KR20090039972A - 미세결정 셀룰로오스 분해 활성을 갖는 갈색부후담자균포미톱시스 팔루스트리스에서 유래한 엔도글루카나제 - Google Patents

미세결정 셀룰로오스 분해 활성을 갖는 갈색부후담자균포미톱시스 팔루스트리스에서 유래한 엔도글루카나제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미세결정 셀룰로오스 분해 활성을 갖는 갈색부후담자균 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris)에서 유래한 엔도글루카나제에 관한 것으로, 본 발명에 따른 갈색부후담자균 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris)에서 유래한 엔도글루카나제는 미세결정 셀룰로오스의 분해에 대하여 높은 효소활성을 나타내고 있으므로 목질재료에 대한 바이오매스 분해 시스템 개발 및 목질 바이오매스 분해효소의 대량 생산 기술을 개발하는 데 있어 매우 유용하다.
목질계바이오매스, 갈색부후담자균, 포미톱시스 팔루스트리스, 미결정 셀룰로오스, 엔도글루카나제

Description

미세결정 셀룰로오스 분해 활성을 갖는 갈색부후담자균 포미톱시스 팔루스트리스에서 유래한 엔도글루카나제{The Endo-Glucanases from the Brown-Rot Basidiomycete Fomitopsis palustris having Microcrystalline Cellulose Degrading activity}
본 발명은 미세결정 셀룰로오스 분해 활성을 갖는 갈색부후담자균 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris)에서 유래한 엔도글루카나제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 미세결정 셀룰로오스를 가수분해할 수 있으므로 농림 폐자원 바이오매스를 효율적으로 분해할 수 있는 효소로서 갈색부후담자균 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris)로 부터 유래된 엔도글루카나제에 관한 것이다.
종래부터 농림 폐자원, 예를 들어 낙엽송, 소나무, 전나무, 잣나무, 리기다소나무, 졸참나무 등의 임목 폐기물 바이오매스를 효율적으로 분해하는 균주를 선발하려는 노력이 진행되어 왔다.
셀룰로오스는 β-1,4-글루코시드 결합으로 연결된 글루코스 단위의 선형 중 합체로서, 목재 바이오매스(woody biomass)의 주성분이다.
균류에 의한 셀룰로오스 분해에는 일반적으로 3그룹의 가수분해 효소인, 엔도글루카나제(endoglucanase; EG), 엑소글루카나제(exoglucanase)(셀로비오하이드로라제, cellobiohydrolase; CBH) 및 β-글루코시다제(β-glucosidase; BGL)이 관여한다고 여겨지고 있다.
EG는 셀룰로오스 내부 사슬의 β-1,4-결합을 무작위로 가수분해하고, CBH은 EG에 가수분해되어 생성된 셀룰로오스 중합체의 환원말단 및 비환원말단을 점진적으로 가수분해하여 2분자의 글루코오스가 결합한 셀로비오스를 생산한다. 셀로비오스는 EG와 CBH에 있어서 강력한 억제제로 작용하므로, BGL은 이러한 셀로비오스를 가수분해시켜 각각 EG와 CBH의 강한 억제를 제거시킨다(Wong, K.K. Y., L. U. L. Tan, J. N. Saddler. 1988. Multiplicity of β-1,4-xylanases in microorgani는: Functions and applications, Microbiol . Rev. 52: 305-317; Medve, J., J. Karlsson, D. Lee, and F. Tjerneld. 1998. Hydrolysis of microcrystalline cellulose by cellobiohydrolase I and endoglucanase II from Trichoderma reesei: Adsorption, sugar production pattern, and synergism of the enzymes. Biotechnol. Bioeng. 59: 621-634).
일반적으로, EG는 셀룰로오스 분자의 무결정 영역을 가수분해할 수 있고, CBH는 결정 영역에 결합하여 셀룰로오스 사슬의 환원 및 비환원 말단으로부터 가용성 환원당을 생산시킬 수 있다(Enari, T. M. and M. L. Niku-Paavula. 1987. Enzymatic hydrolysis of cellulose: Is the current theory of mechanism of hydrolysis valid? Crit . Rev . Biotechnol. 5: 67-87).
