KR20100085751A - 식물 세포벽을 분해하는 푸사리움 속 균주 및 이를 이용하여 식물 세포벽을 분해하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 일 구체예는 식물 세포벽 분해 효소를 생산하는 신규한 푸사리움 속 균주, 이를 이용한 식물 세포벽 분해 및 바이오연료 제조에 관한 것이다.
푸사리움, Fusarium, 식물 세포벽

Description

식물 세포벽을 분해하는 푸사리움 속 균주 및 이를 이용하여 식물 세포벽을 분해하는 방법{Fungus strain Fusarium sp. degrading plant cell wall materials and a method for degrading plant cell wall materials using the same fungus}
본 발명의 일 구체예는 식물 세포벽 분해 효소를 생산하는 신규한 푸사리움 속 균주, 이를 이용한 식물 세포벽 분해 및 바이오연료 제조에 관한 것이다.
바이오연료(biofuel)는 재생가능하고 환경 친화적이다. 왜냐하면, 바이오연료는 이산화탄소 고정에 의한 광합성으로 생성되는 바이오매스(biomass)로부터 생산되기 때문이다. 특히, 점점 줄어드는 화학 연료 공급에 대한 우려, 및 깨끗한 재생가능 에너지에 대한 요구로 인해 바이오연료에 대한 필요성은 증가하고 있는 추세이다.
현재 두 개의 바이오연료인 바이오알코올(바이오에탄올)과 바이오디젤이 각각 가솔린 및 디젤의 대안이 되는 연료로 제안되고 있으며 사용되고 있다. 이들은 대기중 이산화탄소 방출 감소 및 지구 온난화에 긍정적인 효과를 줄 뿐만 아니라, 기존의 자동차의 시스템을 변화시키지 않고 사용될 수 있다. 바이오연료의 일례로, 대부분의 사람들은 목재, 건초 및 스위치 그래스(switchgrss: 북아메리카에 자생하 는 다년생 식물)와 같은 셀룰로오스 자원을 이용하여 바이오에탄올을 생산하고 있다. 최근에, 바이오에탄올의 매년 전세계 생산은 대략 10억 갤론으로 평가되고 있다. 이들 대부분은 기존의 정립된 시스템의 전분 및 당으로부터 생산되고 있다. 이러한 전분 및 당을 비롯한 탄수화물의 수요 증가는 식품 공급 회사들 간에 심각한 경쟁을 불러일으키고 있다. 이러한 결과, 바이오에탄올의 생산 경비를 실질적으로 증가시키고 있고, 곡물을 비롯한 식물 자원의 가격 급등은 심각한 문제가 되고 있다. 따라서, 현재의 기술은 자연 상태에서 가장 풍부한 탄소원인 식물 세포벽 폴리사카라이드를 이용하여 바이오연료를 생산하는 것에 집중하고 있다.
식물 세포벽은 자연 상태에서 가장 풍부한 탄소원이다. 식물 세포벽을 구성하는 폴리사카라이드는 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스(hemicellulose), 펙틴, 및 리그닌으로 구성되어 있다. 식물 세포벽은 육상 식물에 의해 생성되는 전 세계 바이오매스 17 내지 200 x 109 톤의 약 70%를 차지하고 있다. 그러나, 식물 세포벽 중 대략 2%만이 인간에 의해 사용되고 있는 실정이다(Pauly and Keegstra, Plant J. 2008, 54:559-568). 그러므로 식물 세포벽의 이용 비율을 높이는 것이 필요하다. 이를 위해, 식물 세포벽을 이용하여 바이오에탄올을 생산함에 있어서 가장 해결해야할 문제는 식물 세포벽으로부터 유래된 발효성 당(fermentable sugar) 즉 포도당을 효모로 발효시키기 전에 세포벽 폴리사카라이드를 발효성 당으로 효율적으로 분해시키는 것이다. 포도당은 대부분의 식물에 존재하는 세포벽을 구성하는 장쇄 분자쇄인 셀룰로오스 및 세포벽에 포함되어 있는 보다 얇은 헤미셀룰로오스 등의 두 개의 물질로부터 얻어질 수 있다. 포도당은 발효에 의해 에탄올로 전환되어 바이오연료로 사용될 수 있다. 식물 세포벽을 이용하기 위한 최초의 단계는 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스 등의 폴리사카라이드와 방향족 화합물(리그닌) 및 저분자량의 페놀 간의 가교를 제거하기 위하여, 식물 세포벽을 고온, 고압, 알칼리, 산, 유기 용매 및 이들의 배합과 같은 다양한 생물물리학적 전처리하는 것이다. 이러한 전처리는 비용이 많이 들고 환경에 좋지 못할 뿐만 아니라, 효소에 의한 가수분해 및 효모에 의한 발효를 저해시킬 수 있다. 그러므로, 전처리를 최소화하거나 또는 생략하여 바이오에탄올의 생산 효율을 증가시키고 비용을 줄이는 것이 핵심이라 할 것이다.
이러한 목적으로, 식물 세포벽 폴리사카라이드를 분해하여 생존하는 균주 중 식물 세포벽 분해 효소를 생산하는 균주를 찾아내어 이를 바이오연료 개발에 이용하고자 하는 시도가 진행되고 있다. 그러나, 효소들은 다양한 기질 특이성, 활성 및 안정성을 나타낸다. 따라서, 균주로부터 얻은 식물 세포벽 분해 효소를 바이오연료의 생산에 사용하기 위해서는, 효소는 세포벽 분해 활성이 높아야 하고, 고온에서도 활성이 유지되도록 하는 효소 안정성이 높아야한다. 또한, 기존의 육상 식물 한 종류에 국한되지 않고 다양한 종류의 식물에 대해서도 적용가능하도록 기질 특이성이 낮은 효소를 생산하는 균주를 발견해낼 필요가 있다.
