KR20100042108A - 포미톱시스 피니콜라 유래 결정형 셀룰로오스 분해 활성 엔도글루카나제 - Google Patents

포미톱시스 피니콜라 유래 결정형 셀룰로오스 분해 활성 엔도글루카나제 Download PDF

Info

Publication number
KR20100042108A
KR20100042108A KR1020080101246A KR20080101246A KR20100042108A KR 20100042108 A KR20100042108 A KR 20100042108A KR 1020080101246 A KR1020080101246 A KR 1020080101246A KR 20080101246 A KR20080101246 A KR 20080101246A KR 20100042108 A KR20100042108 A KR 20100042108A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
endoglucanase
cellulose
enzyme
crystalline cellulose
fomitopsis
Prior art date
Application number
KR1020080101246A
Other languages
English (en)
Inventor
김경수
신명교
윤정준
김용진
류현진
Original Assignee
한국생산기술연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생산기술연구원 filed Critical 한국생산기술연구원
Priority to KR1020080101246A priority Critical patent/KR20100042108A/ko
Publication of KR20100042108A publication Critical patent/KR20100042108A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P2201/00—Pretreatment of cellulosic or lignocellulosic material for subsequent enzymatic treatment or hydrolysis

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 포미톱시스 피니콜라 유래 결정형 셀룰로오스 분해 활성 엔도글루카나제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola) 균사체 배양액으로부터 분리 정제 가능한, 무결정형 셀룰로오스 뿐만 아니라 결정형 셀룰로오스에 대하여도 높은 분해 활성을 갖는 엔도글루카나제에 관한 것이다.
엔도글루카나제, 셀룰로오스 분해, 결정형 셀룰로오스, 포미톱시스 피니콜라, Fomitopsis pinicola, 갈색부후담자균