그러나, CBH의 작용과 같은 결정성 셀룰로오스를 분해시킬 수 있는 EG가 바실러스 시르쿨란스(Bacilllus circulans)[Kim, C.-H. 1995. Characterization and substrate specificity of an endo-β-1,4-D-glucanase I(Avicelase I) frm an extracellular multienzyme complex of Bacillus circulans. Appl . Envir. Microbiol. 61: 959-965] 및 클로스트리디움 테르모셀룸(Clostridium thermocellum)[Gilad, R., L. Ravinovich, S. Yaron, E.A. Bayer, R. Lamed, H. J. Gibert, and Y. Shoham. 2003. Cell, a noncellulosomal family 9 enzyme from Clostridium thermocellum, is a processive endoglucanase that degrades crystalline cellulose. J. Bacteriol. 185: 391-398]과 같은 박테리아 종 및 글로에오필룸 트라베움(Gloeophyllum trabeum)(Cohen, R., M. Suzuki, and K. E. Hammel. 2005. Processive endoglucanase active in crystalline cellulose hydrolysis by the brown rot basidiomycete Gloeophyllum traveum . Appl . Environ. Microbiol . 71: 2412-2417) 균류 중에서 보고 된 바 있다.
갈색부후담자균(Brown-Rot Basidiomycete)은 가장 파괴적인 유형의 목재 부후를 야기시키고, 바이오매스 재순환의 중요한 유인(誘因)이다(Green III, F. and T.L. Highley. 1997. Mechanism of brown-rot decay: Paradigm or paradox. Int . Biodeter . Biodegrad. 39: 113-124). 이러한 갈색부후담자균류은 일반적으로 목질성분의 리그닌을 거의 분해하지 않고 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스를 선택적으로 분해한다(Kerem, Z., K. A. Jensen, and K. E. Hammel. 1999. Biodegradative mechanism of the brown rot basidimycete Gleophyllum trabeum: Evidence for an extracellular hydroquinone-driven Fenton reaction. FEBS Lett. 446: 49-54).
그러나 갈색부후담자균류에 의한 셀룰로오스의 가수분해 메카니즘에 대한 이용가능한 정보가 거의 없는 실정이다[Highley, T.L. 1973. Influence of carbon source on cellulase activity of white-rot and brown-rot fungi. Wood Fiber 5: 50-58: Ishihara, M. and K. Shimizu. 1984. Purification and properties of two extracellular endo-cellulases from the brown rotting fungus Tyromyces palustris. Mokkuzai Gakkaishi 30: 79-87).
최근 들어, 글로에오필룸 트라베움(G. trabeum)(Cohen, R., M. Suzuki, and K. E. Hammel. 2005. Processive endoglucanase active in crystalline cellulose hydrolysis by the brown rot basidiomycete Gloeophyllum traveum . Appl . Environ . Microbiol . 71: 2412-2417) 및 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris)(Yoon, J.-J. and Y.-K. Kim. 2005. Degradation of crystalline cellulose by the brown-rot basidimycete Fomitopsis palutris . J. Microbiol. 43: 487-492)와 같은 갈색부후담자균류가 결정형 셀룰로오스를 가수분해할 수 있다고 보고된 바 있다.
본 발명에서는 대한민국 및 일본의 목재 방부 효율시험에서 표준균주로 사용되고 있는 전형적인 갈색부후를 야기시키는 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris)를 사용하였으며, 상기 균주로부터 유래한 세포외 효소가 카복시메틸셀 룰로오스, 헤미셀룰로오스 및 몇몇 β-글리코시드들을 분해시키지만, 결정질 셀룰로오스에 대한 셀룰로오스 가수분해 활성을 나타내지 않는다고 보고된 바 있다(Ishihara, M. and K. Shimizu. 1984. Purification and properties of two extracellular endo-cellulases from the brown rotting fungus Tyromyces palustris. Mokkuzai Gakkaishi 30: 79-87).
이에 대하여, 본 발명자들은 상기 균주가 목재로부터 결정질 및 무정질 형태의 셀룰로오스를 분해시킬 수 있음을 보고한 바 있다(Yoon, J.-J. and Y.-K. Kim. 2005. Degradation of crystalline cellulose by the brown-rot basidimycete Fomitopsis palutris . J. Microbiol. 43: 487-492).
본 발명자들은 상기와 같은 종래의 문제점을 극복하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과 본 발명에 이르게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 미세결정 셀룰로오스 분해 활성을 갖는 2 종의 엔도글루카나제를 정제하여 효소특성을 밝혀내었고, 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris)가 미세결정 셀룰로오스를 분해시키는 엔도글루카나제를 함유한다는 사실을 밝혀냄으로써 결정질 셀룰로오스의 분해와 관련된 셀룰라아제 시스템을 확립하는데 있다.
