KR20100043252A

KR20100043252A - 비피도박테리움 롱검으로부터의 랜티바이오틱 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20100043252A
Application number: KR1020107003649A
Authority: KR
Inventors: 다니엘 제이. 오'설리반; 주훈 이
Original assignee: 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타
Priority date: 2007-07-20
Filing date: 2008-07-18
Publication date: 2010-04-28
Also published as: DK2176284T3; WO2009058440A2; JP2010534063A; US20110305763A1; US8933193B2; EP2176284B1; CA2693307A1; NZ582529A; AU2008319177B2; US20090068121A1; WO2009058440A3; US7960505B2; EP2176284A2; AU2008319177A1

Abstract

본 발명은 그람 음성 및 그람 양성 미생물을 억제하는 단리된 랜티바이오틱을 제공한다. 이러한 랜티바이오틱은 화합물의 아미노산 서열과 서열 21 또는 서열 22의 아미노산 서열의 동일성이 80％ 이상인 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 랜티바이오틱은 그람 음성 미생물의 외막을 손상시키지 않는 조건에서 그람 음성 미생물의 성장을 억제하는 특징을 갖는다. 본 발명은 또한 이러한 랜티바이오틱의 제조 및 사용 방법을 제공한다.

Description

비피도박테리움 롱검으로부터의 랜티바이오틱 및 이의 용도{LANTIBIOTICS FROM BIFIDOBACTERIUM LONGUM AND USES THEREOF}

계속 출원 데이터

본 출원은 미국 가출원 일련 번호 60/961,374 (2007년 7월 20일 출원)를 우선권으로 청구하고, 이는 거명에 의해 본원에 포함된다.

정부 기금

본 발명은 미국 에너지부(Department of Energy)에서 수여된 승인 번호 DE-FG02-98ER82577 및 DE-FG02-00ER83009 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 일부 권리를 갖는다.

인간의 장의 미생물 다양성에 관한 최근의 분자 연구는 기존에 인지된 것보다 훨씬 더 큰 다양성을 드러냈고, 인간 유기체에 대한 개별적인 군의 기여가 현재 거의 알려져 있지 않다 ([Gill et al., 2006, Science, 312:1355-1359]). 미생물들 중 수적으로 우세한 한 군인 비피도박테리아(bifidobacteria)는 모유 수유 영아의 대변에서 이들이 최우선적으로 우세한 것을 감안하여 양호한 장 건강과 관련되는 것으로 종종 제안된다 ([Yoshioka et al., 1983, Pediatrics, 72:317-321]). 이러한 현상으로 이들이 1899년에 소아과 의사인 Henri Tissier에 의해 발견되었고, 이어서 그는 이러한 박테리아를 영아 설사의 치료에 사용하였다 ([Tissier, 1906, Crit Rev Soc Biol, 60:359-361]). 비피도박테리아의 제안된 이로운 효과는 노인병 개체에서의 이러한 박테리아의 감소 및 기타 미생물 군, 가장 두드러지게는 클로스트리디아(clostridia) 및 대장균(E. coli)의 수반되는 증가에 의해 추가로 지지된다 ([Mitsuoka et al., 1973, Zentralbl Bakteriol [Orig A], 223:333-342], [Hopkins et al., 2001, Gut, 48:198-205], [Ishibashi et al., 1997, Mal J Nutr, 3:149-159]). 이로서 특히 비피도박테리아의 잠재적인 장 건강 이점을 위해 비피도박테리아를 식품 내에 포함시키는 것에 대한 관심이 세계적으로 성장하게 되었다 ([O'Sullivan, Primary Sources of Probiotic Cultures, Probiotics in food safety and human health. Ed. Goktepe et al., Boca Raton: Taylor & Francis/CRC Press, 2006:91-107]). 그러나, 비피도박테리아를 사용한 임상 급식 연구는 이러한 균주가 급식 실험 동안 대상의 대변에서 검출될 수 있지만, 연구 중단 시 급속히 손실된다는 것을 나타내어, 인간 장 환경 내에서의 경쟁에 대한 균주의 경쟁 적응도의 손실 가능성을 가리킨다 ([O'Sullivan, Primary Sources of Probiotic Cultures, Probiotics in food safety and human health. Edited by Goktepe et al., Boca Raton: Taylor & Francis/CRC Press, 2006:91-107], [Fukushima et al., 1998, Int J Food Microbiol, 42:39-44], [Su et al., 2005, FEMS Microbiol Lett, 244:99-103]). 발효 환경이 인간 결장의 완충되고 혐기성인 환경과 매우 다르기 때문에, 이는 균주의 약화로 인한 것일 수 있다.

박테리오신(bacteriocin)은 많은 유형의 박테리아에 의해 생산되는, 펩티드를 기초로 하는 항균성 화합물이고, 밀접하게 관련된 박테리아에 대해 억제성이다. 종종, 억제 스펙트럼은 생산 박테리아의 속 내이다. 랜티바이오틱(lantibiotic)은 억제 스펙트럼이 광범위하고 번역 후에 또한 변형되는 박테리오신의 한 유형이다. 구체적으로, 변형 효소는 일부 아미노산을 랜티오닌 잔기로 변형시킨다. 락트산 박테리움인 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis)의 특정 균주에 의해 생산되는 나이신(nisin)은 억제 스펙트럼이 대부분의 그람(gram) 양성 박테리아에 이르는, 현재까지 기술된 임의의 랜티바이오틱 중에서 억제 스펙트럼이 가장 광범위한 랜티바이오틱이다. 이의 넓은 스펙트럼을 고려하여, 이는 보존제 및 저장 기간 연장제로서 광범위하게 사용된다. 불행하게도, 부패 및 병원성 박테리아는 단지 그람 양성이지만은 않다. 다수의 병원체, 예컨대 대장균 및 살모넬라(Salmonella)가 그람 음성이고, 다수의 부패 박테리아, 예컨대 슈도모나스(Pseudomonas) 및 클레브시엘라(Klebsiella) 또한 그람 음성이다.

본 발명은 바이신(bisin)으로 명명된, 그람 양성 및 그람 음성 박테리아 양쪽 모두를 억제하는 비피도박테리움 롱검(bifidobacterium longum)의 프로바이오틱(probiotic) 배양물로부터의 랜티바이오틱을 제공한다. 이는 그람 양성 및 그람 음성 박테리아 양쪽 모두에 대한 천연 억제 작용이 있는 것으로 현재까지 기술된 첫번째 박테리오신이다. 따라서, 그람 음성 박테리아, 특히 슈도모나스의 효소 활성이 다수의 결함의 원인이라는 것을 고려할 때, 이는 유제품에서 효과적인 저장 기장 연장제가 될 잠재력이 있다.

랜티바이오틱을 생산할 잠재력이 본원에 기술된 비피도박테리움 롱검 균주의 게놈 서열로부터 최초로 인지되었다; 그러나, 이러한 균주에 의해 생산된 랜티바이오틱을 검출하는 것에서의 초기 시도들은 성공적이지 않았다. 랜티바이오틱이 생산되도록 하는 성장 조건을 발견하기 전에 추가적인 실험들이 요구되었다. 이어서, 생물학적 분석법이 이의 억제 스펙트럼을 테스트하기 위해 사용되었고, 그람 양성 및 그람 음성 지표물 양쪽 모두에 대한 효과적인 억제를 명확하게 나타냈다.

본 발명은 서열 21 또는 서열 22의 아미노산 서열과 80％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 생물학적 활성 화합물을 제공한다. 폴리펩티드 서열은 서열 21 또는 서열 22의 아미노산 서열의 1개 이상의 보존적 치환을 포함할 수 있다. 이 화합물은 그람 음성 미생물의 외막을 손상시키지 않는 조건에서 그람 음성 미생물의 성장을 억제하는 특징을 갖는다. 그람 음성 미생물은 대장균, 세라티아 프로테우스(Serratia proteus), 또는 살모넬라 종일 수 있다. 일부 양상에서, 이는 바람직하게는 슈도모나스 아에루기노사(P. aeruginosa)가 아니다. 화합물은 그람 양성 미생물, 예컨대 락토바실루스(Lactobacillus) 종, 락토코쿠스(Lactococcus) 종, 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 종, 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 종, 또는 바실루스(Bacillus) 종의 성장을 억제한다. 화합물은 비피도박테리움(Bifidobacterium)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명은 또한 단리된 생물학적 활성 화합물 및 식품을 갖는 조성물, 및 단리된 생물학적 활성 화합물 및 제약상 허용가능한 담체를 갖는 조성물을 포함한다.

본 발명은 또한 (a) 폴리펩티드의 아미노산 서열과 서열 21 또는 서열 22의 아미노산 서열의 동일성이 80％ 이상인 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 (b) (a)의 뉴클레오티드 서열의 완전 상보체를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 이종성 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 본 발명은 또한 단리된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터, 및 단리된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포를 제공한다.

본 발명은 그람 음성 미생물의 외막을 손상시키지 않는 조건에서 그람 음성 미생물의 성장을 억제하는, 단리된 랜티바이오틱을 추가로 제공한다. 랜티바이오틱은 화합물의 아미노산 서열과 서열 21 또는 서열 22의 아미노산 서열의 동일성이 80％ 이상인 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 그람 음성 미생물은 대장균, 세라티아 프로테우스, 또는 살모넬라 종일 수 있다. 일부 양상에서, 이는 바람직하게는 슈도모나스 아에루기노사가 아니다.

본 발명은 랜티바이오틱 및 식품을 포함하고, 상기 랜티바이오틱이 그람 음성 미생물의 외막을 손상시키지 않는 조건에서 그람 음성 미생물의 성장을 억제하는 특징을 갖는 조성물을 제공한다. 랜티바이오틱은 식품의 표면 상에, 식품 내에, 또는 식품의 표면 상과 식품 내에 조합되어 존재할 수 있다. 랜티바이오틱은 서열 21 또는 서열 22의 아미노산 서열과 80％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 그람 음성 미생물은 대장균, 세라티아 프로테우스, 또는 살모넬라 종일 수 있다.

본 발명은 랜티바이오틱 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하고, 상기 랜티바이오틱이 그람 음성 미생물의 외막을 손상시키지 않는 조건에서 그람 음성 미생물의 성장을 억제하는 특징을 포함하는 조성물을 제공한다. 랜티바이오틱은 서열 21 또는 서열 22의 아미노산 서열과 80％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 그람 음성 미생물은 대장균, 세라티아 프로테우스, 또는 살모넬라 종일 수 있다.

본 발명은 본원에 기술된 화합물을 생산하는 방법을 또한 제공한다. 이 방법은 단리된 비피도박테리움을 랜티바이오틱을 생산하는데 적절한 조건 하에 성장시키고, 상기 비피도박테리움이 랜티바이오틱을 생산하는 단계를 포함할 수 있다. 이 방법은 랜티바이오틱을 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 성장은 비피도박테리움, 바람직하게는 비피도박테리움 롱검(B. longum)을 표면 상에서 성장시키는 것을 포함할 수 있다. 본 발명은 이러한 방법에 의해 생산된 랜티바이오틱을 또한 포함한다.

랜티바이오틱의 생산 방법은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 성장시키고, 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열과 서열 21 또는 서열 22의 아미노산 서열의 동일성이 80％ 이상이며, 상기 미생물이 이러한 폴리펩티드를 생산하는데 적절한 조건 하에 성장되며, 미생물이 이러한 폴리펩티드를 생산하는 단계를 포함할 수 있다. 미생물은 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 성장은 비피도박테리움, 바람직하게는 비피도박테리움 롱검을 표면 상에서 성장시키는 것을 포함할 수 있다. 본 발명은 이러한 방법에 의해 생산된 폴리펩티드를 또한 포함한다. 이 방법은, 예를 들어, 알콜, 예컨대 메탄올을 포함하는 조성물의 추출에 의해, 폴리펩티드를 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

랜티바이오틱의 사용 방법이 본 발명에 의해 추가로 제공된다. 랜티바이오틱을 식품에 첨가하는 단계가 방법에 포함될 수 있고, 상기 랜티바이오틱은 그람 음성 미생물의 외막을 손상시키지 않는 조건에서 그람 음성 미생물의 성장을 억제하는 특징을 포함한다. 이 방법은, 예를 들어, 랜티바이오틱을 포함하는 케이싱(casing), 필름 또는 포장재의 표면을 식품과 접촉시키는 것에 의해, 식품의 표면에 랜티바이오틱을 적용하는 것을 포함할 수 있다. 첨가는 랜티바이오틱을 식품에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 랜티바이오틱은 식품 보존제로서 작용할 수 있다.

본 발명은 아미노산 서열을 갖는 생물학적 활성 화합물을 포함하고, 상기 화합물의 아미노산 서열과 서열 21 또는 서열 22의 아미노산 서열의 동일성이 80％ 이상이며, 상기 화합물이 그람 음성 미생물의 외막을 손상시키지 않는 조건에서 그람 음성 미생물의 성장을 억제하는 특징을 갖는 치아세정제(dentifrice), 예컨대 구강세정제 또는 치약(toothpaste)을 제공한다.

본 발명은 랜티바이오틱을 갖는 조성물을 동물, 예컨대 인간에게 투여하는 단계를 포함하고, 이때 대상이 랜티바이오틱에 의해 억제되는 미생물로 감염되었거나 감염될 위험이 있으며, 랜티바이오틱이 그람 음성 미생물의 외막을 손상시키지 않는 조건에서 그람 음성 미생물의 성장을 억제하는 특징을 갖는, 랜티바이오틱의 사용 방법을 또한 제공한다. 조성물은 제약상 허용가능한 담체를 포함할 수 있고, 조성물은 국소적으로 투여될 수 있다.

본 발명은 폴리펩티드의 아미노산 서열과 서열 2, 서열 4, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 또는 서열 16의 아미노산 서열의 동일성이 80％ 이상인 단리된 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 또한 제공한다. 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 또한 포함된다.

본 발명은 랜티바이오틱을 생산하는 비피도박테리움을 추가로 제공한다. 이러한 랜티바이오틱은 그람 음성 미생물의 외막을 손상시키지 않는 조건에서 그람 음성 미생물의 성장을 억제하는 특징을 갖는다. 그람 음성 미생물은 대장균, 세라티아 프로테우스, 또는 살모넬라 종일 수 있다. 비피도박테리움은, 예를 들어, 캡슐화되었거나 또는 정제 형태일 수 있고, 식품 내에 존재할 수 있다. 본 발명은 또한 그람 음성 미생물의 외막을 손상시키지 않는 조건에서 그람 음성 미생물의 성장을 억제하는 특징이 있는 랜티바이오틱을 생산할 비피도박테리움을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

용어 "및/또는"은 열거된 요소들 중 하나 또는 전부, 또는 열거된 요소들 중 임의의 2개 이상의 조합을 의미한다.

"바람직한" 및 "바람직하게"라는 단어는 특정 상황 하에 특정 이점을 제공할 수 있는 본 발명의 실시양태를 지칭한다. 그러나, 동일한 상황 또는 또다른 상황 하에 기타 실시양태들이 또한 바람직할 수 있다. 또한, 하나 이상의 바람직한 실시양태의 상술은 다른 실시양태들이 유용하지 않다는 것을 시사하지 않고, 본 발명의 범주에서 다른 실시양태들을 배제하도록 의도되지 않는다.

용어 "포함하다" 및 이의 변형에는 이러한 용어들이 상세한 설명 및 청구항에서 사용되는 경우에 제한적인 의미가 없다.

달리 구체화되지 않는 한, 단수형 관사("a", "an", "the") 및 "하나 이상"은 상호교환가능하게 사용되고, 1개 또는 1개 초과를 의미한다.

또한 본원에서, 종점에 의한 수치 범위의 상술은 이러한 범위 내에 포함되는 모든 값들을 포함한다 (예를 들어, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5 등을 포함한다).

별도의 단계들을 포함하는 본원에 개시된 임의의 방법에 대해, 단계들은 임의의 실현가능한 순서로 수행될 수 있다. 또한, 적합하다면, 2개 이상의 단계들의 임의의 조합이 동시에 수행될 수 있다.

상기의 본 발명의 개요는 본 발명의 각각의 개시된 실시양태 또는 모든 실행을 기술하도록 의도되지 않는다. 하기의 설명은 설명적인 실시양태들을 더욱 상세하게 예시한다. 본 출원 전반에 걸친 여러 곳에서, 예들의 목록을 통해 지침이 제공되고, 이러한 예들은 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 각각의 경우에, 상술된 목록은 대표적인 군으로서만 소용이 있고, 배타적인 목록으로서 해석되지 않아야 한다.

도 1. 비피도박테리움 롱검 DJO10A (A) 및 NCC2705 (B)에서의 이동성 인테그레이스 카셋트 (MIC: mobile integrase cassette)의 구성. Orf 1, 2 및 3은 3개의 인접하였지만 상이한 xerC 인테그레이스(integrase) 유전자를 지칭한다. P; 보존된 20 bp 팔린드롬 (TTAAACCGACATCGGTTTAA (서열 24)이고, MIC III에서는 11 bp 확장이 있음. IR; 96 bp의 역위 반복 (IR)

