KR20100056227A - 항암제 치료약제에 대한 감수성을 일괄적으로 결정하는 방법 - Google Patents

항암제 치료약제에 대한 감수성을 일괄적으로 결정하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 한번의 검사 실시만으로, 1차 항암제 및 2차 항암제 모두에 대한 항암제 감수성을 생체와 근접한 조건에서 일괄적으로 검사하는 방법에 관한 것으로, (i) 1차 항암제 반응판 및 2차 항암제 반응판을 준비하는 단계; (ii) 피검체로부터 준비한 종양조직 시료를 상기 항암제 반응판의 1차 항암제 반응판의 반응정 및 2차 항암제 반응판의 반응정에 분주하고 배양하는 단계; (iii) 1차 항암제 반응판의 반응정 및 2차 항암제 반응판의 반응정에 1차 항암제 후보들을 처리하고 반응시키는 단계; (iv) 1차 항암제 반응판의 반응정에 처리된 1차 항암제 후보들의 감수성을 측정 및 분석하고, 2차 항암제 반응판의 반응정에는 1차 항암제와 상이한 조합의 2차 항암제 후보들을 처리하여 반응시키는 단계; 및 (v) 2차 항암제 반응판의 반응정에 처리된 2차 항암제 후보들의 감수성을 측정 및 분석하는 단계를 포함하는, 종양에 대한 1차 항암제 및 2차 항암제 감수성을 일괄적으로 검사하는 방법을 포함한다.
종양(암), 항암제, 체외 감수성검사, 일괄종양반응성분석

Description

항암제 치료약제에 대한 감수성을 일괄적으로 결정하는 방법{Integrative method for determining susceptibility of tumor to treatment with anti-tumor agents}
본 발명은 일차수술시 획득되는 피검체의 종양조직 시료에 대하여 한번의 검사 실시만으로, 1차 항암제뿐만 아니라 이에 대한 내성을 대비하여 2차 항암제까지 치료 반응성을 검사할 수 있는 체외 일괄종양반응성검사에 관한 것이다.
본 발명은 조직배양을 통해서 항암제의 반응성(Chemo-sensitivity assay on tissue culture 혹은 Histoculture drug response assay)을 분석하는 체외(in vitro) 검사방식으로써 항암제감수성검사의 분야에 관한 것으로, 이에 대한 선행특허로는 국제특허출원 PCT/US89/00371 및 PCT/US94/07476, 미국특허등록 4060081, 4345027 및 5055556 등이 있다.
기존의 방식의 항암제 반응성 검사는 종양조직 획득의 1회성인 제한을 극복하기 힘들고 체외검사의 약리학적 한계성이 있으며 임상간 무작위조절연구 (Randomized controlled trial, RCT)토대의 연관연구가 부족한 문제점이 있었다.
특히, 기존의 검사 방법은 수술에 의해 획득한 종양 조직을 이용하여 단일 항암제에 대한 원발암의 1차 약제반응 검사에 국한되었다. 실제 임상에서는 40% 이내의 환자에서만 1차 약제에 반응을 보이며 이 경우에서도 60%-90%는 1차 약제에 내성을 보인다. 그럼에도 불구하고, 기존의 검사방법으로는 특정 약제에 내성이 생기는 경우에 감수성이 있는 대체 항암제에 대한 정보를 전혀 제공받을 수 없다. 또한 체내환경과 상이한 체외 검사방식이라는 약제대사상의 약점을 극복하지 못하였다.
후루가와 등, 쿠바다 등, 씽 등의 문헌 (Furukawa et al., Clin Cancer Res 1995;1:305-311; Kubota et al., Clin Cancer Res 1995;1:1537?43; Singh et al., Head Neck 2002;24:437?42.)에서 기술한 조직배양약물반응성검사(histoculture drug response assay)는 실험기간이 짧고 생체와 유사한 세포 간 혹은 세포-기질 간 상호작용이 유지되며 생체의 종양세포구조를 유지하여 약물의 조직내 접근이 생체와 유사한 모델에 대하여 기술되어 있다. 그러나 상기 문헌들에 기재된 방법을 포함한 기존의 조직배양약물반응성방법으로는 1차 약제에 대한 감수성 검사만 가능하므로, 항암제에 대하여 내성이 생긴 경우 감수성 있는 대체 항암제의 선택이 불가능하다.