상기와 같은 본 발명의 목적은 2 % 미세결정 셀룰로오스[아비셀(Avicel)]을 탄소원으로 한 배양계에서 생장한 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris)에서 유래한 결정형 셀룰로오스 분해 활성을 갖는 2 종의 엔도글루카나제를 음이온-교환 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피 시스템에 의해 균일하게 정제하고, SDS-PAGE 분석을 통해 정제된 효소의 분자량을 확인하고, 아미노산 서열을 분석하여 서열의 상동성을 확인 한 후, 아비셀 가수분해의 속도 및 가용성 환원당의 양을 측정하고, 아비셀로부터 방출된 가수분해 생성물의 박막 크로마토그래피 분석을 통해 본 발명에 따른 주 생성물이 셀로비오스라는 사실을 확인하고, 이는 갈색부후담자균류가 결정형 셀룰로오스를 분해시킬 수 있는 연작용(processive) EG를 보유한다는 사실을 확인함으로써 달성하였다.
본 발명은 미세결정 셀룰로오스를 분해하는 효소활성을 갖는 갈색부후담자균 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris)에서 유래한 엔도글루카나제를 제공한다.
상기 본 발명에서 정제한 엔도글루카나제의 부분 아미노산 서열은 ALFGLMNEPH 및 AAGAWNYLLL를 갖고, 분자량이 47kDa인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 또 다른 엔도글루카나제는 N-말단 아미노산 서열이 N-ATTLTGQYSXATTGN이고, 분자량이 35 kDa인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 엔도-글루카나제를 유효성분으로 함유하는 목재 바이오매스 분해용 효소 제제를 제공한다.
본 발명에 따른 갈색부후담자균 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris)에서 유래한 엔도글루카나제는 높은 미세결정 셀룰로오스의 분해 활성을 지니고 있으므로 목질재료에 대한 바이오매스 분해 시스템 개발 및 목질 바이오매스 분해효소의 대량 생산 기술을 개발하는 데 있어 매우 유용한 발명인 것이다.
이하에서는 본 발명의 명세서에 첨부된 도면을 참고로 하여 본 발명의 바람직한 실시형태를 보다 상세하게 설명한다. 하지만 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서는 일본 산림자원연구소(the Forest Products Research Institute; FFPRI)로부터 입수한 갈색부후담자균인 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris) FFPRI 0507을 실험에 사용하였다.
28℃에서 7일 동안 감자 덱스트로스 아가(potato dextrose agar) 플레이트 상에서 배양한 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris) 균사체를 100 mL 감자 덱스트로스 브로스(potato dextrose broth)가 들어가 있는 500 mL 프라스크에 접종하였다. 이를 회전식 진탕기 상에서 105 rpm으로 28℃에서 7일 동안 배양하여 전배양액을 만들었다. 전배양액 100 mL를 무균상태로 5 L의 본배양액이 들어가 있는 10 L용 바이오반응기(Samsung Science, Seoul, Korea)에 접종하여 실온에서 14일간 배양하였다. 본배양의 배지조성은 0.8%(w/v) 펩탄, 0.2%(w/v) 효모 추출물, 0.5%(w/v) KH2PO4, 0.5%(w/v) K2HPO4 및 0.3%(w/v) MgSO4?PO4를 함유하고, 2 %(w/v)의 미세결정 셀룰로오스(Avicel; Fluka, Switzerland)를 상기 균류의 배양용 탄소 공급원으로 사용하였다.
실시예 1 : 포미톱시스 팔루스트리스( Fomitopsis palustris )로부터 생성된 글리코실하이드로라제의 정제
갈색부후담자균 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris)를 아비셀을 탄소원으로 사용한 배양계에서 생장시켰을 때 엔도글루카나제 및 엑소글루카나제와 같은 주요 셀룰로오스 가수분해 효소를 생성시킨다고 보고된 바 있다(Yoon, J.-J. and Y.-K. Kim. 2005. Degradation of crystalline cellulose by the brown-rot basidimycete Fomitopsis palutris . J. Microbiol. 43: 487-492).
본 발명에서는 아비셀을 함유한 배양계에서 성장한 균사체의 배양 여과물로부터 CMC 및 아비셀과 같은 β-1,4-글루카나제 기질에 대해 높은 활성을 갖는 2 종의 엔도글루카나제(EG)를 정제하였다.
배양 용액(5.0 L)를 여과지(Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Japan)로 여과하고, 4.0 kgf/cm2의 질소압 하에서 10 kDa 컷오프(cut-off) 폴리에테르술폰 멤브레인(PM 10 membrane, Millipore Corp.)을 장착한 교반 한외여과 셀(model 8400; Millipore Corp., Bedford, MA, U.S.A.)로 농축하고, 20 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)으로 투석하였다. 배양 용액(5.0 L)를 여과지(Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Japan)로 여과하 고, 4.0 kgf/cm2의 질소압 하에서 10 kDa 컷오프(cut-off) 폴리에테르술폰 멤브레인(PM 10 membrane, Millipore Corp.)을 장착한 교반 한외여과 셀(model 8400; Millipore Corp., Bedford, MA, U.S.A.)로 농축하고, 20 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)으로 투석하였다.
