KR20100065913A - 감태 추출물을 이용하여 신경퇴행성 질병을 치료하거나 그 증상을 완화 또는 방지하기 위한 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 감태 추출물을 이용하여 신경퇴행성 질병을 치료하거나 그 증상을 완화 또는 방지하기 위한 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 동물에서의 신경퇴행성 질병을 치료하거나 그 증상을 완화 또는 방지하는 데에 효과적인 양의 감태 추출물을 포함하는 조성물이 제공된다.

감태 추출물, 신경퇴행성 질병

Description

감태 추출물을 이용하여 신경퇴행성 질병을 치료하거나 그 증상을 완화 또는 방지하기 위한 조성물{COMPOSITION FOR TREATING NEURODEGENERATIVE DISEASE, OR ALLEVIATING OR PREVENTING SYMPTOMS THEREOF BY USING ECKLONIA CAVA EXTRACTS}

본 발명은 감태 추출물을 이용하여 신경퇴행성 질병을 치료하거나 그 증상을 완화 또는 방지하기 위한 조성물에 관한 것이다.

감태(Ecklonia cava; EC)는 살균, 라디칼 소거, 티로시나제 억제 및 프로테아제 억제를 위한 활용도가 입증된 바 있는 갈조류의 일종이다. 또한, 본 발명자들이 미국특허출원 제11/851,359호를 통하여 밝힌 바와 같이, 감태 추출물로 구성된 조성물을 활용함으로써 인간을 포함한 동물의 천식 반응을 완화하거나 방지하는 것 역시 가능함이 밝혀진 바 있다.

그러나, 이러한 감태를 이용하여 모종의 염증을 제거하거나 염증으로 인한 증상을 완화하거나 방지하기 위한 시도는 그러한 작용의 기초가 되는 기전의 불분명함 등으로 인하여 원시적인 단계에 머물고 있었다.

본 발명자들은, 감태 추출물로 구성된 조성물을 활용하는 것과 연관하여, 신경퇴행성 질병의 기전에 관하여 살펴볼 수 있다는 점을 고려하였다.

학계를 통하여 알려진 바에 따르면, 소신경교세포는 배발생의 초기에 뇌에 도입되고, 신경계의 성숙과 동시에 발달한다(Mosley 외, 2006). 그리고, 소신경교세포는 뇌의 특정 구역에서 그 세포 집단의 20%까지 차지할 수 있다(Dobrneis, 1998; Lawson 외, 1990). 이러한 소신경교세포는 뇌 손상 및 신경퇴행성 질병에 반응하여 활성화되는, 중추신경계에서 발견되는 면역 세포이고, 지질다당체(LPS), 인터페론-γ 또는 β-아밀로이드에 노출된 후 유도될 수 있다(Lehnardt 외, 2003; Meda 외, 1995; Zielasek 및 Hartung, 1996). 활성화된 소신경교세포는 산화질소(NO), 프로스타글란딘 E₂(PGE₂), 반응성 산소종(ROS) 및 전염증성 시토킨(인터루킨(IL)-1β, IL-6 및 종양 괴사 인자(TNF)-α)을 포함한 신경독성 및 전염증성 인자를 방출할 수 있다. 그러므로, 소신경교세포의 활성화는 몇몇 신경퇴행성 질병의 개시 및 진행에 있어서 중추적인 역할을 하는 것으로 간주할 수 있다. 활성화된 소신경교세포에 의해 생산된 과도한 양의 각각의 인자는 알츠하이머병, 파킨슨병, 외상, 다발 경화증 및 대뇌 허혈을 포함한 뇌 손상 및 기타 질병을 일으킬 수 있다. 따라서, 소신경교세포의 활성화를 조절하는 것은, 신경퇴행성 질병에 있어서 전형적으로 발생하는 뉴런 손상 및/또는 사멸을 감소시키는 것을 가능케 함으로써, 결국 신경퇴행성 질병의 치료, 증상 완화 및/또는 증상 방지로 이어질 수 있다.

한편, LPS는 신경퇴행성 질병의 발병 기전에서 중요한 역할을 하는 많은 주요 세포 반응을 개시시키고, 이는 다시 뉴런을 손상시킬 수 있다. 그러므로, 소신 경교세포의 LPS 자극은 활성화된 소신경교세포로부터 방출된 각종 신경독성 인자에 의한 뉴런 손상에 관한 기전의 연구에 사용하기 위한 유용한 모델이 될 수 있다(Bocchini 외. 1992; Woo 외, 2004). 이들 매개체 중에서, PGE₂ 및 NO는 각각 시클로옥시게나제(COX)-2의 유도성 이소형(isoform) 및 유도성 산화질소 합성 효소(iNOS) 엔자임의 산물이다(Vane 외, 1994). 특히, NO는 혈관 확장, 신경 소통 및 숙주 방어를 포함한 다양한 생리 기능에서 중요한 생물학적 메신저 분자인 것으로 나타났다(MacMicking 외, 1997; Mitchell 외, 1995). 한편, iNOS는 정상적으로는 뇌에서 발현되지 않지만, LPS는 소신경교세포, 별아교세포 및 가능하게는 뉴런에서 iNOS의 발현을 상향 조절하는 것으로 보고되었다(Vegeto 외, 2001; Murphy 외, 2000; Heneka 외, 2001). 이렇듯 활성화된 소신경교세포에 의한 과도한 NO 방출은 신경퇴행의 진전과 상호관련되어 있는 것으로 알려져 있다(Brown, 2007). 또한, 시클로옥시게나제(COX)는 아라키돈산의 프로스타글란딘 H2(다양한 생물학적 활성 매개체, 예를 들어 PGE₂, 프로스타시클린 및 트롬복산 A2에 대한 전구체)로의 전환을 촉매하는 효소이다(Hawkey, 1999; Picot 외, 1994). COX는 다음과 같은 두 가지 주요 동종 효소로서 존재한다: COX-1(구성 시클로옥시게나제) 및 COX-2(유도성 시클로옥시게나제). COX-2는 염증 부위에서 주된 시클로옥시게나제이다(Mitchell 외, 1995; Smith 외, 1996). COX-2는 각종 자극, 예를 들어 뉴런 활성, 전염증성 시토킨에 반응하여 대식세포 및 내피 세포에서 생산되고, 또한 염증과 연관된 부종 및 혈관 확장을 유발할 수 있다. 그러나, 중추 신경계에서, COX-2 는 정상 조건 하에 발현되고, 많은 기초적인 뇌 기능에 기여한다(Minghetti, 2004). 함께 살펴보면, 이들 데이터는 iNOS 및 COX-2를 포함한 염증 매개체가 뇌졸중, 대뇌 허혈, 파킨슨병, 다발경화증 및 알츠하이머병을 포함한 신경퇴행성 질병에서 많은 종류의 뉴런 손상 증상을 유발함을 나타낸다. 따라서, 이들 염증 매개체의 억제가 신경퇴행성 질병의 치료, 최소한 신경퇴행성 질병의 증상 완화 또는 증상 방지를 위한 하나의 목표가 될 수 있다.