이고, MIC I 및 II에서는 3 bp 확장이 있고, MIC III에서는 5 bp 확장이 있으며, MIC 1, 2 및 3에서는 1 bp 확장이 있음. IS; 삽입 서열.
도 2. 게놈 특이 영역. (A) 비피도박테리움 롱검 DJO10A 및 NCC2705 게놈의 염기 편차 지수 (BDI) 분석. 본문에서 정의된 각각의 게놈의 특이 영역이 숫자화된다. oriC 및 terC의 위치가 녹색 화살표로 지시된다. 문자는 양쪽 게놈 내에 존재하는 정의적인 BDI 피크가 있는 영역으로부터의 예상되는 유전자 표현형을 지칭한다; a, GTPase, b, 양이온 수송 ATPase, c, DNA 분배 단백질, d, 콜로일글리신 하이드롤레이스(hydrolase), e, 글루타민 신테이스(synthase) 베타 사슬, f, 알라닐-tRNA 신쎄테이스(synthetase), g, 피루베이트 카이네이스(kinase), h, 양이온 수송 ATPase, I, 제III형 피브로넥틴, j, 아미노펩티데이스(aminopeptidase) C, k, 서브틸리신-유사 세린 프로티에이스(protease), l, 소르테이스(sortase), m, 지방산 신테이스. (B) NCC2705 내의 예상 결실 위치에 잔류하는 ushA 유전자로부터의, 녹색 막대에 의해 지시되는 361 bp DNA 잔여물의 위치를 나타내는 특이 영역 1의 구성. 하늘색의 ORF는 양쪽 게놈 간의 공통 유전자를 가리킨다. a, 이동성 인테그레이스 카셋트.
도 3. 2개의 비피도박테리움 롱검 게놈 간의 올리고당류 활용 유전자 클러스터 7의 비교. 특이 영역 10 내의 DJO10A-특이 유전자는 진회색이고, ISL3-유형 IS 요소는 흑색이며, 매칭되는 다른 유전자들은 백색이다. galA, α-갈락토시데이스(galctosidase); lacI, LacI-유형 억제인자; malEFG, ABC-유형 수송 시스템; ISL3, ISL3-유형 IS 요소; agl1, 글리코시데이스(glycosidase); ilvA, 트레오닌 디하이드라테이스(dehydratase); SIR2, NAD-의존적 단백질 디아세틸레이스(deacetylase); glyH, 글리코실 하이드롤레이스; hyp, 가설 단백질.
도 4. 균주 DJO10A 내의 특이 영역 13 내의 폴리올 대사에서 수반되는 유전자들의 구성, 및 비피도박테리움 아돌레센티스(B. adolescentis) ATCC 15703 내의 유사 영역과의 비교. 아미노산 동일성이 상동성 유전자들 간에 지시된다. 흑색으로 음영진 ORF는 특이 영역 13 및 비피도박테리움 아돌레센티스 ATCC 15703 내의 상응하는 상동체로부터의 것이다.
도 5. 선택된 박테리아의 비소 저항성. (A) 비피도박테리움 롱검 DJO10A, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 168 ([Kunst et al., 1997, Nature 1997, 390:249-256]), 박테로이데스 테타이오타미크론(Bacteroides thetaiotamicron) VPI-5482 ([Xu et al., 2003, Science 2003, 299:2074-2076]), 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis) ATCC 367 ([Makarova et al., Proc Natl Acad Sci USA 103:15611-15616]), 락토바실루스 플란타룸(L. plantarum) WCFS1 ([Kleerebezem et al., 2003, Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100:1990-1995]), 락토바실루스 존소니이(L. johnsonii) NCC 533 ([Pridmore et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA 2004, 101:2512-2517]) 및 대장균 K-12 ([Sofia et al., 1994, Nucleic Acids Res 1994, 22:2576-2586])의 완전한 게놈 서열로부터 컴파일링(compiling)된 비소 저항성 유전자 클러스터들의 유전자 구성. a, 포자형성 동안 부위-특이적 리컴비네이스 SpoIVCA에 의해 절단되는 48 kb 요소, b, 플라스미드 서열을 가리킴, arsR, 억제인자, arsA, 아비산염으로 자극된 ATPase, arsB, 아비산염 유출 펌프, arsC, 비산염 리덕테이스(reductase), arsD, 비소 샤페론, hyp, 가설 단백질. (B) 발효에 대해 개조된 비피도박테리움 아니말리스(B. animalis) 아종 락티스(lactis) 균주, 대장균 및 락토바실루스 플란타룸과 비피도박테리움 롱검 DJO10A에서의 비소 저항성 활성의 비교. c, [van Kranenburg et al., 2005, Appl Environ Microbiol 2005, 71:1223-1230]에서 제시된 데이터로부터 계산됨.
도 6. 비피도박테리움 롱검 DJO10A에 의한 랜티바이오틱 생산. (A) 비피도박테리움 롱검 DJO10A의 랜티바이오틱 코딩 특이 영역 12 및 균주 NCC2705 및 DJO10A-JH1 내의 상응하는 게놈 위치의 구성. IS30 뒤의 A 또는 B 지시어는 게놈 내의 이러한 위치에서만 발견되는 IS30 요소의 특이 클래스를 지칭한다. ' 지시어는 단편화된 IS30 요소를 가리킨다. (B) 비피도박테리움 롱검 DJO10A 및 이의 발효에 대해 개조된 단리물 DJO10A-JH1로부터의 XbaI-소화 전체 DNA의 펄스 필드 젤 전기영동 (PFGE) 분석. 백색 화살표는 균주 DJO10A-JH1에서 손실된 밴드를 가리킨다. (C) DJO10A 및 DJO10A-JH1을 지표물 박테리아로 사용한 비피도박테리움 롱검 DJO10A에 의한 랜티바이오틱 생산에 대한 생물학적 분석법.
도 7. 비피도박테리움 롱검 DJO10A의 게놈에서의 IS30 '점핑(jumping)'. (A) 비피도박테리움 롱검 DJO10A 및 실험실에서 개조된 균주 DJO10A-JH1의 게놈에서의 IS30 요소의 게놈 위치결정. 회색 화살표는 DJO10A 게놈 DNA의 직접적인 서열분석에 의해 확인된 5개의 요소를 가리킨다. 백색 화살표는 DJO10A 게놈 DNA로부터 제조된 일부 서열분석 클론에서 검출된 요소들의 위치를 가리킨다. A6 아래의 별표는 이러한 요소가 DJO10A DNA의 일부 서열분석 클론에서 손실되었음을 가리킨다. (B) 4개의 상이한 IS 요소 패밀리에 특이적인 프로브를 사용한, 왼쪽 젤에 나타난 DJO10A로부터의 NruI-소화 게놈 DNA, 및 이의 서던(Southern) 혼성화 (오른쪽 젤). (1)은 DJO10A를 지칭하고, (2)는 DJO10A-JH1을 지칭한다. 화살표들은 (A)에 도해된 바와 같은 특이적 IS30 요소들에 상응하는 DJO10A에서의 밴드를 가리킨다.
도 8. 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile) 및 대장균에 대한, 비피도박테리움 롱검 DJO10A 및 이의 시험관내 개조 유도체인 균주 DJO10A-JH1의 모의 대변 경쟁 분석. (A) 경쟁 연구 시작 시 (흑색), 비피도박테리움 롱검 DJO10A-JH1과의 경쟁 후 (수평선) 및 비피도박테리움 롱검 DJO10A과의 경쟁 후 (빗금)의 대장균 DJOec1의 생균수. (B) 경쟁 연구 시작 시 (흑색), 비피도박테리움 롱검 DJO10A-JH1과의 경쟁 후 (수평선) 및 비피도박테리움 롱검 DJO10A과의 경쟁 후 (빗금)의 클로스트리디움 디피실레 DJOcd1의 생균수. N = 3.
도 9. oriC 영역의 보존된 구조. 이는 2개의 비피도박테리움 롱검 게놈에서 3개의 클러스터로 구성된다. DnaA 상자는 하기와 같이 A-G로 지정된 7개의 유형으로 구성된다: 유형 A (TTATCCACA), 유형 B (TTGTCCACA), 유형 C (TTTTCCACA), 유형 D (TTACCCACA), 유형 E (TTATCCACC), 유형 F (TTATTCACA), 유형 G (TTATGCACA).
도 10. 비피도박테리움 롱검 게놈에 의해 코딩되는 제I형 및 제II형 제한 변형 (R-M) 시스템. (A) 비피도박테리움 롱검 DJO10과 NCC2705 간의 제I형 R-M 시스템을 코딩하는 게놈 위치의 정렬. (B) Sau3AI-제II형 R-M 시스템 (인식 부위, 5'-GATC-3')과 다른 박테리아 내의 유사한 R-M 시스템의 비교 및 (C) EcoRII-제II형 R-M 시스템 (인식 부위, 5'-CCWGG-3')과 다른 박테리아 내의 유사한 R-M 시스템의 비교. 비피도박테리움 롱검 DJO10A에 비교된 단백질 서열 동일성 백분율이 지시된다.
도 11. 11개의 상이한 유형의 올리고당류 활용 유전자 클러스터 (DJO10A 내의 11개 및 NCC2705 내의 7개)의 구성. 균주 DJO10A의 특이 유전자들이 지시된다. IS, 삽입 서열; Hyp, 가설 단백질; Arab, 아라비노시데이스(arabinosidase); E, malE; F, malF; G, malG; R, lacI-유형 억제인자; K, ABC 수송체의 ATPase; αGal, α-갈락토시데이스; βXyl, β-자일로시데이스(xylosidase); Est, 에스터레이스(esterase); LCFACS, 장쇄 지방산 아세틸 CoA 신쎄테이스; f, 단편화된 유전자; XylT, D-자일로스 양자 공동수송체(symporter); βGal, β-갈락토시데이스; Arab-βGal, 아라비노갈락탄 엔도-1,4-β-갈락토시데이스; O157, 대장균 O157에서만 상동체가 있는 ORF; αMan, α-만노시데이스(mannosidase); GlycH, 글리코실 하이드롤레이스; NAc-Glc, N-아세틸 글루코사미니데이스(glucosaminidase); UhpB, 히스티딘 카이네이스; RfbA, dTDP-글루코스 파이로포스포릴레이스(pyrophosphorylase); RfbB, dTDP-D-글루코스 4,6-디하이드라테이스; RfbC, dTDP-4-데하이드로람노스 3,5-에피머레이스(epimerase); RgpF, 지질다당류 생합성 단백질; TagG, ABC-유형 다당류/폴리올 포스페이트 외수송 시스템, 퍼미에이스(permease) 성분; TagH, ABC-유형 다당류/폴리올 포스페이트 수송 시스템, ATPase 성분; MdoB, 포스포글리세롤 트랜스퍼레이스(transferase); ProP, 퍼미에이스; Acyl-Est, 아실 에스터레이스. 클러스터 7 내의 글리코실 하이드롤레이스 유전자가 NCC2705 게놈 주석에서 이소말테이스(isomaltase)로 주석이 달렸음을 유념하여야 한다.
도 12. dN:dS 비율에 따른 비피도박테리움 롱검 DJO10A와 NCC2705 간의 모든 유전자 상동체의 뉴클레오티드 치환 분석.
도 13. 비피도박테리움 롱검 DJO10A 내의 4개의 예상되는 LPXTG-유형의 세포 표면 고정 단백질의 구성. 신호 펩티드 상자 아래의 숫자는 신호 펩티드의 위치를 가리킨다. 각각의 단백질의 크기가 아미노산으로 지시된다.
도 14. 비피도박테리움 롱검 DJO10A-JH1로부터의 랜티바이오틱 유전자 클러스터의 손실. (A) PCR에 의한 비피도박테리움 롱검 DJO10A 및 이의 발효에 대해 개조된 단리물 DJO10A-JH1 내의 DJO10A 특이적 유전자 클러스터의 검출. M, 1 kb DNA 래더(ladder) (Invitrogen); 레인 1, 특이 영역 15; 레인 2, 특이 영역 6; 레인 3, 특이 영역 9; 레인 4, 특이 영역 11; 레인 5, 특이 영역 5; 레인 6, 특이 영역 7; 레인 7, 특이 영역 12; 레인 8, 16S rRNA 부분 유전자. 화살표는 균주 DJO10A-JH1에서 손실된, 랜티바이오틱이 코딩된 특이 영역 12를 가리킨다. (B) lanM 프로브 및 비피도박테리움 롱검 균주 DJO10A 및 DJO10A-JH1의 EcoRI-소화 게놈을 사용한 서던 블롯 분석. lanM을 함유하는 1.7 kb EcoRI 밴드가 화살표로 지시된다.
도 15. 대변 경쟁 성장 실험에서 사용된 4개의 박테리아의 RCM 배지에서의 성장 곡선. 모든 박테리아가 신선하게 성장된 배양물로부터 1％로 접종되었다. 사각형, 대장균 DJOec1; 삼각형, 클로스트리디움 디피실레 DJOcd1; 원, 비피도박테리움 롱검 DJO10A-JH1; 및 다이아몬드, 비피도박테리움 롱검 DJO10A.
도 16. 랜티바이오틱-코딩 유전자 클러스터를 포함하는 비피도박테리움 롱검 DJO10A (Genbank 접속 번호 CP000605)의 게놈 서열의 일부 (서열 23). 서열 23 내에 하기의 것들이 존재한다: 뉴클레오티드 1979049 - 1979753 (서열 1) 및 이에 의해 코딩되는 폴리펩티드 (서열 2); 뉴클레오티드 1979747 - 1980907 (서열 3) 및 이에 의해 코딩되는 폴리펩티드 (서열 4); 뉴클레오티드 1981217 - 1981417 (서열 5) 및 이에 의해 코딩되는 폴리펩티드 (서열 6); 뉴클레오티드 1981501 - 1982160 (서열 7) 및 이에 의해 코딩되는 폴리펩티드 (서열 8); 뉴클레오티드 1982200 - 1982937 (서열 9) 및 이에 의해 코딩되는 폴리펩티드 (서열 10); 뉴클레오티드 1983009 - 1986110 (서열 11) 및 이에 의해 코딩되는 폴리펩티드 (서열 12); 뉴클레오티드 1986161 - 1986979 (서열 13) 및 이에 의해 코딩되는 폴리펩티드 (서열 14); 뉴클레오티드 1986976 - 1989213 (서열 15) 및 이에 의해 코딩되는 폴리펩티드 (서열 16).

본 발명은 특정 미생물의 성장을 억제하는 화합물을 제공한다. 본 발명의 화합물에는 폴리펩티드가 포함된다. 본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 2개 이상의 아미노산의 중합체를 광범위하게 지칭한다. 용어 "폴리펩티드"는 디술피드 결합에 의해 연결된 1개를 초과하는 폴리펩티드를 함유하는 분자, 또는 다량체 (예를 들어, 이량체, 삼량체)로서 공유결합에 의해 또는 비-공유결합에 의해 함께 연결된 폴리펩티드들의 복합체를 또한 포함한다. 따라서, 용어 펩티드, 올리고펩티드 및 단백질은 폴리펩티드의 정의 내에 모두 포함되고, 이러한 용어들은 상호교환가능하게 사용된다. 이러한 용어들이 아미노산들의 중합체의 특정 길이를 암시하지 않고, 폴리펩티드가 재조합 기술, 화학적 또는 효소적 합성을 사용하여 생산되는지 또는 천연 발생 폴리펩티드인지 여부를 의미하거나 구별하도록 의도되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명의 화합물은 본원에서 랜티바이오틱으로 지칭될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물은 단리된 화합물이다. 본원에서 사용된 "단리된" 폴리펩티드, 예컨대 랜티바이오틱, 또는 폴리뉴클레오티드는 이의 천연 환경으로부터 제거되었거나, 재조합 기술을 사용하여 생산되었거나, 또는 화학적으로 또는 효소적으로 합성된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 정제된 것이고, 즉 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 및 관련된 세포 생성물 또는 기타 불순물이 본질적으로 없다.

제한되도록 의도되지 않으면서, 미생물, 예컨대 비피도박테리움에 의한 본 발명의 화합물의 생산 동안, 프리펩티드(prepeptide)가 생산되고, 이어서 세가지 단계에서 프로세싱된다; 특정 아미노산들의 탈수, 특정 아미노산들 간의 티오에테르 결합의 형성, 및 신호 펩티데이스(peptidase)에 의한 절단. 최초의 프리펩티드의 아미노산 서열은 서열 6일 수 있다.

프리펩티드가 탈수에 의해 프로세싱되어, 중간체가 형성된다. 세린 잔기가 탈수되어 디데하이드로알라닌이 형성될 수 있다. 따라서, 서열 6을 참조로, 위치 36, 38, 42, 45, 47, 49, 52, 61 또는 이들의 조합에서의 세린 아미노산이 탈수되어 디데하이드로알라닌이 형성될 수 있다. 바람직하게는, 위치 47, 49, 및 61에서의 세린 아미노산이 탈수되어 디데하이드로알라닌이 형성된다. 트레오닌 아미노산이 탈수되어 디데하이드로부티린이 형성될 수 있다. 따라서, 서열 6을 참조로, 위치 54, 57 또는 이의 조합에서의 트레오닌 아미노산이 탈수되어 디데하이드로부티린이 형성될 수 있다. 바람직하게는, 위치 54 및 57 양쪽 모두에서의 트레오닌이 탈수되어 디데하이드로부티린이 형성된다.

따라서, 아미노산의 탈수로부터 초래된 중간체 폴리펩티드는 하기의 구조를 가질 수 있다:

메티오닌-세린-이소류신-아스파르트산-글루탐산-라이신-세린-이소류신-발린-글리신-글루탐산-세린-페닐알라닌-글루탐산-아스파르트산-류신-세린-알라닌-알라닌-아스파르트산-메티오닌-알라닌-메티오닌-류신-트레오닌-글리신-아르기닌-아스파라긴-아스파르트산-아스파르트산-글리신-발린-알라닌-프롤린-알라닌-Xaa1-류신-Xaa2-페닐알라닌-알라닌-발린-Xaa3-발린-류신-Xaa4-발린-Xaa5-페닐알라닌-Xaa6-알라닌-시스테인-Xaa7-발린-Xaa8-발린-발린-Xaa9-아르기닌-류신-알라닌-Xaa10-시스테인-글리신-아스파라긴-시스테인-라이신 (서열 19)

[식중, Xaa1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 10은 각각 독립적으로 세린 또는 디데하이드로알라닌이고; Xaa8 및 9은 각각 독립적으로 트레오닌 또는 디데하이드로부티린이다]. 특정 아미노산의 탈수로부터 초래된 중간체 폴리펩티드의 바람직한 예는 하기와 같다:

메티오닌-세린-이소류신-아스파라긴-글루탐산-라이신-세린-이소류신-발린-글리신-글루탐산-세린-페닐알라닌-글루탐산-아스파르트산-류신-세린-알라닌-알라닌-아스파르트산-메티오닌-알라닌-메티오닌-류신-트레오닌-글리신-아르기닌-아스파라긴-아스파르트산-아스파르트산-글리신-발린-알라닌-프롤린-알라닌-세린-류신-세린-페닐알라닌-알라닌-발린-세린-발린-류신-세린-발린-디데하이드로알라닌-페닐알라닌-디데하이드로알라닌-알라닌-시스테인-세린-발린-디데하이드로부티린-발린-발린-디데하이드로부티린-아르기닌-류신-알라닌-디데하이드로알라닌-시스테인-글리신-아스파라긴-시스테인-라이신 (서열 20).

특정 아미노산의 탈수로부터 초래된 폴리펩티드가 추가로 프로세싱되어, 특정 아미노산들 간에 티오에테르 결합이 형성된다. 또다른 아미노산과 티오에테르 결합을 형성하도록 사용될 때 디데하이드로부티린 잔기는 프로세싱되어 2-아미노부티르산 (Abu)을 형성할 수 있고, 또다른 아미노산과 티오에테르 결합을 형성하도록 사용될 때 디데하이드로알라닌 잔기는 프로세싱되어 알라닌을 형성할 수 있으며, 또다른 아미노산과 티오에테르 결합을 형성하도록 사용될 때 시스테인 잔기는 프로세싱되어 알라닌을 형성할 수 있다. 랜티바이오틱에서 관찰된 바와 같이, 랜티오닌 및 3-메틸랜티오닌 잔기는 상이한 아미노산들 간의 티오에테르 결합의 형성으로부터 초래된다.

프로세싱된 폴리펩티드가 2개의 아미노산 간의 절단에 의해 추가로 프로세싱된다. 예상되는 절단 부위는 아미노산 33과 34 사이이다. 서열 6 내의 또다른 절단 부위가 사용되어, 프로세싱된 펩티드가 초래될 수 있다.

따라서, 본 발명의 화합물의 서열은 하기의 서열을 가질 수 있다:

프롤린-알라닌-Xaa1-류신-Xaa2-페닐알라닌-알라닌-발린-Xaa3-발린-류신-Xaa4-발린-Xaa5-페닐알라닌-Xaa6-알라닌-Xaa7-Xaa8-발린-Xaa9-발린-발린-Xaa10-아르기닌-류신-알라닌-Xaa11-Xaa12-글리신-아스파라긴-Xaa13-라이신 (서열 21)

[식중, Xaa1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 및 11은 각각 독립적으로 세린, 디데하이드로알라닌 또는 알라닌이고; Xaa7, 12 및 13는 각각 독립적으로 시스테인 또는 알라닌이며; Xaa9 및 10은 각각 독립적으로 트레오닌, 디데하이드로부티린, 또는 2-아미노부티르산이다]. 본 발명의 화합물의 바람직한 예는 하기와 같다:

프롤린-알라닌-세린-류신-세린-페닐알라닌-알라닌-발린-세린-발린-류신-세린-발린-알라닌-페닐알라닌-디데하이드로알라닌-알라닌-알라닌-세린-발린-디데하이드로부티린-발린-발린-2-아미노부티르산-아르기닌-류신-알라닌-알라닌-알라닌-글리신-아스파라긴-알라닌-라이신 (서열 22).

화합물에는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상의 티오에테르 가교가 있을 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물에는 1개 이상, 더욱 바람직하게는 2개 이상, 가장 바람직하게는 3개 이상의 가교가 있다. 가교는 임의의 조합으로의 서열 21의 위치 Xaa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 및 13에서의 임의의 2개의 잔기 사이에 있을 수 있다. 바람직하게는, 각각의 가교는 1개의 시스테인 잔기, 즉, 서열 21의 Xaa 7, 12, 또는 13을 포함한다. 본 발명의 화합물의 바람직한 예는 위치 14 (Xaa 5) 및 18 (Xaa 7), 위치 24 (Xaa 10) 및 29 (Xaa 12), 및 위치 28 (Xaa 11) 및 32 (Xaa 13)의 아미노산들 간에 티오에테르 가교가 있는 서열 22이다.

본 발명의 화합물은 서열 19, 20, 21, 또는 22, 바람직하게는, 서열 21에 도시된 것들 이외의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 또다른 아미노산 서열과의 구조적 유사성이 있는 것들을 포함할 수 있다. 유사성은 구조적 유사성으로 지칭되고, 서열들의 길이를 따라 동일한 아미노산의 개수를 최적화하도록 2개의 아미노산 서열 (즉, 후보 아미노산 서열 및 서열 19, 20, 21, 또는 22의 아미노산 서열)의 잔기들을 정렬시킴으로써 일반적으로 결정된다; 어느 한쪽 또는 양쪽 모두의 서열 내의 갭(gap)이 동일한 아미노산의 개수를 최적화하기 위해 정렬하는 것에서 허용되지만, 그럼에도 불구하고 각각의 서열 내의 아미노산들은 이들의 올바른 순서로 유지되어야 한다. 후보 아미노산 서열은 서열 21과 같은 아미노산 서열 내에 존재하는 아미노산 서열에 비교될 아미노산 서열이다. 후보 아미노산 서열은 비피도박테리움으로부터 단리될 수 있거나, 또는 재조합 기술을 사용하여 생산될 수 있거나, 또는 화학적으로 또는 효소적으로 합성될 수 있다. 바람직하게는, GCG 패키지 (버젼 10.2, Madison WI) 내의 BESTFIT 알고리즘, 또는 [Tatusova, et al., FEMS Microbiol Lett 1999, 174:247-250]에 기술되어 있고, 월드와이드웹을 통해, 예를 들어 <National Center for Biotechnology Information, National Institutes of Health>의 인터넷 사이트에서 입수가능한, BLAST 2 검색 알고리즘의 Blastp 프로그램을 사용하여 2개의 아미노산 서열이 비교된다. 바람직하게는, 모든 BLAST 2 검색 파라메터에 대한 디폴트(default) 값들이 사용되고, 여기에는 매트릭스 = BLOSUM62; 오픈 갭 페널티 = 11, 확장 갭 페널티 = 1, 갭 x_드랍오프(dropoff) = 50, 예상치 = 10, 워드 크기 = 3, 및 임의적으로 필터 온(on)이 포함된다. BLAST 검색 알고리즘을 사용하는 2개의 아미노산 서열의 비교에서, 구조적 유사성이 "동일성"으로 지칭된다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물은 서열 19, 20, 21, 또는 22, 바람직하게는 서열 21에 대해 80％ 이상의 아미노산 동일성, 81％ 이상의 아미노산 동일성, 82％ 이상의 아미노산 동일성, 83％ 이상의 아미노산 동일성, 84％ 이상의 아미노산 동일성, 85％ 이상의 아미노산 동일성, 86％ 이상의 아미노산 동일성, 87％ 이상의 아미노산 동일성, 88％ 이상의 아미노산 동일성, 89％ 이상의 아미노산 동일성, 90％ 이상의 아미노산 동일성, 91％ 이상의 아미노산 동일성, 92％ 이상의 아미노산 동일성, 93％ 이상의 아미노산 동일성, 94％ 이상의 아미노산 동일성, 95％ 이상의 아미노산 동일성, 96％ 이상의 아미노산 동일성, 97％ 이상의 아미노산 동일성, 98％ 이상의 아미노산 동일성, 또는 99％ 이상의 아미노산 동일성이 있는 아미노산 서열의 폴리펩티드를 또한 포함한다.

서열 19, 20, 21, 또는 22, 바람직하게는 서열 21에 대한 구조적 유사성이 있는 본 발명의 화합물은 서열 19, 20, 21, 또는 22에 개시된 서열의 1개 이상의 보존적 치환을 포함할 수 있다. 전형적으로, 보존적 치환은 한 아미노산이 동일한 클래스의 구성원인 또다른 아미노산으로 치환되는 것이다. 예를 들어, 특정 크기 또는 특성 (예컨대 전하, 소수성 및/또는 친수성)을 갖는 아미노산의 군에 속하는 아미노산이 폴리펩티드의 2차 및/또는 3차 구조를 실질적으로 변화시키지 않으면서 또다른 아미노산으로 일반적으로 치환될 수 있다는 것이 단백질 생화학 분야에 주지되어 있다. 본 발명의 목적을 위해, 보존적 아미노산 치환은 하기의 클래스들 중 하나의 내부로부터의 아미노산 잔기들의 교환에서 초래되는 것으로 정의된다: 클래스 I: Gly, Ala, Val, Leu, 및 Ile (지방족 측쇄를 나타램)); 클래스 II: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, 및 Thr (지방족 및 지방족 하이드록실 측쇄를 나타냄); 클래스 III: Tyr, Ser, 및 Thr (하이드록실 측쇄를 나타냄); 클래스 IV: Cys 및 Met (황-함유 측쇄를 나타냄); 클래스 V: Glu, Asp, Asn 및 Gln (카르복실 또는 아미드 기 함유 측쇄를 나타냄); 클래스 VI: His, Arg 및 Lys (염기성 측쇄를 나타냄); 클래스 VII: Gly, Ala, Pro, Tip, Tyr, ILe, Val, Leu, Phe 및 Met (소수성 측쇄를 나타냄); 클래스 VIII: Phe, Trp, 및 Tyr (방향족 측쇄를 나타냄); 및 클래스IX: Asn 및 Gln (아미드 측쇄를 나타냄). 클래스들은 표준 유전자 코드에서 코딩되지 않고 아미노산의 번역후 변형으로부터 예를 들어 초래되는 아미노산을 포함하여, 천연 발생 아미노산에 한정되지 않고, 인공 아미노산을 또한 포함한다. 보존적 치환은 임의의 위치에, 바람직하게는 서열 21의 위치 1, 2, 4, 6, 7, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 20, 22, 23, 25, 26, 27, 30, 31, 33, 또는 이들의 조합에 존재할 수 있다.

표현형 면에서 침묵성인 아미노산 치환을 만드는 방법에 관한 지침이 [Bowie et al., 1990, Science, 247:1306-1310]에서 제공되고, 상기 문헌에서 저자는 단백질들이 놀랄 만큼 아미노산 치환에 대해 내성임을 지시하였다. 예를 들어, [Bowie et al., 상기 문헌]에는 변화에 대한 폴리펩티드 서열의 내성을 연구하기 위한 2가지 주요 접근법이 있음이 개시되어 있다. 첫번째 방법은 돌연변이가 자연 선택에 의해 허용 또는 거부되는 진화 프로세스에 의존한다. 두번째 접근법은 클로닝된 유전자의 특정 위치에 아미노산 변화를 도입하기 위해 유전자 조작을 사용하고, 기능성을 유지하는 서열들을 확인하기 위해 선별 또는 스크리닝한다. 저자가 언급한 바와 같이, 이러한 연구들은 단백질들이 놀랄 만큼 아미노산 치환에 대해 내성임을 드러냈다. 또한 저자들은 어떠한 변화가 단백질의 특정 위치에서 허용성일 것 같은지를 나타냈다. 예를 들어, 대부분의 매립된 아미노산 잔기들은 비-극성 측쇄를 필요로 하는 반면, 표면 측쇄들의 양상들은 일반적으로 거의 보존되지 않는다. 또다른 이같은 표현형 면에서 침묵성인 치환이 [Bowie et al., 상기 문헌] 및 이에 인용된 참고문헌들에 기술되어 있다.