Description

포미톱시스 피니콜라 유래 결정형 셀룰로오스 분해 활성 엔도글루카나제{An endoglucanase having crystalline cellulose degrading activity from Fomitopsis pinicola}
본 발명은 포미톱시스 피니콜라 유래 결정형 셀룰로오스 분해 활성 엔도글루카나제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola) 균사체 배양액으로부터 분리 정제 가능한, 무결정형 셀룰로오스 뿐만 아니라 결정형 셀룰로오스에 대하여도 높은 분해 활성을 갖는 엔도글루카나제에 관한 것이다.
목질성분의 주요 구성성분인 셀룰로오스는 지구상에서 다량 존재하며 재생에너지 자원으로 관심이 집중되고 있다. 특히 셀룰로오스는 유용당류, 에탄올 그리고 산업적으로 유용한 화학물질로 변환시킬 수 있는 자원이다. 셀룰로오스는 β-1,4-결합을 형성하고 있는 글루코오스 폴리머로서 엔도-β-1,4-글루카나제(endo-β-1,4-glucanase; EG), 셀로비오하이드로라제(cellobiohydrolase; CBH) 및 β-글루코시다제(β-glucosidase; BGL)와 같은 효소시스템에 의해 가수분해되며, 이러한 효소들이 상보적으로 작용할 경우 천연 셀룰로오스를 효율적으로 가수분해할 수 있 다.
EG는 셀룰로오스 내부 사슬의 β-1,4-결합을 무작위로 가수분해하고, CBH은 EG에 가수분해되어 생성된 셀룰로오스 중합체의 환원 말단 및 비환원 말단을 점진적으로 가수분해하여 2분자의 글루코오스가 결합한 셀로비오스를 생산한다. 셀로비오스는 EG와 CBH에 있어서 강력한 억제제로 작용하므로, BGL은 이러한 셀로비오스를 가수분해시켜 각각 EG와 CBH의 강한 억제를 제거시킨다(Wong, K.K. Y., L. U. L. Tan, J. N. Saddler. 1988. Multiplicity of β-1,4-xylanases in microorgani는: Functions and applications, Microbiol . Rev. 52: 305-317; Medve, J., J. Karlsson, D. Lee, and F. Tjerneld. 1998. Hydrolysis of microcrystalline cellulose by cellobiohydrolase I and endoglucanase II from Trichoderma reesei: Adsorption, sugar production pattern, and synergism of the enzymes. Biotechnol. Bioeng. 59: 621-634).
일반적으로, EG는 셀룰로오스 분자의 무결정 영역을 가수분해할 수 있고, CBH는 결정 영역에 결합하여 셀룰로오스 사슬의 환원 및 비환원 말단으로부터 가용성 환원당을 생산시킬 수 있다(Enari, T. M. and M. L. Niku-Paavula. 1987. Enzymatic hydrolysis of cellulose: Is the current theory of mechanism of hydrolysis valid? Crit . Rev . Biotechnol. 5: 67-87).
그러나, CBH의 작용과 같은 결정성 셀룰로오스를 분해시킬 수 있는 EG가 바실러스 시르쿨란스(Bacilllus circulans)[Kim, C.-H. 1995. Characterization and substrate specificity of an endo-β-1,4-D-glucanase I(Avicelase I) from an extracellular multienzyme complex of Bacillus circulans. Appl . Envir . Microbiol. 61: 959-965] 및 클로스트리디움 테르모셀룸(Clostridium thermocellum)[Gilad, R., L. Ravinovich, S. Yaron, E.A. Bayer, R. Lamed, H. J. Gibert, and Y. Shoham. 2003. Cell, a noncellulosomal family 9 enzyme from Clostridium thermocellum, is a processive endoglucanase that degrades crystalline cellulose. J. Bacteriol. 185: 391-398]과 같은 박테리아 종 및 글로에오필룸 트라베움(Gloeophyllum trabeum)(Cohen, R., M. Suzuki, and K. E. Hammel. 2005. Processive endoglucanase active in crystalline cellulose hydrolysis by the brown rot basidiomycete Gloeophyllum traveum . Appl . Environ. Microbiol . 71: 2412-2417) 균류 중에서 보고된 바 있다.
갈색부후담자균(Brown-Rot Basidiomycete)은 가장 파괴적인 유형의 목재 부후를 야기시키고, 바이오매스 재순환의 중요한 유인(誘因)이다(Green III, F. and T.L. Highley. 1997. Mechanism of brown-rot decay: Paradigm or paradox. Int . Biodeter. Biodegrad. 39: 113-124). 이러한 갈색부후담자균류은 일반적으로 목질성분의 리그닌을 거의 분해하지 않고 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스를 선택적으로 분해한다(Kerem, Z., K. A. Jensen, and K. E. Hammel. 1999. Biodegradative mechanism of the brown rot basidimycete Gleophyllum trabeum: Evidence for an extracellular hydroquinone-driven Fenton reaction. FEBS Lett. 446: 49-54).
그러나 갈색부후담자균류에 의한 셀룰로오스의 가수분해 메카니즘에 대한 이용가능한 정보가 거의 없는 실정이다[Highley, T.L. 1973. Influence of carbon source on cellulase activity of white-rot and brown-rot fungi. Wood Fiber 5: 50-58; Ishihara, M. and K. Shimizu. 1984. Purification and properties of two extracellular endo-cellulases from the brown rotting fungus Tyromyces palustris. Mokkuzai Gakkaishi 30: 79-87).
최근 들어, 글로에오필룸 트라베움(G. trabeum)(Cohen, R., M. Suzuki, and K. E. Hammel. 2005. Processive endoglucanase active in crystalline cellulose hydrolysis by the brown rot basidiomycete Gloeophyllum traveum . Appl . Environ. Microbiol . 71: 2412-2417) 및 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris)(Yoon, J.-J. and Y.-K. Kim. 2005. Degradation of crystalline cellulose by the brown-rot basidimycete Fomitopsis palutris . J. Microbiol. 43: 487-492; Yoon, J.-J., Cha, C.-J., Kim, Y.-S., Son, D.-W. and Kim, Y.-K. 2007. The brown-rot basidiomycete Fomitopsis palustris has the endo-glucanases capable of degrading microcrystalline cellulose. J. Microbiol. Biotechnol. 17(5): 800-805)와 같은 갈색부후담자균류가 결정형 셀룰로오스를 가수분해할 수 있다고 보고된 바 있다.