본 발명에서는, 쥐 BV2 소신경교세포에서 LPS-자극된 각종 신경독성 인자에 대한 감태 추출물의 작용의 효과 및 기전이 조사되었다. 쥐 BV2 세포주는 많은 소신경교세포 반응을 모방하는 것으로 나타났고, 모델 소신경교세포계로서 널리 사용되고 있으므로, 본 발명자들은 상기 세포주를 본 발명에서 사용하였다.

기본적으로, 본 발명자들은 감태로부터 적정 조건 하에서 추출물을 추출하고, 쥐 BV2 소신경교세포에서 LPS-자극된 각종 신경독성 인자에 대한 감태 추출물의 작용을 연구하였다. 이에 따라, 본 발명자들은 동물의, 더욱 바람직하게는 인간의 신경퇴행성 질병을 치료하거나 그 증상을 완화 또는 방지하는 데에 효과를 갖는 본 발명에 이르렀다.

본 발명은 동물의, 더욱 바람직하게는 인간의 신경퇴행성 질병을 치료하거나 그 증상을 완화 또는 방지하는 것을 그 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 태양에 따르면, 동물에서의 신경퇴행성 질병을 치료하거나 그 증상을 완화 또는 방지하는 데에 효과적인 양의 감태 추출물을 포함하는 조성물이 제공된다.

본 발명에 의하면, 동물의, 더욱 바람직하게는 인간의 신경퇴행성 질병을 치료하거나 그 증상을 완화 또는 방지하는 데에 도움이 되는 조성물이 제공된다.

후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 실시예를 예시로서 도시하는 첨부 도면을 참조한다. 이들 실시예는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 여기에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 일 실시예와 관련하여 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 실시예로 구현될 수 있다. 또한, 각각의 개시된 실시예 내의 개별 구성요소의 위치 또는 배치는 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 후술하는 상세한 설명 은 한정적인 의미로서 취하려는 것이 아니며, 본 발명의 범위는, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 도면에서 유사한 참조부호는 여러 측면에 걸쳐서 동일 또는 유사한 기능을 지칭한다.

또한, 본 명세서에서의 상세한 설명 및/또는 도면에서 언급되어 있는 각종 염기 서열은, 그것이 본 발명의 범위를 벗어나 구현된 것이 아닌 이상, 당업자의 선택에 따라 일부 변경되어 구현될 수 있음이 이해되어야 한다.

이하에서, 본 발명의 실시예에 관하여 상세하게 설명하기로 한다.

발명의 실시를 위한 물질과 방법

1. 감태 추출물의 준비

본 발명에 필수적인 감태 추출물의 준비 과정을 이하에서 상세히 기술한다.

감태는 갈조류(Laminariaceae)로서, 대한민국 제주도의 조하대 지역에서 풍부하게 발견된다. 근래에 들어, 감태의 살균, 라디칼 소거, 티로시나제 억제 및 프로테아제 억제를 위한 활용도는 입증된 바 있다.

감태는 주로 수온이 서늘한 기간 동안, 대한민국 제주도 해안을 따라 수집되었다. 감태는, 감태 표면에 붙어있는 소금, 착생 식물, 모래 등과 같은 이물질을 제거하기 위해 수도물에 세 번 이상 세척되었다. 그런 다음, 영하 20℃와 같은 저온 환경에서 저장되었다. 이러한 동결된 감태 표본은 추출되기 전에, 분쇄기를 이용해서, 감압 하에 동결 건조되고 균질화되었다. 마지막으로, 감태 분말은 감태 추출물을 얻기 위해 유기 용제에 침지되었다. 추출을 위한 유기 용제는, 바람직하 게는, 메탄올, 에탄올, 에틸 아세테이트, 아세토니트릴, 아세톤, 물 및 그 혼합 용액, 및 물/에탄올 혼합 용액으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것이 유용하다. 선택 사항으로서, 상기 추출 과정은, 각각의 반복 단계에 사용되는 용제를 달리하여, 그 수율을 증가시키기 위해 최소 2번 반복될 수 있다.

본 발명에서는, 말린 감태 분말 1 kg이, 예를 들면, 95% EtOH(1:10 w/v)으로 추출되고 진공 증착된다. 불필요한 물질과 남아 있는 용제를 추출물에서 제거하기 위해, 원심 분리기와 회전 증발 농축기와 같은 분리 및 농축 기구가 사용될 수 있다.

2. 실험 재료의 준비

LPS(대장균(Escherichia coli) 026:B6), p-니트로페닐 포스페이트 및 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT)를 시그마(Sigma, 미국 미주리주 세인트루이스)로부터 구입하였다. RT-PCR 시약은 프로메가(Promega, 미국 위스콘신주 매디슨)로부터 구입하였다. Lightshift 화학발광 전기영동 이동성 시프트(mobility shift) 분석, 핵 및 세포질 추출, 및 비오틴 3' 단부 표지를 위한 시약은 피어스(Pierce, 미국 일리노이주 록포드)로부터 구입하였다. 그리고, iNOS, COX-2 및 p65에 대한 특이적 항체는 산타크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology, 미국 캘리포니아주 산타크루즈)로부터 구입하였다. IκB, ERK, 인산화된 (p)-ERK 1/2, p38, p-p38, JNK/SAPK 및 p-JNK/SAPK에 대한 항체는 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology, 미국 매사추세츠주 베벌리)로부터 구입하였다.

3. 세포 배양

쥐 BV2 소신경교세포를 10% FBS, 100　U/ml 페니실린 및 100　㎍/ml 스트렙토마이신을 보충한 DMEM 내에서 배양하고, 5% CO₂의 가습 인큐베이터 내에 유지하였다. 모든 실험에서, 세포를 표시된 농도의 감태로 60분 동안 전처리한 후, 무혈청 DMEM 내의 LPS(1　㎍/ml)를 첨가하였다.