바람직하게는, 본 발명의 화합물은 생물학적으로 활성이다. 본원에서 사용된 "생물학적으로 활성인" 화합물 또는 "생물학적 활성"이 있는 화합물은 지표 미생물의 성장을 억제하는 화합물이다. 생물학적 활성에 대해 테스트될 랜티바이오틱이 미생물, 바람직하게는 비피도박테리움에 의해 생산되는 경우, 미생물을 사용하여 플레이트의 중심에 접종하고, 이를 일정 기간, 예를 들어, 2일 동안 인큐베이션하여, 미생물이 복제되고 랜티바이오틱이 생산되도록 할 수 있다. 바람직하게는, 한천 플레이트는 MRS 또는 BLIM이다. 이어서, 상이한 플레이트 상에서 또는 브로스(broth)에서 이전에 성장된 지표 균주를 용융된 탑(top) 한천, 예를 들어, 0.5％ 한천에 현탁시키고, 테스트될 랜티바이오틱을 생산하는 미생물을 함유하는 플레이트 위로 붓는다. 지표 균주의 사용량은 변할 수 있지만, 전형적으로는, 랜티바이오틱-생산 미생물의 부재 하에 1일 내지 2일 내에 가시적인 성장을 산출할 농도로 첨가된다. 탑 한천을 냉각 및 경화시키고, 플레이트를 지표 균주의 성장을 허용하는 조건 하에 인큐베이션한다. 플레이트 가운데에 접종된 미생물 주변에 지표 균주가 부재하는 것은 미생물이 생물학적 활성이 있는 랜티바이오틱을 생산한다는 것을 가리킨다. 플레이트에 지표 균주의 성장이 완전히 결여될 수 있거나, 또는 플레이트의 중심에 지표 균주가 없는 헤일로(halo)가 있을 수 있다.

생물학적 활성에 대해 테스트될 랜티바이오틱이 단리 또는 정제되는 경우, 한천 플레이트의 중심에 구멍을 자를 수 있고, 단리 또는 정제된 랜티바이오틱을 함유하는 용액을 구멍에 첨가하여 한천 내로 확산되도록 할 수 있다. 이어서, 상이한 플레이트 상에서 또는 브로스에서 이전에 성장된 지표 균주를 융용된 탑 한천, 예를 들어, 0.5％ 한천에 현탁시키고, 단리 또는 정제된 랜티바이오틱을 함유하는 플레이트 위로 붓는다. 탑 한천을 냉각 및 경화시키고, 플레이트를 지표 균주의 성장을 허용하는 조건 하에 인큐베이션한다. 플레이트 가운데에 접종된 미생물 주변에 지표 균주가 부재하는 것은 미생물이 생물학적 활성이 있는 랜티바이오틱을 생산한다는 것을 가리킨다. 플레이트에 지표 균주의 성장이 완전히 결여될 수 있거나, 또는 플레이트의 중심에 지표 균주가 없는 헤일로가 있을 수 있다.

일부 랜티바이오틱이 그람 음성 미생물에 대한 약간의 생물학적 활성이 있는 것으로 공지되어 있지만, 전형적으로, 랜티바이오틱에의 노출 전에 그람 음성 미생물의 외막이 손상된 경우에만 이러한 생물학적 활성이 존재한다. 본 발명의 랜티바이오틱에는 외막에 대한 손상의 부재 하에 그람 음성 미생물에 대한 생물학적 활성이 있다. 따라서, 랜티바이오틱에 생물학적 활성이 있는지 여부의 테스트가 그람 음성 미생물의 외막을 손상시키지 않는 조건 하에 바람직하게 수행된다. 이같은 조건에는, 예를 들어, 배지 내에 킬레이터를 포함하는 것, 지표 미생물을 삼투압 충격, 열, 정수압의 조건에 적용하는 것, 외막의 지질다당류에 영향을 미치는 준-치사성 항균제에의 노출, 준-치사성 마이크로파 노출, 및 준-치사성 초음파처리가 포함된다. 유사하게, 일부 랜티바이오틱이 그람 음성 미생물에 대한 약간의 생물학적 활성이 있는 것으로 공지되어 있지만, 전형적으로, 그람 음성 미생물이 그람 양성 미생물을 억제하는데 사용되는 것보다 더 높은 농도의 랜티바이오틱에 노출되는 경우에만 이러한 생물학적 활성이 존재한다 (Hillman, 미국 특허 출원 20020128186). 본 발명의 랜티바이오틱에는 동일한 농도로 사용되는 경우에 그람 음성 미생물 및 그람 양성 미생물에 대한 생물학적 활성이 있다.

바람직한 지표 균주에는, 예를 들어, 마이크로코쿠스 레우테우스(Micrococcus leuteus), 락토코쿠스 락티스, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 대장균, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 및 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris)가 포함된다.

또한 본 발명의 화합물에는 10분 동안 100℃로 가열하는 것에 대해 저항성이고, pH 2의 펩신 및 pH 7.5의 프로네이스(pronase) E로의 단백질분해성 소화에 의해 불활성화되며, α-카이모트립신(Chymotrypsin), 프로테이네이스(proteinase) K, 트립신, 및 써모라이신으로의 단백질분해성 소화에 의해 불활성화되지 않는 특징들이 있다. 화합물의 등전점은 9.5이고 분자량은 3291.8 달톤인 것으로 예상된다.

본 발명은 기타 단리된 폴리펩티드들을 또한 제공한다. 제한하려는 의도 없이, 미생물 예컨대 비피도박테리움에 의한 본 발명의 화합물, 예를 들어, 서열 22의 생산이 7개의 또다른 폴리펩티드에 의해 용이해진다. 이러한 7개의 폴리펩티드의 천연 발생 버젼은 천연 발생 단백질원(preprotein) 서열 6을 코딩하는 코딩 영역을 포함하는 코딩 영역들의 셋트에 의해 코딩되고, 이러한 7개의 폴리펩티드 각각의 발현은 화합물, 예를 들어, 서열 22의 생산을 초래한다.

이러한 7개의 폴리펩티드는 2-성분 시스템의 응답 조절인자 (서열 2), 신호 전달 히스티딘 카이네이스 (서열 4), 응답 조절인자 (서열 8), 프리펩티드 변형 폴리펩티드 (서열 10), 변형 효소 (서열 12), 면역 폴리펩티드 (서열 14), 및 수송체 폴리펩티드 (서열 16)이다. 수송체 폴리펩티드는 프리펩티드를 절단하는 프로티에이스 능력을 포함할 것으로 예상된다. 서열 2, 서열 4, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 또는 서열 16의 아미노산 서열과의 구조적 유사성이 있는 폴리펩티드가 본 발명에 또한 포함된다. 유사성은 구조적 유사성으로 지칭되고, 상기 기술된 바와 같이 2개의 아미노산 서열 (즉, 후보 아미노산 서열 및 서열 2, 서열 4, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 또는 서열 16의 아미노산 서열)의 잔기들을 정렬시킴으로써 일반적으로 결정된다. 바람직하게는, 본 발명의 이러한 양상의 폴리펩티드는 서열 2, 서열 4, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 또는 서열 16에 대해 80％ 이상의 아미노산 동일성, 81％ 이상의 아미노산 동일성, 82％ 이상의 아미노산 동일성, 83％ 이상의 아미노산 동일성, 84％ 이상의 아미노산 동일성, 85％ 이상의 아미노산 동일성, 86％ 이상의 아미노산 동일성, 87％ 이상의 아미노산 동일성, 88％ 이상의 아미노산 동일성, 89％ 이상의 아미노산 동일성, 90％ 이상의 아미노산 동일성, 91％ 이상의 아미노산 동일성, 92％ 이상의 아미노산 동일성, 93％ 이상의 아미노산 동일성, 94％ 이상의 아미노산 동일성, 95％ 이상의 아미노산 동일성, 96％ 이상의 아미노산 동일성, 97％ 이상의 아미노산 동일성, 98％ 이상의 아미노산 동일성, 또는 99％ 이상의 아미노산 동일성이 있는 아미노산 서열의 폴리펩티드를 또한 포함한다. 서열 2, 서열 4, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 또는 서열 16에 대한 구조적 유사성이 있는 본 발명의 폴리펩티드는 서열 2, 서열 4, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 또는 서열 16에 개시된 서열의 1개 이상의 보존적 치환을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 서열 2, 서열 4, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 또는 서열 16에 대한 구조적 유사성이 있는 폴리펩티드에는 서열 22의 생물학적 활성 화합물을 생산하는 활성이 있다. 아미노산 서열이 변경된 폴리펩티드들 중 하나를 미생물, 바람직하게는 비피도박테리움 내에서 다른 천연 발생 폴리펩티드들과 함께 발현시키고, 본 발명의 생물학적 활성 화합물이 생산되는지 여부를 결정함으로써, 서열 2, 서열 4, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 또는 서열 16에 대한 구조적 유사성이 있는 폴리펩티드에 활성이 있는지 여부를 결정할 수 있다. 예를 들어, 서열 2에 대한 구조적 유사성이 있는 폴리펩티드를 활성에 대해 테스트하는 경우, 이를 세포 내에서 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 및 서열 16과 함께 발현시킬 수 있고, 세포를 본 발명의 화합물의 생산에 적절한 조건 하에 성장시킬 수 있다. 세포가 생물학적 활성이 있는 화합물을 생산한다면, 테스트된 폴리펩티드, 즉, 서열 2에 대한 구조적 유사성이 있는 폴리펩티드가 활성이다.

폴리뉴클레오티드

본 발명은 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 단리된 폴리뉴클레오티드를 또한 제공한다. 본원에서 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 임의의 길이의 중합체 형태의 뉴클레오티드 (리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드)를 지칭하고, 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA 및 RNA를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 코딩 서열, 및 비-코딩 서열 예컨대 조절 서열이 예를 들어 포함되는 상이한 기능들이 있는 뉴클레오티드 서열들을 포함할 수 있다. 코딩 서열, 비-코딩 서열, 및 조절 서열이 하기에 정의된다. 폴리뉴클레오티드는 천연 공급원으로부터 직접 수득될 수 있거나, 또는 재조합 기술, 효소적 기술 또는 화학적 기술에 의해 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 위상학적으로 선형 또는 원형일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 벡터, 예컨대 발현 또는 클로닝 벡터의 일부분, 또는 단편일 수 있다.

본 발명의 한 폴리뉴클레오티드는 서열 17 (서열 23의 뉴클레오티드 1981316 - 1981417)을 포함하고, 이는 서열 6의 아미노산 34-66에 도시된 폴리펩티드를 코딩한다. 서열 6의 아미노산 34-66에 의해 표시되는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 서열 17에 개시된 뉴클레오티드 서열에 한정되지 않고, 유전자 코드의 축퇴성의 결과로서 이같은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드들의 클래스를 또한 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들어, 천연 발생 뉴클레오티드 서열인 서열 17은 서열 6의 아미노산 34-66에 도시된 아미노산 서열의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열들의 클래스의 단지 하나의 구성원일 뿐이다.

본 발명의 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 코딩하는 또다른 폴리뉴클레오티드에는 서열 17의 뉴클레오티드 서열과 구조적 유사성이 있는 것들이 포함된다. 유사성은 구조적 유사성으로 지칭되고, 서열들의 길이를 따라 동일한 뉴클레오티드의 개수를 최적화하도록 2개의 폴리뉴클레오티드 (즉, 후보 서열의 뉴클레오티드 서열 및 서열 17의 뉴클레오티드 서열)의 잔기들을 정렬시킴으로써 일반적으로 결정된다; 어느 한쪽 또는 양쪽 모두의 서열 내의 갭이 공유되는 뉴클레오티드의 개수를 최적화하기 위해 정렬하는 것에서 허용되지만, 그럼에도 불구하고 각각의 서열 내의 뉴클레오티드들은 이들의 올바른 순서로 유지되어야 한다. 후보 서열은 서열 17에 비교될 서열이다. 후보 뉴클레오티드 서열은 비피도박테리움으로부터 단리될 수 있거나, 또는 재조합 기술을 사용하여 생산될 수 있거나, 또는 화학적으로 또는 효소적으로 합성될 수 있다. 바람직하게는, GCG 패키지 (버젼 10.2, Madison WI) 내의 BESTFIT 알고리즘, 또는 [Tatusova, et al., FEMS Microbiol Lett 1999, 174:247-250]에 기술되어 있고, 월드와이드웹을 통해, 예를 들어 <National Center for Biotechnology Information, National Institutes of Health>의 인터넷 사이트에서 입수가능한, BLAST 2 검색 알고리즘의 Blastn 프로그램을 사용하여 2개의 뉴클레오티드 서열이 비교된다. 바람직하게는, 모든 BLAST 2 검색 파라메터에 대한 디폴트 값들이 사용되고, 여기에는 매치에 대한 보상 = 1, 미스매치에 대한 페널티 = -2, 오픈 갭 페널티 = 5, 확장 갭 페널티 = 2, 갭 x_드랍오프 = 50, 예상치 = 10, 워드 크기 = 11, 및 임의적으로 필터 온이 포함된다. BLAST 검색 알고리즘을 사용하는 2개의 뉴클레오티드 서열의 비교에서, 구조적 유사성이 "동일성"으로 지칭된다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 서열 17에 대해 80％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 81％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 82％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 83％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 84％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 85％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 86％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 87％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 88％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 89％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 90％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 91％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 92％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 93％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 94％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 95％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 96％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 97％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 98％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 또는 99％ 이상의 뉴클레오티드 동일성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 서열 17에 대한 구조적 유사성이 있는 뉴클레오티드 서열은 생물학적 활성이 있는 본 발명의 화합물을 코딩한다.

임의적으로, 서열 17과 동일한 또는 서열 17과의 구조적 유사성이 있는 폴리뉴클레오티드는 서열 17의 바로 5' 또는 상류에 위치하는 추가적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 임의적인 서열은 프로세싱 동안에 제거되는 프리펩티드의 아미노 말단 영역에 상응하는 폴리펩티드, 즉, 서열 6의 아미노산 1-33을 코딩한다. 이러한 뉴클레오티드들은 서열 5의 뉴클레오티드 1 - 99에 개시된다. 서열 6의 아미노산 1-33에 의해 표시되는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 서열 5의 뉴클레오티드 1 - 99에 개시된 뉴클레오티드 서열에 한정되지 않고, 유전자 코드의 축퇴성의 결과로서 이같은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드들의 클래스를 또한 포함한다는 것을 이해하여야 한다.

프리펩티드의 아미노 말단 영역을 코딩하는 또다른 단리된 폴리뉴클레오티드에는 서열 5의 뉴클레오티드 1 - 99의 뉴클레오티드 서열과의 구조적 유사성이 있는 것들이 포함된다. 유사성은 구조적 유사성으로 지칭되고, 상기 기술된 바와 같이 2개의 폴리뉴클레오티드 (즉, 후보 서열의 뉴클레오티드 서열 및 서열 5의 뉴클레오티드 1 - 99)의 잔기들을 정렬시킴으로써 결정된다. 바람직하게는, 이같은 폴리뉴클레오티드는 서열 5의 뉴클레오티드 1 - 99에 대해 80％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 81％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 82％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 83％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 84％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 85％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 86％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 87％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 88％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 89％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 90％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 91％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 92％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 93％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 94％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 95％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 96％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 97％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 98％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 또는 99％ 이상의 뉴클레오티드 동일성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명은 본 발명의 화합물의 생산을 용이하게 하는 7개의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드들을 또한 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드들에는 서열 1, 서열 3, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 및 서열 15가 포함된다. 이러한 폴리뉴클레오티드들은 각각 서열 2, 서열 4, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 및 서열 16을 코딩한다. 서열 2, 서열 4, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 또는 서열 16에 의해 표시되는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 서열 1. 서열 3, 서열 7, 서열 9, 서열 11. 서열 13, 또는 서열 15에 개시된 뉴클레오티드 서열에 한정되지 않고, 유전자 코드의 축퇴성의 결과로서 이같은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드들의 클래스를 또한 포함한다는 것을 이해하여야 한다.

본 발명의 화합물의 발현을 용이하게 하는 7개의 폴리펩티드들 중 하나를 코딩하는 또다른 폴리뉴클레오티드에는 서열 1, 서열 3, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 또는 서열 15의 뉴클레오티드 서열과의 구조적 유사성이 있는 것들이 포함된다. 유사성은 구조적 유사성으로 지칭되고, 상기 기술된 바와 같이 2개의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 후보 서열의 뉴클레오티드 서열 및 서열 1의 뉴클레오티드)의 잔기들을 정렬시킴으로써 결정된다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 서열 1, 서열 3, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 또는 서열 15에 대해 80％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 81％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 82％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 83％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 84％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 85％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 86％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 87％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 88％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 89％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 90％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 91％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 92％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 93％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 94％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 95％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 96％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 97％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 98％ 이상의 뉴클레오티드 동일성, 또는 99％ 이상의 뉴클레오티드 동일성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 서열 1, 서열 3, 서열 7, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 또는 서열 15에 대한 구조적 유사성이 있는 뉴클레오티드 서열에는 서열 22의 화합물을 생산하는 활성이 있다. 이같은 활성에 대한 테스트가 상기에 기술되어 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 벡터 내에 존재할 수 있다. 벡터는 부착된 폴리뉴클레오티드의 복제를 야기하도록 또다른 폴리뉴클레오티드가 부착될 수 있는 복제성 폴리뉴클레오티드, 예컨대 플라스미드, 파지, 코스미드, 또는 인공 염색체이다. 벡터 내에 존재하는 경우, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 재조합 폴리뉴클레오티드로 지칭될 수 있다. 본원에서 사용된 "재조합 폴리뉴클레오티드"는 천연적으로는 함께 연결되지 않는 서열들이 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이러한 서열들은 재조합 기술을 사용하는 상이한 폴리뉴클레오티드 서열들의 인공적인 조작에 의해 연결될 수 있거나, 또는 화학적으로 또는 효소적으로 합성될 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오티드는 적절한 벡터 내에 포함될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터의 구축은 당업계에 공지된 표준 결찰 기술을 이용한다. 예를 들어, [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] 참조.

벡터는 추가적인 클로닝 (폴리뉴클레오티드의 증폭)을 제공할 수 있거나 (즉, 클로닝 벡터), 또는 코딩 영역에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현을 제공할 수 있다 (즉, 발현 벡터). 적절한 발현 벡터에는 본 발명의 조성물에서 사용될 수 있고, 예를 들어, 대상에게 투여될 수 있는 상당량의 폴리펩티드, 바람직하게는 본 발명의 화합물을 생산하는데 사용될 수 있는 것들이 포함된다. 벡터는 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편을 코딩하는 코딩 영역을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 "코딩 영역"은 폴리펩티드를 코딩하고, 적합한 조절 서열의 제어 하에 놓였을 때 코딩된 폴리펩티드를 발현하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 코딩 영역의 경계는 이의 5' 말단의 번역 시작 코돈 및 이의 3' 말단의 번역 정지 코돈에 의해 일반적으로 결정된다.

벡터의 선택은 생성된 구축물 내의 다양한 원하는 특성, 예컨대 선별 마커, 벡터 복제 속도 등에 좌우된다. 본원에서 벡터를 클로닝하거나 발현시키기 위한 적절한 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 세포이다.

발현 벡터는 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 임의적으로 포함한다. 조절 서열은 자신이 작동가능하게 연결된 코딩 영역의 발현을 조절하는 뉴클레오티드 서열이다. 조절 서열의 비제한적인 예로는 프로모터, 전사 개시 부위, 번역 시작 부위, 번역 정지 부위, 및 종결인자가 포함된다. "작동가능하게 연결된"은 작동가능하게 연결된 것으로 기술된 성분들이 이들의 의도된 방식으로 이들이 기능하도록 허용하는 관계에 있는 병치를 지칭한다. 조절 서열과 혼화성인 조건 하에 코딩 영역의 발현이 달성되는 방식으로 연결되는 경우에 조절 서열은 코딩 영역에 "작동가능하게 연결"된다. 본 발명은 임의의 특정 프로모터의 사용에 한정되지 않고, 광범위한 프로모터가 공지되어 있다. 프로모터는 세포 내의 RNA 중합효소에 결합하여 하류 (3' 방향) 코딩 영역의 전사를 개시시키는 조절 신호로서 작용한다. 사용된 프로모터는 구성성 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 이는 숙주 세포와 관련하여 이종성일 수 있지만, 그럴 필요는 없다. 본원에서 사용된 "이종성" 조절 서열은 정상적으로는 자신이 작동가능하게 연결되지 않는 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 조절 서열이다.

발현 벡터는 전사된 메시지의 번역을 개시시켜 폴리펩티드를 생산하도록 하는 리보솜 결합 부위 및 시작 부위 (예를 들어, 코돈 ATG)를 임의적으로 포함할 수 있다. 이는 번역을 끝내도록 하는 종결 서열을 또한 포함할 수 있다. 전형적으로, 종결 서열은 상응하는 아미노아세틸-tRNA가 존재하지 않아서 폴리펩티드 합성을 끝내게 하는 코돈이다. 숙주 세포를 형질전환시키도록 사용된 폴리뉴클레오티드는 전사 종결 서열을 임의적으로 추가로 포함할 수 있다.

벡터는 하나를 초과하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 하나를 초과하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 1개의 벡터 내에 존재하는 경우, 폴리뉴클레오티드들은 오페론으로 조직화될 수 있고, 오페론 내의 첫번째 코딩 영역의 상류에 위치한 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 별법적으로, 하나를 초과하는 프로모터가 폴리뉴클레오티드들의 발현을 구동시킬 수 있다. 예를 들어,

숙주 세포 내로 도입된 벡터는 하나 이상의 마커 서열을 임의적으로 포함하고, 전형적으로 상기 마커 서열은 성장 배지 내의 화합물을 불활성화시키거나, 또는 성장 배지 내의 화합물을 검출하거나 이에 의해 검출되는 분자를 코딩한다. 예를 들어, 마커 서열의 포함은 형질전환된 세포가 항생제에 대해 저항성이게 할 수 있거나, 또는 형질전환된 세포에 화합물-특이적 대사를 부여할 수 있다. 마커 서열의 예는 카나마이신, 앰피실린, 클로람페니콜, 테트라사이클린, 네오마이신 및 에리트로마이신에 대한 저항성을 부여하는 서열이다.