1차 수술 후에 재발한 암의 경우 약 20% 이내에서만 재수술에 의해 종양조직의 획득이 가능한 점을 감안하면 대부분의 환자에서 조직배양약물반응성검사를 재시행하기가 힘들고 재검사에 의한 경비부담이 필수적으로 동반되는 문제점이 있다.
또한, 약물배양검사에서 생체환경과 가장 근접한 환경에서 검사를 진행되는 것이 바람직하다.
상기 문제점을 보완, 해결하고자, 본 발명에서는 1차 수술시 획득되는 피검체의 종양조직 시료에 대하여 1차 항암제 뿐만 아니라, 1차 항암제에 내성을 나타낼 경우, 대체하여 사용할 수 있는 2차 항암제를, 생체 근접 조건에서 한 번에 검사하고자 하였다.
본 발명은, 환자별 맞춤 항암제치료가 가능하도록, 일괄종양반응성검사 (Integrative tumor response assay, ITRA) 방식을 적용하였다. 이를 위하여, 동일한 종양조직 시료에 대하여, (i) 1차 항암제 반응판에서는 1차 항암제 후보군에 대한 감수성 검사가 (ii) 1차 항암제에 대한 내성이 발생한 경우에 대비하여, 2차 항암제 반응판에서는 분석자가 원하는 조합으로 1차 항암제의 처리 후에 2차 항암제 후보군에 대한 감수성 검사가 동시에 이루어질 수 있는 검사 시스템을 고안하였다. 상기 검사는 혈장을 첨가한 조건에서 이루어지도록 하여, 생체 환경과 근접한 조건에서 신뢰성 높은 결과를 도출하도록 하였다.
환자의 향후 항암제 치료계획을 일괄적으로 수립하여 환자별 맞춤 치료를 가능하게 하므로, 항암제 치료효과를 배가시키고 환자의 고통과 비용을 경감할 수 있다.
본 발명은 생체 환경과 근접한 조건에서, 항암제 투여에 앞서, 높은 감수성을 가지는 1차 항암제 및 2차 항암제를 동시에 예측할 수 있는 일괄종양반응성검사 (Integrative tumor response assay, ITRA)에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 종양에 대한 1차 항암제 및 2차 항암제 감수성을 일괄적으로 검사하는 방법은 (i) 1차 항암제 반응판 및 2차 항암제 반응판을 준비하는 단계; (ii) 피검체로부터 준비한 종양조직 시료를 상기 항암제 반응판의 1차 항암제 반응정 및 2차 항암제 반응정에 분주하고 배양하는 단계; (iii) 1차 항암제 반응판의 반응정 및 2차 항암제 반응판의 반응정에 1차 항암제 후보들을 처리하고 반응시키는 단계; (iv) 1차 항암제 반응판의 반응정에 처리된 1차 항암제 후보들의 감수성을 측정 및 분석하고, 2차 항암제 반응판의 반응정에는 1차 항암제와 상이한 조합의 2차 항암제 후보들을 처리하여 반응시키는 단계; 및 (v) 2차 항암제 반응판의 반응정에 처리된 2차 항암제 후보들의 감수성을 측정 및 분석하는 단계를 포함하는, 종양에 대한 1차 항암제 및 2차 항암제 감수성을 일괄적으로 검사하는 방법을 포함한다.
동일한 암이라도 환자마다 항암제에 대한 치료 효과는 한결 같지 않다. 모든 환자(또는 암)가(이) 약물에 반응하는 것이 아니므로, 특정 항암제에 대한 반응 여부를 예측하는 것은 종양 치료에 있어서 매우 중요하다. 특히, 항암제에 대하여 내성이 발생한 경우에 대비하여 2차 항암제의 감수성까지 미리 예측하는 것은, 환자의 향후 항암제 치료계획을 일괄적으로 수립하여 환자별 맞춤 치료를 가능하게 하기 위하여 필수적으로 요구된다. 따라서, 본 발명의 방법은 항암제 투여에 앞서 항암제에 의한 치료가 효과적일 것인 지의 여부를 결정하기 위한 수단을 제공할 뿐만 아니라, 추후 항암제 내성이 발생한 경우에 대비하여 선택할 수 있는 2차 항암제에 정보도 함께 제공받을 수 있다.