식물 세포벽 분해 효소를 생산하는 신규한 균주, 식물 세포벽 분해 효소를 제조하는 방법, 식물 세포벽 분해용 조성물, 식물 세포벽을 분해하는 방법, 및 바이오연료를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 구체예는 식물 세포벽 분해 효소를 생산하는 푸사리움 속(Fusarium sp .) CGMCC 2710을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 구체예는 푸사리움 속 CGMCC 2710을 배양하는 단계를 포함하는 식물 세포벽 분해 효소를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 구체예는 푸사리움 속 CGMCC 2710으로부터 얻은 식물 세포벽 분해 효소를 포함하는, 식물 세포벽 분해용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 구체예는 푸사리움 속 CGMCC 2710으로부터 얻은 식물 세포벽 분해 효소를 이용하는 식물 세포벽을 분해하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 구체예는 바이오연료를 제조하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 구체예는 식물 세포벽 분해 효소를 생산하는 푸사리움 속 CGMC C 2710을 제공한다.
본 명세서에서 "식물"은 벼, 보리, 밀, 귀리, 옥수수(corn 또는 maize), 호 밀 등의 식물을 포함할 수 있지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 "식물 세포벽 분해 효소"는 식물 세포벽에 들어 있는 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 등의 폴리사카라이드 및 펙틴 및 리그닌을 분해시킬 수 있는 효소를 포함할 수 있다. 예를 들면, 식물 세포벽 분해 효소는 엔도글루카나제(endoglucanase), 셀로비오히드로라제(cellobiohydrolase), 글루코시다제(glucosidase), 엑소글루카나제(exoglucanase), 엔도실라나제(endoxylanase), β-실로시다제(β-xylosidase), β-엔도만난나제(β-endomannanase), β-만노시다제(β-mannosidase), 펙틴 히드로라제(pectin hydrolase), 펙틴 용해효소(pectin lyase), α-실로시다제(α-xylosidase), 아라비노옥실란아라비노푸라노히드로라제(arabinoxylanarabinofuranohydrolase), 엔도(endo)- 및 엑소아라비나제(exoarabinase), α- 및 β-갈락토시아제(galactosidase), 엔도- 및 엑소-갈락탄나제(exo-galactanase), α-글루쿠로니다제(α-glucuronidase), 페루로일(feruloyl)-, ρ-쿠마로일(ρ-coumaroyl)-, 아세틸- 및 메틸 에스테라제 등이 될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 의한 푸사리움 속 CGMCC 2710은 자낭균류 주발버섯목 곰보버섯과의 곰보버섯속(Morchella spp.)으로부터 분리 및 동정될 수 있는 푸사리움 속의 신규한 균주임을 특징으로 한다. 예를 들면, 곰보버섯속의 곰보버섯의 자실체(fruiting body)로부터 분리할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 의한 푸사리움 속 CGMCC 2710은 균주의 동정 및 분류 를 위해 18S 리보솜 RNA 유전자의 일부 서열, ITS(internal transcribed spacer) 1, 5.8S 리보솜 RNA 유전자, ITS 2, 및 28S 리보솜 RNA 유전자의 일부 서열을 분석한 결과, 푸사리움 속(Fusarium sp .), 지베렐라 속(Gibberella sp .), 및 코르디세프스 속(Cordyceps sp.)과 높은 상동성을 나타내었다. 특히, 푸사리움 속인 푸사리움 속 5/97-45(AJ279478), 푸사리움 속 MOD-13(EU589150), 푸사리움 속 NRRL13708(X65480), 푸사리움 속 F13(EF055302)과 가장 높은 상동성(99%)을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 일 구체예에 의한 균주는 푸사리움 속과 가장 높은 분자 계통학적 유연 관계를 보였다. 따라서, 상기 분리한 균주를 푸사리움 속으로 동정하고, 푸사리움 속 Q7-31로 명명하였으며, 2008년 10월 14일 중국 과학원 미생물 저장소(China General Microbiological Culture Center)에 기탁하였다(수탁번호 CGMCC 2710). 본 발명의 균주의 동정 및 분류를 위한 18S 리보솜 RNA 유전자의 일부 서열, ITS 1, 5.8S 리보솜 RNA 유전자, ITS 2, 및 28S 리보솜 RNA 유전자의 일부 서열은 서열번호 1에 기재되어 있다.
본 발명의 푸사리움 속 Q7-31은 배지에서 배양되었을 때, 백색의 융모 형태의(villiform) 콜로니를 형성하였고, 격벽이 있는 필라멘트형 균사로 구성되어 있을 수 있다.
본 발명의 푸사리움 속 Q7-31은 식물 세포벽 예를 들면, 벼 세포벽에 의해 유도되어 식물 세포벽 분해 효소를 생산할 수 있다. 식물 세포벽 분해 효소가 작용할 수 있는 식물에는 벼, 보리, 밀, 귀리, 옥수수, 호밀 등의 식물을 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 특히, 벼 세포벽 분말이 있는 배지에서 본 발명의 균주로부터 유도된 식물 세포벽 분해 효소는 벼보다는 보리, 밀, 귀리, 옥수수, 호밀의 세포벽을 더 잘 분해하였다. 식물 세포벽은 서로 다른 조성의 폴리사카라이드를 함유하고 있다. 예를 들면, 벼는 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 및 리그닌을 41.6%, 31.5%, 및 12.5%로 함유하고 있다. 반면에, 밀은 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 및 리그닌을 각각 34.9%, 22.5% 및 21.3%로 함유하고 있다. 이는 본 발명의 균주로부터 유도된 식물 세포벽 분해 효소가 기질 특이성이 낮음을 나타낸다.
