KR20100019580A - 고속 정전류모드 이온전도현미경 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이온전도현미경에 관한 것으로 특히, 정전류를 피펫 전극에 인가하여 피펫구멍과 시편표면 사이의 거리에 반비례하는 이온전도저항의 크기에 비례하는 신호를 피드백신호로 사용함으로써 기존의 거리진동모드현미경의 단점인 저속성을 극복하여 고속으로 주사가 가능하고 아울러 기존의 정전압모드의 낮은 감도를 극복하여 거리진동모드에 준하는 고감도 특성을 갖는 고속 정전류모드 이온전도현미경에 관한 것이다.

이러한 본 발명에 따른 고속 정전류 이온전도현미경은 정전압이 인가된 피펫 전극을 구비한 피펫의 피펫구멍을 통해 흐르는 이온전류의 값의 변화를 감지하여 이를 이미지화하는 피펫을 구비한 기존의 정전압모드 이온전도현미경과는 달리, 피펫전극에 정전류를 인가하여, 시편표면-피펫구멍과의 거리가 가까워지면 이온전도저항이 대략 (1/거리)로 가파르게 증가하고 거리에 매우 민감하게 변하게 되는데 이 이온전도저항과 비례하는 신호를 피드백신호로 사용함으로써 고속 고감도 고분해능 이미징이 가능한 장점이 있다.

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Description

고속 정전류모드 이온전도현미경{High-speed constant-current mode scanning ion conductance microscopy}

본 발명은 고속 정전류모드 이온전도현미경(Scanning Ion Conductance Microscopy)에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 피펫전극에 정전류를 인가하여 피펫구멍이 시편과 가까워지면 이온전도저항이 가파르게 증가하여 이 이온전도저항과 정전류의 곱에 해당하는 전압이 이온전도저항 양단에 걸리는데, 시편표면-피펫구멍 사이의 거리에 매우 민감하게 변하는 이 전압을 피드백신호로 사용함으로써 고속 고감도 이미징이 가능하도록 하는 고속 정전류모드 이온전도현미경에 관한 것이다.

피펫전극과 보통 접지된 기준전극 사이의 전위차에 의하여 흐르는 이온전류는 시편이 피펫구멍에 접근하면 이온의 흐름이 방해되어 이온전류가 감소하는데 이렇게 이온들의 흐름을 방해하는 저항을 이온전도저항이라 한다.

일반적으로 이온전도현미경은 도 1에 도시한 바와 같이, 이온전류를 감지하기 위한 피펫(1)과, 상기 피펫(1) 내부의 피펫전극(2)에 정전압을 인가하여, 이온전류가 피펫구멍(pipet aperture)(1a)을 통하여 시편(3)표면과 피펫구멍(1a) 사이의 거리에 따라서 변하는 이온전도저항을 통과하여 흐른다. 이러한 이온전도현미경 은 구멍이 100 nm 내외인 피펫구멍(1a)을 통하여 흐르는 이온전류를 피드백신호로 삼아 피드백하는 주사탐침현미경(scanning Probe Microscopy)의 일종이다.

이러한 종래의 정전압모드 이온전도현미경은 이온전류가 피펫구멍-시편표면 사이의 거리가 줄어들면 대략 거리에 비례하는 이온전류신호를 발생시키는데, 이 신호의 감도는 매우 낮게 된다(도 3 참조). 이에 따라 기존의 정전압모드 이온전도현미경으로 고분해능 이미징이 불가능하여 세포 등의 이미징은 어려웠고 크기 100nm 정도의 필터구멍 유무 정도를 판별하는 수준에 머물렀다.

