KR20100067850A - Cell expressing dopamine d2 receptor and method of developing novel drugs using the cell - Google Patents

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KR20100067850A
KR20100067850A KR1020080126428A KR20080126428A KR20100067850A KR 20100067850 A KR20100067850 A KR 20100067850A KR 1020080126428 A KR1020080126428 A KR 1020080126428A KR 20080126428 A KR20080126428 A KR 20080126428A KR 20100067850 A KR20100067850 A KR 20100067850A
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백광희
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Abstract

PURPOSE: A polynucleotide which is able to over-express dopamine D2 receptor and a transformant are provided to use in developing a novel drug by targeting dopamine receptor D2. CONSTITUTION: A polynucletodie which is able to over-express dopamine D2 receptor comprises a nucleotide of sequence number 2. A mammalian cell expression vector comprises a polynucleotide of sequence number 2. A transformant is produced by transducing the polynucleotide of sequence number 2 to a host cell. The host cell is BHK(baby hamster kidney cell), CHO(Chinese hamster ovary) cell, mouse embryonic fibroblast cell line, human embryonic kidney cell, and myeloma cell.

Description

도파민 Ｄ2 수용체 발현 세포주 및 이를 이용한 신약 개발 방법{CELL EXPRESSING DOPAMINE D2 RECEPTOR AND METHOD OF DEVELOPING NOVEL DRUGS USING THE CELL}Dopamine D2 receptor expressing cell line and new drug development method using the same {CELL EXPRESSING DOPAMINE D2 RECEPTOR AND METHOD OF DEVELOPING NOVEL DRUGS USING THE CELL}

도파민 D2 수용체를 과발현할 수 있는 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 발현벡터, 이를 포함하는 형질전환체, 상기 형질전환체의 제조 방법, 및 상기 형질전환체를 이용하는 신약 개발 방법이 제공된다.A polynucleotide capable of overexpressing a dopamine D2 receptor, an expression vector comprising the same, a transformant comprising the same, a method for producing the transformant, and a method for developing a new drug using the transformant are provided.

G-단백질 결합 수용체(G-protein coupled receptor; GPCR)의 구조적인 특성은 7개의 막통과 도메인(transmembrane domain)을 가지고 있으며, 많은 신경전달물질 (Neurotransmitter), 호르몬 (Hormone), 사이토카인 (Cytokine), 향기 (Odorants), 빛 (Light) 등의 다양한 외부 자극을 세포내부로 전달하는 역할을 한다. 이들의 신호전달체계는 G-단백질 (GTP-결합 단백질; GTP-binding protein)을 통하여 생체내로 신호가 전달되어, 세포 내의 효소 활성 및 이온 채널을 효과기(effector)로 사용하여 성장, 분화, 사멸 등을 조절하게 된다 (Gilman, 1987, Bockaert et al., 1999, Ristiansen, 2004, McCudden et al., 2005). 지난 수 십년 동안 G-단백질을 포함한 많은 종류의 수용체와 효과기 등에 대한 기능 연구가 수행되었지만, G-단백질의 구조적 및 기능적인 복합성이 외부 자극에 대해 적절하고 특이적인 세포 수준의 반응을 어떠한 작용기전으로 유도하는지는 아직 미지수이다. G-단백질이 신호전달의 중요한 위치를 차지하고 있지만, 단독적으로 신호를 전달하는 것이 아니라 복잡한 다른 여러 종류의 신호전달체계와 협력하고 있으며 가장 중요한 역할을 수행하고 있다. GPCR의 신호전달체계는 마약중독, 항히스타민제, 향정신병 약물, 우울증 치료제 등을 비롯한 수 백가지 약물의 표적으로서 이미 제약 시장의 50% 이상을 차지하고 있으며 계속적으로 이들 수용체를 표적으로 한 새로운 약물 후보물들이 연구 개발 중에 있다 (Hill SJ., 2006). 지금까지의 human genome project를 통하여 분석된 바로는, 약 1,000 종류 이상의 GPCR 유전자가 존재하는 것으로 예상되며, 이 중 약 650여종의 GPCR 유전자가 밝혀졌고, 약 200여 개의 GPCR의 생체 내 리간드가 알려졌으며, 나머지는 생체 내 ligand가 알려지지 않은 orphan GPCR로 분류되어 있다 (Bockaert et al., 1999, Pierce et al., 2002, Rana et al., 2002). GPCR의 다양성뿐만 아니라 또한 중요하게 고려되고 있는 것이 이 수용체들과 상호작용하는 G-단백질이다 (Gudermann et al., 1997, Wess, 1997, Gether et al., 1998). 하나의 G-단백질이 여러 수용체에 의한 반응을 매개하기도 하고 반대로 한 수용체가 여러 G-단백질을 조절하기도 한다.The structural properties of the G-protein coupled receptor (GPCR) have seven transmembrane domains, and many neurotransmitters, hormones, and cytokines. It transmits various external stimuli such as odors and light into the cell. These signaling systems transmit signals in vivo through G-proteins (GTP-binding proteins), and grow, differentiate, and kill cells using enzyme activity and ion channels as effectors. (Gilman, 1987, Bockaert et al. , 1999, Ristiansen, 2004, McCudden et al. , 2005). Although functional studies of many receptors and effectors, including G-proteins, have been conducted over the last few decades, the structural and functional complexity of G-proteins can provide an appropriate and specific cellular level response to external stimuli. It is still unknown whether it induces. Although G-proteins occupy an important place in signaling, they do not carry signals alone but work with many other complex signaling systems and play the most important role. GPCR's signaling system targets hundreds of drugs, including drug addiction, antihistamines, psychotropic drugs, and anti-depressants, already accounting for more than 50% of the pharmaceutical market, and new drug candidates targeting these receptors continue to In research and development (Hill SJ., 2006). As far as the human genome project has been analyzed, more than 1,000 GPCR genes are expected to be present, of which about 650 GPCR genes have been identified, and about 200 GPCR ligands in vivo are known. And the rest are classified as orphan GPCRs in which ligands are unknown in vivo (Bockaert et al. , 1999, Pierce et al. , 2002, Rana et al. , 2002). In addition to the diversity of GPCRs, it is also important to consider G-proteins that interact with these receptors (Gudermann et al. , 1997, Wess, 1997, Gether et al. , 1998). One G-protein mediates responses by several receptors, while one receptor modulates several G-proteins.

GPCR은 모노머 형태로 세포막에 존재할 것이라고 생각되어 왔지만, EGF 수용체 또는 사이토카인 수용체와 유사하게 다이머 또는 올리고머 형태로 존재한다는 보고가 있었다 (Bouvier et al., 2001, Lee　 et al., 2000, Milligan, 2004). 호 모올리고머는 세로토닌 수용체 중 하나인 5HT1B의 post-translational modification에 관하여 연구 중 모노머와 함께 관찰되었으며 (Ng　et al., 1993, Okamoto et al., 1998, Bai et al., 1998), 또한 같은 계열의 5HT1D에서도 호모올리고머가 존재한다고 보고되었다. 그리고 5HT1B와 5HT1D가 헤테로올리고머를 이룬다는 보고도 있었다 (Xie et al., 1999). 또한 도파민 D2 수용체와 무스카린성 아세틸콜린 수용체(muscarinic acetylcholine receptor) 등 여러 수용체에서도 보고되었다 (Zawarynski et al., 1998, Avissar et al., 1983). 이러한 올리고머는 호모올리고머 이외에도 헤테로올리고머의 형태도 많으며, 기본적으로 올리고머를 이루는 경우도 있으나 리간드에 의해 유발되거나 구조적으로 올리고머를 이루는 경우도 많다. 많은 GPCR 종류와 더불어 올리고머화(oigomerization)가 GPCR의 생리적인 현상을 매우 다양하고 복잡한 방식으로 나타나고 있다. 리간드의 결합을 촉진하거나 방해하는 약물학적 다양성과 세포 내 신호전달의 촉진 및 억제도 올리고머의 기능 중 하나이다.GPCRs have been thought to exist in the cell membrane in monomeric form, but it has been reported that they exist in dimeric or oligomeric form similar to EGF receptors or cytokine receptors (Bouvier et al. , 2001, Lee et al. , 2000, Milligan, 2004). ). Homooligomers were observed with monomers in the study of post-translational modification of one of the serotonin receptors, 5HT 1B (Ng et al. , 1993, Okamoto et al. , 1998, Bai et al. , 1998) . It has been reported that homooligomers also exist in the family of 5HT 1D . It has also been reported that 5HT 1B and 5HT 1D form heterooligomers (Xie et al. , 1999). It has also been reported in several receptors, including the dopamine D 2 receptor and the muscarinic acetylcholine receptor (Zawarynski et al. , 1998, Avissar et al. , 1983). These oligomers have many forms of hetero oligomers in addition to homo oligomers, and sometimes form oligomers, but are often induced by ligands or form oligomers structurally. Oligomerization, along with many GPCR types, reveals the physiological phenomena of GPCRs in a variety of complex ways. The pharmacological diversity that promotes or interferes with the binding of ligands and the promotion and inhibition of intracellular signaling are also functions of oligomers.

G-단백질은 수용체의 활성화에 의한 신호를 변환하는 구아노신 트리포스페이트(GTP) 결합 단백질로 세포막에 존재한다 (Offermanns, 2003). G-단백질에 의하여 조절되는 효과기 단백질로는 아데닐레이트 사이클레이즈(adenylate cyclase), 포스포리페이즈(phospholipase) A2, C 및 D, 등 효소와 Ca2 +, K+, 및 Na+ 통로 등이 있다. G-단백질은 3개의 소단위체로 이루어진 헤테로트라이머로서 Gα (39~45kDa), Gβ (35~39kDa), Gγ (6~8kDa)으로 이루어져있다 (Hepler et al., 1992, Gudermann et al., 1996, Hamm et al., 1996). GPCR의 신호전달은 불활성 상태에서 G-단백질의 α 소단위체가 GDP (guanosine diphosphate)와 결합하고 있다가 아고니스트 가 수용체와 결합하게 되면 α 소단위체가 GTP와 결합함으로써 활성화되며, 이때 βγ소단위체는 떨어져 나간다. 활성화된 G-단백질은 효과기인 아데닐레이트 사이클레이즈, 포스포리페이즈, 이온 통로 등의 활성을 조절하는데, 이렇게 G-단백질을 경유한 신호 변환은 α소단위체에 있는 GTPase에 의해 GTP가 GDP로 분해되고, βγ소단위체가 원래 위치로 다시 결합함으로서 끝이 난다 (Gilman, 1987, Bockaert et al., 1999, Neubig et al., 2002, Ristiansen, 2004, McCudden et al., 2005).G-protein is a guanosine triphosphate (GTP) binding protein that converts signals by activation of receptors and is present in the cell membrane (Offermanns, 2003). Effector proteins to be controlled by the G- protein may include adenylate cycle raised (adenylate cyclase), phospholipid phase (phospholipase) A2, C and D, such as enzymes and Ca 2 +, K +, and Na + channels . G-protein is a heterotrimer of three subunits consisting of Gα (39-45kDa), Gβ (35-39kDa), Gγ (6-8kDa) (Hepler et al. , 1992, Gudermann et al. , 1996 , Hamm et al. , 1996). GPCR signaling is activated in the inactive state when the α-subunit of G-protein binds to guanosine diphosphate (GDP) and then when the agonist binds to the receptor, the α-subunit binds to GTP, and the βγ subunit breaks off. . Activated G-proteins modulate the activity of effector adenylate cycles, phospholipids, ion channels, etc.This signal transduction via G-proteins breaks down GTP to GDP by GTPase in the α subunit. And ends by recombining the βγ subunit back to its original position (Gilman, 1987, Bockaert et al. , 1999, Neubig et al. , 2002, Ristiansen, 2004, McCudden et al. , 2005).

약물 개발에 있어 GPCR에 결합하는 ligand를 찾아내고, 이를 이용하여 유효물질이나 선도물질을 찾는 방법을 많이 이용하였다 (Lee et al., 2001, Kim et al., 2002). 최근에는 GPCR을 표적으로 하는 약물 개발에 있어서 가장 많이 쓰이는 고속처리검색법 (high-throughput screening:HTP)을 많이 사용하고 있으며, 선택성 (selectivity), 재현성 (reproducibility), 다목적성 (versatility) 등을 목적으로 개발되어 쉽고 빠른 분석이 가능하다는 장점을 가진다 (Pfleger et al., 2005).In drug development, ligands that bind to GPCR have been used and many methods have been used to find active substances or leading substances (Lee et al. , 2001, Kim et al. , 2002). Recently, high-throughput screening (HTP), which is most commonly used in the development of drugs targeting GPCR, has been used, and its purpose is to selectivity, reproducibility, versatileness, etc. It has been developed for the purpose of easy and fast analysis (Pfleger et al. , 2005).