본 발명의 방법으로, 항암제에 대한 감수성을 측정할 수 있는 종양 및 암의 종류는 제한되지 않는다. 예를 들어, 위암, 대장암, 간과 담도계암, 폐암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 자궁암, 뇌암, 결합조직암 등의 항암제치료가 필요한 모든 고형암 및 조직배양이 가능한 모든 비고형암(혈액암 포함)을 대상으로 한다.
본 발명의 방법으로, 치료 감수성을 측정할 수 있는 항암제는 특별히 제한되지 않는다. 현재 통상적으로 사용되고 있거나, 개발중인 항암제를 포함한다. 본 발명의 방법으로 감수성을 검사할 수 있는 항암제로는, 구체적으로 알킬레이터, 안트라사이클린, 항생제, 대사 독, 방사성핵종, 금속 독, 효소 억제제, 아로마타아제 억제제, 비포스포네이트, 시클로-옥시게나아제 억제제, 에스트로겐 수용체 조절제, 폴레이트 길항제, 무기 비산염, 미세관 억제제, 개질제, 니트로소우레아, 누클레오시드 유사체, 오르토클라제 억제제, 백금 함유 화합물, 레티노이드, 토포이소머라아제 1 억제제, 토포이소머라아제 2 억제제, 및 티로신 키나아제 억제제 등을 예로 들 수 있으나, 이들에만 제한되지 않는다.
종양조직 시료에 대하여 측정하여 얻은 값을 절대적 또는 상대적인 방법으로 비교하여 항암제에 대하여 감수성 있는 것으로 결정할 수 있다. 항암제에 대하여 "감수성"이 있다는 것은 "감수성"이 없는 것으로 결정된 항암제의 효능 가능성과 비교하여 치료적으로 효능이 있을 가능성이 보다 높음을 의미한다.
상기 본 발명의 각 단계를 상세히 살펴보면 다음과 같다.
단계 (i)은 항암제 반응판을 준비하는 단계로, 1차 항암제 후보군에 대한 감수성 측정을 위한 1차 항암제 반응판과 2차 항암제 후보군에 대한 감수성 측정을 위한 2차 항암제 반응판을 모두 포함하는 것을 특징으로 한다. 반응판의 한 예는 96정-마이크로플레이트이다.
1차 항암제 반응판과 2차 항암제 반응판은 항암제 개별 후보군에 대하여, 1 이상, 바람직하게는 4번의 독립적인 측정값을 얻을 수 있도록 배열 및 구성된다. 또한, 1차 반응판 및 2차 반응판은 대조군을 가지도록 배열 및 구성된다.
검사되는 항암제의 숫자에는 제한이 없다. 각 반응판의 수는 검사되는 항암제 후보군의 전체수와 각 후보군 당 배열되는 수에 따라 결정된다.
1차 반응판 배열의 구체적인 한 예는, 도 1의 상단 좌측 도면으로, 각 항암 제당 4번 반응하도록 한 것이다. 96반응정의 배열상 좌측으로부터 대조군, 항암제 가, 항암제 나, 항암제 다, 항암제 라의 순서로 연속적으로 개별 열(column)에 배치하는 것이다. 측정가능한 항암제의 수는 제한이 없으며, 후보군에 수에 따라 상측 4행(row)이 종료되면 하측 4행에 좌측으로부터 차례로 배치하도록 한다.
2차 반응판 배열의 구체적인 한 예는, 도 1의 상단 우측 및 하단 도면으로, 각 항암제당 4번 반응하도록 한 것이다. 예들 들어, 1차 항암제가 “항암제 가”인 경우에는 96반응정의 좌측으로부터 대조군, 1차 항암제와 상이한 조합인, 항암제 나, 항암제 다, 항암제 라를 순서대로 각각 4열씩 배치한다. 1차 항암제가 “항암제 나”인 경우에는, 대조군 및 1차 항암제와 상이한 조합인, 항암제 가, 항암제 다, 항암제 라를 순서대로 각각 4열씩 배치한다. 1차 항암제가“항암제 다”또는 “항암제 라”인 경우에 대해서도, 상기와 동일한 방법으로 1차 항암제와 상이한 조합으로 배치되도록 한다. 측정가능한 항암제의 수는 제한이 없으며, 상측 4행(row)이 종료되면 하측 4행에 좌측으로부터 차례로 배치하도록 한다.
당업자는 실험목적과 조건을 고려하여, 반응판에서의 배치 및 배열을 다양하게 조절 및 응용을 가할 수 있다.