농축된 용액(30 mL)을 동일한 완충액으로 평형을 유지시킨 토요펄(Toyoperl) DEAE650S(Tosoh, Tokyo, Japan) 칼럼에 흡착시켰다. 단백질을 3 mL/min의 유속으로 0 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM 및 500 mM 염화칼륨을 사용하여 각각의 농도별 구배로 용출시켰다.
EG활성을 포함한 분획을 교반 한외여과 셀(model 8400; Millipore Corp.)을 사용하여 50mM 아세트산나트륨에 0.15M 염화나트륨이 함유되어있는 완충액(pH 5.0)으로 투석 및 농축하여 겔 여과 시료로 사용하였다. 농축한 효소 용액(2 mL)을 동일한 완충액으로 평형을 유지시킨 겔 여과 컬럼인 세파크릴(Sephacryl) 300-S HR(Amersham Biosciences) 컬럼(1.6×60cm)에 주입한 후, 동일한 완충액을 사용하여 0.5 mL/min 유속으로 겔 여과를 수행하였다. EG 활성을 함유한 겔 여과 분획을 회수하여 20mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5.0)으로 투석한 후 농축하였다.
겔 여과를 거친 효소액을 20mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)으로 평형을 유지시킨 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼인 모노큐(MonoQ) HR5/5(Amersham Biosciences) 컬럼(0.5×5.0cm)에 흡착시키고 동일한 완충액을 사용하여 세척하였다. 용출은 1.0 mL/min의 유속으로 0 에서 0.5 M 염화칼륨의 선형 구배(linear gradient)로 용출시켰다. 0.2 M 및 0.35 M 염화칼륨 농도에서 각각 용출된 단백질 분획에서 EG활성을 확인하였다.
0.2 M 염화칼륨 농도에서 용출된 단백질 분획을 회수하여, 라엠리(Laemmli)방법(Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. nature 227: 680-685)에 따라 소듐 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 정제단백질의 순도를 체크하였다.
한편, 0.35 M 염화칼륨 농도 부근에서 용출한 분획은 20 mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5.0)으로 투석한 후 농축하여 동일한 완충액으로 평형을 유지시킨 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼인 모노큐 HR5/5(Amersham Biosciences) 컬럼(0.5×5.0cm)에 흡착시킨 후 동일한 완충액으로 세척하였다. 용출은 1.0 mL/min의 유속으로 0 에서 0.5 M 염화나트륨의 선형 구배(linear gradient)로 용출시켰다. EG 활성을 갖는 분획을 회수하여, 농축한 후, 50mM 아세트산나트륨에 0.15 M 염화나트륨이 함유되어있는 완충액(pH 5.0)으로 평형화시킨 겔 여과 크로마토그래픽 컬럼인 TSK-3000SWXL (Tosoh, Tokyo, Japan) 컬럼(0.78×30cm) 상에서 0.5 mL/min의 유속으로 겔 여과하였다.
높은 EG활성을 보인 겔 여과 분획을 회수하여, SDS-PAGE에 의해 정제단백질의 순도를 체크하였다. 정제된 효소의 분자량을 하기의 표준분자량 마커로 계산하였다: 미요신(220 kDa), β-갈락토시다아제(115 kDa), 우혈청 알부민(96 kDa), 난 백 알부민(51 kDa), 무수 카본산(37 kDa), 대두 트립신 억제제(30 kDa) 및 리소좀(20 kDa).
각 정제 단계에서 EG 활성을 함유한 피크 분획을 SDS-PAGE로 점검하였고 피크 I 분획으로부터 EG활성을 갖는 47 kDa 단백질(EG47)을 68배 정제하였고, 피크 II 분획으로부터 2단계의 정제과정을 거쳐 EG활성을 갖는 35 kDa 단백질(EG35)을 107배 정제하였다(도 1 참조).
도 1에 도시한 바와 같이, A는 세포 외 단백질과 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris)에서 유래한 2종의 정제 엔도글루카나제의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 도로서, M은 분자마커(molecular marker)(kDa)를, 레인 1은 조효소를, 레인 2는 정제된 EG47을 레인 3은 정제된 EG35를 나타내며, B는 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris)(FpEG47)로부터 정제된 EG47과 파네로키이테 크라이소스포리움(Phanerochaete chrysosporium)(PchCel5, 수탁번호 AAU12275)에서 유래한 글리코실하이드로라제 패미리 5 (Glycosiyl hydrolase family; GHF 5)의 부분 아미노산 서열을 비교한 것이다.
