KR20100062453A

KR20100062453A - 클로로겐산의 녹색 현상을 이용한 클로로겐산의 함량 측정 방법

Info

Publication number: KR20100062453A
Application number: KR1020080121095A
Authority: KR
Inventors: 전효곤; 정동민
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2008-12-02
Filing date: 2008-12-02
Publication date: 2010-06-10

Abstract

본 발명은 클로로겐산(Chlorogenic acid)의 녹색 현상을 이용한 클로로겐산 함량 측정 방법에 관한 것으로, 구체적으로 클로로겐산은 알칼리성이고 글라이신(glycine)이 있는 조건에서 녹색 색깔을 형성하는 사실을 근거로 96 웰 플레이트(well plate)를 이용하여 녹색 파장에서 흡광도를 측정함으로써 클로로겐산의 함량을 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 클로로겐산의 함량 측정 방법은 의약제, 향미제, 건강보조식품, 음료 또는 식품제조 등에 이용되는 클로로겐산의 함량을 측정할 뿐만 아니라, 종래의 이용되고 있는 HPLC 방법보다도 간편하고, 저가의 비용과 빠른 시간으로 많은 시료를 대량으로 측정할 수 있으므로 유용하게 사용될 수 있다.

클로로겐산, 녹색 색소, 아미노산, pH, 96 웰 플레이트(well plate).

Description

클로로겐산의 녹색 현상을 이용한 클로로겐산의 함량 측정 방법{A Method for measuring amount of Chlorogenic acid using Chlorogenic acid＇s Green phenomenon}

본 발명은 클로로겐산(Chlorogenic acid)의 함량 측정 방법에 관한 것으로,보다 상세하게는 클로로겐산이 알칼리성이고 글라이신(glycine)이 있는 조건에서 녹색 색깔을 형성하는 것을 이용하여 녹색 파장에서 흡광도를 측정함으로써 클로로겐산의 함량을 측정하는 방법에 관한 것이다.

클로로겐산(Chlorogenic acid)은 커피산과 퀴닌산의 에스테르 결합으로 형성된 폴리페놀 화합물의 일종이다. 그것은 주로 커피, 사과, 배, 감자, 고구마, 블루베리, 우엉 및 해바라기 등에 과량으로 함유되어 있고, 인체의 대장에서 흡수된다(Clifford, M. N., J. Sci Food Agric. 80, 1033-1043, 2001).

클로로겐산은 시험관 내(In vitro) 상에서 항산화제 속성을 가지고 있으며, 프리 라디칼 제거, 메탈 이온의 착화합화, 라디칼 및 과산화물 형성을 관여하는 효 소를 억제한다고 알려져 있다(Chen, J. H, Ho, et al., J. Agric. Food Chem. 45, 2374-2378, 1997). 또한, 클로로겐산은 한 용기 내(In situ) 상에서 음식물 부패보존제와 향미제로, 생체 내(In vivo) 상에서는 산화적인 손상을 원인으로 야기되는 암이나 심장혈관 질병을 예방할 수 있는 가능성을 가지고 있고, 건강 촉진 효능을 가지는 것으로 알려져 있다(Rice-Evans, C. A., et al., Free Radical Biol. Med. 20, 933-956, 1996). 이러한 유익한 효과들로 인하여 클로로겐산의 연구와 관심은 점점 높아지고 있는 추세이다(Mateos, R., et al., J. Agric. Food Chem. 54:8724-8732, 2006).

클로로겐산에 의한 갈변현상과 녹색현상은 오래전부터 알려져 왔고, 클로로겐산이라는 이름도 식물조직을 암모니아로 처리했을 때 클로로겐산이 녹색으로 변한다는 사실을 근거로 명명되어졌다(Politir, J., Compt. Rend., 225, 954-956, 1947).

