내지 여러 부분은 D핵산형으로 존재 가능하며, 또는 상기 핵산의 하나 이상 내지 여러 부분은 L핵산형이다. 상기 핵산의 “일부(part)”라는 용어는 최소한 1개 이상의 뉴클레오티드를 의미하는 것일 것이다. 이러한 핵산들은 일반적으로, 각각 “D 및 L핵산”으로 지칭된다.

따라서, 특히 바람직한 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산들은 L뉴클레오티드로 구성되고 최소 하나 이상의 D-뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 D뉴클레오티드는 바람직하게는 본 발명에 따른 핵산, 바람직하게는 이들의 일부를 한정하는 스트레치와는 별개의 다른 부분에 부착되는 것이며, 이 일부들은 핵산의 다른 부분과의 상호작용이 연관된 접촉의 부분을 의미한다. 바람직하게는, 이러한 D뉴클레오티드는 각각 본 발명의 임의의 핵산 및 임의의 스트레치의 말단에 부착되는 것이다. 보다 바람직한 구현예로서, 상기의 D뉴클레오티드는 스페이서(spacer) 또는 링커 (linker)로 작용 될 수 있으며, 바람직하게는 본 발명에 따른 핵산에 PEG 또는 HES와 같은 변형체(modifications)를 부착할 수도 있다.

본원에서 그들의 핵산 서열로 온전히 그대로 개시된 개개 및 임의의 핵산(들)은 특정 뉴클레오티드 서열(들)에 한정되는 것도 또한 본 발명의 범위내이다. 환원하면, 용어 “포함하는(comprising)”또는“포함하다 (comprise(s))”는 이러한 구현예에서 ‘함유하는(containing)’또는‘구성하는 (consisting of)’의 의미로서 해석되어야 할 것이다.

또한, 본 발명에 따른 핵산은 비교적 긴 핵산(longer nucleic acid)의 일부분이며, 상기 비교적 긴 핵산은 최소한 본 발명의 한 부분이 본 발명에 따른 핵산 또는 그 일부분인 여러 부분을 포함한다는 것도 본 발명의 범위 내이다. 이러한 비교적 긴 핵산의 다른 일부분(들)은 하나 이상의 D핵산(들) 또는 하나 이상의 L핵산(들) 중 어느 것일 수 있다. 본 발명에서는 이들의 임의 조합이 사용될 수 있을 것이다. 이러한 비교적 긴 핵산의 다른 일부분은 단독 또는 상호 조합으로 전체로서 또는 특별한 조합으로서, 결합(binding), 바람직하게는 MCP-1과의 결합과는 다른 기능을 나타낼 수 있다. 하나의 가능한 기능은 다른 분자와의 상호작용 (interaction), 예를 들어, 고정화(immobilization), 가교결합(crosslinking), 검출(detection) 또는 증폭(amplification) 등과 같은 작용을 허용하는 것이고, 여기에서 상기 다른 분자들은 바람직하게는 MCP-1과 상이한 것이다. 본 발명의 추가의 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산은 몇 개의 본 발명의 핵산을, 독립적 또는 조합된 부위로서 포함한다. 이와 같은 본 발명의 여러 가지 핵산을 포함하는 핵산은 비교적 긴 핵산의 용어로서 또한 포함한다.

본원에서 사용되는 L핵산들은 L뉴클레오티드, 바람직하게는 오로지 L뉴클레오티드로만 구성된 핵산들이다.

본원에서 사용되는 D핵산들은 D뉴클레오티드, 바람직하게는 오로지 D뉴클레오티드로만 구성된 핵산들이다.

본원에서 사용되는 용어 “핵산(nucleic acid)”및“핵산 분자(nucleic acid molecule)”는 역으로 명백하게 지시되지 않은 한, 호환가능한 방식으로 사용된다.

또한, 역으로 명백하게 지시되지 않은 한, 본원에서 기술된 임의의 뉴클레오티드 서열은 5’→ 3’방향이다.

본 발명의 발명적 핵산이 D뉴클레오티드, L뉴클레오티드 또는 상기 두 형태 뉴클레오티드의 조합, 예를 들어 하나 이상의 L뉴클레오티드 및 하나 이상의 D뉴클레오티드로 구성되는 무작위 조합(random combination) 또는 하나 이상의 L뉴클레오티드 및 하나 이상의 D뉴클레오티드로 구성되는 스트레치의 한정된 서열로 구성되는가 여부에 상관없이, 상기 핵산은 데스옥시리보뉴클레오티드(desoxyribo nucleotide(s)), 리보뉴클레오티드(ribonucleotide(s)) 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다.

L핵산과 같은 본 발명의 발명적 핵산을 고안하는 것은 여러 가지 장점을 갖는다. L핵산은 자연 발생적 핵산들의 거울상 이성질체이다. 그러나 D핵산은 수용액상, 및 특히 핵산 분해 효소(nucleases)의 광범위한 분포에 기인하는 생체 조직(biological systems) 또는 생체 표본(biological samples)에서 매우 불안정하다. 자연 발생적 핵산 분해효소, 특히 동물 세포 유래 핵산 분해 효소는 L핵산에 대한 분해 능력이 없다. 이와 같은 이유로 L핵산의 생물학적 반감기(biological halflife)는 동물체 및 인체를 포함한 상기 조직에서 두드러지게 증가한다. L핵산의 분해능 결핍으로 인해, 핵산 분해 효소의 분해 산물이 발생 되지 않으며, 상기 결과로 어떠한 부작용도 일어나지 않음을 관찰할 수 있다. 이러한 측면은 MCP-1 존재와 관련한 질병 및/또는 장애의 치료를 위해 사용되고 있는 사실상 모든 기타 화합물의 L핵산으로 한정되지 않는 것이다. 특이적으로 왓슨과 크릭의 염기 결합과는 다른 기전을 통한 목표 분자와 결합을 하는 L-핵산 또는 L-뉴클레오티드로 일부 또는 온전히 구성되는 압타머(aptamer), 특히 상기 목표물질(target molecule)과 압타머와의 결합과 관련되는 압타머의 일부분을 갖는 압타머를 또한 스피에겔머 (spiegelmer)라고 지칭된다.

또한, 본 발명에 따른 핵산으로 또한 지칭되는 발명적 핵산은 그 핵산이 D핵산, L핵산 또는 D, L핵산으로 존재하는가 여부 또는 DNA 또는 RNA인가 여부와 상관없이 단일 가닥(single strand) 또는 이중 가닥(double strand) 핵산으로 존재할 수도 있는 것도 본 발명의 범주 내이다. 전형적으로, 본 발명의 발명적 핵산은 일차원 구조에 기인한 한정된 이차원 구조(defined secondary structure)를 나타내는 단일 가닥 핵산으로서, 삼차 구조(tertiary structure)를 또한 형성할 수도 있다. 그러나 본 발명의 발명적 핵산은 서로 상보적인 또는 서로 일부가 상보적인 이중 가닥이 서로 혼성화 된다는 의미에서 이중 가닥도 또한 포함될 수도 있다. 이러한 특성은 특히 핵산이 L형이 아닌 자연 발생의 D형으로 존재한다면 유리할 것으로 생각되므로 핵산에 안정성을 부여한다.

본 발명의 발명적 핵산은 변형가능하다. 이러한 변형은 상기 핵산의 단일 뉴클레오티드와 관련될 수 있으며, 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 변형의 예는 그 중에서도, 하기 문헌들, 즉, 벤카테산 외(Venkatesan, Kim et al, 2003), 커서 (Kusser 2000); 아우럽 (Aurup, 1994); 쿤민 (Cummins, 1995); 이튼 (Eaton, 1995); 그린 (Green, 1995); 카와사키 (Kawasaki, 1993); 레스닉 (Lesnik, 1993); 및 밀러 (Miller, 1993)에 의해 서술되어 있다. 이러한 변형은 핵산을 구성하는 개별적인 뉴클레오티드의 2번 위치에서의 수소 원자, 불소 원자 혹은 OCH₃ 그룹 또는 NH₂ 그룹이 될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 핵산은 하나 이상의 LNA 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산은 LNA 뉴클레오티드로 구성된 것이다.

본 발명의 하나의 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산은 다중 분할된 핵산(multipartite nucleic acid)일 수 있다. 본원에서 사용되는 “다중 분할된 핵산 (multipartite nucleic acid)”은 두 개 이상의 핵산 가닥으로 구성된 핵산이다.

상기 두 개 이상의 핵산 가닥은 목표 분자에 대한 리간드 (ligand)로 작용하는 기능적 부위(functional unit)를 형성한다. 이 두 개 이상의 핵산 가닥은 본 발명의 임의의 핵산으로부터 핵산을 두 개의 가닥으로 분할시키는 방법 또는 본 발명 핵산의 첫 번째 부분에 상응하는 한 개의 핵산 합성, 즉 전체 핵산(overall nucleic acid) 및 전체 핵산의 두 번째 부분에 상응하는 다른 한 개의 핵산을 합성하는 합성 방법으로 유래될 수 있다. 상기 분할(cleavage) 및 합성(synthesis) 방법 모두는 상기에서 예시한 바로 2개 이상의 가닥을 갖는 다중 분할된 핵산을 제조함에도 적용될 수 있음도 알아야 한다. 환원하면, 2개 이상의 핵산 가닥은 비록 다양한 핵산의 일부분 사이에 어느 정도의 상보적 구역(complementarity)이 존재한다 할지라도 서로 상보성 및 혼성화를 갖는 이중 가닥과는 전형적으로 구별된다는 것이다.

마지막으로, 본 발명의 구현예에서, 온전히 닫힌, 예를 들어서 본 발명에 따른 핵산을 위한 원형 구조가 보여 진다, 예를 들어서 본 발명에 따른 핵산이 닫혀있으며, 바람직하게는 공유결합을 통해 닫혀있으며, 보다 더 바람직하게는 그와 같은 공유결합은 본원에 기재된 바와 같이 핵산 서열을 5’말단 및 3’말단 사이에 만들어진다는 점도 본 발명의 범위 내이다.

본 발명자들은 본 발명에 따른 핵산이 매우 좋은 Kd치 (Kd value) 범위를 갖는다는 것을 발견했다.

결합 상수 (binding constant)의 측정은 당업계에 잘 알려진 바와 같은 소위, 비아코아 장치 (biacore device)로 불리는 장치의 사용으로 가능하다. 또한, 본원에서 사용되는 친화도 (affinity)는 하기 실시예에 기재된“풀-다운 측정법 (pull-down assay)”의 사용으로 측정될 수 있다. 본 발명의 경우에 있어서 MCP-1인 목표 분자에 따른 핵산 간의 결합 강도 (intensity of the binding)를 표시하기 적합한 측정치는 당업계에 잘 알려진 측정 방법과 같은 소위 “Kd치 (Kd value)”이다.

본 발명에 따른 핵산은 특정한 Kd치에 의해 특징화 될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 핵산의 Kd치는 1 ㎛ 이하이다. 약 1 ㎛ 정도의 Kd 치는 목표 분자에 대한 핵산의 비특이적 결합 (nonspecific binding)으로 특정된다고 간주된다. 당업자에게 인지된 것인 바와 같이, 본 발명에 따른 핵산과 같은 화합물군의 Kd치가 일정 범위 내에 존재함은 인지될 것이다. 상기한 약 1 ㎛ 정도의 Kd치는 Kd치의 바람직한 상한치에 해당한다. 바람직한 목표 물질 결합 핵산의 Kd치 하한선은 약 10 pM (picomolar) 또는 그 이상일 수 있다. 본 발명에서 MCP-1과 결합하는 개별적인 핵산의 Kd 치는 바람직하게 이 범위 내에 속함도 본 발명의 범주 내이다. 바람직하게는 이 범주 내의 임의의 첫 번째 숫자로 및 이 범주 내의 임의의 두 번째 숫자를 선택함으로서 바람직한 범위가 정의될 수 있다. 바람직한 상위 값은 250 nM 및 100 nM이며, 바람직한 하위 값은 50 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM 및 10 pM이다.

본 발명에 따른 핵산 분자는 목표 분자에 여전히 결합할 수 있는 어떠한 제공된 길이를 가질 수 있다. 본 발명에 따르는 핵산의 바람직한 길이가 있다는 것은 당업계에 자명한 사실이다. 일반적으로, 길이는 15 내지 120 뉴클레오티드 사이 이다. 본 발명에 따르는 핵산을 위한 길이가 15 내지 120 사이의 어떠한 정수가 가능하다는 것은 당업자에게 자명한 사실이다. 본 발명에 따르는 핵산의 길이를 위한 보다 더 바람직한 범위는 약 20 내지 100 뉴클레오티드, 약 20 내지 80 뉴클레오티드, 약 20 내지 60 뉴클레오티드, 약 20 내지 50 뉴클레오티드 및 약 30 내지 50 뉴클레오티드이다.

본원에서 개시된 본 발명의 핵산은 바람직하게는 높은 분자량 기 및/또는 동물 신체, 바람직하게는 인체 내에서 그들 중에 체류 시간을 통한 핵산 특성을 변형시키는 기를 포함함도 본 발명의 범주 내이다. 상기 변형의 특정 바람직한 구현예는 본 발명에 따른 PEG화 반응(PEGylation) 및 HES화 반응(HESylation)이다. 본원에서 사용되는 PEG는 폴리(에틸렌 글라이콜)(poly(ethylene glycol))의 약어이고, HES는 히드록시에틸 전분(hydroxyethyl starch)의 약자로 사용된다. 본원에서 바람직하게 사용되는 PEG화 반응은 본 발명에 따른 핵산에 부착되어 있는 PEG기로 구성되는 변형과 같은 핵산의 변형이다. 본원에서 바람직하게 사용되는 HES화 반응은 본 발명에 따른 핵산에 부착되어 있는 HES기로 구성되는 변형과 같은 핵산의 변형이다. 상기 변형체 뿐만 아니라 상기 변형법을 이용하여 핵산을 변형하는 제조방법은 유럽특허출원 EP 1 306 382호 및 국제특허출원 WO 2005/074993호에 개시되어 있으며, 이 문헌의 개시내용은 본원에서 참고로서 그 전체를 인용하는 것이다.

바람직하게는, 높은 분자량 부위를 함유하거나 구성하고 있는 상기 변형체의 분자량은 약 2,000 내지 250,000 Da이며, 바람직하게는 20,000 내지 200,000 Da이다. 구체적으로 매우 높은 분자량 부위인 PEG의 경우에는, 약 2,000 내지 120,000 Da이며, 바람직하게는 40,000 내지 120,000 Da이며, 보다 바람직하게는 40,000 내지 80,000 Da이다. 구체적으로 매우 높은 분자량 기인 HES의 경우에는 바람직하게는 약 20,000 내지 200,000 Da, 보다 더 바람직하게는 40,000 내지 150,000 Da이다, HES 변형의 제조방법은 예를 들어, 독일특허출원 제 DE 1 2004 006 249.8호 및 국제특허출원 WO 2002/080979호에 개시되어 있으며, 이 문헌의 개시내용은 본원에서 참고로서 그 전체를 인용하는 것이다.

특허출원 WO2005/074993, WO2002/080979 및 PCT/EP02/11950에 서술된 바와 같이 PEG 및 HES 중 어느 하나도 쇄상 및 가지상 중 어느 하나로도 사용될 수 있다는 것도 본 발명의 범주 내이다. 그와 같은 변형은, 원칙적으로, 본 발명의 핵산 분자의 어떠한 위치에서 만들어질 수 있다. 바람직하게, 그와 같은 변형은 5’-말단 뉴클레오티드, 3’-말단 뉴클레오티드 및/또는 핵산 분자의 5’뉴클레오티드와 3’뉴클레오티드 사이의 어떠한 뉴클레오티드 중 어느 하나에 만들어진다.

변형체 및 바람직하게는 PEG 및/또는 HES기는 본 발명의 핵산 분자에 직접적 또는 링커(linker) 중 하나에 부착될 수 있다. 또한 본 발명에 따르는 핵산 분자가 하나 또는 그 이상의 변형체, 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 PEG 및/또는 HES기를 포함함은 본 발명의 범주 내이다. 본 발명의 구현예로서, 상기 독립적인 링커 분자(linker molecule)는 본 발명에 따르는 핵산에 하나 이상의 PEG기 또는 HES기를 부착한다. 본 발명과 관련되어 사용된 링커는 그 자체로 쇄상 또는 가지상이 될 수 있다. 이와 같은 링커는 당업자에게 널리 알려져 있으며, 더 나아가 특허출원 WO 2005/074993 및 PCT/EP02/11950에 서술되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예로서, 상기 링커는 생분해성 링커(biodegradable linker)이다. 상기 생분해성 링커는 본 발명의 핵산 특성을 다른 특성 중에 동물 신체, 바람직하게는 인간 신체에서 본 발명의 핵산으로부터 상기 변형체가 유리되도록 함으로서, 체류 시간에 관한 특성이 변형하도록 한다. 생분해성 링커의 사용은 본 발명의 핵산의 체류 시간의 보다 나은 조절을 가능하게 할 수 있을 것이다. 이러한 바람직한 상기 생분해성 링커로는 이에 제한되지는 않으나, 국제특허 출원 WO2006/052790, WO2008/034122, WO2004/092191, WO2005/099768, WO2004/092191 및 WO2005/099768 들에 개시된 바와 같은 생분해성 링커들이며, 상기 링커는 본원에 개시된 바와 같은 1개 또는 2개 변형체, 핵산 및 이들 사이에 존재하는 생분해성 링커들로 구성된 중합성 올리고뉴클레오티드 전구약물(polymeric oligonucleotide prodrug)의 일부이다.

상기 변형체는 생분해성 변형체이고, 여기에서 상기 생분해성 변형체는 본 발명의 핵산에 링커와 직접 또는 이를 통하여 부착가능함도 본 발명의 범위 내이다. 상기 생분해성 변형체는 본 발명의 핵산 특성을 다른 특성 중에 동물 신체, 바람직하게는 인간 신체에서 본 발명의 핵산으로부터 상기 변형체가 유리되도록 함으로서, 체류 시간에 관한 특성이 변형하도록 한다. 생분해성 변형체의 사용은 본 발명의 핵산의 체류 시간의 보다 나은 조절을 가능하게 할 수 있을 것이다. 이러한 바람직한 상기 생분해성 변형체의 바람직한 구현예로는 이에 제한되지는 않으나, 국제특허 출원 WO2002/065963, WO2003/070823, WO2004/113394 및 WO2000/41647, 바람직하게는 WO2000/41647 18 페이지, 4 내지 24줄들에 개시된 바와 같은 생분해성 변형체들이다. 보다 상세하게는 상기 생분해성 중합체는 WO2004/113394 및 WO2000 /41647에 각각 개시된 바와 같은 생분해성 PEG 또는 생분해성 폴리글리콜산 (biodegradable Polyglycolic acid: 약어 PLGA)인 것이다.

어떠한 이론에 국한되지 않은 범위 내에서, 중합체(polymer)와 같은 고분자량 기, 더욱 상세하게는, 본원에 개시된 바와 같은 중합체, 바람직하게는 생리학적으로 수용이 가능한 중합체를 갖는 본 발명에 따른 핵산을 변형시킴에 따라 배출 역학(excretion kinetic)은 변화될 것이다. 더욱 상세하게는, 이러한 변형된 발명적 핵산의 증가된 분자량 및 핵산, 특히 L형인 경우에 대사과정의 대상이 되지 않는 핵산으로 기인하는 경우에 동물세포, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간으로부터의 배출은 감소된다. 상기 배출은 신장을 통해 전형적으로 일어나므로, 본원 발명자들은 상기 변형된 핵산의 사구체의 여과속도가 이와 같은 높은 분자량의 변형을 거치지 않아 결과적으로 생체 내의 체류시간이 증가 되는 이러한 고분자량의 변형체를 갖지 않은 핵산과 비교시에 현저하게 감소 된다. 이와 연관지어, 본 발명에 따른 핵산의 특성이 상기와 같은 높은 분자량 변형에도 불구 하고 불리한 영향을 받지 않음은 매우 두드러진 사실이다. 지금까지, 본 발명에 따른 핵산은 정상인 경우는 약학 활성 성분으로부터 기대할 수 없는 예를 들어 지체된 방출을 제공하기 위해 지체된 방출속도(sustained release)를 제공하는 약학적 제형이 필수적이지는 않다는 것과 같은 놀라운 특성을 갖는다. 오히려 높은 분자량 부위를 함유하고 있는 변형된 본 발명에 따른 핵산은 서방형(sustained release formulation)으로서 즉시 사용가능하다. 지금까지, 본원에 기재된 핵산의 변형체(들) 및 이리하여 변형된 핵산 분자 및 이를 포함하는 어떠한 조성물은 명확한, 바람직하게는 조절된 약물동력 (pharmacokinetics) 및 그들의 생물분소(biodis tribution). 이는 또한 조직으로의 순환(circulation) 및 분산(distribution)의 잔류시간(residence time)을 포함한다. 이와 같은 변형체는 특허출원 PCT/EP02/11950에 서술되어 있다.

그러나, 본원에서 개시된 핵산은 임의의 변형 및 특히 예를 들어, PEG화 반응 또는 HES화 반응과 같은 비 고 분자량성 변형체를 포함하고 있지 않음도 본 발명의 범주 내이다. 이러한 구현예는, 상기 핵산이 신체 내에서의 임의의 목표 장기 또는 조직으로의 양호한 분포를 갖거나 투여 후에 체내로부터 핵산의 빠른 제거율이 요구되는 경우에 특히 바람직하다. 신체 내에서의 임의의 목표 장기 또는 조직으로의 양호한 분포를 갖는 본원의 핵산은 핵산의 전신 농도를 낮게 유지하면서 목표 조직에서는 효과적인 국소 농도를 달성하게 할 것이다, 이는 경제적 관점에서 유리할 뿐만 아니라, 기타 불필요한 조직으로의 상기 핵산 제제의 노출을 감소시켜 부작용의 잠재적인 위험을 감소시키게 할 것이다. 본원에서 개시한 바와 같은 핵산의 투여 후 신체로부터의 빠른 제거율은 각각 본 발명에 따른, 본 발명의 따른 핵산 또는 이를 포함하는 약제를 사용하는 생체 내 실험 이미징(imaging) 또는 특이적 치료적 투약 요건(specific therapeutic dosing requirements)의 경우에서 바람직하다.

본 발명에 따른 핵산으로 본원에서 또한 발명적 핵산으로 지칭되는, 본 발명의 핵산 및/또는 본 발명에 따른 길항제들은 약제의 생성 또는 제조에 이용될 수 있다. 상기 약제는 적어도 하나 이상의 발명적 핵산을 포함하는데, 임의적으로 추가의 약학적 활성 화합물을 포함할 수 있으며, 여기에서 상기 본 발명 핵산은 바람직하게는 핵산 그 자체가 약학적 활성 화합물로서 작용하는 것이다. 바람직한 구현예로서, 상기 약제는 적어도 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체(carrier)를 포함할 수 있다. 상기 담체로는 예를 들어, 물, 완충액, PBS, 글루코스 수용액, 바람직하게는 5% 포도당 염 조절 수용액, 전분, 당, 젤라틴 또는 기타 임의의 허용되는 담체 물질 등을 들 수 있다. 상기 담체들은 일반적으로 당업계에 널리 알려져 있다. 당업자에게 있어, 본 발명의 임의의 구현예, 사용 및 측면들 또는 약제는 또한 본 발명의 약학 조성물에도 적용가능하고 그 반대도 인지 가능할 것이다.

치료 및/또는 예방을 위한 적응증(indication), 질병(disease) 및 장애 (disorders)의 본 발명과 관련되거나 또는 관련되어 제조된 핵산, 약학조성물 및 약제는 직접적 또는 간접적 중 하나와 각개의 병원성 기전과 관련된 MCP-1로부터 발생한다. 그러나, 이들의 적응증, 질병 및 장애는 MCP-2, MCP-3, MCP-4 및/ 또는 에오탁신이 직접적 또는 간접적으로 관여되어 있는 병원성 기전에서 치료 및 예방될 수 있다. 당업자에게 본 발명에 따른, 특히 상기 핵산들은 지금까지 예를 들어, 더 넓은 범위에서 MCP-2, MCP-3, MCP-4 및 에오탁신과 또는 이들에 각각 상호작용 및 결합하는 MCP-2, MCP-3, MCP-4 및 에오탁신과 관련된 질병들을 위해 사용될 수 있다는 것은 자명하다.

더 상세하게는, 그와 같은 사용은 다른 것들, 단핵 세포 침투 (mononuclear cell infiltration)에 의해 특성화되는 인간 질환에 중요한 역할을 하는 것을 짐작할 수 있는 MCP-1의 발현 패턴 중에 부상한다. 이와 같은 세포 침투 (cell infiltration)은 많은 염증성 및 자가면역 질환에 존재한다.

동물 모델에서, MCP-1는 병소 허혈증 (focal ischemia) 후 (Kim 1995; Wang 1995) 및 실험적 자가면역 뇌척수염 (encephalomyelitis) 동안 (Hulkower 1993; Ransohoff 1993; Banisor 2005) 뇌에서 발현된다는 것으로 알려져 있다. MCP-1은 이러한 동물 모델, 예를 들어 뇌졸중 (stroke) 및 다발성 경화증 (multiple sclerosis)에서 기술된 질병 진행 내의 단핵 세포를 목표를 하는 중요한 케모카인일 수 있다.

수많은 증거들이 단핵세포 화학 친화제 (monocyte chemoattraction) 내에서 및 요컨대 만성 염증 (chronic inflammation)에서의 MCP-1/CCR2 축의 특징적인 역할을 지지하며 주장한다: (i) MCP-1- 또는 CCR2-결핍 마우스들은 기타 마우스들이 정상으로 나타내는데 반하여 현격히 감소된 대식세포 화학주성 반응을 나타낸다 (Kuziel 1997; Kurihara 1997; Boring 1997; Lu 1998). (ii) 시험관 내 시험에서는 다른 케모카인과는 기능적 반복성을 가짐에도 불구하고, MCP-1 작용기 기능 단독의 손실은 몇 가지 실험모델에서 단핵세포 소통 기능의 손실을 나타내기에 충분하다 (Lloyd 1997; Furuichi 2003; Egashira 2002; Galasso 2000; Ogata 1997; Kennedy 1998; Gonzalo 1998; Kitamoto 2003). (iii) MCP-1 수준은 다수의 염증 질환에서 증가된다. 실제로, MCP-1는 류마치스성 관절염 (Koch 1992; Hosaka 1994; Akahoshi 1993; Harigai 1993; Rollins 1996), 신장 질병 (Wada 1996; Viedt 2002), 혈관 성형술 후 재발협착증 (Economou 2001), 알레르기 및 천식 (Alam 1996; Holgate 1997; Gonzalo 1998), 암 (Salcedo 2000; Gordillo 2004), 동맥경화증 (Nelken 1991; Yla-Herttuala 1991; Schwartz 1993; Takeya 1993; Boring1998), 건선 (Vestergaard 2004), 신경계 염증 (Huang 2001), 아토피성 피부염 (Kaburagi 2001), 대장염 (Okuno 2002), 자궁내막증 (Jolicoeur 2001), 포도막염(uveitis) (Tuaillon 2002), 망막성 질환 (Nakazawa 2007), 특발성 폐섬유증 및 유육종증 (Iyonaga 1994) 및 다발성근염(polymyositis)/피부근염(dermatomyositis)(DeBlee cker 2002)과 같은 자명한 염증 요인을 갖거나 갖지 않은 다수 질환에서 역할을 하는 것으로 사료된다.

항-MCP-1 작용제 - 또는 CCR2 길항제-와 치료상의 중재는 여분의 염증성 단핵세포 소통 (inflammatory monocyte trafficking)에 영향을 미치는 반면에, 대식세포의 기초 소통 (basal trafficking)을 면할 것이며, 이로 인해 일반적 면역 억제 (immunosuppression) 및 감염의 증가된 위험 요소를 회피할 수 있다.

추가적으로, 염증 진행의 분자적 기전 및 염증의 국소적 배출된 중재자들의 상호작용에 대한 증가 되고 있는 지식에 기초하여, 신장 질환의 치료를 위한 새로운 목표들이 알려졌다 (Holdsworth 2000; Segerer 2000). 적절한 실험동물 모델 존재에서 특이적 길항제로 발현 및 중재 연구상에서 확실한 데이터를 위한 이러한 목표 중의 하나는 MCP-1이다. 이 단백질은 신장의 염증 부위로까지의 면역-세포 순항에 넓게 과도하지 않은 적절한 역할을 갖는다. 신장으로의 면역 세포 침투는 구조적 신장 손상 및 신장 질환의 다양한 형태로의 진행에 있어서의 신장 기능의 쇠퇴의 주요 기전으로 여겨진다.

모든 종류의 신장 세포들은 시험관 내 실험 (in vitro)상에서 자극에 의해 MCP-1을 포함하는 케모카인 (chemokine)을 발현할 수 있다 (Segerer 2000); 사이토카인 (cytokines), 산화 라디칼 (oxygen radicals), 면역 복합체들 (immune complexes), 및 지방 매개물질 (lipid mediators)을 포함하여 시험관 내 실험 (in vitro)에서 MCP-1 발현을 촉발하는 긴 목록의 자극제(stimuli)들이 있다.

래트 및 마우스의 건강한 신장 내에서, MCP-1은 발현되지는 않으나, 면역 복합체 사구체 신염 (glomerulonephritis), 급성 진행성 사구체 신염 (rapid progressive glomerulonephritis), 증식성 사구체 신염 (proliferative glome rulonephritis), 당뇨성 신병증 (diabetic nephropathy), 폐쇄성 신병증 (obs tructive nephropathy), 또는 급성 신세뇨관 괴사 (acute tubular necrosis)를 포함하는 급성 및 만성 염증 설치류 모델들의 신장 염증 과정 동안에는 손쉽게 상위조절된다 (Segerer 2000; Anders 2003). 설치류 내의 MCP-1의 발현 데이터들은 신장 생체 검사법 (human renal biopsies) 내의 각 발현과도 잘 연관되고 있다 (Rovin 1994; Cockwell 1998; Wada 1999). 더 나아가, 인간 신장 내의 신장 발현은 질병 활성과 관련되며 질병 완화가 적절한 치료로 유도되었을 때 감소한다 (Amann 2003).

사구체 단핵세포 침투(glomerular mononuclear cell infiltration)는 당뇨성 신병증 환자의 미만성 사구체 경화증 (diffuse glomerulosclerosis)의 진행을 수반한다. MCP-1은 사구체 (glomerulus) 내의 단핵 세포 및 임파구의 동원 및 축적에 중요한 역할을 한다 (Banba 2000; Morii 2003).

국소적으로 생성된 MCP-1은 신독성 혈액-유도된 신염 (nephrotoxic serum-induced nephritis; NSN) 형질전환 쥐를 사용하는 실험에서 확인되는 바와 같이, 특히 튜블성 간질성 손상 (tubulointerstitial damage)의 개시 (initiation)와 진행 (progression)과 관련되는 것 같다. MCP-1는 주로 혈관 내피세포 (vascular endothelial cells), 세뇨관 상피세포 (tubular epithelial cells) 및 세포간 손상에서의 침투성 단핵 세포에서 주로 검출된다. 세뇨관 상피세포의 MCP-1 중재된 활성은 진행성 신장 질환의 지표가 되는 내분비계 염증에 MCP-1이 기여한다는 관념과 일치하고 있다 (Wada 2001; Viedt 2002).

한편으로는 MCP-1와 다른 한편으로는 MCP-2, MCP-3, MCP-4 및 에오탁신 간의 상동성으로 의하여, 본 발명에 따르는 핵산, 적어도 각각 MCP-2, MCP-3, MCP-4 및 에오탁신과 상호작용 또는 이들과 결합하는 상기 핵산은 개개 MCP-2, MCP-3, MCP-4 및 에오탁신이 직접적 또는 간접적으로 관련된 임의의 질병의 치료, 예방 및/ 또는 진단을 위해 전형적으로 사용될 수 있다. 본원에서 정의되는 “관련된(involved)”은 만일 상기 질병들과 관련된 개개 분자들이 상기 질병의 병리학적 기전과 연관된 기능의 하나, 일부 또는 모두를 발휘되는 것을 저해한다면, 상기 질환은 치유 또는 진행상의 감소 또는 저해되어 발병의 감소; 이러한 질병의 증상 및 임의의 징표가 상기 질병으로 고통받지 않는 객체 또는 이러한 질병으로 발전할 위험성이 없는 객체상에서 발견되는 증상 (symptom) 또는 지표 (indicator)와 동일 또는 유사할 정도로 완치되고 개선될 것임을 의미한다.

물론, 본 발명에 따르는 MCP-1 결합 핵산이 인간 또는 설치류 MCP-1에 결합하거나 상호작용하므로, 당업자는 본 발명에 따르는 MCP-1 결합 핵산이 인간 및 동물의 본원에서 개시된 임의의 질병의 치료, 예방 및/ 또는 진단을 위해 용이하게 사용될 수 있음을 통상적으로 이해될 것이다.

따라서, 단핵 세포 회학주성 단백질 (monocyte chemoattractant protein; MCP) 군의 이러한 구성원들, 즉, MCP-2, MCP-3, MCP-4 및 에오탁신은 MCP-1와 높은 서열 유사성을 갖는다. 배제되고자 함이 아님에도 불구하고, 에오탁신, MCP-2, -3 및 -4는 인간 호산구상의 특이적인 케모카인 수용체인 CCR3를 통해 상호 작용한다 (Health 1997). CCR3 수용체는 피부 T-세포 임파종 (cutaneous T-cell lymphoma) (Kleinhans 2003), 교아종 (glioblastoma) (Kouno 2004), 또는 신장 세포암 (renal cell carcinoma) (Johrer 2005)와 같은 신생물 질환 (neoplastic conditions)에서 상위조절된다(upregulated).

보다 상세하게는, 상승된 수준의 에오탁신은 천식 진단 (asthma diagnosis) 및 손상된 폐기능 (compromised lung function)을 직접적으로 수반한다 (Nakamura 1999). 알러지성 염증의 부위에서의 에오탁신의 증가된 발현이 아토피성 (atopic) 및 비아토피성 천식 (nonatopic asthmatics) 모두에서 관찰되었다 (Ying 1997; Ying 1999). 또한, MCP-2 및 -4를 코딩하는 mRNAs는 다양한 조직에서 구조적으로 발현된다; 그러나, 이러한 공개내용에서 이들의 생리학적 기능은 알려지지 않았다. 혈장 MCP-2 수준은 MCP-1와 함께 패혈증(sepsis)에서 증가된다 (Bossink 1995); MCP-3 발현은 천식성 (asthmatics)에서 일어난다 (Humbert 1997). 마지막으로, MCP-4는 죽상경화성 혈관 (atherosclerotic vessels)의 내강 표면 (luminal surface)에서 발견될 수 있다 (Berkhout 1997).

따라서, 본 발명에 따르는 약제가 사용될 수 있는 치료 및 예방을 위한 질병(disease) 및/또는 장애(disorders) 및/ 또는 병적 상태(diseased conditions)는, 이에 제한되지 않으나, 염증성 질환 (inflammatory diseases), 자가 면역 질환 (autoimmune diseases), 자기 면역 뇌척수염 (autoimmune encephalomyelitis), 뇌졸중 (stroke), 급성 및 만성 다발성 경화증 (acute and chronic multiple sclerosis), 만성 염증 (chronic inflammation), 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis), 신장 질환 (renal diseases), 재발협착증 (restenosis), 혈관성형 이후 재발협착증 (restenosis after angioplasty), 급성 및 만성 알러지성 반응, 1 차 및 2 차 면역성 또는 알러지성 반응, 천식 (asthma), 결막염 (conjunctivitis), 기관지염 (bronchitis), 암 (cancer), 동맥경화증 (atherosclerosis), 관절경화증 심혈관성 심장 부전 (artheriosclerotic cardiovasular heart failure) 또는 뇌졸중 (stroke), 건선 (psoriasis), 건선의 관절염 (psoriatic arthritis), 신경계 염증 (inflammation of the nervous system), 아토피성 피부염 (atopic dermatitis), 대장염 (colitis), 자궁내막증 (endometriosis), 포도막염 (uveitis), 시력 감퇴를 포함하는 망막 장애 (retinal disorder including macular degeneration), 망막 박리 (retinal detachment), 당뇨병성 망막병증 (diabetic retinopathy), 조숙성 망막증 (retinopathy of prematurity), 색소성 망막염 (retinitis pigmentosa), 증식성 유리체망막병증 (proliferative vitreoretinopathy), 및 중심성 맥락망막염 (central serous chorioretinopathy); 특발성 폐섬유증 (idiopathic pulmonary fibrosis), 유육종증 (sarcoidosis), 다발성 근염 (polymyositis), 피부근염 (dermatomyositis), 면역억제의 회피 (avoidance of immunosuppression), 감염 위해요소의 경감(reducing the risk of infection), 패혈증 (sepsis), 신장 염증 (renal inflammation), 사구체 신염 (glomerulonephritis), 급성 진행성 사구체 신염 (rapid progressive glomerulonephritis), 증식성 사구체 신염 (proliferative glomerulonephritis), 당뇨병성 신증 (diabetic nephropathy), 폐색성 신장병증 (obstructive nephropathy), 급성 신세뇨관 괴사 (acute tubular necrosis), 및 미만성 사구체 경화증 (diffuse glomerulosclerosis), 전신 홍반성 낭창 (systemic lupus erythematosus), 만성 기관지염 (chronic bronchitis), 베체트씨 병 (Behcet's disease), 근위축성 측방 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 카와사키 병 이후의 조숙성 동맥경화증 (premature atherosclerosis after Kawasaki's disease), 심근 경색증 (myocardial infarction), 비만증 (obesity), 만성 간 질환 (chronic liver disease), 페이로니씨 병 (peyronie's disease), 급성 척추신경 손상 (acute spinal chord injury), 폐 또는 신장 이식, 심근염 (myo carditis), 알츠하이머 질환 (Alzheimer's disease) 및 신경 장해 (neuropathy), 유방암 (breast carcinoma), 위암 (gastric carcinoma), 방광암 (bladder cancer), 난소암 (ovarian cancer), 과오종 (hamartoma), 결장직장암 (colorectal car cinoma), 결장 선종 (colonic adenoma), 췌장염 (pancreatitis), 만성 폐색성 폐 질환 (chronic obstructive pulmonary diseases, COPD) 및 크론씨 병 (Crohn's disease) 또는 궤양성 대장염 (ulcerative colitis)과 같은 염증성 장 질환 (inflammatory bowel diseases)을 포함할 수 있다.

특히 바람직한 만성 신장 질환은 낭창성 신염, 바람직하게는 조합치료(combination therapy)를 위한 것이다.

낭창성 신염은 전신성 홍반성 낭창(약어: SLE)으로 기인하는 신장 염증이고 사구체 신염의 하나의 형태 또는 일종인 루프스 사구체신염(lupus glomeru lonephritis)로 지칭된다. 사구체성 신염(glomerular nephritis) 으로 지칭되는 사구체성 신염(Lomerulonephritis)은 신장에서의 사구체 또는 소혈관에서의 염증으로 특징화되는 신장 질환이다.

루프스(lupus)라고도 지칭되는 SLE는 염증 및 조직 손상을 야기하는 만성 자가면역 질환이다. 신장과는 별개로, SLE는 신체 임의의 부위에 영향을 미칠 수 있으나 심장, 관절, 피부, 폐, 혈관, 간 및 신경계에 위해를 주로 끼친다. 폐 손상은 폐렴(pneumonitis)과 같은 상기 만성 호흡기 질환에서 명백하고 폐 증상들은 늑막염 (pleuritis), 흉수(pleural effusion), 루푸스 폐렴 (lupus pneumonitis), 만성 미만형 간질성 폐질환(chronic diffuse interstitial lung disease), 폐고혈압 (pulmonary hypertension), 폐색전증(pulmonary emboli), 폐출혈 (pulmonary hemorrhage), 및 위축성 폐 증후군 (shrinking lung syndrome)을 야기할 수 있는 폐 및 흉강 염증을 포함한다.

낭창성 신염의 진단은 전형적으로 혈액 검사법, 소변분석법, X-레이(ray) 법, 신장 초음파 스캔법 및/또는 신장 생검법으로 수행된다.

국제보건기구(World Health organization)은 낭창성 신염을 생검에 기초하여 5개 분류(class)로 분류하였고 이들은 모두 본원에서 사용된 낭창성 신염(lupus nephritis)이라는 용어의 범위로 포함될 것이다.

상기 분류법은 1982년에 정의되었으며 1995년에 개정되었다.

제 I 분류 (Class I)는 광학 현미경상에서는 조직학적으로 정상이나 전자 현미경하에서는 간질 침착 증상을 나타내는 가질 최소간질 사구체 신염(minimal mesangial glomerulonephritis)이다.

제 II 분류 (Class II)는 간질 증식성 낭창성 신염(mesangial proliferative lupus nephritis) 소견에 기초한다. 이 형태는 전형적으로 코르티코스테로이드 (corticosteroids)로 처치시 완전하게 반응한다.

제 III 분류 (Class III)는 초점성 증식성 신염(focal proliferative nephritis)이며 고용량의 코르티코스테로이드로 처치시에 성공적으로 반응한다.

제 IV 분류 (Class IV)는 미만형 증식성 신염(diffuse proliferative nephritis)이다. 이 형태는 주로 코르티코스테로이드 및 면역억제제로 치료된다.

제 V 분류 (Class V)는 막성 신염(membranous nephritis)이며 이는 극심한 부종 및 단백질 소실 증상으로 특징화된다.

제 VI 분류 (Class VI)는 사구체경화증(Glomerulosclerosis)이다.