이러한 단점을 보완하기 위해 최근에 피펫을 상하로 진동시키면서 변하는 거리진동모드라는 이온전도현미경이 개발되었는데, 도 3에 도시한 바와 같이 높은 감도를 보여 고분해능 이미징 방법으로 주목을 받고 있다. 그러나 이 방법은 AC이온전류를 위상잠금 증폭기(lock-in amplifier)로 측정해야 하므로 이미징속도가 한계가 있어 고속이미징에 부적합한 문제점이 있다. 또한, 피펫을 상하로 진동시켜야 하므로 고가의 거리진동용 나노스테이지, 거리진동용 신호발생기를 필요로 하며, 위상잠금 증폭기 또한 고성능을 가져야 하므로 구조가 복잡하고 비경제적이며 사용이 어려운 단점이 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해소하기 위해 안출된 것으로 본 발명의 목적은 피펫전극에 정전류를 인가하여 이 정전류와 피펫구멍이 시편과 가까워짐에 따라 가파르게 증가하는 이온전도저항에 비례하는 신호 즉, 시편표면-피펫구멍 사이의 거리에 매우 민감하게 변하는 신호를 피드백신호로 사용함으로써 고속 고감도로 세포의 동력학 현상 측정 등 세포 및 생체조직에서 일어나는 생체현상을 인체적용 임상(in-vivo)으로 측정하는데 이용할 수 있는 고속 정전류모드 이온전도현미경을 제공하는 것이다.

위와 같은 목적에 따른 본 발명의 정전류모드 이온전도현미경은 피펫전극에 정전류를 인가하여, 피펫 전극을 구비한 피펫의 피펫구멍을 통해 흐르는 이온전류가 동일한 전류값을 갖고 일정하게 흐르게 하고, 시편표면-피펫구멍 사이의 거리에 반비례하여 매우 민감하게 변하는 이온전도저항의 변화를 감지하여 이를 이미지화하는 정전류모드 이온전도현미경에 있어서, 상기 피펫전극에 정전류를 인가하여 피펫구멍이 시편표면에 가까워짐에 따라서 매우 급격하게 증가하는 이온전도저항과 비례하는 신호를 발생시키고 이를 피드백신호로 사용하여 고감도 고속으로 시료표면 형상을 이미징함을 특징으로 한다.

본 발명은 정전류를 피펫 전극에 인가하여 피펫구멍과 시편표면 사이의 거리 에 반비례하는 이온전도저항의 크기에 비례하는 신호를 피드백신호로 사용함으로써 기존의 거리진동모드현미경의 단점인 저속성을 극복하여 고속으로 주사가 가능하고 아울러 기존의 정전압모드의 낮은 감도를 극복하여 거리진동모드에 준하는 고감도 특성을 갖는 장점이 있다. 또한, 피펫구멍이 시편표면과 가까워지면 이온전도저항이 가파르게 증가하므로 이 이온전도저항과 비례하는 신호를 발생시키는데 이렇게 시편표면-피펫구멍 사이의 거리에 매우 민감하게 변하는 신호를 피드백신호로 사용함으로써 시편표면과 피펫구멍을 가까이 하여 고감도 이미징을 할때 시편표면과 피펫구멍과의 부딪힘을 방지할 수 있어서 살아있는 세포 등 손상이 되면 안 되는 민감한 시편의 in-vivo 측정에 더욱 유용하다.

이하에서는 첨부된 도면을 참조하여 기술되는 바람직한 실시예를 통하여 본 발명을 당업자가 용이하게 이해하고 재현할 수 있도록 상세히 기술하기로 한다.

도 1은 기존의 정전압모드 이온전도현미경의 구조를 나타낸 도면이고, 도 2는 본 발명에 따른 정전류모드 이온전도현미경의 구조를 나타낸 도면이며, 도 3은 본 발명에 따른 정전류모드 이온전도현미경, 정전압모드 이온전도현미경과 정전압모드중 거리진동모드 이온전도현미경에 있어서 신호크기의 피펫구멍-시편표면 거리에 대한 감도를 도시한 그래프이다.

도 1에 도시한 바와 같이, 일반적인 정전압모드 이온전도현미경은 이온전류를 감지하기 위한 피펫(1)과, 상기 피펫(1) 내부의 피펫전극(2)에 정전압을 인가하여, 이온전류가 피펫구멍(1a)을 통하여 시편(3)표면과 피펫구멍(1a) 사이의 저항을 통과하여 흐른다.