전형적인 갈색부후를 야기시키는 포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola)에 관하여는, 이로부터 유래한 세포외 효소가 카복시메틸셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 및 몇몇 β-글리코시드들을 분해시키지만, 결정질 셀룰로오스에 대한 셀룰로오스 가수분해 활성은 나타내지 않는다고 알려져 있었으나(Ishihara, M. and K. Shimizu. 1984. Purification and properties of two extracellular endo- cellulases from the brown rotting fungus Tyromyces palustris . Mokkuzai Gakkaishi 30: 79-87), 이에 대하여 본 발명자들은 상기 균주가 목재로부터 결정질 및 무정질 형태의 셀룰로오스를 분해시킬 수 있음을 보고한 바 있다(Yoon, J.-J. and Y.-K. Kim. 2005. Degradation of crystalline cellulose by the brown-rot basidimycete Fomitopsis palutris . J. Microbiol. 43: 487-492).
본 발명자들은 상기와 같은 종래의 문제점을 극복하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과 목재분해담자균 포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola)가 목질을 분해하는 과정 중에 생산하는 효소 중에서 결정셀룰로오스 분해 활성을 갖는 엔도글루카나제를 분리 정제하고 상기 엔도글루카나제가 무결정형 셀룰로오스 뿐 아니라 결정형 셀룰로오스의 분해에 대하여 높은 효소활성을 나타냄을 확인함으로써 목질계 바이오매스의 셀룰로오스를 효율적으로 분해할 수 있는 효소 제제 및 셀룰로오스 분해효소의 대량 생산 방법을 제공할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 포미톱시스 피니콜라 유래 결정형 셀룰로오스 분해 활성 엔도글루카나제를 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 포미톱시스 피니콜라 유래 결정형 셀룰로오스 분해 활성 엔도글루카나제를 유효성분으로 포함하는 목질계 바이오매스의 셀룰로오스를 효율적으로 분해할 수 있는 효소 제제를 제공하고자 하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola) 유래 결정형 셀룰로오스 분해 활성 엔도글루카나제를 제공한다.
본 발명에서, 포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola) 유래 결정형 셀룰로오스 분해 활성 엔도글루카나제는 DIHNYARW(서열번호 1), LIFDVHKY(서열번호 2) 및 RQAIISETG(서열번호 3)의 부분 아미노산 서열을 갖고, 분자량이 약32kDa인 것을 특징으로 한다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 엔도-글루카나제를 유효성분으로 포함하는 목재 바이오매스 분해용 효소 제제를 제공한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 엔도-글루카나제를 목질계 바이오매스의 셀룰로오스에 첨가하여 반응시킴으로써 목질계 바이오매스의 셀룰로오스를 분해시키는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 구성을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명에서, 엔도글루카나제 생산 균주인 포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola)는 갈색부후담자균의 일종으로서, 자실체 배양액으로부터 직접 분리하여 사용할 수도 있고 기탁되거나 실험실에서 분리된 것을 입수하여 사용할 수도 있다.
본 발명에서, 포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola) 균사체 분리 과정은 당업계에 알려져 있는 방법을 이용할 수 있다. 일반적으로, 포미톱시스 피니콜라 자실체를 일정한 크기로 절단하고, 70% 에탄올로 세척한 후, 감자, 설탕 및 펩톤을 함유하는 배지에 이식하여 수일간 진탕 배양한 다음 생성된 포미톱시스 피니콜라 균사체를 YM agar 배지에 접종하고, 25 내지 35℃에서 5 내지 6일간 배양하여 버섯균사체를 확인한 후, 10 내지 20일 간격으로 계대배양하여 균주로 사용한다.
본 발명에서는, 4% 셀룰로오스를 탄소원으로 한 배양계에서 생장한 포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola)에서 유래한 결정형 셀룰로오스 분해 활성을 갖는 2 종의 엔도글루카나제를 음이온-교환 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피 시스템에 의해 균일하게 정제하고, SDS-PAGE 분석을 통해 정제된 효소의 분자량을 확인하고, 아미노산 서열을 분석하여 서열의 상동성을 확인한 후, 카복시메틸셀룰로오스(CMC)의 가수분해의 속도 및 가용성 환원당의 양을 측정하였다.
본 발명에서, 상기 정제된 포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola) 유래 엔도글루카나제는 DIHNYARW(서열번호 1), LIFDVHKY(서열번호 2) 및 RQAIISETG(서열번호 3)의 부분 아미노산 서열을 갖고, 분자량이 약32kDa인 것으로 확인되었다.
또한, 정제 효소를 결정형 셀룰로오스(Avicel)에 반응시켜 가수분해 생성물 의 박막 크로마토그래피 분석을 통해 본 발명에 따른 주 생성물이 셀로비오스임을 확인하고, 이로써 갈색부후담자균류가 결정형 셀룰로오스를 분해시킬 수 있는 연작용(processive) EG를 보유하는 것으로 확인되었다.
특히, 본 정제효소는 셀로비오스 및 셀로트리오스를 가수분해하지는 못하나 글루코오스가 4개 이상인 셀로테트라오스 및 셀로펜타오스는 가수분해하는 특성을 갖고 있는 엔도글루카나제인 것으로 확인되었다.
본 발명은 상기와 같이 포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola) 균사체 배양액으로부터 결정형 셀룰로오스 분해 활성을 갖는 엔도글루카나제를 분리 정제함으로써 무결정형 및 결정형 셀룰로오스의 분해를 위한 효소를 대량 생산할 수 있게 된다.
본 발명 포미톱시스 피니콜라 유래 결정형 셀룰로오스 분해 활성 엔도글루카나제는 포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola) 균사체 배양액으로부터 무결정형 셀룰로오스 뿐만 아니라 결정형 셀룰로오스에 대하여도 높은 분해 활성을 갖는 엔도글루카나제를 분리 정제함으로써 상기 엔도글루카나제를 이용하여 목질계 바이오매스의 셀룰로오스를 효율적으로 분해할 수 있는 효소 제제를 제공할 수 있으며 아울러 포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola) 균사체 배양을 통해 셀룰로오스 분해효소의 대량 생산 방법을 제공할 수 있는 매우 뛰어난 효과를 가진다.
이하, 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 효과를 보다 더 구체적으로 설명하고자 하나, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 포미톱시스 피니콜라( Fomitopsis pinicola ) 균사체 배양
본 실시예에서는 한국농업진흥청 농업생명과학원(National Institute of Agricultural Science and Technology; NIAST)으로로부터 입수한 갈색부후담자균인 포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola) KACC 53896를 실험에 사용하였다.
본 균은 감자 덱스트로스 아가(potato dextrose agar)에 접종하여 28℃에서 7일간 배양한 후, 4℃에서 보관하였다. 본 균이 생산하는 엔도글루카나아제를 얻기 위해 감자 덱스트로스 아가(potato dextrose agar) 플레이트 상에서 배양한 포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola) 균사체를 100 mL 감자 덱스트로스 브로스(potato dextrose broth)가 들어가 있는 500 mL 프라스크에 접종하였다. 이를 회전식 진탕배양기에서 150 rpm으로 28℃에서 7일 동안 배양하여 전배양액을 만들었다. 전배양액 100 mL를 무균상태로 5 L의 본배양액이 들어가 있는 10 L용 바이오반응기(BioTron, Inc., Korea)에 접종하여 실온에서 14일간 배양하였다. 본배양의 배지조성은 0.8%(w/v) 펩탄, 0.2%(w/v) 효모 추출물, 0.5%(w/v) KH2PO4, 0.5%(w/v) K2HPO4 및 0.3%(w/v) MgSO4PO4를 함유하고, 2 %(w/v)의 셀룰로오스분말을 상기 균류의 배양용 탄소 공급원으로 사용하였다.