본 발명의 균주로부터 유도된 식물 세포벽 분해 효소는 서로 다른 온도, 예를 들면 25℃ 및 40℃의 온도에서 유사한 효소 활성을 보여주었다. 스크리닝한 균주 중 식물 세포벽 분해 효소 활성이 유사하였던 푸사리움 속 Q7-21로부터 유래된 효소는 동일한 온도에서 효소 활성이 하루 이내에 매우 감소하였다. 그러나, 본 발명의 균주로부터 유도된 효소는 25℃ 및 40℃에서 3일 동안 최초 활성의 75%까지 유지되었다. 이는 본 발명의 균주가 매우 안정한 식물 세포벽 효소를 생산할 수 있음을 나타낸다.
또한, 본 발명의 균주는 벼 세포벽 분말이 1%(w/v)로 사용되었을 때 150㎍/ml/분의 속도로 벼 세포벽 분말을 발효성 당 또는 환원당(reducing sugar)으로 분해시켰다. 또한, 1 내지 3일 사이에 균주의 성장이 급격하게 증가하였다. 따라서, 본 발명의 균주는 바이오연료 생산에서 생산 경비를 줄일 수 있도록 식물 세포벽을 분해할 수 있는 산업상 용도로 사용가능함을 예상하게 한다.
본 발명의 일 구체예는 푸사리움 속 CGMCC 2710을 배양하여 배양물을 얻는 단계를 포함하는 식물 세포벽 분해 효소를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 의한 푸사리움 속 CGMCC 2710의 배양은 푸사리움 속 균주를 배양하는데 사용될 수 있다고 알려진 통상의 배지에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 기본 액체 배지(basic liquid medium, BLM) 배지 또는 포테이토 덱스트로스 아가(potato dextrose agar, PDA) 배지가 사용될 수 있다. 푸사리움 속 균주의 배양은 식물 세포벽 분해 효소의 생성 정도에 따라 배양 온도와 배양 시간을 조절할 수 있다. 예를 들면, 25-35℃, 특히 28℃에서 3-5일 동안 배양시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 의한 푸사리움 속 균주는 탄소원으로 식물 세포벽을 포함하는 배지에서 배양시킬 수 있다. 예를 들면, 탄소원으로 식물 세포벽만을 함유하는 배지에서 배양시킬 수 있다. 식물 세포벽은 배지에 대해 0.3-1.0%, 예를 들면 0.5%로 함유될 수 있다.
식물 세포벽 분해 효소를 제조하는 방법은 푸사리움 속 CGMCC 2710을 배양하여 얻은 배양물로부터 식물 세포벽 분해 효소를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 배양물을 원심분리하고 상층액(supernatant)을 회수하여 식물 세포벽 분해 효소를 제조할 수 있다. 예를 들면, 원심 분리는 3,000-4,000 rpm에서 5-10분 동안 수행될 수 있다. 얻은 배양물을 원심분리시키고 얻은 상층액을 식물 세포벽 분해 효소로 사용할 수 있다. 그러나, 추출, 결정화, 크로마토그래피 등의 통상의 방법을 사용하여 식물 세포벽 분해 효소만을 분리할 수 있다. 푸사리움 속 CGMCC 2710을 배양하여 얻은 배양물 자체 및 상기 배양물을 원심분리하고 회수한 상층액에는 식물 세포벽 분해 효소가 포함되어 있다.
본 발명의 일 구체예는 푸사리움 속 CGMCC 2710으로부터 얻은 식물 세포벽 분해 효소를 포함하는, 식물 세포벽 분해용 조성물을 제공한다.
상기 식물 세포벽 분해용 조성물은 푸사리움 속 CGMCC 2710을 그대로 포함할 수 있다. 또한, 식물 세포벽 분해용 조성물은 푸사리움 속 CGMCC 2710으로부터 얻은 식물 세포벽 분해 효소를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 식물 세포벽 분해 효소는 푸사리움 속 CGMCC 2710 배양물 또는 그 배양물로부터 세포 또는 세포 파쇄물(cell debris)을 제거하여 얻어진 물질의 형태일 수 있다. 예를 들면, 식물 세포벽 분해 효소는 푸사리움 속 CGMCC 2710 배양물 또는 그 배양물을 원심분리하여 얻은 상층액의 형태로 될 수 있다. 구체적으로, 상기 식물 세포벽 분해 효소는 푸사리움 속 CGMCC 2710을 배양하여 배양물을 얻는 단계; 상기 배양물로부터 식물 세포벽 분해효소를 분리하는 단계에 의해 얻어질 수 있다. 푸사리움 속 CGMCC 2710 배양은 25-35℃, 특히 28℃에서 3-5일 동안 이루어질 수 있다. 상기 배양물로부터 식물 세포벽 분해 효소를 분리하는 단계는 상기 배양물을 원심분리하고 상층액을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 원심분리는 3,000-4,000 rpm에서 5-10분 동안 수행될 수 있다. 얻은 배양물을 원심분리하고 얻은 상층액을 식물 세포벽 분해 효소로 사용할 수 있다. 그러나, 추출, 결정화, 크로마토그래피 등의 통상의 방법을 사용하여 식물 세포벽 분해 효소만을 분리할 수 있다.