이때, 이온전류는 피펫구멍(1a)이 시편(3)표면에 시편구멍(1a) 크기의 반지름 정도의 거리로 접근하면 이온전류가 거리에 비례하여 감소하는데 이러한 이온전류를 일정한 값으로 유지하도록 하고 주사하면 시편표면의 굴곡을 이미징할 수 있다. 그러나, 이러한 종래의 정전압모드 이온전도현미경은 이온전류가 피펫구멍-시편표면 사이의 거리가 줄어들면 대략 거리에 비례하는 이온전류신호를 발생시키는데, 이 신호의 감도는 도 3에서 보는 바와 같이 매우 낮다. 대략 시편표면-피펫구멍 사이의 거리가 피펫구멍 반지름 정도일 때 신호가 A 이라면, 거리가 절반으로 줄면 신호도 A/2로 줄고 거리가 A/4로 줄어서, 전 영역에서 거리변화에 따른 신호의 기울기가 (A/반지름) 로서 매우 작다. 그리고 피펫구멍이 시편표면에 부딪히는 거리에 위치하여도 감지되는 신호의 기울기가 작아서 피펫과 시편이 부딪히는 것을 판단하지 못하게 되므로 피펫과 시편이 손상될 가능성이 높다. 그래서 기존에 정전압모드 이온전도현미경으로 고분해능 이미징이 불가능하여 세포 등의 이미징은 어려웠고 크기 100nm 정도의 필터구멍 유무 정도를 판별하는 수준에 머물렀다.

그러나 도 2에 도시한 바와 같이 본 발명의 정전류모드 이온전도현미경은 상기 피펫전극(2)에 정전류를 인가하여 피펫구멍(1a)을 통하여 정전류값의 이온전류가 일정하게 흐르는 가운데, 피펫구멍(1a)-시편(3)표면 사이의 거리에 반비례하는 이온전도저항과 이온전류의 곱에 해당하는 신호를 발생시키는데, 이 신호는 도 3에 도시한 바와 같이 감도가 크다. 예를 들어서 시편표면-피펫구멍 사이의 거리가 피펫구멍 반지름일 때 신호가 B라면 거리가 반지름의 절반이 되면 신호크기가 2B가 되고 반지름의 1/4가 되면 4B가 되는 등 신호크기가 거리가 가까워짐에 따라서 거리에 반비례하여 급격하게 증가하여, 신호의 거리에 대한 기울기가 대략 (1/거리의 제곱) 으로 매우 크고 거리가 가까워지면 더욱 커진다. 예를 들어서 거리가 반지름의 절반일 때는 신호의 기울기가 (4B/반지름), 거리가 반지름의 1/4일 때는 신호의 기울기가 (16B/반지름) 으로 매우 크게 증가함으로써 거리에 대한 신호 감도가 기존의 정전압모드에 비하여 매우 크다. 더욱이 시편표면에 피펫구멍이 접근하여 부딪히게 되는 순간에는 기울기가 더욱 커져서 기준 피드백 신호와의 차이도 커지므로 피드백기능으로 빠르게 거리를 멀어지도록 할 수 있어 시편(3)표면과 피펫(1)의 부딪힘을 방지할 수 있게 된다. 시편표면에 더 접근하여 이미징하면 더욱 고분해능으로 이미징할 수 있는데, 정전류모드는 이 경우 감도가 더욱 높아지므로 기존의 정전압모드서는 불가능했던 고분해능 이미징이 가능하다.

피펫을 상하로 진동시키면서 변하는 이온전류를 측정하는 거리진동모드 이온전도현미경과 달리 AC이온전류를 측정하기 위한 위상잠금 증폭기(lock-in amplifier)와, 피펫을 상하로 진동시키는 고가의 거리진동용 나노스테이지, 거리진동용 신호발생기를 필요로 하지 않기 때문에 고속으로 이미징하는데 아무런 제약이 없다. AC이온전류를 위상잠금 증폭기(lock-in amplifier)로 측정하는 거리진동모드와는 달리 이미징속도에 한계가 없어서 본 발명의 정전류모드 이온전도현미경은 고속 고분해능 이미징이 가능한 모드이다.