4. 세포 생활력 분석

포르마잔으로의 미토콘드리아-의존 환원에 의해 결정되는 세포 생활력의 표시제로서 MTT를 사용하였다. 간단히 설명하면, 세포를 접종한 후, 각종 시약으로 표시된 시간 동안 처리하였다. 각종 처리 후, 배지를 제거하고, 세포를 0.5　mg/mL MTT의 용액과 함께 인큐베이팅하였다. 3시간 동안 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이팅한 후, 상등액을 제거하고, 미세판 판독기를 사용하여 540　nm에서 신호를 모니터링하여 포르마잔의 형성을 관찰하였다.

5. 아질산염 분석

배양 상등액 중의 NO의 농도는 이전에 설명된 바와 같이 Griess 시약을 사용하여 NO의 안정한 주요 산물인 아질산염으로서 결정하였다(Coker and Laurent, 1998). 세포(5×10⁵ 세포/ml)를 24-웰 판 내에서 24시간 동안 자극한 후, 100　㎕의 각각의 배양된 배지를 동일 부피의 Griess 시약(1% 술파닐아미드/0.1% N-(1-나프틸)-에틸렌디아민 디히드로클로라이드/2.5% H₃PO₄)과 혼합하였다. 아질산염 수준은 ELISA 플레이트 판독기(Dynatech MR-7000; 다이나테크 래보래토리스(Dynatech Laboratories))를 사용하여 540 nm에서 비색법으로 결정하고, 공지의 농도에 의해 생성된 아질산나트륨의 표준 곡선을 참조하여 아질산염 농도를 계산하였다.

6. 웨스턴 블롯(Western blot) 분석

세포를 PBS로 3회 세척하고 용해 버퍼(1% Triton X-100, 1% 데옥시콜레이트, 0.1% NaN₃)로 용해시켰다. 동일량의 단백질을 10% SDS-폴리아크릴아미드 미니겔 상에서 분리하고, Immobilon 폴리비닐리덴디플루오라이드 막(밀리포어 (Millipore))에 옮겼다. 적절한 1차 항체와 함께 인큐베이팅한 후, 막을 1시간 동안 실온에서 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)에 컨쥬게이팅된 2차 항체와 함께 인큐베이팅하였다. Tris-완충 염수-Tween(TBST) 내에 3회 세척한 후, 면역 반응 밴드를 ECL 검출 시스템을 이용하여 가시화하였다. 평행 실험에서, 제조자의 프로토콜에 따라 핵 추출 시약을 사용하여 핵 단백질을 제조하였다.

7. RT-PCR

TRIzol 시약(인비트로겐(Invitrogen, 미국 캘리포니아주))을 사용하여 총 RNA를 단리하였다. M-MLV 역전사효소(프로메가)를 사용하여 세포로부터의 총 RNA(1.0　㎍)를 역전사시켜 cDNA를 생산하였다. iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β 및 GAPDH를 인코딩하는 RT-생성된 cDNA를 선택적 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR은 쥐 iNOS (5'-ATGTCCGAAGCAAACATCAC-3' 및 5'-TAATGTCCAGGAAGTAGGTG-3'), COX-2 (5'-CAGCAAATCCTTGCTGTTCC-3' 및 5'-TGGGCAAAGAATGCAAACATC-3'), IL-1β (5'-ATGGCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3' 및 5'- TTTCCTTTCTTAGATATGGACAGGAC-3'), TNF-α (5'-ATGAGCACAGAAAGCATGATC-3' 및 5'-TACAGGCTTGTCACTCGAATT-3')에 대한 선택적 프라이머를 사용하여 수행하였다. 증폭시킨 후, PCR 반응액의 일부를 아가로스겔 상에서 전기영동하였다.

8. 효소-결합 면역 흡착 분석(ELISA)

TNF-α, IL-1β 및 PGE₂의 수준을 ELISA에 의해 결정하였다. TNF-α 및 IL-1β의 측정을 위해 알앤디 시스템즈(R&D Systems, 미국 미네소타주 미네아폴리스))로부터의 ELISA 키트를 사용하고, PGE₂의 측정을 위해 케이만 케미칼(Cayman Chemical, 미국 미시건주 앤 아버)의 키트를 사용하였다.

9. 전기영동 이동성 시프트 분석(EMSA)

NE-PER 핵 추출 시약을 사용하여 핵 추출물을 제조하였다. 겔 지연(gel retardation) 분석을 위한 프로브로서, 면역글로불린 κ-사슬 결합 부위 (κB, 5'-CCGGTTAACAGAGGGGGCTTTCCGAG-3')를 갖는 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 비-방사성 방법을 사용하였고, 그에 의해 프로브의 3' 단부를 제조자의 프로토콜(피어스)에 따라 비오틴으로 표지하였다. 결합 반응물은 10　㎍의 핵 추출물 단백질, 버퍼, 50 ng의 폴리(dI-dC) 및 20 fM 비오틴-표지된 DNA를 함유하였다. 반응물을 20분 동안 실온에서 20　μl의 최종 부피로 인큐베이팅하였다. 100배 과량의 냉 κB를 반응 혼합물에 첨가함으로써 경쟁 반응을 수행하였다. 반응 혼합물을 5% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 0.5X　Tris-보레이트 버퍼 내에서 전기영동으로 분리하고, 나일론 막에 옮겼다. 비오틴-표지된 DNA를 LightShift 화학발광 전기영동 이동성 시프트 분석 키트(피어스)를 사용하여 검출하였다.

10. 공초점 레이저 스캐닝 현미경법

NF-κB p65의 핵 국소화를 공초점 현미경을 사용하는 간접적 면역형광 분석에 의해 검사하였다. BV2 세포를 24-웰 판 내에서 24시간 동안 커버글라스 상에 직접 배양하였다. 1　㎍/mL LPS 및/또는 200　㎍/ml 감태로 자극한 후, 세포를 PBS 중 4% 파라포름알데히드로 고정하고, PBS 중 0.2% Triton X-100으로 투과시키고, 1.5% 정상 원숭이 혈청(시그마)으로 차단하였다. NF-κB p65에 대한 폴리클로날 항체(1　㎍/웰)를 1시간 동안 적용한 후, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-컨쥬게이팅된 원숭이 항-토끼 IgG와 함께 1시간 동안 인큐베이팅하였다. PBS로 세척한 후, 커버글라스를 Fluoromount-G에 탑재하고, Zeiss LSM 510 Meta 현미경을 사용하여 형광을 가시화하였다.