제빵 및 튀김과 같은 음식 조제와 요리 과정에서 고구마, 우엉, 해바라기 등에서 짙은 녹색 색소가 형성되는 현상이 일어난다고 한다. 고구마의 경우, 고구마 조각을 첨가한 빵을 만든 다음 오랜 시간동안 보관을 하면 청녹색으로 변한다. 손상되거나 감염된 고구마에서도 녹색이 많이 형성되며, 특히 알칼리성인 베이킹 파우더를 첨가함으로써 녹색이 만들어지는 것을 관찰할 수 있다. 이러한 반응은 폴리페놀 옥시데아제의 효소활성으로 인해 클로로겐산과 같은 폴리페놀이 산화됨으로써 야기되는 것으로 추측되며, 아미노산이 존재하는 조건에서도 녹색현상이 야기되는 것으로 알려져 있다(Uritani, I, et al., Nippon Nogei Kagaku Kaishi, 27, 781-789, 1953). 우엉의 경우, 튀김하는 과정 중에 녹색으로 변하고, 해바라기의 경우도 단백질을 얻기 위해 알칼리 추출을 할 때 녹색반응이 일어난다고 한다. 이러한 녹색현상은 엽록체와 그 유도체를 제외한 천연 식품 시스템에서 녹색 색깔이 형성되기가 드물기 때문에 매우 흥미로운 사실로 알려지고 있다(Yabut, G., et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 65, 2121-2130, 2001).

지금까지 알려진 클로로겐산의 함량 분석 방법은 고성능 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatograph System; HPLC) 기법을 이용하고 있으며, 상기 HPLC 방법 외에는 분석 방법이 개발되지 않고 있다. 또한, 이러한 HPLC 방법은 고가의 장비와 장시간의 측정시간이 필요로 하며, 대량의 시료를 빠르게 분석하기에는 어렵다. 따라서 새로운 클로로겐산의 함량 분석 방법 구축이 필요한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 HPLC 기법과는 달리 저렴성, 단시간의 측정 및 대량 시료의 빠른 분석 등의 차별성을 고려한 클로로겐산의 함량을 측정하는 방법을 구축하기 위해 연구한 결과, 클로로겐산이 알칼리성 조건 및 글라이신이 있는 조건에서 녹색 색깔을 형성하는 것을 이용하여 클로로겐산에 알칼리성 완충용액과 글라이신 용액을 첨가하여 반응시킨 후 96 웰 플레이트(well plate)에서 655 nm 파장으로 흡광도를 측정함으로써 클로로겐산의 함량을 측정할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 클로로겐산의 녹색 현상을 이용하여 클로로겐산을 포함하는 다양한 물질들로부터 클로로겐산의 함량을 측정하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

1) 클로로겐산을 포함하는 화합물 또는 조성물을 알칼리성 조건하에서 아미노산과 반응시켜 반응물을 제조하는 단계; 및

2) 상기 반응물을 녹색 파장에서 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는, 클로로겐산의 녹색 현상을 이용한 화합물 또는 조성물 내 클로로겐산의 함량 측정 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 알칼리성 용액 및 아미노산 용액을 포함하는 클로로겐산의 함량 측정용 키트를 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) 피검 식물을 상기 키트에 처리하여 반응시키는 단계;

2) 상기 반응한 키트를 녹색파장에서 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는, 클로로겐산을 함유하는 식물의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 클로로겐산의 함량 측정 방법은 기존의 HPLC 방법으로 인한 고가의 장비, 장시간의 분석시간, 대용량 시료 분석의 불용이성과 같은 단점들을 극복할 수 있는 효과를 가진다. 특히, 본 발명의 측정방법은 클로로겐산을 포함하는 식품, 향미제, 음료, 생약제제, 건강보조식품의 제조공정에서 클로로겐산의 함량을 용이하게 측정할 수 있고, 대용량의 시료를 측정하기에 적합한 효과를 가진다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 화합물 또는 조성물은 종류에 특별한 제한은 없으며, 클로로겐산이 포함된 물질은 모두 가능하다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 알칼리성 조건은 pH 7.0 ~ 10.0인 것이 바람직하고 pH 9.5인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 아미노산은 히시티딘(hitidine), 페닐알라닌(phenylalanine), 글루탐산(glutamic acid) 및 글라이신(glycine)으로 이루어진 1차 아미노산 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하고, 글라이신이 흡광도 655 nm 파장에서 가장 높은 흡광도 수치를 가지기 때문에 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다(Uritani, I, et al., Nippon Nogei Kagaku Kaishi, 27, 781-789, 1953).