실시예 2: 포미톱시스 피니콜라( Fomitopsis pinicola )로부터 생성된 엔도글루카나제의 정제
갈색부후담자균 포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola)를 결정형 셀룰로오스(아비셀) 배양계에서 생장시켰을 때 엔도글루카나제 및 엑소글루카나제와 같은 주요 셀룰로오스 가수분해 효소를 생성시킨다고 보고된 바 있다(Yoon, J.-J. and Y.-K. Kim. 2005. Degradation of crystalline cellulose by the brown-rot basidimycete Fomitopsis palutris . J. Microbiol. 43: 487-492).
본 실시예에서는 상기 실시예 1에서와 같이 얻은, 아비셀을 함유한 배양계에서 성장한 균사체의 배양 여과물로부터 CMC 및 아비셀과 같은 β-1,4-글루카나제 기질에 대해 높은 활성을 갖는 엔도글루카나제(EG)를 정제하였다.
CMC 및 아비셀과 같은 β-1,4-글루카나제 기질에 대해 활성은 하기와 같은 방법으로 확인하였다.
먼저 CMC의 경우, 효소반응에 사용한 기질은 100 mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5.0)에 1.0% 카복시메틸 셀룰로오스(CMC; Sigma/Aldrich)를 용해 것을 사용하였다. 효소반응은 45㎕의 기질용액과 5㎕의 정제효소가 포함된 100 mM 아세트산나트륨 완충용액 (pH 5.0)을 사용하여 50 ℃에서 30분동안 반응시킨 후, 100℃에서 10분간 가열하여 효소 반응을 정지시켰다. 반응 혼합물은 소모기-넬슨(Somogyi-Nelson) 방법(Somogyi, M. 1952. Notes on sugar determination. J. Biol . Chem . 195: 19-23)에 의해 생성된 환원당을 측정하였다. CMCase 활성 1 단위(U)는 분 당 글루코오스 1 μmol 당량의 방출을 촉진시키는 효소의 양으로 정의되었다.
한편, 아비셀라제(Avicelase)의 활성을 측정하기 위하여는, 2.0 % 아비셀을 포함하는 100mM 아세트나트륨 완충액(pH 5.0) 45㎕의 기질용액에 5㎕의 정제효소를 50 ℃에서 30분동안 반응시킨 후, 100℃에서 10분간 가열하여 효소 반응을 정지시켰다. 반응 혼합물은 소모기-넬슨(Somogyi-Nelson) 방법(Somogyi, M. 1952. Notes on sugar determination. J. Biol . Chem . 195: 19-23)에 의해 생성된 환원당을 측정하였다. 아비셀라제 활성 1 단위(U)는 분 당 글루코오스 1 μmol 당량의 방출을 촉진시키는 효소의 양으로 정의되었다.
구체적인 엔도글루카나제의 분리 정제 과정은 다음과 같았다.
먼저, 상기 실시예 1에서 얻은 배양 용액(5.0 L)을 여과지(Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Japan)로 여과하고, 4.0 kgf/cm2의 질소압 하에서 10 kDa 컷오프(cut-off) 폴리에테르술폰 멤브레인(PM 10 membrane, Millipore Corp.)을 장착한 교반 한외여과 셀(model 8400; Millipore Corp., Bedford, MA, U.S.A.)로 농축하고, 20 mM 트리스 완충액(pH 7.0)으로 투석하였다.
농축된 용액(100 mL)을 동일한 완충액으로 평형을 유지시킨 하이프렙(HiPrep) 16/10 DEAE FF (Amersham Biosciences) 칼럼에 흡착시켰다. 단백질 용출은 1.0 mL/min의 유속으로 0에서 0.5 M 염화나트륨의 선형 구배(linear gradient)로 200분간 용출시켰다.
EG활성을 포함한 분획을 교반 한외여과 셀(model 8400; Millipore Corp.)을 사용하여 50mM 아세트산나트륨에 0.15M 염화나트륨이 함유되어있는 완충액(pH 5.0)으로 투석 및 농축하여 겔 여과 시료로 사용하였다. 농축한 효소용액을 동일한 완충액으로 평형을 유지시킨 겔 여과 컬럼인 세파크릴(Sephacryl) 300-S HR(Amersham Biosciences) 컬럼(1.6×60cm)에 주입한 후, 동일한 완충액을 사용하여 0.5 mL/min 유속으로 겔 여과를 수행하였다. EG 활성을 함유한 겔 여과 분획을 회수하여 20mM 트리스 완충액(pH 7.0)으로 투석한 후 농축하였다.
겔 여과를 거친 효소액을 20mM 트리스 완충액(pH 7.0)으로 평형을 유지시킨 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼인 모노큐(MonoQ) HR5/5(Amersham Biosciences) 컬럼(0.5×5.0cm)에 흡착시키고 동일한 완충액을 사용하여 세척하였다. 용출은 1.0 mL/min의 유속으로 0에서 0.5 M 염화칼륨의 선형 구배(linear gradient)로 용출시켰다. 0.25 M 염화칼륨 농도에서 용출된 단백질 분획에서 EG활성을 확인하였다.
0.2 M 염화칼륨 농도에서 용출된 단백질 분획을 회수하여, 라엠리(Laemmli)방법(Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. nature 227: 680-685)에 따라 소듐 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 정제단백질의 순도를 체크하였다.
정제된 효소의 분자량을 하기의 표준분자량 마커로 계산하였다: 미요신(220 kDa), β-갈락토시다아제(115 kDa), 우혈청 알부민(96 kDa), 난백 알부민(51 kDa), 무수 카본산(37 kDa), 대두 트립신 억제제(30 kDa) 및 리소좀(20 kDa).
각 정제 단계에서 EG 활성을 함유한 피크 분획을 SDS-PAGE로 점검하였고 EG활성을 갖는 약 32 kDa 단백질(EG32)을 11배 정제하였고, 정제된 EG32는 기질인 CMC에 대하여 단백질 mg 당 944 U의 비활성을 가졌다. 정제의 결과를 하기 표 1에 요약하였다(표 1 및 도 1 참조).
이때, 효소 용액 중의 단백질 농도를 브래드포드 방법(Bradford, M. M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal . Biochem. 72: 248-254)을 사용하여 단백질 분석 키트 II(Bio-Rad laboratories, U.S.A.)로 측정하였다.
도 1에 도시한 바와 같이, A는 세포 외 단백질과 포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola)에서 유래한 정제 엔도글루카나제의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 도로서, M은 분자마커(molecular marker)(kDa)를, 레인 1은 조효소를, 레인 2는 정제된 EG32를 나타내며, B는 포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola)로부터 정제된 EG32과 트리코델마 리제이(Trichoderma reesei) 엔도글루카나제III(TvCel5 EGIII, 수탁번호 AAQ21383), 트리코델마 리제이(Trichoderma reesei) 엔도글루카나제II(TvCel5 EGII, 수탁번호 BAA36216), 페니실리움 잔디넬룸(Penicillium janthinellum) 엔도글루카나제(PjCel5, 수탁번호 CAA61740) 및 파네로키이테 크라이소스포리움(Phanerochaete chrysosporium)(PchCel5, 수탁번호 AAU12275)에서 유래한 글리코실하이드로라제 패미리 5 (Glycosiyl hydrolase family; GHF 5)의 부분 아미노산 서열을 비교한 것이다.
포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola)로부터 엔토글루카나제의 정제
정제단계 총 활성(U) 총 단백질(mg) 비활성(U/mg) 활성생산률(%)
조 추출물 32288 375 86 100
하이트렙 DEAE FF 28407 95 299 88
세파크릴 S-300HR 15152 27.5 551 47
모노큐 HR5/5 2965 3.2 944 9.2
실시예 3 : 아미노산 서열 분석에 의한 정제 효소 동정