Scintillation proximity assay는 신약개발을 위한 GPCR과 ligand나 G-protein 상호작용을 이용한 검색방법으로 β-emission sensitive scintillant가 처리된 microspere가 사용된다. 이 방법은 charge-coupled device를 이용하여 multi-well plate에서 대량의 샘플을 동시에 분석할 수 있는 장점을 가지고 있다. 그러나 bead가 가라앉고, assay volume이 작을수록 noise가 증가하는 단점과 화합물에서 발산되는 빛에 의해 간섭현상이 일어 날 수도 있다. 검출의 민감도를 높이기 위해 청색광을 흡수하고 적색광을 방출하는 scintillation imaging bead를 최근에는 많이 사용하고 있다 (Heilker et al., 2005).Scintillation proximity assay is a screening method using GPCR and ligand or G-protein interaction for drug development, and microspere treated with β-emission sensitive scintillant is used. This method has the advantage of simultaneously analyzing a large number of samples in a multi-well plate using a charge-coupled device. However, as the bead sinks and the assay volume is smaller, the noise increases and interference may be caused by the light emitted from the compound. To increase the sensitivity of detection, scintillation imaging beads that absorb blue light and emit red light have recently been used (Heilker et al. , 2005).

현재 형광을 이용한 GPCR 활성의 관찰에 이용되는 기법은 Fluorescence resonance energy transfer (FRET), bioluminescence resonance energy transfer (BRET), fluorescence lifetime imaging (FLIM), fluorescence correlation spectroscopy 등이 있다 (Selvin PR., 2000). 이들은 실시간으로 GPCR 입체형태의 변화, ligand-receptor나 protein-protein 상호작용을 관찰할 수 있기 때문에 환경과 수용체 사이의 상호작용을 살아 있는 세포에서 관찰할 수 있다는 장점을 제공하고 있으며 약물 개발에 있어서 중요한 desensitization, oligomerization, second messenger의 위치 등에 관한 정보도 얻을 수 있다.Current techniques for observing GPCR activity using fluorescence include fluorescence resonance energy transfer (FRET), bioluminescence resonance energy transfer (BRET), fluorescence lifetime imaging (FLIM), and fluorescence correlation spectroscopy (Selvin PR., 2000). They offer the advantage of being able to observe changes in the GPCR conformation and ligand-receptor or protein-protein interactions in real time, so that interactions between the environment and receptors can be observed in living cells and are important in drug development. Information on desensitization, oligomerization, and location of the second messenger can also be obtained.

　최근 GPCR이 의약학적인 신약의 타겟으로 큰 주목을 받는 이유는 GPCR은 세포막에 존재하기 때문에 protein의 활성 억제제와는 다르게, 세포 내로의 약물이동 없이 작용제(agonist)나 길항제(antagonist)로의 약물 개발이 용이하는 것이다 (Morris, 2004). 또한 대부분의 GPCR은 특정 조직과 특정 세포에서만 발현 된다. 이것은 부작용을 최소화한 특수 목적의 약 개발이 가능하다는 장점을 가지게 된다. Recently, GPCR has attracted great attention as a target for medicinal new drugs because GPCR is present in the cell membrane, and unlike protein inhibitors, it is easy to develop drugs as agonists or antagonists without drug movement into cells. (Morris, 2004). In addition, most GPCRs are expressed only in specific tissues and cells. This has the advantage that it is possible to develop special-purpose drugs with minimal side effects.

이에 본 발명은 GPCR의 대표적 종류인 도파민 수용체 (dopamine receptor) D2를 타겟으로 하는 신약 개발을 위한 기반 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a base technology for the development of a new drug targeting dopamine receptor D2, a representative type of GPCR.

본 발명의 구체예는 도파민 D2 수용체를 과발현할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.Embodiments of the present invention provide polynucleotides capable of overexpressing dopamine D2 receptors.

본 발명의 또 다른 구체예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.Another embodiment of the present invention provides an expression vector comprising the polynucleotide.

본 발명의 또 다른 구체예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형질전환체를 제공한다.Another embodiment of the present invention provides a transformant comprising the polynucleotide.

본 발명의 또 다른 구체예는 상기 형질전환체의 제조 방법을 제공한다.Another embodiment of the present invention provides a method for producing the transformant.

본 발명의 또 다른 구체예는 상기 형질전환체를 이용하여 신약을 개발하는 방법을 제공한다. Another embodiment of the present invention provides a method for developing a new drug using the transformant.

도파민 D2 수용체를 과발현할 수 있는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현벡터를 이용하여 제작된 형질전환체, 상기 형질전환체의 제조 방법, 및 상기 형질전환체를 이용하는 신약 개발 방법이 제공된다.A polynucleotide capable of overexpressing the dopamine D2 receptor, an expression vector comprising the polynucleotide, a transformant prepared using the expression vector, a method of preparing the transformant, and a drug development method using the transformant This is provided.

도파민 (dopamine)은 중추신경계와 일부의 자율신경계 신경절에 있는 카테콜라민 신경전달물질이다. 도파민 신경계는 뇌의 호르몬 조절뇌인 시상하부 (hypothalamus), 대뇌 변연계 (limbic system), 운동조절에 관여하는 선조체 (substantia nigra), 인간의 정신과 지식을 총괄하는 대뇌피질부 (cortex) 등의 네 부위에 주로 분포하고 있다 (Moore et al. 1978). 도파민 수용체는 크게 D1 과 D2 두 가지 type으로 분류하는 것이 가장 일반적이다 (Kebabian et al. 1979). 즉, 아데닐레이트 사이클레이즈를 활성화시켜 cAMP의 형성을 증가시키는 수용체를 D1 type이라고 부르며 반대로 cAMP의 형성을 억제하던가 전혀 영향을 미치지 않는 수용체를 D2 type이라 한다. 양적으로는 D1 type이 더 흔하게 분포하고 있다. 약리학적으로 D1과 D2로 분리되던 도파민 수용체는 분자생물학의 도입으로 이제는 5개로 세분화 되었는데, D1은 D1와 D5로 세분화 되었고, D2는 D2, D3, 그리고 D4로 세분화 되었다. 도파민 신경계에 이상이 생기면 호르몬 분비의 이상, 정서 및 기억장애, 파킨슨병 등이 생기게 된다. 이 도파민 신경계의 활동이 과다하게 되면 정신 분열병 증상이 생기는 것으로 알려져 있다.Dopamine is a catecholamine neurotransmitter in the central nervous system and some autonomic ganglia. The dopamine nervous system is divided into four parts: the hypothalamus, the hormonal regulatory brain of the brain, the limbic system, the substantia nigra involved in motor control, and the cortex, which oversees the human mind and knowledge. Mainly distributed in (Moore et al. 1978). Dopamine receptors are most commonly classified into two types, D1 and D2 (Kebabian et al. 1979). That is, a receptor that activates adenylate cyclase to increase the formation of cAMP is called a D1 type. On the contrary, a receptor that inhibits or does not affect the formation of cAMP is called a D2 type. Quantitatively, the D1 type is more commonly distributed. Dopamine receptors, pharmacologically separated into D1 and D2, are now subdivided into five with the introduction of molecular biology, with D1 subdivided into D 1 and D 5 , and D2 into D 2 , D 3 , and D 4 . Abnormalities in the dopamine nervous system can lead to abnormal hormone secretion, emotional and memory disorders, and Parkinson's disease. Excessive activity of the dopamine nervous system is known to cause schizophrenia symptoms.

　본 발명의 구체예에서 도파민 D2 수용체를 dhfr (dehydofolate reductase, DHFR) 유전자가 결핍되어 있는 chinese hamster ovary (CHO) 세포 DG44를 이용하여 과발현 세포주를 개발하고, 도파민 D2 수용체의 활성을 측정할 수 있는 다양한 생화학적 분석방법과 고속처리 검색법을 개발하여 유효물질, 선도물질, 신약 후보 물질 발굴에 이용하고자 하였다. 여러 가지 후보약물 중 좀 더 효과적인 약물을 선별하기 위한 cell-based high-throughput drug screening system 도입 유용성을 확립 하고자 하였다. 그 결과, 포유동물 세포를 이용한 도파민 D2 수용체 발현 세포 주 제조에 성공하였고, 세포주 표면에 발현된 수용체는 대표적인 리간드에 대해 반응하여 세포내의 신호 전달체계를 활성화 시킴을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 따라서, 본 발명은, 향후 세포기반 분석시스템을 이용하여 천연물이나 한약제 등으로부터 선도물질을 발굴하는데 있어서 매우 유용하게 사용될 것으로 기대된다.In an embodiment of the present invention, the dopamine D2 receptor can be developed using the Chinese hamster ovary (CHO) cell DG44, which lacks the dhfr (dehydofolate reductase (DHFR)) gene, to develop an overexpressed cell line and measure the activity of the dopamine D2 receptor. Biochemical analytical methods and high-speed screening methods were developed and used for the discovery of active substances, leading substances, and new drug candidates. The purpose of this study was to establish the usefulness of introducing a cell-based high-throughput drug screening system to select more effective drugs among various candidate drugs. As a result, the production of dopamine D2 receptor-expressing cell lines using mammalian cells was successful, and the receptor expressed on the cell line surface was confirmed to activate an intracellular signal transduction system in response to a representative ligand to complete the present invention. Therefore, the present invention is expected to be very useful for discovering the leading substances from natural products and herbal medicines using cell-based analysis system in the future.

본 발명의 일 실시예는 도파민 D2 수용체를 과발현하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드는 야생형 도파민 D2 수용체 코딩 서열 중 일부 염기가 다른 염기로 치환된 것으로, 이러한 치환은 코딩하는 아미노산 종류에 변화를 가져오지 않는다. 예컨대, 본 발명에 따른 도파민 D2 수용체를 과발현하는 폴리뉴클레오타이드는 사람의 도파민 D2 수용체 유전자인 Accession No. M29066 (서열번호 1)의 도파민 D2 수용체 코딩부위 (서열번호 1의 34번째 염기부터 1365번째 염기까지)의 개시코돈의 첫 번째 염기(서열번호 1의 34번째 염기)를 1bp로 할 때 729 bp 위치의 염기(서열번호 1의 762번째 염기에 해당)가 c에서 t로 치환된 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것일 수 있다. One embodiment of the present invention provides a polynucleotide that overexpresses the dopamine D2 receptor. In the polynucleotide according to the present invention, some bases of the wild type dopamine D2 receptor coding sequence are substituted with other bases, and such substitution does not change the type of amino acid to be encoded. For example, the polynucleotide overexpressing the dopamine D2 receptor according to the present invention may be a human dopamine D2 receptor gene. 729 bp position when the first base of the start codon (34th base of SEQ ID NO: 1) of the dopamine D2 receptor coding region of M29066 (SEQ ID NO: 1) (from base 34 of base number 1 to base 1365) is set to 1 bp The base of (corresponding to the 762th base of SEQ ID NO: 1) may have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 substituted from c to t.

상기 729 bp 위치에서의 치환은 코딩되는 아미노산의 변화를 유발하지 않으므로, 본 발명에 따른 729 bp 위치 치환된 폴리뉴클레오타이드에 의하여 코딩된 도파민 D2 수용체 (서열번호 3)는 야생형의 M29066가 코딩하는 도파민 D2 수용체와 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 이와 같은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드에 의하여 코딩된 도파민 D2 수용체의 기능이 야생형과 동등함은 실시예에서 수행된 바와 같은 수용체 결합 검정 (receptor binding assay)와 기능 검정 (functional assay) 시험을 통하여 야생형과 동등함이 입증되었다. Since the substitution at the 729 bp position does not cause a change in the encoded amino acid, the dopamine D2 receptor (SEQ ID NO: 3) encoded by the 729 bp position substituted polynucleotide according to the present invention is dopamine D2 encoded by the wild type M29066. Have the same amino acid sequence as the receptor. The function of the dopamine D2 receptor encoded by the polynucleotide according to the present invention is equivalent to that of the wild type through the receptor binding assay and the functional assay test performed in the examples. Equivalence has been proven.

또한, 본 발명의 구체예는 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 제공한다. 상기 발현벡터는 포유류 세포 발현에 통상적으로 사용되는 프로모터를 포함하고, 상기 프로모터의 5' 위치에 MAR 인자 (Nuclear matrix attachment region element) 또는 SAR 인자 (scaffold attachment region element)를 포함하고, 상기 프로모터의 3' 위치에 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 형태의 것일 수 있다. In addition, embodiments of the present invention provides an expression vector comprising the polynucleotide of SEQ ID NO: 2. The expression vector includes a promoter commonly used for mammalian cell expression, includes a Nuclear Matrix Attachment Region Element (MAR) or a Scaffold Attachment Region Element (SAR) at the 5 'position of the promoter, and includes a promoter of 3 It may be of a type comprising a polynucleotide of SEQ ID NO: 2 in the position.