신장 질환인 사구체체신염의 기타 형태 또는 일종으로는

(1) 막성 증식성 사구체 신염 (membranoproliferative glomerulonephritis; 약어. MPGN): 신장에서 침착에 기이한 사구체 간질 및 기저막(약어: GBM) 비후, 보체 활성화 및 사구체 손상을 야기하는 일종의 사구체 신염의 일종;

(2) 막성 사구체 신염 (membranous glomerulonephritis; 약어: MGN): 신장의 점진적으로 진행하는 질환으로 일명 막성 신장애(membranous nephropathy);

(3) IgA 신장애(nephropathy): 전 세계적으로 가장 흔한 사구체 신염으로서 상기 질병은 사구체의 중심인 간질(mesangium)에서 얼룩 형태로 면역글로블린 A(약어. IgA)의 침착으로 명명이 유래됨);

(4) 연쇄상구균 감염후 사구체신염 (post-streptococcal glomerulonephrit is): 연쇄상구균 감염 후, 신장 사구체 (사구체 신염) 또는 소 혈관에서의 질환;

(5) 급속진행형 사구체신염 (rapidly progressive glomerulonephritis: 약어. RPGN): 치료를 하지 않고 방치시에 급성 신부전증으로 급속적으로 진행되어 몇 달내에 사망에 이르는 신장 증후군이다. 약 50%에서, RPGN은 굿페스쳐 증후군 (Goodpasture syndrome), 전신성 홍반성 낭창 (systemic lupus erythematosus) 또는 베게너육아종증 (Wegener granulomatosis)과 같은 후속질환을 수반하며 남은 케이스들은 특발성임;

(6) 신염 증후군 (nephritic syndrome; 또는 급성 신염 증후군): 신장에 영향을 미치는 장애, 보다 상세하게는 사구체성 장애를 수반하는 증상들의 집합임;

(7) 국소성 분절성 사구체경화증 (focal segmental glomerulosclerosis): 소아 및 사춘기 청년의 신증후군의 원인뿐만 아니라 성인 신부전증의 중요한 원인임;

(8) 당뇨병성 신장애(diabetic nephropathy): 킴멜스틸-윌슨 증후군 (Kim melstiel-Wilson syndrome) 및 모세혈관내 사구체신증 (intercapillary glomeru lonephritis)로 지칭되는 장애로서 신장 사구체에서 모세관의 맥관병증으로 기인되는 진행성 신장 질환임. 이는 신증후군 및 결절성 사구체경화증으로 특징화된다. 장기간의 진성 당뇨병으로 초래되고 다수의 서양인의 투석의 주요한 원인이다.

(9) 신증후군 (nephrotic syndrome): 신장이 손상되고 다량의 단백질(>3.5 그램/일/1.73 m² 체표면)이 누출되도록 하는 비특이적 장애임;

(10) 간질성신염 (Interstitial nephritis 또는 급성세뇨관 간질성 신염(tubulo-interstitial nephritis)): 세뇨관을 에워싸는 신장 간질조직에 영향을 미치는 신염의 형태임. 본 질병은 급성 또는 만성일 수 있다.

MCP-1 및 이의 개개 케모카인 (chemokine) 수용체 CCR2가 SLE의 임상 증상과 같은 자가면역증의 주요한 역할을 담당한다는 명백한 근거가 있다(Gerard & Rollins 2001). 예를 들어, MCP-1 또는 CCR2 유전자가 결핍된 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스가 루프스-양상 자가면역증으로부터 보호됨이 밝혀졌다 (Perez de Lema 2005, Tesch 1999). 그러므로, 상기 MCP-1/CCR2 축(axis)은 예를 들어, 낭창성 신염과 같은 질환 치료에 유망한 치료제를 개발할 수 있다.

만성 폐 질환(chronic pulmonary diseases) 또는 만성 폐 질병 (chronic lung diseases)으로도 지칭되는 만성 기관지 질환 (Chronic respiratory diseases)은 기도 및 예를 들어, 폐 맥관구조 등과 같은 폐의 기타 기관의 만성질환이다. 가장 흔한 만성 기관지 질환은 천식(asthma), 만성 기도폐쇄성 질환 (chronic obstructive pulmonary disease; 약어 COPD), 기관지 알러지 (respiratory allergies), 직업성 폐질환 (occupational lung diseases) 및 폐 고혈압 (pulmonary hypertension)이다.

만성 기도폐쇄성 질환 (약어 COPD)은 폐로부터의 기도의 지속적인 차단으로 특징되어 지는 폐질환이다. 이는 정상적 호흡을 방해하고 온전하게 가역적이지 않는 생존에 치명적인 잘 진단되지 않는 질환이다. COPD는 몇 가지 폐질환을 포함한다: 가장 흔한 질환으로는 만성 기관지염 및 폐기종이다. COPD를 앓고 있는 다수 환자들은 이러한 질환 모두를 앓고 있다. 폐기종은 필요한 산소를 흡수하기 어렵게 하는, 기도 상부에 위치한 폐포에 대한 손상을 야기하는 질환이다. 만성 기관지염 동안에 기도는 자극되어 홍색으로 변하고 점성의 점액을 과다하게 분비시킨다. 기도 벽이 부풀어 오르고 공기의 통과를 일부 차단하게 한다.

COPD 및/또는 COPD 발병과정과 MCP-1과의 관련성에 대해서는 지금까지 명확하지는 않다. 드 보아(De Boer) 및 동료들은 COPD를 앓는 흡연가 또는 흡연 중단자의 주변 폐 조직상의 반-정량분석 시험결과, MCP-1 mRNA 가 1.5배 높은 수준을 나타냄을 발견하였다 (De Boer 2000). 이러한 결과에 기초하여, 저자는 MCP-1이 COPD 질환자의 대식세포 및 비만 세포가 기도 상피로 순항과정과 관련되는 것으로 추정되었다. 트레이브스 등 (Traves et al; Traves 2002)은 객담에서는 증가된 MCP-1 수준을 나타냈으나, 기관지 폐포세척액 (약어. BAL)에서는 발견되지 않아 MCP-1는 단핵구 및 호중구의 기도로의 이동과 연관되어 COPD를 수반하는 증가된 염증성 지표를 나타내는 것으로 추정된다 (Traves 2002). 그러나 문헌 (2006 Ko 등; Ko 2006)은 COPD 환자의 날숨량(exhaled breath condensate)을 측정하였다. 이들은 COPD 환자의 상승된 MCP-1 수준을 발견하지 못했다 (Ko 2006).

비록 MCP-1이 염증과정 및 염증을 유발하는 단핵구 및/호중구의 순항과 연관됨에도 불구하고, MCP-1이 COPD 및/또는 COPD 발병과 연관되는지 여부에 대해서는 절대적으로 명확하지 않다. 놀랍게도, 본 발명의 실시예 11에 나타난 바와 같이, COPD 치료에 유용한 물질을 검색하는 데 잘 알려진 공인된 동물 모델 시험에서, MCP-1 결합 스피에겔머 (Spiegelmer)가 폐로의 세포성 침투물의 감소효과를 초래한다는 사실을 밝혀냈다. 본원에서 밝혀진 데이터에 기초하여 MCP-1 결합 스피에겔머가 만성 기관지 질환, 바람직하게는 COPD의 치료법에 있어서 단독 또는 조합치료법, 바람직하게는 스테로이드 약물, 바람직하게는 덱사메타손(dexamethasone)과의 조합치료법의 1개 요소로서 사용하기에 적합하다. MCP-1 결합 스피에겔머 및 덱사메타손 또는 기타 스테로이드 약물들과의 조합치료법은 COPD와 같은 만성 기관지 질환을 치료하기 위한 2개의 독립적인 작용기전을 발휘한다는 장점을 갖는다.

폐 맥관구조 및 기능상의 변화가 본원에서 폐 혈관 발달 소견을 갖는 COPD로 구체화되는 바와 같이, COPD 환자에게 있어서 매우 빈발하다 (Peinado 2008). 맥관구조상의 이상증상은 공기 치환을 손상시켜 COPD 환자의 낮은 생존율을 수반하는 주요 원인 중에 하나인 폐고혈압 증상을 초래할 수 있다 (Peinado 2008). 폐 순환 과정의 변화가 초기 질병 단계에서 동정되었으며, 이는 이들의 발병기전에 대한 새로운 이해를 제공한다. 담배 연기 제품 또는 염증성 요소에 의하여 야기되는 내피세포 손상 및 기능장애는 폐고혈압을 초래하는 일련의 발명 과정을 촉발시키는 주요한 변화과정으로 간주 되고 있다 (Peinado 2008).

폐고혈압 (약어. PH)은 통칭하여 폐 맥관구조물 (lung vasculature)로 알려진 폐 동맥, 폐 정맥 또는 폐 말초혈관 혈압상의 상승을 의미하며, 이는 운동에 의하여 악화되는, 호흡 곤란, 현기증, 기절 및 기타 증상을 초래한다. PH 증상은 급격한 감소된 운동 내성을 나타내고 심부전증을 초래하는 심각한 질환으로 진행될 수 있다. 1973 이후에 일차성 PH 및 이차성 PH 상로간의 차별점이 밝혀졌다 (Hatano & Strasser 1975).

일차성 PH 는 알려진 원인이 없이 만성적으로 증가된 폐 혈관 저항증 (pulmonary vascular resistance)으로 특징화된 증상으로서 만일 치료하지 않으며, 대대 4년 이내에 사망을 초래한다 (Rubin 1997).

이차성 PH는 유지되는 혈관 수축 및 폐 혈관상으로의 구조적 변형으로부터 유래된다 (Hopkins 2002). 이러한 변화를 담당하는 주요 자극은 만성 폐포 저산소증, 만성 염증 및 과도한 전단 응력이다 (Voelker 1995).

2003년에, 베니스에서 개최된 제 3차 폐동맥고혈압 국제학회(World Sym posium on Pulmonary Arterial Hypertension)에서 질병 기전에 대한 새로운 이해에 기초하여 분류법을 변화시켰다. 이러한 그룹에서 개발한 상기 개정 시스템은 폐고혈압을 이해하기 위한 현재의 분류 골격체계를 제공한다 (Simonneau 2004):

(1) WHO(국제보건기구) 그룹 I - 폐 동맥 고혈압(Pulmonary arterial hyper tension; 약어 PAH)

o 특발성 폐 동맥성 고혈압 (Idiopathic pulmonary arterial hypertension; 약어 IPAH)

o 가족성 폐 동맥성 고혈압 (Familial pulmonary arterial hypertension; 약어 FPAH)

o 기타 질환을 수반하는 폐 동맥성 고혈압 (Pulmonary arterial hypertension associated with other diseases; 약어 APAH): 여기에서 상기 기타질환은 콜라겐 맥관 질환 (collagen vascular disease; 예를 들어 경피증(scleroderma)), 전신 및 폐 순환계간의 선천적 문합(congenital shunts), HIV 감염증, 약물, 독소, 또는 기타 질병 또는 장애

o 정맥 또는 말초 혈관계 질환을 수반하는 폐 동맥 고혈압 (Pulmonary arterial hypertension)

(2) WHO 그룹 II - 좌측 심장 질환 수반 폐 고혈압 (Pulmonary hypertension associated with left heart disease)

o 심방 또는 심실 질환

o 심장판막 질환 (예: 승모판 협착증)

(3) WHO 그룹 III - 폐 질환 및/또는 저산소증 수반 폐 고혈압 (Pulmonary hypertension associated with lung diseases and/or hypoxemia)

o 만성 폐색성 폐 질환 (약어 COPD), 간질성 폐질환 (약어 ILD)

o 수면-장애 호흡증, 폐포 저환기증(alveolar hypoventilation)

o 고도 만성 노출

o 진행성 폐 기형증

(4) WHO 그룹 IV - 혈전성 및/또는 색전성 질환으로 기인한 폐 고혈압 (Pulmonary hypertension due to chronic thrombotic and/or embolic disease)

o 근위(proximal) 또는 원위(distal) 폐 동맥상의 폐 색전증

o 암세포 또는 기생충 등과 같은 다른 개체의 혈전 폐색증

(5) WHO 그룹 V - 기타 질환( Miscellaneous )

최근에 일차성 및 이차성 PAH에 대한 다수의 치료제들이 개발되어 왔다: 에포프로스테놀 (epoprostenol) 등과 같은 프로스타사이클린 유도체 (prostacyclin derivative), 보센탄(bosentan)과 같은 엔도텔린 (endothelin) 수용체 길항제 및 실데나필 (sildenafil)과 같은 포스포디에스테라제 5형 (phosphodiesterase type 5) 저해제 (Torres 2007).

MCP-1 수준은 건강한 대조군과 비교시 특발성 폐 동맥 고혈압 또는 일차성 폐 고혈압 환자에서 상승된 수준을 나타냈다. 이러한 결과는 폐 고혈압 발병에 MCP-1이 기여함을 의미한다 (Itoh 2006,). 실시예 12에 나타난 바와 같이, MCP-1 결합 스피에겔머는 폐 고혈압 치료에 대한 유용성을 검색하는데 놀리 사용되는 동물 실험 모델에서 PH에 대하여 양성 활성을 나타낸다. 따라서, MCP-1 결합 스피에겔머는 PH 치료를 위한 치료제로서 유용할 수 있다.

본 발명의 추가적인 구현예로서, 상기 약제는 추가의 약학 활성 작용제를 포함하는 것이다. 이러한 추가의 약학 활성 작용제는 이들 중 그러나 이에 제한되지는 않는 혈압 및 당뇨를 조절하는 것으로 알려진 것, 예를 들어 안지오텐신 변환효소 (angiotensin converting enzyme, ACE) 저해제 및 안지오텐신 수용체 억제제 (angiotensin receptor blockers)이다. 추가의 약학 활성 성분은, 추가의 구현예로서, 만성 염증 부위로의 면역 세포의 침투를 감소시키거나 일반적으로 만성 염증성 상태에 존재하여 조직 손상에 이르는 과잉의 면역 반응을 억제하는 화합물 중 하나일 수 있다. 이러한 화합물로는, 이에 한정하지 않으나, 스테로이드 또는 면역 억제제가 될 수 있으며, 바람직하게는 프레드니손 (prednisone), 메틸프레드니솔론 (methylprednisolone), 히드로코르티손 (hydrocortisone), 덱사메타손 (dexametha sone)과 같은 코르티코스테로이드 (corticosteroid), 및 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 사이클로스포린 (cyclosporine), 클로람부실 (chlorambucil), 아자티오프린 (azathioprine), 타크로리무스 (tacrolimus) 또는 마이코페놀레이트 모페틸 (mycophenolate mofetil)과 같은 일반적 면역 억제제를 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 추가적으로, 예를 들어, CD154 또는 CD40 또는 CD28 또는 CD86 또는 CD80 차단제(blockers)와 같은 보다 특이적인 T-세포 공자극 (cos timulation) 차단제; 또는 항-CD20 제와 같은 T- 및/ 또는 B-세포 파괴 작용제들이 추가적인 구현예로서 유용하다. 마지막으로, 추가적인 약학 활성 작용제는 케모카인 효현제 또는 길항제 또는 케모카인 수용체 효현제 또는 길항제일 수 있는 임의의 기타 케모카인 활성 조절제 (modulator)일 수 있다. 호환적으로, 또는 추가적으로, 이와 같은 추가적인 약학 활성 작용제는 본 발명에 따르는 추가적인 핵산이다. 호환적으로, 상기 약제는 MCP-1와 상이한 목표 분자와 결합하거나 본 발명에 따르는 핵산 중 하나와 상이한 기능을 나타내는 하나 이상의 핵산을 포함한다.

상기 약제는 원칙적으로 상기 질병의 치료를 위한 약제의 사용과 관련된 임의 질병의 예방을 위해 호환적으로 또는 추가적으로 사용될 수 있음도 본 발명의 범주 내이다. 따라서, 예를 들어 개개 질병을 위한 개개 마커 (marker)는 당업자에게 널리 알려져 있다. 바람직하게는, 상기 개개 마커는 MCP-1이다. 호환적 및/ 또는 추가적으로, 상기 개개 마커는 MCP-2, MCP-3, MCP-4, 및 에오탁신을 포함하는 그룹으로부터 선택된다. 보다 더 추가적인 마커의 그룹은 예를 들어, 항-dsDNA 항제들 (anti-dsDNA antibodies) 또는 류머티즘 인자 (rheumatoid factor)와 같은 혈장 내 자가반응적 항체들 (autoreactive antibodies)을 포함하는 군으로부터 선택되는 것이다.

본 발명의 약제의 하나의 구현예로서, 상기 약제는 본원에 개시된 임의 질병, 바람직하게는 본 발명의 약제가 사용될 임의 질병에 대한 다른 치료법과 조합하여 사용할 수 있다.

“조합 치료법 (combination therapy)” (또는 “공동-치료법 (co-therapy)”)은 본 발명의 약제 투여 및 이러한 치료제를 공동-작용 (co-action)함으로서 유리한 효과를 제공하기 위한 특정 치료 처방 (specific treatment regimen)의 부분으로서 최소한 2차 작용제를 포함, 즉, 본 발명의 약제 및 상기 2차 작용제와의 조합 투여를 포함한다. 상기 조합의 유리한 효과는, 이에 제한되지는 않으나, 치료제들의 조합으로 초래되는 약물동력학적 (pharmacokinetic) 또는 약물역학적 (pharmacody namic) 공동-작용을 포함한다. 이러한 치료제들의 조합 투여는 전형적으로 한정된 일정 기간 (선택된 조합에 따라 보통 분, 시간, 일 또는 주 단위)이상 수행된다.

일반적이지는 않으나, “조합 치료 (combination therapy)”는 본 발명의 조합을 우발적 및 자발적으로 초래하는 분리된 단독요법 처방의 일부분으로서 2개 이상의 이러한 치료제 조합 투여를 포함하는 의도일 수 있다. “조합 치료”는 상기 치료제 투여를 연속적인 순서, 즉 상기 이러한 치료제들의 투여뿐만 아니라 개개 치료제를 상이한 시각에 투여하거나 또는 2 개 이상의 치료제들을 실질적 동시 투여방법(substantially simultaneously manner)을 포함할 의도이다. 이러한 실질적 동시 투여 방법은 예를 들어, 고정된 비를 갖는 개개 치료제를 함유한 단일 캡슐 또는 개개 치료제의 다중, 단일 캡슐을 투여객체에 투여함으로써 달성가능하다.

본 발명의 바람직한 구현예로서, 상기 조합치료법을 이용하여 치료되어야 할 상기 만성 질환은 만성 신장 질환 및 보다 바람직하게는 낭창성신염(lupus nephritis), 또는 만성 폐질환 및 보다 바람직하게는 폐렴 중 하나이다. 상기한 조합치료법은 본원에 개시된 바와 같은 핵산, 및 면역억제제와의 조합을 이용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 면역억제제는 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 및 마이코페놀레이트 모페틸 (mycophenolate mofetil)을 포함하는 군으로부터 선택되는 것이다.

시토포스판 (cytophosphane)으로도 지칭되는, 시클로포스파미드 (상품명: Cytoxan, Neosar, Revimmune)은 옥사조포린기(oxazophorines group)로부터 유래된 질소 겨자 알킬화제 (nitrogen mustard alkylating agent)이다. 시클로포스파미드의 정맥 내 및 경구투여는 낭창성 사구체신염에 대한 기본적 치료법이었다 (Steinberg 1991). 시클로포스파미드는 간에서 화학요법적 활성을 갖는 활성형으로 전환되는 “전구약물 (prodrug)” 사실상, 시클로포스파미드의 사용은 골수 억제, 출혈성 방광염, 기회성 감염증, 악성 종양 질환, 조기 생식샘 부전증 등을 포함한 잠재적인 극심한 독성 작용 때문에 제한점이 있다 (Boumpas 1995). 코르티코스테로이드와 시클로포스파미드와의 조합으로 간헐적인 정맥 내 주사투여한 임상시험에서 코르티코스테로이드 단독으로 치료한 치료법과 비교시에, 보다 장기간의 신장 생존율은 나타냈으나 전체적인 생존율은 나타내지는 못했다 (Austin 1986; Valeri 1994; Lehman 1989; Boumpas 1992). 게다가, 신장 부전증 진행의 증가된 비율을 수반하는, 병의 관해(차도; remission)를 달성하기 위한 실패가 시클로포스파미드 투여받은 환자들의 18 내지 57%에서 보고된 바 있다 (Korbert 2000; Gourley 1996; Ionnidis 2000; Mok 2004).

마이코페놀레이트 모페틸 (mycophenolate mofetil)은 면역억제제의 일종이며, 이는 간에서 대사되어 활성형인 미코페놀 산(mycophenolic acid)으로 전환된다. 이는 이노신 모노포스페이트 디히드로게나제 (inosine monophosphate dehydro genase)을 저해하는데, 상기 효소는 B 및 T 임파구 중식에 이용되는 퓨린 합성의 신생합성 (de novo pathway) 중의 구아닌 모노포스페이트 (guanine monophosphate)의 합성 속도를 조절한다. 마이코페놀레이트 모페틸은 이식 거부증의 예방제로 승인되었으며, 시클로포스마미드에 내성을 갖는 낭창성 신염 환자 및 시클로포스파미드에 효능을 나타내지 않는 환자에 사용되어 왔다 (Dooley 1990; Gaubitz 1999; Kingdon 2001; Karim 2002). 4-주간의 시험에서, 마이코페놀레이트 모페틸은 낭창성 신염의 병의 관해를 유도시키는 데 시클로포스파미드의 정맥 내 주사보다 유효한 활성을 나타냈다 (Ginzler 2005).

그러나, 상기 2개의 개개약물은 심각한 이환율 및 사망률을 수반한다. 예를 들어, 연구그룹(Aspreva Lupus Management Study; ALMS)의 임상실험에서 마이코페놀레이트 모페틸은 27.7%에서 심각한 부작용을 나타냈고 4.7%에서 치료-관련 치사율을 나타냈으며 시클로포스파미드 처치군에서는 치료환자의 22.8%에서 심각한 부작용을 나타냈고 2.8%에서 치료-관련 치사율을 각각 나타냈다 (Appel 2007). 가장 심각한 부작용 및 치사율은 시클로포스파미드 및 마이코페놀레이트 모페틸의 비특이적인 면역억제 효과에 기인한 감염과 관련되었다 (Appel 2007). 자가면역성 염증을 특이적으로 차단하는 신규 약물들은 시클로포스파미드 및 마이코페놀레이트 모페틸 약물을 대체하거나 또는 상기 약물들을 조합시에 유의 적인 투여 용량의 감소를 허용하게 함으로서 현재 치료 요법상의 독성을 감소시킬 수 있다.

상기한 조합 치료와 관련하여, 면역억제제의 전체적인 투여용량을 유의적으로 감소시키는 것이 치료 효과를 달성시키면서도 가능하다. 상기한 면역억제제의 전체적인 투여용량을 감소시키는 것은 개개 투여 시점에 면역억제제의 양을 감소시키거나 또는 질병치료 중에 면역억제제의 투여 빈도를 낮춤으로써 실현될 수도 있다. 상기한 2개의 선택사항이 수행 여부와 상관없이, 질병치료 중 환자에게 투여되는 면역억제제의 전체 투여용량은 면역억제제 및 본 발명에 따른 핵산 분자와의 조합이 아닌 상기 면역억제제만이 투여된다면 환자 치료중에 투여되는 면역억제제의 전체적인 투여용량과 비교시에는 감소 된다. 단순하게 약학적 활성제로서 상기 질환의 치료와 연관된 면역억제제의 상기 투여법을 본원에서는 단독치료법 (monotherapy)이라고도 지칭된다. 상기한 감소폭의 정도는 치료되어야 할 개개 환자의 특성뿐만 아니라 특정한 면역억제제 및 특정 질환에 따라 의존한다. 모든 경우에 있어서, 본 발명에 따른 상기 조합치료법은 단독치료법으로 개개 면역억제제의 사용과 비교하여 볼 때보다 적은 부작용을 갖는다.

단일의 약학적 활성제로서 조합치료법의 본 발명의 보다 바람직한 구현예로서, 본 발명에 다른 핵산은 만성 기관지 질환 치료와 연관된 조합치료법인 것이며, 여기에서 상기 만성 기관지 질환은 바람직하게는 COPD이다. 본 발명에 따른 핵산 분자와 함께 상기 조합치료법에 사용되는 상기 약제는 항-염증제이다. 바람직하게는, 상기 항-염증제는 덱사메타손(dexamathasone) 및 로플루밀라스트(roflumilast)을 포함하는 군으로부터 선택된 약물; 보다 바람직하게는 상기 항-염증제는 덱사메타손(dexamathasone)이다.

각 치료제의 연속적 또는 실질적 동시 투여방법은 이에 제한되지는 않으나, 국소투여 경로(topical routes), 경구투여 경로(oral routes), 정맥 내 투여경로 (intraveneous routes), 근육 내 투여 경로(intramuscular routes) 및 점막 조직을 통한 직접 흡수(direct absorption) 경로를 포함하는, 임의의 모든 적절한 경로로 영향을 미칠 수 있다. 상기 치료제들은 동일한 경로 또는 서로 상이한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 선택된 조합의 첫 번째 치료제는 주사를 통해 투여되면서, 조합의 또 다른 치료 작용제는 국소적으로 투여될 수도 있다.

호환적으로, 예를 들어, 모든 치료제들은 국소적으로 투여될 수도 있거나 또는 모든 치료제들을 주사로 투여할 수도 있다. 투여되는 치료제의 순서는 별도로 지적하지 않은 한은 엄밀하게 중요하지 않다. 또한 “조합 치료”는 다른 생물학적 활성 성분들과 추가적인 상기한 치료제와의 조합 투여를 포함할 수도 있다. 상기 조합 치료가 추가적으로 비-약물 치료법(non-drug treatment)을 포함하는 경우는 상기 비-약물 치료법은 상기 치료제 및 비-약물 치료법의 조합상의 공동-작용이 유리한 효과를 유지할 수 있는 한 임의의 적절한 시간 동안에도 수행될 수 있다. 예를 들어, 적절한 사례에서, 상기 비-약물 치료법이 치료제의 투여로부터 일시적, 아마도 수일 또는 수주일 동안 제거될 때에도 상기 유리한 효과는 달성될 수 있다.

상기와 같이 일반적인 정의로 설시된 바와 같이, 본 발명에 따른 약제는 원칙적으로 당업자에게 알려진 임의의 형태로 투여될 수 있다. 바람직한 투여경로는 전신 투여법이며, 보다 바람직하게는 비경구적 투여법, 가장 바람직하게는 주사법이다. 호환적으로, 상기 약제는 국소 투여가 가능하다. 기타 투여 경로로는 근육 투여법, 복강 투여법, 피하 투여법, 경구 투여 또는 바람직하게는 효능을 유지하면서도 최소한 침투성을 갖는 투여 경로가 주어지는 선호도를 갖는 비강 투여법 (intranasal), 기관 내 투여 (intratracheal) 또는 경폐 투여법 (pulmonary)들이다.

비경구 투여는 일반적으로 피하, 근육 내 또는 정맥 내 주사 또는 주입으로 사용된다. 추가적으로, 비경구 투여를 위한 하나의 접근법으로 당업계에 종사하는 자에게 잘 알려진, 일정한 투여용량을 유지하게 보장하는 지연성 방출 시스템 또는 서방성 방출 시스템의 적용 방법도 포함한다.

더 나아가, 본 발명의 바람직한 약제는 당업계에 종사하는 자에게 잘 알려진, 적절한 비강 매개물, 흡입기의 국소적 사용을 통해 경비 투여 형태, 또는 경피 투여 피부용 패취 (transdermal skin patches) 형태와 같은 형태를 이용한 경피 경로 (transdermal route)를 통해 투여될 수 있다. 경피 전달 시스템 (transdermal delivery system)의 형태로 투여되기 위해서는, 상기 용량 투여 (dosage admin istration)는 물론, 용량 처방 (dosage regimen) 내내 간헐적 보다는 연속적 투여용량일 것이다. 기타 바람직한 국소 제제로는 전형적으로 활성 성분 농도가 0.01% 내지 15% (w/w 또는 w/v)인, 크림제(creams), 연고제(ointments), 로션제 (lotion s), 분무제(sprays) 및 겔 제(gels)를 포함한다.

본 발명의 약제는 일반적으로, 이에 한정되지는 않으나, 약학적으로 허용된 매질에 용해 또는 분산된 본 발명의 핵산을 포함하는, 치료학적으로 유효량의 활성 작용제를 포함할 것이다. 약학적으로 허용가능한 매질 또는 담체로는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균성 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 저해제 및 그 유사체를 포함한다. 이러한 약학적 활성 물질을 위한 이와 같은 매질 및 작용제의 사용은 이미 당업계에 잘 알려져 있다. 보조 활성 성분 (supplementary active ingredient)도 또한 본 발명의 약제 내에 혼입될 수도 있다.

본 발명의 추가적인 측면은 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 약학 조성물은 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산, 및 바람직하게는 약학적으로 허용된 담체 (vehicle)를 함유한다. 상기 담체는 당업계에 공지 및/또는 사용되는 임의의 담체 또는 임의의 결합제 (binder)일 수 있다. 더욱 상세하게는, 상기 결합제 또는 담체는 본원에 개시된 약제의 제조와 관련되어 설시한 임의의 결합제 또는 담체이다. 추가적인 구현예로서, 상기 약학 조성물은 추가적인 약학 활성 성분을 포함하는 것이다.

약제 및 약학 조성물의 제조는 본원 개시 내용으로 보아 당업계에 종사하는 자에게 널리 알려진 것일 것이다. 전형적으로, 상기 조성물은 액제 또는 현탁제와 같은 주사가능 형태; 주사 전에 현탁제 또는 액제 내의 용액을 위해 적절한 고형 형태; 경구투여를 위한 정제 또는 기타 고형물; 시간 방출형 캡슐제; 또는 안약, 크림, 로션, 연고, 흡입제 등을 포함하는 현재 통상적으로 사용되는 형태로 제조될 수 있다. 외과의사, 내과의사 또는 보건직이 수술 분야 내에서 특정 부위를 치료하기 위해 사용하는, 예를 들어 염수-기초 세척제 (saline-based washes)와 같은 멸균된 제형의 사용도 특히 유용할 수 있다. 조성물은 또한 마이크로장치 (microdevice), 미세입자 (microparticle) 또는 스폰지를 통해 운반될 수도 있다.

제형에 있어서, 약제는 용량 제형과 양립될 수 있는 방법으로 투여될 수 있으며, 상기 함량은 약학적으로 효과적인 것이다. 상기 제형은 상술한 주사제 형태와 같은, 다양한 투여용량 형태로 용이하게 투여될 수 있으나 약물 방출형 캡슐 및 그 유사체도 또한 사용될 수 있다.

본원에서, 투여되는 활성 성분의 양 및 조성물의 부피는 치료할 개인 또는 객체 대상에 의존한다. 투여에 요구되는 활성 화합물의 특정한 함량은 치료자의 판단에 의존되며, 개개인마다 고유하다.

활성 화합물을 분산하기 위해 요구되는 약제의 최소 부피가 전형적으로 이용된다. 투여를 위한 적절한 용법 또한 다양하지만, 화합물을 일차적으로 투여함으로써 정형화되고 그 결과를 모니터하여 추가적인 간격으로 추가적으로 조절된 용량으로 투여가능하다.

예를 들어, 정제 또는 캡슐 (예를 들어, 젤라틴 캡슐) 형태의 경구투여를 위해, 상기 활성 약물 조성, 즉, 본 발명의 핵산 분자 및/ 또는 본원에서 일명, 치료제 (therapeutic agent) 또는 활성 화합물 (active compounds)로 지칭되는 임의의 추가적인 약학적 활성 작용제는 에탄올, 글리세롤, 물 및 그 유사체와 같은 경구, 비독성의 약학적으로 허용가능한 불활성 운반체 (inert carrier)와 조합될 수 있다. 게다가, 요구되거나 또는 필요시에, 적당한 결합제 (binder), 윤활제 (lu bricant), 붕해제 (disintegrating agents), 및 착색제 (coloring agents)를 또한 상기 혼합물 내로 혼입시킬 수 있다. 적당한 결합제로는 전분, 마그네슘 알루미늄 실리케이트(magnesium aluminium silicate), 전분 반죽(starch paste), 젤라틴, 메틸셀룰로오스 (methylcellulose), 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 및/또는 폴리비닐피롤리딘, 포도당 또는 베타-락토스 (beta-lactose)와 같은 천연 당류, 옥수수 감미제, 아카시아, 트라가칸트 (tragacanth) 또는 알긴산 나트륨 (sodium alginate)와 같은 천연 및 합성 껌, 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol), 왁스 등을 포함한다. 이러한 투여 형태에서 사용되는 윤활제로는 나트륨 올레산염 (sodium oleate), 나트륨 스테아르산염 (sodium stearate), 마그네슘 스테아르산염 (magnesium stearate), 나트륨 안식향산염 (sodium benzoate), 나트륨 아세테이트 (sodium acetate), 염화 나트륨 (sodium chloride), 실리카 (silica), 활석 (talcum), 스테아르산 (stearic acid), 이의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol) 등을 포함한다. 붕해제로는 제한 없이, 전분, 메틸 셀루로스, 아가 (agar), 벤토나이트, 잔탄 껌 전분 (xanthan gum starches), 아가, 알긴산 (alginic acid) 또는 이의 나트륨염, 또는 비등성 혼합물 등을 포함한다. 희석제로는, 예를 들면, 유당, 덱스토로스(dextrose), 수크로스 (sucrose), 만니톨, 소르비톨, 셀룰로스 및/ 또는 글리신(glycine)을 포함한다.

본 발명의 약제는 이와 같은 지효성 및 서방성 정제 또는 캡슐, 환약, 분말, 과립제, 엘렉시르 (elixirs), 팅크제 (tinctures), 현탁제, 시럽제 및 유화액제(emulsion)와 같은 경구 투여 형태로 투여될 수도 있다. 좌약 (suppositories)은 지방성 유화액제 또는 현탁액제에서 유리하게 제조된다.

상기 약학조성물 또는 약제는 살균될 수 있거나 또는 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제와 같은 보조제, 용액 촉진제, 삼투압 조절용 염 및/또는 완충액을 함유할 수 있다. 추가적으로, 그들은 또한 기타 치료적으로 유용한 성분들을 함유할 수 있다. 상기 조성물은 통상적 혼합법, 과립화법, 또는 코팅법에 따라 전형적으로 활성 성분의 약 0.1% 내지 75%, 바람직하게는 1% 내지 50%을 함유하여 제조된다.

액제, 특히 주사용 조성물은, 예를 들어, 용해, 분산 등에 의해 제조될 수 있다. 상기 활성 화합물은 약학적으로 순수한 용매, 예를 들어, 물, 식염수, 수용성 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등에 용해되거나 혼합될 수 있으며, 이로써 주사용 용액 또는 현탁액을 생성한다. 추가적으로, 주사 전 액체 용해에 적절한 고형 형태는 제조될 수 있다.

고형 조성물을 위해서, 부형제(excipients)는 약제 등급의 만니톨, 유당, 전분, 마그네슘 스테아르산염, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로스, 포도당, 자당, 마그네슘 탄산염 등을 포함한다. 상기에서 정의된 활성 화합물(active compounds)은 좌약, 예를 들어 운반체로서, 예를 들어 프로필렌 글리콜 (propylene glycol)과 같은 폴리알킬렌 글리콜 (polyalkylene glycols)을 사용하여 제조될 수 있다. 몇몇 구현예로서, 좌약은 지방성 유화제 또는 현탁액에서 유리하게 제조된다.

본 발명의 약제 및 핵산 분자는, 각각 예를 들어 소형 단층 소포 (small unilamellar vesicles), 대형 단층 소포 (large unilamellar vesicles) 및 다층 소포 (multilamellar vesicles)과 같은 리포좀 전달 시스템 (liposome delivery system)의 형태로 투여될 수 있다. 리포좀 (liposome)은 콜레스테롤, 스테아릴아민 (stearylamine) 또는 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholines)을 포함하는 다양한 인지질 (phospholipids)로부터 형성될 수 있다. 몇몇 구현예로서, 당업계에 널리 알려진 바와 같이, 지질 성분의 필름이 약물의 수용액으로 수화되어 약물을 캡슐화한 지질층을 제조할 수 있다. 예를 들면, 본원에서 상술하고 있는 핵산 분자는 당업계에 널리 알려진 제조방법을 이용하여 구성되는, 친유성 화합물 또는 비-면역성(non-immuogenic), 고분자량 화합물로 복합체 (complex) 형태로 제공될 수 있다. 추가적으로, 리포좀은 세포 독성을 내부적으로 매개하는 세포독성제(cytotoxic agent)를 목표 또는 운반하기 위하여 그 표면상에 상기 핵산 분자를 함유할 수 있다. 핵산 수반 복합체의 예는 미국 특허 번호 제 6,011,020호에서 제공된다.

본 발명의 약제 및 핵산 분자는, 각각 표적 가능한 약물 운반체로서 가용성 중합체와 결합될 수 있다. 상기 중합체로는 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrol idone), 피란 공중합체 (pyran copolymer), 폴리히드록시프로필-메트아크릴아미드-페놀 (polyhydroxypropyl-methacrylamide-phenol), 폴리히드록시에틸아스판아미드페놀 (polyhydroxyethylaspanamidephenol), 또는 팔미토일 잔기 (palmitoyl resi due)로 치환된 폴리에틸렌옥시드폴리리신 (polyethylene oxide polylysine)을 포함할 수 있다. 게다가, 본 발명의 약제 및 핵산 분자는, 각각 약물 방물 조절에 유용한 생분해성 중합체 (biodegradable polymer)류, 예를 들어, 폴리락트 산 (poly lactic acid), 폴리엡실론 카프로 락톤 (polyepsilon capro lactone), 폴리히드록시 부티르산 (polyhydroxy butyric acid), 폴리오로토에스테르 (polyorthoesters), 폴리아세탈 (polyacetals), 폴리히드로피란 (polydihy dropyrans), 폴리시아노아크릴레이트 (polycyanoacrylates) 및 가교화 또는 양친매성 하이드로젤 블록 공중합체(block copolymer)와 결합 될 수 있다.

요구된다면, 상기 투여될 약학조성물 및 약제는, 각각 습윤제 또는 유화제, pH 완충제와 같은 미량의 무독성 보조 물질 (non-toxic auxiliary substance) 및 나트륨 아세테이트 (sodium acetate) 및 트리에탄올아민 올레이트 (triethanola mine oleate)와 같은 기타 물질을 미량 포함할 수 있다.

본 발명의 핵산 분자 및 약제, 각각을 이용하는 용량 처방 (dosage regimen)은 환자의 유형, 종, 나이, 무게, 성 및 건강 상태; 치료될 상태 정도; 투여 경로; 환자의 신장 및 간 기능; 및 적용되는 특정 압타머 및 이들의 염을 포함한 다양한 요인에 따라 선정된다. 당업계에 숙련된 의사 또는 수의사는 병적 상태의 진행을 저해, 대항 또는 저지하기 위해 요구되는 약물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.

본 발명에 따른 핵산의 효과적인 혈장 수준은 본원에 개시된 모든 질병의 치료에 있어서 바람직하게는 500 fM 내지 500 ㎛의 범위이다.

본 발명의 핵산 분자 및 약제, 각각은 바람직하게는 매일, 매 둘째 또는 셋째 날, 매주, 매 둘째 주당 단회 투여용법, 또는 매달 또는 매 셋째 달 단일 투여용법으로 투여될 수 있다.

본원에서 개시된 약제가 본원에 개시된 약학조성물을 구성한다는 것도 본 발명의 범위 내이다.

본 발명의 추가적인 측면으로서, 본 발명은 본 발명에 따른 약학적 유효량의 하나 이상의 핵산을 치료가 요구되는 객체에 투여함을 포함하는, 치료 방법에 관한 것이다. 하나의 구현예로서, 상기 객체는 질병으로부터 고통받거나 이와 같은 질병으로 진행될 위험성이 있으며, 여기에서 상기 질병은 본원에서 개시된 임의의 질병, 특히 약제 제조를 위한 본 발명에 따른 임의의 핵산의 사용과 연관된 임의의 질병이다.

본 발명에 따른 길항제 뿐만 아니라 핵산이 약제로서 또는 약제 제조를 위해 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 미용상 목적, 특히 염증성 국부 피부손상 (inflamed regional skin lesion)에서의 MCP-1의 전개와 관련된 목적으로 이용될 수 있음도 이해되어야 한다. 그러므로, 치료 또는 예방을 위한 본 발명에 따른 핵산, 약제 및/또는 약학조성물이 사용될 수 있는 추가적인 병적상태 (conditions) 또는 질병 (disease)은 염증성 국부 피부손상이다.

본원에서 바람직하게 사용된 바와 같이, 진단용 (diagnostic) 또는 진단제 (diagnostic agent) 또는 진단 수단 (diagnostic means)은 직접적 또는 간접적으로 MCP-1, 바람직하게는 본원에 서술된 바와 같은 MCP-1, 보다 바람직하게는 본원에 서술된 다양한 장애 (disorder) 및 질병과 연관된 MCP-1을 검출하기에 적절하다. 그러나, 본 발명에 따른 핵산 분자들이 임의의, 어떤 또는 모든 MCP-2, MCP-3, MCP-4 및 에오탁신과 결합하는 범위까지, 상기 핵산 분자는 개개 질병 및 장애의 진단을 위해 사용될 수 있으며, 상기 병원성 기전은 MCP-2, MCP-3, MCP-4 및/ 또는 에오탁신과의 과발현 또는 과활성으로 직접 또는 간접적으로 연계 또는 수반된다.

상기 진단은 본원에 개시된 각각 임의의 장애 및 질병의 검출 (detection) 및/ 또는 추적조사 (follow-up)를 위해 적절한 것이다. 상기 검출은 본 발명의 핵산과 MCP-1의 결합을 통해 가능하다. 상기 결합은 직접적 또는 간접적으로 검출될 수 있다.

각각의 방법 및 수단을 당업자에게 잘 알려져 있다. 다른 이들 중에서, 본 발명에 따른 핵산은, 본 발명에 따른 핵산, 바람직하게는 MCP-1와 결합한 핵산의 검출을 허용하는 표지 (label)를 포함한다. 상기 표지는 바람직하게는, 방사성 (radioactive), 효소 (enzymatic) 및 형광성 (fluorescent) 표지법을 포함하는 군으로부터 선택된다. 원칙적으로, 항체를 위해 개발된 알려진 모든 측정법은 본 발명에 따른 핵산을 위해 채택될 수 있는 반면에, 목표-결합 항체 (target-binding antibody)는 목표-결합 핵산으로 치환된다. 비-표지 목표-결합 항체를 이용한 항체-어세이법 (antibody-assay)에서, 상기 검출은 바람직하게는, 방사성, 효소 및 형광성 표지로 변형된 2차 항체에 수행되며, 그 Fc 단편 (fragment)에 상기 목표-결합 항체가 결합 된다. 핵산, 바람직하게는 본 발명에 따른 핵산의 경우에 있어서, 상기 핵산은 이러한 표지법에 의해 변형되며, 여기에서, 바람직하게 상기 표지는 비오틴(biotin), Cy-3 및 Cy-5을 포함하는 군으로부터 선택되는 것이며, 상기 표지는 이러한 표지에 반하는 항체, 예를 들어, 항-비오틴 항체 (anti-biotin antibody), 항-Cy3 항체 또는 항-Cy5 항체 또는 - 표지가 비오틴인 경우에 있어서는- 상기 표지는 비오틴과 자연적으로 결합하는 스트렙타비딘 (streptavidin) 또는 아비딘 (avidin)에 의해 검출된다. 상기 항체, 스트렙타비딘 또는 아비딘은 차례로, 바람직하게는 개개 표지, 예를 들어 방사성, 효소 또는 형광성 표지 (2차 항체와 같은)와 함께 변형되는 것이다.