제조 방법

본 발명은 본 발명의 화합물의 제조 방법에 또한 관련된다. 본 발명의 화합물의 생산 방법은 비피도박테리움을 화합물을 생산하는데 적절한 조건 하에 성장시키는 단계를 포함할 수 있다. 전형적으로, 이같은 조건은 비피도박테리움을 표면 상에서 성장시키는 것을 포함할 수 있다. 고체 배지용으로 사용될 수 있는 적절한 성분에는 한천, 젤라틴, 및 검(gum) 예컨대 알지네이트, 잔탄 등이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 배지는 완전 배지 또는 최소 배지, 바람직하게는 완전 배지일 수 있다. 적절한 배지의 예로는 발효가능한 당을 포함하는 복합 배지, 예컨대 MRS, BLIM, 및 뇌-심장 침출물(Brain Heart Infusion)이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 화합물을 생산할 수 있는 비피도박테리아는 개체로부터 수득될 수 있거나, 또는 실험 균주가 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물의 공급원으로서 사용될 수 있는 비피도박테리아의 예로는 비피도박테리움 아돌레센티스, 비피도박테리움 아에로필룸(B. aerophilum), 비피도박테리움 안굴라툼(B. angulatum), 비피도박테리움 아니말리스(B. animalis), 비피도박테리움 아스테로이데스(B. asteroides), 비피도박테리움 비피둠(B. bifidum), 비피도박테리움 보움(B. boum), 비피도박테리움 브레베(B. breve), 비피도박테리움 카테눌라툼(B. catenulatum), 비피도박테리움 코에리눔(B. choerinum), 비피도박테리움 코리네포르메(B. coryneforme), 비피도박테리움 쿠니쿨리(B. cuniculi), 비피도박테리움 덴티콜렌스(B. denticolens), 비피도박테리움 덴티움(B. dentium), 비피도박테리움 갈리쿰(B. gallicum), 비피도박테리움 갈리나룸(B. gallinarum), 비피도박테리움 인디쿰(B. indicum), 비피도박테리움 인판티스(B. infantis), 비피도박테리움 이노피나툼(B. inopinatum), 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 마그눔(B. magnum), 비피도박테리움 메리시쿰(B. merycicum), 비피도박테리움 미니뭄(B. minimum), 비피도박테리움 슈도카테눌라툼(B. pseudocatenulatum), 비피도박테리움 슈도롱검(B. pseudolongum), 비피도박테리움 사이크라에로필룸(B. psychraerophilum), 비피도박테리움 풀로룸(B. pullorum), 비피도박테리움 루미난티움(B. ruminantium), 비피도박테리움 사에쿨라레(B. saeculare), 비피도박테리움 스카르도비이(B. scardovii), 비피도박테리움 서브틸레(B. subtile), 비피도박테리움 테르마시도필룸(B. thermacidophilum), 및 비피도박테리움 테르모필룸(B. thermophilum)이 포함된다. 바람직하게는, 비피도박테리움은 비피도박테리움 브레베, 비피도박테리움 인판티스, 또는 비피도박테리움 롱검이고, 더욱 바람직하게는, 비피도박테리움 롱검이다.

비피도박테리아는 액체 배지에서의 장기간의 시험관내 배양 후 랜티바이오틱을 생산하는 능력을 잃는 것으로 여겨지기 때문에, 바람직하게는 비피도박테리움이 개체로부터 수득된다. 개체로부터 비피도박테리움을 수득하는 방법은 일상적이고, 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, [Kullen et al., 1997, FEMS Microbiol. Lett, 154:377-383]; [O'Suillivan, 미국 특허 6,746,672 참조). 예를 들어, 신선한 대변 샘플을 개체로부터 수집하고, 즉각적으로 적합한 양의 무균성 용액 예컨대 무균성 펩톤수 (0.1％)에서 균질화시킬 수 있다. 바람직하게는, 개체는 위장관 장애의 병력이 없고, 이전해에 항생제를 사용하지 않았다. 균질화물을 혐기성 챔버로 옮겨서, 연속적으로 희석하고, 예를 들어, BIM-25 ([Munoa et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol, 54:1715-1718]) 상에, 플레이팅할 수 있다. 37℃에서의 혐기성 인큐베이션 후, 적색 콜로니를 무작위로 선택할 수 있다. BIM-25 플레이트 상에 나타난 콜로니의 진정성을 일상적인 방법에 의해, 예컨대 비피도박테리아에 대한 진단 효소인 프룩토스-6-포스페이트 포스포케톨레이스(phosphoketolase)의 활성을 평가함으로써, 또는 [Kullen et al., 1997, FEMS Microbiol Lett., 154:377-383]에 기술된 바와 같은 16s rRNA 유전자 또는 recA 유전자의 분자 분석에 의해 증명할 수 있다.

일단 미생물 예컨대 비피도박테리움이 랜티바이오틱 생산을 허용하는 조건에서 성장 중이면, 계속 그러할 수 있을 것으로 예상된다. 그러나, 본 발명의 화합물을 생산하는 비피도박테리움은 랜티바이오틱 생산에 유리하지 않는 조건 하에, 예컨대 브로스에서 장기간 동안 성장되지 않아야 하는데, 이들이 화합물을 코딩하는 유전자 클러스터를 잃을 수 있기 때문이다. 이러한 유전자 클러스터가 면역 유전자를 또한 코딩하기 때문에, 랜티바이오틱이 이러한 환경 내에 있다면 이는 손실될 수 없다.

비피도박테리움을 스크리닝하여, 본 발명의 화합물을 생산하는지를 결정할 수 있다. 스크리닝 방법은 랜티바이오틱의 발현에 적절한 조건 하에 비피도박테리움을 배양하는 단계 및 랜티바이오틱의 존재를 테스트하는 단계를 포함한다. 비피도박테리움에 의한 랜티바이오틱의 생산과 같은 이벤트가 일어나기에 "적절한" 조건, 또는 이벤트가 일어나도록 "허용"하는 조건, 또는 "적절한" 조건은 이같은 이벤트가 일어나는 것을 방지하지 않는 조건이다. 따라서, 이러한 조건들은 이벤트를 허용하고/하거나, 강화시키고/시키거나, 촉진하고/하거나, 이에 도움이 된다. 비피도박테리움이 본 발명의 화합물을 발현하는지 여부를 결정하기 위한 방법이 하기에 기술된다.

스크리닝 방법은 비피도박테리움에 본 발명의 화합물의 합성에서 수반되는 폴리뉴클레오티드들 중 하나 이상이 있는지를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 증폭에 의해 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 존재를 결정할 수 있다. 바람직하게는, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 폴리뉴클레오티드가 증폭된다. PCR에서, 몰 과량의 프라이머 쌍이 테스트 비피도박테리움으로부터의 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 염색체 DNA를 포함하는 샘플에 첨가된다. 프라이머가 확장되어 상보적 프라이머 확장 생성물을 형성하고, 이는 원하는 증폭된 폴리뉴클레오티드를 합성하기 위한 주형으로서 작용한다. 예상 크기의 증폭된 폴리뉴클레오티드의 존재는 테스트 비피도박테리움이 본 발명의 화합물을 생산할 수 있음을 가리킨다.

증폭될 수 있는 적절한 폴리뉴클레오티드는 서열 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 및 15 내에 존재하는 코딩 영역을 포함한다. 바람직하게는, 증폭된 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드 서열 6을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (서열 5)의 일부분이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 일부를 증폭시키는 프라이머를 쉽게 입수가능한 컴퓨터 프로그램, 예컨대 OMIGA 프로그램 (Oxford Molecular, Ltd. (Oxford, UK))을 사용하여 디자인할 수 있다. 프라이머의 디자인에서 고려될 수 있는 인자에는 용융 온도, 프라이머 길이, 증폭 생성물의 크기, 및 특이성이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 프라이머 길이는 일반적으로 뉴클레오티드 15개 내지 30개 사이이지만, 원한다면 더 짧거나 더 길 수 있다. PCR에 의해 폴리뉴클레오티드를 증폭시키기 위한 조건은 사용된 프라이머의 뉴클레오티드 서열에 따라 다르고, 이같은 조건을 결정하는 방법은 당업계에서 일상적이다. 프라이머 쌍의 예로는, 예를 들어, 676 bp의 증폭 생성물을 초래하는 LANR1-F (ATGAAGGCGATTCTGTTTC, 서열 38) 및 LANR1-R (TCACAGCTCGATATTGGTG, 서열 39), 및 788 bp의 증폭 생성물을 초래하는 LANT1-F (GAGCATCAATGAGAAGTCC, 서열 56) 및 LANT1-R (GCAATCAACACCAAAACC, 서열 57)이 포함된다.

또다른 양상에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 존재를 테스트 비피도박테리움 내에 존재하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화하도록 디자인된 폴리뉴클레오티드 프로브로 결정할 수 있다. 본원에서 사용된 "혼성화하다", "혼성화하는" 및 "혼성화"는 표준 조건 하에서의 프로브와 표적 폴리뉴클레오티드 간의 비-공유결합 상호작용 형태를 지칭한다. 표준 혼성화 조건은 프로브가 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하도록 하는 조건이다. 이같은 조건은 당업계에 주지된 기술을 사용하여 프로브 및 표적 폴리뉴클레오티드에 대해 쉽게 결정되고, 예를 들어 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory: New York (1989)]를 참조한다. 혼성화에 의해 확인될 수 있는 적절한 폴리뉴클레오티드에는 서열 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 및 15 내에 존재하는 코딩 영역이 포함된다. 바람직하게는, 혼성화에 의해 확인되는 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드 서열 6을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. 프로브는 길이가 뉴클레오티드 20개 미만, 뉴클레오티드 20개 이상, 또는 뉴클레오티드 100개 이상일 수 있다.

또다른 양상에서, 본 발명의 화합물의 생산 방법은 서열 19, 서열 20, 서열 21, 또는 서열 22, 바람직하게는 서열 22에 대한 구조적 유사성이 있는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 성장시키는 단계를 포함할 수 있다. 미생물은 본 발명의 lanA를 코딩하는 코딩 영역을 포함할 수 있고, 임의적으로, 본 발명의 lanR2, 본 발명의 lanK, 본 발명의 lanR1, 본 발명의 lanD, 본 발명의 lanM, 본 발명의 lanI, 본 발명의 lanT, 또는 이들의 조합을 코딩하는 코딩 영역을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 미생물은 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 또는 이들의 조합을 코딩하는 코딩 영역을 포함할 수 있다. 본 발명의 화합물은 생체 내에서 또한 생산될 수 있다 ([Xie et al., 2004, Science, 303:679-681]).

본 발명의 화합물을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물은 고세균(Archae), 진핵생물(Eukarya) 또는 유박테리아(Eubacteria), 바람직하게는 유박테리아, 예컨대 그람 음성 또는 그람 양성 미생물일 수 있다. 그람 음성 미생물의 예로는 대장균 및 살모넬라 종이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 그람 양성 미생물의 예로는 바실루스(Bacillus) 종, 예컨대 바실루스 서브틸리스(B. subtilis), 엔테로코쿠스(Enterococcus) 종, 예컨대 엔테로코쿠스 파에시움(E. faecium), 엔테로코쿠스 파에칼리스(E. faecalis), 락트산 박테리아 예컨대 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 락토코쿠스 사케이(L. sakei), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 기타 미생물에는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 효모가 포함된다.

본 발명의 화합물은 단리될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물을 생산하는 미생물, 바람직하게는 비피도박테리움이 랜티바이오틱의 생산에 적절한 조건에서 배양될 수 있고, 배지를 포함하는 배양물이 화합물을 단리하는데 적절한 조건에 노출될 수 있다. 한 양상에서, 세포, 및 임의적으로, 세포가 성장된 고체 배지를 건조시킴으로써 본 발명의 화합물이 단리될 수 있다. 임의적으로, 배양물을 추가로 처리하여 이를 멸균시킬 수 있다. 예를 들어, 배양물 내에 존재하는 비피도박테리아를 사망시키는 조건에의 노출에 의해 배양물을 처리할 수 있다. 멸균에 유용한 조건의 예로는 열 또는 자외선 조사가 포함된다. 본질적으로 모든 수분이 제거되고 화합물을 함유하는 분말이 남을 때까지 배양물을 건조시킬 수 있다. 배양물을 건조시키는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 분무 건조, 동결 건조, 터널 건조, 진공 건조, 및 공기 건조가 포함된다. 이같은 방법의 결과는 본 발명의 화합물이 포함되는 다수의 성분들을 포함하는 혼합물이다. 이같은 혼합물을 식품에 첨가할 수 있다. 식품에 첨가되는 혼합물은 무균성일 수 있다.

또다른 양상에서, 메탄올 추출에 의해 본 발명의 랜티바이오틱이 단리될 수 있다. 랜티바이오틱의 단리 및/또는 정제용으로 당업계에 공지된 방법을 사용하는 추가적인 단리 및/또는 정제에 부가적인 방법들이 사용될 수 있다. 이같은 방법에는 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 예컨대 C18 컬럼을 예를 들어 사용하는 역상 HPLC가 포함되는 컬럼 크로마토그래피가 전형적으로 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 사용될 최적의 조건은 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있다. 정제된 본 발명의 화합물을 공지된 합성 화학 기술을 사용하여 제조할 수 있다.

조성물

본 발명은 조성물을 또한 제공한다. 조성물은 본 발명의 화합물을 포함할 수 있다. 이같은 조성물은 제약상 허용가능한 담체를 임의적으로 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 "제약상 허용가능한 담체"에는 제약상 투여와 혼화성이고 이의 수용자에게 해롭지 않은, 염수, 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균 작용제, 등장성 및 흡수 지연 작용제 등이 포함된다. 조성물 내에 존재하는 화합물은 단리 또는 정제되었을 수 있다. 단리된 화합물은 세포를 건조시킴으로써 단리된 것일 수 있다. 추가적인 활성 화합물이 조성물 내로 또한 혼입될 수 있다.

본 발명의 조성물은 그람 음성 미생물의 외막을 손상시키는 하나 이상의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 하나 이상의 킬레이터, 바람직하게는 금속 킬레이터를 포함할 수 있다. 킬레이터 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)을 랜티바이오틱과 함께 사용하는 것은 일부 랜티바이오틱, 예컨대 나이신의 활성이 단지 그람 양성 미생물인 것에서 그람 음성 미생물을 포함하는 것으로 확장되도록 하는 것으로 공지되어 있다 (Blackburn et al., 미국 특허 5,691,301). 킬레이터를 본 발명의 화합물과 함께 사용하는 것이 화합물이 그람 음성 미생물에 대해 활성인 것에 요구되지는 않는다. 금속 킬레이터의 예로는 천연 및 합성 화합물이 포함된다. 천연 화합물의 예로는 식물 페놀계 화합물, 예컨대 플라보노이드가 포함된다. 플라보노이드의 예로는 구리 킬레이터 카테친 및 나린제닌, 및 철 킬레이터 미리세틴 및 퀘르세틴이 포함된다. 합성 구리 킬레이터의 예로는, 예를 들어, 테트라티오몰리브데이트가 포함되고, 합성 아연 킬레이터의 예로는, 예를 들어, N,N,N',N'-테트라키스 (2-피리딜메틸)-에틸렌 디아민이 포함된다. 합성 철 킬레이터의 예로는 2,2'-디피리딜, 8-히드록시퀴놀린, EDTA, 에틸렌디아민-디-O-히드록시페닐아세트산 (EDDHA), 데스페리옥사민 메탄술포네이트 (데스페롤), 트랜스페린, 락토페린, 오보트랜스페린, 생물학적 철포획제, 예컨대 카테콜레이트 및 하이드록사메이트, 및 시트르산이 포함된다. 바람직하게는, 킬레이터는 EDTA이다.

본 발명의 조성물은 하나 이상의 계면활성제, 바람직하게는 비-이온성 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 비-이온성 계면활성제의 예로는 글리세롤 모노라우레이트, 수크로스 에스테르 예컨대 수크로스 팔미테이스, 폴리소르베이트 20, TRITON X-100, Isoceteth-20, ARLASOLVE 200L, 라우라민 옥시드, 데실폴리글루코스, 인지질 PTC, MEROXAPOL 105 등이 포함된다.

본 발명의 조성물은 정균 및/또는 살균 활성이 있는 또다른 작용제들을 포함할 수 있다. 예로는 라이소스타핀, 바시트라신, 네오마이신, 폴리믹신, 베타-락탐 (페니실린, 메티실린, 목살락탐 및 세팔로스포린, 예컨대 세파클로르, 세파드록실, 세파만돌 나페이트, 세파졸린, 세픽심, 세피네타졸, 세포니오이드, 세포페라존, 세포라니드, 세포탄메, 세포탁심, 세포테탄, 세폭시틴, 세프포독심 프록세틸, 세프타지딤, 세프티족심, 세프트리악손, 세프리악손, 세푸록심, 세팔렉신, 세팔로스포린 C, 세팔로스포린 C 나트륨 염, 세팔로틴, 세팔로틴 나트륨 염, 세팔로틴 2수화물, 세파피린, 세프라딘, 세푸록심악세틸, 로라카르베프 등 포함), 당펩티드, 항균 효소 (항-스타필로코쿠스 효소 예컨대 무타놀라이신, 라이소자임 또는 셀로질 무라미데이스 포함), 항균 항체, 기타 항균 펩티드 예컨대 디펜신, 및 박테리오신 (나이신, 서브틸린, 에피더민, 신나마이신, 듀라마이신, 앙코베닌 및 Pep 5와 같은 기타 랜티바이오틱 포함)이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 일부 양상에서, 조성물이 국소적으로 적용되는 경우에 이러한 작용제들이 특히 바람직할 수 있다.

조성물은 식품에서의 사용에 허용가능한 유기 산, 또는 이러한 산의 염을 함유할 수 있다. 조성물은 개별적인 산 또는 염, 또는 이들의 혼합물을 함유할 수 있다. 조성물에서 사용하기 위한 바람직한 유기 산 또는 염에는 아세트산, 아세트산나트륨, 디아세트산나트륨, 아세트산칼륨, 락트산, 락트산나트륨, 락트산칼륨, 프로피온산, 프로피오네이트 (프로피온산나트륨 및 프로피온산칼륨이 포함되지만 이에 한정되지 않음), 시트르산 또는 이의 염 예컨대 시트르산나트륨 또는 시트르산칼륨, 또는 이들의 조합물이 포함된다.

약학 분야에 공지된 방법에 의해 대상에게 투여하기 위한 조성물이 제조될 수 있다. 일반적으로, 조성물의 의도된 투여 경로와 혼화성인 투약 형태로 조성물이 제형될 수 있다. 투여 경로의 예로는 관류; 비경구, 예를 들어, 정맥내, 피내, 근육내, 피하; 국소, 예를 들어, 점막 (예컨대, 비강, 설하, 질, 협측 또는 직장) 및 경점막; 귀; 및 경구가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 용액 또는 현탁액은 하기의 성분들을 포함할 수 있다: 무균성 희석제, 예컨대 투여용수, 염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항균제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트; 전해질, 예컨대 나트륨 이온, 클로라이드 이온, 칼륨 이온, 칼슘 이온, 및 망간 이온, 및 등장성 조정제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨에 의해 pH가 조정될 수 있다. 조성물을 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰풀, 1회용 주사기 또는 다중 용량 바이알 내에 넣을 수 있다.

조성물은 무균성 수성 용액 (수용성인 경우) 또는 분산액, 및 무균성 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 무균성 분말을 포함할 수 있다. 정맥내 투여를 위해, 적절한 담체에는 생리식염수, 정균수, 또는 포스페이트 완충 염수 (PBS)가 포함된다. 조성물은 전형적으로 무균성이고, 주사용 용도에 적절한 경우에는, 용이한 주사가능성이 존재하는 정도로 유체여야 한다. 이는 제작 및 보관 조건 하에 안정적이어야 하고, 임의적으로는 미생물 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보호되어야 한다. 담체는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적절한 혼합물을 예를 들어 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 임의적인 항균 및 항진균 작용제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 다수의 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알콜 예컨대 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨이 조성물 내에 포함되는 것이 바람직할 것이다. 조성물 내에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 주사용 조성물의 장기 흡수가 달성될 수 있다.

원하는 양의 활성 화합물 (즉, 본 발명의 화합물)을, 필요하다면 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 이의 조합물과 함께, 적합한 용매 내에 혼입시킨 후, 여과 멸균시킴으로써 무균성 용액을 제조할 수 있다. 일반적으로, 활성 화합물을 기본적인 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 기타 성분을 함유하는 무균성 비히클 내로 혼입시킴으로써 분산액이 제조된다. 무균성 주사 용액의 제조를 위한 무균성 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 이전의 무균성-여과 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말이 산출되는 진공 건조 및 동결 건조이다.

경구 조성물은 불활성 희석제 또는 식용 담체를 일반적으로 포함한다. 치료적 경구 투여를 위해, 활성 화합물이 부형제와 혼입되어, 정제 또는 캡슐, 예를 들어, 젤라틴 맵슐의 형태로 사용될 수 있다. 치아세정제로서 사용하기 위한 유체 담체를 사용하여 경구 조성물이 또한 제조될 수 있다. 치아세정제는 액체, 페이스트, 또는 분말, 예컨대 구강세정제 또는 치약일 수 있다. 제약상 혼화성인 결합제가 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 알약, 캡슐 등은 하기의 성분들 중 임의의 것 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대 미세결정질 셀룰로스, 트라가칸트 검 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 전분 또는 락토스, 붕해제, 예컨대 알긴산, 프리모젤(Primogel), 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘 또는 스테로테스(Sterotes); 활택제, 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 풍미제, 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지 향료. 또다른 양상에서, 조성물은 본 발명의 화합물을 발현하는 트랜스제닉(transgenic) 식물일 수 있다.

흡입에 의한 투여를 위해, 활성 화합물이 적절한 추진제, 예를 들어, 하이드로플루오로알칸과 같은 기체, 또는 분무제를 함유하는 가압 용기 또는 디스펜서로부터 에어로솔 스프레이의 형태로 전달될 수 있다.

국소 투여를 위해, 본 발명의 조성물은 국소적으로 적용될 수 있고 피부 및 점막 표면 내로의 균일한 확산 및 흡수를 허용할 다양한 혼합물 및 조합물을 포함할 수 있다. 예로는 스프레이, 미스트, 에어로솔, 로션, 크림, 수성 및 비-수성 용액 또는 액체, 오일, 젤, 분말, 연고, 페이스트, 고약, 에멀션 및 현탁액이 포함된다. 본 발명의 화합물을 국소적인 건조 제형, 액체 제형, 크림 제형 및 에어로솔 제형에서 일반적으로 사용되는 통상적인 제약 또는 약용화장품 희석제 또는 담체와 조합함으로써 국소 제형이 제조될 수 있다. 액체 및 분말 양쪽 모두 스프레이, 미스트 또는 에어로솔로서 전달될 수 있다.

임의의 적절한 분말 기제, 예를 들어, 탈크, 락토스, 전분 등에 의해 분말이 형성될 수 있다. 수성 또는 비-수성 기제로 용액이 제형될 수 있고, 이는 하나 이상의 분산제, 현탁제, 가용화제 등을 또한 포함할 수 있다. 분자량 및 농도 수준이 활성 화합물의 수성 또는 비-수성 용액 또는 현탁액의 점성 용액 또는 콜로이드성 젤을 형성하는데 효과적인 중합체를 사용하여 국소용 젤이 제조될 수 있다. 국소용 젤이 제조될 수 있는 중합체에는 폴리포스포에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 고분자량 폴리(락트)산, 하이드록시프로필 셀룰로스, 키토산, 폴리스티렌 술포네이트 등이 포함된다.

예를 들어, 수성 또는 오일성 기제, 및 적절한 증점제, 젤화제, 안정화제, 유화제, 분산제, 현탁제 또는 조도 조절제 등의 첨가로 연고, 크림 및 로션이 제형될 수 있다. 기제에는 물, 알콜 또는 오일, 예컨대 액체 파라핀, 미네랄 오일, 또는 식물성 오일, 예컨대 땅콩 또는 피마자 오일이 포함된다. 기제의 성질에 따라 사용될 수 있는 증점제에는 연질 파라핀, 스테아르산알루미늄, 세토스테아릴 알콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리포스포에스테르, 폴리(락트산), 하이드록시에틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 셀룰로스 검, 아크릴레이트 중합체, 친수성 젤화제, 키토산, 폴리스티렌 술포네이트, 페트로락툼, 양모지, 수소첨가 라놀린, 밀랍 등이 포함된다.