정제된 EG47 및 EG35는 각각 단백질 mg 당 57.5 U 및 89.9 U의 비활성을 가졌다. 정제의 결과를 표 1에 요약하였다.
<표 1>
포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris)로부터 2 종의 엔토글루카나제의 정제
정제단계 총 단백질량(mg) 총 활성(U) 특정 활성(U/mg) 정제(배)
조 추출물 386 326 0.84 1
토요펄 DEAE650S 110 250 2.28 3
세파크릴 S-300HR 30.6 209 6.82 8
1차 모노큐 HR5/5 피크 I 0.24 13.8 57.5 68
피크 II 8.54 132 15.5 18
피크 II 정제 2차 모노큐 HR5/5 0.27 17.2 63.7 76
TSK-3000SWXL 0.11 9.80 89.9 107
실시예 2 : 효소 분석 및 단백질 농축
효소반응에 사용한 기질은 100 mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5.0)에 1.0% 카복시메틸 셀룰로오스(CMC; Sigma/Aldrich)를 용해 것을 사용하였다. 효소반응은 45㎕의 기질용액과 5㎕의 정제효소가 포함된 100 mM 아세트산나트륨 완충용액 (pH 5.0)을 사용하여 50 ℃에서 30분동안 반응시킨 후, 100℃에서 10분간 가열하여 효소 반응을 정지시켰다. 반응 혼합물은 소모기-넬슨(Somogyi-Nelson) 방법(Somogyi, M. 1952. Notes on sugar determination. J. Biol . Chem . 195: 19-23)에 의해 생성된 환원당을 측정하였다. CMCase 활성 1 단위(U)는 분 당 글루코오스 1 μmol 당량의 방출을 촉진시키는 효소의 양으로 정의된다.
효소 용액 중의 단백질 농도를 브래드포드 방법(Bradford, M. M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254)을 사용하여 단백질 분석 키트 II(Bio-Rad laboratories, U.S.A.)로 측정하였다.
실시예 3 : 아미노산 서열 분석에 의한 정제 효소 동정
2 종의 정제된 효소를 동정하기 위하여, 단백질의 N-말단 및 내부 아미노산 서열을 분석하였다. SDS-PAGE 겔 상에 나타난 정제효소의 단일밴드를 절단하여 탈색한 후, 정제 단백질의 내부 아미노산 서열 및 N-말단 아미노산 서열을 분석하기 위하여 대한민국 기초 과학 연구소 서울 센터(Seoul, Korea)에 분석 의뢰하였다. EG47로 얻은 부분 아미노산 서열은 ALFGLMNEPH 및 AAGAWNYLLL로서 결정하였다. 이 두 펩타이드의 아미노산 서열을 CAZy 웹 사이트(http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY)(Henrissat, B. and A. bariroch. 1993. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 293: 781-788) 및 JGI 웹 사이트 (http://genome.jgi-psf.org/whiterot1/)(Martinez, G., L.F. Larrondo, N. Putnam, M.D.S. Gelpke, K. Huang, J. Chapman, K.G. Helfenbein, P. Ramaiya, J.C. Detter, F. Larimer, P.M. Coutinho, B. Henrissat, R. Berka, D. Cullen, and D. Rokhsar. 2004. Genome sequence of the lignocellulose degrading fungus Phanerochaete chrysosporium strain RP78. Nature Biotechnol . 22: 1-6.)의 유전자 데이터베이스를 이용하여 BLAST 검색을 수행한 결과 백색부후담자균인 파네로키이테 크라이소스포리움(Phanerochaete chrysosporium)의 엔도-β-1,4-글루카나제(GH family 5)의 부분 아미노산 서열과 높은 상동성을 갖고 있다는 점을 알아냈다 (도 1B 참조).
EG35의 N-말단서열이 N-ATTLTGQYSXATTGN으로 결정되었음에도, 이는 CAZy 웹 사이트(http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY) 및 JGI 웹 사이트 (http://genome.jgi- psf.org/whiterot1/) 통해 검색 가능한 어떠한 글리코실하이드롤라제 서열과도 일치하지 않았다. 따라서 본 정제 효소는 신규EG일 가능성을 제시하였다.
실시예 4 : 정제된 EG 의 기질 특이성
다양한 표준 글리코실하이드롤라제 기질에 대한 정제된 EG47 및 EG35의 특이성을 표 2에 나타내었다.