본 발명의 추가적인 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 2차 검출 수단에 의해 검출 또는 분석되며, 여기에서 상기 검출은 분자 비콘 (molecular beacon)이다. 분자 비콘의 방법론은 당업자에게 널리 알려져 있다. 간단하게, 분자 비콘으로도 불리는 핵산 탐침 (nucleic acid probes)들은 검출될 핵산 시료와 역 상보적 (reverse complement)이며, 검출될 핵산 시료의 일부와 역 상보적이기에 혼성화된다. 핵산 시료와 결합함으로써 상기 분자 비콘의 형광성 기 (fluorophoric group)가 분리되며 이로 인해 형광 신호의 변화, 바람직하게는 강도의 변화를 초래한다. 이와 같은 변화는 잔존하는 핵산 시료 함량과 상호 관련되어 있다.

본 발명에 따른 핵산을 이용한 MCP-1의 검출은 특히, 본원에서 정의되는 바와 같은 MCP-1의 검출을 허용할 것이라고 인지될 것이다.

MCP-1의 검출과 관련하여, 바람직한 방법은 하기 단계들을 포함한다:

(a) MCP-1의 존재를 시험할 시료를 제공하는 단계,

(b) 본 발명에 따른 핵산을 제공하는 단계,

(c) 핵산과 시료를, 바람직하게는 반응용기 내에서 반응시키는 단계,

상기 단계 (a)는 단계 (b) 이전에 수행, 또는 단계 (b)는 단계 (a) 이전에 수행될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예로서, 핵산과 시료간의 반응을 검출하는 단계로 구성되는 추가적인 단계 (d)가 제공된다. 바람직하게는, 단계 (b)의 상기 핵산은 표면에 고정화된다. 상기 표면은 반응 튜브 (reaction tube), 플레이트의 웰, 또는 예를 들어 비드 (bead)와 같은 이러한 반응 용기 내에 포함된 장치 표면일 수 있다. 상기 표면에 대한 상기 핵산의 고정화는 당업자에게 잘 알려진 임의의 수단, 이네 한정되지는 않으나 비공유 또는 공유 결합으로도 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 결합 (linkage)은 상기 표면과 상기 핵산 간의 공유 화합결합을 통해 성립된다. 그러나 상기 핵산이 표면에 간접적으로 고정화되는 것, 여기에서 상기 간접적 고정화는 추가적인 구성성분 (further component) 또는 상호작용 파트너 (interaction partner)의 쌍의 사용과 관련됨도 또한 본 발명의 범위 내이다. 상기의 추가적인 구성성분은, 바람직하게 상호작용 파트너로도 불리는 고정화될 핵산과 특이적으로 상호작용하여, 표면에 핵산 부착을 매개하는 화합물이다. 상기 상호작용 파트너는 바람직하게는 핵산, 폴리펩티드 (polypeptide), 단백질 및 항체를 포함하는 군으로부터 선택된다. 바람직하게 상호작용 파트너는 항체, 보다 바람직하게는 단일 클론 항체 (monoclonal antibody)이다. 호환적으로, 상기 상호작용 파트너는 핵산, 바람직하게는 기능성 핵산(functional nucleic acid)이다. 보다 바람직하게는, 상기 기능성 핵산은 압타머 (aptamer), 스피에겔머 (spiegelmer) 및 핵산에 최소한 부분적으로 상보적인 핵산을 포함하는 군으로부터 선택된다. 본 발명의 보다 추가적인 구현예로서, 상기 표면으로의 상기 핵산의 상기 결합은 다중-분산형 상호작용 파트너 (multi-partite interaction partner)에 의해서 중재 된다. 상기 다중-분산형 상호작용 파트너는, 바람직하게는 상호작용 파트너의 쌍 또는 첫 번째 멤버 (member) 및 두 번째 멤버로 구성되는 상호작용 파트너이며, 여기에서 상기 첫 번째 멤버는 상기 핵산에 의해 포함되거나 부착되며, 두 번째 멤버는 상기 표면에 부착되거나 포함되는 것이다. 상기 다중-분산형 상호작용 파트너는 바람직하게는 비오틴 (biotin) 및 아비딘 (avidin), 비오틴 (biotin) 및 스트렙타비딘 (streptavidin), 및 비오틴 (biotin) 및 뉴트라비딘 (neutravidin)을 포함하는 상호작용 파트너의 쌍의 군으로부터 선택된다. 바람직하게는 상기 상호작용 파트너의 쌍의 첫 번째 멤버는 비오틴 (biotin)이다.

상기 방법의 바람직한 결과는 MCP-1 및 상기 핵산의 고정화 복합체 (immobilised complex)의 형성이며, 보다 바람직하게는 상기 복합체는 검출되는 것이다. 상기 복합체로부터 상기 MCP-1이 검출되는 것은 구현예의 범위 내이다.

이러한 요건에 상응하는 각각의 검출 방법은 예를 들어, 상기 MCP-1의 해당/해당(들)에 특이적인 임의의 검출 방법이다. 특히 바람직한 검출 수단은 당업자들에게 있어서 그 제조법이 잘 알려진, 핵산, 폴리펩티드, 단백질 및 항체를 포함하는 군으로부터 선택된 검출 수단 (detection means)이다.

MCP-1의 검출을 위한 방법은 또한 시료를 단계 (c)를 수행하는데 바람직하게 사용되는 반응 용기로부터 제거하는 단계를 포함한다.

상기 방법은 본 발명의 추가적인 구현예로서, 표면상, 바람직하게는 상기에서 정의된 표면상에서 MCP-1의 상호작용 파트너를 고정화하는 단계를 또한 포함하는 것이며, 여기에서 상기 상호작용 파트너는 본원에서 정의되며, 바람직하게는 각각 방법과 관련하여 상기와 같은, 보다 바람직하게는 그 다양한 구현예에서 핵산, 폴리펩티드, 단백질 및 항체를 포함하는 것이다. 이 구현예로서, 특히 바람직한 검출 수단은 본 발명에 따른 핵산이며, 여기에서 상기 핵산은 표지되거나 또는 표지되지 않은 것이다. 상기 핵산이 표지된 경우에는, 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 상기 검출은 또한 핵산, 폴리펩티드, 단백질 및 본원에 개시된 다양한 구현예에서의 구현예를 포함하는 군으로부터 선택된 이차 검출 수단 (second detection means)의 사용도 관여될 수 있다. 상기 검출 수단은 바람직하게는 본 발명에 따른 핵산에 특이적이다. 보다 바람직한 구현예로서 상기 이차 검출 수단 (second detection means)은 분자 비콘 (molecular beacon)이다. 상기 핵산 또는 상기 이차 검출 수단 중 어느 하나 또는 이들 모두는 바람직한 구현예로서 검출용 표지 (detection label)를 포함하는 것이다. 상기 검출용 표지는 바람직하게는 비오틴, 브로모-디속시우리딘 표지 (bromo-desoxyuridine label), 디곡시게닌 표지 (digoxigenin label), 형광 표지 (fluorescence label), UV-표지 (UV-label), 방사성-표지 (radio-label) 및 킬레이트제 분자 (chelator molecule)를 포함하는 군으로부터 선택됨이 바람직하다. 호환적으로, 상기 이차 검출 수단은 바람직하게는 상기 핵산이 함유 (contained), 포함 (comprised) 또는 부착 (attached)되어 있는 검출용 표지 (detection label)와 상호작용하는 것이다. 특히 바람직한 조합은 하기와 같다:

상기 검출용 표지는 비오틴이고 이차 검출 수단은 비오틴에 직접적으로 대항하는 항체이거나 또는 여기에서,

상기 검출용 표지는 비오틴이고 이차 검출 수단은 아비딘 (avidin) 또는 아비딘 운반 분자 (avidin carrying molecule)이거나 또는 여기에서,

상기 검출용 표지는 비오틴이고 이차 검출 수단은 스트렙타비딘 (strep tavidin) 또는 스트렙타비딘 운반 분자 (streptavidin carrying molecule)이거나 또는 여기에서,

상기 검출용 표지는 비오틴이고 이차 검출 수단은 뉴트라비딘 (neutravidin) 또는 뉴트라비딘 운반 분자 (neutravidin carrying molecule)이거나 또는 여기에서,

상기 검출용 표지는 브로모-디속시우리딘 (bromo-desoxyuridine)이고 이차 검출 수단은 브로모-디속시유리딘 (bromo-desoxyuridine)에 직접적으로 대항하는 항체이거나 또는 여기에서,

상기 검출용 표지는 디곡시게닌 (digoxigenin)이고 이차 검출 수단은 디곡시게닌 (digoxigenin)에 직접적으로 대항하는 항체이거나 또는 여기에서,

상기 검출용 표지는 킬레이트제 (chelator)이고 이차 검출 수단은 방사성 핵종 (radio-nuclide)이며, 여기에서, 바람직하게는 상기 검출용 표지는 상기 핵산에 부착되는 것이다. 이와 같은 조합 (combination)의 종류는 상기 표지에 상기 핵산이 부착되는 구현예에서도 적용가능하다는 것으로 이해되어야 할 것이다. 이와 같은 구현예로서, 상기 검출용 표지는 상기 상호작용 파트너 (interaction partner)에 부착되는 것이 바람직하다.

마지막으로, 상기 이차 검출 수단은 3차 검출 수단 (third detection means), 바람직하게는 3차 검출 수단은 효소이며, 보다 바람직하게는 이차 검출 수단의 검출에서 효소 반응을 나타내는 3차 검출 수단을 이용하여 검출되거나, 또는 상기 3차 검출 수단은 방사능 검출용 수단, 보다 바람직하게는 방사성 핵종 (radio-nuclide)에 의해 방출되는 방사능을 이용한 방사능 검출용 수단을 이용하여 검출함도 또한 본 발명의 범위 내이다. 바람직하게는, 3차 검출 수단은 2차 검출 수단을 특이적으로 검출 및/ 또는 상호작용하는 것이다.

또한 본 발명의 하나의 구현예로서, 표면상에 고정화되는 MCP-1의 상호작용 파트너 (interaction partner) 및 본 발명에 따른 핵산을, 바람직하게는 MCP-1와 상호작용 파트너 (interaction partner) 간에 형성된 상기 복합체에 첨가하는 것이며, 상기 시료는 반응으로부터, 보다 바람직하게는 단계 (c) 및/또는 단계 (d)가 수행되는 반응 용기 (reaction vessel)로부터 제거될 수 있다.

본 발명의 하나의 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산은 형광성 기 (fluorescence moiety)를 포함하며, 상기 형광성 기 (fluorescence moiety)의 형광은 상기 핵산과 MCP-1 및 유리형 MCP-1 간의 복합체 형성면에서 상이하다.

본 발명의 추가적인 구현예로서, 상기 핵산은 본 발명에 따른 핵산 유도체(derivative)이며, 여기에서 상기 핵산 유도체는 아데노신 (adenosine)을 대체하는 하나 이상의 형광성 유도체 (fluorescent derivative)를 포함한다. 바람직한 구현예로서, 상기 아데노신의 형광성 유도체는 에테노아데노신 (ethenoadenosine)이다.

본 발명의 추가적인 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산 유도체 및 상기 MCP-1으로 구성되는 복합체를 형광도 (fluoreacence)를 이용하여 검출하는 것이다.

상기 방법의 구현예로서, 신호 (signal)는 단계 (c) 또는 단계 (d)에서 발생되며, 상기 신호는 바람직하게는 시료 내의 MCP-1의 농도와 상호관련성을 갖는 것이다.

본 발명의 바람직한 측면으로서, 상기 어세이법 (assay)은 96웰 플레이트에서 수행될 수 있으며, 그 구성성분들이 상술된 바와 같은 반응 용기 내에서 고정화되며 상기 웰들은 반응 용기 역할을 하는 것이다.

당업자에게 있어 상술한 것은 또한 MCP-2, MCP-3, MCP-4 및/ 또는 에오탁신에, 최소한 본 발명에 따른 핵산들이 또한 MCP-2, MCP-3, MCP-4 및/ 또는 에오탁신에 또는 이들과 또한 결합하는 정도까지 적용되는 것은 당업자에게 이해될 것이다.

본원에서 개시된 바와 같이, 시료중 MCP-1을 검출하기 위한 방법은 본원에서 보다 상세하게 개시한 바와 같이, 만성 질환 및 만성 장애와 같은 질병의 진단을 위한 방법으로서 적용될 수도 있음도 본 발명의 범위 내이다.

상기 발명적 핵산은 나아가 신약 설계 (drug design)를 위한 출발 물질 (starting material)로서 사용될 수 있다. 기본적으로 두 가지 가능한 접근 방법이 있다. 그 하나는 화합물 라이브러리 스크리닝법 (screening of compound libraries)으로서, 저분자량 화합물 라이브러리가 바람직하다. 본 발명의 구현예로서 상기 스크리닝법은 고 처리량 스크리닝법 (high throughput screening)이다. 바람직하게 고 처리량 스크리닝법은 목표 기초 어세이법으로서 화합물의 신속하며, 효율적인 시행-및-착오 평가법 (trial-and-error evaluation)이다. 가장 바람직하게는 상기 분석법은 변색 분석법 (colorimetric measurement)에 의해 수행되는 것이다. 이와 관련하여 사용된 라이브러리는 당업계에 잘 알려져 있다.

선택적으로, 본 발명에 따른 상기 핵산은 이론적 신약 설계법 (rational design of drugs)에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 이론적 신약 설계법은 약학적 선두 구조 (pharmaceutical lead structure)의 설계이다. X선 결정학 (Xray crystallography) 또는 핵자기공명분광법 (nuclear magnetic resonance spectro scopy)의 전형적인 방법으로 동정 되는 목표물질의 삼차원 구조로부터 시작하여, 컴퓨터 프로그램들이 다수의 상이한 화학구조를 담고 있는 데이터베이스를 통한 검색에 이용된다. 컴퓨터를 통해 선별이 이뤄지며, 동정된 화합물들은 실험실에서 연속적으로 시험 될 수가 있다.

상기 이론적 신약 설계법은 본 발명에 따른 임의의 핵산으로부터 시작될 수 있으며, 화학구조, 바람직하게는 본 발명 핵산 구조와 유사하거나 또는 발명적 핵산 구조의 결합 매개 부위와 동일한 삼차원 구조로 전개된다. 어떠한 경우라도, 그러한 구조는 발명적 핵산과 동일 내지 유사한 결합 특성을 나타낸다. 상기 이론적 신약 설계법상의 추가적 단계 또는 대체 단계의 일환으로서, 신경전달물질에 결합하는 핵산의 일부 결합부위의 바람직한 삼차원 구조는 뉴클레오티드 및 핵산들과는 상이한 화학물질군에 의하여 모방 설계된다. 이러한 모방 설계법에 의해, 상기 핵산과 상이한 화합물이 설계될 수 있다. 상기 화합물들은 바람직하게는 저분자 물질 또는 펩티드이다.

화합물 라이브러리 스크리닝법의 경우에, 당업자에게 알려진 경쟁적 어세이법을 사용하여, 적절한 MCP-1 유사체, MCP-1 효현제 또는 MCP-1 길항제 등의 화합물들이 발견될 수 있다. 상기 경쟁적 어세이법은 하기와 같이 수행될 수 있다. 본 발명의 발명적 핵산, 바람직하게는 L핵산에 결합하는 목표물질인 스피에겔머 (spiegelmer)는 고체상 (solid phase)에 결합 된다. MCP-1 유사체를 동정하기 위하여 표지된 MCP-1을 어세이법에 추가가능하다. 잠재적 효능을 갖는 유사체는 스피에겔머와 결합하는 MCP-1 분자와 경쟁하여 각각 표지에 의해 획득되는 신호상의 감소를 수반할 것이다. 효현제 또는 길항제에 대한 스크리닝은 당업계에 공지된 세포 배양 어세이법의 사용과 관련될 수 있다.

본 발명에 따른 키트 (kit)는 적어도 하나 이상의 발명적 핵산을 포함할 수 있다. 추가적으로, 상기 키트는 최소한 하나 또는 그 이상의 양성 또는 음성 대조군을 포함할 수 있다. 양성 대조군으로는 예를 들어, MCP-1, 특히, 발명적 핵산이 바람직하게는 액상 형태에서 선택되거나 결합 되는 것일 수 있다. 음성대조군으로는 예를 들어, MCP-1과 유사한 생물리학적 특성을 가지고 있으나, 발명적 핵산에 의해 인식되지는 않는 펩티드일 수 있다. 게다가, 상기 키트는 하나 또는 그 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 건조, 동결건조 또는 액체에 용해된 형태로 다양한 성분들이 키트에 포함될 수 있다. 상기 키트는 상기 하나 이상의 성분이 번갈아 포함될 수 있는 하나 이상의 컨테이너 (container)를 포함할 수도 있다. 보다 구체적인 구현예로서, 상기 키트는 키트를 사용하는 방법 및 다양한 성분에 관한 사용자 정보를 제공하는 지시내용 또는 지시내용 용지 및 이의 다양한 요소를 포함하는 것이다. 키트의 이러한 종류들이 또한 본원에서 개시된 바와 같은 만성 질병 및 만성 장애의 진단 및 검출을 위한 특히 적합함도 이해되어야 할 것이다.

본 발명에 따르는 핵산의 약학적 및 생물분석적 검출은 인간 및 비인간적인 체내의 다양한 액, 조직 및 기관의 약물동력적 (pharmacokinetic) 및 생물역학적 (biodynamic) 분석도의 평가를 위해 기초가 된다. 이와 같은 목적을 위해, 본원에 개시되거나 당업자에게 알려진 모든 검출 방법은 이용될 수 있다. 본 발명의 추가적인 측면에서는, 본 발명에 따른 핵산의 검출을 위한 샌드위치 혼성화 어세이법 (sandwich hybridisation assay)이 제공된다. 검출 어세이법 내에서, 포획 탐침 (capture probe) 또는 검출 탐침 (detection probe)이 이용된다. 포획 탐침은 본 발명에 따르는 핵산의 첫 번째 부분에 상동성이며, 검출 탐침은 두 번째 부분에 상동성이다. 포획 및 검출 탐침 모두는 DNA 뉴클레오티드, 변형된 DNA 뉴클레오티드, 변형된 RNA 뉴클레오티드, RNA 뉴클레오티드, LNA 뉴클레오티드 및/ 또는 PNA 뉴클레오티드에 의해 형성될 수 있다.

그러므로, 포획 탐침은 본 발명에 따르는 핵산의 5’말단에 상동하는 서열 스트레치를 포함하며, 검출 탐침은 본 발명에 따르는 핵산의 3’-말단에 상동하는 서열 스트레치를 포함한다. 이 경우에 있어서, 포획 탐침은 5’-말단을 통해 표면 또는 매트릭스에 고정화되고, 상기 포획 탐침은 이의 5’-말단에 직접적으로 또는 표면 또는 매트릭스와 5’-말단 사이의 링커 (linker)를 통해 고정화된다. 그러나, 원칙적으로 링커는 포획 탐침의 각 뉴클레오티드에 결합될 수 있다. 상기 링커는 당업계에 공지된 친수성 링커 (hydrophilic linker)로 형성될 수 있으며 또는 D-DNA 뉴클레오티드, 변형된 D-DNA 뉴클레오티드, D-RNA 뉴클레오티드, 변형된 D-RNA 뉴클레오티드, D-LNA 뉴클레오티드, PNA 뉴클레오티드, L-RNA 뉴클레오티드, L-DNA 뉴클레오티드, 변형된 L-RNA 뉴클레오티드, 변형된 L-DNA 뉴클레오티드 및/ 또는 L-LNA 뉴클레오티드에 의해 형성될 수 있다.

선택적으로, 포획 탐침은 본 발명에 따르는 핵산의 3’-말단에 상동적인 서열 스트레치를 포함하며 검출 탐침은 본 발명에 따르는 핵산의 5’-말단에 상동적인 서열 스트레치를 포함한다. 이 경우에 있어서, 포획 탐침은 3’-말단을 통해 표면 또는 매트릭스에 고정화되고, 상기 포획 탐침은 이의 3’-말단에 직접적으로 또는 표면 또는 매트릭스와 3’-말단 사이의 링커 (linker)를 통해 고정화된다. 그러나, 원칙적으로 링커는 포획 탐침의 각 뉴클레오티드에 결합될 수 있다. 상기 링커는 당업계에 공지된 친수성 링커 (hydrophilic linker)로 형성될 수 있으며 또는 D-DNA 뉴클레오티드, 변형된 D-DNA 뉴클레오티드, D-RNA 뉴클레오티드, 변형된 D-RNA 뉴클레오티드, D-LNA 뉴클레오티드, PNA 뉴클레오티드, L-RNA 뉴클레오티드, L-DNA 뉴클레오티드, 변형된 L-RNA 뉴클레오티드, 변형된 L-DNA 뉴클레오티드 및/ 또는 L-LNA 뉴클레오티드에 의해 형성될 수 있다.

본 발명에 따른 핵산에 혼성화 (hybridization)를 할 수 있는 포획 및 검출 탐침의 뉴클레오티드의 숫자는 다양하며, 본 발명 자체에 따르는 포획 및/ 또는 검출 탐침 및/ 또는 핵산의 뉴클레오티드 숫자에 의존할 수 있다. 본 발명에 따르는 핵산에 혼성화하는 포획 및 검출 탐침의 뉴클레오티드의 총체적인 숫자는 본 발명에 따르는 핵산에 의해 포함되는 뉴클레오티드의 숫자의 최대치일 것이다. 검출 및 포획 탐침의 뉴클레오티드의 최소 개수 (2 내지 10 뉴클레오티드)는 본 발명에 따르는 핵산의 5’-말단 또는 3’-말단에 각각 혼성화가 가능하다. 본 발명에 따르는 핵산과 분석되는 샘플 내에 일어나는 다른 핵산 사이의 높은 특이성 및 선택성을 파악하기 위해서는 포획 및 검출 탐침의 뉴클레오티드의 총체적인 개수는 본 발명에 따르는 핵산에 의해 포함되는 뉴클레오티드의 숫자가 최대치 또는 되어야할 것이다.

더군다나, 검출 탐침은 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같이 검출될 수 있는 마커 분자 (marker molecule) 또는 표지를 운반한다. 표지 또는 마커 분자는 원칙적으로 검출 탐침의 각 뉴클레오티드에 결합될 수 있다. 바람직하게는, 상기 표지 또는 마커는 검출 탐침의 5’-말단 또는 3’-말단에 위치하며, 상기 검출 탐침 내의 뉴클레오티드 사이에서 본 발명에 따른 핵산에 상동적이며, 상기 표지 링커는 삽입될 수 있다. 상기 링커는 당업계에 공지된 친수성 링커 (hydrophilic linker)로 형성될 수 있으며 또는 D-DNA 뉴클레오티드, 변형된 D-DNA 뉴클레오티드, D-RNA 뉴클레오티드, 변형된 D-RNA 뉴클레오티드, D-LNA 뉴클레오티드, PNA 뉴클레오티드, L-RNA 뉴클레오티드, L-DNA 뉴클레오티드, 변형된 L-RNA 뉴클레오티드, 변형된 L-DNA 뉴클레오티드 및/ 또는 L-LNA 뉴클레오티드에 의해 형성될 수 있다.

본 발명에 따르는 핵산의 검출방법은 하기와 같이 수행될 수 있다:

본 발명에 따르는 핵산은 포획 탐침에 한쪽 끝과 검출 탐침과는 다른 쪽 끝으로 혼성화한다. 그 이후 결합되는 않은 검출 탐침은 예를 들어, 한번 또는 여러 번의 세척 과정을 통해 제거된다. 바람직하게 표지 또는 마커 분자를 지니는 결합된 검출 탐침의 함량은 예를 들어, 본원에서 참고로 인용되는, WO/2008/052774호에 상세하게 개시된 바와 같이 연속적으로 측정될 수 있다.

본원에 바람직하게 사용된 바와 같이, 정의되는 치료(treatment)는 추가적 또는 선택적 예방 (prevention) 및/ 또는 추적치료 (follow-up)을 포함한다.

본원에 바람직하게 사용된 바와 같이, 역으로 지시되지 않는 한, 정의되는 용어 질환 및 장애는 교환가능한 방법으로 사용될 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 정의되는 용어 “포함하다(comprise)”는 바람직하게는 이와 같은 정의에 의해 따르거나 서술되는 주제를 한정하고자 함이 아니다. 그러나, 호환적인 구현예로서, 정의되는 용어 “포함하다(comprises)”는 함유하다(containing)는 의미로 이해될 것이며, 그러므로 그와 같은 정의로 따르거나 서술되는 주제를 한정되어야 할 것이다.

다양한 서열번호들, 본 발명에 따르는 핵산 분자의 화학적 본질 및 본원에서 사용된 목표 분자 MCP-1, 이들의 실질적인 서열 및 내부적으로 사용하는 참고번호는 하기 표에 요약되어 있다.

서열 번호	RNA /펩티드	서열	내적참조( Internal Reference )
1	L-단백질	QPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKT	인간 MCP-1, huMCP-1, CCL2
2	L-단백질	QPDAVNAPLTCCYSFTSKMIPMSRLESYKRITSSRCPKEAVVFVTKLKREVCADPKKEWVQTYIKNLDRNQMRSEPTTLFKTASALRSSAPLNVKLTRKSEANASTTFSTTTSSTSVGVTSVTVN	마우스 MCP-1, mCCL2, mMCP-1, 설치류 MCP-1 (Mus musculus)
3	L-단백질	QPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQIQTPKP	원숭이 MCP-1 (Macaca mulatta)
4	L-단백질	QPDAINSPVTCCYTLTSKKISMQRLMSYRRVTSSKCPKEAVIFKTIAGKEICAEPKQKWVQDSISHLDKKNQTPKP	돼지 MCP-1 (Sus scrofa)
5	L-단백질	QPDAIISPVTCCYTLTNKKISIQRLASYKRVTSSKCPKEAVIFKTVLNKEICADPKQKWVQDSMAHLDKKSQTQTA	개 MCP-1 (Canis familiaris)
6	L-단백질	QPDAVNSPVTCCYTFTNKTISVKRLMSYRRINSTKCPKEAVIFMTKLAKGICADPKQKWVQDAIANLDKKMQTPKTLTSYSTTQEHTTNLSSTRTPSTTTSL	토끼 MCP-1 (Oryctolagus cuniculus)
7	L-단백질	QPVGINTSTTCCYRFINKKIPKQRLESYRRTTSSHCPREAVIFKTKLDKEICADPTQKWVQDFMKHLDKKTQTPKL	사람 MCP-3, CCL7, huMCP-3
8	L-단백질	GPASVPTTCCFNLANRKIPLQRLESYRRITSGKCPQKAVIFKTKLAKDICADPKKKWVQDSMKYLDQKSPTPKP	인간 에오탁신/CCL11
9	L-단백질	QPDSVSIPITCCFNVINRKIPIQRLESYTRITNIQCPKEAVIFKTKRGKEVCADPKERWVRDSMKHLDQIFQNLKP	인간 MCP-2, CCL8, huMCP-2
10	L-RNA	AGCGUGCCCGGAGUGGCAGGGGGACGCGACCUGCAAUAAUGCACGCU	169-B1trc
11	L-RNA	AGCGUGCCCGGAGUGGCAGGGGGACGCGACCUGCAAUUGCACGCU	169-F3trc
12	L-RNA	AGCGUGCCCGGAGUGGCAGGGGGACGCGACCUGUAAUAAUGCACGCU	169-C1trc

서열 번호	RNA/펩티드	서열	내적참조(Internal Reference)
13	L-RNA	AGCGUGCCCGGUGUGGCAGGGGGACGCGACCUGCAAUAAUGCG CGCU	169-A3trc
14	L-RNA	AGCGUGCCCGGAGUAGCAGGGGGGCGCGACCUGCAAUAAUGCACGCU	169-B2trc
15	L-RNA	AGCGUGCCCGGUGUGGUAGGGGGGCGCGAUCUACAAUUGCACGCU	176-B12trc
16	L-RNA	AGCGUGCCCGGUGUGACAGGGGGGCGCGACCUGCAUUUGCACGCU	176-D9trc
17	L-RNA	AGCGUGCCCGGUGUGGCAGGGGGGCGCGACCUGUAUUUGCACGCU	176-B10trc
18	L-RNA	AGCGUGCCCGGAGUGGCAGGGGGGCGCGACCUGCAAUAAUGCACGCU	169-F2trc
19	L-RNA	AGCGUGCCCGGUGUGGCAGGGGGGCGCGACCUGCAAUUGCACGCU	176-B9trc
20	L-RNA	AGCAUGCCCGGUGUGGCAGGGGGGCGCGACCUGCAUUUGCAUGCU	176-H9trc
21	L-RNA	AGCGUGCCCGGUGUGGUAGGGGGGCGCGACCUACAUUUGCACGCU	176-E10trc
22	L-RNA	AGUGUGCCAGCUGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUUACACACU	176-G9trc
23	L-RNA	AGUGUGCCAGCGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUUACACACU	176-F9trc
24	L-RNA	AGUGUGCGAGCGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUUACAUACU	176-C11trc
25	L-RNA	AGUGUGCCAGCGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUUACAUACU	176-E11trc
26	L-RNA	AGUAUGCCAGCGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUACAUACU	176-D10trc
27	L-RNA	AGUGUGCCAGUGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUUACACACU	176-H10trc
28	L-RNA	AGCGUGCCAGUGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUUACACGCU	176-C9trc
29	L-RNA	ACGCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGCGGCUCUGCGU	180-B1-001

서열 번호	RNA/펩티드	서열	내적참조(Internal Reference)
30	L-RNA	ACGCACCUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCGC	180-A4-002
31	L-RNA	ACGCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCGU	180-D1-002
32	L-RNA	GCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCGU	180-D1-011
33	L-RNA	ACGCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGC	180-D1-012
34	L-RNA	GCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGC	180-D1-018
35	L-RNA	CGCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCGU	180-D1-034
36	L-RNA	CGCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCG	180-D1-035
37	L-RNA	GCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCG	180-D1-036 = NOX-E36
38	L-RNA	GUGCUGCGUAGUGGAAGACUACCUAAUGACAGCCGAAUGCUGGCAGCAC	178-A8
39	L-RNA	GUGCUGCGUAGUGGAAGACUACCUAAUGACAGCCUAAUGCUGGCAGCAC	178-F7
40	L-RNA	GUGCUGCGUAGUGGAAGACUACCUUAUGACAGCCGAAUGCUGGCAGCAC	178-G7
41	L-RNA	GUGCUGCGUAGUGAAAAACUACUGCCAGUGGGUCAGAGCUAGCAGCAC	178-C6
42	L-RNA	GUGCUGCGGAGUUAAAAACUCCCUAAGACAGGCCAGAGCCGGCAGCAC	178-E7
43	L-RNA	GUGCUGCGGAGUUGAAAACUCCCUAAGACAGGCCAGAGCCGGCAGCAC	178-G6
44	L-RNA	GUGCUGCGUAGUGGAAGACUACCUAUGACAGCCUAAUGCUGGCAGCAC	178-A7
45	L-RNA	GUGCUGCGGAGUUAAAAACUCCCUAAGACAGGCUAGAGCCGGCAGCAC	178-C7

서열 번호	RNA/펩티드	서열	내적참조(Internal Reference)
46	L-RNA	GUGCUGCGGCGUGAAAAACGCCCUGCGACUGCCCUUUAUGCAG GCAGCAC	178-E5
47	L-RNA	GUGCUGCGUAGUGAAAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAGCAC	181-F1
48	L-RNA	GUGCUGCGUAGUGAAAGACUACCUGUGACAGCCGAAUGCUGGCAGCAC	181-B2
49	L-RNA	GUACUGCGUAGUUAAAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAGCAC	181-C2
50	L-RNA	GUGCUGCGUAGUUAAAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAGCAC	178-A6
51	L-RNA	GUGCUGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACAGGCUAGAGCCGGCAGCAC	178-D6
52	L-RNA	GUGCUGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACUGGCUAGAGCCGGCAGCAC	178-D5
53	L-RNA	GUGCUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAGCAC	181-A2
54	L-RNA	GGCUGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACUGGCUAGAGCCGGCAGCC	178-D5-020
55	L-RNA	GGCGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACUGGCUAGAGCCGGCGCC	178-D5-027
56	L-RNA	GUGCGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACUGGCUAGAGCCGGCGCAC	178-D5-030
57	L-RNA	GUGCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCGCAC	181-A2-002
58	L-RNA	GUGCCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGGCAC	181-A2-004
59	L-RNA	GUGGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCCAC	181-A2-005
60	L-RNA	GUCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCGAC	181-A2-006
61	L-RNA	UGCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCGCA	181-A2-007
62	L-RNA	GCUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAGC	181-A2-008

서열 번호	RNA/펩티드	서열	내적참조(Internal Reference)
63	L-RNA	GCUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAG C	181-A2-011
64	L-RNA	GGUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCACC	181-A2-012
65	L-RNA	UGGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCCA	181-A2-015
66	L-RNA	GCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCGC	181-A2-016
67	L-RNA	GUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAC	181-A2-017
68	L-RNA	GGGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCCC	181-A2-018
69	L-RNA	GAGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCUC	181-A2-019
70	L-RNA	CGGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCCG	181-A2-020
71	L-RNA	CCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCGG	181-A2-021
72	L-RNA	CAGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCUG	181-A2-022
73	L-RNA	CUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAG	181-A2-023
74	L-RNA	AGCGUGUUAGUGAAGUGGGUGGCAGGUAAAGGACACGCU	184-B8trc
75	L-RNA	AGCGUGGUAGCGGUGUGGGUGGUAGGUAAAGGCCACGCU	184-C6trc
76	L-RNA	AGCGUGAUAGAAGAGCGGGUGGUAGGUAAAGGUCAGGCU	184-H5trc
77	L-RNA	AGCGUGUUAGGUAGGGUGGUAGUAAGUAAAGGACACGCU	184-A7trc
78	L-RNA	AGCGUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGACACGCU	187-A5trc
79	L-RNA	AGCGUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGCACGCU	187-H5trc

서열 번호	RNA/펩티드	서열	내적참조(Internal Reference)
80	L-RNA	CCGCUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGGCGG	174-D4-004
81	L-RNA	GCGCGAGCAGGUGGGUGGUAGAAUGUAAAGACUCGCGUC	166-A4-002
82	L-RNA	CGUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGACACG	187-A5trc-001
83	L-RNA	GUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGACAC	187-A5trc-002
84	L-RNA	CGUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGCACG	187-H5trc-002
85	L-RNA	GUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGCAC	187-H5trc-003
86	L-RNA	UGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGCA	187-H5trc-004
87	L-RNA	GGACGAGAGUGACAAAUGAUAUAACCUCCUGACUAACGCUGCGGGCGACAGG	177-B3
88	L-RNA	GGACCUAUCGCUAAGACAACGCGCAGUCUACGGGACAUUCUCCGCGGACAGG	177-C1
89	L-RNA	GGACAAUUGUUACCCCCGAGAGAGACAAAUGAGACAACCUCCUGAAGACAGG	177-C2
90	L-RNA	GGACGAAAGUGAGAAAUGAUACAACCUCCUGUUGCUGCGAAUCCGGACAGG	177-E3
91	L-RNA	GGACGUAAAAGACGCUACCCGAAAGAAUGUCAGGAGGGUAGACCGACAGG	177-D1
92	L-RNA	GGACUAGAAACUACAAUAGCGGCCAGUUGCACCGCGUUAUCAACGACAGG	177-E1
93	L-RNA	GGACUAGUCAGCCAGUGUGUAUAUCGGACGCGGGUUUAUUUACUGACAGG	177-A1
94	L-RNA	GGACUGUCCGGAGUGUGAAACUCCCCGAGACCGCCAGAAGCGGGGACAGG	177-G3
95	L-RNA	GGACUUCUAUCCAGGUGGGUGGUAGUAUGUAAAGAGAUAGAAGUGACAGG	177-C3
96	L-RNA	GGACGAGAGCGAACAAUGAUAUAACCUCCUGACGGAAAGAGAUCGACAGG	177-A2
97	L-RNA	CCUGUGCUACACGCAGUAAGAAGUGAACGUUCAGUAUGUGUGCACAGG	170-E4trc

서열 번호	RNA/펩티드	서열	내적참조(Internal Reference)
98	L-RNA	CGUGAGCCAGGCACCGAGGGCGUUAACUGGCUGAUUGGACACG ACACG	166-D2trc
99	L-RNA	CGUGAACAUGCAAGCUAAGCGGGGCUGUUGGUUGCUUGGCCCGCCACG	174-A2trc
100	L-RNA	CGUGCAGAGAGAGACCAACCACGUAAAAUCAACCUAAUGGGCCGCACG	174-E2trc
101	L-RNA	CGUGCAGAGAGAGACCAACCACGUAAAAUCAACCUAAUGGGCCGCACG	183-G3trc
102	L-RNA	CGUGAACAUUCAAGCUAAGCGGGGCUGUUGGUUGCUUGGCCCGCCACG	183-B2trc
103	L-RNA	CGUGCCGAGGCGGCGACCAGCGUUACUUAGAGAGGCUUUGGCACCACG	166-B2trc
104	L-RNA	CGUGAUAACAGCCGUCGGUCAAGAAAACAAAGUUCGGGCGGCGCACG	166-G3trc
105	L-RNA	CGUGGGUGGCGCACCGAGGGCGAAAAGCCACCAGUAAAGAUAGACCG	166-D1trc
106	L-RNA	CGUGUGAUCUCCUUUGGGGUGAUUAGCUUAGAGACUUCCCACACG	183-H2trc
107	L-RNA	GCACCUUCGCCUAAUACACGUGCCGGCUAGCUAAUACUCGUCCGC	167-A7trc
108	L-RNA	GCACGACUUGGGCGACCAGUGAUACUUAGAGAGCAAGUCGUCGGC	167-C7trc
109	L-RNA	GCGCGCGCUCAGUAAGAAAUUGAAAGUUCAGAAUGUCGUCGCGC	167-B5trc
110	L-RNA	AGUGUGUGGCAGGCUAAGGAGAUAUUCCGAGACCACGCU	184-D7trc
111	L-RNA	AGUGUGUGGCAGACUAUGGAUAGACUCCGAGACCACGCU	184-D6trc
112	L-RNA	AGCGUGAGGCGACCAGCGGAUUACUUAGAGAGUCACGCU	184-E5trc
113	L-RNA	AGCGUGAAGGGGACCAGCGUUACUUACAGAGUUCACGCU	184-G6trc
114	L-RNA	AGCGUGUGAUGUAUGUAGCACCGUAUCAGAGGACACGCU	184-B7trc
115	L-RNA	AGCGUGAGGCGACCCGUGUUUCGUAGAGAGUCACGCU	184-B6trc

서열 번호	RNA/펩티드	서열	내적참조(Internal Reference)
116	L-RNA	5 ’PEG-GCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCU GCG	NOX-E36-5’PEG
117	L-RNA	GCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCG-3’PEG	NOX-E36-3’PEG
118	L-RNA	GAGAUGGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUUGAUGAAUCCGCGGCCAUUC	188-A3-001
119	L-RNA	GAUGGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUUGAUGAAUCCGCGGCCAUUC	188-A3-004
120	L-RNA	GGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUUGAUGAAUCCGCGGCCAUUC	188-A3-005
121	L-RNA	GGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUUGAUGAAUCCGCGGCCAUU	188-A3-006
122	L-RNA	GGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUUGAUGAAUCCGCGGCCA	188-A3-007 = mNOX-E36
123	L-RNA	GCUGGUUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCACCAGC	189-G7-001
124	L-RNA	CUGGUUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCACCAG	189-G7-002
125	L-RNA	UGGUUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCACCA	189-G7-003
126	L-RNA	GCCGGUUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCACCGGC	189-G7-007
127	L-RNA	GCCGGCUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCGCCGGC	189-G7-008
128	L-RNA	GCGCGUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCCGCGC	189-G7-010
129	L-RNA	GGGCCUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCGGCCC	189-G7-012

서열 번호	RNA/펩티드	서열	내적참조(Internal Reference)
130	D-단백질	비오틴-QPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLASYRRITSSKC PKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKT	비오틴화 인간 dMCP-1
131	D-단백질	비오틴-QPDAVNAPLTCCYSFTSKMIPMSRLESYKRITSSR CPKEAVVFVTKLKREVCADPKKEWVQTYIKNLDRNQMRSEP-Biotin	비오틴화 마우스 dMCP-1
132	D-RNA	AGCGUGCCCGGAGUGGCAGGGGGACGCGACCUGCAAUAAUGCACGCU	169-B1trc
133	D-RNA	AGCGUGCCCGGAGUGGCAGGGGGACGCGACCUGCAAUUGCACGCU	169-F3trc
134	D-RNA	AGCGUGCCCGGAGUGGCAGGGGGACGCGACCUGUAAUAAUGCACGCU	169-C1trc
135	D-RNA	AGCGUGCCCGGUGUGGCAGGGGGACGCGACCUGCAAUAAUGCGCGCU	169-A3trc
136	D-RNA	AGCGUGCCCGGAGUAGCAGGGGGGCGCGACCUGCAAUAAUGCACGCU	169-B2trc
137	D-RNA	AGCGUGCCCGGUGUGGUAGGGGGGCGCGAUCUACAAUUGCACGCU	176-B12trc
138	D-RNA	AGCGUGCCCGGUGUGACAGGGGGGCGCGACCUGCAUUUGCACGCU	176-D9trc
139	D-RNA	AGCGUGCCCGGUGUGGCAGGGGGGCGCGACCUGUAUUUGCACGCU	176-B10trc