연고, 페이스트, 크림, 젤 및 로션은 부형제, 예컨대 동물성 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 탈크, 산화아연, 및 이들의 혼합물을 또한 함유할 수 있다. 분말 및 스프레이는 부형제, 예컨대 규산, 수산화알루미늄, 규산칼슘 및 폴리아미드 분말, 또는 이러한 물질들의 혼합물을 또한 함유할 수 있다. 국소 적용을 위한 에어로솔의 제조에서 일상적으로 사용되는 공지된 수단들 중 임의의 것에 의해 용액, 현탁액 또는 분산액이 에어로솔 또는 스프레이로 전환될 수 있다. 일반적으로, 이같은 방법들은 용액, 현탁액 또는 분산액의 용기를 가압하거나 용기에 가압 수단을 제공하고 (일반적으로 불활성 담체 기체 사용), 가압된 기체를 소형 구멍에 통과시키는 것을 포함한다. 스프레이 및 에어로솔은 관습적인 추진제, 예를 들어, 클로로플루오로하이드로카본 또는 휘발성의 치환되지 않은 탄화수소, 예컨대 부탄 및 프로판을 또한 함유할 수 있다.

부형제는 피부 흡수를 촉진하는 화합물, 예컨대 디메틸 술폭시드 (DMSO), 지방산의 부분적인 글리세리드 등을 포함할 수 있다. 부분적인 지방산 글리세리드의 예로는 IMWITOR 742 및 IMWITOR 308이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 국소 제형은 화장용 허용성을 개선시키기 위한 불활성 성분을 또한 임의적으로 포함할 수 있고, 여기에는 보습제, 계면활성제, 향료, 착색제, 연화제, 충전제 등이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

조성물은 분말을 살포하는 것, 에어로솔을 스프레이하는 것, 또는 환자 또는 건강관리 제공자의 손가락 끝, 또는 기타 통상적인 도포 도구 예컨대 면봉 또는 와이프를 사용하여 연고, 크림, 로션, 용액 또는 젤의 필름을 원하는 피부 구역에 도포하는 것에 의해 직접적으로 투여될 수 있다. 먼저 제품을 피부에 도포하고 손가락 끝 또는 도포 도구를 사용하여 확산시킬 수 있거나, 또는 손가락 끝에 도포하고 피부 상에 확산시킬 수 있다. 또한 임의적으로 조성물을 먼저 국소 도포 도구, 예컨대 붕대, 면봉, 습식 직물 또는 부직 와이프 등의 표면 상에 코팅한 후, 이를 조성물을 제공할 피부의 부분에 도포할 수 있다.

활성 화합물은 직장 전달을 위한 좌약 (예를 들어, 통상적인 좌약 기제, 예컨대 코코아 버터 및 기타 글리세리드 사용) 또는 정체 관장의 형태로 또한 제조될 수 있다

신체로부터의 급속한 제거에 대해 활성 화합물을 보호할 담체, 예컨대 제어 방출 제형 (이식물 포함)과 함께 활성 화합물이 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산과 같은 생체분해성, 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 물질들은 상업적으로 또한 수득될 수 있다. 리포솜성 현탁액이 제약상 허용가능한 담체로 또한 사용될 수 있다. 이들은 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.

실시예에서 기술된 랜티바이오틱이 동물 내에 존재하는 동안에 비피도박테리아에 의해 발현되기 때문에, 본 발명의 화합물이 안전하고 동물에서의 사용 (동물이 먹는 식품에서의 사용 포함)에 대해 적절할 것으로 예상된다. 그러나, 이같은 활성 화합물의 독성 및 치료 효능을 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 제약 절차, 예를 들어, LD₅₀ (집단의 50％에 치사성인 용량) 및 ED₅₀ (집단의 50％에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위한 절차에 의해 결정할 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 간의 용량 비율이 치료 지수이고, 이는 LD₅₀/ED₅₀ 비율로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 랜티바이오틱의 독성을 평가하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 일상적이다.

세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 수득된 데이터를 인간이 포함되는 동물에서 사용하기 위한 투여량 범위를 제형하는데 사용할 수 있다. 바람직하게는, 이같은 화합물의 투여량은 독성이 없거나 최소인 ED₅₀을 포함하는 광범위한 혈중 농도 내에 존재한다. 투여량은 사용된 투약 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 변할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 화합물에 대해, 먼저 세포 배양 분석법으로부터 치료적 유효 용량을 추정할 수 있다. 세포 배양에서 결정된 바와 같은 IC₅₀ (즉, 징후의 절반-최대 억제를 달성하는 테스트 화합물의 농도)을 포함하는 농도 범위를 달성하도록 동물 모델에서 용량이 제형될 수 있다. 이같은 정보가 유용한 용량을 더욱 정확하게 결정하는데 사용될 수 있다.

조성물이 제약 용도 또는 개인 관리 용도를 위해 동물에게 투여되는 양상들에서, 조성물은 1회 이상/일 내지 1회 이상/주 (2일에 1번 포함)로 투여될 수 있다. 당업자는 질환 또는 장애의 중증도, 기존의 치료, 대상의 일반적인 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 또다른 질환을 포함하지만 이에 한정되지 않는 특정 인자들이 대상을 효과적으로 치료하는데 필요한 투여량 및 시기결정에 영향을 미칠 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 유효량의 본 발명의 화합물로 대상을 치료하는 것은 단일 치료를 포함할 수 있거나, 바람직하게는, 일련의 치료를 포함할 수 있다.

본 발명은 환자-특이적 투약 형태, 뿐만 아니라 생물테러 공격의 결과로서 병원체에 노출된 집단에서 오염원을 제거하기 위해 사용될 수 있는, 환자-특이적이지 않은 다중 투약 형태 양쪽 모두를 포함한다.

본 발명의 조성물은 본 발명의 화합물을 발현하는 미생물, 예컨대 비피도박테리움을 포함할 수 있다. 본 발명의 화합물을 발현하는 미생물을 포함하는 조성물은, 예를 들어, 당 매트릭스, 지방 매트릭스, 다당류 매트릭스, 또는 단백질 매트릭스 내에 캡슐화될 수 있다. 이는 또한 코팅될 수 있고/있거나 정제 형태로 혼입될 수 있다. 예를 들어, 캡슐화, 코팅, 및 정제 형태로의 혼입은 조성물 내의 미생물의 더 양호한 생존을 허용할 수 있거나, 또는 대장으로의 미생물의 더 양호한 전달을 허용할 수 있다.

본 발명의 화합물을 발현하는 미생물을 포함하는 이같은 조성물은 종종 동물에게 경구 투여된다. 비피도박테리아가 여러 유형의 식품 내로 혼입될 수 있는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 특히, 본 발명의 비피도박테리아는 발효 유제품, 예를 들어, 요거트가 포함되는 고체 및 반고체 유제품 내로 혼입될 수 있다. 유제품의 또다른 예로는 코티지 치즈(cottage cheese), 치즈, 및 분유가 포함된다. 비피도박테리아는 유아용 식품 내로 또한 혼입될 수 있다. 비피도박테리아가 첨가될 수 있는 음료에는 우유, 채소 쥬스, 과일 쥬스, 두유, 발효 두유, 및 과일맛 우유 음료가 포함된다.

사용 방법

본 발명은 본원에 기술된 조성물의 사용 방법에 또한 관련된다. 이 방법은, 예를 들어, 제약 용도, 식품 용도, 개인 관리 용도, 및 프로바이오틱 용도를 포함한다. 이 방법은 미생물 성장을 방지하는 것을 포함할 수 있다. 성장 방지는 본 발명의 화합물의 정균 활성 또는 살균 활성에 기인할 수 있다. 미생물은 그람 양성 또는 그람 음성일 수 있다. 본 발명의 랜티바이오틱에 대해 민감성일 수 있고 억제될 수 있는 그람 양성 미생물의 예로는 스트렙토코쿠스 종, 예컨대 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(S. agalactiae); 엔테로코쿠스 종, 예컨대 엔테로코쿠스 파에칼리스(E. faecalis) 및 엔테로코쿠스 파에시움(E. faecium); 바실루스 종, 예컨대 바실루스 안트라시스(B. anthracis), 바실루스 세레우스(B. cereus), 바실루스 코아굴란스(B. coagulans), 및 바실루스 리케니포르미스(B. hcheniformis); 리스테리아(Listeria) 종, 예컨대 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes); 스타필로코쿠스 종, 예컨대 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus); 스트렙토코쿠스 종, 예컨대 스트렙토코쿠스 아갈락티아에, 스트렙토코쿠스 무탄스(S. mutans), 스트렙토코쿠스 비리단스(S. viridans), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(S. thermophilus), 스트렙토코쿠스 콘스텔라투스(S. constellatus), 및 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스(S. zooepidemicus); 클로스트리디움(Clostridium) 종, 예컨대 클로스트리디움보툴리눔(C. botulinum), 클로스트리디움 디피실레(C. difficile), 클로스트리디움 페르프린젠스(C. perfringens), 클로스트리디움 소르델리이(C. sordellii), 클로스트리디움 테타니(C. tetani), 클로스트리디움 소르델리이, 클로스트리디움 스포로제네스(C. sporogenes), 클로스트리디움 티로부티리쿰(C. tyrobutyncum), 및 클로스트리디움 푸트레파시엔스(C. putrefasciens); 악티노마이세스(Actinomyces) 종, 예컨대 악티노마이세스 이스라엘리이(A. israelii) 및 악티노마이세스 나에슬런디이(A. naeslundii); 레우코노스톡(Leuconostoc) 종; 락토바실루스 종, 마이크로코쿠스(Micrococcus) 종, 마이코박테리움(Mycobacterium) 종, 코리네박테리움(Corynebacterium) 종, 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 종, 페디오코쿠스(Pediococcus) 종, 펩토스트렙토코쿠스(Peptostreptococcus) 종, 스포로락토바실루스(Sporolactobacillus) 종, 브레비박테리움(Brevibacterium) 종, 및 스포로락토바실루스 종이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 랜티바이오틱에 대해 민감성일 수 있고 억제될 수 있는 그람 음성 미생물의 예로는 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 과의 구성원, 예컨대 시트로박터(Citrobacter) 종, 에드워드시엘라(Edwardsiella) 종, 엔테로박터(Enterobacter) 종, 에르위니아(Erwinia) 종, 에쉐리아키아(Escherichia), 예컨대 대장균 (예를 들어, H7:O157), 에윈젤라(Ewingella) 종, 클레브시엘라(Klebsiella), 예컨대 클레브시엘라 뉴모니아에(K. pneumoniae) 종, 플레시오모나스(Plesiomonas), 예컨대 플레시오모나스 시젤로이데스(P. shigelloides) 종, 프로테우스(Proteus), 예컨대 프로테우스 불가리스(P. vulgaris) 종, 프로비덴시아(Providencia) 종, 살모넬라 종, 세라티아(Serratia), 예컨대 세라티아 마르세센스 종, 시겔라(Shigella) 종, 및 예르시니아(Yersinia), 예컨대 예르시니아 엔테로콜리티카(Y. enterocolitica) 및 예르시니아 페스티스(Y. pestis); 비브리오나세아에(Vibrionaceae) 과의 구성원, 예컨대 비브리오 알기놀리티쿠스(Vibrio alginolyticus), 비브리오 콜레라에(V. cholerae), 비브리오 파라하에몰리티쿠스(V. parahaemolyticus), 및 비브리오 불니피쿠스(V. vulnificus); 및 슈도모나다세아에(Pseudomonadaceae) 과의 구성원, 예컨대 슈도모나스 아에루기노사, 슈도모나스 안구일리셉티카(P. anguilliseptica), 슈도모나스 오리지하비탄스(P. oryzihabitans), 슈도모나스 플레코글로시시다(P. plecoglossicida), 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescens) 및 슈도모나스 시린가에(P. syringae)가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 억제될 수 있는 그람 음성 미생물의 또다른 예로는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori); 캄플리오박터(Camplyobacter) 종, 예컨대 캄플리오박터 제주니(C. jejuni), 캄플리오박터 콜라이(C. coli), 및 캄플리오박터 업살리엔시스(C. upsaliensis); 박테로이데스(Bacteroides) 종, 예컨대 박테로이데스 프라길리스(B. fragilis); 푸소박테리움(Fusobacaterium) 종, 예컨대 푸소박테리움 네크로포룸(F. necrophorum), 푸소박테리움 울세르칸스(F. ulcercans), 푸소박테리움 루시(F. russi), 및 푸소박테리움 바리움(F. varium); 렙토스피라(Leptospira) 종; 펙토박테리움(Pectobacterium) 종, 예컨대 펙토박테리움 카로토보룸(P. carotovorum); 파스테우렐라(Pasteurella) 종, 예컨대 파스테우렐라 물토시다(P. multocida), 보렐리아(Borrelia) 종, 레지오넬라(Legionella) 종, 네이사리아(Neissaria) 종, 푸소박테리움 종, 및 아그로박테리움(Agrobacterium) 종이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.

제약 및 개인 관리 용도는, 예를 들어, 미생물 성장을 억제, 바람직하게는 방지하기 위해 동물을 치료하는 방법을 포함한다. 본원에서 사용된 "치료" 및 "치료하는"은 미생물의 존재로부터 초래되는 대상에서의 징후를 방지하거나, 치유하거나, 지연시키거나 이의 중증도를 감소시키기 위한, 및/또는 징후를 야기할 수 있는 미생물에 이미 노출된 대상에서 특정 기간에 걸쳐 징후가 악화되지 않는 것을 초래하기 위한 본 발명의 조성물의 사용을 지칭한다. 치료는 예방적일 수 있거나, 또는 별법적으로 동물이 미생물에 노출된 후에 시작될 수 있다. 예방적 치료는 미생물 성장을 억제, 바람직하게는 방지함으로써, 나중에 대상이 미생물에 노출되는 경우에 용태의 징후를 방지하거나 감소시키기 위한 본 발명의 조성물의 사용을 지칭한다. 예를 들어, 대상이 용태의 징후를 나타내기 전에 시작된 예방적인 치료는 본원에서 용태가 발달될 "위험에 있는" 대상의 치료로 본원에서 지칭된다. 대상이 용태를 야기하는 미생물에 노출된 후에 시작된 치료는 징후의 중증도의 감소 또는 징후의 완전한 제거를 초래할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "징후"는 미생물의 존재에 의해 야기된 용태의 대상에서의 객관적인 증거를 지칭한다. 징후는 미생물에 따라 다를 수 있다. 미생물의 존재에 의해 야기되는 용태의 징후, 및 이같은 징후의 평가는 일상적이고, 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 본 발명은 동물에서의 미생물 감염을 치료하는 방법, 및 미생물에 의해 야기된 용태의 치료 방법에 또한 관련된다. 본원에서 사용된 "미생물 감염"은 미생물에 의한 동물의 해로운 콜로니형성을 지칭한다.

상기 방법들은 유효량의 본 발명의 조성물을 감염 및/또는 미생물에 의해 야기되는 용태의 징후들이 있는 동물에게 투여하는 단계, 및 감염 및/또는 용태의 징후들이 감소되었는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 용태에는 상처 감염, 구취, 충치, 전신 감염, 및 피부 감염이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.

상기 방법들은 본 발명의 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 동물은 척추동물, 더욱 바람직하게는 포유동물, 또는 조류를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 미생물에 의해 야기된 용태에 감수성인 임의의 동물일 수 있다. 포유동물의 예로는 인간; 보비나에(Bovinae) 아과의 구성원, 예컨대 소 및 들소; 카프리나에(Caprinae) 아과의 구성원, 예컨대 양 및 염소; 서스(Sus) 속의 구성원, 예컨대 새끼돼지(pig) 및 돼지(hog); 반려 동물, 예컨대 고양이 및 개; 및 에쿠스(Equus) 속의 구성원, 예컨대 말 및 당나귀가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 새의 예로는 사육용 새 예컨대 칠면조, 닭, 오리, 및 거위가 포함된다. 척추동물의 또다른 예는 어류이다. 본 발명의 조성물이 본원에 기술되고 당업계에 공지된 방법에 의해 동물에게 전달됨으로써, 유효량이 동물에게 제공될 수 있다. 본 발명의 이러한 양상에서, "유효량"은 미생물의 성장의 억제, 용태의 징후들의 발현의 방지, 용태의 징후들의 중증도의 감소, 및/또는 징후들의 완전한 제거에 효과적인 양이다. 임의의 본 발명의 조성물이 모든 미생물의 성장을 완전하게 억제하거나, 또는 치료될 용태의 모든 징후들을 완전하게 치유하거나 제거할 필요는 없다.

음식물 용도에는, 예를 들어, 음식물을 상하게 하는 미생물을 억제하는 것에 의한 음식물 보존이 포함된다. 용어 "음식물" 또는 "식품"은 모든 먹을 수 있는 영양 성분 및 조성물을 포함하고, 여기에는 인간 소비, 뿐만 아니라 예를 들어 가축에 의한 소비용으로 의도되는 것들이 포함된다. "음식물" 및 "식품"은 가공되지 않는 것, 뿐만 아니라 가공된 것, 예를 들어, 조리된 영양 성분 및 조성물, 예컨대 음료를 포함한다. "음식물 내에 존재하는"이라는 표현은 해로운 박테리아에 대해 거주성일 수 있는 음식물의 일부분, 예컨대 외부 표면, 내부 표면, 또는 이들의 조합을 지칭한다.

본 발명의 조성물은 박테리아 성장 또는 분해에 감수성인 식품과 함께 사용될 수 있다. 여기에는 유제품, 과일 및 채소, 과일 및 채소에서 유래된 제품, 곡물 및 곡물에서 유래된 제품, 육류, 가금류, 및 해산물이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 유제품의 예로는 치즈, 우유, 크림, 및 발효 유제품 예컨대 요거트가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 육류의 예로는, 예를 들어, 햄, 소고기, 살라미, 닭, 및 칠면조가 포함되고, 여기에는 전체 부분 또는 이로부터 제조된 가공 육류 제품이 포함된다. 기타 식품에는 즉석 조리 식사물, 앙트레, 및 육류, 델리 샐러드, 마요네즈, 드레싱 (샐러드 드레싱 포함), 소스 및 양념, 파스타, 수프, 식용 오일, 어류 및 어류 제품, 알 제품, 음료, 방부 포장 음식물, 뿐만 아니라 상기의 것들의 혼합물이 포함되는 가공 식품이 포함된다.

본 발명의 조성물은 블렌딩가능한 식품과 혼합되거나 이에 적용됨으로써 사용될 수 있지만, 담구기, 헹구기, 또는 스프레이에 의해 고체 식품의 표면에, 또는 이같은 식품의 내부에의 적용에 의해, 예를 들어 주사에 의해 적용될 수 있다. 조성물은 매리네이드(marinade), 브레딩(breading), 시즈닝 럽(seasoning rub), 글레이즈(glaze), 착색제 혼합물 등으로서, 또는 식품과 혼합되어 식품 내로 혼입될 성분으로서 적용될 수 있다. 또다른 양상에서, 조성물을 식품 포장재, 예컨대 케이싱 또는 필름에 적용한 후, 조성물이 음식물 외부 표면과 접촉하도록 포장재를 음식물 표면에 적용함으로써, 조성물이 간접적으로 음식물 표면과 접촉될 수 있다. 사용될 최적량은 처리될 특정 식품 및 조성물을 음식물 및/또는 음식물 표면에 적용하는데 사용되는 방법에 좌우될 것이지만, 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물의 프로바이오틱 용도에는, 예를 들어, 본 발명의 화합물을 발현하는 미생물, 바람직하게는 비피도박테리움을 식이 보충제로서 또는 음식물 성분으로서 사용하는 것이 포함된다. 식이 보충제로서 비피도박테리아를 사용하는 것은 당업계에 공지되어 있고, 일상적이다. 전형적으로, 본 발명의 화합물을 발현하는 비피도박테리움은 이를 필요로 하는 동물에게 투여된다. 비피도박테리움은 생물학적으로 순수한 배양물로서, 또는 혼합 배양물로서 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 "혼합" 배양물은 비피도박테리움 및 하나 이상의 다른 미생물, 바람직하게는 원핵생물 미생물, 더욱 바람직하게는 제2의 비피도박테리움을 함유하는 것이다.

본 발명의 한 방법은 본 발명의 화합물을 발현하는 비피도박테리움을 동물에게 투여함으로써 동물의 위장관, 바람직하게는 대장에서 미생물의 복제를 억제하는 것을 제공한다. 이 방법은 억제될 미생물이 위장관 내에 존재하는 것을 측정하는 단계를 포함할 수 있고, 이때 비피도박테리움의 투여 후 동물 내의 미생물의 존재가 감소되는 것은 동물의 위장관에서의 미생물의 복제의 억제를 가리킨다.

복제가 억제될 수 있는 미생물의 유형에는 비피도박테리움이 투여될 때 동물의 위장관 내에 존재하는 것들, 및 비피도박테리움이 투여된 후 위장관에 도입되는 미생물이 포함된다. 따라서, 본 발명의 화합물을 발현하는 비피도박테리움은 동물의 위장관 내의 미생물의 확립을 억제하기 위한 방법에서 또한 사용될 수 있다.

또다른 프로바이오틱 용도에는 동물 내에 비피도박테리움 세균총(flora)을 확립하기 위한 방법이 포함된다. 이같은 세균총은 다른 미생물이 자신을 위장관 내에 세균총으로서 확립시키는 능력을 경쟁적으로 억제할 것으로 예상된다. 이 방법은 동물에게 본 발명의 화합물을 발현하는 비피도박테리움을 투여하는 단계를 포함한다. 이 방법은 투여 후에 경시적으로 비피도박테리움의 위장관 내의 존재를 측정하는 단계를 또한 포함한다. 비피도박테리움 세균총은 대변 1 g 당 약 10⁶개 이상의 비피도박테리움이 존재하는 경우에 동물 내에서 확립된 것으로 간주된다. 바람직하게는, 동물은 청년 또는 성인 또는 영아 (미숙아, 조산아 또는 만삭아 포함)이다. 본 방법은 건강한 인간, 및 정상적인 장 세균총이 예를 들어 설사 또는 약물 치료 (항생제 치료법 또는 화학요법)에 의해 변형된 인간에서 비피도박테리움 세균총을 확립하는데 사용될 수 있다.

본 발명이 하기의 실시예에 의해 설명된다. 특정 예, 물질, 양, 및 절차는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 범주 및 취지에 따라 광범위하게 해석되어야 하는 것으로 이해되어야 한다.

[실시예]

실시예 1

비피도박테리아는 주로 모유 수유 영아의 대변에서 이들이 최우선적으로 우세하기 때문에 양호한 장 건강과 관련되는 것으로 종종 제안된다. 그러나, 외인성 비피도박테리아를 사용한 임상 급식 연구는 이들이 장에 잔존하지 않는다는 것을 나타내고, 이는 장의 외부에서 성장되었을 때 이들이 경쟁 적응도를 잃을 수 있다는 것을 시사한다.

비피도박테리아 배양물에서 일어날 수 있는 유전학적 약화의 추가적인 이해를 위해, 본 발명가들은 장 단리물인, 실험실에서 최소 배양 (20세대 미만)된 비피도박테리움 롱검 DJO10A의 완전한 게놈 서열을 수득하였고, 이를 배양물 수집 균주인 비피도박테리움 롱검 NCC2705의 서열과 비교하였다. 이러한 비교에서, 균주 DJO10A 내에 17개의 특이 DNA 영역이, 균주 NCC2705 내에 6개가 존재하는 것을 제외하고, 높은 서열 동일성을 나타낸 공동선형(colinear) 게놈이 밝혀졌다. 이러한 특이 영역들 중 대다수는 다양한 기능의 단백질을 코딩한 한편, DJO10A 게놈으로부터의 8개 및 NCC2705로부터의 1개는 인간 장 환경에 관련되는 다양한 소질, 특히 올리고당류 및 폴리올 활용, 비소 저항성 및 랜티바이오틱 생산에 수반될 것으로 예측되는 유전자 클러스터를 코딩하였다. 이러한 특이 영역들 중 7개는 균주 NCC2705에서 정확하게 결실된 것으로 염기 편차 지수 분석에 의해 제안되었고, 이는 동일한 유전자좌의 NCC2705의 게놈 내에 여전히 잔존하는 영역들 중 하나 내로부터의 DNA 잔여물에 의해 실증된다. 실험실에서의 장 비피도박테리움 롱검의 1,000 세대 동안의 성장으로, NCC2705에 대한 예상 결실 이벤트와 유사하게, 랜티바이오틱 코딩 영역 내의 1개를 포함하여 2개의 대형 결실이 초래되었을 때, 게놈 영역의 이러한 표적화된 손실이 실험적으로 입증되었다. 모의 대변 성장 연구는 클로스트리디움 디피실레 및 대장균에 비해 이러한 결실 균주의 유의한 경쟁력 감소를 나타냈다. 결실된 영역은 게놈 내에서 과다활성인 것으로 실험적으로 실연된 2개의 IS30 요소 사이에 있었다. 또다른 결실된 영역은 이동성 인테그레이스 카셋트 (MIC)로 명명된 이동성 요소들의 신규 클래스에 인접하여, 게놈 결실 이벤트에서의 이러한 요소들의 가능한 역할을 실증하였다.