상기 프로모터로서 포유류 세포 발현에 통상적으로 사용되는 모든 프로모터가 사용 가능하며, 예컨대, SV40 프로모터, CMV (cytomegalo virus) 프로모터, MMTV (Mouse Mammary Tumor Virus) 프로모터 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 MAR 또는 SAR는 β-글로빈 MAR (Accession No.L22754), 인터페론 베타 SAR (Accession No.M83137), CSP-B SAR (Accession No. M62716), DHFR intron SAR (Accession No. X06654), HPRT MAR (Accession No. X07690), Chicken lysozyme MAR element (Accession No. X98408), Chicken pi α-type globin MAR (Accession No. X64113) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. As the promoter, all promoters commonly used for mammalian cell expression may be used. For example, the promoter may be selected from the group consisting of an SV40 promoter, a cytomegalo virus (CMV) promoter, a Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV) promoter, and the like. The MAR or SAR is β-globin MAR (Accession No. L22754), interferon beta SAR (Accession No. M83137), CSP-B SAR (Accession No. M62716), DHFR intron SAR (Accession No. X06654), HPRT MAR ( Accession No. X07690), Chicken lysozyme MAR element (Accession No. X98408), Chicken pi α-type globin MAR (Accession No. X64113) may be selected from the group consisting of.

본 발명에 따른 발현 벡터는 상기 요소들 외에도 통상적인 선별마커, (예컨대, AMPR 등) 및 기타 통상적인 요소를 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 발현 벡터에 있어서, 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드가 도입될 모벡터로 사용되는 벡터는 특별한 제한은 없으며, 포유류 세포 발현에 사용되는 모든 벡터가 사용 가능하고. 예컨대, 1 내지 419 부위에 SV40 프로모터, 420 내지 448 부위에 MCS (multi-cloning site), 449 내지 448 부위에 SV40 small T antigen, 1272 내지 2132 부위에 β-락타메이즈: AMPR, 3322 내지 5523 부위에는 인터페론 베타 SAR인자 (Scaffold Attachment Region element)를 포함하는 pSI-1, 또는 도 4에 도시된 바와 같은 베타글로빈 MAR 인자를 포함하는 pMSG 벡터 등을 모벡터로 사용할 수 있다.The expression vector according to the present invention may further include conventional selection markers (eg, AMP R, etc.) and other conventional elements in addition to the above elements. In addition, in the expression vector according to the present invention, the vector used as the parent vector into which the polynucleotide of SEQ ID NO: 2 is introduced is not particularly limited, and any vector used for mammalian cell expression can be used. For example, SV40 promoter at 1-419 site, MCS (multi-cloning site) at 420-448 site, SV40 small T antigen at 449-448 site, β-lactamase at 1272-2132 site: AMP R , 3322-5523 site For example, pSI-1 including an interferon beta SAR factor (Scaffold Attachment Region element), or a pMSG vector including a beta globin MAR factor as shown in FIG. 4 may be used as a parent vector.

본 발명의 또 다른 구체예는 포유류 세포의 도파민 D2 수용체 유전자의 코딩 부위 중 개시코돈의 첫 번째 염기를 1bp로 하여 729 bp 위치의 염기가 t로 치환된 세포주 (형질전환체)를 제공한다. Another embodiment of the present invention provides a cell line (transformer) in which the base at the 729 bp position is replaced by t with the first base of the start codon in the coding region of the dopamine D2 receptor gene of the mammalian cell as 1 bp.

상기 형질전환체는 포유류 세포에서 해당 위치 염기가 직접 치환된 것이거나, 상기와 같은 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드가 포유류 세포에 도입된 것일 수 있다. The transformant may be a substitution of a corresponding position base in a mammalian cell or a polynucleotide of SEQ ID NO: 2 as described above may be introduced into a mammalian cell.

도파민 수용체는 세포막에 위치하는 단백질로서, 이를 동물세포, 특히 포유류 세포에 인위적으로 발현 또는 과발현시키는 경우, 세포외로 분비되는 단백질과 달리, 숙주세포의 사멸을 야기시키기 때문에, 도파민 수용체를 발현하는 동물세포, 바람직하게는 포유류 세포를 얻는 것이 용이하지 않았다. 본 발명자들은 이러한 기술적 결함을 개선하기 위하여, 특정 발현벡터 및/또는 특정 숙주세포를 선별하여 형질전환체를 제작함으로써, 동물세포, 특히 포유류 세포에서 세포 사멸 없이 도파민 수용체를 발현 또는 과발현 하는 동물세포를 제작하는데 성공하여 본 발명을 완성하였다. Dopamine receptors are proteins located on the cell membrane, which, when artificially expressed or overexpressed in animal cells, particularly mammalian cells, cause the death of host cells, unlike proteins secreted extracellularly, and therefore animal cells expressing dopamine receptors. Preferably, it was not easy to obtain mammalian cells. In order to improve this technical deficiency, the present inventors have developed a transformant by selecting a specific expression vector and / or a specific host cell, thereby expressing or overexpressing an animal cell expressing or overexpressing a dopamine receptor in an animal cell, in particular a mammalian cell without cell death. Successfully completed the present invention.

상기 포유류 세포는 특별한 제한은 없으며, 예컨대, BHK (Baby Hamster Kidney) 세포, CHO (Chinese Hamster Ovary) 세포, 마우스 배아 섬유아세포 (Mouse embryonic fibroblast cell line, 예컨대, NIH3T3), 인간 배아 신장 세포 (Human Embryonic Kidney, 예컨대, HEK 293), 마우스 골수종 세포 (Myeloma Cell, 예컨대, SP2/0) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.The mammalian cells are not particularly limited and include, for example, Baby Hamster Kidney (BHK) cells, Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, Mouse embryonic fibroblast cell lines such as NIH3T3, Human Embryonic kidney cells (Human Embryonic) Kidney, such as HEK 293), one or more selected from the group consisting of mouse myeloma cells (such as SP2 / 0) can be used, but is not limited thereto.

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 상기 포유류 세포는 핵산 합성 경로에 관여하는 효소인 디하이드로폴레이트 리덕테이즈(dehydrofolate reductase, DHFR)가 결핍되어 있는 것이고, 상기 DHFR 결핍 세포주에 DHFR 코딩 유전자 (이하, 'dhfr', Accession No. K01164)를 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드와 함께 도입 (transfection)시켜 본 발명에 따른 형질전환체를 제조할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드와 dhfr 유전자와의 비율은 몰비로 100:0.1 내지 10, 바람직하게는 100: 0.5 내지 5, 더욱 바람직하게는 100: 0.7 내지 2일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In a preferred embodiment of the present invention, the mammalian cell is deficient in dehydrofolate reductase (DHFR), an enzyme involved in the nucleic acid synthesis pathway, and the DHFR coding gene (hereinafter referred to as DHFR coding cell line) , ' dhfr ', Accession No. K01164) may be transfected with the polynucleotide of SEQ ID NO: 2 to prepare a transformant according to the present invention. The ratio of the polynucleotide to the dhfr gene may be 100: 0.1 to 10, preferably 100: 0.5 to 5, more preferably 100: 0.7 to 2, in a molar ratio, but is not limited thereto.

본 발명에 있어서의 포유류 세포로의 형질도입 (transfection)은 통상의 방법에 의하여 수행 가능하며, 예컨대, 리포좀을 이용하거나, 전기천공법 (Electroporation) 등에 의하여 수행 가능하나, 이에 한정되는 것은 아니다. Transfection into mammalian cells in the present invention can be carried out by conventional methods, for example, liposomes, electroporation or the like, but is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구체예는 도파민 D2 수용체를 과발현하는 형질전환체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 제조 방법은 Another embodiment of the present invention provides a method of preparing a transformant that overexpresses the dopamine D2 receptor. The manufacturing method

1) 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 제작하는 단계; 및1) preparing an expression vector comprising the polynucleotide of SEQ ID NO: 2; And

2) 상기 제작된 발현벡터를 포유류 세포에 형질도입시키는 단계 2) transducing the prepared expression vector into mammalian cells

를 포함하는 것일 수 있다.It may be to include.

상기 단계 1)의 상기 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드의 발현벡터는 상기에서 설명한 바와 같다.The expression vector of the polynucleotide of SEQ ID NO: 2 of step 1) is as described above.

상기 단계 2)에서 상기 포유류 세포는 BHK (Baby Hamster Kidney) 세포, CHO (Chinese Hamster Ovary) 세포, 마우스 배아 섬유아세포 (Mouse embryonic fibroblast cell line, 예컨대, NIH3T3), 인간 배아 신장 세포 (Human Embryonic Kidney, 예컨대, HEK 293), 마우스 골수종 세포 (Myeloma Cell, 예컨대, SP2/0) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것으로 디하이드로폴레이트 리덕테이즈(DHFR)가 결핍되어 있는 것일 수 있고, 형질도입시, 상기 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드의 발현벡터는 dhfr 유전자 (Accession No. K01164)를 포함하는 발현벡터와 함께 공동형질도입 (cotransfection)될 수 있다. 상기 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드의 발현벡터와 dhfr 유전자를 포함하는 발현벡터와의 비율은 몰비로 100:0.1 내지 10, 바람직하게는 100: 0.5 내지 5, 더욱 바람직하게는 100: 0.7 내지 2일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 포유류 세포로의 형질도입은 통상의 방법에 의하여 수행 가능하며, 예컨대, 리포좀을 이용하거나 전기천공법 등에 의하여 수행 가능하다.In step 2), the mammalian cells are Baby Hamster Kidney (BHK) cells, Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, mouse embryonic fibroblast cell lines (eg, NIH3T3), human embryonic kidney cells (Human Embryonic Kidney, For example, HEK 293), one or more selected from the group consisting of mouse myeloma cells (eg, SP2 / 0) and the like may be deficient in dihydrofolate reductase (DHFR), at the time of transduction In addition, the expression vector of the polynucleotide of SEQ ID NO: 2 may be cotransfected with an expression vector including a dhfr gene (Accession No. K01164). The ratio between the expression vector of the polynucleotide of SEQ ID NO: 2 and the expression vector including the dhfr gene may be in a molar ratio of 100: 0.1 to 10, preferably 100: 0.5 to 5, and more preferably 100: 0.7 to 2 However, it is not limited thereto. In addition, transduction into the mammalian cells can be performed by a conventional method, for example, using liposomes or by electroporation.

본 발명의 또 다른 측면은 상기와 같은 도파민 D2 수용체를 과발현하는 형질전환체를 이용한 도파민 D2 수용체를 표적으로 하는 도파민 D2 수용체 작용 조절제 스크리닝 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 상기 스크리닝 방법은 Another aspect of the present invention provides a method for screening a dopamine D2 receptor agonist that targets the dopamine D2 receptor using a transformant that overexpresses such a dopamine D2 receptor. More specifically, the screening method

a) 도파민 D2 수용체를 과발현하는 형질전환체를 준비하는 단계; a) preparing a transformant overexpressing the dopamine D2 receptor;

b) 상기 형질전환체에 도파민 D2 수용체에 특이적인 리간드를 처리하고, 후보물질과 접촉시키는 단계; 및b) treating the transformant with a ligand specific for the dopamine D2 receptor and contacting the candidate; And

c) 상기 후보물질과 접촉된 형질전환체에서의 도파민 D2 수용체의 활성을 측정하고, 후보물질을 처리하지 않은 형질전환체에서의 도파민 D2 수용체의 활성을 측정하여, 후보 물질 처리한 형질전환체에서의 도파민 D2 수용체의 활성과 후보 물질을 처리하지 않은 형질전환체에서의 도파민 D2 수용체의 활성과 비교하는 단계c) measuring the activity of the dopamine D2 receptor in the transformant in contact with the candidate, and measuring the activity of the dopamine D2 receptor in the transformant not treated with the candidate, in the transformant treated with the candidate Comparing the activity of the dopamine D2 receptor with the activity of the dopamine D2 receptor in a transformant not treated with the candidate substance.

를 포함할 수 있다.It may include.

상기 단계 a)의 도파민 D2 수용체를 과발현하는 형질전환체는 앞서 설명한 바와 같이 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 제작할 수 있다.The transformant overexpressing the dopamine D2 receptor of step a) can be prepared using the polynucleotide of SEQ ID NO: 2, as described above.

상기 단계 b)에서 리간드 처리와 후보물질 접촉 순서를 특별히 정해진 바 없으며, 실험 설계에 맞게 적절하게 순서를 정하거나 동시에 수행할 수 있다. In the step b), the order of ligand treatment and the contact of the candidate material are not specifically determined, and may be appropriately ordered or simultaneously performed according to the experimental design.

상기 후보물질은 특별한 제한이 없으며, 천연물, 천연물의 추출물, 합성 화합물 등일 수 있다. 상기 리간드는 도파민 D2 수용체와 특이적으로 결합하여 세포 신호 전달에 관여하는 모든 물질일 수 있으며, 예컨대 도파민, 등일 수 있다.The candidate material is not particularly limited and may be natural products, natural extracts, synthetic compounds, and the like. The ligand may be any substance that specifically binds to the dopamine D2 receptor and is involved in cellular signal transduction, such as dopamine, and the like.

상기 단계 c)에서의 도파민 D2 수용체의 활성은 통상적인 방법으로 측정하며, 예컨대, 형질전환체 내의 도파민 D2 수용체와 이에 특이적으로 결합하는 리간드 (예컨대, 도파민)과의 결합 정도를 측정하거나, 상기 리간드 처리시 생성되는 cAMP 농도를 측정하거나, 이를 모두 측정하여 도파민 D2 수용체의 활성을 측정할 수 있다. The activity of the dopamine D2 receptor in step c) is measured by conventional methods, for example, by measuring the degree of binding of the dopamine D2 receptor in the transformant to a ligand (eg, dopamine) that specifically binds to the above, or The cAMP concentration produced during ligand treatment can be measured or all of them can be measured to determine the activity of the dopamine D2 receptor.