서열 번호	RNA/펩티드	서열	내적참조(Internal Reference)
140	D-RNA	AGCGUGCCCGGAGUGGCAGGGGGGCGCGACCUGCAAUAAUGCA CGCU	169-F2trc
141	D-RNA	AGCGUGCCCGGUGUGGCAGGGGGGCGCGACCUGCAAUUGCACGCU	176-B9trc
142	D-RNA	AGCAUGCCCGGUGUGGCAGGGGGGCGCGACCUGCAUUUGCAUGCU	176-H9trc
143	D-RNA	AGCGUGCCCGGUGUGGUAGGGGGGCGCGACCUACAUUUGCACGCU	176-E10trc
144	D-RNA	AGUGUGCCAGCUGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUUACACACU	176-G9trc
145	D-RNA	AGUGUGCCAGCGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUUACACACU	176-F9trc
146	D-RNA	AGUGUGCGAGCGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUUACAUACU	176-C11trc
147	D-RNA	AGUGUGCCAGCGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUUACAUACU	176-E11trc
148	D-RNA	AGUAUGCCAGCGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUACAUACU	176-D10trc
149	D-RNA	AGUGUGCCAGUGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUUACACACU	176-H10trc
150	D-RNA	AGCGUGCCAGUGUGAUGGGGGGGCGCGACCCAUUUUACACGCU	176-C9trc
151	D-RNA	ACGCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGCGGCUCUGCGU	180-B1-001
152	D-RNA	ACGCACCUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCGC	180-A4-002
153	D-RNA	ACGCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCGU	180-D1-002
154	D-RNA	GCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCGU	180-D1-011

서열 번호	RNA/펩티드	서열	내적참조(Internal Reference)
155	D-RNA	ACGCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGC	180-D1-012
156	D-RNA	GCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGC	180-D1-018
157	D-RNA	CGCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCGU	180-D1-034
158	D-RNA	CGCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCG	180-D1-035
159	D-RNA	GCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCG	(D-)180-D1-036, (D-)NOX-E36
160	D-RNA	GUGCUGCGUAGUGGAAGACUACCUAAUGACAGCCGAAUGCUGGCAGCAC	178-A8
161	D-RNA	GUGCUGCGUAGUGGAAGACUACCUAAUGACAGCCUAAUGCUGGCAGCAC	178-F7
162	D-RNA	GUGCUGCGUAGUGGAAGACUACCUUAUGACAGCCGAAUGCUGGCAGCAC	178-G7
163	D-RNA	GUGCUGCGUAGUGAAAAACUACUGCCAGUGGGUCAGAGCUAGCAGCAC	178-C6
164	D-RNA	GUGCUGCGGAGUUAAAAACUCCCUAAGACAGGCCAGAGCCGGCAGCAC	178-E7
165	D-RNA	GUGCUGCGGAGUUGAAAACUCCCUAAGACAGGCCAGAGCCGGCAGCAC	178-G6
166	D-RNA	GUGCUGCGUAGUGGAAGACUACCUAUGACAGCCUAAUGCUGGCAGCAC	178-A7
167	D-RNA	GUGCUGCGGAGUUAAAAACUCCCUAAGACAGGCUAGAGCCGGCAGCAC	178-C7
168	D-RNA	GUGCUGCGGCGUGAAAAACGCCCUGCGACUGCCCUUUAUGCAGGCAGCAC	178-E5
169	D-RNA	GUGCUGCGUAGUGAAAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAGCAC	181-F1
170	D-RNA	GUGCUGCGUAGUGAAAGACUACCUGUGACAGCCGAAUGCUGGCAGCAC	181-B2

서열 번호	RNA/펩티드	서열	내적참조(Internal Reference)
171	D-RNA	GUACUGCGUAGUUAAAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGC AGCAC	181-C2
172	D-RNA	GUGCUGCGUAGUUAAAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAGCAC	178-A6
173	D-RNA	GUGCUGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACAGGCUAGAGCCGGCAGCAC	178-D6
174	D-RNA	GUGCUGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACUGGCUAGAGCCGGCAGCAC	178-D5
175	D-RNA	GUGCUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAGCAC	181-A2
176	D-RNA	GGCUGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACUGGCUAGAGCCGGCAGCC	178-D5-020
177	D-RNA	GGCGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACUGGCUAGAGCCGGCGCC	178-D5-027
178	D-RNA	GUGCGCGUAGUUAAAAACUACCAGCGACUGGCUAGAGCCGGCGCAC	178-D5-030
179	D-RNA	GUGCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCGCAC	181-A2-002
180	D-RNA	GUGCCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGGCAC	181-A2-004
181	D-RNA	GUGGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCCAC	181-A2-005
182	D-RNA	GUCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCGAC	181-A2-006
183	D-RNA	UGCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCGCA	181-A2-007
184	D-RNA	GCUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAGC	181-A2-008
185	D-RNA	GCUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAGC	181-A2-011
186	D-RNA	GGUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCACC	181-A2-012
187	D-RNA	UGGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGC	181-A2-015
188	D-RNA	GCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCGC	181-A2-016

서열 번호	RNA/펩티드	서열	내적참조(Internal Reference)
189	D-RNA	GUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAC	181-A2-017
190	D-RNA	GGGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCCC	181-A2-018
191	D-RNA	GAGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCUC	181-A2-019
192	D-RNA	CGGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCCG	181-A2-020
193	D-RNA	CCGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCGG	181-A2-021
194	D-RNA	CAGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCUG	181-A2-022
195	D-RNA	CUGCGUAGUGAGAAACUACCAACGACUGGCUAGAGCCGGCAG	181-A2-023
196	D-RNA	AGCGUGUUAGUGAAGUGGGUGGCAGGUAAAGGACACGCU	184-B8trc
197	D-RNA	AGCGUGGUAGCGGUGUGGGUGGUAGGUAAAGGCCACGCU	184-C6trc
198	D-RNA	AGCGUGAUAGAAGAGCGGGUGGUAGGUAAAGGUCAGGCU	184-H5trc
199	D-RNA	AGCGUGUUAGGUAGGGUGGUAGUAAGUAAAGGACACGCU	184-A7trc
200	D-RNA	AGCGUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGACACGCU	187-A5trc
201	D-RNA	AGCGUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGCACGCU	187-H5trc
202	D-RNA	CCGCUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGGCGG	174-D4-004
203	D-RNA	GCGCGAGCAGGUGGGUGGUAGAAUGUAAAGACUCGCGUC	166-A4-002
204	D-RNA	CGUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGACACG	187-A5trc-001
205	D-RNA	GUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGACAC	187-A5trc-002
206	D-RNA	CGUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGCACG	187-H5trc-002

서열 번호	RNA/펩티드	서열	내적참조(Internal Reference)
207	D-RNA	GUGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGCAC	187-H5trc-003
208	D-RNA	UGUUAGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAGGGCA	187-H5trc-004
209	D-RNA	GGACGAGAGUGACAAAUGAUAUAACCUCCUGACUAACGCUGCGGGCGACAGG	177-B3
210	D-RNA	GGACCUAUCGCUAAGACAACGCGCAGUCUACGGGACAUUCUCCGCGGACAGG	177-C1
211	D-RNA	GGACAAUUGUUACCCCCGAGAGAGACAAAUGAGACAACCUCCUGAAGACAGG	177-C2
212	D-RNA	GGACGAAAGUGAGAAAUGAUACAACCUCCUGUUGCUGCGAAUCCGGACAGG	177-E3
213	D-RNA	GGACGUAAAAGACGCUACCCGAAAGAAUGUCAGGAGGGUAGACCGACAGG	177-D1
214	D-RNA	GGACUAGAAACUACAAUAGCGGCCAGUUGCACCGCGUUAUCAACGACAGG	177-E1
215	D-RNA	GGACUAGUCAGCCAGUGUGUAUAUCGGACGCGGGUUUAUUUACUGACAGG	177-A1
216	D-RNA	GGACUGUCCGGAGUGUGAAACUCCCCGAGACCGCCAGAAGCGGGGACAGG	177-G3
217	D-RNA	GGACUUCUAUCCAGGUGGGUGGUAGUAUGUAAAGAGAUAGAAGUGACAGG	177-C3
218	D-RNA	GGACGAGAGCGAACAAUGAUAUAACCUCCUGACGGAAAGAGAUCGACAGG	177-A2
219	D-RNA	CCUGUGCUACACGCAGUAAGAAGUGAACGUUCAGUAUGUGUGCACAGG	170-E4trc
220	D-RNA	CGUGAGCCAGGCACCGAGGGCGUUAACUGGCUGAUUGGACACGACACG	166-D2trc
221	D-RNA	CGUGAACAUGCAAGCUAAGCGGGGCUGUUGGUUGCUUGGCCCGCCACG	174-A2trc
222	D-RNA	CGUGCAGAGAGAGACCAACCACGUAAAAUCAACCUAAUGGGCCGCACG	174-E2trc
223	D-RNA	CGUGCAGAGAGAGACCAACCACGUAAAAUCAACCUAAUGGGCCGCACG	183-G3trc

서열 번호	RNA/펩티드	서열	내적참조(Internal Reference)
224	D-RNA	CGUGAACAUUCAAGCUAAGCGGGGCUGUUGGUUGCUUGGCCCGC CACG	183-B2trc
225	D-RNA	CGUGCCGAGGCGGCGACCAGCGUUACUUAGAGAGGCUUUGGCACCACG	166-B2trc
226	D-RNA	CGUGAUAACAGCCGUCGGUCAAGAAAACAAAGUUCGGGCGGCGCACG	166-G3trc
227	D-RNA	CGUGGGUGGCGCACCGAGGGCGAAAAGCCACCAGUAAAGAUAGACCG	166-D1trc
228	D-RNA	CGUGUGAUCUCCUUUGGGGUGAUUAGCUUAGAGACUUCCCACACG	183-H2trc
229	D-RNA	GCACCUUCGCCUAAUACACGUGCCGGCUAGCUAAUACUCGUCCGC	167-A7trc
230	D-RNA	GCACGACUUGGGCGACCAGUGAUACUUAGAGAGCAAGUCGUCGGC	167-C7trc
231	D-RNA	GCGCGCGCUCAGUAAGAAAUUGAAAGUUCAGAAUGUCGUCGCGC	167-B5trc
232	D-RNA	AGUGUGUGGCAGGCUAAGGAGAUAUUCCGAGACCACGCU	184-D7trc
233	D-RNA	AGUGUGUGGCAGACUAUGGAUAGACUCCGAGACCACGCU	184-D6trc
234	D-RNA	AGCGUGAGGCGACCAGCGGAUUACUUAGAGAGUCACGCU	184-E5trc
235	D-RNA	AGCGUGAAGGGGACCAGCGUUACUUACAGAGUUCACGCU	184-G6trc
236	D-RNA	AGCGUGUGAUGUAUGUAGCACCGUAUCAGAGGACACGCU	184-B7trc
237	D-RNA	AGCGUGAGGCGACCCGUGUUUCGUAGAGAGUCACGCU	184-B6trc
238	D-RNA	5’PEG-GCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCG	NOX-E36-5’PEG
239	D-RNA	GCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUCUGCG-3’PEG	NOX-E36-3’PEG

서열 번호	RNA/펩티드	서열	내적참조(Internal Reference)
240	D-RNA	GAGAUGGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUUGAUGA AUCCGCGGCCAUUC	188-A3-001
241	D-RNA	GAUGGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUUGAUGAAUCCGCGGCCAUUC	188-A3-004
242	D-RNA	GGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUUGAUGAAUCCGCGGCCAUUC	188-A3-005
243	D-RNA	GGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUUGAUGAAUCCGCGGCCAUU	188-A3-006
244	D-RNA	GGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUUGAUGAAUCCGCGGCCA	(D-)188-A3-007 = (D-) mNOX-E36
245	D-RNA	GCUGGUUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCACCAGC	189-G7-001
246	D-RNA	CUGGUUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCACCAG	189-G7-002
247	D-RNA	UGGUUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCACCA	189-G7-003
248	D-RNA	GCCGGUUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCACCGGC	189-G7-007
249	D-RNA	GCCGGCUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCGCCGGC	189-G7-008
250	D-RNA	GCGCGUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCCGCGC	189-G7-010
251	D-RNA	GGGCCUACCGAGGGGGCGUCGUUGGAGUUUGGUUGGUUGUCGGCCC	189-G7-012
252	L-단백질	QPDAVNAPLTCCYSFTGKMIPMSRLENYKRITSSRCPKEAVVFVTKLKREICADPNKEWVQKYIRKLDQNQVRSET	래트 MCP-1

서열 번호	RNA/펩티드	서열	내적참조(Internal Reference)
253	L-RNA	5 ’PEG-GGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUUGAUG AAUCCGCGGCCA	mNOX-E36-5’PEG
254	L-RNA	GGCGACAUUGGUUGGGCAUGAGGCGAGGCCCUUUGAUGAAUCCGCGGCCA-3’PEG	mNOX-E36-3’PEG
255	L-RNA	5'-GAGGGACGTGC-(스페이서18)₂-NH4⁺ -3'	NOX-E36 포획 탐침
256	L-RNA	5'- 비오틴-(스페이서18)₂-CGCAGAGCC	NOX-E36 검출 (-ion) 탐침
257	L-단백질	KSMQVPFSRCCFSFAEQEIPLRAILCYRNTSSICSNEGLIFKLKRGKEACALDTVGWVQRHRKMLRHCPSKRK	CCL1/I-309
258	L-단백질	SLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPGVIFLTKRSRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA	CCL3/MIP-1α
259	L-단백질	APMGSDPPTACCFSYTARKLPRNFVVDYYETSSLCSQPAVVFQTKRSKQVCADPSESWVQEYVYDLELN	CCL4/MIP-1β
260	L-단백질	SPYSSDTTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRKNRQVCANPEKKWVREYINSLEMS	CCL5/RANTES
261	L-단백질	FNPQGLAQPDALNVPSTCCFTFSSKKISLQRLKSYVITTSRCPQKAVIFRTKLGKEICADPKEKWVQNYMKHLGRKAHTLKT	CCL13/MCP-4
262	L-단백질	TKTESSSRGPYHPSECCFTYTTYKIPRQRIMDYYETNSQCSKPGIVFITKRGHSVCTNPSDKWVQDYIKDMKEN	CCL14/HCC-1
263	L-단백질	ASVATELRCQCLQTLQGIHPKNIQSVNVKSPGPHCAQTEVIATLKNGRKACLNPASPIVKKIIEKMLNSDKSN	CXCL1/GROα

서열 번호	RNA/펩티드	서열	내적참조(Internal Reference)
264	L-단백질	APLATELRCQCLQTLQGIHLKNIQSVKVKSPGPHCAQTEVIATL KNGQKACLNPASPMVKKIIEKMLKNGKSN	CXCL2/GROβ
265	L-단백질	ASVVTELRCQCLQTLQGIHLKNIQSVNVRSPGPHCAQTEVIATLKNGKKACLNPASPMVQKIIEKILNKGSTN	CXCL3/GROγ
266	L-단백질	EAEEDGDLQCLCVKTTSQVRPRHITSLEVIKAGPHCPTAQLIATLKNGRKICLDLQAPLYKKIIKKLLES	CXCL4/PF4
267	L-단백질	GPAAAVLRELRCVCLQTTQGVHPKMISNLQVFAIGPQCSKVEVVASLKNGKEICLDPEAPFLKKVIQKILDGGNKEN	CXCL5/ENA-78
268	L-단백질	GPVSAVLTELRCTCLRVTLRVNPKTIGKLQVFPAGPQCSKVEVVASLKNGKQVCLDPEAPFLKKVIQKILDSGNKKN	CXCL6/GCP-2
269	L-단백질	SSTKGQTKRNLAKGKEESLDSDLYAELRCMCIKTTSGIHPKNIQSLEVIGKGTHCNQVEVIATLKDGRKICLDPDAPRIKKIVQKKLAGDESAD	CXCL7/NAP-2
270	L-단백질	EGAVLPRSAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS	CXCL8/IL-8
271	L-단백질	TPVVRKGRCSCISTNQGTIHLQSLKDLKQFAPSPSCEKIEIIATLKNGVQTCLNPDSADVKELIKKWEKQVSQKKKQKNGKKHQKKKVLKVRKSQRSRQKKTT	CXCL9/MIG
272	L-단백질	VPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKKKGEKRCLNPESKAIKNLLKAVSKERSKRSP	CXCL10/IP-10

서열 번호	RNA/펩티드	서열	내적참조(Internal Reference)
273	L-단백질	FPMFKRGRCLCIGPGVKAVKVADIEKASIMYPSNNCDKIEVIITL KENKGQRCLNPKSKQARLIIKKVERKNF	CXCL11/I-TAC
274	L-단백질	KPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQVCIDPKLKWIQEYLEKALNKRFKM	CXCL12α/SDF-1α
275	L-단백질	KPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQVCIDPKLKWIQEYLEKALNKRFKM	CXCL12β/SDF-1β
276	L-단백질	QHHGVTKCNITCSKMTSKIPVALLIHYQQNQASCGKRAIILETRQHRLFCADPKEQWVKDAMQHLDRQAAALTRNG	CX₃CL1/Fractalkine
277	L-단백질	VGSEVSDKRTCVSLTTQRLPVSRIKTYTITEGSLRAVIFITKRGLKVCADPQATWVRDVVRSMDRKSNTRNNMIQTKPTGTQQSTNTAVTLTG	XCL1/Lymphotactin
278	L-RNA	5’-비오틴-GCACGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUG GCUCUGCG	비오틴화 NOX -E36
279	L-RNA	5’-UAAGGAAACUCGGUCUGAUGCGGUAGCGCUGUGCAGAGCU	POC
280	L-RNA	5’-PEG-UAAGGAAACUCGGUCUGAUGCGGU AGCGCUGUGCAGAGCU-3’	POC-PEG
281	L-DNA	5'-CCAATGTCGCC-(스페이서18)₂-NH4⁺ -3'	mNOX-E36 포획탐침

서열 번호	RNA/펩티드	서열	내적참조(Internal Reference)
282	L-DNA	5'- 비오틴-(스페이서18)2-CGCAGAGCC	mNOX-E36 검출 (-ion) 탐침
283	L-단백질	QPDAINSPVTCCYTFTGKKISSQRLGSYKRVTSSKCPKEAVIFKTILAKEICADPEQKWVQDAVKQLDKKAQTPKP	말 MCP-1 (Equus caballus)
284	L-단백질	QPDAINSQVACCYTFNSKKISMQRLMNYRRVTSSKCPKEAVIFKTILGKELCADPKQKWVQDSINYLNKKNQTPKP	소 MCP-1 (Bos Taurus)
285	L-단백질	QPDAVNAPLTCCYSFTGKMIPMSRLENYKRITSSRCPKEAVVFVTKLKREICADPNKEWVQKYIRKLDQNQVRSETTVFYKIASTLRTSAPLNVNLTHKSEANASTLFSTTTSSTSVEVTSMTEN	래트 MCP-1 (Rattus norvegicus)
286	L-RNA	5'- ACCGGCGCCUAAGUAGUUUCCCGGAGCGGAGUACGGGUUGGUUACAGCGG-3’PEG	revmNOX-E36-3’-PEG

도 1은 인간 MCP-1에 결합하는데 전체적으로 필수적인 바람직한 구현예인 서열 모티프 (motiff) (“1A 형(Type 1A)”)를 나타내는 인간 MCP-1과 결합하는 관련 RNA 리간드의 서열 배열을 표시한 것이며;
도 2는 인간 MCP-1 및 RNA 리간드 유도체 180-D1-002에 결합하는데 전체적으로 필수적인 바람직한 구현예인 서열 모티프 (“1B 형(Type 1B)”)를 나타내는 인간 MCP-1과 결합하는 관련 RNA 리간드의 서열 배열을 표시한 것이며;
도 3은 인간 MCP-1에 결합하는데 전체적으로 필수적인 바람직한 구현예인 서열 모티프 (“2 형(Type 2)”)를 나타내는 인간 MCP-1과 결합하는 관련 RNA 리간드의 서열 배열을 표시한 것이며;
도 4는 인간 MCP-1에 결합하는데 전체적으로 필수적인 바람직한 구현예인 서열 모티프 (“3 형(Type 3)”)를 나타내는 인간 MCP-1과 결합하는 관련 RNA 리간드의 서열 배열을 표시한 것이며;
도 5는 RNA 리간드 178-D5 및 181-A2 서열 모티프 (“3 형(Type 3)”의 인간 MCP-1 RNA 리간드) 유도체를 나타내며;
도 6은 인간 MCP-1에 결합하는데 전체적으로 필수적인 바람직한 구현예 (기타 서열들)인 서열 모티프 (“4 형(Type 4)”)를 나타내는 인간 MCP-1과 결합하는 관련 RNA 리간드의 서열 배열을 표시한 것이며;
도 7은 MCP-1 결합 서열 모티프인 "1A 형(Type 1A)", "1B 형(Type 1B)", "2 형(Type 2)", "3 형(Type 3)", 또는 "4 형(Type 4)"들과 연관될 수 없는 인간 MCP-1과 결합하는 서로 상이한 RNA 리간드의 서열들을 나타낸 표이며;
도 8은 설치류 MCP-1과 결합하는 RNA 리간드 188-A3-001 및 189-G7-001 유도체의 배열을 나타낸 것이며;.
도 9는 비오틴화 인간 D-MCP-1 과량 농도에 대한 압타머의 결합능으로 표시되는 바와 같이, 상기 비오틴화 인간 D-MCP-1에 대한 압타머 D-NOX-E36의 상온 및 37℃에서의 결합능 분석 결과를 나타낸 것이며;.
도 10는 비오틴화 설치류 D-MCP-1 농도에 대한 압타머의 결합능으로 표시되는 바와 같이, 상기 비오틴화 설치류 D-MCP-1에 대한 압타머 D-mNOX-E36의 37℃에서의 결합능 분석 결과를 나타낸 것이며;
도 11는 인간 MCP-1의 농도에 대한 블랭크 (blank)에 대한 형광도상의 상이성으로 표시된 바와 같이, 약 3 nM의 절반 유효 농도 (EC₅₀)를 나타내는 바와 같은, 인간 MCP-1을 위한 용량 반응적 곡선이 얻어지는 측면에 있어서 THP-1 세포 내에서의 MCP-1-유도성 Ca⁺⁺-분비를 나타내며;
도 12는 NOX-E36의 농도에 대한 대조군에 대한 백분율로 표시된 바와 같이, 다양한 용량의 스피에겔머 NOX-E36으로 37℃에서 전배양한 3 nM의 인간 MCP-1로 세포를 자극하는 단계로 수행되는; 칼슘 분비 어세이 상에서 스피에겔머 NOX-E36의 유효성을 나타낸 것이며;
도 13는 mNOX-E36의 농도에 대한 대조군에 대한 백분율로 표시된 바와 같이, 다양한 용량의 스피에겔머 NOX-E36으로 37℃에서 전배양한 5 nM의 설치류 MCP-1로 세포를 자극하는 단계로 수행되는; 칼슘 분비 어세이 상에서 스피에겔머 mNOX-E36의 유효성을 나타낸 것이며;
도 14는 인간 MCP-1 농도에 대한 대조군에 비하여 X 배 증가로 표시되는 바와 같은, 다양한 MCP-1 농도에 대한 THP-1 세포들의 이동 3시간 후에 MCP-1에 대한 용량-반응 곡선이 얻어지는 측면에서, THP-1 세포들의 인간 MCP-1-유도성 화학주성을 나타낸 것이며;
도 15는 스피에겔머 NOX-E36의 농도에 대한 대조군에 대한 백분율로 표시된 바와 같이, 다양한 용량의 스피에겔머 NOX-E36으로 37℃에서 전배양한 0.5 nM의 인간 MCP-1로 세포가 이동하도록 하는 단계로 수행하는; 화학주성 어세이 상에서 스피에겔머 NOX-E36의 유효성을 나타낸 것이며;
도 16는 스피에겔머 mNOX-E36의 농도에 대한 대조군에 대한 백분율로 표시된 바와 같이, 다양한 용량의 스피에겔머 mNOX-E36으로 37℃에서 전배양한 0.5 nM의 설치류 MCP-1로 세포가 이동하도록 하는 단계로 수행하는; 화학주성 어세이 상에서 스피에겔머 mNOX-E36의 유효성을 나타낸 것이며;
도 17은 시간에 대한 반응(RU)으로 표시되는 바와 같이, 아민 결합 공정으로 파니오니어 F1 센서 칩(Pioneer F1 sensor chip)에 고정화된, 인간 MCP-1에 결합하는 스피에겔머 NOX-E-36의 K_D 치를 의미하는 바이아코어(Biacore) 2000 센서그램 (sensorgram)을 나타낸 것이며;
도 18는 각각 시간에 대한 반응(RU)으로 표시되는 바와 같이, 아민 결합 공정으로 파니오니어 F1 센서 칩(Pioneer F1 sensor chip) 및 CM4 센서 칩에 고정화된, 인간 MCP-계 단백질들 (huMCP-1, huMCP-2, 및 huMCP-3) 및 인간 에오탁신에 결합하는 스피에겔머 NOX-E36의 결합을 의미하는 바이아코어 (Biacore) 2000 센서그램 (sensorgram)을 나타낸 것이며;
도 19는 각각 시간에 대한 반응(RU)으로 표시되는 바와 같이, 서로 상이한 형태의 MCP-1이 아민 결합 공정으로 파니오니어 F1 센서 칩(Pioneer F1 sensor chip) 및 CM4 센서 칩에 고정화되는 데 반하여, 서로 상이한 종들(개 MCP-1, 원숭이 MCP-1, 인간 MCP-1, 돼지 MCP-1, 토끼 MCP-1, 마우스 MCP-1, 및 래트 MCP-1)로부터 유래되는 MCP-1에 대한 스피에겔머 NOX-E 36의 결합을 의미하는 바이아코어(Biacore) 2000 센서그램(sensorgram)을 나타낸 것이며;
도 20은 각각 시간에 대한 반응(RU)으로 표시되는 바와 같이, 아민 결합 공정으로 CM4 센서 칩에 고정화된, 인간 MCP-1에 결합하는 스피에겔머 181-A2-018의 K_D 값을 의미하는 바이아코어(Biacore) 2000 센서그램(sensorgram)을 나타낸 것이며;
도 21은 각각 시간에 대한 반응(RU)으로 표시되는 바와 같이, 아민 결합 공정으로 파니오니어 F1 센서 칩(Pioneer F1 sensor chip) 및 CM4 센서 칩에 고정화된, 인간 MCP-계 단백질들 (huMCP-1, huMCP-2, 및 huMCP-3) 및 인간 에오탁신(eotaxin)에 결합하는 스피에겔머 181-A2-018의 결합을 의미하는 바이아코어(Biacore) 2000 센서그램(sensorgram)을 나타낸 것이며;
도 22는 각각 시간에 대한 반응(RU)으로 표시되는 바와 같이, 서로 상이한 형태의 MCP-1이 아민 결합 공정으로 파니오니어 F1 센서 칩(Pioneer F1 sensor chip) 및 CM4 센서 칩에 고정화되는 데 반하여, 서로 상이한 종들 (개 MCP-1, 원숭이 MCP-1, 인간 MCP-1, 돼지 MCP-1, 토끼 MCP-1, 마우스 MCP-1, 및 래트 MCP-1)로부터 유래되는 MCP-1에 대한 스피에겔머 181-A2-018의 결합을 의미하는 바이아코어(Biacore) 2000 센서그램(sensorgram)을 나타낸 것이며;
도 23은 인간 MCP-2, MCP-3 및 에오탁신 (1-76 위치만)뿐만 아니라 서로 상이한 포유동물 종들로부터 유래된 MCP-1의 클러스털 (Clustal) W 배열을 나타낸 것이며;
도 24는 인간 MCP-2, MCP-3 및 에오탁신 (1-76 위치만)뿐만 아니라 서로 상이한 포유동물 종들로부터 유래된 MCP-1에 대한 NOX-E36 및 181-A2-018의 결합 특이성을 요약한 표이며;
도 25는 비오틴화 NOX-E36이 센서 칩 표면에 고정화되고 다양한 CC 및 CXC 케모카인(Chemokines)의 패널(panel) 결합이 분석되는 비아코아 분석법 (Biacore analysis)으로 측정되는 NOX-E36의 선택성을 요약한 표이며;
도 26은 케모카인들이 CM5 센서 칩 표면에 공유결합적으로 고정화되고, 다양한 농도의 NOX-E36이 주입된 후에 이 NOX-E36의 결합 양상을 비아이밸류에이션 소프트웨어 (BiaEvaluation software)을 이용하여 분석하는 과정을 수행하는, 비아코아 분석법 (Biacore analysis)으로 측정되는 바와 같은, NOX-E36의 케모카인들과의 반응에 대한 역학적 분석 결과를 나타낸 것이며;
도 27은 절반-유효 농도가 약 0.2 nM인 MIP-1α로 자극된 THP-1 세포의 화학 주성 용량-반응 곡선을 나타낸 것이며;
도 28은 NOX-E36으로 인하여 화학 주성이 유도된 MIP-1α의 저해활성을 나타낸 것으로, NOX-E36이 THP-1 세포로 인하여 화학 주성이 유도된 MIP-1α에 아무런 영향을 끼치지 않음을 확인하였으며;
도 29는 NOX-E36-3’-PEG의 농도에 대한 대조군에 대한 백분율로 표시된 바와 같이, 다양한 용량의 스피에겔머 NOX-E 36-3’-PEG로 37℃에서 전배양한 3 nM의 인간 MCP-1로 세포를 자극하는 단계로 수행되는, 칼슘 분비 어세이 상에서 스피에겔머 NOX-E36-3’-PEG의 유효성을 나타낸 것이며;
도 30은 NOX-E 36-3’-PEG의 농도에 대한 대조군에 대한 백분율로 표시된 바와 같이, 다양한 용량의 스피에겔머 NOX-E36-3’-PEG으로 37℃에서 전배양한 0.5 nM의 인간 MCP-1로 세포가 이동하도록 수행하는 단계로 수행되는; 화학주성 어세이 상에서 스피에겔머 NOX-E36-3’-PEG의 유효성을 나타낸 것이며;
도 31은 스피에겔머 NOX-E36-5’-PEG의 농도에 대한 대조군에 대한 백분율로 표시된 바와 같이, 다양한 용량의 스피에겔머 NOX-E36-5’-PEG로 37℃에서 전배양한 3 nM의 인간 MCP-1로 세포를 자극하는 단계로 수행되는, 칼슘 분비 어세이 상에서 스피에겔머 NOX-E 36-5’-PEG의 유효성을 나타낸 것이며;
도 32는 스피에겔머 NOX-E36-5’-PEG의 농도에 대한 대조군(control)에 대한 백분율로 표시된 바와 같이, 다양한 용량의 스피에겔머 NOX-E 36-5’-PEG으로 37℃에서 전배양한 0.5 nM의 인간 MCP-1로 세포가 이동하도록 수행하는 단계로 수행되는; 화학주성 어세이 상에서 스피에겔머 NOX-E 36-5’-PEG의 유효성을 나타낸 것이며;
도 33은 설치류 MCP-1의 농도에 대한 블랭크(blank)에 대한 형광도상의 상이성으로 표시된 바와 같이, 약 5 nM의 절반 유효 농도(EC₅₀)를 나타내는 바와 같은, 설치류 MCP-1을 위한 용량 반응적 커브가 얻어지는 측면에 있어서, THP-1 세포 내에서의 설치류 MCP-1-유도성 Ca⁺⁺-분비를 나타내며;
도 34는 스피에겔머 mNOX-E36-3’-PEG의 농도에 대한 대조군에 대한 백분율로 표시된 바와 같이, 다양한 용량의 스피에겔머 mNOX-E 36-3’-PEG으로 37℃에서 전배양한 3 nM의 설치류 MCP-1로 세포가 자극되도록 수행하는 단계로 수행되는; 칼슘 분비 어세이 상에서 항-설치류 (anti-murine) MCP-1 스피에겔머 mNOX-E36-3’-PEG의 유효성을 나타낸 것이며;
도 35는 설치류 MCP-1 농도에 대한 대조군에 비하여 X 배 증가로 표시되는 바와 같은, 다양한 mMCP-1 농도에 대한 THP-1 세포들의 이동 3시간 후에 mMCP-1에 대한 용량-반응 곡선이 얻어지는 측면에서, THP-1 세포들의 설치류 MCP-1-유도성 화학주성을 나타낸 것이며;
도 36은 항-설치류 스피에겔머 mNOX-E36-3’-PEG의 농도에 대한 대조군(control)에 대한 백분율로 표시된 바와 같이, 다양한 용량의 스피에겔머 mNOX-E36-3’-PEG으로 37℃에서 전배양한 0.5 nM의 설치류 MCP-1로 세포가 이동하도록 하는 단계로 수행하는; 화학주성 어세이 상에서 항-설치류 스피에겔머 mNOX-E36-3’-PEG의 유효성을 나타낸 것이며;
도 37은 각각 시간에 대한 반응(RU)으로 표시되는 바와 같이, 아민 결합 공정으로 파이오니어(Pioneer) F1 센서 칩에 고정화된, 설치류 D-MCP-1에 결합하는 압타머 D-mNOX-E36의 K_D 치를 의미하는 바이아코어(Biacore) 2000 센서그램(sensorgram)을 나타낸 것이며;
도 38은 각각 시간에 대한 반응(RU)으로 표시되는 바와 같이, 아민 결합 공정으로 파이오니어(Pioneer) F1 및 CM4 센서 칩에 서로 상이한 형태의 D-MCP-1이 고정화되는 측면에서, 인간 D-MCP-1 및 설치류 D-MCP-1에 압타머 D-mNOX-E36이 결합함을 의미하는 바이아코어(Biacore) 2000 센서그램(sensorgram)을 나타낸 것이며;
도 39는 지시된 대로 MAC-2 (대식세포) 및 CD3 (T 세포)에 대한 항체, 과옥소산 시프 (Periodic acid Schiff; PAS)로 염색하고; 각 군에서 7-12 마우스에 대표적인 사진인 24-주령 MRL^lpr/lpr 마우스의 신장 조직 단면을 나타낸 것이며 (초기 배율 PAS: x100, PAS 삽입물(inserts): x 400, Mac2: x 400, CD3: x 100);
도 40은 24-주령 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스의 서로 상이한 군에서의 신장 조직 기능 파라미터(parameter) 및 조직학적 관찰 결과를 설명하는 표이며;
도 41은 모든 군으로부터 변화상의 정량결과를 나타낸 것이며(A, 간질부피 지수(interstitial volume index);B, 관상 확장 지수(tubular dilation index); 및 C, 관상 세포 손상 지수 (tubular cell damage index)는 고자장의 백분율로 계산되고 평균± SEM으로 표시된다).
도 42는 카플란-마이어 분석법 (Kaplan-Meier analysis)으로 계산되는 바에 의해, 다양한 처치군의 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스의 생존율을 나타내며;
도 43은 각 군의 RNA 수준이 각 18S rRNA 발현당으로 표시되고, 각 5마리 마우스로 이루어진 각 군으로부터 수집한 총 신장 RNA을 이용하여 실시간 RT-PCR법으로 측정되는 바에 의해, CC-케모카인들, CCL2 및 CCL5에 대한 신장 mRNA 발현을 나타낸 것이며;
도 44는 mNOX-E36-3’PEG 처치에 의한 폐 병리 소견의 감소를 나타낸 것으로; 상기 폐 조직은 24 주령의 모든 군으로부터 준비되고 반정량적으로 측정되었으며; mNOX-E36 및 mNOX-E36-3’PEG의 처치가 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스의 세기관주위성 염증을 감소시키고; 확대 배율 x 100배였으며;
도 45는 항-mCCL2 스피에겔머-처치 마우스(우측 마우스)에서 별로 발생하지 않으나 안면 또는 목 부위 (좌측 마우스)에서 전형적으로 발생하는, 24주령 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스의 피부성 루프스 증상(Cutaneous lupus manifestation)을 나타낸 도이며;
도 46은 24 주령의 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스의 혈청 및 조직학적 소견을 나타낸 것이며;
도 47은 시간적 기능으로서 스피에겔머 mNOX-E36의 혈장 농도로 나타내는, 실험중 혈장 중 PEG화 및 비-PEG화된 항-mCCL2 스피에겔머의 약물동력학적 결과를 나타낸 도이며;
도 48은 24주령 담체 (vehicle)- 또는 mNOX-E36-3’PEG-처치 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스에서의 골수 및 말초 혈관으로의 CCR2에 대한 유세포 분석결과로서; 데이터는 5마리로 구성된 각 군의 골수 또는 말초혈관 내의 CCR2 양성 세포의 평균 백분율± SEM 으로 표시되며;
도 49는 지시한 대로, 서로 다른 시간대에서 ELISA법으로 측정된, PoC-PEG- (백색 바-white bars) 및 mNOX-E36-3’PEG (mNOX-E36-P)-처치된 (흑색 바-black bars) 1K db/db 마우스에서의 혈청 CCL2 수준을 나타낸 것으로서; 데이터는 평균± SEM 으로 표시되며(^*, p<0.05 mNOX-E36-3’PEG (mNOX-E36-P) vs. PoC-PEG임);
도 50은 비처치 또는 POC-PEG 또는 mNOX-E36-3’PEG 처치 db/db 마우스의 사구체 및 간질에서의 Mac-2 및 Ki-67 양성 세포의 침윤 세포수를 나타낸 것이며;
도 51은 6개월령 db/db 마우스에서의 당뇨성 사구체경화증을 나타내며; 서로 다른 군의 마우스들로부터 신장조직 절편을 과옥소산 시프로 염색하고 각 시장 조직 절편으로부터 분리된 15 사구체들을 사구체경화증 진행 정도를 측정하였고; 이미지는 표시된 대로 각각 점수로 구분된 대표적인 사구체들을 보여 주고 확대 배율은 400x 이며; 그래프는 각군 (n= 7-10)의 모든 마우스로부터 얻은 각 점수의 평균 백분율± SEM 으로 표시되며 (^*, p<0.05 mNOX-E36-3’PEG (mNOX-E36-P) vs. PoC-PEG (PoC-P)-처치 1K db/db 마우스에 대하여);
도 52는 6개월령 mNOX-E36-3’PEG (mNOX-E36-P)- 및 PoC-PEG (PoC-P)-처치 1K db/db 마우스에서의 사구체 여과율 (GFR)을 나타내며; 이 GFR은 실험 종료시에 mNOX-E36-3’PEG (mNOX-E36-P)- 및 PoC-PEG (PoC-P)-처치 1K db/db 마우스들의 FITC-인슐린 청소 역학법 (clearance kinetics)으로 측정되었으며;
도 53은 6개월령 db/db 마우스에서의 관상 아트로피 (atrophy) 및 간질 부피를 나타내며; 은-염색 신장조직 절편의 이미지는 각 군으로부터 대표적인 신장을 선택한 것이며 (확대 배율 100x ); 수치는 각 군당 7-10마리 마우스로부터 얻은 각 형태학적 분석의 평균± SEM 으로 표시되며(^*, p<0.05, 2K db/db vs. BKS 자연형 마우스 (wild-type mice)이며; ^#, 0.05 1K vs. 2K db/db 마우스; ^†, p<0.05 mNOX-E36-3’PEG (mNOX-E36-PEG) vs. PoC-PEG (PoC-P)-처치 1K db/db 마우스에 대하여);
도 54는 각 군당 6-10 마리 마우스로 구성된 군으로부터 수집된 총 신장 RNA를 사용하여 실시간 RT-PCR을 이용하여 측정되는 신장 CCL2 mRNA 발현 db/db 마우스를 나타내며; 각 군의 mRNA 수준은 각 18S rRNA 발현 당으로 표시되었으며;
도 55는 면역염색법(immunostaining)으로 측정된 db/db 마우스 신장의 공간 CCL2 발현을 나타내며; 이미지는 지시된 대로 각 군의 6개월령 마우스들로부터 얻은 대표적 신장 절편을 나타낸다(최초 배율, 200x);
도 56-60은 담체(vehicle), revmNOX-E36-3’PEG, mNOX-E36-3’PEG, CYC low, CYC high, CYC low + mNOX-E36-3’PEG 또는 MMF로 MRLlpr/lpr 마우스를 치료한 후에 MRLlpr/lpr 마우스의 낭창성 신염의 마커(marker)를 표시한 도이며, 여기에서 DPLN에 대한 활성 지수 (activity index; 도 56) 및 만성 지수 (chronicity index; 도 57)는 오스틴 등의 문헌(Austin et al. 1984)에 개시된 바대로 PAS 염색 신장 단편에서 측정되었으며; 상기 사구체 대식세포의 평균 숫자는 (도 58) 24주령 MRLlpr/lpr 마우스 (각 단편당 15개 사구체에서의 Mac2+ 세포)의 신장 단편에서 측정되었으며; 간질성 대식세포 (도 59) 또는 T 세포 (도 60)의 숫자는 24주령 MRLlpr/lpr 마우스 (각 단편당 15 고자장에서의 Mac2+ 세포 또는 CD3+ 세포)의 신장 단편에서 각각 측정되었으며;
도 61은 과옥소산 시프 (Periodic acid Schiff; PAS)로 염색된 24 주령 MRLlpr/lpr 마우스의 폐 절편에 대한 폐 손상을 반정량적으로 점수화한 도이며;
도 62는 LPS 도전(change) 24시간 후 BAL 액에서의 총 세포수를 나타낸 것이며 (x10⁶/동물; 평균 ± SEM; * p<0.05, ** p<0.01 vs. 양성 대조군(positive control group)), 여기에서 상기 동물은 LPS 도전전에 담체 (양성 대조군), 덱사메타손, 로플루밀라스트 (Roflumilast) 또는 MCP-1 결합 스피에겔머 mNOX-E36-3’PEG를 처치하거나 깨끗한 공기 도전 전(clean air challenge ; 음성 대조군)에 담체를 처치함);
도 63은 LPS 도전(challenge) 24시간 후 BAL 액에서의 호중구 절대 숫자를 나타낸 것이며 (평균 ± SEM ** p < 0.01 vs. 양성 대조군), 여기에서 상기 동물은 LPS 도전전에 담체 (양성 대조군), 덱사메타손, 로플루밀라스트 (Roflumilast) 또는 MCP-1 결합 스피에겔머 mNOX-E36-3’PEG를 처치하거나 깨끗한 공기 도전 전(clean air challenge ; 음성 대조군)에 담체를 처치함);
도 64는 정상 동물군 또는 MCT/담체 또는 MCT/MCP-1 결합 스피에겔머 mNOX-E36-3’PEG 처치후 동물군의 우측 심장 비대증 결과를 나타낸 도이며; 여기에서 판독은 좌측 심실 및 중격 중량에 대한 우측 심실 중량비로 수행함(RV/(LV+S));
도 65는 정상 동물군 또는 MCT/담체 또는 MCT/MCP-1 결합 스피에겔머 mNOX-E36-3’PEG 처치후 동물군의 우측 심실 수축기압 (RSVP [mmHg])을 나타낸 도이다.