상기한 바와 같이 정전류모드 이온전도현미경에 있어서 이온전도저항에 비례하는 신호를 사용하는데, 일반적인 회로이론에 있어서 어떤 저항을 전류가 통과하 게 되면 저항 양단의 전압 차이가 통과 전류와 저항의 곱으로 표현된다. 이러한 저항 양단의 전압은 간단한 전자회로를 이용하는 프리앰프 등과 같은 검출회로를 사용함으로써 쉽게 검출하여 이온전도저항에 비례하는 신호로서 사용할 수 있다. 이 프리앰프는 간단하게 구성될 수 있고 신호처리속도가 빨라서 고속이미징에 장애가 될 수 없다.

또한, 상기 정전압모드중 거리진동모드의 경우 도 3에서 보는 바와 같이 거리에 대한 신호 감도는 매우 크지만 일정 거리 이상 접근시 다시 감소하므로 이 구간에서는 피드백이 이루어지지 않고 피펫이 시편에 오히려 부딪히게 된다. 만약 거리진동모드를 정전류모드에서 구현하여 이미징을 하게 되면 이와 같이 신호가 감소하는 경우 없이 거리가 가까워짐에 따라서 1/(거리의 제곱) 에 비례하는 큰 감도를 가져서 피드백도 더욱 안정적으로 할 수 있고 시편표면과 더욱 가까운 위치에서 고분해능 고감도로 이미징이 가능하다. 이와 같이 본 발명의 정전압모드 이온전도현미경은 거리진동 모드의 잡음감소 기능 등 모든 장점을 추가하여 매우 유용한 고속 고감도 고분해능 이미징이 가능하다.

또한 상기 정전류모드 이온전도현미경에서, 전극에 정전류와 작은 교류전류를 더하여 인가한 후에 교류전류에 동기된 신호를 위상잠금 증폭기 등으로 검출하여 사용한다면, 특히 거리 의존 신호만을 추출하고 잡음을 억제할 수 있으므로 이미지의 품질을 더 높일 수 있다.

상기에서 설명한 정전류모드 이온전도현미경의 속도에 미치지는 못하지만 만약 정전압모드 이온전도현미경의 신호를 A라고 할 때 이 신호를 1/A로 만드는 회로 를 추가로 사용한다면 거리에 대한 감도를 높일 수 있으므로 고감도 이미징을 구현할 수 있다. 이것은 한 예로서 이와 같이 정전압모드의 이온전류신호를 임의의 전자회로를 통과하여 후처리함으로써 거리에 대한 신호감도를 높인다면 고감도 이미징이 가능하게 된다.

상기 정전압모드의 후신호처리를 하고 거리진동모드를 함께 적용하면, 기존 정전압모드의 거리진동모드에서 시편표면과 피펫구멍과의 거리가 가까워지면 다시 신호가 감소하여 피드백 작동이 되지 않는 단점도 없앨 수 있고, 아울러 후신호처리의 고감도 특징 등 정전류모드의 모든 장점과 거리진동모드의 장점을 결합함으로써 매우 유용한 고속 고감도 고분해능 이미징이 가능하다.

상기 이온전류는 이온이 많이 포함된 버퍼용액 내에서 버퍼용액 내에 놓여진 기준전극과 피펫전극 사이에 전위차이가 존재할 때 피펫구멍을 통해서 흐르는 이온전류이다. 아울러 상기 버퍼용액은 이온을 포함한 어떠한 용액도 가능하다.

도 4는 본 발명의 정전류모드 이미징방법으로 생체물질인 변성 콜라겐(denatured collagen)을 명확하게 이미징한 결과를 나타낸 시편표면을 3차원으로 나타낸 이미징 프로파일이다. 또한, 속도면에서 기존의 거리진동모드로는 0.5Hz 정도의 한 줄 주사속도로 이미징할 수 있었으나, 본 발명의 정전류모드로는 3Hz의 약 6배 더 빠른 속도로 이미징할 수 있었다. 여기서 속도 증가가 6배로 제한된 것은 우리가 사용한 주사장치의 한계 때문이지 정전류모드의 속도 한계가 아니다. 따라서 현재 본 실험실에서 셋업하고 있는 고속나노스테이지를 이용하면 더욱 빠르게 이미징할 수 있다. 결과적으로 도 4는 본 발명의 정전류모드가 거리진동모드 수준 의 이미징을 더욱 고속으로 할 수 있음을 보여 주는 한 예이다.