단계 (ii)는 피검체로부터 종양조직 시료를 획득하여 상기 항암제 반응판의 1차 항암제 반응정 및 2차 항암제 반응정에 분주하고 배양하는 공정이다.
피검체의 조직, 세포, 체액 등으로부터 생물학적 종양조직 시료를 획득될 수 있다. 생물학적 종양조직 시료를 수득하는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있으 며, 종양의 유형 및 위치에 따라 방법은 달라질 수 있다. 한 가지 방법은, 외과적인 방법으로 절제된 조직으로부터 수득하는 것이다.
환자로부터 종양 조직을 적출하여 검사에 사용되는 샘플로 준비하는 공정의 한 구현 예는, 환자로부터 적출된 종양 조직을 베세틴용액 및 생리 식용수로 각 1 내지 5회 세척하는 단계; 생체내 종양 조직과 동일한 3차원 구조를 유지하도록 절단하는 단계; 상기 절단 조직을 종양 조직간에 충분한 혼합이 되도록 교반상태에서 배양하는 단계; 및 배양액으로부터 생존세포를 선별하는 단계를 포함한다. 상기 공정으로 분석에 사용되는 시료를 준비함으로써, 검사 성공률을 향상시킬 수 있다.
분석에 사용되는 시료는 지방, 혈관을 포함한 연부-결합조직 및 괴사조직이 가장 적은 종양조직을 선택하도록 한다. 분석에 필요한 시료의 양은 분석하고자 하는 항암제의 종류와 수에 의존하며, 한 항암제 당 약 1 mm3 소요된다.
단계 (iii), (iv) 및 (v)는 1차 항암제 후보 및 2차 항암제 후보들을 처리하고 항암제 감수성을 측정하는 공정이다. 본 발명의 항암제의 용매는 조직배양액에 개별항암제의 치료농도에 근거해서 혈장을 첨가해서 사용하여 생체환경과 근접한 조건에서 1차 항암제 또는 2차 항암제에 대한 감수성이 측정될 수 있도록 한 것에 특징이 있다.
검사에 사용되는 항암제 후보들은 단일제제 또는 2 성분 이상의 단일제제로 이루어진 복합제제 일 수 있다. 1차 항암제와 2차 항암제 처리 후 세포는 24-120 시간, 보다 바람직하게는 48-72 시간 배양한다. 배양 기간은 종양의 종류와 반응정에 분주된 양, 항암제의 종류 및 농도 등의 조건에 따라 달라질 수 있다.
항암제 후보들의 감수성은 세포활성의 측정하는 방법, 예들 들어, MTT, XTT, WST 또는 MTS 분석으로 측정할 수 있다.
또한, 2차 항암제 반응판에서 항암제 대조군은 1차 항암제 배양판의 해당 항암제 반응정의 흡광도 또는 2차 항암제 반응판의 해당 대조군 반응정의 흡광도를 사용하는 것을 특징으로 한다.
항암제 억제율은 하기 공식으로 계산할 수 있으며, 이로부터 항암제 감수성 유, 무를 판정할 수 있다. 예들 들어, 항암제에 대한 감수성 양성 판정은 개별 항암제의 반응농도에 대한 암조직의 감수성이 30-50% 이상이면 암조직의 감수성이 양성인 것으로 판정하나, 일괄적으로 정의되는 것이 아니라, 사용 항암제의 농도, 억제율, 종양의 종류, 및 원발 또는 재발암이라는 임상결과에 의하여 결정된다.
억제율(inhibition ratio, %) = ( 1 - T/C ) × 100
T, 항암제를 처리한 정의 조직 g당 흡광도
C, 대조정의 조직 g당 흡광도
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재료 및 방법
1-1: 분석 시료 준비
200 mg 정도의 냉동조직 검사상 확인된 종양조직을 환자로부터 무균조작 하에 적출하여 1-2% 베세틴용액(povidone iodide, 현대약품, 천안, 대한민국) 및 생리식염수로 각각 3회씩 세척 후 장관암 운반배양액[Hanks’ balanced salt solution(HBSS, Gibco, Grand Island, NY, USA), 2% 소듐 바이카보네이트, 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, Grand Island, NY, USA), 0.4% 겐타마이신(Gibco, Grand Island, NY, USA)]에 넣어 4℃ 상태로 실험실로 이송하였다. 고형암의 종류에 따라서 조직샘플의 세척이 필요하며 소화관암에서는 균주증식을 차단하기 위해 필수적이며, 소요되는 종양조직의 양은 내성약제의 일괄검사 관계로 기존기술에서 보다 2배 정도 증량되었다.