상기 반응은 반응 온도가 40 ~ 60℃인 것이 바람직하고 45 ~ 55℃인 것이 더욱 바람직하며, 반응 시간이 20분 ~ 2시간인 것이 바람직하고 30분 ~ 40분인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 녹색 파장은 643 ~ 665 nm인 것이 바람직하고, 650 ~ 660 nm인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 흡광도는 96 웰 플레이트(96-well plate)에서 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서는 알칼리성 조건과 글라이신이 있는 조건에서 클로로겐산이 녹색 색깔을 형성하는 것을 이용하여 클로로겐산의 함량을 측정하기 위해, 다양한 농도의 클로로겐산을 각각 알칼리성(pH 9.5) 완충용액과 글라이신 용액에 혼합하여 반응시킨 후 96 웰 플레이트를 이용하여 655 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 클로로겐산의 농도 및 반응시간에 따라 흡광도 수치가 증가하는 것을 확인함으로써 클로로겐산의 함량을 측정할 수 있었고, 최소 30 uM의 클로로겐산 농도까지 측정할 수 있었다(도 1 및 도 2 참조).

또한, 본 발명에서는 기존에 사용되고 있는 클로로겐산의 함량을 측정하는 방법인 HPLC 기법과 본 발명의 클로로겐산의 녹색 현상을 이용한 방법을 비교하기 위해서, 블루베리 잎에 함유하고 있는 클로로겐산의 함량을 상기 두 가지 방법으로 각각 측정하여 그 함량을 비교하였다. 그 결과, 상기 두 가지 방법으로 측정한 클로로겐산의 함량은 유사한 값으로 측정된 것을 확인함으로써 본 발명에 따른 클로로겐산의 함량 측정방법이 기존에 사용되는 HPLC 방법을 대체할 수 있음을 알 수 있었다(표 1 참조).

본 발명의 클로로겐산의 함량 측정 방법은 HPLC 방법에 비해 저가의 비용과 빠른 시간으로 많은 시료를 대량으로 측정할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 클로로겐산의 함량 측정 방법은 생체 내에서 과산화지질의 생성 억제, 콜레스테롤 생합성 억제, 항산화 작용, 항노화 작용 및 항암 작용에 이용되는 클로로겐산을 함유하는 의약제 개발에 있어서 클로로겐산의 함량을 측정하는데 유용하게 사용될 수 있다.

상기 알칼리성 용액은 NaHCO₃용액 또는 Na₂CO₃용액인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 알칼리성 용액은 pH 7.0 ~ 10.0인 것이 바람직하고, pH 9.5인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 아미노산은 히시티딘(hitidine), 페닐알라닌(phenylalanine), 글루탐산(glutamic acid) 및 글라이신(glycine)으로 이루어진 1차 아미노산 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하고, 글라이신이 흡광도 655 nm 파장에서 가장 높은 흡광도 수치를 가지기 때문에 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다

상기 키트의 기질은 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐(polyvinyl) 수지로 합성된 96 웰 플레이트(96 well plate), 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 키트는 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 키트는 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 및 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 반응에 필요한 시약은 모두 포함시킬 수 있다.

아울러, 본 발명은

1) 피검 식물을 상기 키트에 처리하여 반응시키는 단계;

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 반응은 반응 온도가 40 ~ 60℃인 것이 바람직하고 45 ~ 55℃인 것이 더욱 바람직하며, 반응 시간이 30분 ~ 40분인 것이 바람직하고 25분 ~ 35분인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 클로로겐산의 함량 측정