<표 2>
에프. 팔루스트리스로부터 글리코실하이드롤라제의 기질 특이성
기질a 특정 활성(U/단백질 mg)b
EG47 EG35
CMC 89.5±1.1 57.0±7.4
Xylan 0 11.8±5.1
pNPC 0.54±0.01 0.49±0.05
pNPG 0 0
pNPL NDc NDc
pNPX 0 0
아비셀 0.25±0.02 0.79±0.04
a pNPC, p-니트로페닐-β-셀로비오사이드; pNPG, p-니트로페닐-β-글루코피라노즈; pNPL, p-니트로페닐-β-락토피라노사이드; pNPX, p-니트로페닐-β-크실로피라노사이드. pNPC, pNPG, pNPL 및 pNPX에 대한 효소 활성을 분 당 p-니트로페닐 1μmol을 방출시키는데 필요한 효소의 양으로 측정하였다. 보고된 값은 각 기질에 대한 2회 실험의 평균값이다.
b 나타낸 값은 3회 실험의 평균값(±SD)이다.
c ND, 측정하지 않음(<p-니트로페닐 0.005 μmol/min/단백질 mg)
상기의 결과는 EG47이 EG의 전형적 기질인 CMC에 높은 특이적 활성을 가져서, EG47이 GH 과 5에 속하는 엔도-β-1,4-글루카나에임을 제안한다. 아벨에 대한 EG47의 특이적 활성이 EG35의 경우에서 보다 현저하게 낮았기 때문에, 결정질 셀룰로오스에 대한 정제된 EG47의 가수분해 활성은 상대적으로 약했다. 반면, EG35는, 그의 N-말단 아미노산 서열이 어떠한 공지된 글리코실하이드롤라제 서열과 유사하지 않았음에도 불구하고, EG 기질에 대해 상대적으로 높은 특이적 활성을 가졌다.
또한, 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris)로부터 정제된 EG35는 크실란을 분해시켰고, 특이적 활성은 11.8±5.1 U/mg 이었다(표 2 참조). 미생물 셀룰라아제가 셀룰로오스 뿐만 아니라 크실란에도 작용한다는 몇몇 보고가 있어왔다. 종래에는 크실란에 대한 EG의 활성이 셀룰로오스의 글루코피라노실 단위의 C-6 위치에 대해 유연한 특이성을 나타낸다는 사실이 제안된 바 있으며, 또한, 친알칼리성 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 바실러스 에스피(Bacillus sp.) 변종 BK, 및 친알칼리성 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans)와 같은 몇몇 미생물로부터의 크실라나제(xylanases)가 목질 바이오매스에서 크실란을 가수분해시킬 수 있다고 보고된 바 있다(Chen, H.-G., X. yan, X.-Y., Liu, M.-D. Wang, H.-M. Huang, X.-C. Jia, and J.-A. Wang. 2006. Purification and characterization of novel bifunctional xylanase, XynIII, isolated from Aspergillus niger A-25. J. Microbiol . Biotechnol . 72: 248-254; Kaewintajuk, K., G.H. Chon, J.-S. Lee, J. Kongkiattikajorn, K. Ratanakhanokchai, K. L. Kyu, J. H. Lee. 2006. Hydrolysis of agricultural residues and kraft pulps by xylanolytic enzymes from alkaliphilic Bacillus sp. strain BK. J. Mcrobiol. Biotechnol. 16: 1255-1261; Tachaapaikoon, C., Y. S. Lee, K. Ratanakhanokchai, S. Pititglang, K. L. Kyu, M. S. Roh, and S.-K. Lee. 2006. Purification and characterization of two endoxylanases from an alkaliphilic Bacillus halodurans C-1. J. Microbiol . Biotechnol . 16: 613-618). 또한, 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris)는 리그노셀룰로오스 물질에서 크실란을 가수분해시킬 수 있는 크실라나제를 생산하는 점이 밝혀졌다.
실시예 5 : 아비셀(avicel)로부터 방출된 가용성 환원당량 및 박층 크로마토그래피( TLC ) 분석
각각의 효소 용액(정제된 효소 10 ㎍/mL)를 1.0%(w/v) 아비셀(avicel)을 함유한 50 mL 아세트산 나트륨(pH 5.0)의 반응 혼합물(0.8 mL)을 50℃에서 반응시킨 후, 다양한 반응 시간에서 아비셀로부터 생성된 가수분해산물인 환원당량의 변화를 소모기-넬슨 방법(Somogyi, M. 1952. Notes on sugar determination. J. Biol . Chem. 195: 19-23)으로 측정하여 도 2에 도시하였다.
도 2에 도시한 바와 같이, 각각 정제된 EG47 및 EG35에 의한 아비셀의 가수분해로부터 방출된 환원당의 생성 시간 경로를 나타낸 그래프로서, 각 수치는 3 회 반복 측정의 평균값이며, 오류 막대는 표준 편차를 나타낸다.