또한, 상기 식물 세포벽 분해용 조성물은 푸사리움 속 CGMCC 2710의 성장에 영향을 주지 않거나 식물 세포벽 효소의 유도에 영향을 주지 않으면서 식물 세포벽 분해 효소를 생산할 수 있는 다른 균주 또는 이로부터 유도된 식물 세포벽 분해 효소를 더 포함할 수 있다. 이러한 균주로는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 페니실리움 푸니쿨로섬(Penicillium funiculosum), 시조필륨 코뮨(Schizophyllum commune), 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei) 등이 있을 수 있지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 상기 식물 세포벽 효소로는 엔도글루카나제, 셀로비오히드로라제, 글루코시다제, 엑소글루카나제, 엔도실라나제, β-실로시다제, β-엔도만난나제, β-만노시다제, 펙틴 히드로라제, 펙틴 용해효소, α-실로시다제, 아라비녹실란아라미노푸라노히드로라제, 엔도 및 엑소아라비나제, α- 및 β-갈락토시아제, 엔도- 및 엑소-갈락탄나제, α-글루쿠로니다제, 페루로일, ρ-쿠마로일, 아세틸 및 메틸 에스테라제 등이 될 수 있다.
본 발명의 일 구체예는 식물 세포벽을 푸사리움 속 CGMCC 2710으로부터 얻은 식물 세포벽 분해 효소와 접촉시키는 단계를 포함하는, 식물 세포벽을 분해하는 방법을 제공한다.
상기 식물 세포벽 분해 효소는 푸사리움 속 CGMCC 2710 배양물 또는 그 배양물을 원심분리하여 얻은 상층액의 형태일 수 있다.
상기 접촉시키는 단계는 배양한 푸사리움 속 CGMCC 2710을 그대로 사용하여 식물 세포, 식물 세포벽 또는 식물 세포벽 분말에 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 푸사리움 속 CGMCC 2710을 배양하여 얻은 배양물 또는 그 배양물을 원심 분리하여 얻은 상층액에 식물 세포, 식물 세포벽 또는 식물 세포벽 분말을 처리할 수 있다. 푸사리움 속 CGMCC 2710 배양물 또는 상층액을 처리하는 조건은 식물의 종류에 따라 변경시킬 수 있다. 예를 들면, 식물 세포벽이 푸사리움 속 CGMCC 2710 배양물 또는 상층액을 25-35℃, pH 4.5-5.5에서 3-5일 동안 접촉시킬 수 있다.
상기 식물 세포벽을 분해하는 방법에 의해 생성되는 식물 세포벽 분해 생성물은 식물 세포벽에 포함되어 있는 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 펙틴 및 리그닌 등의 분해에 의해 생성되는 발효성 당(fermentable sugar)을 포함할 수 있다. 발효성 당은 예를 들면, 포도당, 과당, 만노오스 등의 6탄당, 맥아당, 자당(설탕) 등이 될 수 있다.
본 발명의 일 구체예는 본 발명의 일 구체예에 의한 식물 세포벽을 분해하는 방법에 의해 생성된 식물 세포벽 분해 생성물에 바이오연료를 생산할 수 있는 미생물을 반응시키는 단계를 포함하는, 바이오연료를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 미생물은 식물 세포벽 분해 생성물에 작용하여 에탄올 등의 바이오연료를 생성할 수 있는 것들이다. 예를 들면, 상기 미생물은 효모 또는 클로스트리듐(Clostridium spp.)과 같은 발효 박테리아(fermenting bacteria)가 될 수 있다.
본 발명의 균주는 탄소원으로 식물 세포벽 분말 만에 의해 쉽게 유도되고 세포벽 분해 활성이 높으며 매우 안정한 세포벽 분해 효소를 생산할 수 있다. 또한, 액체 배지에서 빨리 성장하여 비교적 단기간에 식물 세포벽 분해 효소를 높은 수준 으로 생산할 수 있다. 또한, 벼뿐만 아니라, 보리, 밀, 귀리, 옥수수, 호밀 등의 대부분의 식물의 세포벽을 분해시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예
1. 균주의 분리
푸사리움 속 Q7-31을 포함하는 18개의 균주를 중국의 티벳 알티플라노(Tibet altiplano) 지역에 있는 곰보버섯으로부터 분리하였고, 플레이트에서 계대 배양을 통해 스크리닝하면서 순수한 균주들을 분리하였다. 18개의 균주를 각각 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp .) A-1, 푸사리움 속 Q7-21, Q7-31, F-1 및 F-2, 게오트리쿰 속(Geotrichum sp .) G-1, 모르첼라 속(Morchella spp .) M-1, M-2, M-3, M-4, 및 M-5, 무코르 속(Mucor spp .) U-1, U-2, U-3 및 U-4, 페니실리움 속(Penicilium sp .) P-1, 페스탈로티옵시스 속(Pestalotiopsis sp .) E-1, 트리코데르마 속(Trichoderma sp.) T-1로 명명하였다. 스크리닝을 위한 배지(pH 7.0)는 0.6% 펩톤, 0.1% K2HPO4, 0.05% MgSO4.7H2O 및 1% 글루코스로 구성된다. 18개의 균주를 아가 플레이트에 접종하고 28℃에서 3 내지 5일 동안 배양하였다. 아가 플레이트에서 키운 18개 균주의 콜로니들을 새로운 아가 플레이트로 계대 배양하였다. 균일하게 자란 콜로니에서 균사들을 제거하였고, 스크리닝 아가 배지와 동일한 조성의 기본 액체 배지(basic liquid medium, BLM)에 접종하였다. 액체 상태의 배양물을 28℃에서 100 rpm으로 회전 진탕기에서 유지하였다. 분리한 균주들을 PDA(potato dextrose agar) 플레이트에 접종하였고 4℃에서 유지하였다.