본 발명자들은 클로로로겐산 20 ㎕를 농도별(10, 30, 100 및 300 uM, 및 1, 3 및 10 mM)로 10 mM NaHCO₃/Na₂CO₃ 완충용액(pH 9.5) 및 10 mM 글라이신 용액(Sigma사) 180 ㎕를 혼합하여 96 웰 플레이트(well plate)에서 총량이 200 ㎕이 되도록 혼합하였다. 그런 다음 상기 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, 흡광도 655 nm 파장을 96 웰 플레이트 판독기에서 측정하였다. 상기 측정된 흡광도 수치를 클로로겐산 농도별로 반응시간 당 흡광도 수치를 그래프에 나타내었고, 50℃에서 30분 동안 반응한 흡광도의 파장값을 그래프에 나타내어 클로로겐산 녹색 현상의 정량곡선을 확인하였다.

그 결과, 도 1 및 도 2에서 보는 바와 같이 클로로겐산의 농도 및 반응시간에 따라 흡광도 수치가 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 클로로겐산의 녹색 현상을 이용하여 클로로겐산의 함량을 측정할 수 있고, 최소 30 uM의 클로로겐산 농도까지 측정할 수 있음을 알 수 있었다(도 1 및 도 2).

<실시예 2> 본 발명의 방법과 HPLC 기법의 비교

본 발명자들은 기존에 사용되고 있는 클로로겐산의 함량을 측정하는 방법인 HPLC 기법과 본 발명의 방법을 비교하기 위해서, 블루베리 잎에 함유하고 있는 클로로겐산의 함량을 HPLC 방법과 본 발명의 방법인 두 가지 방법으로 각각 측정하였다.

구체적으로, 블루베리 잎 1 g(농수산물 시장)을 메탄올 10 ml에 넣고 충분히 흔들어 준 다음, 12시간 정치시킨 후 추출하였다. 추출 과정을 3번 반복한 후, 상등액만을 여과한 다음, 회수하여 원심진공농축기(EYELA 사)에 넣고 메탄올을 제거한 다음, 메탄올 5 ml에 녹였다. 상기 메탄올로 녹인 용액을 클로로겐산의 함량을 측정하는 시료로 사용하였다. 블루베리 잎의 건조 무게량을 측정하기 위해서 블루베리 잎을 동결건조한 다음 무게를 측정하였다. 상기 건조 무게량은 블루베리 잎 1 gram 당 건조 무게량 0.89 g이었다.

HPLC는 Agilent사의 1200 series로서, 분석조건 중 칼럼은 YMC ODS-AM 칼 럼(5 um, 4.6 mm x 250 mm), 유속은 1.0 ml/min, 검출기는 DAD를 이용하여 280, 290, 323, 515 nm 파장에서 측정하였다. A 이동상 용매는 증류수(0.05% 트리 플로로 아세트산)와 B 이동상 용매는 메탄올을 사용하고, 용매 기울기는 일정한 혼합비율(A : B = 92 : 8, 70 : 30, 및 30 : 50)로 용출 시켰다. 시료 주입량은 10 ㎕로 하였다.

블루베리 잎의 클로로겐산 함량

	HPLC를 이용한 방법	본 발명을 이용한 방법
블루베리잎에 함유한 클로로겐산의 함량	12.42 mg/g (클로로겐산량/건조무게량)	12.48 mg/g (클로로겐산량/건조무게량)

그 결과, 표 1에서 보는 바와 같이 두 가지 방법으로 측정한 클로로겐산의 함량은 각각 HPLC 방법으로 측정한 경우에는 건조 무게당 12.42 mg으로 나타났고, 본 발명의 방법으로 측정한 경우에는 12.48 mg으로 나타났다. 즉, 상기 두 가지 방법으로 측정한 클로로겐산의 함량은 유사한 값으로 측정된 것을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 클로로겐산의 함량 측정방법은 기존에 사용되는 HPLC 방법을 대체할 수 있는 방법으로 이용될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 클로로겐산의 함량 측정 방법은 기존의 HPLC 방법에 비해 간편하 고 저가의 비용과 빠른 시간으로 많은 시료를 대량으로 측정할 수 있으므로 클로로겐산을 포함하는 식품, 향미제, 음료, 생약제제, 건강보조식품의 제조공정에서 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 클로로겐산 녹색 현상을 보여주기 위해, 다양한 농도별 클로로겐산을 10 mM NaHCO₃/Na₂CO₃ 완충용액(pH 9.5)과 10 mM 글라이신이 함유한 용액에서 50℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, 다양한 농도별 클로로겐산의 반응시간에 따른 655 nm 파장의 흡광도 값을 나타내는 그래프이다.