11. 세포 내 반응성 산소종(ROS) 생성의 측정

ROS는 이전에 설명된 방법을 변형하여 측정하였다(Cho 외, 2000). BV2 세포를 PBS로 세척하였다. 세포 내 ROS를 측정하기 위해, 세포를 4시간 동안 37℃에서 5　μM의 2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트(DCFDA, 몰레귤러 프로브스(Molecular Probes, 미국 오레곤주 유진))를 함유하는 PBS와 함께 인큐베이팅하여 세포 내 ROS를 표지하였다. 이어서, 세포를 즉시 형광-활성화 세포 분류 (FACS)로 분석하였다(비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences, 미국 뉴저지주 루터포드)).

11. 통계학적 분석

제시된 값은 평균 ± S.E.M.을 나타낸다. 통계학적 유의성은 변량 분석에 이은 쉐페(Scheffe) 테스트에 의해 결정하였다. p　<　0.05의 값을 통계학상 유의한 것으로 간주하였다.

12. 감태 추출물을 포함하는 조성물의 구성

전술한 실험에 기초하여, 감태 추출물을 포함하는 조성물은, 신경퇴행성 질병을 치료하거나 그 증상을 완화 또는 방지하기 위해, 식품, 식품 보조제 또는 영양 보조 식품에 포함될 수 있다. 당업자는 실험의 결과를, 인간을 포함한 다른 동물에의 유효 투여량을 결정하기 위해, 전술한 세포와 동물에 사용할 수 있다. "유효량"이란, 세포에서의 생체 외 또는 동물에서의 생체 내 신경퇴행성 기전을 억제하기 위한 농도를 말한다. 예를 들면, 인체 시험 투여량은, 몸무게 또는 표면적 단위로, 세포 연구에서의 유효 투여량 또는 생체 내 유효 투여량으로부터 추정될 수 있다. 이러한 추정은 종래기술에서는 관례적이다. 감태 추출물을 포함하는 조성물은, 하나 이상의 충진제를 사용하여, 식품 보조제로 투여되도록 제제될 수 있다. 대체 방법으로, 이러한 추출물을 포함하는 조성물은, 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 운반체 또는 부형제를 사용하여, 통상의 제약으로 투여될 수 있다. 기능성 식품 조성물은, 이것으로 제한하는 것은 아니지만, (입이나 코를 통한) 흡입 또는 통기, 경구, 구강을 포함한 경로에 의해 투여되거나, 비경구적으로, 질 내에 또는 직장 내에 투여되도록 제제될 수 있다. 일 실시예인 경구 투여에서, 조성물은 음식에 직접 추가하여, 통상의 식사의 일부로서 섭취될 수 있다. 제약을 식품에 추가 또는 통합시키는 여러 가지 방법들은 당업자에게 알려져 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 결합제, 충진제, 윤활제, 붕괴제 또는 침윤제와 같은 약학적으로 허용된 부형제로 종래 수단에 의해 정제 또는 캡슐의 형태로 투여될 수 있다. 정제 또는 캡슐을 형성하는데 사용되는 특정 화합물의 예는 U.S. Pharmacopeia에 상세히 기술되어 있다. 감태 추출물을 구성하는 정제는 또한, 종래기술에 잘 알려진 방법에 의해, 코팅될 수 있다. 또한, 경구 투여를 위해, 용제가 사용될 수 있다. 용제는 용액, 시럽 또는 현탁액, 또는 사용 전 물 또는 적절한 매개체로 재생되는 건조 산물의 형태가 될 수 있다. 이러한 용제는, 현탁화제, 유화제, 비수 매개체 및 보존제와 같은 약학적으로 허용된 첨가제로 종래 수단에 의해 조제될 수 있다. 다시 말하면, 특정 첨가제는 당업자에 잘 알려져 있고, U.S. Pharmacopeia와 같은 곳에 목록화되어 있다. 일 실시예로, 경구용 약물은 지효성 활성 건강 식품 조성물을 제공하도록 제제될 수 있다. 경구 투여를 위해, 감태 추출물은 정제 또는 로젠지로 제제될 수 있다.

흡입 투여를 위해, 본 발명의 조성물은, 가압 포장 또는 적절한 분사제를 사용하는 분무기에서의 에어로졸 분무 형태로 전달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우에, 투약 단위는 측정된 투여량을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다.

비경구적으로 투여하기 위한 조성물은 덩어리로 혹은 지속적으로 주입할 수 있도록 주사 제제로 될 수 있다. 주사 제제는, 앰플과 같은 단위 투여 형태로 또는 보존제를 첨가하여 멀티 투여 단위로 조제될 수 있다. 주사를 위한 조성물은, 유성 또는 수성 매개체로 현탁액, 수용액 또는 에멀젼의 형태가 될 수 있다. 또 한, 이러한 조성물은 현탁화제, 안정제 및/또는 분산제와 같은 제제 물질을 포함할 수 있다. 또한, 주요 재료는 사용 전 적절한 매개체로 재생할 수 있는 분말 형태로 제시될 수 있다. 비경구 주사를 위한 제제를 만드는 특정한 예들은 U.S. Pharmacopeia에서 찾아볼 수 있다.

직장 내 또는 질 내 투여를 위해, 본 발명에서 사용되는 조성물은 좌약, 크림, 겔 또는 정체 관장으로 제제될 수 있다.

식이 보충제를 위해, 감태 추출물은 종래기술의 방법에 따라, 중량 기준 최대 5%까지 농도를 증가시켜 혼합될 수 있다. 동물을 위한 식이 보충제는, 이것으로 제한하는 것은 아니지만, 수용액, 분말 또는 고형 알약 형태를 포함한 다양한 형태로 조제될 수 있다. 본 발명에서, 감태 추출물은 단독으로 또는 신경퇴행성 질병의 치료 등에 영향을 미치는 것으로 알려진 다른 항산화 물질과 결합하여 투여될 수 있고, 여기서 결합 화합물 또는 추출물은 시너지 효과를 낼 수 있다.

따라서, 감태 추출물과 적어도 하나의 다른 항산화 물질로 구성되는 식이 보충제를 결합하는 식이요법은 인간을 포함한 동물에서 신경퇴행성 질병을 치료하거나 그 증상을 완화하고 방지하는 데 유용하다.

상기 물질 및 방법을 사용함에 따른 검증 결과

1. 감태는 LPS-자극된 BV2 소신경교세포에서의 NO 생산을 용량-의존 방식으로 억제한다.

LPS-자극된 BV2 소신경교세포에서 NO 생산에 관한 감태의 효과를 평가하기 위해, 배양 배지 내로 방출된 아질산염을 Griess 시약을 사용하여 측정하였다. BV2 소신경교세포를 각종 농도의 감태(0, 50, 100 또는 200　㎍/ml)로 2시간 동안 처리한 후 LPS(1　㎍/mL)를 첨가하였다. 배지 내의 아질산염 농도의 LPS-유도된 상승은 감태 용량-의존 방식으로 감소하였다(도 1). NO 검출 분석에 따르면, NO는 LPS 자극 후 24시간 동안 후에 BV2 소신경교세포에서 기초 수준의 5.1배로 유의하게 증가하였고, 이러한 증가는 감태 처리에 의해 용량-의존 방식으로 억제되었다.

NO 생산의 억제가 감태 처리에 의해 유발된 세포독성으로 인한 것일 가능성을 배제하기 위해, 24시간 동안 감태로 처리된 BV2 소신경교세포에서 MTT 분석을 수행하였다(도 2). 사용된 농도(50 내지 200 ㎍/ml)에서, 감태는 세포 생활력에 영향을 미치지 않았다. 따라서, LPS-자극된 NO 생산에 대한 감태의 억제 활성은 BV2 소신경교세포에 대한 임의의 세포독성 작용으로 인한 것이 아니었다.

2. 감태는 LPS-유도된 BV2 소신경교세포에서 PGE₂ 생산을 억제한다.

COX-2는 알츠하이머병, 부종 및 열에 관여되는 염증을 유도하는 다량의 PGE₂를 생산하는 것으로 알려져 있다(Coleman 외, 1994; Mitchell 외, 1995; Pasinetti 및 Larkin, 1995). 그러므로, 감태가 COX-2 mRNA 및 단백질뿐만 아니라 PGE₂의 수준에 대해 어떤 효과를 갖는지 조사하였다.

PGE₂는 COX-2 활성의 가장 현저한 염증 산물이기 때문에, 상등액 내의 PGE₂를 정량하였다. BV2 소신경교세포를 감태로 2시간 동안 전처리한 후, 1　㎍/mL LPS로 24시간 동안 자극하였다. 감태(50, 100 또는 200　㎍/ml) 및 LPS를 사용하여 세 포를 전처리하면 PGE₂ 생산의 유의한 용량-의존적 감소를 일으켰다(도 3). 이들 결과는 감태를 사용한 전처리가 LPS-자극된 전염증성 매개체의 발현을 유의하게 억제하는 것을 보여준다.

3. 감태는 LPS-유도된 BV2 소신경교세포에서 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제한다.

감태가 LPS-유도된 NO 및 PGE₂ 생산을 감소시키는 기전을 결정하기 위해, iNOS 또는 COX-2의 LPS-유도된 생산에 영향을 미치는 감태(50, 100 또는 200　㎍/ml)의 능력을 연구하였다. 웨스턴 블롯 분석에 의해 나타난 바와 같이, LPS 처리는 iNOS 및 COX-2의 발현을 유의하게 증가시켰다. 그러나, 상기 발현은 감태로 전처리한 BV2 소신경교세포에서 현저하게 약화되었다(도 4). 웨스턴 블롯은 1　㎍/mL LPS와 함께 24시간 동안 인큐베이팅한 후 BV2 소신경교세포에서 iNOS 및 COX-2 단백질의 유도를 보여주었다(도 4A). 상기 유도는 감태에 의해 농도-의존 방식으로 억제되었다. RT-PCR 분석은 또한 iNOS 및 COX-2 mRNA 수준이 상응하는 단백질의 수준과 상호관련됨을 보여주었다(도 4B). 이들 발견은 감태를 사용한 처리가 전사 억제를 통해 iNOS 및 COX-2의 LPS-자극된 유도를 유의하게 억제하였음을 나타낸다.

4. 감태는 LPS-유도된 BV2 소신경교세포에서 TNF-α 및 IL-1β 생산을 약화시킨다.

본 발명자들은 다음으로 전염증성 시토킨 TNF-α 및 IL-1β의 생산에 대한 감태의 잠재적인 효과를 평가하려고 시도하였다. BV2 세포를 LPS(1　㎍/mL)의 존재 또는 부재 하에 감태(50, 100 또는 200　㎍/ml)와 함께 24시간 동안 인큐베이팅하고, ELISA를 이용하여 배양 배지 내에서 TNF-α 및 IL-1β 수준을 측정하였다. 두 시토킨의 수준은 LPS-자극된 BV2 소신경교세포의 배양 배지에서 증가하였고, 이들 증가는 감태로 처리함으로써 농도-의존 방식으로 유의하게 감소하였다(도 5A). 평행 실험에서, 감태가 이들 시토킨의 발현을 전사 수준에서 억제하는지 결정하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. BV2 소신경교세포를 상이한 농도의 감태로 2시간 동안 처리한 후 LPS 처리하면 IL-1β 및 TNF-α를 인코딩하는 mRNA의 용량-의존적 감소가 발생되었다(도 5B). 이들 결과는 감태가 주로 전사 수준에서 전염증성 시토킨의 축적을 방지함으로써 작용함을 나타낸다.

5. 감태는 LPS-유도된 BV2 소신경교세포에서 LPS-자극된 NF-κB 활성화를 억제한다.

NF-κB의 활성화는 iNOS, COX-2 유전자 및 시토킨의 유도를 위해 필요하다. 본 발명자들은 다음으로 LPS에 반응하는 BV2 소신경교세포에서의 NF-κB의 활성화를 검사하였다(도 6). NF-κB는 LPS에 의해 활성화되면 핵으로 들어가 유전자 발현을 유도하는 것으로 알려져 있다. 헤테로머성(heteromeric) NF-κB 복합체는 세포질 내에서 억제성 IκB-유사 단백질과 복합체화된 불활성 전구체로서 격리되고, LPS는 핵 p65 단백질의 수준을 증가시킴으로써 NF-κB 활성화를 유도하고, 이는 감소된 수준의 세포질 IκB-α 단백질과 연관된다. LPS 처리는 전기영동 이동성 시프트 분석을 이용하여 측정할 때 NF-κB의 DNA-결합 활성의 유의한 증가를 일으켰다(도 6A). 이와 반대로, 감태 처리는 LPS에 의한 NF-κB의 유도된 DNA-결합 활성 을 유의하게 억제하였다.

본 발명자들은 LPS-유도된 NF-κB p65 핵 전위에 대한 감태의 효과를 또한 조사하였다. 유의한 수준의 NF-κB p65가 LPS 처리 15분 후 핵에 국소화되었다(도 6B). p65 단백질의 수준은 LPS 및 감태 모두에 노출된 세포의 핵에서 감소하였고, 이는 감태가 p65 단백질의 핵 전위를 억제하는 것을 나타낸다. 감태에 의한 NF-κB DNA 결합의 억제가 I-κBα 분해와 관련되는지 결정하기 위해, I-κBα의 세포질 수준을 웨스턴 블롯 분석에 의해 검사하였다. 감태로 BV2 소신경교세포를 전처리하면 LPS-유도된 I-κBα 분해를 차단하였다. 이는 감태가 NF-κB의 활성화를 억제한다는 증거가 된다.

NF-κB p65 핵 전위에 대한 감태의 영향을 명확하게 이해하기 위해, BV2 소신경교세포에서 NF-κB p65 핵 시프트를 공초점 현미경을 사용하여 분석하였다(도 6C). 공초점 영상은 NF-κB p65가 세포질 컴파트먼트에서 정상적으로 격리되고(도 6C, 중간 패널), LPS로 자극한 후 BV2 소신경교세포에서 NF-κB p65의 강한 핵 축적이 유도되었음을 보여주었다(도 6C, LPS 패널). NF-κB p65의 LPS-유도된 전위는 감태를 사용한 전처리에 의해 완전히 없어졌다(도 6C, LPS + EC 패널). NF-κB p65의 전위는 LPS 자극의 부재 하에 감태 단독으로 전처리한 후 세포에서 유도되지 않았다(도 6C, EC 패널). 이들 결과는 감태가 NF-κB p65의 전위를 억제함을 보여준다. 함께 살펴보면, 이들 결과는 감태에 의한 NF-κB 활성화의 억제가 BV2 소신경교세포에서 NO, PGE₂ 및 전염증성 시토킨의 감태-매개된 억제를 담당하는 기전임 을 제안한다.

6. 감태는 LPS-유도된 BV2 소신경교세포에서 LPS-유도된 ROS 생산을 감소시킨다.

NF-κB 활성화에 대한 감태의 억제 효과를 담당하는 기전을 평가하기 위해, BV2 소신경교세포에서 ROS의 LPS-유도된 생산에 대한 감태의 효과를 검사하였다. ROS는 NF-κB의 활성화에 관여되는 것으로 보고되었다(Gloire 외, 2006). 세포를 감태(50, 100 또는 200　㎍/ml)와 함께 LPS(1 ㎍/ml)의 존재 또는 부재 하에 24시간 동안 인큐베이팅하였다. 도 7에 나타난 바와 같이, LPS-자극된 BV2 소신경교세포는 증가된 ROS 생산을 보였다. 이와 반대로, 감태로 세포를 전처리하면 LPS의 존재 하에 ROS 생산에 있어서 유의한 감소를 유발하였다.

7. 감태는 BV2 소신경교세포에서 MAPK의 LPS-자극된 인산화를 억제한다.

LPS에 의한 자극에 반응하여 BV2 소신경교세포에서 iNOS 및 COX-2 유전자의 발현을 유도하는 신호전달 캐스케이드를 해명하기 위해 후속 실험을 설계하였다. MAP 키나제가 세포 성장 및 분화의 조절에서 및 시토킨 및 스트레스에 대한 세포 반응의 제어뿐만 아니라 NF-κB의 활성화에서도 핵심 역할을 한다는 증거가 있다. 더구나, MAP 키나제는 iNOS 및 COX-2 발현에서 중요한 것으로 알려져 있다.

감태에 의한 NF-κB 활성화의 억제가 MAP 키나제 경로를 통해 매개되었는지 조사하기 위해, BV2 소신경교세포에서 ERK-1/2, p38 및 JNK/SAPK의 LPS-유도된 인산화에 대한 감태의 효과를 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 검사하였다(도 8). 본 발명자들은 이들 단백질이 LPS 자극 후 인산화되는 것을 보였다. 따라서, ERK- 1/2, p38 및 JNK/SAPK MAP 키나제의 LPS-유도된 활성화에 대한 감태의 효과를 검사하였다. 감태(200　㎍/ml)는 p38, ERK-1/2 및 JNK/SAPK MAP 키나제 활성화를 현저하게 억제하였다. 비-인산화된 p38, ERK-1/2 및 JNK/SAPK의 양은 LPS 또는 감태 처리에 의해 영향을 받지 않았다. 그러므로, MAP 키나제 경로는 iNOS 및 COX-2의 LPS-매개된 발현에서 중요한 것으로 보인다. 이들 결과는 ERK-1/2, JNK/SAPK 및 p38 MAPK의 인산화가 BV2 소신경교세포에서 LPS-유도된 NF-κB 결합에 대한 감태의 억제 효과에 관여하는 것을 암시한다.

본 발명은 LPS로 자극된 쥐 대식세포 BV2 소신경교세포에서의 염증성 매개체의 생산에 대한 감태의 약물학적 및 생물학적 효과를 검사함으로써 이루어졌다. 소신경교세포에서 감태 활성의 분자 기전을 더욱 이해하기 위해, NO 및 PGE₂의 생산, iNOS, COX-2 및 시토킨(TNF-α, IL-1β)의 발현 수준, MAPK의 활성화, 및 전사 인자 NF-κB의 활성화에 대한 감태의 효과를 조사하였다. 본 발명에 따르면, 감태가 BV2 소신경교세포에서 NF-κB 및 MAPK 경로의 차단을 통해 TNF-α, IL-1β, NO 및 PGE₂의 LPS-유도된 생산을 효과적으로 억제하는 것을 알 수 있다. 또한, 감태를 사용한 처리는 LPS-자극된 BV2 소신경교세포에서 유의한 세포독성을 유발하지 않았다. 염증성 매개체 발현에 대한 감태의 억제 효과는 그 소염 작용 및 LPS-자극된 뇌 손상을 치료하기 위한 치료제로서의 가능성에 관한 하나의 기전을 제시한다.