게놈 영역의 결실 (이동성 요소에 의해 종종 촉진됨)은 비피도박테리아가 매우 신속한 방식 (1,000세대 당 2개의 게놈 결실)으로 발효 환경 및 수반되는 장에서의 가능한 경쟁 능력의 손실에 대해 개조되도록 한다.

결과 및 논의

최소 배양된 비피도박테리움 롱검 균주의 게놈 서열분석. 비교 유전체학(genomics)의 능력은 종이 이의 서식지에서 생존하고 경쟁하는데 중용한 양상들에 대한 식견을 제공할 수 있다. 배양 수집물 균주인 비피도박테리움 롱검 NCC2705의 게놈 서열 ([Schell et al., 2002, Proc Natl Acad Sci USA, 99:14422-14427])이 입수가능하고, 이러한 게놈을 시험관 내에서 신중하게 최소 배양된 균주로부터의 것과 비교하는 능력은 인간 대장으로부터의 이러한 두드러진 종에 중요할 수 있는 양상들에 대한 새로운 식견을 제공할 수 있다. 새롭게 단리되고 최소 배양된 비피도박테리움 롱검 균주들이 특성화되었고, 분석된 모든 배양 수집물 및 시판되는 비피도박테리아에서 약화된 것으로 나타난 특징인 철포획제의 생산을 통해 다른 박테리아를 정균적으로 억제하는 이의 두드러진 능력 (O'Sullivan, 미국 특허 번호 6,746,672)을 기초로 균주 DJO10A가 선택되었다. 따라서, 이러한 균주가 장 내의 이의 기원물로부터 최소로 약화되었을 것 같은 단리물로서 게놈 서열분석용으로 선택되었다. 이러한 균주의 완전한 게놈 서열이 해독되었고, 이는 1개의 원형 염색체 및 2개의 잠적 플라스미드인 pDOJH10L 및 pDOJH10S (기존에 기술됨)로 구성되었다 ([Lee and O'Sullivan, 2006, Appl Environ Microbiol 2006, 72:527-535]).

비피도박테리움 롱검 DJO10A 게놈의 일반적인 특징. 비피도박테리움 롱검 DJO10A의 염색체는 2,375,792 bp를 함유하였고, G+C 함량은 60.15％였으며, 4개의 rRNA 오페론을 함유하는 1,990개의 코딩된 유전자, 58개의 tRNA, 6개의 삽입 서열 (IS) 패밀리, 뿐만 아니라 1개의 프로파지가 있었다 (표 1). 이의 게놈 특성은 이의 프로파지 상에 코딩된 여분의 tRNA_Ser:GCT을 함유한 것을 제외하고는 균주 NCC2705와 유사하였다 ([Ventura et al., 2005, Appl Environ Microbiol 2005, 71:8692-8705]). 코돈 용법 분석은 이러한 tRNA가 프로파지 내의 가장 빈번하게 사용된 tRNA_Ser인 한편, 비피도박테리움 롱검 DJO10A 게놈에 대한 가장 많이 사용된 tRNA_Ser이 아니라는 것을 나타냈고 (표 2), 이는 프로파지 상의 이의 존재에 대한 진화성 선택압을 가리킨다. 양쪽 게놈 모두 모든 아미노산에 대한 tRNA를 함유하였지만, 아스파라긴 및 글루타민 양쪽 모두에 대한 아미노아실-tRNA 신쎄테이스에 대한 상응하는 유전자가 없었고, 이는 많은 다른 박테리아와 유사하게, 이러한 아미노산들을 사용하는 번역에 대한 대안 경로에 대한 의존을 시사한다 ([Skouloubris et al., 2003, Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100:11297-11302], [Min et al., 2002, Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99:2678-2683]). 이러한 대안 경로 양쪽 모두는 gatABC (양쪽 게놈 내에 존재함), 뿐만 아니라 글루타민 및 아스파라긴 대안 번역 경로에서 각각 수반되는 gltX 및 aspS를 수반하여, 이러한 제안된 번역 경로를 실증한다. 흥미롭게도, 비피도박테리움 롱검 게놈은 2개의 IS3-유형 IS 요소 사이에 샌드위치된 역위 반복 및 팔린드롬 구조가 플랭킹(flanking)된 3개의 상이한 인접 인테그레이스로 구성된 신규 이동성 인테그레이스 카셋트 (MIC)를 함유하였다 (도 1). 비피도박테리움 롱검 NCC2705의 게놈의 분석은 균주 DJO10A에 비해 비-선형 방식으로 위치하는 3개의 유사한 MIC 요소를 나타냈고, 이는 이러한 요소들이 실제로 이동성임을 가리킨다 (도 9). 흥미롭게도, 또다른 비피도박테리움 종인 비피도박테리움 아돌레센티스 (GeneBank AP009256), 뿐만 아니라 또다른 장 박테리아인 박테로이데스 (AE015928), 락토바실루스 (CP000033), 및 대장균 (U00096)의 게놈 서열의 분석에서는 MIC 요소들이 드러나지 않았고, 이는 이러한 구조들이 밀접하게 관련된 비피도박테리아의 부분집합에 특이할 수 있음을 시사한다.

복제 기원 및 말단의 구성. oriC 및 terC 가 균주 DJO10A의 게놈 및 균주 NCC2705의 개정된 게놈 서열 내의 동일한 위치에서 발견되었다 (도 9). 이러한 영역들은 양쪽 게놈 내에서 매우 고도로 보존되고 (99.9％를 초과하는 동일성), 3개의 oriC 클러스터 및 terC (다른 박테리아 게놈들로부터의 예상 복제 영역과 일치함)로 구성되었다 ([Mackiewicz et al., 2004, Nucleic Acids Res 2004, 32:3781-3791]). 그러나, 양쪽 게놈 내의 관찰된 oriC 영역의 위치는 헬리코박터 파일로리 26695 게놈에서 기존에 나타난 특색인 게놈 비대칭을 기초로 하는 예상되는 위치와 약간 상이하였다 ([Mackiewicz et al., 2004, Nucleic Acids Res 2004, 32 :3781-3791], [Zawilak et al., 2001, Nucleic Acids Res 2001, 29:2251-2259]). 다중 oriC 클러스터뿐만 아니라, 서열분석된 게놈 대다수와 일관적인 7개의 상이한 유형의 DnaA 상자가 있고, 이들은 염색체 복제의 개시를 제어하는데 수반되는 것으로 제안되었다 ([Mackiewicz et al., 2004, Nucleic Acids Res 2004, 32:3781-3791]).

제한 및 변형 (R-M) 시스템. R-M 시스템이 박테리아에 부여하는 보호 역할을 고등 생물의 면역 시스템과 비교하였다 ([Price and Bickle, 1986, Microbiol Sci 1986, 3:296-299]). 수많은 박테리아 내에 이러한 시스템이 존재하는 것은 자연에서의 박테리아 생존을 위한 이의 중요한 역할을 증명한다. 비피도박테리움 롱검 게놈 양쪽 모두가 제I형 및 2개의 제II형 R-M 시스템을 코딩하고, 이들은 고도로 보존되었다 (도 10). 이들은 메틸화 DNA (일반적으로 HhaII 또는 PstI 메틸화 DNA)를 제한하는 것으로 예상되는 Mrr 시스템을 또한 함유하였고, 이는 양쪽 균주들 간에 100％ 보존되었다 (도 10A). Mrr과 제I형 R-M 시스템의 클러스터링은 대장균 K12 (GenBank U00096)과 유사하였다. 2개의 균주 내의 HsdS 단백질 간의 낮은 동일성 (40％)은 아마도 이들의 진화적 분기 후의 이러한 균주들에서의 이러한 제I형 R-M 시스템의 독립적인 진화를 반영할 것인데, 이러한 시스템들이 이들의 특이성 성분 (HsdS)을 변화시켜 상이한 서열을 인식할 수 있게 함으로써 진화하기 때문이다. 이는 IS256 삽입 이벤트에 의해 불활성화된 hsdS 유전자의 존재에 의해 실증되고, 이러한 파괴된 유전자의 양쪽 부분은 훨씬 더 높은 보존을 나타내어, 진화적 분기 이전에 삽입 이벤트가 일어났음을 시사하였다 (도 10A). 균주 DJO10A 내의 이러한 유전자좌 상류에, 또다른 제한 유전자인 McrA (HpaII 또는 SssI에 의해 메틸화되는 DNA를 제한함)가 존재하고, 이는 NCC2705에는 존재하지 않았다. 양쪽 균주 내의 보존된 제II형 R-M 시스템은 매우 빈번하게 발생하는 부위에서 DNA를 제한하는 Sau3AI 및 EcoRII의 아이소스키조머(isoschizomer)였다 (도 10B 및 10C). 이는, 존재하는 제한 시스템의 범위와 함께, 이러한 박테리아 내로의 외래 DNA의 유입을 제한하는, 따라서 현재까지 비피도박테리아에 대해 보고된 매우 낮은 전기천공 빈도를 설명하는 인자일 수 있다.

비피도박테리움 롱검 균주 내의 특이 게놈 영역. 비피도박테리움 롱검 DJO10A의 게놈 서열과 균주 NCC2705의 게놈 서열의 정렬은, 이동성 IS 및 MIC 요소를 제외하고는, 이들이 고도로 보존되고 공동선형이라는 것을 설명하였다 (도 9). 또한 균주 NCC2705 내에 명백한 게놈 감소가 있었고, 이는 후속 결실 전에 수평 유전자 전달 기회 및 과다한 유전자 축적 돌연변이 없이 안정적인 환경에서 성장 중인 미생물에 대한 기존의 관찰과 일치한다 ([Nilsson et al., 2005, Proc Natl Acad Sci USA 2005, 102:12112-12116]). 2개의 게놈 간에 10 bp를 초과하는 특이 서열이 248개 있었고, 이때 이들 중 대다수는 짧고, 유전자를 거의 코딩하지 않았다. 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 임상 단리물 및 실험실에서 수십년 동안 대규모로 계대된 것의 게놈이 크기가 2배인 게놈에서 오직 86개의 이같은 영역만을 나타낸 것을 가정했을 때, 2개의 균주 간의 이러한 다수의 특이 서열은 뜻밖이었다 ([Fleischmann et al., 2002, J Bacteriol 2002, 184:5479-5490]). 기능성 또는 가설 유전자를 코딩하고 크기가 3.0 내지 48.6 kb 범위인 23개의 더 큰 특이 영역이 있었고, 이때 균주 DJO10A 내에 존재하는 이러한 특이 영역들 중 17개는 219개의 예상 유전자를 코딩하였고, NCC2705 내의 6개의 특이 영역은 84개의 유전자를 코딩하였다 (도 2A). 이러한 특이 영역들은 기존에 종내(intraspecies) 변이의 영역과 관련된 oriC 및 terC 주변에 클러스터링되지 않았다 ([Berger et al, 2007, J Bacteriol 2007, 189:1311-1321], [Molenaar et al., 2005, J Bacteriol 2005, 187:6119-6127]).

각각의 게놈 내의 1개의 특이 영역은 프로파지에 상응한다. 말단 절단된 균주 NCC2705 내의 프로파지는 염기 편차 지수 (BDI) 피크 (도 2A)와 일치하지 않기 때문에 게놈의 장기 거주물인 것으로 보이는데, 이는 이러한 분석은 최근의 수평 유전자 전달 (HGT) 이벤트를 예측하기 때문이다. 이는 균주 DJO10A의 게놈에서 상이한 프로파지로 교체된 것으로 보이고, 교체된 프로파지는 완전하고 유도성이며 ([Lee and O'Sullivan, 2006, Appl Environ Microbiol 2006, 72:527-535]), 이러한 최근의 HGT 이벤트를 실증하는 유의한 BDI 피크와 일치한다. 균주 NCC2705 내의 나머지 5개의 특이 영역은 주로 가설성인 유전자 또는 어떠한 유의한 유전자 클러스터도 없는 다양한 기능의 유전자를 함유하였다. 그러나, 이러한 영역들 중 하나 (특이 영역 4')는 대장에서의 경쟁에 중요할 것으로 예측되는 기능인 추정 자일란 분해 유전자를 코딩하였다. 이러한 영역이 BDI 피크에 일치하기 때문에, 이는 이러한 균주에 의한 최근의 획득일 수 있고, 대장에서의 이의 진화는 이러한 특이 영역을 획득하기 위한 선택압을 제공할 것임이 시사된다. 균주 DJO10A 내의 또다른 16개의 특이 영역 중에서, 8개는 대장에서의 경쟁에 중요할 것으로 예측되는 기능, 특히 올리고당류 및 폴리올 활용, 비소 저항성 및 랜티바이오틱 생산에 수반되는 유의한 유전자 클러스터를 코딩하였다.

올리고당류 및 폴리올 활용. COG 기능 분류 ([Tatusov et al., 2000, Nucleic Acids Res 2000, 28:33-36])에 따르면, 예상 기능이 있는 균주 DJO10A 내의 특이 유전자들 중 가장 많은 수가 탄수화물 대사 [G] 카테고리에 속했다 (표 3). 흥미롭게도, 탄수화물 대사 카테고리 내의 특이 유전자 대부분은 대장 내의 미생물이 이용가능한 주요 탄화수소 공급원인 올리고당류 활용에 수반되었다. 전부 11개의 올리고당류 활용 유전자 클러스터가 균주 DJO10A 내에 존재하였고, 이중 5개가 균주 NCC2705 내에 완전하게 존재하였고, 2개가 부분적으로 존재하였다 (도 11). 이러한 클러스터들 중 하나 (도 11의 클러스터 7)가 균주 DJO10A 내의 여분의 올리고당류 활용 유전자의 정확한 위치에서 NCC2705 게놈 내에 ISL3 요소를 함유한다는 것이 주목할 만하였다 (도 3). BDI 분석은, 어느 것도 BDI 피크와 일치하지 않았기 때문에, 균주 DJO10A 내의 여분의 올리고당류 유전자 클러스터가 균주 NCC2705로부터의 진화적 분기 후에 획득되지 않았음을 시사하였다 (도 2A). 최근의 HGT 이벤트를 시사하는 BDI 피크의 대부분이 양쪽 게놈에서 동일하여, 이러한 분석을 실증하였다. 이는 발효 환경에 대한 균주 NCC2705의 개조 동안 올리고당류 활용 유전자를 코딩하는 6개의 특이 영역 6, 9, 10, 11, 15 및 17가 균주 NCC2705에서 손실되었을 것임을 시사할 것이다. 균주 NCC2705로부터의 이러한 특이 영역들의 손실에 대한 추가적인 증거가 NCC2705 내의 이러한 유전자좌에서 잔류하여 남아 있는 특이 영역 1 내의 ushA 유전자로부터의 361 bp의 DNA 잔여물 (98％ 동일성)으로부터 나타났다 (도 2B).

폴리올은 인간에 의해 소화될 수 없고, 이의 대사는 인간 대장에서의 박테리아 경쟁에 중요한 것으로 여겨지며, 이의 섭취는 비피도박테리아 수의 증가에 연루되었다 ([Gostner et al,. 2006, Br J Nutr, 95:40-50]). 균주 NCC2705는 폴리올 대사에 수반되는 유전자를 함유하지 않는 한편, 폴리올 인식, 수송 및 탈수에 수반되는 유전자들을 함유하는 균주 DJO10A 내의 특이 영역 13이 이에 헌신하고 (도 4), 특이 영역 11 내에도 약간의 폴리올 대사 유전자가 있었다. 특이 영역 13이 BDI 피크와 일치한다는 것을 고려할 때 (도 2A), 이는 균주 DJO10A에 의한 유전자 획득을 나타낼 수 있다. 흥미롭게도, 유사한 폴리올 유전자좌가 비피도박테리움 아돌레센티스 ATCC 15703에서 유사한 게놈 위치에서 발견되었다 (도 4).

비소 저항성. 균주 DJO10A 내의 또다른 특이 영역들은 인간의 장에서의 생존 및 경쟁에 중요할 특성들에 수반되는 것으로 예측되는 유전자 클러스터들을 코딩하였다. ATP-의존적 비소 저항성 유전자를 코딩하는 2개의 오페론이 특이 영역 5 및 7 내에 있었고, 인간의 장이 식이로부터의 낮은 농도의 비소를 함유하기 때문에 이는 장 생존에 중요할 수 있다 ([Ratnaike 2003, Postgrad Med J 2003, 79:391-396]). 다수의 장 박테리아 예컨대 대장균, 락토바실루스 및 박테로이데스가 비소 저항성 유전자를 함유하여 (도 5A), 장에서 이러한 능력이 있는 것의 경쟁 우위를 실증하였다. 이러한 비소 저항성 유전자를 함유하는 특이 영역 5 및 7이 BDI 피크에 일치하지 않기 때문에 (도 2A), 이는 균주 DJO10A가 이들을 최근에 획득하지 않았을 수 있고, 균주 NCC2705에서 손실되었음을 시사한다. 순수-배양 발효 환경에 대한 개조로 비소 저항성의 손실이 초래될 수 있다는 이러한 이론이 발효 개조 비피도박테리움 단리물 (비피도박테리움 애니말리스 아종 락티스 BB12)보다 2,000％ 더 크고 대장균 K12보다 100％ 더 큰 균주 DJO10A의 예외적인 비산염 저항성에 의해 추가로 실증되었다 (도 5B). 이는 이러한 표현형이 장 단리물에 대해 경쟁 우위이지만, 순수-배양 발효 환경에 대해 유의하지 않다는 것을 시사할 것이다.

랜티바이오틱 생산. 항균 펩티드, 또는 박테리오신의 생산은 천연 환경에서의 박테리아 경쟁에 대한 중요한 특징이다. 박테리오신의 한 예외적으로 광범위한 스펙트럼 클래스는 랜티오닌 잔기를 형성하도록 번역 후에 변형되고 현재까지 어떠한 비피도박테리아로부터 단리되지 않은 랜티바이오틱이다. 랜티바이오틱을 가리키는 모든 유전자를 코딩하는 10.2 kb 유전자 클러스터가 균주 DJO10A의 특이 영역 12에서 검출되었다 (도 6A). 이러한 특이 영역이 BDI 피크에 일치하지 않았음이 또한 주지되었고, 이는 균주 NCC2705로부터 이러한 영역이 아마도 손실되었음을 시사한다. 랜티바이오틱 생산은 장에서의 미생물 경쟁에 매우 유리할 것이지만, 순수 배양물 내의 미생물에게는 유용하지 않을 것이기 때문에, 이는 균주 NCC2705로부터의 이러한 특이 영역 12의 손실에 대한 선택압을 제공한다.

발효 환경에서의 비피도박테리움 롱검의 게놈 약화. 균주 NCC2705에서 손실된 것으로 예측되는, 균주 DJO10A의 게놈 내의 다수의 특이 DNA 영역을 고려할 때, 이는 유용하지 않은 DNA 영역의 결실이 인간의 대장 내에 존재하는 것보다 새롭고 매우 상이한 환경에 대한 비피도박테리움 롱검의 신속한 개조를 반영할 수 있다는 것을 시사한다. 이는 상승된 돌연변이 빈도를 시사할 것이다. 균주 DJO10A와 NCC2705 간의 비교 뉴클레오티드 치환 분석은 대다수의 유전자들이 고도로 보존된다는 것을 나타냈고 (도 12), 이는 2개의 밀접하게 관련된 균주로 예상된 대로이다. 그러나, 52개의 가장 덜 보존된 유전자들 (도 12에서 '양성 선택'으로 열거됨)의 분석은 하나의 균주 또는 또다른 균주에 기여할 수 있는 돌연변이 (프레임 이동, 결실, 삽입 및 정지 돌연변이) 중에서, 11개는 균주 NCC2705로부터의 것이고, 3개는 균주 DJO10A로부터의 것임을 가리켰다 (표 4). 균주 NCC2705에서의 증가된 돌연변이 빈도의 추가적인 실증이 2개의 균주 간의 표면 단백질 유사체를 코딩하는 유전자 비교로부터 나타났다. 세포 표면 고정 단백질의 한 클래스의 서명인 LPXTG 모티프에 대한 DJO10A 게놈의 검색으로 4개의 잠재적인 단백질이 발견되었고, 이러한 단백질들 (BLD1468, BLD1511, BLD1637 및 BLD1638)의 SignalP 분석에서 각각의 경우에서의 신호 서열의 존재가 확증되었다 (도 13 추가 파일 10). 추가적으로, 이러한 4개의 단백질의 BLASTP 분석은 이들이 LPXTG 모티프를 함유하는 또다른 공지된 표면 단백질과 매우 유사하다는 것을 나타냈다. NCC2705는 이러한 유전자 상동체 중 3개 (BLD1468, BLD1637 및 BLD1638)를 나타냈고, BLD1511에 대해 99％ 아미노산 동일성을 나타내는 예상 단백질이 있었지만, 유전자의 3' 말단에서의 ISL3 삽입으로 인해 LPXTG 모티프가 손실되었다. 이는 인간의 장으로부터 순수-배양 발효 환경 내로 제거되었을 때 비피도박테리아의 신속한 진화 상태를 추가로 강조하였다.

비피도박테리움 롱검 게놈에서의 IS30 '점핑'. 일부 IS30 요소의 위치를 제외하고는 모든 것이 동일하였다는 DNA의 여러 뱃치로부터의 게놈 서열분석 동안의 흥미진진한 관찰에 의해 발효 환경 내의 비피도박테리움 롱검 세포 내의 동적 환경이 추가로 실증되었다 (도 7A). 세포 내에서의 IS 요소의 이러한 매우 신속한 이동은 기존에 관찰되지 않았다. 게놈 내에서의 IS30의 이동은, 이의 삽입 표적 특이성과 일관되게, 특이적 부위에서만 발생하였다 ([Olasz et al., 1998, Mol Microbiol 1998, 28:691-704]).

순수-배양 환경에 대한 비피도박테리움 롱검 DJO10A의 개조. 장과 같은 가변성이고 복합적인 환경으로부터 비교적 안정적이고 단순화된 순수-배양 환경으로의 전환이 과다 IS30 활성 및 새로운 환경에 더 이상 이롭지 않은 영역의 신속한 DNA 손실을 초래한다는 가설을 테스트하기 위해, 균주 DJO10A를 pH 제어 없이 전형적인 실험 배지에서 약 1,000세대 동안 성장시켰다. 그후, 단리된 콜로니를 인간의 장에서의 생존에 유용할 것으로 예측되는 기능들을 코딩하는 7개의 특이 영역에 대해 스크리닝하였다. 랜티바이오틱 생산에서 수반되는 이러한 영역들 중 하나 (12번)가 단리물의 40％에서 손실되는 것으로 발견되어 (도 14), 이러한 가설을 실증하였다. 이러한 개조된 균주 DJO10A-JH1의 분석은 균주 NCC2705와 매우 유사하게 결실이 전체 랜티바이오틱 영역 너머로 확장되었음을 나타냈다 (도 6A). 펄스 필드 젤 전기영동 (PFGE)을 사용하여, 이러한 영역을 함유하는 39.9 kb XbaI 밴드가 균주 DJO10A-JH1에서 손실되었음이 추가로 주지되었다 (도 6B). 배양물의 40％에서의 완전한 랜티바이오틱 유전자 클러스터의 손실이 흥미로웠는데, 이는 클러스터가 세포를 랜티바이오틱 활성으로부터 보호하는 면역 유전자를 또한 코딩하기 때문이다. 그러나, 균주 DJO10A에 의한 랜티바이오틱 생산의 분석은 브로스 배지에서의 성장 동안 아무 것도 발생하지 않았고, 스트렙토코쿠스 파이오제네스(Streptococcus pyogenes)로부터의 스트렙틴 생산 ([Wescombe and Tagg, 2003, Appl Environ Microbiol 2003, 69:2737-2747])과 유사하게, 한천과 같은 고체 표면이 생산에 필요하였음을 나타냈다 (도 6C). 완전한 랜티바이오틱 유전자 클러스터의 손실은 균주 DJO10A-JH1가 광범위한 스펙트럼의 박테리아에 대해 또한 활성인 이러한 프로네이스-E 민감성 랜티바이오틱에 민감성이도록 하였다 (도 6C). 흥미롭게도, 순수-배양 환경에 대한 균주 DJO10A의 개조 동안 결실된 랜티바이오틱 게놈 영역이 2개의 IS30 요소 사이에 위치하여, 게놈 결실 이벤트에서의 이의 역할을 시사하였다.

순수-배양 개조 균주 DJO10A-JH1에서 140.7 kb XbaI 밴드가 또한 손실되었음이 또한 주지되었다 (도 6B). 이러한 밴드가 4개의 MIC 요소 중 하나를 함유하여, 이것이 수반되었을 수 있었음을 시사하는 것이 흥미로웠다. 이러한 MIC 요소에 바로 인접하는 유전자좌의 PCR 분석은 결실이 이러한 요소로부터 직접적으로 하류의 10 kb 내지 50 kb 사이에 확장되었음을 드러내어, 이러한 결실 이벤트에서의 이의 역할 가능성을 실증하였다. 이는 이러한 박테리아에 의한 진화성 개조 동안의 신속한 DNA 손실 및 이동성 요소의 두드러진 역할을 추가로 실증하였다.

균주 DJO10A 및 DJO10A-JH1의 서던 혼성화에서 순수-배양 환경에서의 성장 동안의 IS30 '점핑'이 실증된 한편, 다른 IS 요소들 (IS21, IS256 및 ISL3)의 위치는 안정적으로 남아 있었다 (도 7B). 비피도박테리움 롱검 게놈에서의 이러한 IS30 과다활성은 새로운 환경에 대한 개조 동안 결실 이벤트 및 게놈 감소에서 중요한 역할을 할 수 있다.

개조된 비피도박테리움 롱검 균주 DJO1A-JH1의 경쟁 '적응도'. 발효 조건에서의 순수-배양 성장 동안 비피도박테리움 롱검 DJO10A이 경험하는 신속한 게놈 감소는 손실된 게놈 영역이 장에서의 경쟁에 중요할 수 있었음을 시사하였다. 이러한 시험관내 개조가 균주의 '적응도'에 영향을 미쳤는지를 테스트하기 위해, 모의 대변 경쟁 접근법이 개발되었다. 비피도박테리아는 장 환경 내의 클로스트리디아(Clostridia) 및 엔테로박테리아에(enterobacteriae)의 구성원에 대해 성공적으로 경쟁하는 것으로 종종 제안된다. 이러한 박테리아 군 양쪽 모두의 구성원을 선택하여, 비피도박테리움 롱검 DJO10A 및 이의 시험관내 개조 유도체인 균주 DJO10A-JH1의 상대적인 경쟁력을 테스트하였다. 선택된 경쟁물 균주가 어떠한 방식으로도 약화되지 않았음을 확실히 하기 위해, 새로운 단리물이 선별 배지 상에서의 플레이팅에 의해 신선한 대변으로부터 수득되었고, 16S rRNA 유전자의 서열 분석을 사용하여 종분화되었다. 이에 의해 클로스트리디움 디피실레 DJOcd1 및 대장균 DJOec1이 단리되었고, 이들을 비피도박테리움 롱검 균주와의 대변 경쟁 실험 전에 최소로 배양하였다. 시험관내 성장 속도 분석으로, 대장균 DJOec1의 성장 속도가 가장 빠르고, 클로스트리디움 디피실레 DJOcd1, 비피도박테리움 롱검 DJO10A-JH1 및 비피도박테리움 롱검 DJO10A이 뒤를 이었음이 확립되었다 (도 15). 균주 DJO10A와 비교하여 비피도박테리움 롱검 DJO10A-JH1의 눈에 띄는 증가된 성장 속도는 시험관내 성장 환경에서 선호되는 균주 DJO10A-JH1의 게놈 감소를 실증하였다.

모의 혐기성 대변 환경에서의 대장균 DJOec1 및 클로스트리디움 디피실레 DJOcd1 양쪽 모두를 사용한 경쟁 성장 실험에서, 대장균 및 클로스트리디움 디피실레 양쪽 모두에 비해 비피도박테리움 롱검 DJO10A의 경쟁력이 유의하게 더 컸음이 드러났다 (도 8). 비피도박테리움 롱검 DJO10A에 의한 박테리아의 양쪽 모두의 이러한 군에서의 유의하게 더 큰 감소는 순수-배양 성장에서 나타난 게놈 감소가 박테리아가 자신의 원래 환경에서 경쟁하는 능력을 손상시킬 수 있다는 게놈 분석 가설을 지지한다.

모의 대변 경쟁 연구는 랜티바이오틱 코딩 게놈 영역이 인간의 장에서의 경쟁에 중요하였음을 시사하였지만, 장 모델에서의 생체내 연구가 이러한 가설을 입증하기 위해 필요할 것이다.

방법

박테리아 균주 및 성장 조건. 비피도박테리움 롱검 균주 DJO10A가 건강한 청소년의 대변으로부터 단리되었고 ([Islam, 2006, MS thesis. University of Minnesota, Department of Food Science and Nutrition]), 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 BB12가 Chr. Hansen (Denmark)으로부터 수득되었다. 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 균주 S1, S2, 및 S14는 발효 음식으로부터의 유전학적으로 별개인 단리물들이다. 클로스트리디움 디피실레 DJOcd1이 클로스트리디움 디피실레 선별 한천 (BD Diagnostics) 상에서의 플레이팅에 의해 신선한 대변으로부터 수득되었고, 이의 16S rRNA 유전자의 서열 분석을 사용하여 종분화되었다. 대장균 DJOec1이 MacConkey 한천 (Difco) 상에서의 플레이팅에 의해 신선한 대변으로부터 수득되었고, 이의 16S rRNA 유전자의 서열 분석을 사용하여 종분화되었다. 대장균 K12가 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC)으로부터 수득되었다. 비피도박테리아를 BBL 혐기성 시스템 (BBL) 또는 Bactron II 혐기성/환경 챔버 (Sheldon Manufacturing)를 사용하여 혐기성 조건 하에 37℃에서 0.05％ L-시스테인ㆍHCl (Sigma)이 보충된 MRS (Difco), 비피도박테리아 로우-아이언(Low-Iron) 배지 (BLIM) ([Islam, 2006, MS thesis. University of Minnesota, Department of Food Science and Nutrition]), 또는 비피도박테리아 발효 배지 (BFM) (2％ 프로테오스 펩톤, 0.15％ K2HPO4, 0.15％ MgSO4ㆍ7H2O, 0.5％ D-글루코스)에서 배양하였다.

게놈 서열분석 및 조립. 전체-게놈 샷건(shotgun) 서열분석이 미국 에너지부 연합 게놈 연구소 (JGI)에서 수행되었다. Phred/Phrep/Consed 소프트웨어를 사용하여 서열들이 227개의 컨티그(contig)로 조립되었고, 서열 커버리지(coverage)는 9.2배였다. ThermoFidelase-Fimer의 직접적인 게놈 서열분석 기술을 사용하여 피델리티 시스템(Fidelity System)에서 갭 폐쇄 및 게놈 서열 피니싱(finishing)을 수행하였다 ([Slesarev et al., 2002, Proc Natl Acad Sci USA, 99:4644-4649]). A5, A6 및 A7 유전자좌를 커버하는 IS30 요소가 있는 또는 없는 샷건 판독물이 확인되어 따로따로 조립되었다. 게놈 DNA 샘플 내의 긴 반복 서열의 존재 및 위치가 특이/반복 접합부의 직접적인 게놈 서열분석에 의해 입증되었다. 가닥 변위 역량이 증가된 하이브리드 TopoTaq DNA 중합효소로 증폭된 PCR 생성물을 서열분석함으로써 가장 복합적인 높은 GC-풍부 반복물이 해상되었다.

생물정보학(Bioinformatic) 분석. 모든 예상 유전자의 수동 점검 전에, 모든 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 Glimmer, GeneMark, JGI 주석 도구 및 GAMOLA ([Altermann et al., 2003, OMICS 2003, 7:161-169])를 사용하여 주석을 달았다. MUMmer3, ACT4 및 ClustalX를 사용하여 2개의 비피도박테리움 롱검 게놈의 비교 분석을 수행하였다. OriLoc ([Frank and Lobry, 2000, Bioinformatics 2000, 16:560-561])을 사용하여 복제 기원 및 말단을 예측하였다. 일반적인 코돈 용법 분석 (GCUA) 프로그램 ([McInerney 1998, Bioinformatics 1998, 14:372-373])을 사용하여 코돈 용법을 분석하였다. Artemis8의 척도화 χ2 분석에 의해 염기-편차 지수 (BDI)를 수행하였다. 유전자 기능을 예측하기 위해, GAMOLA 및 InterProScan의 2개의 보존된 단백질 도메인 데이터베이스를 사용하였다. COG 기능 카테고리가 양쪽 비피도박테리움 롱검 게놈 서열 내의 모든 유전자의 기능 분류에 사용되었다.

분자 기술. Big-Dye 종결물 및 ABI Prism 3730x1 자동 서열분석기 (Applied Biosystems)를 사용하여 일반적인 서열분석을 수행하였다. 모든 PCR 프라이머들이 표 5에 열거된다. 특이 영역 12의 서던 블롯 분석을 위해, lanM 유전자로부터의 646 bp 프로브가 LANT-F 및 LANT-R 프라이머로의 PCR을 사용하여 수득되었다. IS 요소에 대한 프로브가 또한 PCR에 의해 증폭되었다. 제조업자의 지시 (Roche)에 따라, 프로브들을 DIG로 표지하고, 소화된 게놈 DNA와 혼성화시켰다. XbaI-소화 비피도박테리움 롱검 게놈의 펄스 필드 젤 전기영동을 제조업자의 지시 (Bio-Rad)에 따라 CHEF-DR III 가변각 펄스 필드 젤 전기영동 시스템을 사용하여 수행하였다.

2개의 비피도박테리움 롱검 게놈들 간의 유전자 상동체의 확인. 네이 및 고조보리 (Nei & Gojobori)의 알고리즘 ([Nei and Gojobori, 1986, Mol Biol Evol 1986, 3:418-426])에 의한 비교 뉴클레오티드 치환 분석을 사용하여, 유전자 상동체를 확인하였다. 양쪽 게놈 서열의 예상 유전자들을 NCBI 툴키트 내의 BlastN 프로그램을 사용하여 비교하였고, 1,590개의 정렬된 유전자들이 네이(Nei)의 비-가중 방법 1 ([Nei and Gojobori, 1986, Mol Biol Evol 1986, 3:418-426])에 의한 뉴클레오티드 치환 분석용으로 사용되었다. dN:dS의 비율에 따라, 모든 매칭된 유전자들을 고도로 보존됨 (< 0.035), 정상, 및 양성 선택 (> 1)의 3개의 군으로 분류하였다.

비소의 최소 억제 농도. 비소의 최소 억제 농도를 결정하기 위해, BLIM에 여러 농도의 아비산나트륨 (AsO2-, 1 내지 100 mM) 및 비산나트륨 (AsO3-, 1 내지 500 mM)을 보충하였다. 신선하게 성장된 배양물을 아비산염/비산염 배지 내로 하위-접종하고, 혐기성으로 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다.

시험관내 발효 조건에 대한 비피도박테리움 롱검 DJO10A의 개조. 비피도박테리움 롱검 DJO10A을 BFM에서 연속적으로 약 1000세대까지 성장시켰다. 그후, 배양물을 단계 희석하고, BFM 한천 상에 플레이팅하였다. 10개의 콜로니를 분석용으로 무작위로 선별하였다.

균주 DJO10A-JH1에서의 결실의 지도작성. 비피도박테리움 롱검 DJO10A-JH1 게놈 내의 랜티바이오틱 오페론의 결실의 정확한 위치를 발견하기 위해, PCR을 사용하여 랜티바이오틱 오페론 내의 여러 유전자를 테스트하였다. 2개의 프라이머 F3 (위치 1,974,570-1,974,587 bp) 및 R3 (위치 1,996,024-1,996,005 bp)을 사용하여, 결실에 스패닝(spanning)되는 약 1.8 kb 영역을 증폭시켰고, 서열분석에서 정확한 경계의 위치가 정해졌다 (도 6). 140.7 kb XbaI 단편 내의 결실의 위치의 지도를 작성하기 위해, 프라이머 MIC-F1 (위치, 1,539,767-1,539,768) 및 MIC-R1 (위치, 1,542,535-1,542,553)을 사용하여 MIC III의 상류 영역을 증폭시켰고, 프라이머 MIC-F2 (위치, 1,543,406-1,543,424) 및 MIC-R2 (위치, 1,545,713-1,545,732)를 사용하여 하류 영역을 증폭시켰다.

랜티바이오틱 활성의 생물학적 분석법. 비피도박테리움 롱검 DJO10A을 MRS 한천 플레이트의 중심 내로 접종하였고, 혐기성으로 37℃에서 2일 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 1％의 지표 균주를 함유하는 동일한 배지의 용융 0.5％ 탑 한천을 플레이트 상에 중층시키고 나서 인큐베이션하였다.

비피도박테리아의 모의 대변 경쟁 분석. 야생형 비피도박테리움 롱검 DJO10A의 경쟁 '적응도'를 이의 시험관내 개조 유도체 균주 DJO10A-JH1과 비교하여 평가하기 위해, 모의 시험관내 대변 시스템이 개발되었다. 각각의 균주에 대해 삼중 실험이 사용되었다. 각각의 실험을 혐기성 챔버 내의 10 g의 살균 대변에서 수행하였고, 여기에 0.38 g의 강화 클로스트리디움 배지 (RCM) 및 0.02 g 뮤신 (돼지 위장 제III형)을 첨가하였다. 2개의 경쟁물 박테리아를 대장균 DJOec1에 대한 1.2×10⁷ cfu/g 및 클로스트리디움 디피실레 DJOcd1에 대한 5.1×10⁷의 계산된 농도로 모든 튜브에 첨가하였다. 비피도박테리움 롱검 DJO10A를 4.0×10⁷ cfu/g의 계산된 농도로 3개의 튜브에 첨가하였고, 균주 DJO10A-JH1을 4.4 cfu/g으로 또다른 3개의 튜브에 첨가하였다. 표준 생육성 플레이트 계수를 사용하여, 모든 박테리아 농도를 계산하였다. 혐기성 환경에서의 철저한 혼합 후, 튜브를 37℃에서 3일 동안 방치함으로써, 정확한 일련의 플레이트 계수 분석을 수행하기 위해 전체 대변 샘플을 90 ㎖ 펩톤수에서 균질화시켰다.

실시예 2

추출된 비피도박테리움 랜티바이오틱의 제조

비피도박테리움 롱검 균주 DJO10A를 0.05％ L-시스테인-HCl (Sigma)이 보충된 MRS 브로스 또는 비피도박테리아 로우-아이언 배지 (BLIM)에서 성장시켰다. 그후, 브로스를 사용하여 100 mM PIPES가 보충된 MRS 한천 플레이트 또는 100 mM PIPES가 보충된 BLIM 한천 플레이트의 표면을 덮었다. 플레이트를 BBL 혐기성 시스템 (BBL) 또는 Bactron II 혐기성/환경 챔버 (Sheldon Manufacturing)를 사용하여 혐기성 조건 하에 37℃에서 2일 동안 인큐베이션하였다. 20개의 플레이트를 사용하였다.

세포 및 한천 배지를 분쇄하고, 혼합물을 일상적인 방법을 사용하여 95％ 메탄올로 추출하였다. 하룻밤 동안 추출을 진행하였다. 최종 용적물을 SpeedVac 내에 놓아 메탄올을 제거하고 랜티바이오틱을 농축하였다.

잔존하는 한천을 부분적인 정제를 위해 밀리포어 센트리프렙(Millipore CentriPrep) 여과를 사용하여 크기 분획화에 의해 제거하였다. 추출물을 1,500×g에서 각각 15분 및 10분의 2회의 원심분리에 의해 센트리프렙-30 (30 kDa 차단)으로 분획화하였고, 여과액 (<30 kDa)을 센트리프렙-10 (10 kDa 차단)으로 옮겼다. 이를 3,000×g에서 각각 40분 및 10분 동안 2회 원심분리하였다. 여과액을 센트리프렙-3 (3 kDa 차단)으로 옮겼다. 이를 3,000×g에서 각각 95분 및 35분 동안 2회 원심분리하였다, 분획화된 용액 (3-10 kDa)을 수집하고, SpeedVac 기계에 의해 농축하였다.

농축된 랜티바이오틱을 재현탁시키고, 확산 방법을 사용하여 즉각적으로 테스트하였다. 한천 플레이트는 MRS 또는 BLIM로 제조되었고, PIPES가 보충되었으며, 5 ㎜의 웰이 각각의 플레이트의 가운데 내로 절단되었다. 100 ㎕의 현탁된 랜티바이오틱을 웰 내에 놓고, 웰 내의 액체가 사라질 때까지 확산시켰다. 그후, 플레이트에 지표 균주를 중층시켰다.

랜티바이오틱은 지표 균주인 마이크로코쿠스 레우테우스, 락토코쿠스 락티스, 스타필로코쿠스 아우레우스, 스타필로코쿠스 에피더미디스, 대장균, 세라티아 마르세센스, 및 프로테우스 불가리스의 성장을 억제하였다. 이러한 분석법에서 랜티바이오틱은 슈도모나스 아에루기노사를 억제하지 않았다; 그러나, 이러한 데이터로부터 랜티바이오틱이 슈도모나스 아에루기노사를 억제하지 않을 것이라고 결론지을 수 없다.

실시예 3

추출된 비피도박테리움 랜티바이오틱의 내열성

실시예 2로부터의 랜티바이오틱을 비등 수조 내에 10분 동안 놓은 후, 확산 방법 및 지표 균주로서의 마이크로코쿠스 레우테우스를 사용하여 활성에 대해 테스트하였다. 랜티바이오틱이 10분 동안의 비등 후 활성이었다.

실시예 4

추출된 비피도박테리움 랜티바이오틱의 단백질분해 분석

단백질분해 효소의 모액을 하기와 같이 제조하였다.

펩신 (Sigma No. P6887)을 37℃의 2 mM 트리스-HCl 또는 물 (pH 2)에 34600 U/㎖ (10 ㎎/㎖)의 농도로 용해시켰다.

프로네이스 E (Sigma No. P5147)를 37℃의 20 mM 트리스-HCl 또는 50 mM 포스페이트 염수 (pH 7.5)에 5500 U/㎖ (500 ㎎/㎖)의 농도로 용해시켰다.

α-카이모트립신 (Sigma No. C4129)을 25℃의 80 mM 트리스-HCl (pH 7.8)에 5100 U/㎖ (100 ㎎/㎖)의 농도로 용해시켰다.

프로테이네이스 K (Sigma P2308)를 37℃의 10 mM 트리스-HCl (pH 7.5)에 6000 U/㎖ (200 ㎎/㎖)의 농도로 용해시켰다.

pH 7.6, 25℃의 트립신 (MP biochemical (ICN) No. 15021310)을 4750 U/㎖ (50 ㎎/㎖)의 농도로 사용하였다.

pH 7.2, 37℃의 써모라이신(Thermolysin) (Fluka No. 88303)을 6000 U/㎖ (150 ㎎/㎖)의 농도로 사용하였다.

100 ㎕의 실시예 2로부터의 랜티바이오틱을 각각의 분석법에서 사용하였다. 단백질분해 효소들을 각각 100 ㎖의 랜티바이오틱에 하기와 같이 첨가하였다: 펩신, 5 ㎕ (173 U); 프로네이스 E, 20 ㎕ (110 U); α-카이모트립신, 20 ㎕ (102 U); 프로테이네이스 K, 20 ㎕ (120 U); 트립신, 20 ㎕ (95 U); 및 써모라이신, 20 ㎕ (120 U). 펩신, 프로네이스 E, 프로테이네이스 K, 또는 써모라이신을 함유하는 샘플은 37℃에서 인큐베이션하였고, α-카이모트립신 또는 트립신을 함유하는 샘플은 25℃에서 인큐베이션하였다. 24시간 동안 인큐베이션하였다. 소화 후, 샘플을 pH 7.5로 중화시키고, 모든 샘플을 비등수에서 10분 동안 인큐베이션하여 단백질분해 효소 활성을 제거하였다.

각각의 샘플을 확산 방법, 불활성화된 단백질분해 효소를 함유하는 샘플 50 ㎕, 및 지표 균주로서의 마이크로코쿠스 레우테우스를 사용하여 활성에 대해 테스트하였다. 추출된 랜티바이오틱은 펩신 (pH 2) 및 프로네이스 E (pH 7.5)에 대해 민감성이었고, 다른 4개의 단백질분해 효소에 대해서는 민감성이지 않았다.

본원에서 인용된 모든 특허, 특허 출원, 및 간행물, 및 전자적으로 입수가능한 물질 (예를 들어, GenBank 및 RefSeq에 예를 들어 기탁된 뉴클레오티드 서열, 및 SwissProt, PIR, PRF, PDB에 예를 들어 기탁된 아미노산 서열, 및 GenBank 및 RefSeq 내의 주석이 달린 코딩 영역으로부터의 번역물)이 거명에 의해 포함된다. 본 출원의 개시내용과 본원에 포함된 임의의 문헌의 개시내용(들) 간에 임의의 모순이 존재하는 경우에는, 본 출원의 개시내용이 적용되어야 한다. 상기의 상세한 설명 및 실시예는 단지 이해의 명확성을 위해서 제공되었다. 이로부터 불필요한 제한이 이해되지 않아야 한다. 본 발명은 제시 및 기술된 엄밀한 상세사항에 한정되지 않는데, 당업자에게 명백한 변형들이 청구항에 의해 정의되는 본 발명 내에 포함될 것이기 때문이다.

달리 지시되지 않는 한, 명세서 및 청구항에서 사용된 성분의 양, 분자량 등을 표현하는 모든 숫자들은 용어 "약"에 의해 모든 경우에 변형되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 반대로 지시되지 않는 한, 명세서 및 청구항에 기재된 수치 파라메터들은 본 발명에 의해 수득될 것으로 추구되는 원하는 성질에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 적어도, 그리고 균등론을 청구항의 범주에 한정하려고 시도하지 않으면서, 적어도 각각의 수치 파라메터는 보고된 유효 숫자의 값의 견지에서, 그리고 통상적인 반올림 기술에 의해 해석되어야 한다.

광범위한 본 발명의 범주를 기재하는 수치 범위 및 파라메터 셋팅이 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에 기재된 수치는 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나, 모든 수치는 이들 각각의 테스팅 측정에서 발견되는 표준 편차로부터 필연적으로 초래되는 범위를 고유하게 함유한다.

모든 표제는 독자의 편의를 위한 것이고, 달리 구체화되지 않는 한, 표제에 이어지는 본문의 의미를 제한하도록 사용되지 않아야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> REGENTS OF THE UNIVERSITY OF MINNESOTA <120> LANTIBIOTICS AND USES THEREOF <130> 110.03060201 <140> PCT/US2008/070511 <141> 2008-07-18 <150> US 60/961,374 <151> 2007-07-20 <160> 57 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 705 <212> DNA <213> Bifidobacterium longum <400> 1 atgttcgtac gaaaaacgtc tatcatgtgc gctatgggga atccaaatga aatcagactg 60 gcgatagtcg ataacgacga cttcgtgctg atgggtttgg cagcgttctt gtcgcgtcat 120 ctgccgaatg ttcggttagc ttggaaggcg aataccggaa ccgatgctct ggaatatgcg 180 acggatcccg caaatgaagc ggacattctg ctggttgaca tgagtctgga ggacatgccc 240 ggagacatgg tgtgccggga aatcagaagt cgtaacagga tgttgccgtt gctggcggtg 300 acatcgttca gtttaattcg ctatgcgcga cgtgctgctg agggtggtgc tcaaggcatt 360 gtgtcaaaag ctgattttcc agcactgtgt aaagcggtca agctcgtcag cgatggtcat 420 actctctgtg ttcgagtagg aggggagact attggattcg aggatgtaga tgctgcatat 480 catcgtctgg ttcgacttcc cgtgaataga atcgaaagat tgtcggaacg ggaaaaatat 540 gccatggaac tatattcaca gtcgtataag cccactcaga ttgcccggat gatggatgtt 600 tcggcaggga cggtgaaaac ctatcttgac cgtgttcaga acaaactcca tcttacttcc 660 agagccgaac tgattgccta ttggtggagg cgggaacgat ggtga 705 <210> 2 <211> 234 <212> PRT <213> Bifidobacterium longum <400> 2 Met Phe Val Arg Lys Thr Ser Ile Met Cys Ala Met Gly Asn Pro Asn 1 5 10 15 Glu Ile Arg Leu Ala Ile Val Asp Asn Asp Asp Phe Val Leu Met Gly 20 25 30 Leu Ala Ala Phe Leu Ser Arg His Leu Pro Asn Val Arg Leu Ala Trp 35 40 45 Lys Ala Asn Thr Gly Thr Asp Ala Leu Glu Tyr Ala Thr Asp Pro Ala 50 55 60 Asn Glu Ala Asp Ile Leu Leu Val Asp Met Ser Leu Glu Asp Met Pro 65 70 75 80 Gly Asp Met Val Cys Arg Glu Ile Arg Ser Arg Asn Arg Met Leu Pro 85 90 95 Leu Leu Ala Val Thr Ser Phe Ser Leu Ile Arg Tyr Ala Arg Arg Ala 100 105 110 Ala Glu Gly Gly Ala Gln Gly Ile Val Ser Lys Ala Asp Phe Pro Ala 115 120 125 Leu Cys Lys Ala Val Lys Leu Val Ser Asp Gly His Thr Leu Cys Val 130 135 140 Arg Val Gly Gly Glu Thr Ile Gly Phe Glu Asp Val Asp Ala Ala Tyr 145 150 155 160 His Arg Leu Val Arg Leu Pro Val Asn Arg Ile Glu Arg Leu Ser 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acttacagct tgctgagggg atgcatgatg ccatgtctgg tgagttgaca 600 cgaatgttgg tcatagtgca ggaaggtatc gatgcatcga aggaagaaga gcttaagcga 660 tggagaaaat tgcagaacgg tatcaataag gtattccaag atctgcattc ggttatgaat 720 tatctatcgg atgatgacca taaacaagat gaggtatttc atgtaagtct tgccgaacat 780 attcaagcta cattgagtga aagtgaccgt cggttgcatg acaaagggtt ttgcggtcat 840 tcatctcttc gcggtgtatc cagcgcaatg ttgaactcgt ggaatcaaat aatcgttaac 900 ctgttgcgtg aaatttacac gaatattgaa cgctatgctg acaaaagtga atattccgtc 960 attgtcacat tttcaaataa tgctgttgat attgttcagg tgaataaatg tcgacaaaag 1020 agtcggcgat gtgtgacttt gggagcaaga aaagggctaa gtatatattc ccgtttgata 1080 tctggacaag gaggattcat cagatatgaa aaagacggcg aagaatggtc tttctattgc 1140 atgttaccgc tactgaccta a 1161 <210> 4 <211> 386 <212> PRT <213> Bifidobacterium longum <400> 4 Met Val Arg Arg Leu Ala Met Glu Thr Ile Leu Val Val Arg Lys Lys 1 5 10 15 Cys Leu Gly Val Ser Lys Lys Asn Leu Val Leu Ser Ile Val Ala Met 20 25 30 Thr Cys Leu Ala Ala Cys Ile Ala Glu Trp Ile Leu Asp Ser Pro Glu 35 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tgccgctgtg cctgttctcg gtcggttatg tcgtattggt agtggtcgcc 600 atcggtattt caaccggagt attctctcga tattttatca acaccaatat cgagctgtga 660 <210> 8 <211> 219 <212> PRT <213> Bifidobacterium longum <400> 8 Met Lys Ala Ile Leu Phe Arg Asp Cys Lys Ala Cys Phe Gln Ser Phe 1 5 10 15 Lys Asn Trp Gly Met Val Leu Ile Ile Met Val Thr Ala Ile Phe Val 20 25 30 Glu Met Val Ala Ser Gly Ala Gly Ile Leu Asp Pro Phe Thr Trp Ala 35 40 45 Val Phe Phe Gly Pro Phe Phe Ile Tyr Ser Ser Cys Ser Val Met Val 50 55 60 Ser Ile Leu Tyr Gln Asp Phe Arg Asp Gly Leu Phe Glu Leu Tyr Ile 65 70 75 80 Gln Ser Gly Arg Ser Tyr Trp Ser Tyr Cys Trp Cys Lys Cys Leu Phe 85 90 95 Pro Val Ile Leu Thr Val Ile Ser Val Leu Leu Asn Leu Ala Phe Met 100 105 110 Arg Val Leu Ser Ser Gly Phe Gln Ile Thr Ala Gly Ala Asp Asp Ala 115 120 125 Ile Gly Ala Leu Ile Val Ser Val Leu Gly Thr Ile Val Cys Ser Leu 130 135 140 Gly Ala Met Pro Met Val Tyr Val Ser Arg Asn Ser Asp Pro Thr Met 145 150 155 160 Ala Gln Leu Val Leu Val Leu Ile Ala Ile Leu Leu Gln Leu 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cccgacgaga cggtagcgat gcagaatcgc ggtattggcg ggaacgcggc 660 atgttcgact gtgcgacgtt ccatgaatac gtcgaaacgc ggcggaagct gccggaatcc 720 gtccacgccg aacggtag 738 <210> 10 <211> 245 <212> PRT <213> Bifidobacterium longum <400> 10 Met Thr Ser Met Val Ala Tyr Val Ala Ser Arg Asn Pro Gln Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Arg Ser Val Arg Leu Ile Gln Asp Ala Val Ser Gly Asn Ile 20 25 30 Asp Ala Glu Trp Thr Ile Leu Thr Pro Asn Asp Thr Thr Ile Leu Pro 35 40 45 Ser Asp Gly Thr Ala Ser Glu Phe Ser Thr Gly Val Asp His Ile Glu 50 55 60 Leu Asn Gly Leu Asp Asp Ser Ala Arg Val Lys Lys Ala Ile Glu Arg 65 70 75 80 Cys Asp Tyr Leu Ile Leu Gly Ser Pro Thr Tyr Gly His Asn Val Ser 85 90 95 Gly Asp Met Lys Ile Leu Met Asp Arg Leu Thr Tyr Trp Gly His Leu 100 105 110 Phe His Leu Ala Gly Lys Pro Gly Met Ala Met Val Ser Ala Thr Thr 115 120 125 Asn Gly Phe Leu Glu Val Gly Glu Leu Met Glu Arg Phe Met Glu Ser 130 135 140 Leu Gly Ile Ile Ile Asp Glu Thr Ala Tyr His Thr Thr Phe Thr Pro 145 150 155 160 Phe Asp Glu Ala Met Ala Asp 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cggttcgttg 480 ggcgacggcg atgcgaagcg acaattgcgg cgatatttcg aactgctggc caccgacgaa 540 taccgtggcc atatgtatgc gaaatatccg gtactgcttc gttttgtcac gcagacgaca 600 gtccattaca tcgatttcgt caaggaaatg ctcgaccgcg tatccatgga tcgcgacgag 660 ctcgcctcct tcgcaggcgt cggcgatgat ttcaggttgg aagatatgtc catcgaccgt 720 ggcgacgcgc acgacggtgg aagagccgtg gccatgctca ccatcggcgg acggaaaatc 780 gtatacaagc cgcgtgacct gcatatccat gagcttttcg ccggattggt gaggcgatgc 840 gaacggacga agggtttcct tccgatgcga gtgtcggacg tgctgacgaa atccggctac 900 gcctatgagg aattcgtgga acacggcacc tgcgaggatg cacgtcaggt ggagcgctat 960 tacaccagat acggtcagct gctcggattg gtatggctcc tgcacggcga cgacatgcac 1020 cacgagaaca tcatcgccag cggggaatat ccgatggtcg tcgatttcga gacgatcgcc 1080 acgaaccatg tgaccatgga catgcccgac ggcaccgatg ccgacatccg cgtatccacg 1140 atattgcggg attcactggc atcctcctgt ctgttgccgg cgaaaacggc gatgtcggcc 1200 gacggtacat ccgtcgacat cagcgccttc gaaaccggtg agcagacgat gcccggcatc 1260 gtcgcgtccc cggtgggatt ggactccgcc gatgcccatt acgagaggaa cgccgtgacg 1320 ttcagcaagg acggctgcgc ggtgacattg gatgacgccg ttgtggatcc gtatcattac 1380 aagcgacaga ttctccaagg attccgcaat acggtcgccg cggcgatgac catcgacgcg 1440 gatgaatggg atgcgatgct gtccggcgag gatacgaccg tgcgtgtgct ggtgcgcaac 1500 accagcgcct acgcccgatt tgcggatttc atccatcatc cgtcggcgtt gaaggacatg 1560 ctggacgtcg aagccatact ggagaacctg tatgtctacc cattccgtga caagcgcatc 1620 ttcgcaagcg aataccggca gatgctcgcc ggggacatcc ccatgttcac cgcacagctg 1680 acgggacatg atctgcacgc tcccgatgga acgaccattg acggcgtctg cgaacgttcg 1740 gtacgcgaac gggtgcttga caccatcggg catcttgacg aacaggccgc attgcaatcg 1800 cgcattatcc gcaacgcctt gcgcatggaa cccggcatgg aggacgcgca tccgacggct 1860 tcggtgtcgt cggacacgga tgcggagcat tacccaatcg aactcggcac gaggatagcc 1920 gacacggcca tcctccagga aaccgatggc accgtatcat ggcttacagc gaaccgatcc 1980 gacaccatgg ccgcggacaa gaccgtggat gaacggtacg aaccgggggc gccgacttcg 2040 ggactctacg acggcatggc cgggacgggc atgttcgccg ccgaactgta tcggcggaca 2100 cacgatgagc gctggcgtga cctgtgcacg cgtatgatgc ggagtctgat gcgccgcaag 2160 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didehydrobutyrine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> X is threonine or didehydrobutyrine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> X is serine or didehydroalanine <400> 19 Pro Ala Xaa Leu Xaa Phe Ala Val Xaa Val Leu Xaa Val Xaa Phe Xaa 1 5 10 15 Ala Cys Xaa Val Xaa Val Val Xaa Arg Leu Ala Xaa Cys Gly Asn Cys 20 25 30 Lys <210> 20 <211> 33 <212> PRT <213> artificial <220> <223> intermediate polypeptide resulting from dehydration <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X is didehydroalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> X is didehydroalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> X is didehydrobutyrine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> X is didehydrobutyrine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> X is didehydroalanine <400> 20 Pro Ala Ser Leu Ser Phe Ala Val Ser Val Leu Ser Val Xaa Phe Xaa 1 5 10 15 Ala Cys Ser Val Xaa Val Val Xaa Arg Leu Ala Xaa Cys Gly Asn Cys 20 25 30 Lys <210> 21 <211> 33 <212> PRT <213> artificial <220> <223> polypeptide resulting from dehydration <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X is serine, didehydroalanine, or alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X is serine, didehydroalanine, or alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X is serine, didehydroalanine, or alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> X is serine, didehydroalanine, or alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X is serine, didehydroalanine, or alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> X is serine, didehydroalanine, or alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> X is cysteine or alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> X is serine, didehydroalanine, or alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> X is threonine, didehydobutyrine, or 2-aminobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24) <223> X is threonine, didehydobutyrine, or 2-aminobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (28)..(28) <223> X is serine, didehydroalanine, or alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29)..(29) <223> X is cysteine or alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> X is cysteine or alanine <400> 21 Pro Ala Xaa Leu Xaa Phe Ala Val Xaa Val Leu Xaa Val Xaa Phe Xaa 1 5 10 15 Ala Xaa Xaa Val Xaa Val Val Xaa Arg Leu Ala Xaa Xaa Gly Asn Xaa 20 25 30 Lys <210> 22 <211> 33 <212> PRT <213> artificial <220> <223> polypeptide resulting from dehydration <220> <221> THIOETH <222> (14)..(18) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> X is didehydroalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21) <223> X is didehydrobutyrine <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> X is Abu <220> <221> THIOETH <222> (24)..(29) <220> <221> THIOETH <222> (28)..(32) <400> 22 Pro Ala Ser Leu Ser Phe Ala Val Ser Val Leu Ser Val Ala Phe Xaa 1 5 10 15 Ala Ala Ser Val Xaa Val Val Xaa Arg Leu Ala Ala Ala Gly Asn Ala 20 25 30 Lys <210> 23 <211> 12219 <212> DNA <213> Bifidobacterium longum <400> 23 ctactccaac ttgacaaaac acagcggtag cgcctgcgcg gttcggcgcg cctgcggccg 60 gccttgcgcc gcggcggggc cggcgatgta gtatccgccc gtccacgggc ccgtcttcag 120 ccgtttcggc cggtacggcc ggtaggactc gttctcgttg gacgggaacc acgtgtcgcg 180 tttgatctcc ctgccgaccg tcgaggcgtt gcggccgagc atcagaccga tcctgcggat 240 gctggtgccg ttgccgatct cgatctggat gacctggcgt tcctcttccg acaggtgcga 300 acatgcttct cccataggtg caacatccct tcggactggt tatccggaca atctccaatc 360 caacgggtgt tgcactttca attagacaac ggggcgggca tgttcgtacg aaaaacgtct 420 atcatgtgcg ctatggggaa tccaaatgaa atcagactgg cgatagtcga taacgacgac 480 ttcgtgctga tgggtttggc agcgttcttg tcgcgtcatc tgccgaatgt tcggttagct 540 tggaaggcga ataccggaac cgatgctctg gaatatgcga cggatcccgc aaatgaagcg 600 gacattctgc tggttgacat gagtctggag gacatgcccg gagacatggt gtgccgggaa 660 atcagaagtc gtaacaggat gttgccgttg ctggcggtga catcgttcag tttaattcgc 720 tatgcgcgac gtgctgctga gggtggtgct caaggcattg tgtcaaaagc tgattttcca 780 gcactgtgta aagcggtcaa gctcgtcagc gatggtcata ctctctgtgt tcgagtagga 840 ggggagacta ttggattcga 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21 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 38 atgaaggcga ttctgtttc 19 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 39 tcacagctcg atattggtg 19 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 40 cagcwgccgc ggtaatwc 18 <210> 41 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 41 acgggcggtg tgtrc 15 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 42 atccaacgag caagaacc 18 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 43 gtgaaatcac cactaccacc 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 44 cacatcttgg aactgcttgg 20 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 45 cgtacaccga tgaatgacc 19 <210> 46 <211> 19 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 46 gttcttcgtc acctccacc 19 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 47 agtaatgtcc cgaatcctcc 20 <210> 48 <211> 19 <212> DNA 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Claims

서열 21의 아미노산 서열과 80％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 생물학적 활성 화합물.
제1항에 있어서, 폴리펩티드가 서열 21의 아미노산 서열의 1개 이상의 보존적 치환을 포함하는 단리된 생물학적 활성 화합물.
제1항에 있어서, 그람(Gram) 음성 미생물의 외막을 손상시키지 않는 조건에서 그람 음성 미생물의 성장을 억제하는 특징을 포함하는 단리된 생물학적 활성 화합물.
제3항에 있어서, 대장균(E. coli), 세라티아 프로테우스(Serratia proteus), 또는 살모넬라(Salmonella) 종의 성장을 억제하는 단리된 생물학적 활성 화합물.
제1항에 있어서, 그람 양성 미생물인 락토바실루스(Lactobacillus) 종, 락토코쿠스(Lactococcus) 종, 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 종, 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 종, 또는 바실루스(Bacillus) 종의 성장을 억제하는 단리된 생물학적 활성 화합물.
제1항에 있어서, 비피도박테리움(Bifidobacterium)에 의해 생산되는 단리된 생물학적 활성 화합물.
제1항의 단리된 생물학적 활성 화합물 및 식품을 포함하는 조성물.
제1항의 단리된 생물학적 활성 화합물 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
(a) 폴리펩티드의 아미노산 서열과 서열 21의 아미노산 서열의 동일성이 80％ 이상인 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 (b) (a)의 뉴클레오티드 서열의 완전 상보체를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제9항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 서열 21의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
이종성 조절 서열에 작동가능하게 연결된 제9항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제9항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제9항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포.
그람 음성 미생물의 외막을 손상시키지 않는 조건에서 그람 음성 미생물의 성장을 억제하는, 단리된 랜티바이오틱(lantibiotic).
제14항에 있어서, 화합물의 아미노산 서열과 서열 21의 아미노산 서열의 동일성이 80％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 랜티바이오틱.
제15항에 있어서, 그람 음성 미생물이 대장균, 세라티아 프로테우스, 또는 살모넬라 종인 단리된 랜티바이오틱.
랜티바이오틱 및 식품을 포함하고, 상기 랜티바이오틱이 그람 음성 미생물의 외막을 손상시키지 않는 조건에서 그람 음성 미생물의 성장을 억제하는 특징을 포함하는 조성물.
제17항에 있어서, 랜티바이오틱이 식품의 표면 상에 존재하는 조성물.
제17항에 있어서, 랜티바이오틱이 식품 내에 존재하는 조성물.
제17항에 있어서, 랜티바이오틱이 서열 21의 아미노산 서열과 80％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 조성물.
제17항에 있어서, 그람 음성 미생물이 대장균, 세라티아 프로테우스, 또는 살모넬라 종인 조성물.
랜티바이오틱 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하고, 상기 랜티바이오틱이 그람 음성 미생물의 외막을 손상시키지 않는 조건에서 그람 음성 미생물의 성장을 억제하는 특징을 포함하는 조성물.
단리된 비피도박테리움을 랜티바이오틱을 생산하는데 적절한 조건 하에 성장시키고, 상기 비피도박테리움이 랜티바이오틱을 생산하는 단계
를 포함하는, 랜티바이오틱의 생산 방법.
제23항에 있어서, 성장이 비피도박테리움을 표면 상에서 성장시키는 것을 포함하는 방법.
제23항에 있어서, 비피도박테리움이 비피도박테리움 롱검(B. longum)인 방법.
제23항의 방법에 의해 생산된 랜티바이오틱.
아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 성장시키고, 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열과 서열 21의 아미노산 서열의 동일성이 80％ 이상이고, 상기 미생물이 폴리펩티드를 생산하는데 적절한 조건 하에 성장되며, 상기 미생물이 폴리펩티드를 생산하는 단계
를 포함하는 랜티바이오틱의 생산 방법.
제27항에 있어서, 미생물이 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10, 서열 12, 서열 14, 서열 16, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 방법.
제27항에 있어서, 성장이 미생물을 표면 상에서 성장시키는 것을 포함하는 방법.
제27항에 있어서, 미생물이 비피도박테리움 종인 방법.
제27항에 있어서, 단리가 알콜을 포함하는 조성물로의 추출을 포함하는 방법.
제31항에 있어서, 알콜이 메탄올인 방법.
랜티바이오틱을 식품에 첨가하는 단계를 포함하고, 상기 랜티바이오틱이 그람 음성 미생물의 외막을 손상시키지 않는 조건에서 그람 음성 미생물의 성장을 억제하는 특징을 포함하는, 랜티바이오틱의 사용 방법.
제32항에 있어서, 첨가가 랜티바이오틱을 식품의 표면에 적용하는 것을 포함하는 방법.
제34항에 있어서, 랜티바이오틱을 포함하는 케이싱(casing), 필름 또는 포장재의 표면을 식품과 접촉시키는 것에 의해 랜티바이오틱이 적용되는 방법.
제33항에 있어서, 첨가가 랜티바이오틱을 식품에 첨가하는 것을 포함하는 방법.
제33항에 있어서, 랜티바이오틱이 식품 보존제인 방법.
아미노산 서열을 포함하는 생물학적 활성 화합물을 포함하고, 상기 화합물의 아미노산 서열과 서열 21의 아미노산 서열의 동일성이 80％ 이상이며, 상기 화합물이 그람 음성 미생물의 외막을 손상시키지 않는 조건에서 그람 음성 미생물의 성장을 억제하는 특징을 포함하는 치아세정제(dentifrice).
제38항에 있어서, 구강세정제 또는 치약(toothpaste)인 치아세정제.
랜티바이오틱을 포함하는 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하고, 이때 대상이 랜티바이오틱에 의해 억제되는 미생물로 감염되었거나 감염될 위험이 있으며, 상기 랜티바이오틱이 그람 음성 미생물의 외막을 손상시키지 않는 조건에서 그람 음성 미생물의 성장을 억제하는 특징을 포함하는, 랜티바이오틱의 사용 방법.
제38항에 있어서, 조성물이 국소적으로 투여되는 방법.
제38항에 있어서, 조성물이 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 방법.
제40항에 있어서, 동물이 인간인 방법.
폴리펩티드의 아미노산 서열과 서열 2의 아미노산 서열의 동일성이 80％ 이상인, 단리된 생물학적으로 활성인 폴리펩티드.
제44항의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
랜티바이오틱을 생산하는 비피도박테리움을 포함하고, 상기 랜티바이오틱이 그람 음성 미생물의 외막을 손상시키지 않는 조건에서 그람 음성 미생물의 성장을 억제하는 특징을 포함하는 조성물.
제46항에 있어서, 비피도박테리움이 캡슐화된 조성물.
제46항에 있어서, 식품을 추가로 포함하는 조성물.
그람 음성 미생물의 외막을 손상시키지 않는 조건에서 그람 음성 미생물의 성장을 억제하는 특징을 포함하는 랜티바이오틱을 생산할 비피도박테리움을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.