포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola)로부터 정제된 효소를 동정하기 위하여, 단백질의 N-말단 및 내부 아미노산 서열을 분석하였다. SDS-PAGE 겔 상에 나타난 정제효소의 단일밴드를 절단하여 탈색한 후, 정제 단백질의 부분 아미노산 서열을 분석하기 위하여 프로바이온에 분석 의뢰하였다. EG32로 얻은 부분 아미노산 서열은 DIHNYARW(서열번호 1), LIFDVHKY(서열번호 2) 및 RQAIISETG(서열번호 3)로서 결정하였다.
상기 펩타이드의 아미노산 서열을 CAZy 웹 사이트(http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY)(Henrissat, B. and A. bariroch. 1993. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 293: 781-788) 및 JGI 웹 사이트 (http://genome.jgi-psf.org/whiterot1/)(Martinez, G., L.F. Larrondo, N. Putnam, M.D.S. Gelpke, K. Huang, J. Chapman, K.G. Helfenbein, P. Ramaiya, J.C. Detter, F. Larimer, P.M. Coutinho, B. Henrissat, R. Berka, D. Cullen, and D. Rokhsar. 2004. Genome sequence of the lignocellulose degrading fungus Phanerochaete chrysosporium strain RP78. Nature Biotechnol . 22: 1-6)의 유전자 데이터베이스를 이용하여 BLAST 검색을 수행한 결과, 트리코델마 리제이(Trichoderma reesei) 엔도글루카나제III(TvCel5 EGIII, 수탁번호 AAQ21383), 트리코델마 리제이(Trichoderma reesei) 엔도글루카나제II(TvCel5 EGII, 수탁번호 BAA36216), 페니실리움 잔디넬룸(Penicillium janthinellum) 엔도글루카나제(PjCel5, 수탁번호 CAA61740) 및 파네로키이테 크라이소스포리움(Phanerochaete chrysosporium)(PchCel5, 수탁번호 AAU12275)의 엔도-β-1,4-글루카나제(GH family 5)의 부분 아미노산 서열과 높은 상동성을 갖고 있다는 점을 알아냈다 (도 1B 참조).
실시예 4 : 정제된 EG 의 효소특성
다양한 표준 글리코실하이드롤라제 기질에 대한 정제된 EG32의 효소특성을 표 2에 나타내었다.
포미톱시스 피니콜라 유래의 엔도글루카나제의 효소특성
　 EG
K m (mg CMC/ml) 11.6
V max (μmol/min/mg 단백질) 1250
K cat (1/s) 667
최적 pH 5.0
최적온도 [℃] 60
열안정성 (활성 반감기) 50 ℃ 60 ℃ 70 ℃ 　 >24 h 21 h 1.3 h
기질의 농도는 0 내지 40mg CMC/mg(w/v)의 범위에서 CMC의 가수분해에 대한 효소반응속도 상수(K m 와 V max )를 50 ℃ 및 pH 5.0 조건하에서 결정하였다. EG활성에 대한 최적 pH를 pH 3.0부터 pH 10의 범위 안에서 효소활성을 측정하여 최적 pH를 구했다. 또한 EG활성에 대한 최적 온도를 조사하기 위하여 30℃에서 90℃ 범위 안에서 효소활성을 측정하여 최적 온도를 구했다. 정제효소의 열안정성을 검토하기 위하여 50℃, 60℃, 70℃에서 효소를 인큐베이션한 후, 실시예 2에서 설명한 효소측정방법을 이용하여 잔여활성을 측정하였다.
상기의 결과로부터 본 균주로부터 정제한 EG32가 pH 5.0, 60℃의 조건 하에서 가장 높은 효소활성을 보임을 알 수 있었다. 온도에 따른 EG활성의 반감기는 60℃에서 21시간, 70℃에서 1.3시간이었다. 본 정제효소액을 100mM sodium acetate 완충용액(pH 5.0)으로 평형화한 후, 온도 안정성을 조사한 결과 50℃에서는 24시간이상 효소활성을 보였다.
실시예 5 : 정제된 EG 의 기질 특이성
정제 EG의 기질 특이성을 다양한 종류의 불용성 글리코실히드로라아제 기질인 CMC(1%, w/v), Avicel (1%, w/v), 셀룰로오스 (1%, w/v), 자일란 (1%, w/v)로부터 생성된 환원당량을 측정하는 방법으로 결정하였고, 가용성 기질인 pNPG (파라-니트로페닐 글루코시드; 1 mM), pNPG2 (파라-니트로페닐 셀로비오시드; 1 mM), pNPL (파라-니트로페닐 락토시드; 1 mM)과 pNPX (파라-니트로페닐 자이로시드; 1 mM)로부터 가수분해된 pNP량을 측정하는 방법으로 결정하였다.
그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
포미톱시스 피니콜라 유래의 엔도글루카나제의 기질 특이성
Substrate Activity (%)
Soluble substrates 　
CMC (1 %, w/v) 100
pNPG (1 mM) -
pNPG2 (1 mM) -
pNPL (1 mM) -
pNPX (1 mM) -
Insoluble substrates 　
Avicel (1 %, w/v) 24
Cellulose (1 %, w/v) 46
Xylan (birch) (1 %, w/v) 12
상기의 결과를 통해 정제효소가 EG의 전형적인 기질인 CMC에 대해 높은 기질 특이성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
아미노산 서열분석 결과와 기질 특이성의 결과로부터, 본 정제 EG32는 GH family 5에 속하는 엔도-β-1,4-글루카나아제임을 알 수 있었다.
또한, 포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicole)로부터 정제된 EG32는 자일란을 분해시켰다. 미생물 셀룰라아제가 셀룰로오스뿐 아니라 자일란에도 작용한다는 연구가 보고되어 왔다. 종래에는 자일란에 대한 EG의 활성이 셀룰로오스의 글루코피라노실 단위의 C-6 위치에 대해 유연한 특이성을 나타낸다는 사실이 제안된 바 있으며, 또한 친알칼리성 아스페르지루스 니거(Aspergillus niger), 바실러스 에스피(Bacillus sp.) 변종 BK 및 친알칼리성 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans)와 같은 몇몇 미생물로부터의 자일라나제(xylanase)가 목질 바이오매스에서 자일란을 가수분해시킬 수 있다고 보고된 바 있다(Chen, H.-G., X. yan, X.-Y., Liu, M.-D. Wang, H.-M. Huang, X.-C. Jia, and J.-A. Wang. 2006. Purification and characterization of novel bifunctional xylanase, XynIII, isolated from Aspergillus niger A-25. J. Microbiol . Biotechnol . 72: 248-254; Kaewintajuk, K., G.H. Chon, J.-S. Lee, J. Kongkiattikajorn, K. Ratanakhanokchai, K. L. Kyu, J. H. Lee. 2006. Hydrolysis of agricultural residues and kraft pulps by xylanolytic enzymes from alkaliphilic Bacillus sp. strain BK. J. Mcrobiol . Biotechnol. 16: 1255-1261; Tachaapaikoon, C., Y. S. Lee, K. Ratanakhanokchai, S. Pititglang, K. L. Kyu, M. S. Roh, and S.-K. Lee. 2006. Purification and characterization of two endoxylanases from an alkaliphilic Bacillus halodurans C-1. J. Microbiol . Biotechnol . 16: 613-618).
실시예 6 : 정제된 EG 에 의한 셀로-올리고당의 가수분해