하기의 예들은 단지 본 발명의 설명의 목적을 설명하고자 하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명의 보호범위를 제한하고자 함이 아니다.

실시예 1. 인간 MCP -1과 결합하는 핵산

목표로서 비오틴화 인간 D-MCP-1을 이용하여, 인간 MCP-1과 결합하는 몇가지 핵산은 도 1 내지 도 7에 묘사된 핵산 서열을 제조할 수 있다. 상기 핵산은 압타머, 즉, 비오틴화 인간 D-MCP-1으로 수행되는 경쟁적 또는 직접 풀-다운(pull down) 어세이법을 이용한 D-핵산 수준 (실시예 4) 또는 스피에겔머 수준, 즉, 비아코아 (Biacore) 2000 기기를 이용한 표면 플라즈몬 공명 기기 (surface plasmon resonance measurement) (실시예 7), 시험관내(in vitro) 세포 배양 Ca⁺⁺-분비 어세이법 (실시예 5) 또는 시험관내(in vitro) 화학 주성 어세이법 (실시예 6)에 의한 MCP-1의 자연 배위를 갖는 L-핵산 (L-MCP)으로 특징화된다.

따라서 생성된 핵산은 4개의 서로 다른 서열 모티프(sequence motiffs)를 나타내고 이 4개 주요 형태는 도 1 및 2 (1A/1B 형), 도 3 (2 형), 도 4 및 5 (3 형), 및 도 6 (4 형)에서 정의되어 있다. 서로 관련될 수 없고 본원에서 개시된 서로 다른 서열 모티프에 결합하는 추가적인 MCP-1 결합 핵산들을 도 7에 표시되어 있다. 핵산 서열 모티프를 정의하기 위하여, 모호한 핵산을 IUPAC 생략표기법을 이용하여 하기와 같이 이용하였다:

S- 강(strong)- G 또는 C;

W- 약(weak)- A 또는 U;

R- 퓨린(purine)- G 또는 A;

Y- 피리미딘(pyrimidine)- C 또는 U;

K- 케토(keto)- G 또는 U;

M- 이미노 (imino)- A 또는 C;

B- A가 아닌(not A)- C 또는 U 또는 G;

D- C가 아닌(not C)- A 또는 G 또는 U;

H- G가 아닌(not G)- A 또는 C 또는 U;

V- U가 아닌(not U)- A 또는 C 또는 G;

N- 모두(all)- A 또는 G 또는 C 또는 U.

역으로 지시되지 않는다면, 임의의 핵산 서열 또는 스트레치(streches) 및 박스(boxes)의 서열을 각각 5’→3’방향으로 정의된다.

1A 형 MCP -1 결합 핵산 ( Type 1A MCP -1 binding nucleic acids ; 도 1 참조)

도 1에 도시된 바와 같이, 1A 형 MCP-1 결합 핵산들의 모든 시퀀스들은 박스(box; 본원에서 진한 이태리체 및 밑줄로 표시함) B1A 및 박스 B1B 가 서로 혼성화될 수 있는 5’- 및 3’말단 스트레치(terminal stretches)인 몇 가지 시퀀스, 스트레치 또는 박스들을 포함한다. 그러나, 상기 혼성화는 생리학적 조건하에 실제로 존재하는 분자에 반드시 필요하지는 않다. 박스들 B2, B3, B4, B5 및 박스 B6는 박스 B1A 및 박스 B1B 로 플랭크(Flanked) 된다.

상기 핵산들은 이들의 결합 양상 (실시예 4) 측면에서 이를 서열화시키기 위해 비오틴화 인간 D-MCP-1로 수행하는 경쟁적 또는 직접 풀-다운(pull-down) 어세이법을 이용한 압타머 수준으로 특징화 된다. 선택된 시퀀스는 스피에겔머 (실시예 3)로 합성되고 시험관 내 세포 배양 Ca⁺⁺-분비 어세이법 (실시예 5)상에서 MCP-1 (L-MCP)의 자연 상태 배위형을 이용하여 시험 되었다.

상기 정의된 박스의 서열들은 MCP-1에 결합 친화성에 영향을 주는 1A 형 MCP-1 결합 핵산 간에 서로 상이할 수 있다. 1 A형 MCP 결합 핵산( type 1A MCP binding nucleic acids ) 으로 요약된 서로 상이한 MCP-1 결합 핵산의 결합력 분석에 기초하여, 상기 박스 B1A, B2, B3, B4, B5 , B6 및 박스 B1B 및 하기에서 개시되는 이들의 핵산 서열들은 개별적이고, 보다 바람직하게는 MCP-1에 결합하기에 그 전체로서 필수적이다:

박스들 B1A 및 B1B 들은 5’- 및 3’ 말단 스트레치들이 서로 혼성화될 수 있다; 여기에서 B1A 는 AGCRUG , 바람직하게는 AGCGUG ; 및 BIB 는 CRYGCU , 바람직하게는 CACGCU 이며;

박스 B2는 CCCGGW, 바람직하게는 CCCGGU이며;

박스 B3는 GUR, 바람직하게는 GUG이며;

박스 B4는 RYA, 바람직하게는 GUA이며;

박스 B5 는 GGGGGRCGCGAYC , 바람직하게는 GGGGGGCGCGACC 이며;

박스 B6는 UGCAAUAAUG 또는 URYAWUUG, 바람직하게는 UACAUUUG이며;

도 1에 도시된 바와 같이, 176-E10trc로 표기되는 상기 핵산 분자는 MCP-1과 가장 강력한 결합 친화성을 갖고 있으며 (5 nM의 K_D 치로 풀-다운 어세이법에서 압타머 및 시험관 내 세포 배양 Ca⁺⁺-분비 어세이법 상에서 4-5 nM의 IC₅₀ 수치를 갖는 스피에겔머로 작용), 따라서, 최적의 서열 및 서열 구성 요소들인 박스 B1A , B2, B3, B4, B5 , B6 및 박스 B1B 의 최적의 조합을 구성할 수 있을 것이다.

1B 형 MCP -1 결합 핵산 ( Type 1B MCP -1 binding nucleic acids ; 도 2 참조)

도 2에 도시된 바와 같이, 1B 형들의 모든 서열들은 박스(box) B1A 및 박스 B1B 가 서로 혼성화될 수 있고 박스들 B2, B3, B4, B5 및 박스 B6는 박스 B1A 및 박스 B1B 로 플랭크(Flanked)되는, 5’- 및 3’말단 스트레치(terminal stretches)인, 몇 가지 서열, 스트레치 또는 박스들을 포함한다. 그러나, 상기 혼성화는 생리학적 조건하에 실제로 존재하는 분자에 반드시 필요하지는 않다.

상기 핵산들은 이들의 결합 양상 측면(실시예 4)에서 이를 서열화시키기 위해 비오틴화 인간 D-MCP-1로 수행하는 경쟁적 또는 직접 풀-다운(pull-down) 어세이법을 이용한 압타머 수준으로 특징화 된다. 선택된 서열은 스피에겔머 (실시예 3)으로 합성되고 시험관 내 세포 배양 Ca⁺⁺-분비 어세이법 (실시예 5)상에서 MCP-1 (L-MCP)의 자연 상태 배위형을 이용하여 시험 되었다.

상기 정의된 박스의 서열들은 MCP-1에 결합 친화성에 영향을 주는 1B 형 MCP-1 결합 핵산 간에 서로 상이할 수 있다. 1B형 MCP 결합 핵산( type 1A MCP binding nucleic acids ) 으로 요약된 서로 상이한 MCP-1 결합 핵산의 결합력 분석에 기초하여, 상기 박스 B1A, B2, B3, B4, B5 , B6 및 박스 B1B 및 하기에서 개시되는 이들의 핵산 서열들은 개별적이고, 보다 바람직하게는 MCP-1에 결합하기에 그 전체로서 필수적이다:

박스들 B1A 및 B1B 들은 서로 혼성화 될 수 있다; 여기에서 B1A 는 AGYRUG , 바람직하게는 AGCGUG ; 및 BIB 는 CAYRCU , 바람직하게는 CACGCU 이며;

박스 B2는 CCAGCU,또는 CCAGY, 바람직하게는 CCAGU이며;

박스 B3는 GUG이며;

박스 B4는 AUG이며;

박스 B5 는 GGGGGGCGCGACC 이며;

박스 B6는 CAUUUUA 또는 CAUUUA, 바람직하게는 CAUUUUA이며;

도 2에 도시된 바와 같이, 176-C9trc로 표기되는 상기 핵산은 MCP-1과 가장 강력한 결합 친화성을 갖고 있으며 (5 nM의 K_D 치로 풀-다운 어세이법(pull-down assay)에서 압타머 및 시험관내 세포 배양 Ca⁺⁺-분비 어세이법 상에서 4-5 nM의 IC₅₀ 수치를 갖는 스피에겔머로 작용), 따라서, 최적의 서열 및 서열 구성 요소들인 박스 B1A, B2, B3, B4, B5 , B6 및 박스 B1B 의 최적의 조합을 구성할 수 있을 것이다.

2 형 MCP -1 결합 핵산 ( Type 2 MCP -1 binding nucleic acids ; 도 3 참조)

도 3에 도시된 바와 같이, 2 형들의 모든 서열들은 박스(box) B1A 및 박스 B1B 가 서로 혼성화될 수 있는 5’- 및 3’말단 스트레치들이고 박스 B2은 중앙 시퀀스 구성요소인, 몇 가지 서열, 스트레치 또는 박스들을 포함한다. 그러나, 상기 혼성화는 생리학적 조건하에 실제로 존재하는 분자에 반드시 필요하지는 않다.

상기 핵산들은 이들의 결합 양상 측면 (실시예 4)에서 이를 서열화시키기 위해 비오틴화 인간 D-MCP-1로 수행하는 경쟁적 또는 직접 풀-다운(pull-down) 어세이법을 이용한 압타머 수준으로 특징화 된다. 선택된 서열은 스피에겔머 (실시예 3)으로 합성되고 시험관 내 세포 배양 Ca⁺⁺-분비 어세이법 (실시예 5)상에서 MCP-1 (L-MCP)의 자연 상태 배위형을 이용하여 시험 되었다.

상기 정의된 박스의 서열들은 MCP-1에 결합 친화성에 영향을 주는 3 형 MCP-1 결합 핵산 간에 서로 상이할 수 있다. 2형 MCP 결합 핵산( type 2 MCP binding nucleic acids ) 으로 요약된 서로 상이한 MCP-1 결합 핵산의 결합력 분석에 기초하여, 상기 박스 B1A, B2, 및 박스 B1B 및 하기에서 개시되는 이들의 핵산 서열들은 개별적이고, 보다 바람직하게는 MCP-1에 결합하기에 그 전체로서 필수적이다:

박스들 B1A 및 B1B 들은 서로 혼성화 될 수 있는 5’- 및 3’말단 스트레치이며; 여기에서 B1A 는 ACGCA 이고 B1B 는 UGCGU , 또는 B1A 는 CGCA 이고 B1B 는 UGCG , 또는 B1A 는 GCA 이고 B1B 는 UGCG 또는 UGC ; 바람직하게는 B1A 는 GCA 이고 B1B 는 UGCG 이며;

박스 B2는 CSUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGYGGCUC, 바람직하게는 CGUCCCUCACCG GUGCAAGUGAAGCCGUGGCUC이며;

도 3에 도시된 바와 같이, 180-D1-002뿐 아니라 180-D1-011, 180-D1-012, 180-D1-035, 및 180-D1-036 (=NOX-E36)과 같은 180-D1-002의 유도체로 표기되는 상기 핵산들은 MCP-1과 1 nM 이하의 K_D 치로 풀-다운 어세이법(pull-down assay) 에서 압타머로 작용하는, 가장 강력한 결합 친화성을 갖고 있으며, 따라서, 최적의 서열 및 서열 구성요소들인 박스 B1A, B2, 및 박스 B1B 의 최적의 조합을 구성할 수 있을 것이다.

핵산 분자 D-NOX-E36 (D-180-D1-036; 서열번호 159)을 대상으로 한 실험에서, 해리 상수 (dissociation constant; K_D)가 실온에서는 890± 65 pM이고 37℃에서는 146± 13 pM로 결정되었다 (실시예 4; 도 9 참조). 각각의 스피에겔머 NOX-E36 (180-D1-036; 서열 번호 37)은 시험관 내 Ca⁺⁺-분비 어세이법(실시예 5; 도 12 참조)상에서 3-4 nM 및 시험관 내 화학주성 어세이법(실시예 6; 도 15 참조)에서 약 0.5 nM의 저해농도 (IC₅₀)을 나타냈다. NOX-E36, NOX-E36-3'PEG 및 NOX-E36-5'PEG와 같은 PEG화 유도체들을 대상으로 한 실험에서는, 시험관 내 Ca⁺⁺-분비 어세이법(실시예 5; 도 29 및 도 31참조) 상에서 약 3 nM 및 시험관 내 화학주성 어세이법(실시예 6; 도 30 및 32 참조) 에서 1 nM 이하의 저해농도(IC₅₀)를 나타냈다.

3 형 MCP -1 결합 핵산 ( Type 3 MCP -1 binding nucleic acids ; 도 4 및 5 참조)

도 4 및 도 5에 도시된 바와 같이, 3 형의 모든 서열들은 박스상의 3개의 쌍들은 3 형 MCP-1 결합 핵산에 특징적인 몇 개의 서열, 스트레치 또는 박스를 포함한다.

박스(box) B1A 및 박스 B1B , 박스(box) B2A 및 박스 B2B , 박스(box) B5A 및 박스 B5B들은 서로 혼성화될 수 있는 능력을 갖는다. 그러나 상기 혼성화는 생리학적 조건하에 실제로 존재하는 분자에 반드시 필요하지는 않다. 이러한 잠재적으로 혼성화된 서열 구성요소들 간에는 비-혼성화 뉴클레오티드(nucleotide)들이 박스(box) B3, 박스 B4 및 박스 B6 라고 지칭되어 위치한다.

상기 핵산들은 이들의 결합 양상 (실시예 4) 측면에서 이를 서열화시키기 위해 비오틴화 인간 D-MCP-1으로 수행하는 경쟁적 또는 직접 풀-다운(pull-down) 어세이법을 이용한 압타머 수준으로 특징화 된다. 선택된 서열은 스피에겔머 (실시예 3)로부터 합성되고, 시험관 내 화학 주성 어세이법 (실시예 6) 또는 바이아코아 (Biacore) 측정법(실시예 7)상에서 MCP-1 (L-MCP)의 자연 상태 배위형을 이용하여 시험되었다.

상기 정의된 박스들의 서열들은 MCP-1에 결합 친화도에 영향을 주는 3 형 MCP-1 결합 핵산 간에 서로 상이할 수 있다. 3형 MCP 결합 핵산 ( type 3 MCP binding nucleic acids ) 으로 요약된 서로 상이한 MCP-1 결합 핵산의 결합력 분석에 기초하여, 상기 박스 B1A, B2A, B3, B2B, B4, B5A, B6 , B5B 및 하기에서 개시되는 이들의 핵산 서열들은 개별적이고, 보다 바람직하게는 MCP-1에 결합하기에 그 전체로서 필수적이다:

박스들 B1A 및 B1B 들은 서로 혼성화될 수 있는 5’- 및 3’말단 스트레치이며; 여기에서 B1A 는 GURCUGC 이고 B1B 는 GCAGCAC ; 바람직하게는 B1A 는 GUGCUGC 이고 B1B 는 GCAGCAC 이며;

또는 B1A 는 GKSYGC 이고 B1B 는 GCRSMC ; 바람직하게는 B1A 는 GUGCGC 이고 B1B 는 GCGCAC 이며;

또는 B1A 는 KBBSC 이고 B1B 는 GSVVM ; 바람직하게는 B1A 는 KKSSC 이고 B1B 는 GSSMM 이며;

또는 B1A 는 BNGC 이고 B1B 는 GCNV ; 바람직하게는 B1A 는 SNGC 이고 B1B 는 GCNS 이며; 가장 바람직하게는, B1A 는 GGGC 이고 B1B 는 GCCC 이다.

박스들 B2A 및 B2B 들은 서로 혼성화될 수 있는 스트레치이며; 여기에서 B2A 는 GKMGU 이고 B2B 는 ACKMC ; 바람직하게는 B2A 는 GUAGU 이고 B2B 는 ACUAC 이며;

박스 B3는 KRRAR이고; 바람직하게는 UAAAA 또는 GAGAA이며;

박스 B4는 CURYGA 또는 CUWAUGA 또는 CWRMGACW 또는 UGCCAGUG; 바람직하게는 CAGCGACU 또는 CAACGACU이며;

박스들 B5A 및 B5B들은 서로 혼성화될 수 있는 스트레치이며; 여기에서 B5A는 GGY이고 B2B는 GCYR이고, 여기에서 GCY는 B5A 의 뉴클레오티드와 서로 혼성화 될 수 있으며; B5A는 CWGC이고 B5B는 GCWG이고; 바람직하게는 B5A는 GGC이고 B5B는 GCCG이며;

박스 B6는 YAGA 또는 CKAAU 또는 CCUUUAU ; 바람직하게는 UAGA 이다.

도 4 및 도 5에 도시된 바와 같이, 178-D5 및 이의 유도체 178-D5-030 뿐만 아니라 181-A2-002, 181-A2-004, 181-A2-005, 181-A2-006, 181-A2-007, 181-A2-017, 181-A2-018, 181-A2-019, 181-A2-020, 181-A2-021, 및 181-A2-023과 같은 181-A2 계열 유도체와 181-A2로 표기되는 상기 핵산들은 MCP-1과 가장 강력한 친화성을 갖는다. 178-D5 및 178-D5-030은 약 500 pM의 K_D 치로 직접 또는 경쟁적 풀-다운 어세이법(pull-down assay; 실시예 4)에서 압타머로서의 작용을 평가받았다. 동일한 실험적 조건하에서, 181-A2는 약 100 pM의 K_D 치를 갖는 것으로 측정되었다. 바이아코아 분석법 (실시예 7)에서, MCP-1에 대한 181-A2 및 이의 유도체들의 K_D 치는 200-300 pM을 갖는 것으로 측정되었다. 배양세포로 수행한 Ca⁺⁺-분비 어세이법 및 화학 주성 어세이법 (실시예 5 및 6, 각각)에서, 178-D5 및 181-A2는 약 500 pM의 IC₅₀를 갖는 것으로 측정되었다. 따라서 178-D5 뿐만 아니라 181-A2 및 그 유도체들은 최적의 서열 및 서열 구성요소들인 박스 B1A, B2A, B3, B2A, B4, B5A, B6 , B5B 및 박스 B1B 의 최적의 조합을 구성할 수 있을 것이다.

4 형 MCP -1 결합 핵산 ( Type 4 MCP -1 binding nucleic acids ; 도 6 참조)

도 6에 도시된 바와 같이, 4 형의 모든 서열들은 박스(box) B1A 및 박스 B1B 가 서로 혼성화 될 수 있는 5’- 및 3’말단 스트레치이며, 박스 B2 는 중앙 시퀀스 구성요소인 몇 개의 시퀀스, 스트레치 또는 박스들을 포함한다.

상기 핵산들은 이들의 결합 양상 (실시예 4) 측면에서 이를 서열화시키기 위해 비오틴화 인간 D-MCP-1으로 수행하는 직접 풀-다운(pull-down) 어세이법을 이용한 압타머 수준으로 특징화 된다. 선택된 서열은 스피에겔머 (실시예 3)로서 합성되고, 시험관 내 Ca⁺⁺-분비 어세이법 (실시예 5), 및/또는 시험관 내 화학 주성 어세이법 (실시예 6)상에서 MCP-1 (L-MCP)의 자연 상태 배위형을 이용하여 시험 되었다.

상기 정의된 박스들의 서열들은 MCP-1에 결합 친화성에 영향을 주는 4 형 MCP-1 결합 핵산 간에 서로 상이할 수 있다. 4형 MCP -1 결합 핵산 ( type 4 MCP -1 binding nucleic acids ) 으로 요약된 서로 상이한 MCP-1 결합 핵산의 결합력 분석에 기초하여, 상기 박스 B1A, B2, 및 B1B 및 하기에서 개시되는 이들의 핵산 서열들은 개별적이고, 보다 바람직하게는 MCP-1에 결합하기에 그 전체로서 필수적이다:

박스들 B1A 및 B1B 들은 서로 혼성화될 수 있는 5’- 및 3’말단 스트레치이며; 여기에서 B1A 는 AGCGUGDU 이고 B1B 는 GNCASGCU ; 또는 B1A 는 GCGCGAG 이고 B1B 는 CUCGCGUC ; 또는 B1A 는 CSKSUU 이고 B1B 는 GRSMSG ; 또는 B1A 는 GUGUU 이고 B1B 는 GRCAC ; 또는 B1A 는 UGUU 이고 B1B 는 GGCA ; 바람직하게는 B1A 는 CSKSUU 이고 B1B 는 GRSMSG 이며; 보다 바람직하게는 B1A 는 CCGCUU 이고 B1B 는 GGGCGG 이며; 및

박스 B2는 AGNDRDGBKGGURGYARGUAAAG 또는 AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG 또는 CAGGUGGGUGGUAGAAUGUAAAGA, 바람직하게는, AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG이다.

도 6에 도시된 바와 같이, 174-D5-004 및 166-A4-002로 표기되는 상기 핵산들은 MCP-1과 가장 강력한 친화성을 갖으며 (시험관 내 세포배양 Ca⁺⁺ 분비 어세이법 상에서 2~5 nM의 IC₅₀를 갖는 스피에겔머로서), 따라서, 이들은 최적의 서열 및 서열 구성요소들인 박스 B1A, B2, 및 박스 B1B 의 최적의 조합을 구성할 수 있을 것이다.

추가적으로, MCP-1 결합 핵산의 1형 내지 4형으로 표시되어 온 뉴클레오티드 서열 구성요소들의 조합으로 묘사될 수 없는 MCP-1 결합 핵산과는 상이한 29개의 다른 핵산들이 동정 되었다. 이들의 서열은 도 7에 도시하였다.

도 1 내지 도 7에 개시된 임의의 서열들은 절단된 형태를 포함한 본 발명에 따른 핵산이나, 각각 절단되고 신장된 핵산 분자들이 목표에 결합할 수 있는 능력을 갖는다는 전제하에 이들의 신장된 형태도 포함되는 것으로 이해되어야 할 것이다.

실시예 2. 설치류 MCP -1과 결합하는 핵산

목표로서 비오틴화 설치류 D-MCP-1을 이용하여, 이에 결합하는 몇 가지 핵산 분자들을 제조할 수 있다. 이러한 핵산 분자들의 서열 분석 결과는 도 8에 설명된다.

상기 핵산들은 이들의 결합 양상 측면 (실시예 4)에서 이를 서열화시키기 위해 비오틴화 설치류 D-MCP-1으로 수행하는 풀-다운(pull-down) 어세이법을 이용한 압타머 수준으로 특징화 된다. 선택된 서열은 스피에겔머 (실시예 3)로부터 합성되고, 시험관 내 세포배양 Ca⁺⁺ 분비 어세이법 (실시예 5) 및 시험관 내 화학 주성 어세이법 (실시예 6)상에서 MCP-1 (L-MCP)의 자연 상태 배위형을 이용하여 시험 되었다.

도 8에 도시된 바와 같이, D-188-A3-001 및 D-189-G7-001 및 이들의 유도체들은 풀-다운(pull-down) 어세이법 상에서 D-MCP-1과 나노몰 이하의 K_D 치 수준으로 결합한다.

핵산 분자 D-mNOX-E36 (=D-188-A3-007; 서열번호 244)을 대상으로 한 실험에서, 해리 상수 (dissociation constant; K_D)가 37℃에서는 0.1-0.2 nM로 결정되었다 (실시예 4; 도 10 참조). 각각의 스피에겔머 mNOX-E36 (188-A3-007; 서열 번호 122)은 시험관 내 Ca⁺⁺-분비 어세이법 (실시예 5; 도 13 참조)상에서 약 12 nM 및 시험관 내 화학 주성 어세이법 (실시예 6; 도 16 참조)에서 약 7 nM의 저해농도(IC₅₀)을 나타냈다. mNOX-E36, mNOX-E36-3’PEG (서열번호 254)와 같은 PEG화 유도체들을 대상으로 한 실험에서는, 시험관 내 Ca⁺⁺-분비 어세이법 (실시예 5; 도 34 참조)상에서 약 8 nM 및 시험관 내 화학 주성 어세이법 (실시예 6; 도 36 참조)에서 약 3 nM의 저해농도 (IC₅₀)를 나타냈다.

각각 절단되고 신장된 핵산 분자들이 목표에 결합할 수 있는 능력을 갖는다는 것을 전제로 하여 도 1 내지 도 7에 개시된 임의의 서열들은 절단된 형태 뿐 만 아니라 신장된 형태를 포함한 본 발명에 따른 핵산인 것으로 해석되어야 할 것이다.

실시예 3. 압타머 및 스피에겔머들의 합성 및 유도체화

소규모 합성법

압타머 및 스피에겔머들은 2‘TBDMS RNA 포스포라미다이트(Phosphoramidite) 화학법 (M.J. Damha, K. K. Ogilvie, Methods in Molecular Biology, Vol. 20 올리고뉴클레오티드 및 유사체를 위한 지시서 (Protocols for oligonucleotides and analogs), Ed. S. Agrawal, p 81-114, Humana Press Inc. 1993))을 이용한 합성기 (ABI 394 synthesizer)로 고체-상 합성법 (solid-phase synthesis)으로 생산하였다. D- 및 L- 입체 배위를 갖는 rA(N-Bz)-, rC(Ac)-, rG(N-ibu)-, 및 rU- 포스포라미다이트들은 회사 (ChemGenes, Wilmington, MA)에서 구입하였다. 압타머 및 스피에겔머 등은 겔 전기영동법 (Gel electrophoresis)로 정제하였다.

대규모 합성법 및 개량

스피에겔머 NOX-E36은 2‘TBDMS RNA 포스포라미다이트(Phosphoramidite) 화학법 (M.J. Damha, K. K. Ogilvie, Methods in Moleculr Biology, Vol. 20 올리고뉴클레오티드 및 유사체를 위한 지시서(Protocols for oligonucleotides and analogs), Ed. S. Agrawal, p 81--114, Humana Press Inc. 1993))을 이용한 합성기 (100 synthesizer)로 고체-상 합성법 (solid-phase synthesis)으로 생산하였다. L-rA (N-Bz)-, L-rC(Ac)-, L-rG(N-ibu)-, 및 L-rU- 포스포라미다이트들은 회사(ChemGenes, Wilmington, MA)에서 구입하였다. 5’-아미노-변형체 (amino-modifier)는 회사 (American International Chemicals Inc. Framingham, MA, USA)에서 구입하였다. 상기 비-변형 (unmodified) 스피에겔머의 합성은 L-riboG 개량 CPG (공극 크기, 1000 Å, Link Technology, Glasgow, UK)로 출발하고; 3’-NH₂-개량 스피에겔머는 3’-아미노개량화제(aminomodifier)-CPG (공극 크기, 1000 Å, ChemGenes, Wilmington, MA)을 사용하였다. 결합을 위하여 (사이클 당 15 분), 0.3 M 아세토니트릴 중 벤질티오테트라졸 (benzylthiotetrazole; CMS-Chemicals, Abi ngdon, UK) 및 3.5 당량의 개개 아세토니트릴 중 0.1 M 포스포라미다이트 용액을 사용하였다. 산화-캡핑 사이클 (oxidation-capping cycle)이 사용되었다. 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 추가적인 표준 용매 및 시약들은 회사(Biosolve, Val kenswaard, NL)에서 구입하였다. 스피에겔머는 DMT-ON 합성되고; 탈보호화 한 후에, Source 15RPC 배양액 (Amersham)을 이용한 프렙 (preparative) RP-HPLC (Wincott F. 등.(1995) Nucleic Acids Res 23: 2677)으로 정제되었다. 상기 5’DMT-기는 80% 초산으로 제거되었다 (실온에서 30분). 연속적으로, 수용성 2 M NaOAc 용액을 가하고 상기 스피에겔머는 5 K 재생 셀룰로오스 막(Millipore, Bed ford, MA)을 이용한 탄젠셜-유동 여과법 (tangential-flow filtration)으로 탈염을 수행하였다.

NOX - E36 의 PEG 화 반응( PEGylation )

생체 내 (in vivo)에서 스피에겔머의 혈장 체류 시간 (plasma residence time)을 연장시키기 위하여, 스피에겔머 NOX-E36을 40 kDa 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 기에 3’- 또는 5’-말단에 공유 결합시켰다.

NOX - E36 의 3’- PEG 화 반응

PEG화 반응을 위하여 (구체적인 기술적인 PEG화 반응의 방법은 유럽특허 출원 제 1 306 382호를 참고), 정제한 3’-아미노 변형된 스피에겔머(3’-amino modified Spiegelmer)는 물 (2.5 ㎖), DMF (5 ㎖) 및 완충액 A (buffer A; 시트르산ㆍ1 수화물 [7 g], 붕산 [3.54 g], 인산 [2.26 ㎖] 및 1M NaOH [343 ㎖]를 혼합하고 물을 가하여 1 L의 최종 용량을 만들고; 1 M 염산으로 pH (=8.4)로 적정하였다)의 혼합물에 용해시켰다.

상기 스피에겔머 용액의 pH는 1 M NaOH으로 8.4로 적정하였다. 그리고, 40 kDa PEG-NHS 에스테르 (Nektar Therapeutics, Huntsville, AL)를 최대 수율이 75-85%에 도달하도록 0.6 당량의 4 부분 (portions)으로 매 30분씩 37℃에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물의 pH를 상기 PEG-NHS 에스테르의 첨가 중에 1 M NaOH로 8-8.5를 유지토록 하였다.

상기 반응 혼합물을 4 ㎖ 우레아 (urea) 용액 (8 M), 4 ㎖ 완충액 (buffer) A, 및 4 ㎖ 완충액 B (수중 0.1 M 트리에틸 암모니움 아세테이트)와 혼합하고 15분간 95℃로 가열하였다. 그리고 상기 PEG화 스피에겔머를 아세토니트릴 경사법 (완충액 B; 완충액 C: 아세토니트릴 중 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트)을 이용하여 소스 (Source) 15RPC 배양액 (Amersham)으로 RP-HPLC로 정제하였다. 과잉의 PEG를 5% 완충액 C로 용출시키고 PEG화 스피에겔머는 10-15% 완충액 C로 용출시켰다. 95% 이상의 순도 (HPLC로 측정)를 갖는 목적물 분획을 수집하고 40 ㎖ 3 M NaOAc와 혼합하였다. 상기 PEG화 스피에겔머는 탄젠셜-유동 여과법 (tangential-flow fil tration; 5 K 재생 셀룰로오스 막 (Millipore,Bedford, MA)을 이용)으로 탈염을 수행하였다.

NOX - E36 의 5’- PEG 화 반응

PEG화 반응을 위하여 (구체적인 기술적인 PEG화 반응의 방법은 유럽특허 출원 제 1 306 382호를 참고), 정제한 5’-아미노 개량화 스피에겔머(3’-amino modified Spiegelmer)는 물 (2.5 ㎖), DMF (5 ㎖) 및 완충액 A (buffer A; 시트르산ㆍ1 수화물 [7 g], 붕산 [3.54 g], 인산 [2.26 ㎖] 및 1 M NaOH [343 ㎖]를 혼합하고 물을 가하여 1 L의 최종 용량을 만들고; 1 M 염산으로 pH (=8.4)로 적정하였다)의 혼합물에 용해시켰다.

상기 스피에겔머 용액의 pH는 1M NaOH으로 8.4로 적정하였다. 그리고, 40 kDa PEG-NHS 에스테르 (Nektar Therapeutics, Huntsville, AL)를 최대 수율이 75-85%에 도달하도록 0.25 당량의 6 부분 (portions)으로 매 30분씩 37℃에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물의 pH를 상기 PEG-NHS 에스테르의 첨가 중에 1 M NaOH로 8-8.5를 유지토록 하였다.

상기 반응 혼합물을 4 ㎖ 우레아 (urea) 용액 (8 M), 4 ㎖ 완충액 B (수중 0.1 M 트리에틸 암모니움 아세테이트)와 혼합하고 15분간 95℃로 가열하였다. 그리고, 상기 PEG화 스피에겔머를 아세토니트릴 경사법(완충액 B; 완충액 C: 아세토니트릴중 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트)을 이용하여 소스(Source) 15RPC 배양액 (Amersham)으로 RP-HPLC로 정제하였다. 과잉의 PEG를 5% 완충액 C로 용출시키고 PEG화 스피에겔머는 10-15% 완충액 C로 용출시켰다. 95% 이상의 순도 (HPLC로 측정)를 갖는 목적물 분획을 수집하고 40 ㎖ 3M NaOAc와 혼합하였다. 상기 PEG화 스피에겔머는 탄젠셜-유동 여과법(tangential-flow filtration; 5 K 재생 셀룰로오스 막 Millipore, Bedford, MA)으로 탈염을 수행하였다.

실시예 4. 결합 상수의 측정(풀-다운 어세이법 )

직접 풀-다운 어세이법( Direct pull - down assay )

D-MCP-1에 대한 압타머의 친화도는 풀-다운 어세이 포메트 (pull-down assay format)에서 20 또는 37℃에서 각각 측정하였다. 압타머들은 [γ-³²P]-표지 ATP (Hartmann Analytic, Braunschweig, 독일)을 이용하여 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(polynucleotide kinase; Invitrogen, Karlsruhe, 독일)에 의해 5’포스페이트 표지화 되었다.

표지 압타머의 특이적 방사능은 200,000800,000 cpm/pmol이었다. 압타머들은 선택용 완충액 (20 mM Tris-HCl pH 7.4; 137 mM NaCl; 5 mM KCl; 1 mM MgCl₂; 1 mM CaCl₂; 0.1% [w/vol] Tween-20) 중에서 다양한 양의 비오틴화 D-MCP-1과 저농도에서 평형을 도달토록 4-12시간 동안 37℃에서 20 pM에서 변성 (denaturation) 및 재생 (renaturation)후에 배양되었다. 선택용 완충액은 사용된 플라스틱 용기 또는 고정화 매트릭스 (matrix) 표면으로의 결합 파트너들의 흡수를 억제하기 위하여 10 ㎍/㎖ 인간 혈청 알부민 (human serum albumin; Sigma-Aldrich, Steinheim, 독일), 및 10 ㎍/㎖ 효모 RNA (Ambion, Austin, 미국)를 첨가하였다. 비오틴화 D-MCP-1의 농도 범위는 8 pM 내지 100 nM으로 조정하고; 총 반응 부피는 1 ㎖였다. 펩타이드 및 펩타이드-압타머 복합체는 6 ㎕ 총 부피에서 선택용 완충액으로 예비-평형화(pre-equilibrated) 및 재현탁된 1.5 ㎕ 스트렙타비딘 울트라링크(Streptavidin Ul tralink) 첨가 입자 (Plus particles) (Pierce Biotechnology, Rockford, 미국)상에 고정화시켰다. 상기 입자들을 열 혼합기에서 각각의 온도로 30분간 현탁 상태로 유지하였다. 고정화된 방사능은 상등액을 분리하고 적절한 세척 후에 신틸레이션 계수기 (scintillation counter)로 정량화하였다. 상기 결합의 백분율은 비오틴화 D-MCP-1 농도에 따라 구도되었고 해리상수 (dissociation constants)는 1:1 화학양론으로 추정되는 소프트웨어 알고리즘(software algorithms)을 이용하여 계산되었다 (GRAFIT; Erithacus Software; Surrey 영국).

경쟁적 풀-다운 어세이법( Competitive pull - down assay )

서로 상이한 D-MCP-1 결합 압타머들을 서로 비교하기 위하여, 경쟁적 서열화 어세이법(competitive ranking assay)이 수행되었다. 상기 목적을 위하여 입수 가능한 가장 근접한 압타머를 방사선으로 표지하고(상기 참조) 표준물질로 제공하였다. 변성 및 재생과정 후에, 경쟁 없이 고정화 후에 펩티드에 5-10% 결합하고 뉴트라비딘 아가로스 (NeutrAvidin agarose; Pierce사) 또는 스트렙타비딘 울트라링크 플러스 (Streptavidin Ultralink Plus; Pierce사)로 세척하는 조건하에서 1 ㎖ 선택용 완충액으로 37℃에서 배양하였다. 과량의 변성 및 재생된 비표지 (non-labeled) D-RNA 압타머 변이체(aptamer variants)들을 표지된 표준물질 압타머와 함께 평형 결합반응(parallel binding reactions)을 수행하도록 여러 농도 (예를 들어 2, 10, and 50 nM)로 첨가하였다. 시험될 상기 압타머들은 목표 결합을 위해 상기 표준물질 압타머들과 경쟁하였고, 결국, 이들의 결합 특성에 따라서 상기 결합 신호를 감소시켰다. 본 어세이법에서 가장 활성이 강한 압타머는 추후의 압타머 변이체의 비교분석시험을 위해 새로운 표준물질로 제공될 수 있을 것이다.

실시예 5. Ca ⁺⁺ 분비 어세이법에서 저해 농도의 측정

THP-1-세포 (DSMZ, Braunschweig)을 10% 우태아혈청, 50 units/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 50 ㎛ β-머캅토에탄올(mercaptoethanol)이 첨가된 GlutaMAX (Invitrogen)와 함께 RPMI 1640 배지 내에서 0.3x 10⁶/㎖의 세포 밀도, 37℃ 온도 및 5% CO₂ 조건하에서 하룻밤 동안 배양하였다.

상기 스피에겔머는 1 mg/㎖ 우혈청알부민, 5 mM 프로베네시드 (probenecid) 및 20 mM HEPES (HBSS+)를 함유한 행크스 균형 염 용액 (Hanks balanced salt solution; HBSS)에서 0.2 ㎖ 저 양상 (low profile) 96-튜브 플레이트에서 37℃ 온도 하에서 15 내지 60분간 재조합 인간 MCP-1 (Bachem사)와 함께 배양하였다 (일명, "자극 용액 (stimulation solution)").

칼슘 지시제 염료(calcium indicator dye)로 로딩(loading)하기 위하여, 세포들을 300 x g의 속도로 5분간 원심분리를 수행하였고 ,4 ㎖ 지시약 염료 용액 (10 ㎛ 플루오-4 [Molecular Probes], 및 0.08% 플루로닉(pluronic)127 [Molecular Probes]HBSS+내)로 재현탁한 후에 37℃에서 60분간 배양하였다. 그리고, 11 ㎖의 HBSS+를 첨가하고 상기 세포들을 상기한 바와 같이 원심분리하고, 15 ㎖ HBSS+로 1회 세척한 후에 1.1x10⁶/㎖의 세포 밀도를 제공하기 위하여 HBSS+로 재현탁 하였다. 90 ㎕의 본 세포 현탁액을 흑색 96-웰-플레이트의 각 웰에 첨가하였다.

형광신호를 측정기기 (Fluostar Optima multidetection plate reader, BMG사)로 여기 파장 (485 nm) 및 방출파장 (520 nm)하에서 측정하였다. 몇가지 시료들의 평행 측정을 위하여 96웰-플레이트의 일렬(수직)의 웰들을 같이 측정하였다. 기준선을 결정하기 위하여 4초간의 지연시간을 갖고 최초 3회 측정을 수행하였다. 그리고 그 기록을 중단하고 플레이트들을 기기로부터 제거하였다. 다채널 피펫 (multi-channel pipette)을 이용하여, 10 ㎕의 자극 용액 (stimulation solution)을 상기 웰에 첨가하고 플레이트들을 다시 기기로 이동하고 측정을 속행하였다. 모두 합쳐, 4초 간격으로 20회의 기록을 수행하였다.

각 웰에서 최대 형광도 및 기저선 사이의 차이를 측정하고 MCP-1 농도 또는 스피에겔머들에 의한 칼슘 분비 억제실험에서는 스피에겔머 농도에 대하여 구도를 수행하였다.

인간 MCP -1에 대한 절반-최대 유효농도( EC ₅₀ )의 측정

다양한 농도의 hMCP-1에 의한 THP-1 세포의 자극 및 최대 및 기저 신호간의 차이를 구도화한 후에, 인간 MCP-1에 대한 용량-반응 곡선을 구한 결과, 절반-유효 농도 (EC₅₀)가 약 2-4 nM을 나타냄을 확인하였다 (도 11 참조). 이 농도는 추후의 스피에겔머에 의한 Ca⁺⁺-분비 저해 실험에 사용되었다.

설치류 MCP -1에 대한 절반-최대 유효농도( EC ₅₀ )의 측정

다양한 농도의 mMCP-1에 의한 THP-1 세포의 자극 및 최대 및 기저 신호간의 차이를 구도화한 후에, 설치류 MCP-1에 대한 용량-반응 곡선을 구한 결과, 절반-유효 농도 (EC₅₀)가 약 5 nM을 나타냄을 확인하였다 (도 33 참조). 이 농도는 추후의 스피에겔머에 의한 Ca⁺⁺-분비 저해 실험에 사용되었다.