시토킨(예를 들어 TNF-α 및 IL-1β)의 생산 또는 기능의 이상은 많은 염증 병변에서 기능하는 것으로 보고되어 있다(De Nardin, 2001). 시토킨은 많은 상이한 신경병리학적 자극 이후에 뇌에서 방출된다. 활성화된 소신경교세포는 시토킨, 예를 들어 IL-1β 및 TNF-α의 방출을 통해 염증-매개 조직 파괴에 이차적으로 기여한다. TNF-α는 주로 단핵세포, 대식세포 및 T 세포에 의해 생산되고, 선천 면역 반응에서 역할을 할 수 있다. 따라서, 이는 대식세포의 강력한 활성화인자이고, IL-6, IL-1β, PGE₂, 콜라게나제 및 어드헤신 분자의 생산 또는 발현을 자극할 수 있다. TNF-α는 많은 신경학적 병태, 신경아교증, 대뇌 부종의 발병기전 및 아밀로이드 신경독성의 악화에 관련되어 있다(Arvin 외, 1995; Selmaj 및 Raine, 1988; Shohami 외, 1993). IL-1 유전자는 임상 알츠하이머병의 발병 위험의 증가와 연관되고(Licastro 외, 2000), 알츠하이머병 뇌로부터 활성화된 별아교세포에서 과다 발현된다(Griffin 외, 1989). CNS 손상 이후, IL-1은 활성화된 소신경교세포로부터 신속하게 방출된다. 따라서, 시토킨 생산 또는 기능의 억제가 염증 제어에서 핵심 기전이다. 본 발명에서, 감태가 LPS에 의해 자극된 BV2 소신경교세포에서 전염증성 시토킨 TNF-α 및 IL-1β의 생산을 유의하게 억제함이 밝혀졌다. 이는 감태가 잠재적으로 유용한 소염 활성을 갖는다는 증거가 된다.

NF-κB는 면역 및 염증 반응에 관여되는 각종 유전자의 다면 발현 조절 인자이다. NF-κB 활성화는 iNOS, COX-2 및 각종 시토킨의 생산에 관여하는 몇몇 세포 신호 전달 경로를 활성화하는 핵심 전사 인자인 것으로 나타났다(Baeuerle 및 Henkel, 1994; Baldwin, 1994). iNOS 및 COX-2를 인코딩하는 쥐 유전자의 프로모 터 구역은 NF-κB 결합 모티프를 함유한다. iNOS 및 COX-2 프로모터의 상류의 NF-κB 부위에 대한 NF-κB의 결합이 iNOS 및 COX-2 유전자의 LPS-유도된 상향 조절에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다(Lee 외, 2003). 이들 전염증성 매개체의 발현은 NF-κB에 의해 조정되기 때문에, 본 발명은 감태 처리가 BV2 소신경교세포에서 IκB의 분해 및 NF-κB의 활성화를 차단하는 것을 나타낸다. 본 발명에 따르면, NF-κB의 LPS-매개된 활성화의 억제에 기반한 감태에 의해 매개된 새로운 소염 기전이 설명된다.

몇몇 천연 항산화 화합물은 NF-κB-의존 시토킨 iNOS 및 COX-2의 발현을 직접 억제하여 염증을 감소시키고(Ma 외, 2003; Surh 외, 2001), NF-κB 복합체의 활성화는 세포성 산화환원 상태와 관련되는 것으로 나타났다(Hirota 외, 1999). 연관된 염증성 매개체의 생산에 대한 이들 항산화 화합물의 억제 효과는 그들의 항산화 활성과 연관된다. 항산화성 NF-κB 억제 인자는 상응하는 유전자의 발현을 억제함으로써 염증성 매개체의 생산을 제한하고, 또한 염증성 질병을 예방한다. 또한, 세포 내 ROS의 변화는 신호 전달 경로를 조절할 수 있어서, NF-κB 활성의 조정을 일으킨다. ROS는 신경염증 및 신경퇴행 과정과 연관되어 있다(Brown 및 Bal-Price, 2003; Floyd, 1999). 최근에, 감태는 항산화 및 소염 활성을 나타내는 것으로 보고되어 있다(Shin 외, 2006). 그러나, LPS-자극된 소신경교세포에서 감태 작용의 생물학적 활성 및 분자 기전은 아직 보여지지 않았다. 본 발명에서는 감태가 BV2 소신경교세포에서 세포 내 라디칼 소거 활성을 갖는다는 것을 입증하였고, 이는 NF-κB 활성화에 대한 감태의 억제 효과를 시사한다. 그러므로, 감태에 의한 ROS 생성의 잠재적인 억제는 NF-κB-의존 시토킨 및 iNOS 및 COX-2 발현의 억제와 일치하며 따라서 염증을 감소시킨다.

각종 세포 내 신호 전달 경로가 NF-κB 활성 및 염증성 시토킨 발현의 조정에 관여한다. MAPK는 염증 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 보이는 일군의 신호전달 분자이다. LPS는 MAPK 신호전달 경로를 통해 iNOS 및 COX-2 발현을 조절한다. 따라서, LPS 처리는 p38, ERK-1/2 및 JNK의 인산화를 일으켜, 소신경교세포에서 NF-κB 활성화를 일으킨다(Hou 외, 2006; Kim 외, 2006; Moon 외, 2007). 또한, MAPK의 활성화는 NF-κB의 활성화의 제어를 통해 iNOS 및 COX-2 발현의 조절에서 중요한 것으로 입증되었다 (Pergola 외, 2006; Suh 외, 2006). 따라서, 본 발명자들은 BV2 소신경교세포에서 MAPK의 LPS-자극된 인산화에 대한 감태의 효과를 조사하였다. 본 발명은 감태가 BV2 소신경교세포에서 LPS 자극에 의해 유도된 MAPK, 예를 들어 ERK, p38 및 JNK의 강력한 억제 인자임을 나타낸다. 이들 결과는 MAPK가 LPS-유도된 iNOS 및 COX-2 발현, 및 NF-κB 활성화에 대한 감태의 억제 효과에 관여함을 제안한다.

요약하면, 본 발명자들은 BV2 소신경교세포를 감태로 처리하면 LPS 자극 이후 전염증성 매개체의 수준을 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 감태는 NO, PGE₂, TNF-α 및 IL-1β의 방출을 농도-의존 방식으로 유의하게 억제하여, 전사 수준에서 작용하였다. 감태의 소염 특성은 MAPK, NF-κB의 하향조절 및 ROS 축적의 억제에 의해 매개되었다. 따라서, 본 발명자들은 감태는 잠재적인 소염 활성 및 신경퇴행 질병의 치료를 위한 유익한 특징을 갖는 것으로 정리하였다.

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도 1은 BV2 소신경교세포에서 LPS-유도된 NO 생산에 대한 감태의 효과를 나타내는 도면이다. BV2 세포를 표시된 농도의 감태로 2시간 동안 전처리한 후, LPS(1 ㎍/ml)와 함께 24시간 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 배양 상등액을 단리하고 아질산염 생산에 대해 분석하였다. 각각의 값은 3회의 독립 실험으로부터의 평균 ± S.E.M.을 나타낸다. ^*는 감태의 부재 하에 LPS로 처리한 세포에 비해 유의한 차이(p<0.05)를 나타낸다.