예컨대, 후보물질 처리시 형질전환체 내의 도파민 수용체와 리간드와의 결합 정도가 증가하거나, 리간드 농도가 증가할수록 생성되는 cAMP의 농도가 감소하는 경우, 상기 후보물질은 도파민 D2 수용체의 작용 증진제로 판단할 수 있으며, 반대로, 후보물질 처리시 형질전환체 내의 도파민 D2 수용체와 리간드와의 결합 정도가 감소하는 경우, 상기 후보물질은 도파민 D2 수용체의 작용 억제제로 판단할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 도파민 수용체 D2의 활성은 도파민 D2 수용체를 통한 신호전달 (signal transduction)에서 생성되는 산물의 농도를 측정하여 결정할 수 있다. For example, when the degree of binding between the dopamine receptor and the ligand in the transformant increases or the concentration of cAMP decreases as the ligand concentration increases during the treatment of the candidate, the candidate may be considered as an enhancer of the dopamine D2 receptor. On the contrary, if the degree of binding of the dopamine D2 receptor and the ligand in the transformant decreases when the candidate is treated, the candidate may be determined as an inhibitor of the action of the dopamine D2 receptor. In another embodiment, the activity of the dopamine receptor D2 can be determined by measuring the concentration of product produced in signal transduction through the dopamine D2 receptor.

상기 스크리닝 방법에 의하여 얻어진 도파민 D2 수용체 작용 조절제는 도파민 D2 수용체의 기능 부전 또는 과다 활성에 의하여 유발되는 질병의 치료제로서 사용될 수 있다. 상기에서 스크리닝된 얻어진 도파민 D2 수용체의 작용 증진제는 도파민 신경계의 작용 부전에 따라 발생하는 질병인 정서장애, 기억장애, 파킨슨병 등의 치료제로서 사용 가능하며, 도파민 D2 수용체의 작용 억제제는 도파민 신경계의 과다 활성에 의하여 야기되는 정신 분열병의 치료제로서 사용 가능하다.The dopamine D2 receptor agonist modulator obtained by the screening method can be used as a therapeutic agent for a disease caused by a malfunction or excessive activity of the dopamine D2 receptor. The action enhancer of the obtained dopamine D2 receptor screened above can be used as a therapeutic agent for the disorders caused by dysfunction of the dopamine nervous system, such as emotional disorders, memory disorders, Parkinson's disease, and the dopamine D2 receptor inhibitor is an excess of the dopamine nervous system. It can be used as a therapeutic agent for schizophrenia caused by activity.

본 발명에서 제공되는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 이를 포함하는 형질전환체는 향후 세포기반 분석시스템을 통한 천연물이나 한약제 등으로부터 선도물질을 발굴하는데 있어서 매우 유용하다.The polynucleotides provided in the present invention and / or transformants comprising the same are very useful for discovering leading substances from natural products or herbal medicines through cell-based analysis systems in the future.

이하, 본 발명을 하기의 실시예를 들어 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, these examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.

　

[[ 실시예Example 1] Human  1] Human D2D2 수용체 유전자를 발현하는 Expressing receptor genes CHOCHO 세포주의 확립 Establishment of Cell Lines

1.1.　Human 1.1. Human D2D2 수용체 유전자 발현 벡터의 제조Preparation of Receptor Gene Expression Vectors

사람의 도파민 D2 수용체 cDNA (Accession number: M29066)가 포함된 벡터를 ResGenTM에서 구입하였다. 구입한 cDNA를 주형으로 하여 단백질 코딩부위의 양 말단에 해당하는 5D2NheI 프라이머와 3D2XhoI 프라이머를 제작하여 PCR을 수행하였다. 그 결과 1,347bp의 PCR 산물을 얻었고, 그 산물을 pGEM-T easy Vector에 클로닝한 후 염기서열을 분석하였다 (서열번호 2). Dopamine D2 in Humans Vectors containing the receptor cDNA (Accession number: M29066) were purchased from ResGen ™ . PCR was performed by using 5D2NheI primers and 3D2XhoI primers corresponding to both ends of the protein coding region using the purchased cDNA as a template. As a result, a PCR product of 1,347bp was obtained, and the product was cloned into pGEM-T easy Vector and analyzed for nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2).

이를 보다 상세히 설명하면, 상기 PCR은 pfu 폴리머레이즈(Promega)를 이용하여 수행하였고, 95℃에서 5분동안 변성(denaturation)시키고, 95℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분 과정을 30회 반복한 후, 72℃에서 10분동안 증폭시켰다. 이렇게 증폭된 PCR 산물을 1％ 아가로오스 젤 상에서 확인하였다. PCR을 통하여 얻은 산물을 pGEM-T easy vector (Promega)에 서브클로닝하였다. 플라스미드 DNA 는 QIAprep

Figure 112008085642759-PAT00001
Spin Miniprep kit (QIAGEN)로 분리하였고, DNA 염기 서열을 분석하였다.In more detail, the PCR was performed using pfu polymerase (Promega), denatured at 95 ° C. for 5 minutes, 1 minute at 95 ° C., 1 minute at 55 ° C., and 2 minutes at 72 ° C. The procedure was repeated 30 times and then amplified at 72 ° C. for 10 minutes. The PCR product thus amplified was identified on 1% agarose gel. The product obtained by PCR was subcloned into pGEM-T easy vector (Promega). Plasmid DNA is QIAprep
Figure 112008085642759-PAT00001
Spin Miniprep kit (QIAGEN) was isolated and DNA sequence was analyzed.

상기 PCR 및 서열 분석에 사용된 프라이머는 다음과 같다:Primers used for the PCR and sequencing are as follows:

Cloning primerCloning primer

5D2NheI: 5'-GCT AGC GCC ACC ATG GAT CCA CTG AAT CTG TC (서열번호 4)5D2NheI: 5'-GCT AGC GCC ACC ATG GAT CCA CTG AAT CTG TC (SEQ ID NO: 4)

Nhe Ⅰ(GCTAGC) - Kozak sequence (GCCACC)Nhe I (GCTAGC)-Kozak sequence (GCCACC)

3D2XhoI: 5'-CTC GAG TCA GCA GTG GAG GAT CTT CAG (서열번호 5)3D2XhoI: 5'-CTC GAG TCA GCA GTG GAG GAT CTT CAG (SEQ ID NO: 5)

Xho Ⅰ(CTCGAG)Xho I (CTCGAG)

Sequencing primerSequencing primer

S1D2R: 5'-TGG ACG TCA TGA TGT GCA (서열번호 6)S1D2R: 5'-TGG ACG TCA TGA TGT GCA (SEQ ID NO: 6)

S2D2R: 5'-TCA AGA TCT ACA TTG TCC (서열번호 7)S2D2R: 5'-TCA AGA TCT ACA TTG TCC (SEQ ID NO: 7)

상기 얻어진 서열번호 2의 D2 수용체 염기서열을 M29066과 비교 분석한 결과 729 bp위치의 c가 t로 치환되었음을 확인하였다. 그러나, 이와 같은 729 bp 위치의 염기서열 변화는 아미노산 변화를 유발하지 않았다. D2 of SEQ ID NO: 2 obtained above A comparative analysis of the receptor sequence with M29066 confirmed that c at the 729 bp position was substituted with t. However, such sequence changes at the 729 bp position did not cause amino acid changes.

D2 수용체 유전자의 Accession number M29066과 비교하여 729 bp위치에 염기서열 돌연 변이가 있음을 확인하고 다음 단계를 진행하였다. 상기 pGEM-T 벡터에 Nhe Ⅰ과 Xho Ⅰ 제한효소를 처리하여 선형화하여 1,347 bp의 DNA 단편을 얻고, 동일한 제한효소로 선형화한 동물 발현 벡터인 pSI-1 벡터와 라이게이션(ligation) 반응시켜 pSI1-D2를 제작하였다 (도 1 참조). D2 Compared to the accession number M29066 of the receptor gene confirmed that there is a nucleotide sequence mutation at the 729 bp position and proceeded to the next step. The pGEM-T vector was linearized by treatment with Nhe I and Xho I restriction enzymes to obtain a DNA fragment of 1,347 bp and ligation reaction with pSI-1 vector, which is an animal expression vector linearized with the same restriction enzyme, to pSI1-T. D2 was produced (see FIG. 1).

이를 보다 상세히 설명하면 다음과 같다. This will be described in more detail as follows.

발현벡터는 동물세포 발현 벡터인 pSI-1에 D2 수용체 유전자를 삽입하여 사용하였다. pSI-1 벡터는 1 내지 419 부위에 SV40 프로모터, 420 내지 448 부위에 MCS (multi-cloning site), 449 내지 448 부위에 SV40 small T antigen, 1272 내지 2132 부위에 β-락타메이즈: AMPR, 3322 내지 5523 부위에는 인터페론 베타 SAR인자 (Scaffold Attachment Region element)를 포함하고 있다. 인터페론 베타 SAR인자는 위치 독립적 발현(position-independent expression)을 위한 것으로 외래 유전자를 숙주 염색체에 삽입할 때, 이들 외래 유전자를 각각의 단위체로 인식하게 하여 유전자가 인접한 숙주 염색체 서열에 의해 영향을 받지 않고 발현되는 기능을 한다.The expression vector was used by inserting the D2 receptor gene into pSI-1, an animal cell expression vector. The pSI-1 vector has an SV40 promoter at 1-419, a multi-cloning site (MCS) at 420-448, an SV40 small T antigen at 449-448, and β-lactamase at 1272-2132: AMP R , 3322. The region to 5523 includes an interferon beta SAR factor (Scaffold Attachment Region element). The interferon beta SAR factor is for position-independent expression and when foreign genes are inserted into the host chromosome, these foreign genes are recognized as individual units so that the gene is not affected by adjacent host chromosomal sequences. It functions to be expressed.

상기에서 얻어진 서열이 확인된 D2 수용체 유전자를 갖는 pGEM-Teasy 벡터를 Nhe I과 Xho I 제한효소 (KOSCHEM)로 처리하여 D2 수용체 유전자를 분리하고, pSI-1 벡터(한국 특허등록 제0529281호에 pPGM-1 vector로 기재)도 같은 제한효소로 처리하고 1％ 아가로오스 젤 상에서 원하는 DNA 밴드를 분리하였고, QIAEX II Extraction Kit(QIAGEN)를 이용하여 D2 수용체 DNA 절편을 정제하였다. 상기 정제된 D2 수용체 DNA와 상기 제한효소 처리된 벡터를 3:1의 몰비로 넣고, T4 DNA 리가아제 (Promega)를 첨가하여 22℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 그리고 나서, E.coli JM109 competent cell에 형질 전환하고, LB AMP+ 배지(10 g NaCl, 10 g Bacto-tryptone, 5 g Yeast Extract, 증류수 1 리터/Ampicillin, 0.1 mg/mL, Sigma)에서 배양한 후 QIAprep

Figure 112008085642759-PAT00002
Spin Miniprep kit를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. The pGEM-Teasy vector having the D2 receptor gene having the above-identified sequence was treated with Nhe I and Xho I restriction enzymes (KOSCHEM) to isolate the D2 receptor gene, and the pSI-1 vector (pPGM in Korean Patent Registration No. 0529281). -1 vector) was also treated with the same restriction enzyme and the desired DNA band was isolated on 1% agarose gel, and the D2 receptor DNA fragment was purified using QIAEX II Extraction Kit (QIAGEN). The purified D2 receptor DNA and the restriction enzyme treated vector were added in a molar ratio of 3: 1, and T4 DNA ligase (Promega) was added thereto and reacted at 22 ° C. for 6 hours. Then, E. coli JM109 competent cells were transformed and cultured in LB AMP + medium (10 g NaCl, 10 g Bacto-tryptone, 5 g Yeast Extract, 1 liter of distilled water / Ampicillin, 0.1 mg / mL, Sigma). QIAprep
Figure 112008085642759-PAT00002
Plasmid DNA was isolated using a Spin Miniprep kit.