실시예 6. 화학주성 어세이법에서 저해 농도의 측정

상기한 바와 같은 방법으로 성장한 THP-1-세포를 원심분리하고, HBH (1 mg/㎖ 우 혈청 알부민 및 20 mM HEPES를 포함하는 HBSS)로 1회 세척하고, 3x10⁶ 세포/㎖로 재현탁 되었다. 100 ㎕의 이 현탁액을 5 ㎛ 공극 크기를 갖는 트랜스웰 삽입물 (Transwell inserts; Corning, #3421)에 첨가하였다. 하층 분획에서 MCP-1을 상기 세포 첨가 전에 37℃에서 20 내지 30분간 600 ㎕HBH 중 다양한 농도의 스피에겔머와 함께 전배양 하였다. 세포들을 3시간 동안 37℃에서 이동토록 하였다. 그리고, 상기 삽입물을 제거하고 인산 완충성 식염수중 60 ㎕의 440 ㎕ 레사주린 (resazurin; Sigma)을 하층 분획에 첨가하였다. 2.5시간 동안 37℃에서 배양한 후에, 형광도를 측정기기 (Fluostar Optima multidetection plate reader, BMG사)로 여기 파장(544 nm) 및 방출파장 (590 nm)하에서 측정하였다.

다양한 농도의 인간 MCP-1로의 THP-1 세포의 이동 3시간 후에, 인간MCP-1에 대한 용량-반응 곡선을 구한 결과, 최대 유효 농도가 약 1 nM을 나타내고 그 이상의 고농도에서 감소된 활성화를 나타냄을 확인하였다 (도 14 참조). 추가적인 스피에겔머에 의한 화학 주성 저해 실험을 위하여, 0.5 nM의 MCP-1 농도를 실험에 사용되었다.

다양한 농도의 설치류 MCP-1로의 THP-1 세포의 이동 3시간 후에, 설치류 MCP-1에 대한 용량-반응 곡선을 구한 결과, 최대 유효 농도가 약 1-3 nM을 나타내고 그 이상의 고농도에서 감소된 활성화를 나타냄을 확인하였다 (도 35 참조). 추가적인 스피에겔머에 의한 화학 주성 저해 실험을 위하여, 0.5 nM의 설치류 MCP-1 농도를 실험에 사용되었다.

실시예 7. 표면 플라즈몬 공명 측정법( Surface Plasmon Resonance Measurement)에 의한 결합력 분석

7.1. NOX - E36 , 181-A2-018 및 mNOX - E36 의 특이성( Specificity ) 측정

바이아코아 2000 기기 (Biacore AB, Uppsala, 스웨덴)를 인간 MCP-1 및 관련 단백질에 대한 핵산의 결합력을 분석하는데 사용하였다. 아민기에 의하여 결합반응이 완성될 때에, 상기 단백질을 간섭하는 아민기들을 제거하기 위하여 1-2시간 동안 물에 대하여 투석을 수행하였다 (Millipore VSWP 혼합 셀룰로오스 에스테르; 공극 크기, 0.025 ㎛). 파이오니아 F1 (PioneerF1) 또는 CM4 센서 칩 (sensor chips; Biacore AB)을 5 ㎕/분의 유량 속도로 0.4 M NHS 및 0.1 M EDC의 1:1 희석액을 35-㎕ 주사를 함으로서 단백질 결합반응 전에 활성화 시킨다. 그리고, 케모카인(Chemokines)을 기기 반응이 1000 내지 2000 RU (상대적 단위) 범위 내에 도달시까지 2 ㎕/분의 유량 속도로 0.1-1.5 ㎍/㎖의 농도로 주사하였다. 미반응된 NHS 에스테르는 5 ㎕/분의 유량 속도로 35 ㎕의 에탄올 아민 염산 용액 (pH 8.5) 주사함으로서 비활성화시켰다. 상기 센서 칩을 결합 완충액 (binding buffer)으로 2배로 채우고 기저선이 안정될 때까지 약 1 내지 2시간 동안 10 ㎕/분으로 평형화시켰다. 모든 단백질을 위하여, 역학적 파라미터 (kinetic parameters) 및 해리 상수 (dissociation constants)를 선택용 완충액 (Tris-HCl, 20 mM; NaCl, 137 mM; KCl, 5 mM; CaCl₂,1 mM; MgCl₂,1 mM; Tween 20, 0.1% [w/v]; pH7.4) 중 다양한 농도 즉, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 및 0 nM농도로 연속적으로 스피에겔머를 주사함으로서 측정하였다.

모든 실험에서, 상기 분석은 37℃에서 10 ㎕/분의 유량 속도로, 180초의 결합 시간 및 360초의 해리 시간으로 한정하는 킨젝트 코멘드 (Kinject command)를 이용하여 수행되었다. 데이터 분석 및 해리 상수 (K_D) 계산은 랑무어 (Langmuir) 1:1 화학양론적 적정 알고리즘 (stochiometric fitting algorithm)을 이용한 소프트웨어 (BIAevaluation 3.0 software; BIACOREAB, Uppsala, 스웨덴)로 수행되었다.

7.1.1 NOX - E36 및 181-A2-018 (인간- MCP -1 특이적 핵산)

오직 인간 MCP-1을 위한 모든 센소그램 (sensorgrams)들이 도시되어 있다 (각각 도 17 및 도 20 참조); 기타 다른 단백질을 위한 125 nM 스피에겔머 농도로부터 수득한 센소그램만이 구체적으로 표시되었다 (도 18/19 및 도 21/22 참조).

상기 NOX-E36●hMCP-1 반응 분석: 재조합 인간 MCP-1를 제조업자의 지시에 따라 (아민 커플링 공정), 기기 반응이 1381 RU (상대적 단위)에 도달할 때까지 파이오니아 F1 센서 칩에 고정화하였다. 인간 MCP-1에 결합하는 NOX-E36에 대한 측정된 해리상수 (K_D)는 약 890 pM이었다 (도 17 참조).

상기 181-A2-018●hMCP-1 반응 분석: 재조합 인간 MCP-1를 제조업자의 지시에 따라 (아민 커플링 공정), 기기 반응이 3111 RU (상대적 단위; relative unit)에 도달할 때까지 CM4 센서 칩에 고정화하였다. 인간 MCP-1에 결합하는 181-A2-01에 대한 측정된 해리상수 (K_D)는 약 370 pM이었다 (도 20 참조).

NOX-E36 및 181-A2-018의 특이성(specificity)을 측정하기 위하여, 인간 에오탁신 뿐만 아니라 다양한 인간 MCP-1 계열 단백질을 파이오니아 F1 및 CM4 센서 칩 (hMCP-1, 1754 RU; hMCP-2, 1558 RU; hMCP-3, 1290 RU; 에오탁신, 1523 RU) 상에 고정화시켰다.

동력학적 분석 결과를 통하여 NOX-E36는 5-10 nM의 해리상수로 에오탁신 및 hMCP-2와 결합하며; hMCP-3는 인지하지 않았다 (도 18 및 24 참조). 반면에, 181-A2-018는 에오탁신, hMCP-2 및 hMCP-3와 결합하나 약간 낮은 친화도를 갖는다 (1020nM; 도 21 및 도 24 참조).

NOX-E36 및 181-A2-018간의 종간 교차-반응성 (cross-reactivity)은 파이오니아 F1 및 CM4 센서 칩 상에서 인간 (1460 RU), 원숭이 (1218 RU), 돼지 (1428 RU), 개 (1224 RU), 토끼 (1244 RU), 래트 (1267 RU), 및 마우스 (1361 RU) 유래의 아미노-커플링 (amino-coupling) 고정화 MCP-1을 이용하여 측정하였다. 동력학적 분석 결과, NOX-E36는 마우스, 래트 및 토끼로부터 유래된 MCP-1이 인지되지 않는 반면에, 0.89-1.2 nM의 상당한 해리 상수(K_D)로 인간, 원숭이, 돼지, 개 MCP-1와 결합하는 것으로 밝혀졌다 (도 19 및 24 참조). 181-A2-018는 돼지, 토끼 및 개 MCP-1과는 더욱 낮은 친화성으로 결합하는 데 반하여, 0.5-0.6 nM의 상당한 해리 상수(K_D)로 인간, 및 원숭이 MCP-1와 결합하는 것으로 밝혀졌다 (도 22 및 24 참조).

서로 상이한 종의 MCP-1 단백질 및 매우 근접한 인간 단백질 간에 백분율 상으로 동일한 아미노산 면에서 유사성 (homology) 및 서열들을 도 23에 도시하였으며; NOX-E36 및 181-A2-018에 대한 계산된 해리상수(K_D)를 관상 포르맷(tabular format)형으로 도시하였다 (도 24).

7.1.2 mNOX - E36 (설치류- MCP -1 특이적 핵산)

mNOX-E36의 결합 양상을 분석하기 위하여, 합성 비오틴화 설치류 D-MCP-1의 3759 RU (플로우 세포(flow cells) 3 및 비오틴화 인간 D-MCP-1 의 3326 RU 플로우 세포(flow cells) 4을 스트렙타비딘 접합 센서 칩 (Streptavidin conjugated sensor chip; Biacore AB, Freiburg, 독일)에 각각 고정화하였다. 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 및 0 nM의 mNOX-E36 압타머 (D-RNA) 용액을 180초의 결합 (association) 시간 및 360초의 해리 (dissociation) 시간으로 한정하는 킨젝트 코멘드 (Kinject command)를 이용하여 주사하였다. 비특이적 D-펩타이드인 플로우 세포 (Flow cell) 2를 상기 압타머의 비특이적 결합을 측정하기 위하여 고정화하는 반면에, 플로우 세포 1은 완충액 및 덱스트란 매트릭스 대조군 (dextran matrix control; Biacore SA-Chip 표면)으로 사용하였다. 도 42은 200-300 pM의 계산된 해리상수 (K_D)를 갖는 설치류 D-MCP-1과의 결합을 위한 상기 D-NOX-E36 동력학의 센소그램을 표시한다. mNOX-E36은 인간 D-MCP-1과 결합하지 않는다 (도 43 참조); 명료화하기 위해 125 nM 스피에겔머로 얻은 센소그램만을 표시하였다.

7.2 NOX - E36 의 선택성( selectivity ) 측정

NOX-E36의 선택성을 스트렙타비딘 (SA-칩)상에서 5’-비오틴화 NOX-E36을 고정화함으로서 표면 플라즈몬 공명 분석법(surface plasmon resonance analysis)로 측정되었다. 플로우셀(FC) 1에 대한 NOX-E36의 352 RU 및 FC 2에 대한 동일량의 5’-말단 비오틴화 비-기능성 대조 스피에겔머 (5’-terminal biotinylated non-functional control Spiegelmer; POC)를 스트렙타비딘/비오틴 결합에 의해 고정화되었다. FC3는 상기 덱스트란-(dextran) SA 센서 표면으로의 비특이적 결합을 측정하기 위한 표면 대조군 (surface control)으로 사용하였다.

모두 4개의 서브그룹 (subgroup; CC, CXC, CX3C 및 XC)로부터 유래되는 인간 케모카인의 100 nM 의 패널 (panel)을 360초간 주사하였으며 이 복합체를 10 ㎕/분의 유량속도 및 37℃의 온도하에서 해리시켰다. 상기 결합 (반응 1; 반응 정도) 및 해리 (반응 2; 반응 친화도) 이후의 반응 단위 (response unit)을 구도화하였다. 개개의 주사 후, 상기 칩 표면을 0.1% 트윈(Tween)과 1 M 염화나트륨으로 240초간 재생하였으며; 연속적으로 고정화된 스피에겔머를 생리학적 조건 (유출 완충액-running buffer) 하에서 2분간 재접힘(refold)를 수행토록 하였다. 개개의 케모카인은 3회에 걸쳐 반복주사하였다. CXCL1, CXCL2, CXCL6 및 CXCL9는 리보핵산 및 칩 덱스트란 표면에 비특이적으로 결합함을 나타내었다. 고정화된 NOX-E36에 대한 특이적 고-친화성은 CCL2/MCP-1, CCL8/MCP-2, CCL11/에오탁신, CCL3/MIP1α, 및 CXCL7/NAP-2에서만 검출되었다 (도 25 참조). MCP-2 및 에오탁신이 NOX-E 36와 결합된다는 사실은, 기능적 저해(functional inhibition) 시험관 내 시험법을 수행 또는 현재까지 확립된 실험 결과에 의하여 이러한 케모카인들과 MCP-1 상의 유사성(homology) 및 예측하지 못한 양성 CCL3/MIP-1α, 및 CXCL7/NAP-2 간의 유사성(homology)이 비교적 높은 각각 62 및 70%로 나타났다는 사실에 기인하여 놀라운 것은 아니다.

결론적으로, NOX-E36 및 CCL2/MCP1, CCL8/MCP2, CCL11/에오탁신, CCL3/MIP1α, CXCL7/NAP-2, CCL7/MCP-3 및 CCL13/MCP-4 간의 반응의 역학적 파라미터 (parameter) 는 “역전된 (inverted)”시스템에서 측정되었다. 여기에서, 상기 케모카인들은 고정화되고 유리형 (free) NOX-E36 을 주사하였다(보다 구체적 프로토콜은 7.1 참조). 동력학적 데이터는 도 26에 요약하였다.

7.3 시험관 내 항- MIP -1α 기능성의 측정

바이아코아 측정법 (Biacore measurement)으로 NOX-E36의 MIP-1α 과의 NOX-E36의 교차 반응성(cross reactivity)을 확인하였다. 기능성, 세포 배양-기초 시험관 내 어세이법을 적용함으로서, NOX-E36의 MIP-1α과의 미약한 바이아코아 결합이 기능성(functionality), 즉, 길항작용(antagonism)으로 해석된다면 검사해야 할 것이다.

이를 위해, THP-1 세포를 이용한 화학 주성 실험을 MIP-1α에 의하여 자극될 수 있는 지를 확인하기 위하여 수행하였다. 상기한 바대로 성장한 THP-1 세포를 원심분리하고, HBH (1 mg/㎖ 우 혈청 알부민 및 20 mM HEPES을 함유한 HBSS)로 재차 세척하고 3x10⁶세포/㎖로 재현탁 하였다. 100 ㎕의 이 현탁액을 5 공극크기의 트랜스웰 삽입물 (Transwell inserts; Corning, #3421)에 첨가하였다. 하층 분획에서, MIP-1a를 세포에 첨가하기 전에 37℃에서 20 내지 30 분 동안 600 ㎕ HBH 내에서 다양한 농도의 스피에겔머들과 전 배양하였다. 세포를 3시간 동안 37℃에서 이동하도록 하였다. 이후에, 상기 삽입물을 제거하고 인산 완충액 식염수 중 60 ㎕의 440 ㎛ 레자주린(resazurin; Sigma)을 상기 하층 분획에 첨가하였다. 2.5시간 동안 37℃에서 배양을 한 후에, 형광도를 측정기기 (Fluostar Optima multidetection plate reader, BMG사)로 여기 파장 (544 nm) 및 방출파장 (590 nm)하에서 측정하였다.

다양한 농도의 인간 MCP-1α로의 THP-1 세포의 이동 3시간 후에, 인간 MCP-1α에 대한 용량-반응 곡선을 구한 결과, 절반-유효 농도 (EC₅₀)가 약 1 nM을 나타내고 그 이상의 고농도에서 감소된 활성화를 나타냄을 확인하였다 (도 27 참조). 추가적인 스피에겔머에 의한 화학 주성 저해 실험을 위하여, 0.5 nM의 MCP-1α 농도를 실험에 사용되었다.

NOX-E36에 의한 화학 주성 저해를 측정하기 위한 시험을 0.5 nM MIP-1α로 자극함으로서 수행되었다. 명백하게, NOX-E36가 1 MIP-1α의 최고 시험 농도까지 화학 주성을 유도한 MIP-1α를 저해하지 않음을 확인할 수 있었다. 양상 대조군으로서, 자극제로서 MCP-1을 사용한 개개 시험을 평행하게 수행하였다 (도 28 참조).

실시예 8. 항- mMCP -1 스피에겔머에 의한 MRL ^lpr ^/ ^lpr 마우스에서의 루프스 -유사 질병의 치료

전염증 매개자 (proinfammatory mediator)를 차단하는 방법이 만성 염증 치료를 위한 성공적인 접근법이 되고 있다 (Steinman 2004). CC-케모카인들의 혈관내 공간에서 염증 부위로의 백혈구 순항을 매개하므로 TNF 및 인터류킨에 추가적으로 CC-케모카인들이 중요한 특이적 길항작용을 위한 후보물질로 알려져 있다 (Baggiolini 1998, Luster 2005). MCP-1 (=CCL2) 및 이의 개개 케모카인 수용체 CCR2는 전신 홍반성 낭창 (systemic lupus erythematosus)과 같은 임상적 명백한 증거와 같은 자가면역 세포 손상에 주요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있음은 매우 강력한 증거이다 (Gerard & Rollins 2001). 예를 들어, Ccl2 또는 Ccr2 유전자 중 하나가 결실된 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스는루프스-유사 (lupus-like) 자가면역증으로부터 보호된다 (Perez de Lema 2005, Tesch 1999). 따라서, 상기 CCL2/CCR2 축(axis)은 예를 들어, 루프스성 신장염 (lupus nephritis)과 같은 질환의 유망한 치료 목표로 대변될 수도 있다. 사실상, NH₂-절단형 (truncated) MCP-1의 원위치 (in situ) 제조 결과를 모두 나타내는 지연된 유전자 치료법 (delayed gene therapy) 또는 감염된 세포의 전달은 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스의 자가면역 조직 손상을 현격하게 감소시켰다. 그러나, 이러한 실험실적 접근법은 제어 불가능한 길항제 생성 및 종양 생성 때문에 인간에게는 사용될 수 없다 (Hasegawa 2003, Shimizu 2004). 그러므로, 생체 내에서 양호한 약물 동력학 양상을 갖는 신규 CCL2 길항제의 개발이 요구된다. 이러한 예로서, 상기 항-mCCL2 스피에겔머 NOX-E36 또는 mNOX-E36-3’PEG로 설치류 CCL2를 억제하는 방법이 루프스성 신장염 및 전신성 홍반성 낭창 (SLE)의 기타 발현 질환의 치료에 적절할 것이다. mCCL2 스피에겔머 치료법의 후발성은 치료학적 CCL2/CCR2 봉쇄(blockade)를 수반하는 임의의 기존 문제점과 독립적으로 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스에서의 루프스성 신장염 (lupus nephritis), 자가면역성 세기관지주위염(autoimmune peribronchitis) 및 루프스-유사 피부 질환(lupus-like skin diease)을 효과적으로 개선 시킨다.

실험 동물 및 실험 프로토콜( protocol )

10주령 암컷 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스를 회사 (Harlan Winkelmann, Borchen, 독일)에서 구입하여 12시간 주야 주기성의 정상 사육조건을 유지하였다. 물 및 표준 사료 (Ssniff, Soest, 독일)는 자유롭게 공급하였다. 14주째 날에, 12마리의 그룹들에게 5% 포도당 중 스피에겔머를 경피 주사를 주당 3회(주사용량, 4 ㎖/kg)로 하기 조성으로 수행하였다: mNOX-E36, 1.5 ㎛/kg; mNOX-E36-3’PEG, 0.9 ㎛/kg; 비기능성 대조 스피에겔머(nonfunctional control Spiegelmer) PoC (5’-UAAGGAAACUCGGUCUGAU GCGGUAGCGCUGUGCAGAGCU -3’), 1.9 /kg; PoC-PEG, 0.9 /kg; 담체(vehicle, 5 % 포도당). mNOX-E36 및 mNOX-E36-3'PEG의 혈장 수준을 주사 후 3 또는 24 시간 후에 각각 안와후 동 (retroorbital sinus)으로부터 매주 수집한 혈청 시료로 측정 하였다. 혈장 시료 중 스피에겔머 수준은 실시예 8에 개시된 샌드위치 혼성화 방법 (sandwich hybridization method)을 변형하여 측정되었다. 마우스들을 24주째 되는 시점에 경추 도살하였다.

전신성 루프스(systemic lupus)의 측정

피부 손상부위는 반정량적 점수법(semiquantitative score)으로 기록하였다 (Schwarting 2005). 총 체중대비 비장 및 장간막 림프절 덩어리의 중량비를 루프스-수반 리프증식증(lupus-associated lymphoproliferative syndrome)의 마커로 계산하였다. 혈액 및 소변 시료를 에테르 마취법으로 통상적인 마취조건하에서 안와후 정맥총으로부터 채혈함으로서 실험기간 말에 각 동물로부터 수집하였다. 혈액 및 소변 시료를 실험기간 말에 각 동물로부터 수집하였고 소변 알부민/크레아티닌 비율(albumin/creatinine ratio ) 및 혈청 dsDNA 자가항체 IgG 이소형 적정(isotype titer)를 기존문헌에 개시된 대로 측정하였다 (Pawar 2006). 사구체 여과율 (GFR)을 혈장 FITC-인슐린의 (Sigma-Aldrich, Steinheim, 독일) 청소 동력학법으로 24 주째에 단회 주사 볼루스 (single bolus injection)후 5, 10, 15, 20, 35, 60 및 90분에 각각 측정하였다 (Qi 2004). 형광도는 여기 파장 (485 nm) 및 방출 파장(535 nm)에서 측정되었다. GFR은 비선형 회귀곡선-적정 소프트웨어 (GraphPad Prism, GraphPad Software Inc., San Diego, CA)를 이용한 2-분획 모델을 기초하여 계산되었다. 혈청 사이토카인 수준은 상용키트 (ELISA kits for IL-6, IL-12p40; OptEiA, BD Pharmingen) 및 IFN-α (PBL Biomedical Labs, USA) 상용 ELISA 키트를 이용하여 측정되었다. 모든 마우스로부터, 신장 및 폐를 10% 완충화 포르말린으로 고정화시키고, 파라핀 침투과정을 거쳐 블록화하였다. 통상적인 염색법에 따라 (Anders 2002)은 및 피리오딕산-시프 염색법 (periodic acid-Schiff stain)을 위해 5-μm 섹션을 준비하였다. 신장 병변의 심각성은 인간 낭창 신장염을 위해 서술된 바대로 (Austin 1984년), 그 활성 및 만성도(chronicity)를 위한 지표로 사용하여 점수화하였고, 신장성 간질 상해의 형태계측(morphometry)은 이전에 개시된 바대로 수행하였다 (Anders 2002년). 세기관주위 염증의 정도를 0-4까지 반정량적으로 점수를 매겼다. 면역염색법을 위해, 포르말린-고정되고 파라핀-침투된 조직 단편을 탈왁스 (dewaxed) 및 재수화 (rehydrated)시켰다. 내인성 과산화 효소는 3% 수소 과산화물에 의해 억제되고 항원 복구(antigen retrieval)는 오토클레이브 오븐에서 항원 복구 용액 (antigen retrieval solution; Vector, Burlingame, 캘리포니아주)에서 수행하였다. 비오틴은 키트 (Avidin/Biotin Blocking Kit, Vector사)를 사용하여 억제하였다. 상기 슬라이드를 1시간 동안 1차 항체로 배양하고, 비오틴화(biotinylated) 2차 항체 (항-래트 IgG, Vector사)로 그리고 ABC 시약 (Vector사)로 배양하였다. 상기 슬라이드를 배양 단계 사이에 인산 완충액 식염수에서 세척하였다. 금속성 증진제 (metal enhancement)와 함께 3’- 3’디아미노벤지딘 (DAB, 시그마(Sigma)사, Taufkirchen, 독일)을 흑색 결과물을 초래하는 검출 시스템으로 이용되었다. 메틸 그린(methyl green)시약을 역상 염색시약으로 사용하였고, 슬라이드를 탈수 후 히스토마운트(Histomount; Zymed Laboratories사, 샌프란시스코, 캘리포니아주)에 장착하였다.

하기 1차 항체들을 사용하였다: 래트 항-Mac2 (대식 세포, Cederlane, 온타리오, 캐나다, 1:50), 항-마우스 CD3 (1: 100, 클론(clone) 500A2, BD), 항-마우스 IgG₁ (1: 100, M32015, Caltag Laboratories, Burlingame, 캘리포니아, 미국), 항-마우스 IgG_2a (1: 100, M32215, Caltag), 항-마우스 C3 (1: 200, GAM/C3c/FITC, Nordic Immunological Laboratories, Tilburg 네덜란드). 음성 대조군은 개개 이소형(isotype) 항체로 배양하였다. 정량적인 분석을 위하여, 사구체 세포를 각 단편(section)당 15개 피질성 사구체세포로 계측하였다. 사구체성 Ig 및 C3c 침착물을 15 피질성 사구체 단편 상에서 0-3 범위에서 점수화했다.

RNA 준비 및 실시간 정량 ( TaqMan ) RT - PCR

각 마우스로부터 얻은 신장세포를 액체 질소에서 급냉동시키고 -80°C에 저장하였다. 각 동물로부터, 문헌에 개시된 바대로 총 신장 RNA를 준비하고 역전사를 수행하였다 (Anders 2002). 프라이머 (primer) 및 탐침 (probe)은 회사(PE Biosys tems, Weiterstadt, 독일)에서 구입하였다. 사용한 프라이머 (300 nM)를 Ccl2 , Ccl5 및 d18S rRNA 검출에 사용하고 PE Biosystems사로부터 얻은 TaqMan 어세이 시약을 예비 전개를 수행하였다.

유체 세포측정법( Flow cytometry )

총 혈액 및 골수 견본 시료를 시험 종료시에 모든 군의 마우스로부터 수집하였다. 유체 세포측정법을 기기 (FACScalibur machine)를 이용하고 문헌에 개시된 바대로 MC21 항-mCCR2 항체로 특징화되는 방법에 따라 수행하였다 (Mack 2001). 비오틴화 항-래트 IgG 항체 (BD Biosciences)를 검출에 사용되었다. 래트 IgG_2b (BD Biosciences)를 이소형 (isotype) 대조군으로 사용하였다.

통계 분석

데이터는 SEM (평균± 평균의 표준 오차)으로 표시되었다. 그룹간의 비교는 단일변수통계법(univariate ANOVA)를 이용하여 수행하였다. 다중 비교를 위하여 보정법 (Posthoc Bonferroni 보정)을 사용하였다. p < 0.05의 수치를 통계학적 유의성을 갖는 것으로 간주하였다.

샌드위치 혼성화 어세이법( Sandwich Hybridistion Assay )

시료 중 스피에겔머의 양은 문헌 (PharmRes 17:1503)에 개시된 어세이법에 기초한 샌드위치 혼성화 어세이법에 의하여 정량화되었다. 혈액시료를 NOX-E36의 혈장 청소율을 측정하기 위하여 같이 수집하였다. 선택된 조직을 스피에겔머 농도를 측정하기 위하여 준비하였다.

혼성화 플레이트 준비

스피에겔머 mNOX-E36는 비-유효성 샌드위치 혼성화 어세이법(non-validated sandwich hybridisation assay)을 이용하여 정량화되었다. 요약하면, mNOX-E36 포획 탐침 (서열 번호: 281)을 0.5 M 나트륨 인산염, 1 mM EDTA, 4℃에서 하룻밤 동안 pH 8.5조건으로 0.75 mM 농도로 백색 DNA-BIND 96웰 플레이트 (Corning Costar, Wiesbaden, 독일)에 고정화시켰다. 웰들을 두번 세척하고, 1 mM EDTA 0.25 M 나트륨 인산염 중 0.5% w/v BSA로 37℃, 3 시간 동안 pH 8.5에서 차단하고, 다시 세척하고 사용 전까지 4℃에서 저장하였다. 혼성화 전에, 웰들을 37℃로 예비-가열하고 예비-가열된 세척 완충액 (3xSSC, 0.5% [w/v] 도데실 사르코시네이트 나트륨 (sodium dodecyl sarcosinate), pH 7.0; 이전에 20 x 스톡(stock) [3M NaCl, 0.3M Na₃Citrate)으로 도데실 사르코시네이트 나트륨없이 제조하고 희석함)으로 두 번 세척하였다.

시료 준비( sample preparation )

모든 시료는 이중으로 분석되었다. 혈장 시료들을 얼음으로 해빙하고, 교반 (vortexed)하고 냉각된 탁상 원심분리기에서 간단히 원심분리 하였다. 조직 균질화액을 실온에서 해빙하고 실온에서 최대속도로 5분간 원심분리 하였다. 각 시료 중 5 ㎕만 분석을 위해 취하고, 이후 보관을 위해 냉장고에 보관했다. 시료들을 하기 조건에 따라, 실온에서 혼성화 완충액 (세척용 완충액 중 8 nM mNOX-E36 검출 탐침 (서열 번호: 282)으로 희석하였다:

1:30 5 ㎕ 시료 + 145 ㎕ 혼성화 완충액

1:300 20 ㎕ 1:30 + 180 ㎕ 혼성화 완충액

1:3000 20 ㎕ 1:300 + 180 ㎕ 혼성화 완충액

1:30000 20 ㎕ 1:3000 + 180 ㎕ 혼성화 완충액

모든 시료 희석을 분석하였다. mNOX-E36 표준을 0-4 nM 범위를 자동화하는 8-점 검정 곡선으로 연속 희석하였다. 어떤 QC 시료도 준비되고 분석되지 않았다. 교정용 표준은 연구용 (in-study) 시료들의 데이터와 동일하였다.

혼성화 및 검출 ( hydridisation and detection )

시료를 95℃에서 10 분간 가열하고 37℃로 냉각시켰다. 스피에겔머/검출 탐침 복합체를 37℃에서 30분간 포획 탐침을 고정화하기 위하여 어닐링(annealing)시켰다. 비결합 스피에겔머은 세척용 완충액 및 1xTBST (20 mM Tris-Cl, 137 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.5)으로 각각 세척하여 제거하였다. 혼성화된 복합체를 1xTBST 중에서 1:5000로 희석된 스트렙타비딘 알칼리성 포스파타제 (streptavidin alkaline phosphatase)로 실온에서 1시간 동안 검출하였다. 비결합 접합체를 제거하기 위하여, 웰들을 1x TBST, 20 mM Tris Cl, 1 mM MgCl₂로 pH 9.8에서 다시 세척하였다. 웰들을 최종적으로 100 ㎖ CSDP 기질 (Applied Biosystems, Darmstadt, 독일)로 채우고 실온에서 45분간 배양하였다. 화학발광법 (Chemiluminescene)은 측정기(FLUOstarOptima microplate reader; BMG Labtechnologies, Offenburg, 독일) 상에서 측정되었다.

데이터 분석

후술하는 분석용 시료 희석법을 정량적 데이터 분석을 위해 사용되었다:

래트 EDTA 플라스마 1:2000

담체군 (vehicle group; 스피에겔머가 투여되지 않은 군)으로부터 얻은 데이터는 배경 신호로서 공제되었다.

본원에서 개시된 바와 같이, 상기 샌드위치 혼성화 어세이법을 또한 개개 NOX-E36 포획 탐침 (서열번호: 255) 및 개개 NOX-E36 검출 탐침 (서열번호: 256)을 사용한 (데이타 무), 스피에겔머 NOX-36, NOX-E36-5’-PEG 및 NOX-E36-3’-PEG에도 유사한 방법으로 사용되었다.

결과

mNOX - E36 -3' PEG 는 MRL ^lpr ^/ ^lpr 마우스의 생존율 및 신장병을 개선한다

암컷 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스는 인간에서의 미만성 증식성 루프스 신장염과 극히 유사한 유사성을 갖는 증식성 면역성 복합체가 발병하고 결국 사망하게 된다. 이러한 치료학적 연구 구도에서, 처치된 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스는 PEG화(pegylated) 및 비PEG화 (unpegylated) 항-mCCL2 스피에겔머, PEG화 및 비PEG화 대조용 ("PoC")-스피에겔머 또는 담체로 14주 내지 24주령 마우스에 처치되었다. 이 시점에서, 담체군, PoC 또는 PoC-PEG-처치 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스들은 사구체성 대식세포 침투, 사구체 및 간질성 Mac2-양성 대식세포 및 간질성 CD3-양성 임파구로 의한 사구체성 대식세포 침투 및 혼합형 사구체 주위 및 간질성 염증성 세포 침투를 특징으로 하는 미만성 증식성 사구체염을 나타냈다 (도 39 및 40 참조). mNOX-E36-3’PEG는 신장 염증의 전술한 마커(marker)들 (도 40 참조)뿐만 아니라 루프스 신장염의 활성 및 만성도 지수(chronicity index)를 향상시켰다. 상기 비PEG화 분자 mNOX-E36는 만성도 지수 및 간질성 대식세포 및 T 세포 산출수 면에서 덜 효과적이다 (도 40 참조). 진행된 만성 신장 질환은 담체군 투여, PoC- 및 PoC-PEG-처치 마우스에서 간질성 (interstitial) 섬유증의 확대된 영역으로 보다 더 상세하게 설명된다 (도 39 참조). 이러한 변화를 정량화하기 위한 형태계측 (morphometry)를 적용한 결과, PEG화 및 비PEG화 mNOX-E36들이 간질성 부피, 튜브성 세포 손상 및 튜브성 팽창 및 만성 신장 질환의 심각성 및 예후를 위한 모든 마커(marker)들을 감소시킴을 확인 할 수 있었다 (도 41 참조). 비PEG화 mNOX-E36가 아닌 mNOX-E36-3'PEG만이 50% 치사율을 개선시켰다 (도 42 참조). 따라서, mNOX-E36-3’PEG는 신장 대식 세포의 수 및 T 세포 침투를 감소시킬 수 있고, MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스의 루프스성 신장염 및 (신장) 생존율을 개선시켰다. mNOX-E36 및 mNOX-E36-3’PEG의 처치가 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스에서의 신장내 염증에 영향을 미치는가의 여부를 연구하기 위하여, 실시간 RT-PCR를 신장성 질환의 진행중에 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스의 신장에서의 점진적으로 상위-조절되는 것으로 이전에 나타난, 염증전구성 케모카인 (proinflammatory chemokines) CCL2 및 CCL 5의 발현 수준을 결정하기 위해 수행되었다 (Perez de Lema 2001). 14 주 내지 24주 동안 mNOX-E36 및 mNOX-E36-3’PEG의 처치는 담체-처치 대조군에 비하여 CCL2 및 CCL5 mRNA의 신장 발현을 감소하였다 (도 43 참조).

항- CCL2 스피에겔머는 MRL ^lpr ^/ ^lpr 마우스에서의 신장세포외성 자가면역성 조직 상해를 감소시킨다

피부 및 폐도 또한 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스의 자가 면역성 조직 상해에도 공통적으로 영향을 받았다. 담체-처치된 (vehicle-treated) 마우스에서, 자가면역성 폐 질환은 중등 세기관 주위성 및 혈관주위성 염증 세포 침투가 특징으로 나타나고 피부 장애는 마우스에서 60%의 감소를 나타냈다 (도 44, 45 및 40 참조). mNOX-E36 및 mNOX-E36-3’PEG는 모두 각각 담체군(vehicle), PoC 및 PoC-PEG-처치된 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스와 비교하여 세기관 주위성 염증 및 피부 질환을 감소시켰다 (도 44, 45 및 40 참조). 따라서, CCL2-특이적 스피에겔머의 영향은 루프스성 신장염에 제한되지 않고 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스에서의 자가 면역성 조직 상해의 또 다른 명백한 증거까지 미친다.

MRL ^lpr ^/ ^lpr 마우스에서의 mNOX - E36 및 임파증식성 증후군 ( lymphoproliferative syndrome), dsDNA 자가 항체 및 혈청 사이토카인 수준

암컷 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스는 자궁 경관, 겨드랑이, 서혜부, 및 장간막 임파선의 집중 비종 및 덩어리 형성이 특징인 임파선 증식성 증후군 (lympho proliferative syndrome)이 전개된다. mNOX-E36 및 mNOX-E36-3’PEG는 모두 MRL^lpr/lpr마우스의 비장과 임파선의 무게에 아무런 영향을 미치지 않았다 (도 46 참조). MRL^lpr ^/ ^lpr마우스의 자가면역은 dsDNA를 포함한 다중 핵 항원에 대한 자가 항체 생산으로 특징화 된다. 24 주령 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스 혈청에서, dsDNA IgG, IgG₁, IgG_2a 및 IgG_2b 자가 항체가 높은 수준으로 존재하였다. mNOX-E36 및 mNOX-E36-3’PEG는 모두 이러한 DNA 자가항체들의 어떠한 항체에도 영향을 미치지 않았다 (도 46 참조). 담체-처치 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스에서의 루프스-양 질환(Lupus-like disease)은 상승된 혈청 수준의 IFN-α, IL-12p40 및 IL-6이 특징화 되었다. mNOX-E36 및 mNOX-E36-3’PEG는 모두 이러한 염증성 매개자의 어떠한 것에도 영향을 미치지 않았다 (도 46 참조). 따라서, 모든 mNOX-E36 변형체들은 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스상의 임파증식(lymphoproliferation), 항-dsDNA IgG 생산 및 혈청 사이토카인 수준에 영향을 미치지 않는다.

M RL ^lpr ^/ ^lpr 마우스의 mNOX - E36 및 mNOX - E36 -3' PEG 의 혈장 수준

mNOX-E36 및 mNOX-E36-3’PEG 혈장 수준은 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스의 진행성 신장 질환 중 약물 노출을 감시하기 위하여 1주 간격으로 측정하였다. 주입 3시간 이후의 mMOX-E36 및 주입 24시간 이후의 mNOX-E36-3'PEG의 중앙 혈장 수치는 시험중 내내 각각 약 300 nM 및 1 ㎛으로 나타났다 (도 47 참조). 따라서, PEG화 (pegylation)는 mNOX-E36의 혈장 수준을 증가시키고 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스의 진행성 신장 질환은 양 스피에겔머들의 약물 동력학을 조절하지 않았다.

mNOX - E36 -3' PEG 는 골수로부터 얻은 단핵세포의 이주를 차단한다

세균성 감염 도중 골수로부터의 단핵세포의 이주 (emigration)는 케모카인 수용체 CCR2와 관련된 것으로 알려져 있으나 (Serbina 2006), 자가면역증 환경에서 CCL2의 역할은 가설상으로만 남아있다. 그러므로, 24주령 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스의 mNOX-E36-3’PEG- 및 담체-처치군상의 마우스의 말초혈관 및 골수상의 CCR2-양성 단핵세포의 분포가 검사되었다. mNOX-E36-3’PEG의 처치는 26% 내지 11%까지 말초혈관의 이들 분포를 감소시키는 데 반하여, 13% 내지 26%까지로 골수상의 CCR2 양성 세포의 백분율을 증가시켰다 (도 48 참조). 이러한 데이터는 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스의 자가면역증 질환 중 골수로부터 CCR2 양성세포의 침투를 위한 CCL2의 역할을 뒷받침한다.

개요

스피에겔머 기술을 적용함으로서, 시험 관내 및 생체 내에서 mCCL2를 강력하게 차단하는 신규 및 특이적인 mCCL2 길항제를 창제하였다. 실제로, CCL2 스피에겔머 처치의 늦은 개시는 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스의 진행된 자가면역성 조직 상해를 현격하게 개선하였다. 이러한 데이터는 CCL2의 만성 염증 조직 상해상의 중추적인 역할을 뒷받침해주고 CCL2 스피에겔머의 자가면역성 조직 상해를 위한 신규 치료제로서 역할을 확인해 준다.

실시예 9. 항- mMCP -1 스피에겔머에 의한 일측성 신적출 당뇨성 마우스에서의 당뇨병성 신병증의 치료

당뇨병성 신병증은 엔지오텐신-의존성 병리기전의 목표화가 항상 질병 진행을 억제하지 않기 때문에 최종-단계의 신장 질환의 주요 요인으로 알려져 있다 (Zimmet 2001; Ritz 1999; 미국 신장 자료 체계 (United States Renal Data System 2004; Svensson 2003). 그러므로, 당뇨병성 신병증을 위한 치료적 병기에 또 다른 처치 전략이 추가로 요구된다.

최근 실험적인 연구 결과는 당뇨병성 신병증의 진행이 신장 내 염증과 관련됨이 알려져 있다 (Galkina 2006; Mora 2005; Meyer 2003; Tuttle 2005). 예를 들면, 미코페놀에이트 모페틸 (mycophenolate mofetil), 메토트렉세이트 (metho trexate) 또는 방사선 조사는 스트렙토조토신-유도 당뇨병성 신병증을 갖는 래트의 소변 알부민 배출, 및 사구체경화증을 감소시킨다 (Yozai 2005; Utimura 2003). 당뇨병성 신병증에서의 신장 내 염증의 분자적 및 세포적 기전은 아직 불명확하게 특정화되었다. 당뇨병성 신병증을 갖는 환자는 염증의 급성 상 마커 (acute phase marker)의 증가된 수준을 갖고 있으나 신장 내 염증을 나타내지 않을 수 있다 (Dalla Vesta 2005; Navarro 2003). 당뇨병성 신병증을 갖는 환자는 신장 내 염증에 보다 특이적일 수 있는 소변상의 CC-케모카인 단핵세포 화학주성 단백질 (MCP-1/CCL2)의 높은 수준을 분비한다 (Morii 2003; Tashiro 2002; Takebayashi 2006). 실제로, MCP-1/CCL2는 어느 것이든 고수준의 포도당 농도 또는 진전된 당화 최종산물 (advanced glycation end products)에 노출된 인간 사구체 간질세포에 의해 발현된다 (Ihm 1998; Yamagishi 2002). CCL2는 혈관 내에서 혈관 외 격실, 즉, 사구체 및 신장 간극으로의 백혈구 순항의 복잡한 다단계 과정과 관련된다 (Baggiolini 1998). 실제로, 대식 세포 침투는 인간 및 실험적 당뇨병성 사구체경화증 및 튜브성간극성 상해 (tubulointerstitial injury)상에 공통적인 현상이다 (Bohle 1991; Furuta 1993; Chow 2007). Ccl2-결핍 1형 또는 2형 당뇨병 마우스는 보다 약한 사구체성 상해를 수반하는 보다 적은 사구체성 대식세포 측정수를 갖는다 (Chow 2004; Chow 2006). 이러한 연구에서, 1 형 및 2형 당뇨병성 신병증의 사구체 병인학에 있어서의 CCL2의 기능적 역할도 또한 증명되었다. 따라서, CCL2는 당뇨병성 신병증을 위한 잠재적인 치료학적 목표를 대표할 수도 있을 것이고 양호한 약동력학적 양상을 갖는 적합한 CCL2 길항제가 이 질병 치료에 유효해야 할 것이다. 이 실시예에서 우리는 진행된 당뇨병성 신병증을 갖는 2형 당뇨병 db/db 마우스에서의 PEG화 항-CCL2 스피에겔머 mNOX-E36-3’PEG의 효과를 보고한다. 우리는 또한 항-CCL2 스피에겔머가 당뇨병성 신병증의 치료에 적합할 것을 확인하였다.