EG35의 초기 가수분해 속도는 48 시간 동안은 비교적 빨랐고, 96 시간 후 방출된 가용성 환원당의 양은 100 ㎍/mL였다. 그러나, 24 시간 후 EG47에 의한 가수 분해는 서서히 증가하였고, 가수분해 속도는 EG35의 가수분해 속도 보다 느렸다. 더욱이, 아비셀로부터 방출된 가수분해 생성물의 TLC 분석은 주 생성물이 소량의 글루코스(G1)을 포함한 셀로비오스(G2)였고(도 3 참조), 효소들은 셀로비오스를 분해시키지 않았다는 사실을 지시하였다(데이터는 나타내지 않음).
아비셀로부터 얻은 가수분해 생성물을 0.2 mL 실리카 겔 60F254 플레이트 상에서 에틸아세테이트/물/메탄올(40:15:20 vol/vol)로 분류시키고, 길라드 등(Gilad et al)이 기술한 방법[Gilad, R., L. Ravinovich, S. Yaron, E.A. Bayer, R. Lamed, H. J. Gibert, and Y. Shoham. 2003. Cell, a noncellulosomal family 9 enzyme from Clostridium thermocellum, is a processive endoglucanase that degrades crystalline cellulose. J. Bacteriol. 185: 391-398)으로 분리 스폿트(spot)을 검출하여 도 3에 도시하였다.
도 3에 도시한 바와 같이, 각각 정제된 EG47 및 EG35에 의한 아비셀의 분해에 따른 가용성 당의 박막 크로마토그래피 분석을 나타낸 도로서, 표준샘플(Standard; ST)는 글루코스(G1) 및 셀로비오스(G2)를, C는 대조군(효소 없음)을 나타낸다.
이와 같은 결과는 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris)에서 유래한 EG35의 특성이 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride) 유래의 CBH의 특성(Berghem, L. E. and L. G. Pettersson. 1973. The mechanism of enzymatic cellulose degradation. Purification of a cellulolytic enzyme from Trichoderma viride active on highly ordered cellulose. Eur . J. Biochem. 37: 21-30)과 유사 하다는 사실을 지시한다.
포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris)에서 유래한 EG35의 작용은 바실러스 키르쿨란스(Bacillus circulans)[Kim, C.-H. 1995. Characterization and substrate specificity of an endo-β-1,4-D-glucanase I(Avicelase I) from an extracellular multienzyme complex of Bacillus circulans. Appl . Envir. Microbiol. 61: 959-965], 클로스트리디움 테르모셀룸(Clostridium thermocellum)[Gilad, R., L. Ravinovich, S. Yaron, E.A. Bayer, R. Lamed, H. J. Gibert, and Y. Shoham. 2003. Cell, a noncellulosomal family 9 enzyme from Clostridium thermocellum, is a processive endoglucanase that degrades crystalline cellulose. J. Bacteriol. 185: 391-398] 및 글로에오필룸 트라베움(Gloeophyllum trabeum)에서 유래한 EG들의 작용과 유사하다고 여겨진다. 문헌(Yamanobe, T., Y. Mitsuishi, and M. Yagisawa. 1988. Purification and some properties of a microcrystalline cellulose-hydrolyzing enzyme(Avicelase II) from fungi strain Y-94. Agric . Biol . Chem . 52: 2493-2524)에는 균류 Y-94 변종으로부터의 셀룰라아제가 아비셀을 가수분해시키며, 엑소셀룰라아제라기 보다 특정 엔도셀룰라아제로서 분류되었다는 사실이 보고되었다.
갈색부후담자균은 목재성분를 생분해시키는 주요한 인자이다. 갈색부후담자균류에 의한 셀룰로오스 분해는, 이러한 유형의 균류가 셀룰로오스를 탈중합화시키기 때문에(Highley, T. L. 1980. Cellulose degradation of cellulose-clearing and non cellulose-clearing brown-rot fungi. Appl . Environ . Microbiol. 40: 1145-1147), 목재 강도를 손상시키는 결정적인 요인이다. 목재의 기공 크기는 공지된 갈색부후담자균에서 생산된 효소가 목재성분인 셀룰로오스와 접촉하기 위해 목재 세포벽을 통해 자유롭게 확산되기에는 너무 작다(Flournoy, D. S., T. K. Kirk, and T. L. Highley. 1991. Wood decay by brown-rot fungi: Changes in pore structure and cell wall volume. Holzforschung 45: 383-388). 따라서, 이들 균류로 생산된 세포 외 셀룰라아제는, 다른 갈색부후담자균류에서 보고된 바와 같이(Cohen, R., M. Suzuki, and K. E. Hammel. 2005. Processive endoglucanase active in crystalline cellulose hydrolysis by the brown rot basidiomycete Gloeophyllum traveum . Appl . Environ . Microbiol . 71: 2412-2417: Green III, F. and T.L. Highley. 1997. Mechanism of brown-rot decay: Paradigm or paradox. Int . Biodeter . Biodegrad. 39: 113-124: Jensen Jr., K. A., C. J. Houtman, Z. C. Ryan, and K. E. Hammel. 2001. Pathways for extracellular Fenton chemistry in the brown rot basidiomycete Gloephyllum trabeum . Appl . Envir . Microbiol. 67: 2705-2711) 목재 세포벽을 통해 확산할 수 있는 반응성 산소 종(reactive oxygen species, ROS)과 같은 세포 외 작용제에 의해 방출된 셀룰로오스에 작용하여 가수분해한다.