상기 E. coli JM109 competent cell은 다음과 같은 방법으로 제작하였다:The E. coli JM109 competent cell was prepared by the following method:

1. LB 고체배지에 균주(E. coli)를 streaking하여 하루 동안 배양; 1. Streaking the strain (E. coli) in LB solid medium and cultured for one day;

2. Single colony를 따서 100 ml flask에 들어 있는 10 ml TYM broth (2개)에다 접종; 2. Inoculate a single colony into 10 ml TYM broth (2) in a 100 ml flask;

3. Shake incubator(37℃, 3-4hr)에서 cell을 배양하고, 50ml TYM broth가 있는 500 ml flask (2개)에 부어 다시 Shake incubator (1hr)에서 배양;3. Incubate the cells in a shake incubator (37 ° C., 3-4hr), pour into 500 ml flasks (2) with 50ml TYM broth and incubate in the shake incubator (1hr);

4. 250 ml TYM broth가 있는 1l flask(2개)에 부어 희석 후 다시 Shaking incubator(1hr)에서 배양;4. Pour into 1 l flask (2) with 250 ml TYM broth, dilute and incubate again in Shaking incubator (1 hr);

5. Cell이 OD600 0.6으로 성장했을 때, flask를 ice-water에 넣어 서서히 shaking(rapid cooling); 5. When the cells grew to OD 600 0.6, place the flask in ice-water slowly shaking (rapid cooling);

6. 배양 상태가 차게되었을 때, 250ml의 centrifuge tube 4개에 균등하게 분주하여 4.2krpm으로 spin(15min); 6. When incubated, spin evenly into 4 250ml centrifuge tubes and spin (15min) at 4.2krpm;

7. 상층액을 버리고 차가운 TfBⅠ을 25ml씩 pellet에 부어 얼음물에서 천천히 흔들면서 재현탁; 7. Discard supernatant and re-suspend with 25 ml of cold TfBⅠ in pellets, shaking slowly in ice water;

8. 4.2krpm으로 respin(8min); 8. respin (8 min) to 4.2 kpm;

9. 상층액을 버리고 차가운 TfBⅡ을 5ml씩 pellet에 부어 얼음물에서 천천히 흔들면서 재현탁; 및9. Discard supernatant and resuspend by pouring cold TfBII into pellets 5 ml each time, shaking slowly in ice water; And

10. 냉각된 microfuge tube에 0.2ml씩 나누어 부은 후 액체 질소에서 냉동하 여 -70℃에 저장.10. Pour 0.2ml into cooled microfuge tubes and freeze in liquid nitrogen and store at -70 ℃.

이와 같이 얻어진 pSI1-D1 플라스미드 DNA 10 μg을 Nar I 제한효소(KOSCHEM)로 37℃에서 3시간 동안 반응시켜 선형화 한 후 Chroma spin column (Clontech)으로 분리 정제한 후 농도를 측정하였다.10 μg of the pSI1-D1 plasmid DNA thus obtained was linearized by reacting with Nar I restriction enzyme (KOSCHEM) at 37 ° C. for 3 hours, and then purified by Chroma spin column (Clontech), and then the concentration was measured.

1.2. 형질도입 (1.2. Transduction ( TransfectionTransfection ) 및 세포주 선별) And cell line selection

상기에서 얻어진 사람의 D2 수용체를 발현하는 pSI1-D2 플라스미드를 Nar I 제한효소로 선형화하고, dhfr 유전자를 발현하는 pDCH1P(목암연구소)와 혼합하여, 리포좀 (dosperTM) (Roche)을 사용하여 CHO-DG44 세포(Chasin 박사, 미국)에 공동형질도입 (cotransfection)시켰다. The pSI1-D2 plasmid expressing the human D2 receptor obtained above was linearized with Nar I restriction enzyme, mixed with pDCH1P expressing the dhfr gene, and then mixed with pDCH1P (Modal Cancer Research Institute), using CHO- by using a liposome (dosper TM ) (Roche). DG44 cells (Chasin, USA) were cotransfected.

이를 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.This will be described in more detail as follows.

본 실험에서 사용한 CHO DG44 세포주는 핵산을 합성하는 경로에 관여하는 효소를 만드는 dhfr (dehydrofolate reductase, DHFR) 유전자가 결핍되어 있는 세포이다. 형질도입 할 때 dhfr 유전자가 포함되어 있는 플라스미드 (pDCH1P)도 동시에 형질도입하여 뉴클레오사이드와 데옥시뉴클레오사이드가 포함되어 있지 않은 10% dFBS w/o MEM-α 배지 (Invitrogen)로 일차 선별하였다.The CHO DG44 cell line used in this experiment is a cell that lacks the dhfr (dehydrofolate reductase) gene, which makes an enzyme involved in the nucleic acid synthesis pathway. At the time of transduction, the plasmid containing the dhfr gene (pDCH1P) was also transduced at the same time, and first selected with 10% dFBS w / o MEM-α medium (Invitrogen) containing no nucleosides and deoxynucleosides. .

　CHO 세포 2×105개를 10% cFBS MEM-α 배지 2 mL과 함께 6 well에 접종하여 37℃ 5% CO2 배양기에서 하루 동안 배양하였다. 형질도입하기 직전에 준비된 세포를 무혈청배지(serum free media)로 두 번 세척하였다. 형질도입은 상기 선형화된 플라스미드 DNA와 pDCH1P DNA (dhfr 유전자를 포함하는 선별마커 DNA)를 100:1의 몰비로 혼합하고, 50 μL의 부피가 되도록 MEM-α 무혈청배지를 1.5 mL 튜브에 혼합하였다. 다른 튜브에는 리포좀 (dosper) 5.3 μg과 MEM-α 무혈청배지를 넣어 최종 부피가　50 μL가 되도록 준비하였다. 그리고 난 후, 상기 두 용액을 혼합하여 상온에서 45분간 반응시킨 후 상기 준비된 세포에 넣어 주고, CO2 배양기에서 6시간 동안 배양한 후, 용액을 제거하고, 10% cFBS MEM-α 배지 2 mL 첨가하여 CO2 배양기에서 배양하였다.2 × 10 5 CHO cells were inoculated into 6 wells with 2 mL of 10% cFBS MEM-α medium and incubated in a 37 ° C. 5% CO 2 incubator for one day. Immediately before transduction, the prepared cells were washed twice with serum free media. Transduction was performed by mixing the linearized plasmid DNA and pDCH1P DNA (selective marker DNA including dhfr gene) in a molar ratio of 100: 1, and MEM-α serum-free medium was mixed in a 1.5 mL tube to a volume of 50 μL. . In another tube, 5.3 μg of liposome (dosper) and MEM-α serum free medium were prepared so that the final volume was 50 μL. Then, the two solutions were mixed and reacted at room temperature for 45 minutes, and then put into the prepared cells, incubated for 6 hours in a CO 2 incubator, and then the solution was removed and 2 mL of 10% cFBS MEM-α medium was added. Incubated in a CO 2 incubator.

2 내지 3일 후 형질전환된 세포들이 충분히 자랐을 때, 트립신 2 내지 3 drops을 처리한 후 α-MEM (w/o) + 10% dFBS 배지 2 mL/well 첨가하여 잘 섞어주었다. 세포는 50 μL/5 mL α-MEM(w/o) + 10% dFBS의 농도로　100 mm dish에 분주하여 배양하였다. 2 내지 3일 간격으로 배지를 교환하면서 현미경으로 세포의 상태와 단일 콜로니 생성여부를 관찰하였고, 약 10일 후에 초기 적응된 콜로니을 얻을 수 있었다. 상기 초기 적응된 콜로니들은 트립신 처리하여 떼어낸 후, 6 well plate로 옮겨 배양하였다. 초기 적응된 세포를 6-well plate에 5 x 105 cells/well이 되도록 분주하고, 10 nM MTX(methotrexate)를 포함하는α-MEM (w/o) + 10% dFBS 배지에서 배양하였다. 10 nM MTX에 적응된 세포는 배지에 첨가된 MTX 농도를 100 nM, 1 μM 로 단계적으로 증가시킴으로써 도입 유전자의 증폭을 유도하였다. After 2 to 3 days, when the transformed cells were fully grown, trypsin 2 to 3 drops, and then mixed well by adding α-MEM (w / o) + 2 mL / well of 10% dFBS medium. Cells were cultured by aliquoting a 100 mm dish at a concentration of 50 μL / 5 mL α-MEM (w / o) + 10% dFBS. The state of the cells and the generation of single colonies were observed under a microscope while the medium was exchanged at intervals of 2 to 3 days. After about 10 days, initially adapted colonies were obtained. The initially adapted colonies were removed by trypsin treatment and transferred to 6 well plates for incubation. Initially adapted cells were aliquoted to 5 × 10 5 cells / well in 6-well plates and incubated in α-MEM (w / o) + 10% dFBS medium containing 10 nM MTX (methotrexate). Cells adapted to 10 nM MTX induced amplification of the transgene by stepwise increasing the MTX concentration added to the medium to 100 nM, 1 μM.

D2 수용체를 발현하는 콜로니를 선별하기 위하여, 5D2NheI primer와 3D2XhoI primer를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. In order to select colonies expressing the D2 receptor, RT-PCR was performed using 5D2NheI primer and 3D2XhoI primer.

상기 RT-PCR은 다음과 같이 수행하였다. 　w/o MEM-α 배지에서 선별한 각각의 콜로니들과 최종 MTX 농도 1 μM까지 적응한 콜로니들의 인간 D2 수용체 유전자가 발현되는지 확인하기 위해 세포로부터 total RNA를 준비하였다. 100 ㎜ dish에 세포를 90% 이상 자라도록 키운 후, 106cells 당 0.2 mL RNA-BEE reagent(Tel-Test Inc.,)를 넣고 잘 혼합하였다. 클로로포름 40 μL를 첨가하고 볼텍싱하였다. 얼음에 5분간 반응시킨 후, 이를 12,000rpm에서 15분간 원심 분리하고 상층액을 새 튜부로 옮겼다. 여기에 100% 이소프로판올 100 μL를 넣고 상온에서 10분간 두었다가, 12,000 rpm에서 15분간 원심 분리하였다. 모든 용액을 제거하고 75% 에탄올 1 mL을 첨가한 후 10,000rpm에서 5분간 원심 분리하고, 에탄올을 모두 제거한 뒤 pellet을 공기 중에 살짝 말렸다. 이를 0.1% DEPC (diethyl pyrocarbonate) water 40 μL에 녹인 후 60℃에서 15분간 처리하였다. The RT-PCR was performed as follows. Total RNA was prepared from the cells to confirm that the human D2 receptor genes of each colony selected from w / o MEM-α medium and colonies adapted to a final MTX concentration of 1 μM were expressed. After growing 90% or more of the cells in a 100 mm dish, 0.2 mL RNA-BEE reagent (Tel-Test Inc., per 10 6 cells) was added and mixed well. 40 μL of chloroform was added and vortexed. After reacting with ice for 5 minutes, it was centrifuged at 12,000 rpm for 15 minutes and the supernatant was transferred to a new tube. 100 μl of 100% isopropanol was added thereto, left at room temperature for 10 minutes, and centrifuged at 12,000 rpm for 15 minutes. All solutions were removed, 1 mL of 75% ethanol was added, centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes, all ethanol was removed, and the pellet dried slightly in air. This was dissolved in 40 μL of 0.1% DEPC (diethyl pyrocarbonate) water and treated at 60 ° C. for 15 minutes.

음성 대조군으로서 형질도입하지 않은 CHO 세포에서 추출한 total RNA를 사용하였고, 양성대조군으로서 상기 실시예 1.1에서 제작된 pSI1-D2 DNA를 직접 PCR하였다. RT-PCR 반응은 TitanTM one tube RT-PCR system　 (Boehringer Mannheim)을 이용하여 수행하였다. 조성은 5×반응버퍼(Boehringer Mannheim) 10 μL, 2.5mM dNTPs (Boehringer Mannheim) 4 μL, 100 pmol 프라이머 각각 1 μL, 100 mM DTT 2.5 μL, RNase-free water (Fisher Scientific), template mRNA와 2.5 U의 enzyme(Boehringer Mannheim) 을 50 μL 부피로 맞추어 사용하였다. RT-PCR 조건은 55℃에서 30분간 배양한 뒤 94℃에서 5분간 precycling하고, 다음 33 cycle은 94℃에서 1min, 55℃에서 1min, 72℃에서 2분간 수행하였다. 마지막 cycle은 72℃에서 10분간 수행하였다.As a negative control, total RNA extracted from non-transduced CHO cells was used, and the pSI1-D2 DNA prepared in Example 1.1 was directly PCR as a positive control. RT-PCR reaction was performed using a Titan ™ one tube RT-PCR system (Boehringer Mannheim). The composition is 10 μL of 5 × reaction buffer (Boehringer Mannheim), 4 μL of 2.5 mM dNTPs (Boehringer Mannheim), 1 μL each of 100 pmol primer, 100 μM DTT 2.5 μL, RNase-free water (Fisher Scientific), template mRNA and 2.5 U The enzyme (Boehringer Mannheim) was used in 50 μL volume. RT-PCR conditions were incubated for 30 minutes at 55 ℃ and then precycling for 5 minutes at 94 ℃, 33 cycles were performed for 1 min at 94 ℃, 1 min at 55 ℃, 2 minutes at 72 ℃. The last cycle was performed at 72 ° C for 10 minutes.

RT-PCR 분석결과 여러 개의 D1수용체를 발현하는 콜로니를 얻었고, 그 중 D2-3, 5, 6, 10, 22 콜로니를 선택하여, 단계적으로 10 nM, 100 nM, 1 μM MTX 첨가된 배지에서 배양하여 적응된 세포를 얻었다. 최종적으로 세포의 모양이 안정적이고, 세포 성장이 좋은 1 μM MTX가 첨가된 배지에서 적응된 D2-5 세포주를 선별하였으며, 2008년 10월 22일자로 서울 종로구 연건동에 소재하는 한국세포주 은행에 기탁하여 기탁번호 KCLRF-BP-00189를 부여받았다.RT-PCR analysis yielded colonies expressing several D1 receptors, among which D2-3, 5, 6, 10, 22 colonies were selected and cultured in medium with 10 nM, 100 nM, 1 μM MTX added stepwise. To obtain adapted cells. Finally, D2-5 cell line was selected from medium containing 1 μM MTX with stable cell shape and good cell growth, and deposited on October 22, 2008 at Bank of Korea Cell Line located in Yeongun-dong, Jongno-gu, Seoul. Accession number KCLRF-BP-00189 was assigned.