실험동물 및 실험 프로토콜( Protocol )

웅성 5 주령 C57BLKS db/db 또는 C57BLKS 자연형 (wild-type) 마우스를 회사 (Taconic, Ry, 덴마크)에서 구입하고 시험의 지속을 위해 음식 및 물을 제한없이 공급하고 12시간 주/야간 사이클 (cycle)로 필터 톱 케이지(filter top cage)에서 합숙시켰다. 케이지, 침구, 둥지, 음식 및 물을 사용 전에 고압가마 (autoclave)에서 소독해서 살균되었다. 6주령의 일측성 신적출군 (“1K" 마우스) 또는 허위 수술군 ("2K" 마우스)을 db/db 및 자연형 마우스에서 이전에 개시된 대로 1 cm 측면 절개를 통해서 수행되었다 (Bower 1980). 상기 허위 수술군의 마우스들은 신장을 본래 장소에 정치시켰다. 10주 후에, 4개월령 1K db/db 마우스를 5% 포도당 (투여량, 0.9 ㎛/kg; 주사 부피, 1 mg/kg)중 mNOX-E36-3'PEG 또는 PoC-PEG로 주당 3회 경피 주사한 군들로 구분하였다. 이 처치를 실험동물들을 희생시키고 조직을 조직병리학적 검사를 위해 수득한 시점에 8주간 (6개월령이 될 때까지) 지속하였다. 모든 실험적인 절차는 지방 정부 기관의 승인하에 수행되었다.

당뇨병성 신병증의 평가

모든 면역 조직학적 검사를 문헌에 개시된 바대로 파라핀-함침된 단편상에서 수행되었다 (Anders 2002). 후술하는 항체들을 1차 항체로 이용하였다: 래트 항-Mac2 (사구체성 대식 세포, Cederlane, 온타리오, 캐나다 1:50), 항-Ki 67 (세포 증식, Dianova, 함부르크, 독일, 1:25). 조직병리학적인 평가를 위해, 개개 마우스로부터 얻은 신장 절편을 인산-완충화 식염수로 고정화하고 파라핀으로 함침하였다. 3 ㎛-절편을 과염소산-시프(periodic acid-Schiff) 시약 또는 은으로 공급업체의 지시에 따라 염색하였다 (Bio-Optica, 밀라노, 이탈리아). 사구체 경화성 병변을 하기와 같이 맹검자에 의하여 반정량적 점수법을 이용하여 평가하였다: 각각 0 = 병변 없음, 1 = <25% 경화도, 2 = 25- 49% 경화도, 3 = 50-74% 경화도, 4 = 75- 100% 경화도. 15개의 사구체 세포를 절편당 분석되었다. 간극 부피 및 튜브성 팽창의 지수는 전에 개시된 바대로 10개의 비-중첩 피질 영역(non-overlapping cortical fields)상에 100점의 격자 (grid)를 중첩하여 결정하였다 (Anders 2002). 간질성 세포 측정수는 맹검자에 의해 15 고자장 영역 (hpf, 400x)에서 결정되었다. RNA 준비 및 실시간 정량 (TaqMan) RT-PCR는 탈파라핀화된 (deparaffinized) 사구체 세포로부터 수행되었다. 용해성 완충액 (10 mM Tris HCl, 0.1 mM EDTA, 2% SDS 및 20 ㎍/ml 단백질 가수분해 효소 K)중 60℃에서 16시간 동안 배양 후에, 페놀-클로로포름-기초 RNA 추출법 (phenol-chloroform-based RNA extraction)을 수행하였다. 사구체 RNA는 10 ㎕ RNAse 제거 물에 용해되었다. 총 기관 및 사구체성 RNA로부터 역전사 및 실시간 RT-PCR를 수행하였다 (Anders 2002, Cohen 2002). ddH₂O로 이루어져 있는 대조군은 표적 (target) 및 하우스키퍼 (housekeepers) 유전자에 대하여 음성이었다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 (Oligonucleotide primer, 300 nM) 및 mCcl2, Gapdh 및 18S rRNA를 위한 탐침 (100 nM)을 회사 (PE. Primers)로부터 얻은 TaqMan 어세이용 시약으로 미리 전개시켰고 탐침은 회사 (ABI Biosystems, Weiterstadt, 독일)에서 구입하였다. 사구체 여과율 (GFR)은 단회 볼러스 주사 (bolus injection)후 5, 10, 15, 20, 35, 60 분에 혈장 FITC-이눌린 (Sigma-Aldrich, Steinheim, 독일)의 청소 역학으로 측정되었다 (Qi 2004). 형광도는 485 nm 여기 파장 및 535 nm 방출파장에서 측정되었다. GFR는 비선형 회귀 곡선-적정 소프트웨어 (GraphPad Prism, GraphPad Software Inc., 샌디에고, 캘리포니아)를 이용한 2-분획상 모델 (two-compartment model)형에 근거하여 산출되었다. 모든 데이타는 평균± SEM으로 표현되었다. 군의 비교는 ANOVA를 사용하여 수행되었고, 포스트-혹 본페로니 보정법 (post-hoc Bonferroni's correction)을 다중 비교를 위해 사용되었다. p<0.05 수치를 통계적인 유의성을 갖는 것으로 간주하였다.

결과

mNOX - E36 -3' PEG 는 일측성 신적출성 db / db 마우스상의 사구체 대식 세포 측정수 및 구형 사구체경화증 ( global glomerulosclerosis )을 감소시킨다

기능적인 CCL2의 부족이 db/db 마우스에서의 사구체성 대식세포 순항을 수반하고 (Chow 2007), mNOx-E36’PEG가 시험관 내 및 생체 내 시험에서 CCL2-매개성 대식세포 순항을 차단할 수 있을 때, mNOX-E36’PEG는 진행된 2 형 당뇨병성 신병증을 갖는 db/db 마우스에서의 신장 대식 세포 순항을 손상해야 한다. 이러한 가설을 시험하기 위하여, 우리는 mNOX-E36-3’PEG 또는 PoC-PEG로 4주령의 일측성 신적출성 1K db/db 마우스에 피하 주사함으로써 시작했다. 처치는 조직들을 당뇨병성 신병증의 검사를 위해 수집되는 시점까지 지속 되었다. 이 시험기간 중, mNOX-E36-3'PEG 처치는 비 당뇨병성 BLKS 마우스 (데이타 무)에 비교하여, db/db 마우스의 모든 군에서 모두 현격하게 상승 되었던 혈구 또는 혈소판 측정수, 혈중 포도당 수준 또는 체중에 유의적으로 영향을 미치지 않았다. 흥미롭게도, mNOX-E36-3’PEG는 db/db 마우스의 CCL2의 혈청 수준을 증가시켰으며, 이는 CCL2 길항제가 순환중 CCL2를 보유함을 의미한다 (도 49 참조). 우리의 가설과 일치하게, mNOX-E36-3’PEG는 mNOX-E36-3’PEG-처치 db/db 마우스상의 낮은 수준의 사구체 내 Ki-67 양성 증식성 세포를 수반하는, PoC-PEG- 또는 담체-처치 db/db 마우스와 비교하여 사구체성 대식세포를 40%로 감소시켰다 (도 50 참조). 이러한 결과는 1K db/db 마우스의 구형 당뇨병성 사구체경화증의 유의 적인 개선효과를 수반함을 의미한다. 사실상, mNOX-E36-3’PEG-처치는 동일 연령의 비-신적출성 (2K) db/db 마우스에 사구체성 경화증이 나타날 때까지 1K db/db 마우스의 당뇨병성 사구체경화증을 감소시켰다 (도 51 참조). 이러한 시험결과는 mNOX-E36-3’PEG로 CCL2-의존성 사구체 대식세포 순항의 지체된 차단이 2 형 db/db 마우스의 구형 당뇨병성 사구체경화증을 저해함을 확인하였다.

mNOX - E36 -3' PEG 는 1K db / db 마우스에서 GFR 를 개선한다

1K db/db 마우스의 당뇨병성 사구체경화증 치료에 있어서의 mNOX-E36-3’PEG 처치의 유리한 효과는 보다 더 나은 GFR이 수반되어야 한다. 우리는 db/db 마우스에서 GFR 마커로서 FITC-이눌린 청소 역학을 분석하였다 (Qi 2004). db/db 마우스에서 보통 약 250 ㎖/분의 GFR을 나타내는 데 비하여, 우리는 PoC-PEG로 주사한 6개월령 1K db/db 마우스에서 112± 23 ㎖/분의 감소된 GFR을 나타냄을 확인하였다 (도 52 참조). mNOX-E36-3’PEG 처치는 1K db/db 마우스에서 231±30 ㎖/분 (p<0.001)의 GFR로 유의적으로 개선된 효과를 나타냈으며, 이는 CCL2-의존성 사구체 대식세포 순항의 차단이 또한 2형 당뇨병성 마우스에서 신장 기능을 또한 개선시킬 수 있음을 의미한다.

mNOX - E36 -3' PEG 는 1K db / db 마우스상의 간질 대식세포( interstitial macrophage ) 측정수 및 튜브성간질( tubulointerstitial ) 상해를 감소시킨다

인간의 진전된 당뇨병성 신병증은 간질 대식세포 및 튜브성 간질의 유의적인 숫자를 수반한다 (Bohle 1991). 2K db/db 마우스에서, 간질성 대식세포 침투 및 유의적인 튜브성 간질 상해는 8개월령 전에는 나타나지 않는다 (Chow 2007). 초기 일측성신적출 (uninephrectomy)은 db/db 마우스의 튜브성 간질성 병리의 진행을 촉진시키며 (Ninichuk 2005), 결국 우리는 6개월령 마우스 모든 군에서 튜브성 간질 상해의 마커로서 정량화된 간질성 대식 세포, 튜브성 팽창 및 간질 부피를 정량화했다. 이 시점에서, 1K db/db 마우스는 2K db/db 마우스에 비교하여, 증가된 수의 간질성 대식세포 및 튜브성 팽창 및 간질성 부피의 유의 적인 상승을 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 50 및 도 53 참조). mNOX-E36-3' PEG는 1K db/db 마우스에서 간질성 대식세포 수를 53%로 감소시킬 뿐만 아니라 튜브성 팽창 및 간질성 부피를 감소시켰다 (도 50 및 도 53 참조). 따라서, CCL2-의존성 신장 대식세포 순항의 차단은 또한 2형 당뇨병성 db/db 마우스상의 튜브성 간질 상해를 방지한다.

mNOX - E36 -3' PEG 는 1K db / db 마우스에서의 Ccl2 의 신장 발현을 감소시킨다

대식 세포 침투는 조직 상해, 즉, 국소 CCL2 발현에 대한 염증성 반응을 증폭시킨다. 따라서, 우리는 신장 대식 세포에서의 mNOX-E36-3’PEG-관련 감소경향이 보다 적은 CCL2 발현을 수반하는 것으로 가정할 수 있었다. 우리는 db/db 마우스에서의 CCL2의 mRNA 발현을 정량화하기 위하여 실시간 RT-PCR을 사용하였다. mNOX-E36-3’PEG는 동일-연령의 PoC-PEG-처치 마우스와 비교하여 6개월령 1K db/db 마우스의 신장에서의 CCL2 mRNA 수준을 감소시켰다 (도 54 참조). CCL2의 공간적 발현을 보다 더 측정하기 위하여, 우리는 신장 절편상에 CCL2 단백질을 위한 면역염색법을 수행하였다. 1K db/db 마우스에서, CCL2의 발현은 2K db/db 또는 2K 자연형 마우스와 비교하여, 사구체, 튜블 (tubuli) 및 간질성 세포 (interstitial cells)에서의 현격한 증진을 나타냈다 (도 55 참조). mNOX-E36-3’PEG는 담체성- 또는 PoC-PEG-처치 1K db/db 마우스에 비교하여 모든 이 분획 (compartment)에서 CCL2 염색을 현격하게 감소시켰다. 이러한 데이터는 mNOX-E36-3’PEG의 CCL2-의존성 신장 대식세포 순항의 차단이 1K db/db 마우스에서의 CCL2의 국소적 발현을 감소시킴을 의미한다.

요 약

염증이 인간 당뇨병성 신병증의 진행에 기여한다는 개념이 점차적으로 수용되고 있고 (Tuttle 2005), 잠재적 목표로서의 MCP-1/CCL2를 불러오는 것이 이러한 질병을 치료한다는 점이 중점화되었다. 이러한 실시예에서, 우리는 mNOX-E36-3'PEG로 일측성 신적출 당뇨병성 마우스의 치료는 6 개월령 마우스에서 사구체 (및 간질성)의 대식세포수를 감소시키고 보다 적은 증식성 사구체 세포를 수반함을 나타냈다. 추가로, CCL2 mRNA의 신장/사구체성 발현은 mNOX-E36-3’PEG 처치로 현격하게 감소됨을 확인할 수 있었다. 게다가 치료군에서 적은 수의 사구체성 대식세포 및 사구체성 증식 세포가 구형 사구체 경화증의 보호 및 사구체 여과율 (GFR)의 유의적인 개선을 수반하였다. 당뇨병성 마우스에서의 사구체 병인학 및 신장 기능에 대한 mNOX-E36-3’PEG의 유리한 효과는 사구체성 상해의 기타 모델에서의 또다른 CCL2 길항제를 이용한 실험결과와 일치하였다 (Lloyd 1997. Hasegawa 2003, Tang 1996, Wenzel 1997, Fujinaka 1997, Schneider 1999). 현저하게, CCL2 차단의 지연된 시발은 또한 1K db/db 마우스에서의 보다 적은 튜브성간질 병리 (tubulointerstitial pathology)를 수반하는, 적은 수의 간질성 대식세포를 나타냈다.

또한, 이러한 데이터는 CCL2가 당뇨병성 신병증을 위한 유망한 치료학적 목표로서 입증되는 것이고 스피에겔머로 CCL2 차단을 개시 (질병의 보다 진행된 단계에서 마저)에서도 보호적일 수 있음을 의미한다.

실시예 10: mNOX - E36 -3’- PEG 은 MRL ^lpr ^/ ^lpr 마우스에서의 미만형 증식성 낭창성 신염 및 폐렴을 대조군에 비하여 시클로포스파미드의 용량 감소를 허용한다.

인간 미만형 증식성 낭창성 신염(약어 DPLN)의 조절에는 시클로포스파미드 (약어 CYC) 또는 미코페놀레이트 모페틸 (약어 MMF)에 의한 강력한 면역억제제 작용이 요구된다. 상기 약물 각각은 심각한 이환율 및 사망률을 수반한다 (Appel 2007). 대부분의 심각한 부작용 및 사망은 CYC 및 MMF의 비특이적인 면역 제어적 효과에 기인한 감염증과 관련된다 (Appel 2007). 자가면역성 염증을 특이적으로 차단하는 신규 약물은 CYC 및 MMF을 대체하거나 또는 상기 약물을 조합하여 사용시 유의 적인 용량 감소에 의하여 현재 사용중인 치료요법상의 독성을 감소시킬 수 있다.

MCP-1 및 이의 수용체인 CCR2가 전신 홍반성 낭창 (약어. SLE)의 증상과 같은 자가 면역성 손상에서 주요한 역할을 담당함이 실험적 연구를 통하여 밝혀졌다 (Gerard 2001). 예를 들어, 실험적 SLE를 유발한 MCP-1 또는 CCR2-결핍 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스가 DPLN으로부터 보호된다는 것이 입증되었다 (Perez 2005; Tesch 1999). 단독요법으로서 항-mMCP-1 스피에겔머 mNOX-E36-3’-PEG에 의한 MCP-1 차단으로 인한 유리한 효과는 암컷 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스에 의한 생체 내 시험에서 이미 입증되었다: 14주령 마우스부터 10주간 mNOX-E36-3’-PEG를 처치한 경우에 DPLN 증상을 실시예 9에 나타난 바와 같이 유의적으로 개선시켰다. 비록 그 치료효과가 명백하게 밝혀졌음에도 불구하고, mNOX-E36-3’-PEG 의 효력이 CYC 또는 MMF의 효력과 어떻게 비교될 것인가에 대해서는 명백하지 않다. 최대 용량의 CYC와 동등한 치료효과가 -면역계를 효과적으로 억제하는- 저용량 CYC 및 mNOX-E36-3’-PEG와의 조합의 효과에 이를 수 있는가라는 가설을 입증하기 위하여, 두 번째 생체 내 연구를 수행하였다.

동물 및 실험 계획

7주령 암컷 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스를 회사(Harlan Winkelmann; Borchen, 독일)에서 구입하여 12시간 명암 사이클로 정상 사육조건하에서 사육하였다. 물 및 표준 사료 (Ssniff, Soest, Germany)를 자유로이 섭취하도록 하였다. 14주부터 마우스에 하기와 같은 시료를 주사하였다: (A), 5% 포도당 경피주사 (담체군: vehicle group); (B), 0.89 ㎛/kg PEGy화 대조 스피에겔머 revmNOX-E36 경피주사; (C), 0.89 ㎛/kg mNOX-E36-3’-PEG 경피주사(s.c); (D), 30 mg/kg/4주 CYC 복강투여 (CYC 저(low)투여군); (E), 30 mg/kg/week CYC 복강투여(i.p) (CYC 고(high)투여군); (F), 0.89 ㎛/kg mNOX-E36-3’-PEG 및 30 mg/kg/4주 CYC (조합투여군) 및 (G), 100 mg/kg/day MMF 경구투여 (Roche, Mannheim, 독일). 모든 담체 및 스피에겔머를 3x/주로 주사를 하였다. 마우스를 10주간 처치 종료시점에 경추도살 하였다. 모든 실험 과정은 독일 동물 보호법 (German animal care) 및 윤리 강령(ethics legislation)에 따랐으며 지방 정부 승인하에 수행되었다.

전신성 루프스 ( systemic lupus ) 평가

총 체중에 대한 비장 및 장간막 림프절(mesenterial lymph nodes) 중량비를 루프스-수반 림프증식성 중후군(lupus-associated lymphoproliferative syndrome)의 지표로서 계산되었다. 뇨 알부민(Urine albumin)/크레아티닌(creatinine) 비율을 이전에 개시된 바대로 측정하였다 (Pawar 2006). 모든 마우스로부터, 신장 및 폐를 10% 완충화 포르말린으로 고정화하고, 가공하고 파라핀으로 함침하였다. 과염소산-시프(periodic acid-Schiff) 염색을 위한 5 ㎛-절편을 하기 통상 프로토콜(protocols)에 따라 준비하였다 (Anders 2002). 신장 손상의 심각도를 인간 낭창성 신염에 대하여 개시된 바와 같이 그 활성 및 만성도에 대한 지수를 이용하여 등급화하였다 (Austin1984). 기관지 주변 염증 심각도는 맹검 관찰자에 의하여 반정량적으로 0-4으로 등급화하였다. 면역적염색법을 이전 문헌에 따라 수행하였다 (Anders 2002). 하기 1차 항체들을 사용하였다: 래트 항-Mac2 (대식세포, Cederlane, Ontario, 카나다, 1:50), 항-마우스 CD3 (1:100, clone 500A2, BD). 음성대조군(Negative controls)은 개개 이형 항체들과 배양하는 단계를 포함시켰다. 양성 사구체 세포들을 개개 절편당 15개 피질 사구체세포 수로 판독하였다. 간질 세포들을 고자장 (약어. hpf)로 판독하였다.

통계 분석

데이터는 평균치(mean)의 평균 기준 오차(mean standard error)로서 표시하였다 (약어 SEM). 군간의 비교는 단변수(univariate) ANOVA을 이용하여 수행하였다. 보정법 (Posthoc Bonferroni’scorrection)을 다중 비교 (multiple comparison)를 위하여 사용하였다. p < 0.05 수치는 통계학적 유의성을 갖는 것으로 간주하였다.

mNOX - E36 -3’ PEG 를 추가한 치료법은 MRL ^lpr ^/ ^lpr 마우스 신장질환에 대한 CYC 매달 처치에 의한 효과를 개선시킨다 .

암컷 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스는 인간에 있어 DPLN과 유사하게 증식성 면역 복합체 사구체신염 (proliferative immune complex glomerulonephritis)으로 진전된다. MRL^lpr/lpr마우스를 14 내지 24주부터 CYC, MMF, 스피에겔머 또는 담체(vehicle)로 처치하였다. 이는 14주령 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스가 4.1±1.1의 활성 점수 지수(activity score index)를 나타내는 DPLN를 나타내므로 치료학적 치료 프로토콜을 대표한다. 이 연령에서, 간질성 분획(tubulointerstitial compartment)상의 주요 기형이 부재(나타나지 않음)이다. 치료 10주 후에, 담체- 및 대조군 스피에겔머-처치 MRL^lpr/lpr 마우스는 사구체 세포증식증 (glomerular hypercellularity), 사구체 매트릭스 확장(expansion of glomerular matrix), 국소성 속모 괴사증(focal tuft necrosis) 및 사구체주변성 및 간질성 염증 세포 침윤증 복합증상을 수반하는 DPLN 증상을 나타냈다. 주당 CYC 및 월당 CYC 및 mNOX-E36-3’-PEG 복합투여는 낭창성 신염의 활성 및 만성도 지수를 개선시키는 데 동등하게 강력한 효과를 나타냈다 (도 56 및 57). MMF 뿐만 아니라 mNOX-E36 및 저용량 CYC 단독 투여군은 덜 강력하였으나 낭창성 신염의 활성 및 만성도 지수를 개선 시키는데 유의 적인 효과를 나타냈다. 따라서, 월단위 CYC-기반 투여처방에 mNOX-E36-3’-PEG을 조합하는 것은 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스의 DPLN에 대한 주당 CYC 치료법과 거의 동등하게 강력한 효과를 나타낸다.

mNOX - E36 및 월단위 CYC 투여는 MRL ^lpr ^/ ^lp 마우스 신장에서 면역세포 침윤 감소 효과를 상승시키는 효과를 갖는다.

면역세포 침윤은 낭창성 신염에서의 신장 손상에 기여하고 (Vielhauer 2006) MCP-1은 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스 (Tesch 1999)에서의 T 세포 및 대식세포의 순항을 매개한다. 따라서, mNOX-E36-3’-PEG/월별 CYC 조합치료법에 의한 상승효과는 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스에서의 손상된 대식세포 및 T 세포 순항과 연관되는 것으로 가정하였다. 면역적염색법에 의한 사구체 및 간질성 대식세포 및 간질성 T 세포 (Mac2+ 대식세포 및 CD3+ T 세포) 수의 측정은 의 주당 CYC 및 월당 CYC 및 mNOX-E36와의 조합치료가 MRL^lpr/lpr 마우스 신장에서의 간질성 Mac2+ 대식세포뿐만 아니라 사구체 숫자를 감소시키는데 있어 동등하게 강력한 효과를 갖는다는 것이 밝혀졌다 (도 58 및 59). MMF뿐만 아니라 mNOX-E36-3’-PEG 및 월당 CYC 단독치료는 덜 강력하나 모든 분획에서의 대식세포를 유의적으로 감소시켰다 (도 58 및 59). 동일한 결과가 간질성 CD3 양성 T 세포 숫자 면에 있어서도 밝혀 졌다 (도 3E). 따라서, MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스의 신장 병리에 대한 mNOX-E36-3’-PEG 및 월당(monthly) CYC의 상승효과는 주당(weekly) CYC에 대한 효과와 유사하게 사구체 대식세포뿐만 아니라 간질성 대식세포 및 T 세포에 대한 유의적인 감소효과를 수반한다.

mNOX - E36 -3’ PEG 및 월당 CYC 투여는 MRL ^lpr ^/ ^lpr 마우스에서의 폐 손상 감소에 대하여 상승효과를 나타낸다.

자가면역성 기관지주위염(Autoimmune peribronchitis)은 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스에서의 루프스-유사 전신성 자가면역증의 또 다른 증상이다. 주당 CYC 투여는 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스에서의 폐손상을 조절하는 데 있어서 월당 CYC 투여보다 보다 효과적이다. 그러나, 월당 CYC 및 mNOX-E36의 조합투여는 주당 CYC 투여와 유사한 효과를 나타냈다 (도 61). 놀랍게도, MMF는 MRL^lpr ^/ ^lpr 마우스에서의 폐 손상에 영향을 미치지 않았다.

요약

상기 데이터는 mNOX-E36 및 저-용량 CYC와의 조합투여법은 14주령 (자가면역성 조직 손상이 이미 확립된 시점)에서 개시되고 (Tesch 1999; Perez 2001), MRL^lpr/lpr 마우스에서의 DPLN 및 폐 손상을 억제하는데 고용량 CYC와 거의 동등한 효과를 나타냄을 입증한다. 결론적으로, CYC와의 조합에 의한 MCP-1의 저해는 DPLN과 같은 자가면역성 조직 손상의 동등 효력의 조절작용을 나타냄에도 CYC의 심각한 면역독성적 효과를 회피하는 유의 적인 CYC 용량 감소효과를 허용한다. 이러한 새로운 개념은 DPLN 및 MCP-1 의존성 면역세포 침윤과 연관되는 자가 면역성 질병의 기타 심각한 증상을 겪는 환자의 심각하고 잠재적으로 치명적인 CYC 독성을 감소시키는데 도움을 줄 수 있을 것이다.

실시예 11: COPD 검색 연구 - MCP -1 결합 스피에겔머 mNOX - E36 -3’ PEG 처치에 의한 폐로의 세포성 침윤 감소

만성 기관지 질환의 이질성군으로는 만성 기관지염, 만성 폐색성 폐 질환 (약어. COPD) 및 천식을 포함한다. COPD 및 천식 환자의 폐 조직 소견은 대식 세포 및 과립구, 주로 COPD인 경우는 호중구 및 천식인 경우는 호산구의 현저한 기도 침윤을 나타낸다. 임상연구에서, 이러한 염증성 매개변수(parameters)들은 비특이적 자극에 대하여 폐기능 저하 및 악화된 기관지수축 (기도 과반응증; 약어. AHR)과 관련되는 것으로 나타났다. COPD의 만성 염증을 모방하고, 수일에 걸친 폐 기능 검사를 만족시키고 호중구 증가증(neutrophilia) 및 AHR을 수반하는 점액성 과분비증을 자극하는 생체 내 시험 모델이 별로 없다. 래트/인간에 대한 지질다당류(약어. LPS)의 일회성 노출은 급성 폐 호중구 증가증 및 AHR를 야기하는 것으로 밝혀졌다. LPS 흡입은 COPD와 유사한 추가적인 증상, 즉, 폐 기능상의 진행성 저하, 지속적인 AHR, 및 산화 질소 과형성증과 함께, 기관지 폐포 액에서의 호중구성 염증 세포 증식과 같은 증상을 야기한다. 염증성 세포 활성화 순항 및 LPS로부터 유래 되는 매개체들은 상피성 증식, 침투성 및 점성 과분비성 표현형 (mucus hypersecretory phenotype)을 유도하는 것으로 판단된다.

본원에서 개시된 연구에서, 박테리아 LPS를 이용한 도전 모델(challenge model)은 래트의 LPS 유도성 폐염증 모델에서 MCP-1 결합 스피에겔머 mNOX-E36-3’-PEG의 치료효과를 평가하는 데 사용되었다. 모든 동물들은 급성 호흡기성 염증을 유도하기 위하여 LPS로 도전되었다. 다양한 용량의 MCP-1 결합 스피에겔머 mNOX-E36-3’-PEG, 덱사메타손 (약물학적 참고 물질 1), 및 로플루밀라스트(Roflumilast) (약물학적 참고 물질: pharmacological reference substance 2)에 의한 치료학적 간섭을 수행하였다.

덱사메타손은 스테로이드 호르몬 중 글루코코르티코이드 계열의 강력한 합성 물질군이다. 이는 면역억제제일 뿐만 아니라 항염증제로서 작용한다:

(I) 항-염증(anti-inflammatory): 글루코코르티코이드(glucocorticoids)는 리포코로틴(lipocortin-1; annexin-1) 합성을 유도하고, 이는 세포막과 결합하여 포스포리파제(phospholipase) A2가 이의 기질인 아라키돈 산과 접촉하는 것을 방해한다. 이는 소실된 에이코사노이드(eicosanoid) 생성을 초래한다. 시클로옥시게나제 (COX-1 및 COX-2 모두) 발현도 제어되며, 이는 그 작용을 증강 시킨다. 환원하면, 염증에서 주요 2가지 산물인 프로스타글란딘(prostaglandins) 및 류코트리엔(leukotrienes)은 글루코코르티코이드의 작용으로 저해된다. 또한 글루코코르티코이드 (Glucocorticoids)는 리포코르틴(lipocortin)-1의 세포 외 공간으로의 이동을 자극하며, 이는 백혈구 막 수용체와 결합하여 하기와 같은 다양한 염증성 사건들(inflammatory events)을 저해한다: 상피성 부착(epithelial adhesion), 이동 (emigration), 화학주성(chemotaxis), 식균작용 (phagocytosis), 호흡성 파열 (respiratory burst), 및 호중구, 대식세포 및 비만세포로부터의 다양한 매개체들 (리소솜 효소(lysosomal enzymes), 시토킨(cytokines), 조직 플라스미노겐 활성화제(tissue plasminogen activator), 케모카인(chemokines) 등)들의 분비.

(II) 면역억제 (immunosuppressant): 글루코코르티코이드(glucocorticoids)는 세포-매개 면역성을 억제한다. 이들은 다수 시토킨(cytokines) 유전자, 이중 가장 중요한 유전자는 IL-2 유전자를 억제함으로서 작용하며, 이는 결국 T-세포 증식을 감소시킨다. T 세포 증식을 저해하는 것에 추가적으로, 또 다른 잘 알려진 효과는 글루코코르티코이드 유도성 세포사멸(apoptosis)이다. 상기 효과는 아직 흉선에 존재하는 미성숙한 T 세포보다 현저하고 말초성 T 세포에도 영향을 미친다. 결론적으로, 글루코코르티코이드는 체액성 면역(humoral immunity)을 억제하고, 이는 B 세포가 보다 적은 양의 IL-2 및 IL-2 수용체를 발현하도록 유도한다. 이는 B 세포 클론 증식 및 항체 합성 모두를 감소시킨다. 상기 감소된 IL-2 양은 또한 보다 적은 수의 T 임파구 세포가 활성화되도록 유도한다.

로플루밀라스트(Roflumilast)는 포스포디에스테라제 효소(phosphodiesterase enzyme) PDE-4의 선택적으로 장기-작용성 저해제로 작용하는 약물이다. 이는 항염 효과를 갖고 천식, 만성 폐색성 폐질환 및 페기종과 같은 폐의 염증성 증상 치료를 위해 경구 투여 약물로서 개발 중이다. 로플루밀라스트가 임상시험에서 효과적인 것으로 확인되었으나, 이는 오심, 설사 및 두통을 포함하는 부작용으로 사용상의 제약이 있으며 개발은 임상적 효력을 유지하면서 부작용 발생을 최소화하는데 주력하고 있다.

동물 및 사육

LPS-유도성 염증의 잘 확립된 실험모델인 수컷 스프라그 도울리 래트(Sprague Dawley rats)를 본 실험에 사용하였다. 상기 래트는 회사(Harlan Winkelmann, Borchen, Germany)의 5주령을 공급받아 사용하였고 7주령에 실험에 착수하였다. 동물은 케이지 (Makrolon(polycarbonate)cages; 케이지 당 2마리 래트)에서 사육하고 통상적인 실험 사육조건을 유지하였다. 케이지 및 잠자리(softwood bedding material; Ssniff 3/4, Soest, 독일)는 1주당 2회 교체하였다. 동물 사육실의 온도 및 상대 습도는 전기적으로 조절하고 연속적으로 기록하였다. 온도 및 상대습도의 한계는 각각 22 ± 2℃ 및 55 ± 15 % 으로 조절하였다. 12-시간 명/암 주기를 자동 시간 측정장치로 광 조절에 사용하였다. 펠렛(pellet) 형태의 상용 사료를 식이로 사용하였다 (Ssniff R/M-H V1534, Ssniff-Spezialdiaten, Soest, 독일). 식이 및 식수 (Stadtwerke Hannover)를 자유롭게 섭취하도록 했다.

동물을 2주간 적응시키고 무작위화(randomization) 및 1차 감작화 전에 사육 환경에 순화토록 하였다. 시험에 사용된 동물은 이들의 건강한 조건상의 쇠퇴에 대한 어떠한 신호도 나타내지 않았다. 모든 동물은 매일 케이지에서 관찰되었다.

재료

MCP -1 결합 스피에겔머 mNOX - E36 -3’P EG

mNOX - E36 -3’- PEG 에 대한 담체 : 주사용 5 % 포도당 용액

LPS : 대장균(Escherichia coli 0111:B4; Sigma/Aldrich, Batch No. 76K4085)으로부터 분리된 지질다당체(Lipopolysaccharide), 사용 용액은 매 적용 일에 새롭게 제조하였다.

약물학적 참고 물질 (1): 덱사메타손 디히드로겐포스팟 나트륨 (Dexameth asone dihydrogenphosphat sodium;, Ratiopharm Batch No. H22416) 4 mg/㎖ 용액. 스톡 용액(stock solution)을 7일간 개봉 전까지 냉장고에서 보관하였다. 사용 용액을 매 적용 일에 새롭게 제조하였다.

약물학적 참고 물질 (2): 로플루밀라스트 (선택적 PDE4 저해제, Batch No. K429927). 사용 용액을 매 적용 일에 새롭게 제조하였다.

덱사메타손에 대한 담체 : 둘베코 인산 완충 염(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline; 약어. DPBS) - Ca++ 및 Mg++ 무첨가 0.0095 M (PO4)

시험 수행과정

모든 동물은 제 1차 감작화 전에 체중을 측정하고 무작위화 하였다: 이들의 체중을 고려하여 각군당 10마리씩 균일하게 분배하였다. 그룹중 분배 후에, 평균 체중의 평균값 및 표준 편차(±SD)를 검사하고 각 군뿐만 아니라 개개 그룹 내에서 20% 이하였다. 각 동물의 체중을 측정하고 개별적으로 기록하였다.

시험 1일째, LPS 도전을 흡입법을 수행하여 약 2.93 ㎍ LPS의 축적 용량이 되도록 하였다. 양성 및 음성 대조군의 동물들을 LPS 도전 (양성 대조군) 또는 청정 대기 허위 도전(sham challenge; 음성 대조군) 1시간 전에 담체 (5% 포도당)로 정맥주사 투여를 하였다. 약물학적 대조군 (1) 동물에게는 복강투여로 LPS 도전 18시간 및 1시간 전에 2 mg/kg 덱사메타손을 투여하고; 약물학적 대조군 (2) 동물에게는 위관영양 삽입법으로 동물당 600 ㎍ 로플루밀라스트를 투여하였다. MCP-1 결합 스피에겔머 mNOX-E36-3’-PEG을 이용한 치료를 LPS 도전 1시간 전에 정맥 주사로 4가지 상이한 용량으로 투여되었다 (0.02 mg/kg; 0.2 mg/kg; 2 mg/kg; 20 mg/kg).

도전 24 시간 이후에, 동물들을 과량의 펜토바비탈 나트륨(pentobarbital sodium)으로 무통적으로 희생시키고 기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar lavage; 약어 BAL)을 회수하였다. 동물의 폐를 빙냉 0.9% NaCl 5.0 ㎖로 매회 5회 세척하였다. BAL의 측정을 위해, 1차 세척액의 상등액을 원심분리에 의한 침강법 이후에 할당하였다. 이후에, 모든 세척액으로부터 얻은 세포들을 회수하고 회수하자마자 원심분리하였다 (1,200 U/min속도로 10분간). 세포들을 1 ㎖ PBS로 재현탁하고 판독기(Casyoell counter)로 자동으로 판독하였다. 세포반점(Cytospots)을 준비하고 다양한 세포 판독을 위해 파펜하임(Pappenheim)으로 염색하였다. 폐 속 염증 상태를 각 세포 반점당 400 세포의 총 개수를 판독함으로서 대식세포/단핵세포, 호중구, 호염기구 및 임파구 수를 포함하여 분석하였다.

통계 방법

그룹간 유의적 차이를 시험하기 위하여, 비-매개변수성(non-parametric) 시험법을 수행하였다. 다중 비교법을 위해 (> 2 그룹), 아노바 시험법 (Anova test) 및 비-매개변수성 던네트(non-parametric Dunnett) 시험법을 수행하였다. p < 0.05 의 차이를 유의적으로 간주하였다.

결론

BAL 중 총 세포수는 예상대로 양성대조군에 비교하여 음성 대조군에서 유의적으로 감소하였다. 20 mg/kg MCP-1 결합 스피에겔머 mNOX-E36-3’-PEG에 의한 처치는 총 세포 수를 BAL 중 양성대조군의 41% 감소시켰다. 덱사메타손을 이용한 처치법은 세포 수의 71% 감소를 유도한 데 반하여, 로플루밀라스트는 어떠한 유의 적인 효과가 나타나지 않았다 (도 62 참조).

흡입성 LPS 도전은 BAL에서 71.8% 호중구 과립구를 나타내는 호중구증가증으로 대표되는 폐의 염증을 유발하였다. 음성대조군인 비처치된 동물의 폐 세척액은 어떠한 호중구 과립구도 포함하지 않았다. 덱사메타손 및 2 또는 20 mg/kg MCP-1 결합 스피에겔머 mNOX-E36-3’PEG을 이용한 처치는 호중구상의 유의적으로 감소된 수를 초래했다. 이미 2 mg/kg mNOX-E36-3’PEG 는 호중구 수를 약 42% 감소시켰고 20 mg/kg mNOX-E36-3’PEG 는 호중구 수를 약 48% 감소시켰다. 로플루밀라스트 처치는 양성 대조군에 비교하여 폐 세척액 중 절대적 및 상대적 호중구에 영향을 미치지 않았다(도 63 참조).

결론

BAL 중 분화 세포 판독 결과는 폐에서의 급성 LPS 유도성 염증 반응을 확실히 유도하였음을 확인시켰다. LPS 도전된 래트에서의 덱사메타손에 의한 치료적 처치는 유의적으로 LPS에 대한 노출 후 염증 반응을 방지하는 것으로 보였다. 또한 유의 적인 치료학적 효과가 동물의 MCP-1 결합 스피에겔머 mNOX-E36-3’-PEG에 의한 처치로 나타났다. 본원에서 나타난 데이터에 기초하여, MCP-1 결합 스피에겔머들은 만성 호흡기성 질환, 바람직하게는 COPD의 단독 또는 조합치료법, 바람직하게는 덱사메타손과의 조합치료법으로 사용되기에 효과적이다. MCP-1 결합 스피에겔머의 덱사메타손과의 조합치료법은 COPD와 같은 만성 호흡기성 질환을 치료하기에 2개의 독립적인 작용기전의 장점을 발휘할 수 있게 한다.

실시예 12: 실험적 페 고혈압에서 MCP -1 결합 스피에겔머 mNOX - E36 의 효과

본원에 개시된 바와 같은 연구는 래트에서의 모노크로탈린(monocrotaline) 유도성 폐 고혈압의 확립된 실험 모델에서의 혈액동력학(hemodynamics) 및 리모델링(remodeling)에 미치는 영향을 측정하기 위하여 수행되었다.

폐 동맥성 고혈압 (Pulmonary arterial hypertension; 약어 PAH)은 휴식기 평균 폐 동맥압 (= 20 mmHg)의 상승, 혈관성 리모델링 (remodelling) 및 우 심실 비후증 (hypertrophy)으로 정의된다. 1차성 폐 고혈압 (primary pulmonary hyper tension, 약어 PPH)이라고도 지칭되는 특발성 PAH는 치료하지 않고 방치시에는 3년 이내에 젊은 여성에게 있어 심부전에 의한 사망을 초래한다. 상기 질환의 심각성에 대한 핵심은 폐 동맥성 평활근 세포(pulmonary artery smooth muscle cells; 약어 PASMCs)의 증식 및 이동으로 특징 되는 폐 혈관성 리모델링이다. 신생내막성 병변 (Neointimal lesions)이 내피세포증식의 결과로서, PAH의 진행된 단계에서 관찰될 수도 있다. 관찰된 병적 상태는 질병 진행에 역할을 수행하는 성장인자 및 염증성 매개물들의 동시다발적 조절부전을 나타내는, 저절로 계속 순환될 잠재성이 있다.

폐 고혈압 설치류 모델로서의 모노크로탈린( Monocrotaline )

본 모델은 프로스타노이드 (prostanoids), 포스포디에스테라제 저해제(phosphodiesterase inhibitors) 및 엔도텔린 수용체 길항제 (endothelin receptor antagonists)를 포함한, 임상적 폐 고혈압 치료를 위한 모든 최근 치료법들의 임상적 유효성을 성공적으로 예측하였다. 추가적으로, 이는 PAH의 모든 예방적 및 회복적 연구를 위한 기회도 제공한다. 모노크로탈린(Monocrotaline) 실험 모델에서, 래트에게 단일 경피주사로 피롤리지딘 알칼로이드 독소 (pyrrolizidine alkaloid toxin)인 모노크로탈린을 주입한다. 상기 독소는 3-4주 후에 현격한 폐 고혈압을 유발하는 염증성 폐 혈관병증 (inflammatory pulmonary vasculopathy)을 야기한다. 이러한 모델을 위한 판독대상은 우 심실압 (right ventricular pressure), 전신 혈압 (systemic pressure), 우심실(right ventricle) /좌심실 (left ventricle) + 중격 중량 비(septum weight ratio (RV/[LV + S])) 및 폐 혈관성 리모델링 (pulmonary vascular remodeling)을 포함한다.

동물

성체 수컷 스프라그 도울리 래트 (Sprague Dawley rats; 300-350 g 체중)를 회사(Charles River Laboratories; Sulzfeld, 독일)로부터 구입하였다. 실험은 실험동물 사용에 대한 국제 보건 기구 지침(National Institutes of Health Guidelines on the Use of Laboratory Animals)에 따라 실험을 수행하였다.

실험 포로토콜

생존시 과정( In - life procedure ): 모노크로탈린 (약어 MCT; Sigma, Deishofen)를 1 M HCl에 용해시키고, 1 M NaOH로 pH 7.4로 적정하고 상술한대로 60 mg/kg 체중의 용량으로 단회 경피 주사법으로 투여하였다. 대조군 래트는 동량의 등장성 염수를 투여했다.

만성 간섭 연구 ( chronic intervention studies ), MCT 주사 래트는 주당 3회 경피투여로 플라세보(placebo)로서 5% 포도당 (n = 10) 또는 MCP-1 결합 스피에겔머 mNOX-E36-3’-PEG (n = 10, 2 및 20 mg/kg 2개 용량으로 각각) 로 나누었다. 치료는 폐 고혈압이 완전하게 정립되는 시점- MCT 주사 후 3주에 개시하였다. 동물은 추가로 2주간, 즉, 전체적으로 6회 주사로 처치되었다. 35일째, 혈액동력학적 매개변수들을 측정하고 조직을 준비하였다.

혈액동력학 ( Haemodynamics ): 혈액동력학적 매개변수를 측정하기 위하여 래트들을 마취시켰다. 이후로, 래트들은 실험 동안 혈관미주신경성 부작용을 최소화하기 위하여 아트로핀을 근육주사(250 ㎍/kg body mass) 하였다. 래트들을 기관절개하고 60/분의 빈도로 공기를 주입시켰다. 양성 말단 배기압 (Positive end expiratory pressure)을 1 cm H2O으로 조절하였다. 좌측경동맥에 동맥압 측정을 위해 캐눌러를 꽂고, 우측심장 카테터 (right heart catheter)를 유체 충만 힘 변환기(fluid filled force transducers)를 이용하여 우심실압 측정을 위하여 우측 목정맥을 통하여 삽입하였다.

조직 준비: 피를 뽑은 후, 폐를 폐 동맥을 통하여 22 cm H2O의 고정압에서 등장성 염수로 충진하였다. 우측 폐를 허파문에서 결찰하고, 액체 질소로 냉동시키고, -80℃에 저장하였다; 좌측 폐엽을 폐 동맥을 통하여 22 cm H2O 의 압력으로 고정화액(Zamboni's fixative)으로 5분간 관류시켰다. 조직을 12시간 동안 4℃에서 포르말린(4 %)으로 고정하고 0.1 M 인산 완충액으로 옮겼다.

우측 심장 비후증 측정 (Right heart hypertrophy assessment): 우심실 비후증을 측정하기 위하여 심장을 제거하고 절개하였다. 좌심실 및 중격 중량 대비 우 심실 중량비 (RV/(LV+S)0을 계산하였다.

통계 분석

모든 데이터는 평균±SEM으로 표시하였다. 그룹간 차이는 다중비교법을 위한 아노바 (ANOVA) 및 시험법( Student-Newman-Keuls post-hoc test)으로 계산되었다.

결과

예측된 바대로, MCT/플라세보(placebo)-처치 동물은 건강한 동물들에 비하여 우측 심장 비후증 면에서 놀랍고 통계학적으로 유의적인 증가를 나타냈다. MCT/ 플라세보-처치 동물은 약 0.61의 RV/(LV+S) 수치를 나타낸 반면에 건강한 래트는 단지 약 0.23 수치를 나타냈다. 플라세보 대신에 MCP-1 결합 스피에겔머 mNOX-E36-3’PEG 투여는 MCT-처치 동물에게 mNOX-E36의 2 mg/kg 투여시는 약 0.39 및 20 mg/kg 투여시는 약 0.45의 유의적으로 감소된 우측 심장 비후증을 나타냈다 (도 64 참조).

우측 심장 비후증 결과와 일치하게, MCT/플라세보-처치 래트에서의 측정된 우 심실 수축기 압력은 69 mmHg (건강한 동물, 29 mmHg)으로 증가하였다. 플라세보(placebo) 대신에 MCP-1 결합 스피에겔머 mNOX-E36-3’-PEG를 처치한 경우에 mNOX-E36-3’PEG의 2 mg/kg 투여시는 약 46 mmHg 및 20 mg/kg 투여시는 약 49 mmHg의 유의적으로 감소된 우심실 수축기 압력을 나타냈다 (도 65 참조).

결론

MCT/플라세보 처치 동물에서의 우 심장 비후증 및 우 심실 수축기 압력에 대한 실험결과로 MCT에 의한 폐 동맥 교혈압 유도가 확인되었다. MCT-처치 래트에 대한 MCP-1 결합 스피에겔머 mNOX-E36-3’-PEG의 처치는 우 심장 비후증 및 우 심실 수축기 압력 모두를 유의적으로 저해하였다. 따라서, MCP-1 결합 스피에겔머는 폐 고혈압 치료에 대한 유망한 약제이다.

본원 명세서, 청구항 및/또는 도면에 개시된 본 발명의 특징은 모두 각각 개별적으로 및 조합되어 다양한 형태로 본 발명을 실현하기 위한 재료가 될 수 있을 것이다.

<110> NOXXON Pharma AG <120> MCP-1 binding nucleic acids and use thereof <130> DIFI/PA1011/KH <150> EP07023267.3 <151> 2007-11-30 <160> 286 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 76 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr 1 5 10 15 Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr 20 25 30 Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala 35 40 45 Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Met 50 55 60 Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr 65 70 75 <210> 2 <211> 125 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Gln Pro Asp Ala Val Asn Ala Pro Leu Thr Cys Cys Tyr Ser Phe Thr 1 5 10 15 Ser Lys Met Ile Pro Met Ser Arg Leu Glu Ser Tyr Lys Arg Ile Thr 20 25 30 Ser Ser Arg Cys Pro Lys Glu Ala Val Val Phe Val Thr Lys Leu Lys 35 40 45 Arg Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Lys Glu Trp Val Gln Thr Tyr Ile 50 55 60 Lys Asn Leu Asp Arg Asn Gln Met Arg Ser Glu Pro Thr Thr Leu Phe 65 70 75 80 Lys Thr 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uu 52 <210> 244 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCP-1 binder <400> 244 ggcgacauug guugggcaug aggcgaggcc cuuugaugaa uccgcggcca 50 <210> 245 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCP-1 binder <400> 245 gcugguuacc gagggggcgu cguuggaguu ugguugguug ucaccagc 48 <210> 246 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCP-1 binder <400> 246 cugguuaccg agggggcguc guuggaguuu gguugguugu caccag 46 <210> 247 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCP-1 binder <400> 247 ugguuaccga gggggcgucg uuggaguuug guugguuguc acca 44 <210> 248 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCP-1 binder <400> 248 gccgguuacc gagggggcgu cguuggaguu ugguugguug ucaccggc 48 <210> 249 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCP-1 binder <400> 249 gccggcuacc gagggggcgu cguuggaguu ugguugguug ucgccggc 48 <210> 250 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCP-1 binder <400> 250 gcgcguaccg agggggcguc guuggaguuu gguugguugu ccgcgc 46 <210> 251 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCP-1 binder <400> 251 gggccuaccg agggggcguc guuggaguuu gguugguugu cggccc 46 <210> 252 <211> 76 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 252 Gln Pro Asp Ala Val Asn Ala Pro Leu Thr Cys Cys Tyr Ser Phe Thr 1 5 10 15 Gly Lys Met Ile Pro Met Ser Arg Leu Glu Asn Tyr Lys Arg Ile Thr 20 25 30 Ser Ser Arg Cys Pro Lys Glu Ala Val Val Phe Val Thr Lys Leu Lys 35 40 45 Arg Glu Ile Cys Ala Asp Pro Asn Lys Glu Trp Val Gln Lys Tyr Ile 50 55 60 Arg Lys Leu Asp Gln Asn Gln Val Arg Ser Glu Thr 65 70 75 <210> 253 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCP-1 binder <400> 253 ggcgacauug guugggcaug aggcgaggcc cuuugaugaa uccgcggcca 50 <210> 254 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCP-1 binder <400> 254 ggcgacauug guugggcaug aggcgaggcc cuuugaugaa uccgcggcca 50 <210> 255 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NOX-E36 Capture probe <400> 255 gagggacgtg c 11 <210> 256 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NOX-E36 Detect probe <400> 256 cgcagagcc 9 <210> 257 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL1/I-309 <400> 257 Lys Ser Met Gln Val Pro Phe Ser Arg Cys Cys Phe Ser Phe Ala Glu 1 5 10 15 Gln Glu Ile Pro Leu Arg Ala Ile Leu Cys Tyr Arg Asn Thr Ser Ser 20 25 30 Ile Cys Ser Asn Glu Gly Leu Ile Phe Lys Leu Lys Arg Gly Lys Glu 35 40 45 Ala Cys Ala Leu Asp Thr Val Gly Trp Val Gln Arg His Arg Lys Met 50 55 60 Leu Arg His Cys Pro Ser Lys Arg Lys 65 70 <210> 258 <211> 69 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL3/MIP-1alpha <400> 258 Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ser 1 5 10 15 Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser Ser 20 25 30 Gln Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg Ser Arg Gln 35 40 45 Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser Asp 50 55 60 Leu Glu Leu Ser Ala 65 <210> 259 <211> 69 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL4/MIP-1beta <400> 259 Ala Pro Met Gly Ser Asp Pro Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr 1 5 10 15 Ala Arg Lys Leu Pro Arg Asn Phe Val Val Asp Tyr Tyr Glu Thr Ser 20 25 30 Ser Leu Cys Ser Gln Pro Ala Val Val Phe Gln Thr Lys Arg Ser Lys 35 40 45 Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Ser Trp Val Gln Glu Tyr Val Tyr 50 55 60 Asp Leu Glu Leu Asn 65 <210> 260 <211> 68 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL5/RANTES <400> 260 Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala 1 5 10 15 Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly 20 25 30 Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln 35 40 45 Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser 50 55 60 Leu Glu Met Ser 65 <210> 261 <211> 82 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL13/MCP-4 <400> 261 Phe Asn Pro Gln Gly Leu Ala Gln Pro Asp Ala Leu Asn Val Pro Ser 1 5 10 15 Thr Cys Cys Phe Thr Phe Ser Ser Lys Lys Ile Ser Leu Gln Arg Leu 20 25 30 Lys Ser Tyr Val Ile Thr Thr Ser Arg Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile 35 40 45 Phe Arg Thr Lys Leu Gly Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Glu Lys 50 55 60 Trp Val Gln Asn Tyr Met Lys His Leu Gly Arg Lys Ala His Thr Leu 65 70 75 80 Lys Thr <210> 262 <211> 74 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL14/HCC-1 <400> 262 Thr Lys Thr Glu Ser Ser Ser Arg Gly Pro Tyr His Pro Ser Glu Cys 1 5 10 15 Cys Phe Thr Tyr Thr Thr Tyr Lys Ile Pro Arg Gln Arg Ile Met Asp 20 25 30 Tyr Tyr Glu Thr Asn Ser Gln Cys Ser Lys Pro Gly Ile Val Phe Ile 35 40 45 Thr Lys Arg Gly His Ser Val Cys Thr Asn Pro Ser Asp Lys Trp Val 50 55 60 Gln Asp Tyr Ile Lys Asp Met Lys Glu Asn 65 70 <210> 263 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL1/GROalpha <400> 263 Ala Ser Val Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln 1 5 10 15 Gly Ile His Pro Lys Asn Ile Gln Ser Val Asn Val Lys Ser Pro Gly 20 25 30 Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Arg 35 40 45 Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Ile Val Lys Lys Ile Ile Glu 50 55 60 Lys Met Leu Asn Ser Asp Lys Ser Asn 65 70 <210> 264 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL2/GRObeta <400> 264 Ala Pro Leu Ala Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln 1 5 10 15 Gly Ile His Leu Lys Asn Ile Gln Ser Val Lys Val Lys Ser Pro Gly 20 25 30 Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Gln 35 40 45 Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Lys Lys Ile Ile Glu 50 55 60 Lys Met Leu Lys Asn Gly Lys Ser Asn 65 70 <210> 265 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL3/GROgama <400> 265 Ala Ser Val Val Thr Glu Leu Arg Cys Gln Cys Leu Gln Thr Leu Gln 1 5 10 15 Gly Ile His Leu Lys Asn Ile Gln Ser Val Asn Val Arg Ser Pro Gly 20 25 30 Pro His Cys Ala Gln Thr Glu Val Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly Lys 35 40 45 Lys Ala Cys Leu Asn Pro Ala Ser Pro Met Val Gln Lys Ile Ile Glu 50 55 60 Lys Ile Leu Asn Lys Gly Ser Thr Asn 65 70 <210> 266 <211> 70 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL4/PF4 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Pro His Cys Ala Asn Thr Glu Ile Ile Val 35 40 45 Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp 50 55 60 Val Gln Arg Val Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala Glu Asn Ser 65 70 75 <210> 271 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL9/MIG <400> 271 Thr Pro Val Val Arg Lys Gly Arg Cys Ser Cys Ile Ser Thr Asn Gln 1 5 10 15 Gly Thr Ile His Leu Gln Ser Leu Lys Asp Leu Lys Gln Phe Ala Pro 20 25 30 Ser Pro Ser Cys Glu Lys Ile Glu Ile Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly 35 40 45 Val Gln Thr Cys Leu Asn Pro Asp Ser Ala Asp Val Lys Glu Leu Ile 50 55 60 Lys Lys Trp Glu Lys Gln Val Ser Gln Lys Lys Lys Gln Lys Asn Gly 65 70 75 80 Lys Lys His Gln Lys Lys Lys Val Leu Lys Val Arg Lys Ser Gln Arg 85 90 95 Ser Arg Gln Lys Lys Thr Thr 100 <210> 272 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL10/IP-10 <400> 272 Val Pro Leu Ser Arg Thr Val Arg Cys Thr Cys Ile Ser Ile Ser Asn 1 5 10 15 Gln Pro Val Asn Pro Arg Ser Leu Glu Lys Leu Glu Ile Ile Pro Ala 20 25 30 Ser Gln Phe Cys Pro Arg Val Glu Ile Ile Ala Thr Met Lys Lys Lys 35 40 45 Gly Glu Lys Arg Cys Leu Asn Pro Glu Ser Lys Ala Ile Lys Asn Leu 50 55 60 Leu Lys Ala Val Ser Lys Glu Arg Ser Lys Arg Ser Pro 65 70 75 <210> 273 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL11/I-TAC <400> 273 Phe Pro Met Phe Lys Arg Gly Arg Cys Leu Cys Ile Gly Pro Gly Val 1 5 10 15 Lys Ala Val Lys Val Ala Asp Ile Glu Lys Ala Ser Ile Met Tyr Pro 20 25 30 Ser Asn Asn Cys Asp Lys Ile Glu Val Ile Ile Thr Leu Lys Glu Asn 35 40 45 Lys Gly Gln Arg Cys Leu Asn Pro Lys Ser Lys Gln Ala Arg Leu Ile 50 55 60 Ile Lys Lys Val Glu Arg Lys Asn Phe 65 70 <210> 274 <211> 72 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCL12alpha/SDF-1alpha <400> 274 Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser 1 5 10 15 His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro 20 25 30 Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln 35 40 45 Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu 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XCL1/Lymphotactin <400> 277 Val Gly Ser Glu Val Ser Asp Lys Arg Thr Cys Val Ser Leu Thr Thr 1 5 10 15 Gln Arg Leu Pro Val Ser Arg Ile Lys Thr Tyr Thr Ile Thr Glu Gly 20 25 30 Ser Leu Arg Ala Val Ile Phe Ile Thr Lys Arg Gly Leu Lys Val Cys 35 40 45 Ala Asp Pro Gln Ala Thr Trp Val Arg Asp Val Val Arg Ser Met Asp 50 55 60 Arg Lys Ser Asn Thr Arg Asn Asn Met Ile Gln Thr Lys Pro Thr Gly 65 70 75 80 Thr Gln Gln Ser Thr Asn Thr Ala Val Thr Leu Thr Gly 85 90 <210> 278 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> biotinylated NOX-E36 <400> 278 gcacgucccu caccggugca agugaagccg uggcucugcg 40 <210> 279 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> POC <400> 279 uaaggaaacu cggucugaug cgguagcgcu gugcagagcu 40 <210> 280 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> POC-PEG <400> 280 uaaggaaacu cggucugaug cgguagcgcu gugcagagcu 40 <210> 281 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mNOX-E36 Capture probe <400> 281 ccaatgtcgc c 11 <210> 282 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mNOX-E36 Detect probe <400> 282 cgcagagcc 9 <210> 283 <211> 76 <212> PRT <213> Equus caballus <400> 283 Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ser Pro Val Thr Cys Cys Tyr Thr Phe Thr 1 5 10 15 Gly Lys Lys Ile Ser Ser Gln Arg Leu Gly Ser Tyr Lys Arg Val Thr 20 25 30 Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Leu Ala 35 40 45 Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Glu Gln Lys Trp Val Gln Asp Ala Val 50 55 60 Lys Gln Leu Asp Lys Lys Ala Gln Thr Pro Lys Pro 65 70 75 <210> 284 <211> 76 <212> PRT <213> Bos Taurus <400> 284 Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ser Gln Val Ala Cys Cys Tyr Thr Phe Asn 1 5 10 15 Ser Lys Lys Ile Ser Met Gln Arg Leu Met Asn Tyr Arg Arg Val Thr 20 25 30 Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Leu Gly 35 40 45 Lys Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Ile 50 55 60 Asn Tyr Leu Asn Lys Lys Asn Gln Thr Pro Lys Pro 65 70 75 <210> 285 <211> 125 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 285 Gln Pro Asp Ala Val Asn Ala Pro Leu Thr Cys Cys Tyr Ser Phe Thr 1 5 10 15 Gly Lys Met Ile Pro Met Ser Arg Leu Glu Asn Tyr Lys Arg Ile Thr 20 25 30 Ser Ser Arg Cys Pro Lys Glu Ala Val Val Phe Val Thr Lys Leu Lys 35 40 45 Arg Glu Ile Cys Ala Asp Pro Asn Lys Glu Trp Val Gln Lys Tyr Ile 50 55 60 Arg Lys Leu Asp Gln Asn Gln Val Arg Ser Glu Thr Thr Val Phe Tyr 65 70 75 80 Lys Ile Ala Ser Thr Leu Arg Thr Ser Ala Pro Leu Asn Val Asn Leu 85 90 95 Thr His Lys Ser Glu Ala Asn Ala Ser Thr Leu Phe Ser Thr Thr Thr 100 105 110 Ser Ser Thr Ser Val Glu Val Thr Ser Met Thr Glu Asn 115 120 125 <210> 286 <211> 50 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCP-1 binder <400> 286 accggcgccu aaguaguuuc ccggagcgga guacggguug guuacagcgg 50

Claims

만성 질병 및/또는 만성 장애, 바람직하게는, 만성 호흡기 질환, 만성 신장 질환 및 전신성 홍반성 낭창으로 구성된 군으로부터 선택된 만성 질병 및/또는 만성 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 약제에 사용하기 위한, MCP-1와 결합가능한 핵산 분자.
만성 질병 및/또는 만성 장애, 바람직하게는, 만성 호흡기 질환, 만성 신장 질환 및 전신성 홍반성 낭창으로 구성된 군으로부터 선택된 만성 질병 및/또는 만성 장애의 진단을 위한 진단제에 사용하기 위한, MCP-1와 결합가능한 핵산 분자.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 만성 호흡기 질환은 폐렴, 폐 및 흉막 염증, 늑막염, 흉수, 루푸스 폐렴, 만성 미만형 간질성 폐질환, 폐색전증, 폐출혈, 위축성 폐 증후군, 폐고혈압 및 만성 폐색성 폐질환 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 핵산 분자.
제 3항에 있어서,
상기 폐고혈압은 좌측 심장 질환 수반 폐 고혈압, 폐 질환 및/또는 저산소증 수반 폐 고혈압, 혈전성 및/또는 색전성 질환으로 기인한 폐 고혈압, 폐 동맥성 고혈압, 바람직하게는 특발성 폐 동맥성 고혈압, 콜라게나제-수반 폐 동맥성 고혈압, 가족성 폐 동맥성 고혈압, 기타 질환을 수반하는 폐 동맥성 고혈압 및 정맥성 또는 말초성 질환을 수반하는 폐 동맥성 고혈압으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 핵산 분자.
제 3항에 있어서,
상기 만성 폐색성 폐질환은 폐 정맥성 침범을 수반 또는 수반하지 않는 만성 폐색성 폐질환인 핵산 분자.
제 3항 또는 제 5항에 있어서,
상기 만성 폐색성 폐질환은 만성 기관지염 및 폐기종으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 핵산 분자.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 만성 신장 질환은 낭창성신염, 막성 증식성 사구체 신염, 막성 사구체 신염, IgA 신장애, 연쇄상구균 감염 후 사구체신염, 급속진행형 사구체신염, 신염 증후군, 국소성 분절성 사구체경화증, 당뇨병성 신장애, 신증후군 및 신증후군으로 구성된 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 낭창성신염인 것인 핵산 분자.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 핵산은 1A형 핵산, 1B형 핵산, 2형 핵산, 3형 핵산, 4형 핵산 및 서열 번호 87 내지 115중 임의의 핵산 서열을 갖는 핵산을 포함하는 군으로부터 선택되는 핵산인 것인 핵산 분자.
제 8항에 있어서,
상기 2형 핵산은 5’->3’ 방향으로 1차 스트레치(stretch) 박스(Box) B1A, 2차 스트레치 박스 B2, 및 3차 스트레치 박스 B1B을 포함하고 있으며,
여기에서 상기 1차 스트레치 박스 B1A 및 3차 스트레치 박스 B1B는 선택적으로 상호 간에 혼성화될 수 있으며, 이 혼성화에 의해 이중 가닥 구조가 형성되며,
여기에서
1차 스트레치 박스 B1A는 ACGCA, CGCA 및 GCA을 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
2차 스트레치 박스 B2는 CSUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGYGGCUC의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
3차 스트레치 박스 B1B는 UGCGU, UGCG 및 UGC을 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 9항에 있어서,
상기 2차 스트레치 박스 B2는 CGUCCCUCACCGGUGCAAGUGAAGCCGUGGCUC의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 9항 또는 제 10항에 있어서,
(a) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 ACGCA의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 3차 스트레치 박스 B1B는 UGCGU의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는;
(b) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 CGCA의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 3차 스트레치 박스 B1B는 UGCG의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는;
(c) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 GCA의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 3차 스트레치 박스 B1B는 UGC 또는 UGCG의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 9항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 1차 스트레치 박스 B1A는 GCA의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 9항 내지 제 11항 중 어느 한 항, 바람직하게는 제 12항에 있어서,
상기 3차 스트레치 박스 B1B는 UGCG의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 9항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산은 서열 번호 37, 서열 번호 116, 서열 번호 117 및 서열 번호 278에 따른 핵산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 8항에 있어서,
상기 3형 핵산은 5’->3’ 방향으로 1차 스트레치(stretch) 박스(Box) B1A, 2차 스트레치 박스 B2A, 3차 스트레치 박스 B3, 4차 스트레치 박스 B2B, 5차 스트레치 박스 B4, 6차 스트레치 박스 B5A, 7차 스트레치 박스 B6, 8차 스트레치 박스 B5B및 9차 스트레치 박스 B1B을 포함하고 있으며,
여기에서
상기 1차 스트레치 박스 B1A 및 9차 스트레치 박스 B1B는 선택적으로 상호간에 혼성화될 수 있으며, 이 혼성화에 의해 이중가닥 구조가 형성되며,
상기 2차 스트레치 박스 B2A 및 4차 스트레치 박스 B2B는 선택적으로 상호간에 혼성화될 수 있으며, 이 혼성화에 의해 이중가닥 구조가 형성되며,
상기 6차 스트레치 박스 B5A 및 8차 스트레치 박스 B5B는 선택적으로 상호간에 혼성화될 수 있으며, 이 혼성화에 의해 이중가닥 구조가 형성되며,
여기에서
상기 1차 스트레치 박스 B1A는 GURCUGC, GKSYGC, KBBSC 및 BNGC을 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
상기 2차 스트레치 박스 B2A는 GKMGU의 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
상기 3차 스트레치 박스 B3는 KRRAR의 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
상기 4차 스트레치 박스 B2B는 ACKMC의 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
상기 5차 스트레치 박스 B4는 CURYGA, CUWAUGA, CWRMGACW 및 UGCCAGUG을 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
상기 6차 스트레치 박스 B5A는 GGY 및 CWGC을 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
상기 7차 스트레치 박스 B6는 YAGA, CKAAU 및 CCUUUAU을 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
상기 8차 스트레치 박스 B5B는 GCYR 및 GCWG을 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
상기 9차 스트레치 박스 B1B는 GCAGCAC, GCRSMC, GSVVM 및 GCNV을 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 15항에 있어서,
상기 3차 스트레치 박스 B3는 GAGAA 또는 UAAAA의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 15항 또는 제 16항에 있어서,
상기 5차 스트레치 박스 B4는 CAGCGACU 또는 CAACGACU의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 15항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 5차 스트레치 박스 B4는 CAGCGACU 의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 박스 B3는 UAAAA의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 15항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 5차 스트레치 박스 B4는 CAACGACU의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 박스 B3는 GAGAA의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 15항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 7차 스트레치 박스 B6는 UAGA의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 15항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 GURCUGC의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 9차 스트레치 박스 B1B는 GCAGCAC의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는;
(b) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 GKSYGC의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 9차 스트레치 박스 B1B는 GCRSMC의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는;
(c) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 KBBSC의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 9차 스트레치 박스 B1B는 GSVVM의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는;
(d) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 BNGC의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 9차 스트레치 박스 B1B는 GCNV의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 21항에 있어서,
(a) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 GUGCUGC의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 9차 스트레치 박스 B1B는 GCAGCAC의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는;
(b) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 GUGCGC의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 9차 스트레치 박스 B1B는 GCGCAC의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는;
(c) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 KKSSC의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 9차 스트레치 박스 B1B는 GSSMM의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는;
(d) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 SNGC의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 9차 스트레치 박스 B1B는 GCNS의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 22항에 있어서,
상기 1차 스트레치 박스 B1A는 GGGC의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 9차 스트레치 박스 B1B는 GCCC의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 15 항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 2차 스트레치 박스 B2A는 GKMGU의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 4차 스트레치 박스 B2B는 ACKMC의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 24항에 있어서,
상기 2차 스트레치 박스 B2A는 GUAGU의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 4차 스트레치 박스 B2B는 ACUAC의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 15항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 상기 6차 스트레치 박스 B5A는 GGY의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 8차 스트레치 박스 B5B는 GCYR의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는;
(b) 상기 6차 스트레치 박스 B5A는 CWGC의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 8차 스트레치 박스 B5B는 GCWG의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 26항에 있어서,
상기 6차 스트레치 박스 B5A는 GGC의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 8차 스트레치 박스 B5B는 GCCG의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 15항 내지 27항 중 어느 한 항, 바람직하게는 제 26항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 6차 스트레치 박스 B5A는 제 8차 스트레치 박스 B5B의 뉴클레오티드 GCY와 선택적으로 상호간에 혼성화되는 것인 핵산 분자.
제 15항 내지 18항 및 제 20항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산은 서열번호 56에 따른 핵산을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 15항 내지 17항 및 제 19항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산은 서열번호 57 내지 61, 서열번호 67 내지 71 및 서열 번호 73에 따른 핵산을 포함하는 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 8항에 있어서,
상기 4 형 핵산은 5’->3’ 방향으로 1차 스트레치(stretch) 박스(Box) B1A, 2차 스트레치 박스 B2 및 3차 스트레치 박스 B1B을 포함하고 있으며,
여기에서
상기 1차 스트레치 박스 B1A 및 상기 3차 스트레치 박스 B1B는 선택적으로 상호간에 혼성화될 수 있으며, 이 혼성화에 의해 이중가닥 구조가 형성되며,
상기 1차 스트레치 박스 B1A는 AGCGUGDU, GCGCGAG, CSKSUU, GUGUU, 및 UGUU을 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하며;
상기 2차 스트레치 박스 B2는 AGNDRDGBKGGURGYARGUAAAG, AGGUGGGUGGUA GUAAGUAAAG 및 CAGGUGGGUGGUAGAAUGUAAAGA을 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하며;
상기 3차 스트레치 박스 B1B는 GNCASGCU, CUCGCGUC, GRSMSG, GRCAC, 및 GGCA을 포함하는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 31항에 있어서,
(a) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 GUGUU의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 3차 스트레치 박스 B1B는 GRCAC의 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
(b) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 GCGCGAG의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 3차 스트레치 박스 B1B는 CUCGCGUC의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는;
(c) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 CSKSUU의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 3차 스트레치 박스 B1B는 GRSMSG의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는;
(d) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 UGUU의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 3차 스트레치 박스 B1B는 GGCA의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는;
(e) 상기 1차 스트레치 박스 B1A는 AGCGUGDU의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 3차 스트레치 박스 B1B는 GNCASGCU의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 32항에 있어서,
상기 1차 스트레치 박스 B1A는 CSKSUU의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 3차 스트레치 박스 B1B는 GRSMSG의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 33항에 있어서,
상기 1차 스트레치 박스 B1A는 CCGCUU의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 3차 스트레치 박스 B1B는 GGGCGG의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 31항 내지 제 34항 중 어느 항에 있어서,
상기 2차 스트레치 박스 B2는 AGGUGGGUGGUAGUAAGUAAAG의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 31항 내지 제 35항 중 어느 항에 있어서,
상기 핵산은 서열번호 80 및 서열번호 81에 따른 핵산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 8항에 있어서,
상기 1A 형 핵산은 5’->3’ 방향으로 1차 스트레치(stretch) 박스(Box) B1A, 2차 스트레치 박스 B2, 3차 스트레치 박스 B3, 4차 스트레치 박스 B4, 5차 스트레치 박스 B5, 6차 스트레치 박스 B6 및 7차 스트레치 박스 B1B을 포함하고 있으며,
여기에서
상기 1차 스트레치 박스 B1A 및 상기 7차 스트레치 박스 B1B는 선택적으로 상호간에 혼성화될 수 있으며, 이 혼성화에 의해 이중가닥 구조가 형성되며,
상기 1차 스트레치 박스 B1A는 AGCRUG의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
상기 2차 스트레치 박스 B2는 CCCGGW의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
상기 3차 스트레치 박스 B3는 GUR의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
상기 4차 스트레치 박스 B4는 RYA의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
상기 5차 스트레치 박스 B5는 GGGGGRCGCGAYC의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
상기 6차 스트레치 박스 B6는 UGCAAUAAUG 또는 URYAWUUG의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
상기 7차 스트레치 박스 B1B는 CRYGCU의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 37항에 있어서,
상기 1차 스트레치 박스 B1A는 AGCGUG의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 37항 또는 제 38항에 있어서,
상기 2차 스트레치 박스 B2는 CCCGGU의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 37항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 3차 스트레치 박스 B3는 GUG의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 37항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 4차 스트레치 박스 B4는 GUA의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 37항 내지 제 41항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 5차 스트레치 박스 B5는 GGGGGGCGCGACC의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 37항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 6차 스트레치 박스 B6는 UACAUUUG의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 37항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 7차 스트레치 박스 B1B는 CACGCU의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 37항 내지 제 44항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산은 서열번호 21에 따른 핵산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 8항에 있어서,
상기 1B 형 핵산은 5’->3’ 방향으로 1차 스트레치(stretch) 박스(Box) B1A, 2차 스트레치 박스 B2, 3차 스트레치 박스 B3, 4차 스트레치 박스 B4, 5차 스트레치 박스 B5, 6차 스트레치 박스 B6 및 7차 스트레치 박스 B1B을 포함하고 있으며,
여기에서
상기 1차 스트레치 박스 B1A 및 상기 7차 스트레치 박스 B1B는 선택적으로 상호간에 혼성화될 수 있으며, 이 혼성화에 의해 이중가닥 구조가 형성되며,
상기 1차 스트레치 박스 B1A는 AGYRUG의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
상기 2차 스트레치 박스 B2는 CCAGCU 또는 CCAGY의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
상기 3차 스트레치 박스 B3는 GUG의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
상기 4차 스트레치 박스 B4는 AUG의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
상기 5차 스트레치 박스 B5는 GGGGGGCGCGACC의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 6차 스트레치 박스 B6는 CAUUUUA 또는 CAUUUA의 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
상기 7차 스트레치 박스 B1B는 CAYRCU의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 46항에 있어서,
상기 1차 스트레치 박스 B1A는 AGCGUG의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 46항 또는 제 47항에 있어서,
상기 2차 스트레치 박스 B2는 CCAGU의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 46항 내지 제 48항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 6차 스트레치 박스 B6는 CAUUUUA의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 46항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 7차 스트레치 박스 B1B는 CACGCU의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 46항 내지 제 50항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산 분자는 서열번호 28 및 서열번호 27에 따른 핵산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
제 1항 내지 제 51항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 MCP-1은 원숭이 MCP-1, 말 MCP-1, 토끼 MCP-1, 소 MCP-1, 개 MCP-1, 돼지 MCP-1 및 인간 MCP-1을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 핵산 분자.
제 1항 내지 제 52항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산은 인간 MCP-1와 결합가능한 것인 핵산 분자.
제 1항 내지 제 53항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 MCP-1은 서열번호 1에 따른 아미노산 서열을 갖는 것인 핵산 분자.
제 1항 내지 제 54항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산은 변형체 (modification)를 포함하며, 여기에서 상기 변형체는 바람직하게는 고분자량 기이며 및/ 또는 상기 변형체는 바람직하게는, 동물 또는 인체, 바람직하게는 인체 내의 잔류시간의 측면에 있어서 제 1항 내지 제 54항 중 어느 한 항에 따른 임의의 핵산의 특성을 변형하도록 하는 것인 핵산 분자.
제 55항에 있어서,
상기 변형체는 HES기, PEG기, 생분해성 변형체 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 핵산 분자.
제 56항에 있어서,
상기 변형체는 쇄상 또는 가지상 PEG로 구성되는 PEG 기이며, 상기 PEG 기의 분자량은 바람직하게는, 약 20,000 내지 120,000 Da, 보다 바람직하게는 약 30,000 내지 80,000 Da, 및 가장 바람직하게는 약 40,000 Da인 것인 핵산 분자.
제 56항에 있어서,
상기 변형체는 HES 기이며, 여기에서 상기 HES 기의 바람직한 분자량은 약 10,000 내지 200,000 Da, 보다 바람직하게는 약 30,000 내지 170,000 Da, 및 가장 바람직하게는 약 150,000 Da인 것인 핵산 분자.
제 55항 내지 제 58항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 변형체는 링커 (linker)를 통해 핵산이 결합되는 것이고, 여기에서 상기 링커는 일커 또는 생분해성 링커인 것인 핵산 분자.
제 55항 내지 제 59항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 변형체는 핵산과 5’-말단 뉴클레오티드 및/또는 3’-말단 뉴클레오티드 및/ 또는 5’-말단 뉴클레오티드 및 3’-말단 뉴클레오티드 사이의 핵산의 뉴클레오티드에 결합되는 것인 핵산 분자.
제 1항 내지 제 60항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산의 또는 이 핵산을 생성하는 뉴클레오티드들은 L-뉴클레오티드인 것인 핵산 분자.
제 1항 내지 제 61항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산은 L-핵산인 것인 핵산 분자.
제 1항 내지 제 61항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 MCP-1에 결합가능한 핵산의 부위는 L-뉴클레오티드로 구성된 것인 핵산 분자.
제 1항 내지 제 63항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 핵산 분자 및 임의적인 추가 구성 성분을 포함하는 약학조성물 (여기에서 상기 추가 구성 성분은 약학적으로 허용 가능한 부형제, 약학적으로 허용가능한 담체 및 약학적으로 활성을 갖는 활성제를 포함하는 군으로부터 선택되며 상기 약학조성물은 만성 질병 또는 만성 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 것임).
제 64항에 있어서,
상기 약학 조성물은 제 1항 내지 제 63항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 핵산 분자, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것인 약학 조성물.
제 64항 또는 제 65항에 있어서,
상기 만성 질병 및 만성 장애는 전술한 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 것인 약학 조성물.
제 64항 내지 제 66항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학조성물은 제 2차 약학 활성화제를 포함하고, 여기에서 상기 제 2차 약학 활성화제는 면역억제제인 것인 약학 조성물.
제 67항에 있어서,
상기 면역억제제는 분리된 투여 단위(dosage unit)로서 상기 약학 조성물 내에 포함되는 것인 약학 조성물.
제 67항 또는 제 68항에 있어서,
상기 약학 조성물은 단독요법(monotherapy)으로서 면역억제제를 포함하는 약학 조성물보다 적은 량의 면역억제제를 포함하는 것인 약학 조성물.
제 67항 내지 제 69항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 면역억제제의 투여 단위는 단독요법으로 사용시에 면역억제제 투여단위보다 적게 포함하는 것인 약학 조성물.
제 69항 또는 제 70항에 있어서,
상기 면역억제제의 감소는 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상, 바람직하게는 75% 이상인 것인 약학 조성물.
제 67항 내지 제 71항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 면역억제제는 시클로포스아미드 및 미코페놀에이트 모페틸을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 약학 조성물.
제 64항 내지 제 72항 중 어느 한 항, 보다 바람직하게는 제 71항 또는 제 72항에 있어서,
상기 만성 질병은 루프스신염 및/또는 폐렴인 것인 약학 조성물.
제 64항 내지 제 66항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학조성물은 제 2차 약학 활성화제를 포함하고, 여기에서 상기 제 2차 약학 활성화제는 항염증제인 것인 약학 조성물.
제 74항에 있어서,
상기 항염증제는 분리된 투여 단위로서 상기 약학 조성물 내에 포함되는 것인 약학 조성물.
제 74항 또는 제 75항에 있어서,
상기 약학 조성물은 단독요법으로서 항염증제를 포함하는 약학 조성물보다 적은 량의 항염증제를 포함하는 것인 약학 조성물.
제 74항 내지 제 76항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항염증제의 투여 단위는 단독요법으로 사용시에 면역억제제 투여단위보다 적게 포함하는 것인 약학 조성물.
제 76항 또는 제 77항에 있어서,
상기 제 76항 또는 제 77항에 따른 면역억제제의 감소는 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상, 바람직하게는 75% 이상인 것인 약학 조성물.
제 74항 내지 제 78항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항염증제는 덱사메타손 및 로플루밀라스트을 포함하는 군으로부터 선택되는 것이고, 바람직하게는 상기 항염증제는 덱사메타손인 것인 약학 조성물.
제 74항 내지 제 79항 중 어느 한 항, 보다 바람직하게는, 제 78항 또는 제 79항에 있어서,
상기 만성 질병은 만성 기관지 질환이며 보다 바람직하게는, 만성 기도폐쇄성 질환 (COPD)인 것인 약학 조성물.
약학적 활성량의 상기 핵산을 상기 객체에 투여함을 포함하는, 만성 질병 또는 만성 장애이거나 또는 발달될 위험성이 있는 객체의 치료를 위한 방법에 사용하기 위한, 제 1항 내지 제 63항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 핵산 분자.
제 81항에 있어서,
상기 만성 질병 또는 만성 장애는 전술한 청구항 중 임의의 항에 정의된 바와 같은 핵산 분자.
제 81항 또는 제 82항에 있어서,
상기 방법은 추가적으로 면역억제제를 상기 객체에 투여하는 단계를 포함하는 것인 핵산 분자.
제 83항에 있어서,
상기 치료 과정 중 투여되는 면역억제제의 양은 단독요법으로서, 상기 객체에 투여되어 온 면역억제제의 양보다 적은 것인 핵산 분자.
제 84항에 있어서,
상기 면역억제제의 양은 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상, 바람직하게는 75% 이상 감소되는 것인 핵산 분자.
제 81항 내지 제 85항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항염증제는 덱사메타손 및 로플루밀라스트를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 핵산 분자.
제 81항 내지 제 86항 중 어느 한 항, 보다 바람직하게는 제 85항 또는 제 86항에 있어서,
상기 만성 질병은 만성 신장 질환이고, 바람직하게는 낭창성 신염(lupus nephritis) 및/또는 폐렴 (pneumonitis)인 것인 핵산 분자.
제 81항 또는 제 82항에 있어서,
상기 방법은 추가적으로 항 염증제를 상기 객체에 투여하는 단계를 포함하는 것인 핵산 분자.
제 88항에 있어서,
상기 치료 과정 중 투여되는 항염증제의 양은 단독요법으로서, 상기 객체에 투여되어 온 면역억제제의 양보다 적은 것인 핵산 분자.
제 89항에 있어서,
상기 면역억제제의 양은 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상, 바람직하게는 75% 이상 감소되는 것인 핵산 분자.
제 88항 내지 90항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항염증제는 덱사메타손(dexamethasone) 및 로플루밀라스트(roflumila st)를 포함하는 군으로부터 선택되는 것이고, 바람직하게는 상기 항염증제는 덱사메타손인 것인 핵산 분자.
제 88항 내지 91항 중 어느 한 항, 바람직하게는 제 90항 또는 제 91항에 있어서,
상기 만성 질병은 만성 기도 질환 (chronic respiratory disease)이고 보다 바람직하게는, 만성 기도폐쇄성 질환 (COPD)인 것인 핵산 분자.
만성 질병 또는 만성 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 약제를 제조하기 위한, 제 1항 내지 제 63항 중 어느 한 항에 정의되는 바와 같은 핵산 분자의 용도.
제 93항에 있어서,
상기 질병 또는 장애는 본 발명의 전술한 항에 정의된 바와 같은 중 하나인 용도.
제 93항 또는 제 94항에 있어서,
상기 약제는 인체용 의약품 또는 수의학적 의약품으로 사용하기 위한 것인 용도.
(a) 만성 질병 또는 만성 장애로 고통받거나 또는 발전 될 위험성이 있는지 여부를 시험 대상객체로부터 채취한 시료를 제 1항 내지 제 63항 중 어느 한 항에 정의되는 바와 같은 핵산 분자와 접촉시키는 단계; 및
(b) MCP-1 및 상기 핵산을 포함하는 복합체가 형성되는지 여부를 직접 또는 간접적으로 탐지하는 단계;
를 포함하는 만성 질병 또는 만성 장애를 진단하기 위한 방법.
제 96항에 있어서,
상기 만성 질병 또는 만성 장애는 전술한 청구항에 정의된 바와 같은 만성질병 또는 만성 장애인 것인 방법.
전술한 청구항에 정의된 바와 같은 만성질병 또는 만성 장애의 진단을 위한 진단제를 제조하기 위한, 제 1항 내지 제 63항 중 어느 한 항에 정의되는 바와 같은 핵산의 용도.