도 2는 BV2 소신경교세포의 생활력에 대한 감태의 효과를 나타내는 도면이다. 세포를 표시된 농도의 감태(50, 100 또는 200 ㎍/ml)로 2시간 동안 처리한 후, 24시간 동안 LPS(1　㎍/ml)로 처리하였다. 세포 생활력을 MTT 환원 분석을 이용하여 평가하였고, 생존 세포 값을 대조군 처리된 세포(감태를 첨가하지 않음)의 퍼센트로서 표현한다. 각각의 값은 3회의 독립 실험으로부터의 평균 ± S.E.M.을 나타낸다.

도 3은 BV2 소신경교세포에서 LPS-유도된 PGE₂ 생산에 대한 감태의 효과를 나타내는 도면이다. BV2 세포를 감태(50, 100 또는 200 ㎍/ml)와 함께 LPS(1 ㎍/ml)의 존재 또는 부재 하에 24시간 동안 인큐베이팅하였다. PGE₂ 농도를 배양 배지 내에서 시판 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다. 각각의 값은 3회의 독립 실험으로부터의 평균 ± S.E.M.을 나타낸다. ^*은 감태의 부재 하에 LPS로 처리한 세포 에 비해 유의한 차이(p<0.05)를 나타낸다.

도 4는 BV2 소신경교세포에서 감태에 의한 LPS-유도된 iNOS 및 COX-2 단백질(A) 및 mRNA(B) 발현의 억제를 나타내는 도면이다. (A) BV2 세포(5×10⁵ 세포/ml)를 표시된 농도의 감태(50, 100 또는 200 ㎍/ml)와 함께 2시간 동안 인큐베이팅한 후 LPS(1　㎍/ml)로 24시간 동안 처리하였다. 세포 용해물을 전기영동하고, iNOS 및 COX-2의 발현 수준을 특이적 항체를 사용하여 검출하였다. (B) 6시간 동안 LPS 처리한 후, 총 RNA를 BV2 소신경교세포로부터 제조하고, RT-PCR을 iNOS 및 COX-2 유전자에 대해 수행하였다. β-액틴 및 GAPDH를 각각 웨스턴 블롯 분석 및 RT-PCR 분석에 대한 내부 대조물로서 사용하였다. 이 실험을 세번 수행하였고, 유사한 결과를 얻었다.

도 5는 BV2 소신경교세포에서 LPS-유도된 TNF-α 및 IL-1β생산에 대한 감태의 효과를 나타내는 도면이다. BV2 세포를 감태(50, 100 또는 200 ㎍/ml)와 함께 2시간 동안 인큐베이팅한 후 LPS(1 ㎍/ml)로 처리하고, 총 RNA 및 상등액을 각각 LPS 처리 후 3시간 및 24시간에서 단리하였다. TNF-α 및 IL-1β의 세포외 수준을 배양 배지 내에서 시판 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다(A). 3시간 동안 인큐베이팅한 후, TNF-α 및 IL-1β mRNA의 수준을 RT-PCR에 의해 결정하였다(B). 각각의 값은 3회의 독립 실험으로부터의 평균 ± S.E.M.을 나타낸다. ^*는 감태의 부재 하에 LPS로 처리한 세포에 비해 유의한 차이(p<0.05)를 나타낸다.

도 6은 LPS-자극된 BV2 소신경교세포에서 NF-κB 활성에 대한 감태의 효과를 나타내는 도면이다. (A) 핵 추출물 (1 ㎍)을 제조하고, 전기영동 이동성 시프트 분석을 이용하여 NF-κB의 DNA 결합 활성에 대해 분석하였다. BV2 소신경교세포를 비히클 또는 표시된 농도의 감태로 2시간 동안 전처리한 후, LPS(1 ㎍/ml)로 추가 1시간 동안 자극하였다. 나타난 결과는 3회의 독립 실험의 대표이다. (B) 핵 단백질 추출물 내의 NF-κB의 p65 하위 단위 및 세포질 단백질 내의 I-κBα의 수준을 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정하였다. BV2 세포를 LPS(1 ㎍/ml)로 0.5시간 동안 처리하고, p65 단백질 및 I-κBα를 특이적 항체를 사용하여 검출하였다. (C) BV2 소신경교세포를 200 ㎍/ml 감태로 2시간 동안 전처리한 후, LPS(1 ㎍/ml)로 20분 동안 자극하였다. 세포 내의 p65 단백질 국소화를 항-p65 항체 및 FITC-표지된 항-토끼 IgG 항체를 사용하여 결정하고, 세포를 레이저 공초점 스캐닝 현미경을 사용하여 가시화하였다. 3 내지 5회의 독립 실험의 대표 실험을 도시한다.

도 7은 BV2 소신경교세포에서 LPS-유도된 ROS 생산에 대한 감태의 효과를 나타내는 도면이다. BV2 세포를 표시된 농도의 감태(50, 100 또는 200 ㎍/ml)로 2시간 동안 전처리한 후 24시간 동안 LPS(1 ㎍/ml)로 처리하였다. 세포를 재현탁시키고, 유동세포측정법을 이용하여 평균 형광 강도(MFI)를 측정하였다. 각각의 값은 3회의 독립 실험의 결과를 나타낸다.

도 8은 BV2 소신경교세포에서 ERK-1/2, SAPK/JNK 및 p38 MAP 키나제의 LPS-유도된 인산화에 대한 감태의 효과를 나타내는 도면이다. BV2 세포를 비히클 또는 표시된 농도의 감태(50, 100 또는 200 ㎍/ml)로 2시간 동안 처리한 후, LPS(1 ㎍/ml)와 함께 인큐베이팅하였다. 이어서, 세포 용해물을 제조하고, ERK-1/2, SAPK/JNK 및 p38의 인산화된 형태에 특이적인 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅하였다. 결과는 3회의 독립 실험을 나타낸다.

Claims (9)

1. 동물에서의 신경퇴행성 질병을 치료하거나 그 증상을 완화 또는 방지하는 데에 효과적인 양의 감태 추출물을 포함하는 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 감태 추출물은, 감태를 감압 하에 동결 건조하여 균질화하고 에탄올을 포함한 유기 용제에 침지하며 진공 증착함으로써, 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 생리학적으로 허용되는 운반체 또는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 경구용 조성물인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 음식을 통해 상기 동물에게 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 기능성 식품인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 식이 보충물인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 캡슐, 정제, 로렌지 또는 코팅된 정제의 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 용액, 시럽 또는 현탁액의 형태인 것을 특징으로 하는 방법.

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