본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 바람직한 실시예를 중심으로 기술되었지만 당업자라면 이러한 기재로부터 본 발명의 범주를 벗어남이 없이 많은 다양한 자명한 변형이 가능하다는 것은 명백하다. 따라서 본 발명은 첨부된 특허청구범위의 문언에 의해서만 제한 해석될 수 있다.

도 1은 기존의 정전압모드 이온전도현미경의 구조를 나타낸 도면.

도 2는 본 발명에 따른 정전류모드 이온전도현미경의 구조를 나타낸 도면.

도 3은 본 발명에 따른 정전류모드 이온전도현미경, 정전압모드 이온전도현미경과 정전압모드중 거리진동모드 이온전도현미경에 있어서 신호크기의 피펫구멍-시편표면 거리에 대한 감도를 도시한 그래프.

도 4는 본 발명의 정전류모드 이미징방법으로 변성 콜라겐(denatured collagen)을 이미징한 결과를 나타낸 시편표면의 프로파일.

*도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명*

1: 피펫 1a: 피펫구멍

2: 피펫 전극 3: 시편

Claims (5)

1. 피펫 전극(2)을 구비한 피펫(1)의 피펫구멍(1a)을 통해 이온전류를 흐르게 하여 시편(3)표면의 형상을 이미징하는 이온전도현미경의 상기 피펫 전극(2)에 정전류를 인가하여, 상기 피펫(1)의 피펫구멍(1a)과 시편(3)표면의 거리에 민감하게 의존하는 이온전도저항에 비례하는 신호를 피드백신호로 사용하여 시편표면의 형상을 이미징하는 것을 특징으로 하는 고속 정전류모드 이온전도현미경.
2. 제 1항에 있어서,

   상기 이온전도현미경은 상기 이온전도저항에 비례하는 신호를 직접 피드백신호로 사용하는 일반이온전도현미경, 피펫 또는 시편을 상하로 진동시켜서 진동에 비례하는 신호를 사용하는 거리진동모드이온전도현미경 및 정전류와 이보다 작은 교류전류를 합한 전류를 피펫전극에 인가하고 위상잠금 증폭기로 상기 교류전류에 동기된 신호를 측정하는 교류전류형 이온전도현미경으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 고속 정전류모드 이온전도현미경.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,

   상기 이온전도저항에 비례하는 신호 또는 상기 이온전도저항에 걸리는 전압을 검출하는 검출회로를 구비한 것을 특징으로 하는 고속 정전류모드 이온전도현미경.
4. 정전압이 인가된 피펫 전극을 구비한 피펫의 피펫구멍을 통해 흐르는 이온전류의 값의 변화를 감지하여 이를 이미지화하는 피펫을 구비한 이온전도현미경의 상기 이온전류 신호를 상기 피펫의 피펫구멍과 시편표면의 거리에 민감하게 의존하는 이온전도저항에 비례하는 신호로 변환시켜 이 변환된 신호를 피드백신호로 사용하여 시편표면의 형상을 이미징하는 것을 특징으로 하는 고속 정전류모드 이온전도현미경.
5. 제 4항 있어서,

   상기 이온전도현미경은 상기 변환된 신호를 직접 피드백신호로 사용하는 일반이온전도현미경, 피펫 또는 시편을 상하로 진동시켜서 진동에 비례하는 신호를 사용하는 거리진동모드 이온전도현미경 및 정전압과 이보다 작은 교류전압을 합한 전압을 피펫전극에 인가하고 위상잠금 증폭기로 상기 교류전압에 동기된 신호를 측정하는 교류전압형 이온전도현미경으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 고속 정전류모드 이온전도현미경.

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