2. 세포벽 분해 활성을 갖는 균주 스크리닝
탄소원으로 1% 글루코스를 함유하는 기본 액체 배지(BLM) 50 ml에 각각의 균주의 균사를 접종하였고, 포화 상태가 될 때까지 배양하였다. 포화된 배양물 약 50 ㎕를 0.5% 벼 세포벽 분말 함유하는 BLM 배지 5 ml에 옮겼고 28℃에서 배양하였다. 각각의 배양 배지 1 ml에 들어있는 환원당을 디니트로살리신산(dinitrosalicylic acid, DNS) 방법(Sengupta et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000, 53(6): 732-5)으로 측정하였고, 18개 균주에 대해 그 결과를 비교하였다. 균주 배양물 0.5 ml와 DNS 시약(0.5% DNS, 0.025% 중황산나트륨, 0.5% NaOH, 0.1% 페놀, 및 2.5N KOH) 0.1 ml를 10분 동안 100℃에서 배양하였다. 증류수 0.4 ml를 첨가하여 전체 부피를 1 ml로 만들었다. 575 nm에서 흡광도(A575) 측정하였고, 3일 및 6일째로 2회 측정하였다. 그 결과를 표 1, 도 1 및 도 2 에 나타내었다.
표 1: 스크리닝된 18개 균주의 배양 시간에 따른 환원당의 비율 및 벼 세포벽 분해 정도
균주 속
 균주명
 환원당 A575 벼 세포벽 분해 정도＊
3일 6일 3일 6일
아스퍼질러스 속 A-1 0.03 0.12±0.018 M H
푸사리움 속


 Q7-21 0.12±0.023 0.27±0.009 H H
Q7-31 0.24±0.004 0.34±0.029 H H
F-1 0.06 0.17±0.012 M M
F-2 0 0.05 H H
게오트리쿰 속 G-1 0.13±0.029 0.03 N P
모르첼라 속



 M-1 0.06 0.04 H H
M-2 0.01 0 N P
M-3 0.04 0.02 N P
M-4 0 0.10±0.008 N M
M-5 0.26±0.013 0 N P
무코르 속


 U-1 0.20±0.009 0.05 P M
U-2 0.03 0.04 M H
U-3 0 0 H H
U-4 0 0.03 H H
페니실리움 속 P-1 0.10±0.005 0.05 M H
페스탈로티옵시스 속 E-1 0.06 0.19±0.015 H H
트리코데르마 속 T-1 0.06 0.11±0.028 H H
(＊벼 세포벽 분해 정도; H: 높음, M: 중간 정도, P: 좋지 않음, N: 검출될 정도로 세포벽이 분해되지 않음)
도 1은 탄소원으로 0.3% 벼 세포벽 분말만을 사용한 배지에서 균주((A)모르첼라 속 M-1, (B) 푸사리움 속 Q7-31; (C) 페스탈로티옵시스 속 E-1; (D) 푸사리움 속 Q7-21; (E) 트리코데르마 속 T-1; (F) 페니실리움 속 P-1; (G) 무코르 속 U-1; (H) 푸사리움 속 F-2; (I) 게오트리쿰 G-1; (J) 모르첼라 속 M-2; (K) 모르첼라 속 M-3)를 3일 동안 배양하였을 때의 상태를 나타낸 것이다.
도 1의 결과에 따르면, (A) 내지 (E)는 콜로이드 상태가 되어 균주들이 식물 세포벽 분말을 잘 분해하였음을 나타낸다. 반면, (I) 내지 (K)는 세포벽 분말이 전혀 분해되지 않고 최초 상태의 과립 상태로 존재하고 있음을 나타낸다. (F) 내지 (H)는 균사와 부분적으로 분해된 세포벽 분말이 응집되어 있음을 나타낸다.
도 2는 0.3% 벼 세포벽 분말을 함유하는 배지에서 3일 및 6일 동안 18개 균주를 각각 배양하였을 때 생성된 환원당을 DNS 방법으로 측정한 결과이다.
도 2 및 표 1의 결과에 따르면, 모르젤라 속 M-5와 무코르 속 U-1은 3일째에는 세포벽 분말의 분해가 어느 정도 진행되었다. 6일 째에는 세포벽 분말의 분해가 전혀 일어나지 않았음을 보여준다. 그러나, 푸사리움 속 Q7-31과 Q7-21은 3일과 6일 모두에서 식물 세포벽 분말의 분해가 많이 진행되었다. 특히, 푸사리움 속 Q7-31은 푸사리움 속 Q7-21에 비해 분해가 많이 진행되었고 하기에서 살핀 바와 같이 푸사리움 속 Q7-21보다 효소 안정성이 더 높았다. 따라서, 푸사리움 속 Q7-31을 선택하고 이의 균학적 성질 및 분자유전학 계통을 규명하였다.
3. 푸사리움 속 Q7 -31의 형태 및 규명
0.3% 벼 세포벽 분말을 함유하는 플레이트에서 푸사리움 속 Q7-31을 28℃에서 5일 동안 배양하고, 균사체(mycelia) 넒이, 포자 형성 및 포자 형태와 같은 형태학적 측정 방법으로 푸사리움 속 Q7-31을 규명하였다.
도 3은 푸사리움 속 Q7-31의 콜로니 및 이를 확대한 것이다.
도 3의 결과에 따르면, 플레이트에서 자란 푸사리움 속 Q7-31의 균사체는 백색의 융모 형태(villiform)의 콜로니를 형성하였고 격벽(septa)이 있는 필라멘트형 균사(filamentous mycelia)로 구성되어 있음을 알 수 있다.