[실시예 2]　Human D2 수용체 발현 세포주 기능성 분석Example 2 Analysis of Functional of Human D2 Receptor Expression Cell Line

2.1.　수용체 결합 분석 시험 (Receptor binding assay) 2.1. Receptor binding assay

상기 제작된　Human D2 수용체 발현 세포 D2-5 (1μM MTX)를 선택하여 수용체 결합 분석 시험을 수행하였다. 상기 Human D2 수용체 발현 세포는 75 cm2 flask를 이용하여 대량 배양하였고, 세포가 90% 이상 자라면 배지를 제거하고 PBS buffer로 2회 세척한 후에 1 mM EDTA-PBS buffer 2 mL를 첨가하여 37℃, 5분 동안 반응시켜 세포를 수확하였다. 수확된 세포는 PBS buffer로 다시 2회 세척한 후에 Protease Inhibitor (200 μM Phenylmethylsulfonyl Fluoride, 5 μg/mL Leupeptin)가 첨가된 lysis buffer (5 mM Tris pH 7.4, 5 mM MgCl2)에 현탁 시킨 후 초음파 분쇄기로 분쇄하였다. 세포파편은 4,000 rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 제거하였고, 상층 액은 50,000 rpm에서 30분 동안 초원심 분리하여 세포막 분획이 포함된 침전물을 얻었다. 세포막 분획 침전물을 binding buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM EDTA, 4 mM MgCl2, 5 mM KCl, 1.5 mM CaCl2)에 녹인 후, Bradford 방법에 의해 농도를 측정하였다.Human D2 receptor expressing cells D2-5 (1 μM MTX) prepared above were selected to perform receptor binding assay. The human D2 receptor-expressing cells were cultured in a large volume using a 75 cm 2 flask. If the cells grew more than 90%, the medium was removed, washed twice with PBS buffer, and then 2 mL of 1 mM EDTA-PBS buffer was added to 37 ° C. The cells were harvested by reacting for 5 minutes. The harvested cells were washed twice with PBS buffer and suspended in lysis buffer (5 mM Tris pH 7.4, 5 mM MgCl 2 ) to which Protease Inhibitor (200 μM Phenylmethylsulfonyl Fluoride, 5 μg / mL Leupeptin) was added. Trituration with. Cell debris was removed by centrifugation at 4,000 rpm for 5 minutes, and supernatant was ultracentrifuged at 50,000 rpm for 30 minutes to obtain a precipitate containing cell membrane fractions. The cell membrane fraction precipitate was dissolved in binding buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM EDTA, 4 mM MgCl 2 , 5 mM KCl, 1.5 mM CaCl 2 ), and then the concentration was measured by the Bradford method.

전체 결합은 상기 얻어진 세포막 분획 (5 내지 10 ㎍/assay)과 D2 수용체에 대한 방사선 동위원소가 표지된 리간드 (radioligand), [3H] Spiperone (GE Healthcare)를 0, 0.01, 0.05, 0.075, 0.1, 0.2, 0.5, 0.75, 1, 2, 5, 10nM의 농도로 혼합하여 측정하였고, 비특이적 결합은 같은 조건에 10μM의 방사성 동위원소가 표지되지 않은 리간드인 돔페리돈(Domperidone, Sigma)를 첨가하여 수행하였다. 세포막 분획과 binding buffer, 및 비특이적 결합의 경우 방사성 동위원소가 표지되지 않은 리간드를 혼합한 후에 방사선 동위원소가 표지된 리간드를 첨가하여 37℃, 30분동안 반응시켰다. GF/B 필터(Whatman)은 0.3% 폴리에틸렌이민을 실온에서 1시간 동안 처리한 후에 binding buffer(50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM EDTA, 4 mM MgCl2, 5 mM KCl, 1.5 mM CaCl2) 로 3회 세척하였다. 진공조건에서 전 처리된 GF/B 필터에 상기 리간드와 세포막 분획의 반응물을 통과 시킨 다음, 상기 필터를 5 mL의 cold-ice binding buffer로 3회 세척하여 상온에서 건조시켰다. 건조된 필터는 3 mL의 scintillation cocktail 용액에 넣어서 Liquid Scintillation Counter(Wallac 1209RACKBETA)로 cpm값을 측정하였다. 특이적 결합값은 전체 결합 cpm 값에서 비특이적 결합 cpm 값을 빼서 얻었고, cpm 값과 리간드의 농도는 GraphPad Prim 3.03 프로그램 (http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm)을 이용하여 특이적 결합 친화도(specific binding affinity)와 수용체 단백질의 밀도를 계산하였다. Total binding resulted in the cell membrane fraction (5-10 μg / assay) obtained above and the radioisotope labeled radioligand for the D2 receptor, [ 3 H] Spiperone (GE Healthcare), 0, 0.01, 0.05, 0.075, 0.1 , 0.2, 0.5, 0.75, 1, 2, 5, 10 nM was measured by mixing, non-specific binding was carried out by the addition of 10 μM radioisotope unlabeled ligand domperidone (Sigma) under the same conditions It was. In the case of cell membrane fraction, binding buffer, and nonspecific binding, radioisotope-labeled ligands were mixed, and then radioisotope-labeled ligands were added to react at 37 ° C. for 30 minutes. The GF / B filter (Whatman) was treated with 0.3% polyethyleneimine for 1 hour at room temperature, followed by binding buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM EDTA, 4 mM MgCl 2 , 5 mM KCl, 1.5 mM CaCl 2 ). Washed three times. After passing the reactant of the ligand and the cell membrane fraction through a GF / B filter pretreated in vacuum, the filter was washed three times with 5 mL of cold-ice binding buffer and dried at room temperature. The dried filter was put into 3 mL of scintillation cocktail solution and the cpm value was measured by Liquid Scintillation Counter (Wallac 1209RACKBETA). Specific binding values were obtained by subtracting nonspecific binding cpm values from total binding cpm values, and cpm values and ligand concentrations were specific using GraphPad Prim 3.03 program (http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm). Specific binding affinity and density of receptor protein were calculated.

이와 같이 얻은 결과를 도 2에 나타내었다. 특이적 결합 친화도를 나타내는 Kd (equilibrium dissociation constant)는 리간드 농도의 증가에 따라 포화된 cpm값이 반으로 떨어졌을 때의 리간드 농도를 나타내며, Bmax (the maximum specific binding to be fit)값은 세포막 분획(membrane fraction) 1㎎에 존재하는 수용체의 농도를 나타낸다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, D2 수용체의 Kd는 0.45±0.13 nM이고, Bmax는 1.42±0.13 pmol/㎎ 단백질로 나타났다. 이는 전형적인 binding assay 결과인 Bmax 10 내지 1000 fmol, Kd 10 pM 내지 10 nM (Bmax의 경우 수용체 유전자가 형질전환 되었을 때는 몇 배 더 값이 커짐)의 범위 내에 포함된다.The results thus obtained are shown in FIG. 2. K d (equilibrium dissociation constant) represents the specific binding affinity of the ligand indicates the concentration at which the saturated cpm value with an increase in the ligand concentration drops to half, B max The maximum specific binding to be fit value represents the concentration of the receptor present in 1 mg of the membrane fraction. As can be seen in Figure 2, the D2 receptor K d is 0.45 ± 0.13 nM, B max was found to be 1.42 ± 0.13 pmol / ㎎ protein. It is included in the range of typical binding assay results of B max 10 to 1000 fmol, K d 10 pM to 10 nM (B max is several times higher when the receptor gene is transformed).

2.2. 기능 분석 시험　(Functional assay)2.2. Functional assay

Human D2 수용체 발현 세포 중 D2-5 세포를 선별하여 대표적인 리간드인 도파민에 대하여 정상적으로 반응하는지 여부를 확인하기 위하여, 상기 D2 수용체 발현 세포주에 리간드를 처리한 후, 신호전달에 의한 세포내의 cAMP의 농도 변화를 cAMP Biotrak Enzyme-immunoassay (EIA) System을 이용하여 측정하였다. 상기　cAMP assay system (cAMP Biotrak Enzymeimmunoassay System, Amersham Biosciences)은 cAMP-특이적 항체에 퍼옥시다아제 컨쥬게이티드 cAMP와　cAMP간의 경쟁을 이용하여 컨쥬게이티드 cAMP 양을 측정하는 방법이다. In order to check whether D2-5 cells in human D2 receptor expressing cells respond normally to dopamine, which is a representative ligand, after treating the ligand with the D2 receptor expressing cell line, the concentration of cAMP in the cell by signaling is changed. Was measured using the cAMP Biotrak Enzyme-immunoassay (EIA) System. The cAMP assay system (cAMP Biotrak Enzymeimmunoassay System, Amersham Biosciences) is a method for measuring the amount of conjugated cAMP using a competition between the peroxidase conjugated cAMP and cAMP in a cAMP-specific antibody.

상기 수용체 발현 세포를 96 well plate에 2×104 cells/well 씩 분주하여 18 시간동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척한 후에 무혈청 배지 (serum free media)를 100 μL/well씩 첨가하여 1시간동안 배양하였다. D2 수용체에 대한 대표적인 리간드인 도파민(Sigma)은10 fM 내지 10 μM까지의 농도를 무혈청 배지로 희석하여 준비하였다. 리간드, 500 μM IBMX (Sigma), 및 무혈청 배지를 혼합하여 96 well plate에 첨가한 후 37℃, 20 min동안 반응시켰다. 각 well에 cell lysis buffer(5 mM Tris pH 7.4, 5 mM MgCl2)를 20 μL씩 첨가하여 상온에서 10분 동안 plate shaker를 이용하여 흔들면서 반응시켰다. 세포가 용해되었는지 여부를 현미경으로 관찰한 후에 상층액 만을 취하여 EIA에 이용하였다. The receptor expressing cells were dispensed in 96 well plates at 2 × 10 4 cells / well and incubated in 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 18 hours. After removing the medium and washing twice with PBS, serum-free medium was added and cultured for 1 hour by adding 100 μL / well. Dopamine (Sigma), a representative ligand for the D2 receptor, was prepared by diluting concentrations from 10 fM to 10 μM in serum-free medium. The ligand, 500 μM IBMX (Sigma), and serum-free medium were mixed and added to a 96 well plate, followed by reaction at 37 ° C. for 20 min. 20 μL of cell lysis buffer (5 mM Tris pH 7.4, 5 mM MgCl 2 ) was added to each well and allowed to react by shaking with a plate shaker at room temperature for 10 minutes. After observing whether the cells were lysed under a microscope, only the supernatant was taken and used for EIA.

Anti-rabbit Ig 항체가 coating된 EIA plate에 cAMP standard (0, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400, 800, 1600, 3200 fmol/well), NSB (Non Specific Binding) (이상, Amersham Biosciences) 및 위에서 얻은 상층액을 각각 100 μL/well씩 첨가하고, Blank와 NSB well을 제외한 모든 well에 Rabbit anti-cAMP 항체(Amersham Biosciences)를 100 μL/well씩 첨가하여 4℃, 2시간동안 반응시켰다. Blank를 제외한 각 well에 cAMP-퍼옥시다아제 컨쥬게이트 (Amersham Biosciences)를 50 μL/well씩 첨가하여 4℃, 1시간동안 반응시켰다. 세척액(Amersham Biosciences, 0.01 ㅡ phaphate buffer pH 7.5/0.05% Tween 20)으로 4회 세척하고 TMB substrate(3,3,5,5'-tetramethylbenzidine, Amersham Biosciences)를 첨가하여 실온에서 1시간동안 반응시킨 후 반응정지액을 첨가하여 450 nm에서 OD 값을 측정하였다. 측정된 OD 값은 다음의 식으로 percent bound (%B/Bo)값을 얻었고, cAMP standard curve(Amersham Biosciences 제조자 설명서)를 이용하여 시료의 cAMP 농도를 얻었다.CAMP standard (0, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400, 800, 1600, 3200 fmol / well), NSB (Non Specific Binding) (above, Amersham Biosciences) on EIA plate coated with Anti-rabbit Ig antibody 100 μL / well was added to the supernatant obtained above, and 100 μL / well of rabbit anti-cAMP antibody (Amersham Biosciences) was added to all wells except Blank and NSB wells, followed by reaction at 4 ° C. for 2 hours. 50 μL / well of cAMP-peroxidase conjugate (Amersham Biosciences) was added to each well except blank, and the reaction was performed at 4 ° C. for 1 hour. After washing 4 times with a wash solution (Amersham Biosciences, 0.01-phaphate buffer pH 7.5 / 0.05% Tween 20) and adding TMB substrate (3,3,5,5'-tetramethylbenzidine, Amersham Biosciences) for 1 hour at room temperature The reaction stopper was added to measure the OD value at 450 nm. The measured OD value was obtained as percent bound (% B / Bo) by the following equation, and the cAMP concentration of the sample was obtained using a cAMP standard curve (Amersham Biosciences manufacturer's manual).

　　　　　　　　　　(Standard 또는 sample OD - NSB OD) ×100(Standard or sample OD-NSB OD) × 100

%B/Bo = ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━% B / Bo = ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

　　　　　　　　　　　　　　　(Zero standard OD - NSB OD)Zero standard OD-NSB OD

상기 얻어진 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 분석결과, D2 수용체의 도파민의 농도가 증가할수록 생성되는 cAMP의 농도는 감소하였고, EC50은 0.85±0.025 nM 이었다. 따라서, Human D2 수용체 발현 세포주는 수용체를 통한 신호전달 체계가 활성화 되었음이 확인되었다.The obtained result is shown in FIG. As a result of the analysis shown in Figure 3, as the concentration of dopamine of the D2 receptor increased the concentration of cAMP produced, EC 50 was 0.85 ± 0.025 nM. Thus, the human D2 receptor expressing cell line was confirmed that the signaling system through the receptor is activated.

도 1은 pSI1-D2 벡터의 restriction map을 나타낸 것이다.Figure 1 shows a restriction map of the pSI1-D2 vector.

도 2는 D2 수용체의 binding assay 결과를 나타낸 그래프이다.Figure 2 is a graph showing the results of the binding assay of the D2 receptor.

도 3은 D2 수용체 발현 세포주의 cAMP assay 결과를 나타낸 그래프이다.Figure 3 is a graph showing the cAMP assay results of D2 receptor expressing cell lines.

도 4는 pMSG 벡터의 restriction map을 나타낸 것이다.4 shows a restriction map of the pMSG vector.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of KyungHee University <120> CELL EXPRESSING DOPAMINE D2 RECEPTOR AND METHOD OF DEVELOPING NOVEL DRUGS USING THE CELL <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2482 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dopamine D2 Receptor gene Accession No. M29066 <400> 1 agagcctggc cacccagtgg ctccaccgcc ctgatggatc cactgaatct gtcctggtat 60 gatgatgatc tggagaggca gaactggagc cggcccttca acgggtcaga cgggaaggcg 120 gacagacccc actacaacta ctatgccaca ctgctcaccc tgctcatcgc tgtcatcgtc 180 ttcggcaacg tgctggtgtg catggctgtg tcccgcgaga aggcgctgca gaccaccacc 240 aactacctga tcgtcagcct cgcagtggcc gacctcctcg tcgccacact ggtcatgccc 300 tgggttgtct acctggaggt ggtaggtgag tggaaattca gcaggattca ctgtgacatc 360 ttcgtcactc tggacgtcat gatgtgcacg gcgagcatcc tgaacttgtg tgccatcagc 420 atcgacaggt acacagctgt ggccatgccc atgctgtaca atacgcgcta cagctccaag 480 cgccgggtca ccgtcatgat ctccatcgtc tgggtcctgt ccttcaccat ctcctgccca 540 ctcctcttcg gactcaataa cgcagaccag aacgagtgca tcattgccaa 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1440 tgagcaggaa ggcctgggtg gatcggcctc ctcttcttag ccccggcagg ccctgcagtg 1500 ttcgcttggc tccatgctcc tcactgcccg cacaccctca ctctgccagg gcagtgctag 1560 tgagctgggc atggtaccag ccctggggct ggccccagct caggggcagc tcatagagtc 1620 ccccctccca cctccagtcc ccctatcctt ggcaccaaag atgcagccgc cttccttgac 1680 cttcctctgg ggctctaggg ttgctggagc ctgagtcagg gcccagaggc tgagttttct 1740 ctttgtgggg cttggcgtgg agcaggcggt ggggagagat ggacagttca caccctgcaa 1800 ggcccacagg aggcaagcaa gctctcttgc cgaggagcca ggcaacttca gtcctgggag 1860 acccatgtaa ataccagact gcaggttgga cccgagagat tcccaagcca aaaaccttag 1920 ctccctcccg caccccgatg tggacctcta ctttccaggc tagtccggac ccacctcacc 1980 ccgttacagc tccccaagtg gtttccacat gctctgagaa gaggagccct catcttgaag 2040 ggcccaggag ggtctatggg gagaggaact ccttggccta gcccaccctg ctgccttctg 2100 acggccctgc aatgtatccc ttctcacagc acatgctggc cagcctgggg cctggcaggg 2160 aggtcaggcc ctggaactct atctgggcct gggctaggga catcagaggt tctttgaggg 2220 actgcctctg ccacactctg acgcaaaacc actttccttt tctattcctt ctggcctttc 2280 ctctctcctg tttcccttcc cttccactgc ctctgcctta gaggagccca cggctaagag 2340 gctgctgaaa accatctggc ctggcctggc cctgccctga ggaaggaggg gaagctgcag 2400 cttgggagag cccctggggc ctagactctg taacatcact atccgatgca ccaaactaat 2460 aaaactttga cgagtcacct tc 2482 <210> 2 <211> 1332 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Dopamine D2 Receptor gene <400> 2 atggatccac tgaatctgtc ctggtatgat gatgatctgg agaggcagaa ctggagccgg 60 cccttcaacg ggtcagacgg gaaggcggac agaccccact acaactacta tgccacactg 120 ctcaccctgc tcatcgctgt catcgtcttc ggcaacgtgc tggtgtgcat ggctgtgtcc 180 cgcgagaagg cgctgcagac caccaccaac tacctgatcg tcagcctcgc agtggccgac 240 ctcctcgtcg ccacactggt catgccctgg gttgtctacc tggaggtggt aggtgagtgg 300 aaattcagca ggattcactg tgacatcttc gtcactctgg acgtcatgat gtgcacggcg 360 agcatcctga acttgtgtgc catcagcatc gacaggtaca cagctgtggc catgcccatg 420 ctgtacaata cgcgctacag ctccaagcgc cgggtcaccg tcatgatctc catcgtctgg 480 gtcctgtcct tcaccatctc ctgcccactc ctcttcggac tcaataacgc agaccagaac 540 gagtgcatca 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D2 Receptor Encoded by SEQ ID NO: 2 <400> 3 Met Asp Pro Leu Asn Leu Ser Trp Tyr Asp Asp Asp Leu Glu Arg Gln 1 5 10 15 Asn Trp Ser Arg Pro Phe Asn Gly Ser Asp Gly Lys Ala Asp Arg Pro 20 25 30 His Tyr Asn Tyr Tyr Ala Thr Leu Leu Thr Leu Leu Ile Ala Val Ile 35 40 45 Val Phe Gly Asn Val Leu Val Cys Met Ala Val Ser Arg Glu Lys Ala 50 55 60 Leu Gln Thr Thr Thr Asn Tyr Leu Ile Val Ser Leu Ala Val Ala Asp 65 70 75 80 Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Met Pro Trp Val Val Tyr Leu Glu Val 85 90 95 Val Gly Glu Trp Lys Phe Ser Arg Ile His Cys Asp Ile Phe Val Thr 100 105 110 Leu Asp Val Met Met Cys Thr Ala Ser Ile Leu Asn Leu Cys Ala Ile 115 120 125 Ser Ile Asp Arg Tyr Thr Ala Val Ala Met Pro Met Leu Tyr Asn Thr 130 135 140 Arg Tyr Ser Ser Lys Arg Arg Val Thr Val Met Ile Ser Ile Val Trp 145 150 155 160 Val Leu Ser Phe Thr Ile Ser Cys Pro Leu Leu Phe Gly Leu Asn Asn 165 170 175 Ala Asp Gln Asn Glu Cys Ile Ile Ala Asn Pro Ala Phe Val Val Tyr 180 185 190 Ser Ser Ile Val Ser Phe Tyr Val Pro Phe Ile Val Thr Leu Leu Val 195 200 205 Tyr Ile Lys Ile Tyr Ile Val Leu Arg Arg Arg Arg Lys Arg Val Asn 210 215 220 Thr Lys Arg Ser Ser Arg Ala Phe Arg Ala His Leu Arg Ala Pro Leu 225 230 235 240 Lys Gly Asn Cys Thr His Pro Glu Asp Met Lys Leu Cys Thr Val Ile 245 250 255 Met Lys Ser Asn Gly Ser Phe Pro Val Asn Arg Arg Arg Val Glu Ala 260 265 270 Ala Arg Arg Ala Gln Glu Leu Glu Met Glu Met Leu Ser Ser Thr Ser 275 280 285 Pro Pro Glu Arg Thr Arg Tyr Ser Pro Ile Pro Pro Ser His His Gln 290 295 300 Leu Thr Leu Pro Asp Pro Ser His His Gly Leu His Ser Thr Pro Asp 305 310 315 320 Ser Pro Ala Lys Pro Glu Lys Asn Gly His Ala Lys Asp His Pro Lys 325 330 335 Ile Ala Lys Ile Phe Glu Ile Gln Thr Met Pro Asn Gly Lys Thr Arg 340 345 350 Thr Ser Leu Lys Thr Met Ser Arg Arg Lys Leu Ser Gln Gln Lys Glu 355 360 365 Lys Lys Ala Thr Gln Met Leu Ala Ile Val Leu Gly Val Phe Ile Ile 370 375 380 Cys Trp Leu Pro Phe Phe Ile Thr His Ile Leu Asn Ile His Cys Asp 385 390 395 400 Cys Asn Ile Pro Pro Val Leu Tyr Ser Ala Phe Thr Trp Leu Gly Tyr 405 410 415 Val Asn Ser Ala Val Asn Pro Ile Ile Tyr Thr Thr Phe Asn Ile Glu 420 425 430 Phe Arg Lys Ala Phe Leu Lys Ile Leu His Cys 435 440 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5D2NheI <400> 4 gctagcgcca ccatggatcc actgaatctg tc 32 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3D2XhoI <400> 5 ctcgagtcag cagtggagga tcttcag 27 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer S1D2R <400> 6 tggacgtcat gatgtgca 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer S2D2R <400> 7 tcaagatcta cattgtcc 18 <110> Industry Academic Cooperation Foundation of KyungHee University <120> CELL EXPRESSING DOPAMINE D2 RECEPTOR AND METHOD OF DEVELOPING          NOVEL DRUGS USING THE CELL <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2482 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dopamine D2 Receptor gene Accession No. M29066 <400> 1 agagcctggc cacccagtgg ctccaccgcc ctgatggatc cactgaatct gtcctggtat 60 gatgatgatc tggagaggca gaactggagc cggcccttca acgggtcaga cgggaaggcg 120 gacagacccc actacaacta ctatgccaca ctgctcaccc tgctcatcgc tgtcatcgtc 180 ttcggcaacg tgctggtgtg catggctgtg tcccgcgaga aggcgctgca gaccaccacc 240 aactacctga tcgtcagcct cgcagtggcc gacctcctcg tcgccacact ggtcatgccc 300 tgggttgtct acctggaggt ggtaggtgag tggaaattca gcaggattca ctgtgacatc 360 ttcgtcactc tggacgtcat gatgtgcacg gcgagcatcc tgaacttgtg tgccatcagc 420 atcgacaggt acacagctgt ggccatgccc atgctgtaca atacgcgcta cagctccaag 480 cgccgggtca ccgtcatgat ctccatcgtc tgggtcctgt ccttcaccat ctcctgccca 540 ctcctcttcg gactcaataa cgcagaccag aacgagtgca tcattgccaa cccggccttc 600 gtggtctact cctccatcgt ctccttctac gtgcccttca ttgtcaccct gctggtctac 660 atcaagatct acattgtcct ccgcagacgc cgcaagcgag tcaacaccaa acgcagcagc 720 cgagctttca gggcccacct gagggctcca ctaaagggca actgtactca ccccgaggac 780 atgaaactct gcaccgttat catgaagtct aatgggagtt tcccagtgaa caggcggaga 840 gtggaggctg cccggcgagc ccaggagctg gagatggaga tgctctccag caccagccca 900 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ctttgtgggg cttggcgtgg agcaggcggt ggggagagat ggacagttca caccctgcaa 1800 ggcccacagg aggcaagcaa gctctcttgc cgaggagcca ggcaacttca gtcctgggag 1860 acccatgtaa ataccagact gcaggttgga cccgagagat tcccaagcca aaaaccttag 1920 ctccctcccg caccccgatg tggacctcta ctttccaggc tagtccggac ccacctcacc 1980 ccgttacagc tccccaagtg gtttccacat gctctgagaa gaggagccct catcttgaag 2040 ggcccaggag ggtctatggg gagaggaact ccttggccta gcccaccctg ctgccttctg 2100 acggccctgc aatgtatccc ttctcacagc acatgctggc cagcctgggg cctggcaggg 2160 aggtcaggcc ctggaactct atctgggcct gggctaggga catcagaggt tctttgaggg 2220 actgcctctg ccacactctg acgcaaaacc actttccttt tctattcctt ctggcctttc 2280 ctctctcctg tttcccttcc cttccactgc ctctgcctta gaggagccca cggctaagag 2340 gctgctgaaa accatctggc ctggcctggc cctgccctga ggaaggaggg gaagctgcag 2400 cttgggagag cccctggggc ctagactctg taacatcact atccgatgca ccaaactaat 2460 aaaactttga cgagtcacct tc 2482 <210> 2 <211> 1332 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Dopamine D2 Receptor gene <400> 2 atggatccac tgaatctgtc ctggtatgat gatgatctgg agaggcagaa ctggagccgg 60 cccttcaacg ggtcagacgg gaaggcggac agaccccact acaactacta tgccacactg 120 ctcaccctgc tcatcgctgt catcgtcttc ggcaacgtgc tggtgtgcat ggctgtgtcc 180 cgcgagaagg cgctgcagac caccaccaac tacctgatcg tcagcctcgc agtggccgac 240 ctcctcgtcg ccacactggt catgccctgg gttgtctacc tggaggtggt aggtgagtgg 300 aaattcagca ggattcactg tgacatcttc gtcactctgg acgtcatgat gtgcacggcg 360 agcatcctga acttgtgtgc catcagcatc gacaggtaca cagctgtggc catgcccatg 420 ctgtacaata cgcgctacag ctccaagcgc cgggtcaccg tcatgatctc catcgtctgg 480 gtcctgtcct tcaccatctc ctgcccactc ctcttcggac tcaataacgc agaccagaac 540 gagtgcatca ttgccaaccc ggccttcgtg gtctactcct ccatcgtctc cttctacgtg 600 cccttcattg tcaccctgct ggtctacatc aagatctaca ttgtcctccg cagacgccgc 660 aagcgagtca acaccaaacg cagcagccga gctttcaggg cccacctgag ggctccacta 720 aagggcaatt gtactcaccc cgaggacatg aaactctgca ccgttatcat gaagtctaat 780 gggagtttcc cagtgaacag gcggagagtg gaggctgccc ggcgagccca ggagctggag 840 atggagatgc tctccagcac cagcccaccc gagaggaccc ggtacagccc catcccaccc 900 agccaccacc agctgactct ccccgacccg tcccaccatg gtctccacag cactcccgac 960 agccccgcca aaccagagaa gaatgggcat gccaaagacc accccaagat tgccaagatc 1020 tttgagatcc agaccatgcc caatggcaaa acccggacct ccctcaagac catgagccgt 1080 aggaagctct cccagcagaa ggagaagaaa gccactcaga tgctcgccat tgttctcggc 1140 gtgttcatca tctgctggct gcccttcttc atcacacaca tcctgaacat acactgtgac 1200 tgcaacatcc cgcctgtcct gtacagcgcc ttcacgtggc tgggctatgt caacagcgcc 1260 gtgaacccca tcatctacac caccttcaac attgagttcc gcaaggcctt cctgaagatc 1320 ctccactgct ga 1332 <210> 3 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Dopamine D2 Receptor Encoded by SEQ ID NO: 2 <400> 3 Met Asp Pro Leu Asn Leu Ser Trp Tyr Asp Asp Asp Leu Glu Arg Gln   1 5 10 15 Asn Trp Ser Arg Pro Phe Asn Gly Ser Asp Gly Lys Ala Asp Arg Pro              20 25 30 His Tyr Asn Tyr Tyr Ala Thr Leu Leu Thr Leu Leu Ile Ala Val Ile          35 40 45 Val Phe Gly Asn Val Leu Val Cys Met Ala Val Ser Arg Glu Lys Ala      50 55 60 Leu Gln Thr Thr Thr Asn Tyr Leu Ile Val Ser Leu Ala Val Ala Asp  65 70 75 80 Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Met Pro Trp Val Val Tyr Leu Glu Val                  85 90 95 Val Gly Glu Trp Lys Phe Ser Arg Ile His Cys Asp Ile Phe Val Thr             100 105 110 Leu Asp Val Met Met Cys Thr Ala Ser Ile Leu Asn Leu Cys Ala Ile         115 120 125 Ser Ile Asp Arg Tyr Thr Ala Val Ala Met Pro Met Leu Tyr Asn Thr     130 135 140 Arg Tyr Ser Ser Lys Arg Arg Val Thr Val Met Ile Ser Ile Val Trp 145 150 155 160 Val Leu Ser Phe Thr Ile Ser Cys Pro Leu Leu Phe Gly Leu Asn Asn                 165 170 175 Ala Asp Gln Asn Glu Cys Ile Ile Ala Asn Pro Ala Phe Val Val Tyr             180 185 190 Ser Ser Ile Val Ser Phe Tyr Val Pro Phe Ile Val Thr Leu Leu Val         195 200 205 Tyr Ile Lys Ile Tyr Ile Val Leu Arg Arg Arg Arg Arg Lys Arg Val Asn     210 215 220 Thr Lys Arg Ser Ser Arg Ala Phe Arg Ala His Leu Arg Ala Pro Leu 225 230 235 240 Lys Gly Asn Cys Thr His Pro Glu Asp Met Lys Leu Cys Thr Val Ile                 245 250 255 Met Lys Ser Asn Gly Ser Phe Pro Val Asn Arg Arg Arg Val Glu Ala             260 265 270 Ala Arg Arg Ala Gln Glu Leu Glu Met Glu Met Leu Ser Ser Thr Ser         275 280 285 Pro Pro Glu Arg Thr Arg Tyr Ser Pro Ile Pro Pro Ser His His Gln     290 295 300 Leu Thr Leu Pro Asp Pro Ser His His Gly Leu His Ser Thr Pro Asp 305 310 315 320 Ser Pro Ala Lys Pro Glu Lys Asn Gly His Ala Lys Asp His Pro Lys                 325 330 335 Ile Ala Lys Ile Phe Glu Ile Gln Thr Met Pro Asn Gly Lys Thr Arg             340 345 350 Thr Ser Leu Lys Thr Met Ser Arg Arg Lys Leu Ser Gln Gln Lys Glu         355 360 365 Lys Lys Ala Thr Gln Met Leu Ala Ile Val Leu Gly Val Phe Ile Ile     370 375 380 Cys Trp Leu Pro Phe Phe Ile Thr His Ile Leu Asn Ile His Cys Asp 385 390 395 400 Cys Asn Ile Pro Pro Val Leu Tyr Ser Ala Phe Thr Trp Leu Gly Tyr                 405 410 415 Val Asn Ser Ala Val Asn Pro Ile Ile Tyr Thr Thr Phe Asn Ile Glu             420 425 430 Phe Arg Lys Ala Phe Leu Lys Ile Leu His Cys         435 440 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5D2NheI <400> 4 gctagcgcca ccatggatcc actgaatctg tc 32 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3D2XhoI <400> 5 ctcgagtcag cagtggagga tcttcag 27 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer S1D2R <400> 6 tggacgtcat gatgtgca 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer S2D2R <400> 7 tcaagatcta cattgtcc 18  

Claims (12)

서열번호 2의 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오타이드.Polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. 서열번호 2의 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 포유류 세포 발현 벡터.Mammalian cell expression vector comprising a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. 서열번호 2의 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오타이드가 형질도입된 형질전환체.A transformant transduced with a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. 제3항에 있어서, The method of claim 3, 상기 형질전환체는 상기 폴리뉴클레오타이드가 BHK (Baby Hamster Kidney) 세포, CHO (Chinese Hamster Ovary) 세포, 마우스 배아 섬유아세포 (Mouse embryonic fibroblast cell line), 인간 배아 신장 (Human Embryonic Kidney) 세포, 및 마우스 골수종 세포 (Myeloma Cell)로 이루어진 군에서 선택된 포유류 세포에 형질도입된 것인 형질전환체. The transformant is a polynucleotide wherein the polynucleotide is BHK (Baby Hamster Kidney) cells, CHO (Chinese Hamster Ovary) cells, mouse embryonic fibroblast cell line, human embryonic kidney (Human Embryonic Kidney) cells, and mouse myeloma A transformant that is transduced to a mammalian cell selected from the group consisting of cells (Myeloma Cell). 제4항에 있어서, The method of claim 4, wherein 상기 포유류 세포는 디하이드로폴레이트 리덕테이즈(dehydrofolate reductase, DHFR)가 결핍된 것인 형질전환체.The mammalian cell is deficient in dehydrofolate reductase (DHFR) transformants. 제3항에 있어서, The method of claim 3, 기탁번호 KCLRF-BP-00189인 형질전환체. Transformant with accession number KCLRF-BP-00189. 1) 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 제작하는 단계; 및1) preparing an expression vector comprising the polynucleotide of SEQ ID NO: 2; And 2) 상기 제작된 발현벡터를 포유류 세포에 형질도입시키는 단계2) transducing the prepared expression vector into mammalian cells 를 포함하고,Including, 상기 포유류 세포는 BHK (Baby Hamster Kidney) 세포, CHO (Chinese Hamster Ovary) 세포, 마우스 배아 섬유아세포 (Mouse embryonic fibroblast cell line), 인간 배아 신장 (Human Embryonic Kidney) 세포, 및 마우스 골수종 세포 (Myeloma Cell)로 이루어진 군에서 선택된 것으로, 디하이드로폴레이트 리덕테이즈(DHFR)가 결핍된 것인,The mammalian cells include Baby Hamster Kidney (BHK) cells, Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, Mouse embryonic fibroblast cell lines, Human Embryonic Kidney cells, and Mouse Myeloma Cells. It is selected from the group consisting of, dihydrofolate reductase (DHFR) is deficient, 형질전환체의 제조 방법.Method for preparing a transformant. 제7항에 있어서, The method of claim 7, wherein 상기 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터는 dhfr 유전자 (Accession No. K01164)를 포함하는 발현벡터와 100:0.1 내지 10의 몰비로 공동형질도입시키는 것을 특징으로 하는 형질전환체의 제조 방법. The expression vector comprising the polynucleotide of SEQ ID NO: 2 is co-transformed with the expression vector containing the dhfr gene (Accession No. K01164) in a molar ratio of 100: 0.1 to 10 characterized in that the method for producing a transformant. a) 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드가 형질도입된 형질전환체를 준비하는 단계; a) preparing a transformant transduced with the polynucleotide of SEQ ID NO: 2; b) 상기 형질전환체에 도파민 D2 수용체에 특이적인 리간드를 처리하고, 후보물질과 접촉시키는 단계; 및b) treating the transformant with a ligand specific for the dopamine D2 receptor and contacting the candidate; And c) 상기 후보물질과 접촉된 형질전환체에서의 도파민 D2 수용체의 활성을 측정하고, 후보물질을 처리하지 않은 형질전환체에서의 도파민 D2 수용체의 활성을 측정하여, 후보 물질과 접촉된 형질전환체에서의 도파민 D2 수용체의 활성과 후보 물질을 처리하지 않은 형질전환체에서의 도파민 D2 수용체의 활성과 비교하는 단계c) measuring the activity of the dopamine D2 receptor in the transformant in contact with the candidate, and measuring the activity of the dopamine D2 receptor in the transformant not treated with the candidate, thereby transforming the contact with the candidate. Comparing the activity of dopamine D2 receptor in and the activity of dopamine D2 receptor in a transformant not treated with the candidate substance 를 포함하는 도파민 D2 수용체 작용 조절제의 스크리닝 방법.Screening method of dopamine D2 receptor action modulator comprising a. 제9항에 있어서, 10. The method of claim 9, 상기 도파민 D2 수용체의 활성은 도파민 D2 수용체와 리간드와의 결합 정도, 생성되는 cAMP의 농도, 또는 도파민 D2 수용체를 통한 신호전달에서 생성되는 산물의 농도에 의하여 측정하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법. The activity of the dopamine D2 receptor is measured by the degree of binding of the dopamine D2 receptor and the ligand, the concentration of cAMP produced, or the concentration of the product generated in the signaling through the dopamine D2 receptor. 제10항에 있어서, The method of claim 10, 후보물질과 접촉된 형질전환체에서의 도파민 D2 수용체와 리간드와의 결합 정도가 후보물질을 처리하지 않은 형질전환체보다 증가하거나, 생성되는 cAMP의 농도가 후보물질을 처리하지 않은 형질전환체보다 감소하는 경우, 상기 후보물질을 도파민 D2 수용체의 작용 증진제로 판단하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.The degree of binding of the dopamine D2 receptor to the ligand in the transformant in contact with the candidate was increased than that of the candidate-treated transformant, or the concentration of cAMP produced was lower than that of the candidate-treated transformant. If so, the candidate method is characterized in that the screening method characterized in that it is determined as an action enhancer of the dopamine D2 receptor. 제10항에 있어서, The method of claim 10, 후보물질과 접촉된 형질전환체에서의 도파민 D2 수용체와 리간드와의 결합 정도가 후보물질을 처리하지 않은 형질전환체보다 감소된 경우 상기 후보물질을 도파민 D2 수용체의 작용 억제제로 판단하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.When the degree of binding of the dopamine D2 receptor and the ligand in the transformant in contact with the candidate is reduced than that of the transformant not treated with the candidate, the candidate is regarded as an inhibitor of the action of the dopamine D2 receptor. Screening method.
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