상기 조직을 세척액(phosphate buffered saline, 1% penicillin-streptomycin, 0.4% gentamycin)을 이용하여 3회 이상 세척하고, 멸균된 조직겸자와 메스를 이용하여 조직으로부터 암 조직을 제외한 모든 부위를 제거 후에, 조직을 새로운 페트리-디쉬에 옮기고 약 0.5 mm3 - 1 mm3 이하의 크기로 절단하였다. 분리된 세포가 아닌 생체내 종양조직과 동일한 3차원 구조를 유지하여 생체 내 항암제 반응성과 유사하게 유지하였다.
절단된 조직은 항균배양액[RPMI(Gibco, Grand Island, NY, USA), 2% sodium bicarbonate, 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, 0.4% gentamycin, 1% tetracyclin(Carl Roth, Karlsruhe, Germany), 10% chloramphenicol(Carl Roth, Karlsruhe, Germany)]을 사용하여 2회 세척하였다. 배양액 5 ml에 10x 테트라졸리움 염(MTS; Promega, Madison, WI, CA, USA)을 1/10을 첨가하여 조직을 37℃, CO2 배양기에서 2시간 배양하여 생존조직을 염색을 통해서 선별하였다. 배양후 생존조직만을 선별함으로써 사멸세포에 의한 오염으로 인한 부적절한 약제반응성을 차단하였다.
염색된 조직을 선별하여 페트리-디쉬로 옮긴 후 37℃, CO2 배양기에서 24시간 배양 후, 균일 크기의 탈색된 조직을 준비된 96정 반응판에 분주하였다. 배양시 교반기 작동상태에서 시행하여 절단된 조직이 충분히 섞이게 한다. 본 조작을 통해서 종양의 특성인 종양조직을 구성하는 클론의 다양성을 최소화할 수 있다. 본 실험에서는 종양조직의 정내 콜라겐 젤 상 거치를 하지 않으며 이는 그간의 결과에서 본 조작으로 항암제의 종양세포 억제에 미치는 영향이 무시할 정도를 보였음에 근거하였다.
1-2: 항암제 후보군 처리 및 분석
96정 반응판에서 1차 항암제 반응정과 2차 항암제 반응정에는 준비된 1차 항암제를 각각 처리하고(약제별 농도는 임상농도에 근접한 농도로써 분리농도는 기존 체외감수성검사에서 확인된 농도를 사용함), 대조정에서는 항암제를 처리할 때 사 용한 용매를 처리하여, 37℃ CO2 배양기에서 72시간 배양하였다. 다음 1차 항암제 반응정과 2차 항암제 반응정은 하기의 공정을 별도로 수행한다.
1차 항암제 반응정은 배양액을 버리고 새 배양액에 10x MTT(Sigma, St Louis, MO, USA)(4㎎/㎖)를 최종농도인 1x로 100㎕씩 처리한 후 2~4시간 동안 37℃ CO2 배양기에서 배양 후에 MTT 분석을 수행하였다.
2차 항암제 반응정은 2차 항암제 처리한 후에 37℃ CO2 배양기에서 48-72시간 배양한 후에 MTT 분석을 수행하였다. 2차 항암제 투여시 암세포의 증식에 관여하는 암세포의 종류, 분화도, 종양의 크기에 따라서 48-72 시간의 배양기간을 결정하였다.
상기 항암제의 배양액 용매에 환자의 혈장을 첨가하도록 한다.
MTT 처리가 끝난 배양액은 버리고 여기에 DMSO(Amresco, solon, USA) 100 μL를 넣어 1-2시간 동안 흔들어 준 후, 100 μL씩, 새로 준비된 96정 반응판에 옮겨 흡광분석기(VersaMax, Sunnyvale, CA, U.S.A.)로 570 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 하기 공식을 이용하여 흡광도로부터 억제율을 계산하였다. 각 항암제의 경계농도에 대한 암조직의 감수성이 30-50% 이상(일괄되게 정의하지 않으며 대조군의 성장과 환자의 임상적 소견에 따라 결정)이면 암조직의 감수성이 양성인 것으로 판정하였다.