5일 동안 PDA 플레이트에서 자란 푸사리움 속 Q7-31 균사체로부터 게놈 DNA를 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide) 추출 방법(Van Burik et al., Med. Mycol. 1998, 36(5): 299-303)을 사용하여 추출하였다. 추출한 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 18S 리보솜 RNA 유전자의 일부 서열, ITS(internal transcribed spacer) 1, 5.8S 리보솜 RNA 유전자, ITS 2, 및 28S 리보솜 RNA 유전자의 일부 서열에 해당되는 게놈 DNA 영역(567 base, 서열번호 1)을 PCR로 증폭하였다(ITS5 정방향 프라이머: 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3' 서열번호 2, ITS4 역방향 프라이머: 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 서열번호 3). PCR 프로그램은 95℃에서 5분 동안의 초기 변성 후, 30 주기의 94℃에서 30초 동안 변성, 54℃에서 30초 동안 결합, 72℃에서 1분 동안 증폭과 최종적으로 72℃에서 7분 동안 증폭하였다. PCR 생성물의 서열을 NCBI BLAST 데이타베이스로 분석하였다. 특히 푸사리움 속(Fusarium sp .), 지베렐라 속(Gibberella sp .), 및 코르디세프스 속(Cordyceps sp .)과 비교하였다.
도 4는 푸사리움 속 Q7-31 및 비교 속들의 서열을 나타낸 것이다.
도 4의 결과에 따르면, 푸사리움 속 Q7-31은 푸사리움 속인 푸사리움 속 5/97-45(AJ279478), 푸사리움 속 MOD-13(EU589150), 푸사리움 속 NRRL13708(X65480), 푸사리움 속 F13(EF055302), 지베렐라 속인 지베렐라 속 FA05(EU255795), 및 코르디세프스 속인 코르니세프스 속 (AB067719)과 99% 동일한 서열을 나타내었다. 도 3과 도 4에 따라 콜로니 형태 및 서열 분석을 통해 푸사리움 속 Q7-31은 푸사리움 속에 속함을 확인하였다. 본 발명자는 상기 분리한 푸사리움 속 Q7-31을 중국 과학원 미생물 저장소에 2008년 10월 14일로 기탁하였고, 수탁번호 CGMCC 2710를 받았다.
4. 푸사리움 속 Q7 -31 및 Q7 -21로부터 생성된 효소 안정성 비교
18개 균주 중 세포벽 분해 활성이 높았던 푸사리움 속 Q7-31과 Q7-21을 각각 0.5% 벼 세포벽 분말을 함유하는 BLM 배지에서 28℃에서 3일 동안 배양하였다. 배양 배지의 일부를 원심분리하여 균사체와 잔여 세포벽 분말을 제거하였고 상층액을 얻었다. 50 mM 시트릭-포스페이트 버퍼 중에 배양 상층액 0.2 ml와 1.0 %(w/v) 벼 세포벽 분말 0.4 ml로 구성되는 효소 반응 용액(pH 5.5)을 제조하였다. 효소 반응을 25℃ 또는 40℃에서 4일 동안 수행하였다. 특정한 시간에 환원당의 함량을 상기 기술한 바와 같은 DNS 방법으로 측정하였다. 0시간일 때의 환원당에 대한 특정한 시간의 환원당의 비율로 잔여 효소의 활성을 퍼센트로 나타내었다. 그 결과를 표 2와 도 5에 나타내었다.
표 2: 푸사리움 속 Q7-31과 Q7-21로부터 유도된 식물 세포벽 분해 효소의 처리 온도 및 처리 시간에 따른 효소 활성
시간(hr)
 Q7-31 Q7-31 Q7-21
25℃ 40℃ 25℃
0 100 100 100
2 100 99.8 100
4 99.5 83.8 74.0
12 95.0 83.0 60.0
24 80.0 82.7 0
78 75.1 82.2 0
80 76.3 80.0 0
82 65.5 64.5 0
84 52.0 57.4 0
96 53.1 46.1 0
도 5는 푸사리움 속 Q7-31 및 Q7-21 균주로부터 유도된 식물 세포벽 분해 효소의 처리 시간 및 처리 온도에 따른, 식물 세포벽 분해 효소의 상대적 활성을 나타낸 것이다.
표 2 및 도 5에 따르면, 푸사리움 속 Q7-21로부터 유래된 효소의 활성은 동 일한 온도에서 하루 만에 감소하였다. 특히, 푸사리움 속 Q7-21로부터 유래된 효소는 24시간을 처리하였을 때에는 효소 활성이 남아있지 않았다. 그러나, 푸사리움 속 Q7-31로부터 유래된 효소는 25℃에서 3일 동안 최초 활성의 75%까지 유지되었다. 또한, 푸사리움 속 Q7-31로부터 유래된 효소는 40℃와 25℃에서 유사한 활성을 보여주었다.
5. 식물 종류에 따른 식물 세포벽 분해 활성
벼, 보리, 밀, 귀리, 옥수수, 호밀의 종자를 30분 동안 가정용 표백제의 2분의 1 농도로 표면만 살균하였고, 물로 포화된 토양에 심었다. 20일령된 줄기를 액체 질소에서 갈아 미세한 분말로 만들었다. 95% 에탄올 중 65℃에서 분말을 배양함으로써 엽록소와 가용성 성분들을 대충 제거하였다. 3000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 액체 상태를 제거하였다. 얻은 고체 물질을 65℃ 오븐에서 완전히 건조시킨 후에, 건조된 분말을 균일하고 미세한 분말로 더 갈았다. 이를 통해 식물 세포벽 분말을 제조하였다.
푸사리움 속 Q7-31을 0.5% 벼 세포벽 분말을 함유하는 BLM에서 28℃에서 3일 동안 배양하였다. 배양 배지의 일부를 원심분리하여 균사체와 잔여 세포벽 분말을 제거하고 상층액을 얻었다. 50 mM 시트릭-포스페이트 버퍼 중에 배양 상층액 0.2 ml와 1.0%(w/v) 상기 제조한 식물 세포벽 분말 0.4 ml로 구성되는 효소 반응 용액(pH 5.5)을 제조하였다. 효소 반응을 40℃에서 10분 동안 수행하였다. DNS 방법으로 환원당을 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6은 식물 종류에 따른 푸사리움 속 Q7-31의 세포벽 분해 활성을 나타낸 것이다.
도 6의 결과에 따르면, 푸사리움 속 Q7-31으로부터 유래된 효소는 벼 세포벽 분말보다 다른 식물 세포벽 분말에 대해 더 높은 분해 활성을 나타내었다. 즉, 벼 세포벽 분말을 함유하는 배지에서 유도된 세포벽 분해 효소는 벼 이외의 다른 식물에 대한 활성이 더 컸다. 이는 본 발명의 균주로부터 유도된 식물 세포벽 효소가 기질 특이성이 낮음을 예상하게 한다.
6. 푸사리움 속 Q7 -31의 성장속도, 효소 활성 및 단백질 농도 결정
푸사리움 속 Q7-31의 균사체를 0.6% 펩톤, 0.1% K2HPO4, 0.05% MgSO4.7H2O, 및 탄소원으로 0.3% 벼 세포벽 분말을 함유하는 배양 배지(pH 7.0) 5 ml 플레이트의 중심에 접종하였다. 액체 배양물을 100 rpm에서 28℃ 배양기에서 연속적으로 흔들면서 배양하였다. 균주 성장 속도는 콜로니 직경을 매일 측정하여 콜로니 직경의 증가로 나타내었다.
도 7은 푸사리움 속 Q7-31의 배양 시간에 따른 콜로니의 직경을 나타낸 것이다.
도 7의 결과에 따르면, 배양하고 7일 안에 직경이 약 6 cm에 도달하였다. 특히 1 내지 3일 사이에 균주의 성장이 급격하게 증가하였다.
푸사리움 속 Q7-31을 0.5% 벼 세포벽 분말을 함유하는 BLM에서 28℃에서 배양하였다. 푸사리움 속 Q7-31을 배양하면서 동일한 시간에 배양 배지의 일부를 원심분리하여 균사체와 남아있는 세포벽 분말을 제거하고 상층액을 얻었다. 얻은 상 층액과 1% 벼 세포벽 분말을 40℃에서 10분 동안 배양하면서 효소의 활성을 측정하였다. DNS 측정 방법에 따른 전체 환원당의 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를 농도를 알고 있는 글루코스로부터 유래된 표준 곡선에 의해 ㎍/ml로 표시하였다. 효소 활성은 얻은 ㎍/ml 값을 효소 반응 시간 10분으로 나눔으로써 계산하였다. 그 결과를 도 8과 표 3에 나타내었다.
표 3: 푸사리움 속 Q7-31의 배양 시간에 따른 식물 세포벽 분해 효소 활성
배양 시간(일) 효소 활성(㎍/ml/분)
1 34.7±1.42
2 41.6±1.32
3 66.5±8.34
4 46.6±6.26
5 67.1±7.06
6 49.7±9.09
7 83.8±17.83
8 57.0±16.55
9 25.6±4.72
도 8은 푸사리움 속 Q7-31의 배양 시간에 따른 세포벽 분해 효소 활성을 나타낸 것이다.
도 8과 표 3에 따르면, 3일 이내에 효소활성이 상당히 증가하였다.
단백질 농도는 표준 곡선을 만들기 위해 소혈청알부민(BSA)을 사용하는 Bradford 방법에 의해 결정하였다. 분석 혼합물은 Coomassie Bright Blue G250 시약 0.4 ml, 및 얻은 상층액 1.6 ml로 구성되었다. 배양 시간에 따라 상층액 일부에 대해, 5분 이내에 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. BSA에 의한 표준 곡선에 기초하여, 흡광도를 ㎍/ml로 전환하였다.
도 9는 푸사리움 속 Q7-31의 배양 시간에 따른 단백질 농도를 나타낸 것이다.
도 9의 결과에 따르면, 배양하고 5일부터 단백질 농도가 감소하였다.
도 1은 탄소원으로 0.3% 벼 세포벽 분말만을 사용한 배지에서 균주를 3일 동안 배양하였을 때 배지의 모습을 나타낸 것이다.
(A)모르첼라 속 M-1, (B) 푸사리움 속 Q7-31; (C) 페스탈로티옵시스 속 E-1; (D) 푸사리움 속 Q7-21; (E) 트리코데르마 속 T-1; (F) 페니실리움 속 P-1; (G) 무코르 속 U-1; (H) 푸사리움 속 F-2; (I) 게오트리쿰 G-1; (J) 모르첼라 속 M-2; (K) 모르첼라 속 M-3.
도 2는 0.3% 벼 세포벽 분말을 함유하는 배지에서 3일 및 6일 동안 각각의 균주를 배양하였을 때 생성된 환원당을 DNS 방법으로 측정한 결과이다.
도 3은 푸사리움 속 Q7-31의 콜로니 및 콜로니를 확대한 것이다.
도 4는 푸사리움 속 Q7-31 및 비교 속들의 ITS 서열을 나타낸 것이다(차이가 있는 159개 염기만 표시됨). 화살표는 ITS2와 28S 리보솜 RNA 유전자의 경계를 나타낸다.
도 5는 푸사리움 속 Q7-31 및 Q7-21 균주로부터 유도된 식물 세포벽 분해 효소의 처리 시간 및 처리 온도에 따른, 식물 세포벽 효소의 상대적 활성을 나타낸 것이다.
도 6은 식물 종류에 따른 푸사리움 속 Q7-31의 세포벽 분해 활성을 나타낸 것이다.
도 7은 푸사리움 속 Q7-31의 배양 시간에 따른 콜로니의 직경을 나타낸 것이다.
도 8은 푸사리움 속 Q7-31의 배양 시간에 따른 세포벽 분해 효소 활성을 나타낸 것이다.
도 9는 푸사리움 속 Q7-31의 배양 시간에 따른 단백질 농도를 나타낸 것이다.
<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION QINGHAI UNIVERSITY <120> FUNGUS STRAIN FUSARIUM SP. CAPABLE OF DEGRADING PLANT CELL WALL MATERIALS AND A METHOD FOR DEGRADING PLANT CELL WALL MATERIALS USING THE SAME FUNGUS <130> PN082248 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 564 <212> DNA <213> Fusarium sp. Q7-31 <400> 1 gaatatcggg aattctacct gatccgaggt caacattcag aagttggggt tttacggcat 60 ggccgcgccg cgttccagtt gcgaggtgtt agctactacg caatggaggc tgcagcgaga 120 ccgccaatgt atttcggggg cggcaccgcc cagaagggca gagccgatcc ccaacaccaa 180 acccgggggc ttgagggttg aaatgacgct cgaacaggca tgcccgccgg aataccagcg 240 ggcgcaatgt gcgttcaaag attcgatgat tcactgaatt ctgcaattca cattacttat 300 cgcattttgc tgcgttcttc atcgatgcca gaaccaagag atccgttgtt gaaagttttg 360 atttatttgt ttgttttact cagaagttac aataagaaac attagagttt gggtcctctg 420 gcgggccgtc ccgttttacg gggcgcgggc tgatccgccg aggcaacatt aaggtatgtt 480 cacaggggtt tgggagttgt aaactcggta atgatccctc cgctggttca ccaacggaga 540 ccttgttacg acttttactt cctc 564 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS5 forward primer <400> 2 ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS4 reverse primer <400> 3 tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (17)

  1. 식물 세포벽 분해 효소를 생산하는 푸사리움 속(Fusarium sp .) CGMCC 2710.
  2. 푸사리움 속 CGMCC 2710을 배양하여 배양물을 얻는 단계를 포함하는 식물 세포벽 분해 효소를 제조하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 배양은 25-35℃에서 3-5일 동안 이루어지는 것인 식물 세포벽 분해 효소를 제조하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 배양은 탄소원으로 식물 세포벽만을 함유하는 배지에서 이루어지는 것인 식물 세포벽 분해 효소를 제조하는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 배양물로부터 식물 세포벽 분해 효소를 분리하는 단계를 더 포함하는 것인 식물 세포벽 분해 효소를 제조하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 식물 세포벽 분해 효소를 분리하는 단계는 상기 배양물을 원심분리하고 상층액을 회수하는 단계를 포함하는 것인 식물 세포벽 분해 효소를 제조하는 방법.
  7. 푸사리움 속 CGMCC 2710으로부터 얻은 식물 세포벽 분해 효소를 포함하는, 식물 세포벽 분해용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 식물 세포벽 분해 효소는 푸사리움 속 CGMCC 2710 배양물 또는 그 배양물로부터 세포 또는 세포 파쇄물(cell debris)을 제거하여 얻어진 물질의 형태인 것인 식물 세포벽 분해용 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 식물 세포벽 분해 효소는 푸사리움 속 CGMCC 2710을 배양하여 배양물을 얻는 단계; 상기 배양물로부터 식물 세포벽 분해 효소를 분리하는 단계에 의해 얻어지는 것인 식물 세포벽 분해용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 배양은 25-35℃에서 3-5일 동안 이루어지는 것인 식물 세포벽 분해용 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 식물 세포벽 분해 효소를 분리하는 단계는 상기 배양물을 원심분리하고 상층액을 회수하는 단계를 포함하는 것인 식물 세포벽 분해용 조성물.
  12. 식물 세포벽을 푸사리움 속 CGMCC 2710으로부터 얻은 식물 세포벽 분해 효소와 접촉시키는 단계를 포함하는, 식물 세포벽을 분해하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 식물 세포벽 분해 효소는 푸사리움 속 CGMCC 2710 배양물 또는 그 배양물을 원심분리하여 얻은 상층액의 형태인 것인 식물 세포벽을 분해하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 25-35℃, pH 4.5-5.5에서 3-5일 동안 이루어지는 것인 식물 세포벽을 분해하는 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 식물 세포벽을 분해하는 방법에 의해 생성되는 식물 세포벽 분해 생성물은 발효성 당(fermentable sugar)을 포함하는 것인 식물 세포벽을 분해하는 방법.
  16. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법으로 얻은 식물 세포벽 분해 생성물에 바이오연료(biofuel)을 생산할 수 있는 미생물을 반응시키는 단계를 포함하는 바이오연료를 제조하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 미생물은 효모 또는 발효 박테리아인 것인 바이오연료를 제조하는 방법.
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KR1020090005209A KR20100085751A (ko) 2009-01-21 2009-01-21 식물 세포벽을 분해하는 푸사리움 속 균주 및 이를 이용하여 식물 세포벽을 분해하는 방법

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