정제효소에 의해 생성된 결정형 셀룰로오스(Avicel) 및 셀로-올리고당의 가수분해 산물을 박층 크로마토그래피(TLC)에 의해 분석하여 도 2에 도시하였다. 셀로-올리고당 및 Avicel로부터 얻은 가수분해 생성물을 0.2 mL 실리카 겔 60F254 플레이트 상에서 에틸아세테이트/물/메탄올(40:15:20 v/v)로 분류시키고, 길라드 등(Gilad et al)이 기술한 방법(Gilad, R., L. Ravinovich, S. Yaron, E.A. Bayer, R. Lamed, H. J. Gibert, and Y. Shoham. 2003. Cell, a noncellulosomal family 9 enzyme from Clostridium thermocellum, is a processive endoglucanase that degrades crystalline cellulose. J. Bacteriol. 185: 391-398)으로 분리 스폿트(spot)을 검출하여 도 2에 도시하였다.
도 2A는 정제 EG32에 의한 셀로-올리고당의 분해에 따른 가용성 당의 TLC분석을 나타낸 도로서 표준샘플(Standard; S)은 글루코오스(G1), 셀로비오스(G2), 셀로트리오스(G3), 셀로테트라오스(G4), 셀로펜타오스(G5)를, C는 대조군(효소 무반응 샘플)을 나타낸다. 정제 EG32는 G4와 G5를 가수분해하였지만 G3이하의 셀로-올리고당은 가수분해하지 못했다. 또한 G4와 G5의 주요 가수분해산물로서 G2와 G3가 생성됨을 확인하였다.
도 2B에 도시한 바와 같이, 정제 EG32에 의한 Avicel 분해에 따른 가용성 당의 TLC분석결과 주요 가수분해산물로서 셀로비오스가 생성됨을 확인하였다.
이와 같은 결과는 포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola)에서 유래한 EG32의 특성이 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride) 유래의 CBH의 특성(Berghem, L. E. and L. G. Pettersson. 1973. The mechanism of enzymatic cellulose degradation. Purification of a cellulolytic enzyme from Trichoderma viride active on highly ordered cellulose. Eur. J. Biochem. 37: 21-30)과 유사하다는 사실을 나타낸다. 포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola)에서 유래한 EG32의 작용은 바실러스 키르쿨란스(Bacillus circulans)[Kim, C.-H. 1995. Characterization and substrate specificity of an endo-β-1,4-D-glucanase I(Avicelase I) from an extracellular multienzyme complex of Bacillus circulans. Appl. Envir. Microbiol. 61: 959-965], 클로스트리디움 테르모셀룸(Clostridium thermocellum)[Gilad, R., L. Ravinovich, S. Yaron, E.A. Bayer, R. Lamed, H. J. Gibert, and Y. Shoham. 2003. Cell, a noncellulosomal family 9 enzyme from Clostridium thermocellum, is a processive endoglucanase that degrades crystalline cellulose. J. Bacteriol. 185: 391-398] 및 글로에오필룸 트라베움(Gloeophyllum trabeum)에서 유래한 EG들의 작용과 유사하다고 여겨진다. 문헌에는 균류 Y-94 변종으로부터의 셀룰라아제가 아비셀을 가수분해시키며, 엑소셀룰라아제라기 보다 특정 엔도셀룰라아제로서 분류되었다는 사실이 보고되었다 (Yamanobe, T., Y. Mitsuishi, and M. Yagisawa. 1988. Purification and some properties of a microcrystalline cellulose-hydrolyzing enzyme(Avicelase II) from fungi strain Y-94. Agric . Biol . Chem . 52: 2493-2524).
따라서, 상기와 같은 본 발명의 결과는 갈색부후담자균 포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola)에서 유래한 연작용 엔도글루카나제가 결정형 셀룰로오스에 대해 분해 활성을 갖는다는 사실을 명확하게 지시한다.
이상 상기 실시예를 통해 설명한 바와 같이, 본 발명 포미톱시스 피니콜라 유래 결정형 셀룰로오스 분해 활성 엔도글루카나제는 포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola) 균사체 배양액으로부터 무결정형 셀룰로오스 뿐만 아니라 결정형 셀룰로오스에 대하여도 높은 분해 활성을 갖는 엔도글루카나제를 분리 정제함으로써 상기 엔도글루카나제를 이용하여 목질계 바이오매스의 셀룰로오스를 효율 적으로 분해할 수 있는 효소 제제를 제공할 수 있으며 아울러 포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola) 균사체 배양을 통해 셀룰로오스 분해효소의 대량 생산 방법을 제공할 수 있으므로 효소 및 바이오연료산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
도 1의 A는 갈색부후담자균 포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola)로부터 생산된 균체 외 단백질과 정제 엔도글루카나제(EG32)의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 도(M, 분자량 마커; 1, 균체 외 단백질; 2, 정제 EG32)이며 , B는 포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola)로부터 분리정제한 EG32(FpiEG32)과 트리코델마 리제이(Trichoderma reesei) 엔도글루카나제III(TvCel5 EGIII, 수탁번호 AAQ21383), 트리코델마 리제이(Trichoderma reesei) 엔도글루카나제II(TvCel5 EGII, 수탁번호 BAA36216), 페니실리움 잔디넬룸(Penicillium janthinellum) 엔도글루카나제(PjCel5, 수탁번호 CAA61740) 및 파네로키이테 크라이소스포리움(Phanerochaete chrysosporium)(PchCel5, 수탁번호 AAU12275)에서 유래한 글리코실하이드로라제 패미리 5 (Glycosiyl hydrolase family; GHF 5)의 부분 아미노산 서열을 비교한 것이다.
도 2는 정제 EG32에 의한 셀로-올리고당(A) 및 Avicel(B)의 분해에 따른 가용성 당의 박막 크로마토그래피 분석을 나타낸 도이다. (A) S, 표준샘플; C, 대조군; 1, 글루코오스(G1); 2, 셀로비오스(G2); 3, 셀로트리오스(G3); 4, 셀로테트라오스(G4); 5, 셀로펜타오스(G5). (B) 효소반응시간 2, 4, 24, 120시간.
<110> KOREA INSTITUTE OF INDUSTRIAL TECHNOLOGY <120> An endoglucanase having crystalline cellulose degrading activity from Fomitopsis pinicola <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Fomitopsis pinicola <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(8) <223> partial amino acid sequence of endoglucanase <400> 1 Asp Ile His Asn Tyr Ala Arg Trp 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Fomitopsis pinicola <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(8) <223> partial amino acid sequence of endoglucanase <400> 2 Leu Ile Phe Asp Val His Lys Tyr 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Fomitopsis pinicola <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> partial amino acid sequence of endoglucanase <400> 3 Arg Gln Ala Ile Ile Ser Glu Thr Gly 1 5