억제율(inhibition ratio, %) = ( 1 - T/C ) × 100
T: 항암제를 처리한 정의 조직 g당 흡광도
C: 대조정의 조직 g당 흡광도
실시예 2: 항암제 반응성 검사
본 발명의 “일괄종양반응성검사 (Integrative tumor response assay)"를 2008년 3-8월 동안, 보조 혹은 치료 목적의 항암치료가 필요한 대장암 병기 2기에서 4기의 수술 환자로부터 획득한 대장암 조직 34 예를 대상으로 시행하였다. 실험에 사용된 대상 항암제는 대장암에서 일반적으로 사용되는 1차 약제 5-FU (중외제약, 한국) 및 카페시타빈 (capecitabine: 종근당, 한국)과 2차 약제 이리노테칸 (irinotecan: 제일제당, 한국) 및 옥살리플라틴 (oxaliplatin: 사노피, 한국)를 사용하였다.
항암제의 병용없이 단일제재로써 상기한 4가지 항암제를 1차 약제 반응정에서 기존 배양약물반응성검사 방식과 동일하게 진행하고 동시에 개별 약제와 다른 3가지 약제를 검사할 수 있는 본 발명에서 고안한 2차 반응정에서 상기 실시예 1-2에서 기술한 방식으로 처리하여 일괄종양반응성검사를 시행하였다.
1차 항암제의 억제율이 40%를 초과(감수성이 있는 약제로 판정)하는 대장암의 숫자는 옥살리플라틴에서 가장 많았으며 (34예 중 28예, 82.4%), 5-FU와 이리노테칸에서 가장 적게 나타났다 (34예 중 11예, 32.4%) (도 2). 4가지 항암제의 1차 약제로써의 억제율은 5-FU, 이리노테칸, 옥살리플라틴, 카페시타빈에서 각각 34.1%, 31.11%, 56.9%, 38.2% 이었다. 4가지 항암제를 1차 처리 후에 각각 나머지 3가지 항암제의 처리한 억제율은 옥살리플라틴에서 1차 처리 항암제와 무관하게 51.9% - 65.5%를 보여 가장 높은 억제력이 있었다 (도 3).
본 발명의 가장 큰 장점은 1차 항암제와 1차에서 내성을 보이는 적합한 2차 항암제의 선정을 치료개시 전 일괄적으로 파악할 수 있었다 (표 1). 즉, 1차 항암제의 감수성에 따라 감수성이 있는 적합한 2차 항암제 선정을 할 수 있었다.
Figure 112008079855882-PAT00001
또한, 4종의 항암제(전술한 내용과 동일함)와 3종의 병합제재(FL, 5-FU+leucovorin; FOLFIRI, FL+irinotecan; FOLFOX, FL+oxaliplatin)의 감수성 검사를 수행하였다. 다른 1차약제 반응정을 사용해서 약제용매에 환자의 혈장을 첨가하였으며 동일한 34예를 대상으로 기존 방식과 비교하였음(도 4). 단일제재에서는 두 가지의 방식 간 현저한 차이를 보이지 않았지만 5-FU+leucovorin 및 5-FU+leucovorin+oxaliplatin의 병용군에서 유의한 차이를 보였다. 한편 개인별 약제감수성에서는 두 가지방식 모두에서 매우 의미있는 상관관계를 보였으며(표 2), 기존방식의 임상결과 간 유의성을 고려하면 본 발명의 신기술인 혈장첨가 방식의 임상적용성을 확인할 수 있었으며 향후 임상시험을 통해서 본 신기술의 생체근접 모형면에서 그 우월성을 입증할 수 있었다.
Figure 112008079855882-PAT00002
일괄종양반응성검사 (Integrative tumor response assay, ITRA) 결과와 실제 임상 결과간의 유의한 상관성을 통한 임상적용성 검증은 공지된 논문을 참조하였다 (Nakada S et al., (2005) Int J Gynecol Cancer 15:445-452; Vescio RA et al., (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84:5029-5033; Kubota et al., (1995) Clin Cancer Res 1:1537-1543; Singh B et al., (2002) Head Neck 24:437-442).
본 발명은 1회의 검사만으로 개별 환자의 향후 항암제 치료 계획을 일괄적으로 수립하여 환자별 맞춤 치료를 가능하게 하는 효과적인 방법을 제공하므로, 의료 분야에서 다양한 이용을 기대할 수 있다.
도 1은 일괄종양반응성분석(Integrative tumor response assay, ITRA)용 반응판을 2개 조성함. 상단 좌측 반응판은 기존의 방식을 이용한 1차 항암제 감수성검사를 위해 조성하고 상단 우측 반응판은 본 발명에서 새롭게 고안한 것으로써 1차항암제를 반응시킨후 하단에 제시한의 방법으로 2차항암제 감수성검사를 시행하게 됨. 약제 당 4배수를 시행하여 오차를 최소화 함. “C"로 표시된 정은 1차성 항암제 처리후 2차 항암제 대신 배양액을 넣어서 배양하여 각각 해당 1차 항암제 대한 대조군으로 사용하게 된다.
도 2은 개별 1차 항암제에 대한 각각의 감수성을 나타낸다 (억제율이 40%를 초과; IR40, >40%).
도 3는 1차 항암제 억제율(약제군별 가장 좌측 막대) 및 1차 항암제 처리 후 개별 2차 항암제의 억제율(약제군별 우측 3개의 막대)을 나타낸다.
도 4는 기존 조직배양검사에서 약제용매로 사용한 배양액 군과 본 발명의 혈장 첨가군 간에 1차항암제 처리 후의 억제율의 비교한 결과이다. FL*과 FOLFOX†제재에서 양 군간 유의한 차이를 보인다(P-value, 각각 0.036, 0.013). FL, 5-FU+leucovorin; FOLFIRI, FL+irinotecan; FOLFOX, FL+oxalipaltin.

Claims (9)

  1. (i) 1차 항암제 반응판 및 2차 항암제 반응판을 준비하는 단계;
    (ii) 피검체로부터 준비한 종양조직 시료를 상기 항암제 반응판의 1차 항암제 반응정 및 2차 항암제 반응정에 분주하고 배양하는 단계;
    (iii) 1차 항암제 반응판의 반응정 및 2차 항암제 반응판의 반응정에 1차 항암제 후보들을 처리하고 반응시키는 단계;
    (iv) 1차 항암제 반응판의 반응정에 처리된 1차 항암제 후보들의 감수성을 측정 및 분석하고, 2차 항암제 반응판의 반응정에는 1차 항암제와 상이한 조합의 2차 항암제 후보들을 처리하여 반응시키는 단계; 및
    (v) 2차 항암제 반응판의 반응정에 처리된 2차 항암제 후보들의 감수성을 측정 및 분석하는 단계를 포함하는,
    종양에 대한 1차 항암제 및 2차 항암제 감수성을 일괄적으로 검사하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 1차 항암제 용매 및 2차 항암제 용매는 혈장을 포함하는 것인 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 1차 항암제 반응판 및 2차 항암제 반응판은 대조군을 가지 는 것인 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 2차 항암제 반응판에서 항암제 대조군은 1차 항암제 배양판의 해당 항암제 반응정의 흡광도 또는 2차 항암제 반응판의 해당 대조군 반응정의 흡광도를 사용하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 항암제 후보들의 감수성의 측정 및 분석은, 각 항암제 후보당 2내지 4배수로 수행하는 것인 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 1차 항암제 반응판의 배열은, 대조군을 좌측에 배열하고, 각 항암제 후보들을 연속적으로 개별 열(column)에 배치하며 상측 행(row)이 종료되면 하측 행에 좌측으로부터 차례로 배치시키는 것인 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 2차 항암제 반응판의 배열은, 대조군을 좌측에 배치하고, 1차 항암제 후보와 상이한 조합의 항암제 후보들을 연속적으로 개별 열에 배치하며 상측 행이 종료되면 하측 행에 좌측으로부터 차례로 배치시키는 것인 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 단계 (ii)에서 종양조직 시료는, 적출된 종양 조직을 베세틴용액 및 생리 식용수로 각 1 내지 5회 세척하는 단계; 생체내 종양 조직과 동일한 3차원 구조를 유지하도록 절단하는 단계; 상기 절단 조직을 교반상태에서 배양하는 단계; 및 배양액으로부터 생존세포를 선별하는 단계를 포함하는 방법으로 준비된 것인 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 단계 (iv) 및 (v)에서 항암제 후보들의 감수성은 사용 항암제의 농도, 억제율, 종양의 종류, 및 조직시료의 임상경과 (원발 또는 재발암)에 의하여 결정되는 것인 방법.
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