도 2는 클로로겐산 녹색 현상의 정량 곡선을 보여주기 위해, 다양한 농도별 클로로겐산을 10 mM NaHCO₃/Na₂CO₃ 완충용액(pH 9.5)과 10 mM 글라이신이 함유한 용액에서 50℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 클로로겐산의 농도에 따른 655 nm 파장의 흡광도 값을 나타내는 그래프이다.

Claims

2) 상기 반응물을 녹색 파장에서 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는, 클로로겐산의 녹색 현상을 이용한 화합물 또는 조성물 내 클로로겐산의 함량 측정 방법.

제 1항에 있어서, 단계 1)의 알칼리성 조건은 pH 7.0 ~ 10.0인 것을 특징으로 하는 클로로겐산의 함량 측정 방법.

제 1항에 있어서, 단계 1)의 아미노산은 히시티딘(hitidine), 페닐알라닌(phenylalanine), 글루탐산(glutamic acid) 및 글라이신(glycine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 클로로겐산의 함량 측정 방법.

제 1항에 있어서, 단계 1)의 아미노산은 글라이신인 것을 특징으로 하는 클로로겐산의 함량 측정 방법.

제 1항에 있어서, 단계 1)의 반응물은 온도 40 ~ 60℃에서 30분 ~ 40분 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는 클로로겐산의 함량 측정 방법.

제 1항에 있어서, 단계 2)의 녹색 파장은 643 ~ 665 nm인 것을 특징으로 하는 클로로겐산의 함량 측정 방법.

제 1항에 있어서, 단계 2)의 흡광도 측정은 96 웰 플레이트(96-well plate)에서 측정하는 것을 특징으로 하는 클로로겐산의 함량 측정 방법.

알칼리성 용액 및 아미노산 용액을 포함하는 클로로겐산의 함량 측정용 키트.

제 8항에 있어서, 상기 알칼리성 용액은 NaHCO₃용액 또는 Na₂CO₃용액인 것을 특징으로 하는 클로로겐산의 함량 측정용 키트.

제 8항에 있어서, 상기 알칼리성 용액은 pH 7.0 ~ 10.0인 것을 특징으로 하는 클로로겐산의 함량 측정용 키트.

제 8항에 있어서, 상기 아미노산은 히시티딘(hitidine), 페닐알라닌(phenylalanine), 글루탐산(glutamic acid) 및 글라이신(glycine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 클로로겐산의 함량 측정용 키트.

제 8항에 있어서, 상기 아미노산은 글라이신(glycine)인 것을 특징으로 하는 클로로겐산의 함량 측정용 키트.

제 8항에 있어서, 상기 키트의 기질은 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐(polyvinyl) 수지로 합성된 96 웰 플레이트(96 well plate), 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스로 구 성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 클로로겐산의 함량 측정용 키트.

1) 피검 식물을 제 8항의 키트에 처리하여 반응시키는 단계;

2) 상기 반응한 키트를 녹색파장에서 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는, 클로로겐산을 함유하는 식물의 스크리닝 방법.

제 14항에 있어서, 단계 1)의 반응은 온도 40 ~ 60℃에서 30분 ~ 40분 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는 클로로겐산을 함유하는 식물의 스크리닝 방법.

제 14항에 있어서, 단계 2)의 녹색 파장은 643 ~ 665 nm인 것을 특징으로 하는 클로로겐산을 함유하는 식물의 스크리닝 방법.

제 14항에 있어서, 단계 2)의 흡광도는 96 웰 플레이트(96-well plate)에서 측정하는 것을 특징으로 하는 클로로겐산을 함유하는 식물의 스크리닝 방법.