갈색부후담자균이 목재의 셀룰로오스를 과도하게 분해시킴에도 불구하고, 균류 배양액으로부터 검출된 효소는 엑소글루카나제 성분이 부족한 것으로 여겨지며, 이들은 결정형 셀룰로오스를 비효율적으로 분해시키나, CMC와 같은 셀룰로오스들을 효율적으로 분해한다 [Highley, T.L. 1973. Influence of carbon source on cellulase activity of white-rot and brown-rot fungi. Wood Fiber 5: 50-58: Ishihara, M. and K. Shimizu. 1984. Purification and properties of two extracellular endo-cellulases from the brown rotting fungus Tyromyces palustris . Mokkuzai Gakkaishi 30: 79-87). 다른 연구들과는 반대로, 본 발명자들의 이전 결과는 갈색부후담자균 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris)가 각각 EG 및 CBH를 균체 외로 생산하며, 목재 내의 결정형 및 무결정형 셀룰로오스를 분해시킬 수 있다는 사실을 지시하였다. 더욱이, 아비셀 상에서 성장한 균류는 셀로비오스를 글루코스로 가수분해시키는 β-글루코시다제를 생성한다(Yoon, J.-J. and Y.-K. Kim. 2005. Degradation of crystalline cellulose by the brown-rot basidimycete Fomitopsis palutris . J. Microbiol. 43: 487-492). 또한, 코헨(Cohen)과 그의 동료들은 갈색부후균 글로에오필룸 트라베움(Gloeophyllum trabeum)이 결정형 셀룰로오스를 가수분해하여 동화성 글루코스를 생성하는 연작용(processive) EG를 생산한다는 사실을 보고하였다(Cohen, R., M. Suzuki, and K. E. Hammel. 2005. Processive endoglucanase active in crystalline cellulose hydrolysis by the brown rot basidiomycete Gloeophyllum traveum. Appl . Environ . Microbiol . 71: 2412-2417).
따라서, 상기와 같은 본 발명의 결과는 갈색부후담자균 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris)에서 유래한 연작용 엔도글루카나제가 결정형 셀룰로오스에 대해 분해 활성을 갖는다는 사실을 명확하게 지시한다.
도 1의 A는 갈색부후담자균 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris)의 세포 외 단백질과 정제된 엔도글루카나제의 SDS-PAGE 분석을 나타낸 도이며, B는 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris)로부터 정제된 EG47(FpEG47)과 파네로키이테 크라이소스포리움(Phanerochaete chrysosporium) 유래의 GH family 5 EG (PchCel5, 수탁번호 AAU12275)의 부분 아미노산 서열 비교를 나타낸 도이다.
도 2는 각각 정제된 EG47 및 EG35에 의한 아비셀의 가수분해로부터 방출된 환원당의 생성 시간 경로를 나타낸 그래프이다.
도 3은 각각 정제된 EG47 및 EG35에 의한 아비셀의 분해에 따른 가용성 당의 박막 크로마토그래피 분석을 나타낸 도이다.

Claims (4)

  1. 부분 아미노산 서열 ALFGLMNEPH 및 AAGAWNYLLL를 갖고, 분자량이 47kDa인 미세결정 셀룰로오스 분해 활성을 갖는 갈색부후담자균 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris)에서 유래한 엔도-글루카나제 EG47.
  2. N-말단 아미노산 서열이 N-ATTLTGQYSXATTGN이고, 분자량이 35 kDa인 미세결정 셀룰로오스 분해 활성을 갖는 갈색부후담자균 포미톱시스 팔루스트리스(Fomitopsis palustris)에서 유래한 엔도-글루카나제 EG35.
  3. 제1항에 따른 엔도-글루카나제 EG47를 유효성분으로 함유하는 목재 바이오매스 분해용 효소 제제.
  4. 제2항에 따른 엔도-글루카나제 EG35을 유효성분으로 함유하는 목재 바이오매스 분해용 효소 제제.
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