Claims (4)

  1. 부분 아미노산 서열 DIHNYARW(서열번호 1), LIFDVHKY(서열번호 2) 및 RQAIISETG(서열번호 3)를 갖고, 분자량이 약32kDa인 무결정형 및 결정형 셀룰로오스 분해 활성을 갖는 포미톱시스 피니콜라(Fomitopsis pinicola) 유래의 엔도-글루카나제.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 엔도-글루카나제는 셀로테트라오스(G4) 또는 셀로펜타오스(G5)를 가수분해하여 셀로비오스(G2) 또는 셀로트리오스(G3)를 생산하는 것인, 엔도-글루카나제.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 따른 엔도-글루카나제를 유효성분으로 포함하는 목재 바이오매스 분해용 효소 제제.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 따른 엔도-글루카나제를 목질계 바이오매스의 셀룰로오스에 첨가하여 반응시킴으로써 목질계 바이오매스의 셀룰로오스를 분해시키는 방법.
KR1020080101246A 2008-10-15 2008-10-15 포미톱시스 피니콜라 유래 결정형 셀룰로오스 분해 활성 엔도글루카나제 KR20100042108A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020080101246A KR20100042108A (ko) 2008-10-15 2008-10-15 포미톱시스 피니콜라 유래 결정형 셀룰로오스 분해 활성 엔도글루카나제

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020080101246A KR20100042108A (ko) 2008-10-15 2008-10-15 포미톱시스 피니콜라 유래 결정형 셀룰로오스 분해 활성 엔도글루카나제

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20100042108A true KR20100042108A (ko) 2010-04-23

Family

ID=42217566

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020080101246A KR20100042108A (ko) 2008-10-15 2008-10-15 포미톱시스 피니콜라 유래 결정형 셀룰로오스 분해 활성 엔도글루카나제

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20100042108A (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2458128C2 (ru) Способ обработки целлюлозного материала и используемые в нем ферменты
Liu et al. Characterization of a thermostable β-glucosidase from Aspergillus fumigatus Z5, and its functional expression in Pichia pastoris X33
EP2188381B1 (en) Enzymatic hydrolysis of lignocellulosic feedstocks using accessory enzymes
Kaur et al. Purification and characterization of two endoglucanases from Melanocarpus sp. MTCC 3922
CN105316303B (zh) 具有改善的特性的β-葡萄糖苷酶I变体
RU2433140C2 (ru) Слитые белки, включающие ферменты, разрушающие клеточную оболочку растений, и их применения
Liu et al. Expression, purification and characterization of two thermostable endoglucanases cloned from a lignocellulosic decomposing fungi Aspergillus fumigatus Z5 isolated from compost
Yoon et al. The brown-rot basidiomycete Fomitopsis palustris has the endo-glucanases capable of degrading microcrystalline cellulose
CN103502444A (zh) 糖基水解酶及其在生物质水解方面的用途
CN103492561A (zh) 纤维素酶组合物和使用相同组合物用于改善木质纤维素生物质转化成可发酵糖的方法
US9969995B2 (en) Methods for recombinant expression of beta-glucosidase gene
Yoon et al. Purification and characterization of thermostable β-glucosidase from the brown-rot basidiomycete Fomitopsis palustris grown on microcrystalline cellulose
Adav et al. Trichoderma secretome: an overview
US20130309729A1 (en) Mutant cellobiohydrolase
Kotchoni et al. Purification and biochemical characterization of carboxymethyl cellulase (CMCase) from a catabolite repression insensitive mutant of Bacillus pumilus
Shimonaka et al. Molecular cloning of a gene encoding endo-β-D-1, 4-glucanase PCE1 from Phycomyces nitens
KR20100042108A (ko) 포미톱시스 피니콜라 유래 결정형 셀룰로오스 분해 활성 엔도글루카나제
KR20090039972A (ko) 미세결정 셀룰로오스 분해 활성을 갖는 갈색부후담자균포미톱시스 팔루스트리스에서 유래한 엔도글루카나제
李宜海 A study on β-glucosidases derived from wood-feeding insect and symbiotic protist of termite
Khisti Microbial enzymes related to agro-waste material degradation

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid