KR20100003371A - 종양 항원에 결합하는 비-표지된 제 1 단클론 항체 및 ｎｉｒ 형광 표지로 표지된 비-교차 반응성 제 2 단클론 항체로 이루어진 조성물 - Google Patents
종양 항원에 결합하는 비-표지된 제 1 단클론 항체 및 ｎｉｒ 형광 표지로 표지된 비-교차 반응성 제 2 단클론 항체로 이루어진 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 종양 항원에 결합하는 비-표지된 제 1 단클론 항체 및 동일한 종양 항원에 결합하는 NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체로 이루어진 조성물에 관한 것으로서, 여기서 제 1 및 제 2 항체는 교차 반응성을 보이지 않는다. 상기 조성물은 이러한 종양 항원의 과다발현과 관련된 고체 종양을 겪는 환자의 치료에 사용될 수 있다. 또한 본 발명은 상기 제 1 및 제 2 항체의 공동 투여 뿐 아니라, 이러한 종양의, 또는 상기 조성물로 상기 환자를 치료하는 동안 이러한 종양을 겪는 환자의 NIR 형광 영상을 얻는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 종양 항원에 결합하는 비-표지된 제 1 단클론 항체 및 동일한 종양 항원에 결합하는 NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체로 이루어진 조성물에 관한 것으로서, 여기서 제 1 및 제 2 항체는 교차 반응성을 보이지 않는다. 상기 조성물은 이러한 종양 항원의 과다발현과 관련된 고체 종양을 겪는 환자의 치료에 사용될 수 있다. 또한 본 발명은 상기 제 1 및 제 2 항체의 공동 투여 뿐 아니라, 이러한 종양의, 또는 상기 조성물 또는 상기 항체의 공동 투여로 치료하는 동안 이러한 종양을 겪는 환자의 NIR 형광 영상을 얻는 방법에 관한 것이다.
치료요법에서의
단클론
항체
암에 대한 치료적 무기고를 개선하기 위한 진행 중인 연구에서, 수술, 화학요법 및 방사선요법 외의 4번째 무기, 즉 표적 치료요법이 떠오르고 있다. 표적 치료요법은 티로신 키나아제 수용체 억제제 (이마티닙, 게피티닙 및 에르로티닙 과 같은 작은 분자 억제제), 프로테아좀 억제제 (보르테조밉), 생물학적 반응 개질제 (데니류킨 디프티톡스) 및 단클론 항체 (MAb)를 포함한다. 표적 치료요법으로서 MAb의 주목할 만한 특이성은 이를 인간 치료요법에 대한 유망한 제제로 만든다. MAb는 질환에 대해 보호하기 위해 치료학적으로 사용될 수 있을 뿐 아니라, 다양한 질병의 진단, 혈청 단백질 및 약물 수준의 측정, 조직 및 혈액의 유형 분류 및 면역 반응에 포함된 감염 제제 및 특이적 세포를 확인하는데 사용될 수 있다. 개발 중인 모든 생물공학 약물의 약 4분의 1이 MAb이고, 약 30개 제품이 사용 중이거나 조사 중이다. 다수의 MAb는 암 치료에 사용된다 (Gupta, N.; 등, Indian Journal of Pharmacology 38 (2006) 390-396; Funaro, A.; 등, Biotechnology Advances 18 (2000) 385-401; Suemitsu, N. 등, Immunology Frontier 9 (1999) 231-236)
표지된
단클론
항체 및 체내 영상화
통상 항체의 표지된 유도체를 기준으로 종양 조직에서의 치료적 항체의 정량화에 대해, 여러 체내 영상화 방법이 활용가능하다. 상기 표지된 항체에는 통상 방사선표지 예컨대 124I, 111In, 64Cu 및 다른 것들 (위치 방출 단층 촬영 (PET)에서 사용됨), (예를 들어 Robinson, M.K., 등, Cancer Res 65 (2005) 1471-1478; Lawrentschuk, N., 등, BJU International 97 (2006) 916-922; Olafsen, T., 등, Cancer Research 65 (2005) 5907-5916; 및 Trotter, D. E., 등, Journal of Nuclear Medicine 45 (2004) 1237-1244를 참고), 123I, 125I 및 99 mTc 및 다른 것들 (단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영 (SPECT)에서 사용됨) (예를 들어 Orlova, A., 등, Journal of Nuclear Medicine 47 (2006) 512-519; Dietlein, M., 등, European Journal of Haematology 74 (2005) 348-352 참고)로 표지된 항체가 포함된다.
또한, 비방사성 표지가 체내 영상화 기술에 대해 공지되는데, 예를 들어 근적외선 (NIR) 형광 표지, 활성화 염료 및 내인성 리포터 군 (GFP성 단백질과 같은 형광 단백질 및 생물발광 영상화)이 있다 (Licha, K., 등, Adv 약물 Deliv Rev, 57 (2005) 1087-1108). 특히 NIR 형광 영상화는 종양 조직에서의 치료적 항체의 정량화에 사용될 수 있다. 현재 사용되는 다른 임상 영상화 기술을 넘어서는 근적외선 영상화의 유리한 점에는 하기가 포함된다: 다중, 식별가능한 프로브의 동시 사용에 대한 가능성 (분자 영상화에서 중요함); 높은 시간 해상도 (기능적 영상화에서 중요함); 높은 공간 해상도 (체내 현미경 검사에서 중요함); 및 안전성 (이온화 방사 없음).
NIR 형광 영상화용 단일 제제로서 사용된, NIR 형광 표지와 공유 결합된 상이한 단클론 항체가 존재한다 (Hilger, I., 등, Eur Radiol (2004) 1124-1129; Ballou, B., 등, Cancer Immunol Immunother. 41 (4) (1995) 257-63; Ballou, B., 등, Proceedings of SPIE-The International Society for Optical Engineering 2680 (1996) 124-131; Ballou, B., 등, Biotechnol Prog. (1997) 649-58; Ballou, B., 등, Cancer detection and prevention (1998), 22 251-257 Becker, A., 등, Nature Biotechnology 19 (2001) 127-131; Montet, X., 등, Cancer Research 65 (2005), 6330-6336; Rosenthal, E.L., 등, The Laryngoscope 116 (2006) 1636- 1641; EP 1619501, WO 2006/072580, WO 2004/065491 및 WO 2001/023005).
NIR 형광 영상화에서, 정의된 주파수 폭으로 여과된 광 또는 레이저가 여기 광의 원천으로서 사용된다. 여기 광은 신체 조직을 통과하여 이동한다. 이것이 근적외선 형광 분자 ("조영제")와 조우하는 경우, 여기 광이 흡수된다.
이후 형광 분자는 여기 광으로부터 스펙트럼으로 식별가능한 (약간 긴 파장) 광을 방사한다 (형광). 근적외선광에 의한 생물학적 조직의 양호한 투과에도 불구하고, 통상적인 근적외선 형광 프로브는 다른 조영제와 조우하는 많은 동일한 제한 (낮은 표적/배경 비율을 포함)에 접한다.
근적외선 파장 (약 640~1300 nm)은 내부 조직의 광학 영상화에 사용되어 왔는데, 이는 근적외선 방사선이 6~8 센티미터 이하의 조직 투과를 나타내기 때문이다. 예를 들어, [Wyatt, J.S., 및 Kirkpatrick, P.J., Phil. Trans. R. Soc. B 352 (1997) 701-705; Tromberg, 등, Phil. Trans. R. Soc. London B 352 (1997) 661-667]를 참고한다.
체내 영상화에 사용된 항체-표지 컨쥬케이트의 정확한 양은 사용된 표지의 상이한 특징 및 측면에 의지하는데, 예를 들어 NIR 형광 표지에 대해서 표지의 양 수율은 사용된 표지된 항체 또는 표지의 양에 대한 기준 중 하나이다 (예를 들어 WO 2006/072580를 참고).
단클론
항체로의 치료 동안의 치료요법
모니터링
악성 질환의 성공적인 치료요법에 영향을 주는 요소에는 사용된 항체 용량 (dose) 및 투여 일정, 항체의 반감기 및 빠른 혈중 제거율, 순환 항원의 존재, 높 은/몰 중량 단클론 항체 (Mab)의 취약한 종양 투과 및 이들 분자가 이화하는 방법이 포함된다. 현재, 항체의 생리학적 기능 및 대사 작용의 많은 측면에 대한 정보가 부족하다 (Iznaga-Escobar, N. 등, Meth. Find. Exp. Clin. Pharm. 26(2) (2004) 123-127). 그러므로 이러한 치료요법의 추이를 모니터링하는 것이 중요하다.
이러한 치료의 성공은 통상 흉부 X선, 컴퓨터 단층 촬영 (CT), 컴퓨터 단층 촬영 (CAT), 분자 공명 영상화 (MRI), 양전자 방출 단층 촬영 (PET), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영 (SPECT), 형광 영상화 (FI) 및 생물발광 영상화 (BLI)와 같은 상이한 영상화 기술을 사용하여 평가된다 (예를 들어 Helms, M. W, 등, Contributions to microbiology 13 (2006) 209-231 및 Pantel, K., 등, JNCI 91 (1999) 1113-1124 참고). 이는 종종 치료에 대한 "반응"으로서 정의된다. RECIST 기준에 따라 고체 종양에 대한 종양 반응은 (Therasse, 등, J. Nat. Cancer Institute. 92 (2000) 205-216) 네 가지 수준으로의 종양의 부피 향상 또는 퇴화 에 따라 카테고리화된다 (예를 들어 CT를 통해 측정됨): 완전 반응 (CR) 또는 부분 반응 (PR), 안정 질환 (SD) 및 진행 질환 (PD) (표 1 참고). 또한, 유럽 암 연구 치료 연합 (EORTC)은 2-[18F]-플루오로-2-데옥시글루코오스 포지트론 방출 단층 촬영 (FDG-PET)을 통해 측정된 종양의 대사 작용에 따른 네 가지 수준으로의 카테고리화를 제시하였다 (Young, H., 등, Eur J Canc 35 (1999) 1773-1782 및 Kelloff, G. J., 등, Clin Canc Res 11 (2005) 2785- 2808): 완전 대사 작용 반응 (CMR) 또는 부분 대사 작용 반응 (PMR), 안정 대사 작용 질환 (SMD) 및 진행 대사 작용 질환 (PMD) (표 2 참고). 최근에는 CT 및 PET로의 조합된 평가가 보다 흔하다. CT가 주로 종양 크기의 발달에 초점을 두어, 종양 대사 작용에 대한 제한된 정보만을 전달하며, 방사성 조사에 대한 노출과 관련되는 반면, PET 영상화는 종양 대사 작용에 대한 식견을 더 제공하지만, 방사성 표지가 이러한 기술에 여전히 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 하기 제 1 및 제 2 항체가 교차 반응성을 갖지 않는 것을 특징으로 하는, 하기를 포함하는 약학 조성물을 포함한다:
a) 종양 항원에 결합하는 비-표지된 제 1 단클론 항체 및
b) 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는, NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체.
이러한 조성물은 항체를 모두 포함하는 한 구획, 또는 하나는 비-표지된 단클론 항체를 포함하고 하나는 표지된 단클론 항체를 포함하는 두 구획으로 이루어질 수 있다.
바람직하게는 비-표지된 단클론 항체는 항-HER2 항체, 바람직하게는 트라스투주맙 또는 페르투주맙이다.
또 다른 바람직한 구현예에서 비-표지된 단클론 항체는 항-EGFR 항체, 바람직하게는 카에툭시맙 또는 rhMab ICR62이다.
본 발명의 한 구현예는 상기 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양을 겪는 환 자의 치료용 약제 제조를 위한, 종양 항원에 특이적으로 결합하는 비-표지된 제 1 단클론 항체의 용도이며, 여기서 비-표지된 제 1 단클론 항체는 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는 NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체와 공동 투여된다 (제 1 및 제 2 항체는 교차 반응성을 나타내지 않는 것을 특징으로 함).
본 발명의 또 다른 구현예는 비-표지된 제 1 단클론 항체로 이전에 치료된, 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양을 겪는 환자의 치료용 약제의 제조를 위한, 상기 종양 항원에 특이적으로 결합하는 상기 비-표지된 제 1 단클론 항체, 및 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는 NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체의 용도로서, 제 1 및 제 2 항체가 교차 반응성을 갖지 않는 것을 특징으로 하며, 그로 인해 상기 이전 치료 후 고체 종양의 부위에서의 형광 신호가, 상기 비-표지된 제 1 단클론 항체를 사용한 상기 이전 치료 전 고체 종양의 상기 부위에서의 NIR 형광 신호와 비교하여 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상 감소된다.
본 발명의 또 다른 측면은 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양을 겪는 환자의 치료용 약학 조성물의 제조를 위한, 상기 종양 항원에 특이적으로 결합하는 비-표지된 제 1 단클론 항체의 용도로서, 약제의 투여 패턴은 하기의 단계를 포함하고, 제 1 및 제 2 항체가 교차 반응성을 나타내지 않는 것을 특징으로 한다:
a) 환자가, 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는 NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체로 제 1 용량을 받는 단계;
b) 고체 종양의 부위에서의 NIR 형광 표지로 표지된 상기 제 2 단클론 항체 의 NIR 형광 신호를 측정하는 단계;
c) 환자가 상기 비-표지된 제 1 단클론 항체로 제 1 용량을 받는 단계;
d) 환자가 NIR 형광 표지로 표지된 상기 제 2 항체로 제 2 용량을 받는 단계;
e) 고체 종양의 상기 부위에서 NIR 형광 표지로 표지된 상기 제 2 단클론 항체의 NIR 형광 신호를 측정하고, b) 하에 측정한 신호와 비교하여 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상으로 감소되는 단계;
f) 환자가 단계 e)의 측정 결과를 기준으로 상기 비-표지된 제 1 단클론 항체로 제 2 용량을 받는 단계.
본 발명의 또 다른 측면은 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양을 겪는 환자의 치료용 약학 조성물의 제조를 위한, 상기 종양 항원에 특이적으로 결합하는 NIR 형광 표지로 표지된 단클론 항체의 용도이다.
본 발명의 또 다른 측면은 고체 종양의 치료용 약제의 제조를 위한, 종양 항원에 특이적으로 결합하는 비-표지된 제 1 단클론 항체의 용도로서, 상기 치료 동안, 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는 NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체가 치료를 모니터링하는데 사용되며, 제 1 및 제 2 항체가 교차 반응성을 나타내지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 종양 항원에 특이적으로 결합하는 비-표지된 제 1 단클론 항체의 용량, 및 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는 NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체의 용량을 받은, 상기 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양을 겪는 환자의 NIR 형광 영상을 얻는 방법으로서, 제 1 및 제 2 항체가 교차 반응성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하며, 여기서 NIR 형광 신호는 고체 종양의 부위에서 측정된다.
본 발명의 또 다른 측면은, 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 단클론 항체로 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양을 겪는 환자를 치료하는 동안 고체 종양의 부위에서 종양 항원에 특이적으로 결합하는 NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체의 신호가 측정되는 NIR 형광 영상을 얻는 방법으로서, 제 1 및 제 2 항체가 교차 반응성을 나타내지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는 비-표지된 제 1 단클론 항체로 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양을 겪는 환자를 치료하는 동안 고체 종양의 부위에서 종양 항원에 특이적으로 결합하는 NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체의 NIR 형광 신호를 측정하는 방법으로서, 하기 단계가 수행되고, 제 1 및 제 2 항체가 교차 반응성을 나타내지 않는 것을 특징으로 한다:
a) 환자가 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는, NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체로 제 1 용량을 받는 단계 (여기서 제 1 및 제 2 항체는 교차 반응성을 나타내지 않음),
b) 고체 종양의 부위에서 NIR 형광 표지로 표지된 상기 제 2 단클론 항체의 NIR 형광 신호가 측정되는 단계,
c) 환자가 상기 비-표지된 제 1 단클론 항체로 제 1 용량을 받는 단계,
d) 환자가 NIR 형광 표지로 표지된 상기 제 2 항체로 제 2 용량을 받는 단 계,
e) 고체 종양의 상기 부위에서 NIR 형광 표지로 표지된 상기 제 2 단클론 항체의 NIR 형광 신호를 측정하고, b) 하에 측정된 신호와 비교하여 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상으로 감소되는 단계,
f) 환자가 단계 e)의 측정 결과를 기준으로 상기 비-표지된 제 1 단클론 항체로 제 2 용량을 받는 단계.
용어 "항체"는 전체 항체, 인간 항체, 인간화된 항체 및 유전자 조작된 항체 (단클론 항체, 키메라 항체 또는 재조합 항체와 같은) 뿐 아니라 본 발명에 따른 특징적인 특성이 유지되는 한 이러한 항체의 절편을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 다양한 형태의 항체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "단클론 항체" 또는 "단클론 항체 조성물"은 단일 아미노산 조성의 항체 분자의 제조물을 나타낸다. 따라서, 용어 "인간 단클론 항체"는 인간 생식 계열 면역글로불린 서열에서 유래한 가변 및 불변 부위를 갖는, 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 나타낸다. 한 구현예에서, 인간 단클론 항체는 유전자삽입 비인간 동물, 예를 들어 유전자삽입 마우스 (불멸화 세포와 융합된 인간 경쇄 삽입유전자 및 인간 중쇄 삽입유전자를 포함하는 게놈을 갖는)에서 수득한 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 제조된다.
용어 "키메라 항체"는 통상 재조합 DNA 기술에 의해 제조된, 상이한 원천 또는 종에서 유래된 불변 부위의 적어도 한 일부, 및 한 원천 또는 종으로부터의 가변 부위 즉 결합 부위를 포함하는 단클론 항체를 나타낸다. 쥐과 가변 부위 및 인간 불변 부위를 포함하는 키메라 항체가 특히 바람직하다. 이러한 쥐과/인간 키메라 항체는 쥐과 면역글로불린 가변 부위를 인코딩하는 DNA 단편, 및 인간 면역글로불린 불변 부위를 인코딩하는 DNA 단편을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 생성물이다. 본 발명에 의해 포함되는 다른 형태의 "키메라 항체"는 원래 항체의 것에서 개질 또는 변화된 클래스 또는 서브클래스의 것이다. 이러한 "키메라" 항체를 또한 "클래스-전환된 항체"로서 나타낸다. 키메라 항체의 생성 방법에는 현재 당업계에 잘 공지된 통상적인 재조합 DNA 및 유전자 트렌스펙션 기술이 포함된다. 예를 들어, [Morrison, S.L., 등, Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5,202,238 및 US 5,204,244]를 참고한다.
용어 "인간화된 항체"는 모체 면역글로불린의 것과 비교하여 상이한 특이성의 면역글로불린의 CDR (상보성 결정 부위)를 포함하도록 골격부 또는 "상보성 결정 부위"가 개질된 항체를 나타낸다. 바람직한 구현예에서, 쥐과 CDR은 "인간화된 항체"가 제조되도록 인간 항체의 골격부 부위에 이식된다. 예를 들어, [Riechmann, L., 등, Nature 332 (1988) 323-327; 및 Neuberger, M.S., 등, Nature 314 (1985) 268-270]을 참고한다. 특히 바람직한 CDR은 키메라 및 양기능 항체에 대해 상기 나타낸 항원을 인지하는 서열을 나타내는 것에 상응한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "인간 항체"는 인간 생식 계열 면역글로불린 서열에서 유래한 가변 및 불변 부위를 갖는 항체를 포함하도록 의도된다. 인간 항체는 기술적 수준에서 잘 공지된다 (van Dijk, M.A., 및 van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374). 이러한 기술을 기준으로, 다양한 표적에 대한 인간 항체가 생성될 수 있다. 인간 항체의 예는, 예를 들어 [Kellermann, S. A., 등, Curr Opin Biotechnol. 13 (2002)593-597]에 기재된다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 NS0 또는 CHO 세포와 같은 숙주 세포로부터, 또는 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자삽입인 동물 (예를 들어 마우스)로부터 단리된 항체, 또는 숙주 세포에 트렌스펙션된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체를 포함하도록 의도된다. 이러한 재조합 인간 항체는 재배열된 형태로 인간 생식 계열 면역글로불린 서열에서 유래한 가변 및 불변 부위를 갖는다. 본 발명에 따른 재조합 인간 항체는 체내 체세포 과돌연변이되었다. 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 부위의 아미노산 서열은, 인간 생식 계열 VH 및 VL 서열에서 유래하고 관련되지만, 체내 인간 항체 생식 계열 목록 안에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
본원에 사용된 바와 같이, "특이적 결합"은 종양 항원 (항체가 이에 대해 특이적인)에 특이적으로 결합하는 항체를 나타낸다. 바람직하게는 결합 친화성은 KD-값 10-8 mol/l 이상 (예를 들어 10-9 mol/l), 바람직하게는 KD-값 10-9 mol/l 이상, 보다 바람직하게는 KD-값 10-10 mol/l 이상의 것이다. 결합 친화성은 표준 결합 분석법 예컨대 표면 플라스몬 공명 기술 (Biacore
)로 측정된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하도록 의도된다. 핵산 분자는 단일 나선 또는 이중 나선일 수 있으나, 바람직하게는 이중 나선 DNA이다.
"불변 영역"은 항원에 대한 항체 결합에 직접적으로 포함되지는 않으나, 효과기 기능 (ADCC, 상보성 결합 및 CDC)에는 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "가변 부위" (경쇄 (VL)의 가변 부위, 중쇄 (VH)의 가변 부위)는 항원에 대한 항체 결합에 직접적으로 포함되는 경쇄 및 중쇄의 각각의 쌍을 나타낸다. 가변 인간 경쇄 및 중쇄의 영역은 동일한 일반적 구조를 가지며 각각의 영역은 널리 보존된, 세 "고변위 부위" (또는 상보성 결정 부위, CDR)에 의해 연결된 네 개의 골격부 (FR) 부위를 포함한다. 골격부 부위는 β-시트 형태를 채택하고, CDR은 β-시트 구조를 연결하는 루프를 형성할 수 있다. 각각의 사슬에서의 CDR은 골격부 부위에 의해 이의 3차원 구조에서 고정되며, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 부위는 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화성에서 특히 중요한 역할을 하며, 따라서 본 발명의 추가적인 목적을 제공한다.
본원에서 사용되는 경우 용어 "고변이 부위" 또는 "항체의 항원-결합 부분"은 항원 결합을 책임지는 항체의 아미노산 잔기를 나타낸다. 고변이 부위는 "상보성 결정 부위" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "골격부" 또는 "FR" 부위는 본원에 정의된 바와 같은 고변이 부위보다는 가변 영역 부위의 것이다. 그러므로, 항체의 경쇄 및 중쇄는 N- 내지 C-말단의 영역 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 특히, 중쇄의 CDR3은 항원 결합에 대해 최대로 기여하는 부위이다. CDR 및 FR 부위는 [Kabat, E.A., 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]의 표준 정의 및/또는 "고변이 루프"로부터의 이들 잔기에 따라 결정된다.
본원에 사용된 바와 같은 "종양 항원"에는 당업계에 공지된 의미가 포함되는데, 종양 세포의 발암성 특징에 기여하는 것으로 공지 또는 생각되는 종양 세포 상 발현된 (또는 종양 세포의 발달과 관련된) 임의 분자가 포함된다. 많은 종양 항원이 당업계에 공지된다. 분자가 종양 항원인지는 또한 당업자에게 잘 공지된 기술 또는 분석법, 예를 들어 클론원성 분석, 형질전환 분석, 체외 또는 체내 종양 형성 분석, 겔 이동 분석, 유전자 넉아웃 분석 등에 따라 측정될 수 있다. 본원에서 사용되는 경우 바람직하게는 용어 "종양 항원"은 인간 막통과 단백질, 즉 세포의 지질 이중층에 고정되는 세포막 단백질을 나타낸다. 인간 막통과 단백질은 일반적으로 본원에서 사용된 바와 같은 "세포외 영역"을 포함할 것이며, 이는 리간드; 인산화될 수 있는 여러 티로신 잔기를 갖는 카르복실-말단 신호 영역, 보존된 세포내 영역 티로신 키나아제 영역 및 호지성 막통과 영역에 결합할 수 있다. 종양 항원에는 분자 예컨대 EGFR, HER2/neu, HER3, HER4, Ep-CAM, CEA, TRAIL, TRAIL-수용체 1, TRAIL-수용체 2, 림포톡신-베타 수용체, CCR4, CD19, CD20, CD22, CD28, CD33, CD40, CD80, CSF-1R, CTLA-4, 섬유모세포 활성 단백질 (FAP), 헵신, 멜라노마-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 (MCSP), 프로스테이트-특이적 막 항원 (PSMA), VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, IGF1-R, TSLP-R, TIE-1, TIE-2, TNF-알파, 세포자멸사의 TNF성 약한 유도제 (TWEAK), IL-1R, 바람직하게는 EGFR, HER2/neu, CEA, CD20 또는 IGF1-R; 보다 바람직하게는 HER2/neu 또는 EGFR, 보다 더 바람직하게는 HER2/neu가 포함된다.
용어 "과다발현된" 종양 항원 또는 종양 항원의 "과다발현"은, 조직 또는 기관으로부터의 정상 세포에서의 발현 수준에 관한 환자의 특정 조직 또는 기관 내 고체 종양과 같은 질환 영역으로부터의 세포에서의 종양 항원의 비정상적 발현 수준을 나타내도록 의도된다. 종양 항원의 과다발현을 특징으로 하는 고체 종양을 갖는 환자는 당업계에 공지된 표준 분석법으로 측정될 수 있다. 바람직하게는 과다발현은 면역조직화학 (IHC) 검출을 사용하여 동결 또는 파라핀-함몰된 조직 절편의 고정된 세포에서 측정된다. 조직학적 염색과 결합되는 경우, 표적 단백질의 국소화가 측정될 수 있고, 이의 종양 내 발현 정도가 정성적 및 반정량적으로 측정될 수 있다. 이러한 IHC 검출 분석법은 당업계에 공지되며, 예를 들어 임상 시험 분석 (CTA), HER2 항원용 시판되는 LabCorp 4D5 시험, 및 HER2 종양 항원용 시판되는 DAKO HercepTest
(DAKO, Carpinteria, Calif.)가 포함된다. 후 자 분석법 (DAKO HercepTest
)은 HER2 단백질의 과다발현을 갖는 암을 확인하기 위해 0 내지 3+ 세포 염색 (0은 정상 발현, 3+은 최대 양성 발현을 나타냄)의 특정 범위를 사용한다 (Herceptin
(트라스투주맙) 전체 지시 정보를 참고; September 1998; Genentech, Inc., San Francisco, Calif.). 따라서, 예를 들어 1+, 2+ 또는 3+, 바람직하게는 2+ 또는 3+, 보다 바람직하게는 3+의 범위 내에서의 HER2 종양 항원의 과다발현을 특징으로 하는 고체 종양을 갖는 HER2 종양 항원 환자에 대해, 본 발명의 치료요법이 이득이 될 것이었다. 대안적으로는 이러한 과다발현은 상기 종양 항원에 특이적으로 결합하는 NIR 형광 표지로 표지된 단클론 항체의 고체 종양의 부위에서의 NIR 형광 신호의 측정, 및 비종양성 조직 또는 다른 종양 비-과다발현 상기 종양 항원의 NIR 형광 신호 또는 영상에 대한, 고체 종양의 부위에서의 상기 NIR 형광 신호 또는 영상의 비교에 의해 검출될 수 있다 (예를 들어 실시예 1 및 2, 도 1 및 2를 참고).
용어 "교차 반응성을 나타내지 않는 제 1 및 제 2 항체"는 종양 항원에 특이적으로 결합하는 비-표지된 제 1 단클론 항체, 및 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는 NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체에서, 이들 두 항체가 상기 종양 항원에 관한 교차 반응성을 나타내지 않는다는 것을 나타낸다. 동일한 종양 항원에 관한 이들 두 항체의 교차 반응성은 경쟁 분석법으로 검출될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 예를 들어 효소 면역분석법으로, 고정된 종양 항원에 결합하기 위해 제 1 항체가 제 2 항체와 경쟁하는 정도를 시험한다. 이러한 목적을 위해, 적정하게 고정된 종양 항원을, 검출가능한 부분에 대해 분석 목적으로 컨쥬게이션된 제 1 항체 및 과량의 제 2 항체와 함께 인큐베이션한다. 검출가능한 부분에는 직접 검출가능 또는 간접 검출가능 시스템이 포함된다. 결합된 표지의 검출에 의해, 문제의 항체가 결합 부위로부터 공지된 항체를 교체할 수 있는 정도를 쉽게 확인할 수 있다. 동일한 농도 또는 더 높은 농도에서, 바람직하게는 105배 과량의 제 2 항체 (공지된 항체를 나타냄)의 경우에, 10% 초과, 바람직하게는 20% 초과의 교체가 있다면, 두 항체는 교차 반응성을 나타내는 것이다. 이는 두 항체가 동일 또는 중복되는 에피토프에 결합한다는 것을 의미한다 (비교차 반응성 및 교차 반응 실시예 예를 들어 실시예 3, 4 및 5, 도 3, 4 및 5 참고).
교차 반응성을 나타내지 않는 이러한 제 1 및 제 2 항체를 사용함으로써, 교차 반응성을 나타내는 제 1 및 제 2 항체의 신호/배경 비율과 비교하여 (예를 들어 실시예 3: 1.06 = 530MFI/500MFI - 트라스투주맙 치료 후 Cy5 표지된 트라스투주맙-도 3a 참고) 명백하게 개선된 (=더 높아진) 신호/배경 비율이 수득되었다 (예를 들어 실시예 3: 2.88 = 1440MFI/500MFI - 트라스투주맙 치료 후 Cy5 표지된 페르투주맙-도 3b 참고). 이는, 덜 NIRF 표지된 항체가 주어지더라도, 교차 반응 항체를 사용하는 것보다 종양 부위의 국소화가 양호하게 한다. 따라서 교차 반응성을 나타내지 않는 이러한 제 1 및 제 2 항체의 사용이 효과적이다.
따라서 본 발명의 한 구현예에서, 교차 반응성을 나타내지 않는 이러한 제 1 및 제 2 항체의 사용에 의한 신호/배경 비율은 1.5 이상, 바람직하게는 2.0 이상이다.
약어 MFI는 평균 NIR 형광 (NIRF) 신호 세기 [임의 단위]를 나타낸다. NIR 형광 신호 세기는, 관심 부위 (ROI)에서의 픽셀의 수 및 신호 세기를 합산하여 정량화될 수 있다.
용어 "신호/배경 비율"은 각각 관심 부위 (ROI) 예를 들어 고체 종양의 부위에서의 NIR 형광 신호 (MFI로서 측정됨), 및 각각 NIR 형광 배경 신호 (MFI로서 측정됨) 예를 들어 비종양 조직에서 측정된 신호의 신호/배경 비율을 나타낸다.
상기 경쟁 분석법에서 제 1 항체에 컨쥬게이션된 직접적으로 검출가능한 부분 (분석 목적만을 위한)에는, 예를 들어 크로모겐 (형광 또는 발광기 및 염료), 효소, NMR-활성기 또는 금속 입자, 합텐 예를 들어 디곡시게닌이 포함되며, 이는 검출가능 표지의 예이다. 간접적 검출 시스템에는, 예를 들어 검출 시약이 포함되는데, 예를 들어 검출 항체가 바이오아핀 결합 쌍의 제 1 파트너로 표지된다. 적절한 결합 쌍의 예는 합텐 또는 항원/항체, 바이오틴 또는 바이오틴 유사체 예컨대 아미노바이오틴, 이미노바이오틴 또는 데스티오바이오틴/아비딘 또는 스트렙타비딘, 당/렉틴, 핵산 또는 핵산 유사체/상보적 핵산, 및 수용체/리간드, 예를 들어 스테로이드 호르몬 수용체/스테로이드 호르몬이다. 바람직한 제 1 결합 쌍 멤버에는 합텐, 항원 및 호르몬이 포함된다. 특히 바람직한 것은 디곡신 및 바이오틴과 같은 합텐 및 이의 유사체이다. 이러한 결합 쌍의 제 2 파트너, 예를 들어 항체, 스트렙타비딘 등은 통상 직접 검출되도록, 예를 들어 상기 언급한 바와 같은 표지에 의해 표지된다. 검출가능한 표지는 또한 광활성가능한 교차 연결기 예를 들어 아지도 또는 아지린기일 수 있다. 전기화학발광으로 검출될 수 있는 금속 킬레이트는 또한 바람직한 신호-방사기이며, 루테늄 킬레이트 예를 들어 루테늄 (비스피리딜) 32+ 킬레이트가 특히 바람직하다. 적절한 루테늄 표지기는, 예를 들어 EP 0 580 979, WO 90/05301, WO 90/11511 및 WO 92/14138에 기재된다.
교차 반응성을 나타내지 않는, 동일한 종양 항원에 결합하는 이러한 제 1 및 제 2 항체의 예는, 예를 들어 두 항-HER2 항체 트라스투주맙 및 페르투주맙, 또는 두 항-EGFR 항체 세툭시맙 및 rhMab ICR62이다. 그러나 당업자는 종양 항원 예컨대 EGFR, HER2/neu, HER3, HER4, Ep-CAM, CEA, TRAIL, TRAIL-수용체 1, TRAIL-수용체 2, 림포톡신-베타 수용체, CCR4, CD19, CD20, CD22, CD28, CD33, CD40, CD80, CSF-1R, CTLA-4, 섬유모세포 활성 단백질 (FAP), 헵신, 멜라노마-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 (MCSP), 프로스테이트-특이적 막 항원 (PSMA), VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, IGF1-R, TSLP-R, TIE-1, TIE-2, TNF-알파, 세포자멸사의 TNF성 약한 유도제 (TWEAK), IL-1R, 바람직하게는 EGFR, HER2/neu, CEA, CD20 또는 IGF1-R에 대한 추가적인 비-교차 반응성 항체를 쉽게 만들 수 있다. 이러한 목적을 위해, 예를 들어 파지 디스플레이 기술이 (Henderikx 등 Cancer Res. 58 (1998) 4324-4332; Huse 등 Science 246 (1989) 1275-1281 또는 Kang 등 PNAS 88 (1991) 11120-11123에 기재된 바와 같은) 후속적인 키메라화 및/또는 인간화와 함께 사용될 수 있다. 또한 면역화 기술이 당업계에 잘 공지되므로, 관련 종양 항원 (예를 들어 이의 DNA, 이의 단백질 또는 절편)으로의 면역화가 이러한 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 IGF-1R에 대한 인간 항체는 하기의 방법에 따라 제조될 수 있다:
항-
IGF
-
IR
항체를 생성하는
하이브리도마
세포주의 생성
하이브리도마의
배양
생성된 HuMab 하이브리도마를, 2 mM L-글루타민 (BioWhittaker) 및 4% Origen 클로닝 인자 (Igen, France)가 보충된 하이브리도마 발현 배지 (PAA Laboratories GmbH, Austria)에서 37℃ 및 5% CO2에서; 또는 태아 클론 혈청 (50 ml: Hyclone, Utah) 및 Origen 하이브리도마 클로닝 인자 (30 ml: Igen, Gaithersburg MD)가 보충된 이스코브 개질 둘베코 배지 (500 ml: BioWhittaker Europe, Belgium)에서 37℃ 및 5% CO2에서 배양한다.
유전자삽입 마우스의 면역화 방법
10마리의 HCo7 유전자삽입 마우스 (수컷 4마리 및 암컷 6마리), 균주 GG2201 (Medarex, San Jose, CA, USA)을 1x106 NIH 3T3 세포로 대안적으로 면역화, IGF-IR에 대한 발현 벡터, IGF-IR의 가용성 세포외 영역 20 ㎍로 트렌스펙션한다. 총 6회 면역화 (IGF-IR 발현 세포로 3회 복강내 (IP) 면역화하고, 재조합 단백질로 꼬리 기반에서 3회 피하 (SC) 면역화)를 수행한다. 최초의 면역화를 위해, 100 ㎕의 1x106 NIH 3T3 IGF-IR 세포를 100 ㎕의 프로인트 완전 면역보강제 (CFA; Difco Laboratories, Detroit, USA)와 혼합한다. 다른 모든 면역화를 위해, PBS 중 세포 100 ㎕를 사용하거나, 재조합 단백질을 100 ㎕ 프로인트 불완전 면역보강제 (ICFA; Difco)와 혼합한다.
항원 특이적
ELISA
면역화된 마우스의 혈청에서의 항-IGF-IR 역가를, 항원 특이적 ELISA로 측정한다. 96웰 플레이트에 대해, PBS 중 1 ㎍/ml의 농도에서 IGF-IR 가용성 세포외 영역을 하룻밤 동안 4℃에서 코팅하거나, 또는 2시간 동안 37℃에서 코팅하였다. 그 후, 웰을 PBSTC (0.05% Tween
-20 및 2% 닭 혈청 (Gibco BRL)이 보충된 PBS)로 1시간 동안 실온에서 블러킹한다. 제 1 천자 혈청을 PBSTC에서 1/50 희석하고, 다른 모든 천자로부터의 혈청을 PBSTC에서 1/100 예비희석하고, 1/6400까지 연속 희석한다. 희석된 혈청을 웰에 첨가하고 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 에비-천자 혈청을 음성 대조군으로서 사용한다. 200 ng/ml 염소 항-인간 IGF-IR (100 ㎍/ml)을 양성 대조군으로서 사용한다. 이후, 플레이트를 PBST로 2회 세척하고 서양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP)-컨쥬게이션된 랫트 항-인간 IgG F(ab')2 (DAKO) (PBSTC에 1/2000 희석된)로 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 웰을 PBST로 2회 세척하고, 새롭게 제조한 ABTS
용액 (1 mg/ml) (ABTS: 2,2'-아지노 비스 (3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산)으로 암 (dark) 환경에서 30분 동안 실온 (RT)에서 분석을 현상하였다. 흡광도를 405 nm에서 측정한다.
FACS
분석
항원 특이적 ELISA에 의한 측정에 추가적으로, 면역화된 마우스의 혈청에서의 항-IGF-IR 역가를 또한 FACS 분석으로 측정한다. NIH 3T3 IGF-IR 세포 및 모체 NIH 3T3 세포를 희석된 혈청으로 30분 동안 4℃에서 인큐베이션한다. IP 면역화로 시작하여, 대체 IP 및 SC 면역화를 2주 간격으로 수행한다. 예비-천자 혈청 (모체 NIH 3T3 세포)을 음성 대조군으로서 사용한다. 초기에는, 200 ng/ml 염소 항-인간 IGF-IR을 양성 대조군으로서 사용한다. 1% 소과 혈청 알부민 및 0.01% 아자이드가 보충된 PBS에서 세포를 3회 세척한다. 이후, FACS 완충액에서 1/100 희석된 랫트 항-인간 인간 IgG의 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-컨쥬게이션된 항원 결합 절편 (F(ab')2 절편)으로 30분 동안 4℃에서 세포를 인큐베이션한다. 세포를 FACS 완충액에서 2회 세척하고, 검체를 FACSCalibur (Becton Dickinson, Erembodegem-Aalst, Belgium) 상에서 분석한다.
마우스의
부스팅
항-IGF-IR의 혈청 역가가 충분한 것으로 발견되는 경우, 융합 전 4 및 3일에, 마우스를 200 ㎕ PBS 중 15 ㎍ IGF-IR 세포외 영역으로 2회 추가적으로 정맥 내 (i.v.) 부스팅한다.
하이브리도마
생성
마우스를 희생시키고 비장 및 림프절 측면 위치 복부대동맥 및 대정맥을 수집한다. 비장세포 및 림프절 세포의, 융합 파트너 SP 2.0 세포로의 융합은 표준 작업 절차에 따라 수행된다.
κ-
ELISA
융합에서 야기된 하이브리도마가 인간 항체를 생성하는지를 측정하기 위해, κ-ELISA를 수행한다. PBS에서 1/10000 희석된 랫트 항-인간 IgG κ-경쇄 항체 (DAKO)로, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션에 의해 ELISA 플레이트를 코팅한다. 웰을 비운 후, 플레이트를 PBSTC로 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하여 블러킹한다. 그 후, PBSTC에서 1/2 희석된 하이브리도마 배양 상청액으로 웰을 인큐베이션한다. PBSTC에서 1/2 희석된 배양 배지를 음성 대조군으로서 사용하고, PBSTC에서 1/100 희석된 κ-경쇄 양성 마우스 혈청을 양성 대조군으로서 사용한다. 이후, 웰을 3회 세척하고 새롭게 제조한 ABTS
용액 (1 mg/ml)으로 암 (dark) 환경에서 30분 동안 실온 (RT)에서 분석을 현상한다. 흡광도를 ELISA 플레이트 리더에서 405 nm에서 측정한다.
이러한 방법으로 항-IGF-1R 항체 라이브러리를 생성할 수 있다.
상기 라이브러리 중 모든 항체 (이러한 기술 또는 또 다른 면역화 또는 파지 디스플레이 기술에 의해 생성됨)를 이후, 예를 들어 효소 면역분석으로 (상기 일반 정의 및 또한 상기 IGF-1R 항원 특이적 ELISA의 예를 참고), 이들이 동일한 종양 항원에 대한 교차 반응성을 나타내는지 아닌지를 시험할 수 있다. 이러한 방법으로 당업자는 교차 반응성을 나타내지 않는, 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 및 제 2 항체의 쌍을 쉽게 생성할 수 있다.
예를 들어 이러한 방법에서 상기 면역화 기술을 사용하면, 숙련자의 통상의 기술에 의해 하기로 이루어지는 군에서 선택된 제 1 비-표지된 항체에서와 같이 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는 제 2 비-교차반응성 항체가 생성된다: 알렘투주맙, 아폴리주맙, 세툭시맙, 에프라투주맙, 갈릭시맙, 젬투주맙, 이필리무맙, 라베투주맙, 파니투무맙, 리툭시맙, 트라스투주맙, 니모투주맙, 마파투무맙, 마투주맙, rhMab ICR62 및 페르투주맙. 이러한 제 2 비-교차반응성 항체는 이후 NIRF 표지 (예를 들어 Cy5)로 표지될 수 있고, 본 발명의 구현예 중 하나에 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "종양"은 전형적으로 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유류에서의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. 종양의 예에는 암종, 림프종, 모세포종 (속질모세포종 및 망막모세포종 포함), 육종 (지방육종 및 윤활 세포 육종), 신경내분비 종양 (카르시노이드 종양, 가스트린종 및 섬 세포 암 포함), 중피종, 신경집종 (청신경초종 포함), 수막종, 샘암종 및 흑색종이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 경우 용어 "고체 종양"은 위암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장 또는 콩팥암, 프로스테이트 암, 음문암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 고환암, 식도암, 담도 종양 뿐 아니라 두경부 암, 바람직하게는 유방암의 군에서 선택된 종양을 나타낸다.
본원에서 사용되는 경우 용어 "고체 종양의 부위"는 고체 종양을 포함하는 영역을 나타낸다. 고체 종양의 부위는 전체 고체 종양 또는 이의 오직 국부적인 부분을 포함할 수 있다. 상기 고체 종양 부위에서의 NIR 형광 신호가 측정되며, 상응하는 NIR 형광 영상은, 예를 들어 주변의 비-종양성 조직과 비교하여 또는 참고로서 상이한 시간 지점에서의 NIR 형광 신호 또는 영상과 비교하여, 2차원 또는 3차원 형태로 수득된다.
본원에서 사용되는 경우 용어 "공동 투여", "공동 투여된" 또는 "공동 투여하는"은, 표지된 단클론 항체가 비-표지된 단클론 항체와 함께 투여되는 것을 의미한다. 표지된 항체와 비-표지된 항체의 투여는 한 단일 제형으로서 또는 두 개별 제형으로서 (하나는 비-표지된 항체에 대한 것이고 하나는 표지된 항체에 대한) 실행될 수 있다. 공동 투여는 동시 또는 어느 한쪽 순서로 순차적일 수 있으며, 종양이 아직 존재하고 종양이 상기 종양 항원을 과다발현하는 한, 바람직하게는 단클론 항체 모두가 고체 종양 상에서 동일한 종양 항원에 동시에 결합하는 동안 시간 기간이 있다. 한 단일 제형이 사용된다면, 두 항체는 동시에 공동 투여된다. 두 개별 제형 (하나는 비-표지된 항체에 대한 것이고 하나는 표지된 항체에 대한)이 사용된다면, 두 항체가 동시에 (예를 들어 한 단일 연속 주입 또는 동시에 두 개별 연속 주입을 통한) 또는 순차적으로 투여된다. 항체 모두가 순차적으로 공동 투여되는 경우 표지된 항체는 두 개별 투여 중 동일한 날에 비-표지된 항체 전 또는 후에 투여될 수 있거나, 또는 예를 들어 표지된 항체는 NIR 형광 영상을 얻기 위해 1일에 투여되고 비-표지된 항체는 예를 들어 2일 내지 7일 후 공동 투여된다. 특정 기간 예를 들어 1 내지 5주 후, 비-표지된 항체의 추가 투여가 포함될 수 있는데, NIR 형광 표지로 표지된 항체가 NIR 형광 영상을 얻기 위해 다시 투여된다. 동일한 조건을 사용하여 (예를 들어 동일한 양의 표지된 항체, 투여 후 동일한 시간 지점, 동일한 획득 시간 등) 고체 종양의 부위에서 바람직하게 수득된 이들 NIR 형광 영상의 비교를 기준으로 하여, NIR 형광 신호가 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상 및 보다 바람직하게는 30% 이상 감소된 경우 비-표지 항체를 추가로 투여한다. 본원에 사용되는 경우 용어 "용량"은 단클론 항체의 투여를 나타낸다. 비-표지된 단클론 항체의 "용량"은, 예를 들어 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 체중의 범위일 수 있다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg 체중의 하나 이상의 연속 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 단속적으로, 예를 들어 매주 마다 또는 2주 또는 3주 마다 (예를 들어 환자가 약 2 내지 약 20회, 예를 들어 약 6회 용량의 트라스투주맙 및 페르투주맙을 각각 받도록) 투여될 수 있다. 또한, 초기의 더 높은 로딩 용량 후, 1회 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 그 중 NIR 형광 표지로 표지된 단클론 항체는 0.001 mg/kg 체중 이상, 바람직하게는 0.01 mg /kg 체중, 보다 바람직하게는 0.01 mg/kg 체중 이상의 양 또는 용량으로 공동 투여된다. 정확한 양 또는 "용량"은 다양할 수 있으며 예를 들어 표지 및 his 양 수율에 의존할 수 있다. 비-표지된 단클론 항체 및 NIR 형광 표지로 표지된 단클론 항체의 양 또는 "용량"은 단순한 정형적 실험으로써 숙련자에 의해 정의될 수 있다.
본원에서 사용되는 경우 용어 "약제의 투여 패턴"은 바람직하게는 상기 약제의 투여 동안의 순차적 단계를 나타내며, 이에는 투여 자체, 고체 종양의 부위에서의 NIR 형광 신호의 측정, 동일한 조건 하 측정된 동일한 고체 종양의 부위에서의 상이한 NIR 형광 신호의 비교 (예를 들어 비-표지된 단클론 항체의 투여 전 및 후, 동일한 고체 종양의 부위에서의 NIR 형광 신호가 치료 동안 감소하였다는 발견을 기준으로 한 비-표지된 단클론 항체 추가 용량의 투여)가 포함될 수 있다.
본원에서 사용되는 경우 비-표지된 제 1 단클론 항체로의 "상기 치료 동안" 용어는 동시 또는 어느 한쪽 순서로 순차적일 수 있는 NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체의 공동 투여를 나타내는데, 종양이 아직 존재하고 종양이 상기 종양 항원을 발현 또는 과다발현하는 한, 바람직하게는 단클론 항체 모두가 고체 종양 상에서 동일한 종양 항원에 동시에 결합하는 동안 시간 기간이 있다. 비-표지된 제 1 단클론 항체로의 "상기 치료 동안" 용어와 관련하여, 상기 비-표지된 제 1 단클론 항체의 치료 기간은 최초 용량 투여에서 시작 (상기 제 1 항체의 여러 연속 투여를 포함할 수 있으면서, 환자에 존재하는 상기 항체의 양 (바람직하게는 치료학적 유효량)이 항상 있음)하고, 상기 제 1 항체의 마지막 투여 후 상기 제 1 항체가 상기 환자 내에서 완전히 분해되는 시기 (바람직하게는 상기 제 1 항체가 치료학적 유효량 미만의 잔존량까지 분해될 때)에 끝난다.
본원에서 사용되는 경우 용어 "상기 비-표지된 제 1 단클론 항체로 이전에 치료된, 상기 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양을 겪는 환자"는, 상기 비-표지된 제 1 단클론 항체의 상기 1회 이상의 용량이 단클론 항체 모두로 환자를 치료하기 전 상기 환자에게 투여되었다는 것을 의미한다.
조직, 시스템, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 끌어낼 대상 화합물 또는 조합물의 양인 치료학적 유효량으로 환자에게 투여된 비-표지된 항체가 연구자, 수의사, 의학 박사 또는 다른 임상의에 의해 탐색되고 있다는 것이 자체적으로 명백하다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "환자"는 바람직하게는 암 또는 전암 상태 또는 병변에 대한 치료가 필요한 인간을 나타낸다. 그러나, 용어 "환자"는 또한 치료가 필요한 비-인간 동물, 바람직하게는 포유류 예컨대 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양 및 다른 것들 중 비-인간 영장목을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "NIR 형광 표지로 표지된 항체", "표지된 항체" 또는 "표지된 단클론 항체"는 NIR 형광 표지에 컨쥬게이션된 단클론 항체를 나타낸다. 컨쥬게이션 기술은 지난 연도 동안 크게 성숙되었으며, [Aslam, M., 및 Dent, A., Bioconjugation, London (1998) 216-363], 및 ["Macromolecule conjugation" in Tijssen, P. "Practice and theory of enzyme immunoassays" (1990) 221-278 Elsevier, Amsterdam]의 챕터에 우수한 개관이 주어진다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "비-표지 항체"는 NIR 형광 표지에 대해 표지되지도 않고 다른 부분에 컨쥬게이션되지도 않은 단클론 항체를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "NIR"은 근적외선을 의미한다.
본 발명은 하기 제 1 및 제 2 항체가 교차 반응성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는, 하기를 포함하는 약학 조성물을 포함한다:
a) 종양 항원에 특이적으로 결합하는 비-표지된 제 1 단클론 항체 및
b) 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는, NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체.
이러한 조성물은 단일 제형 상에서의 항체 모두를 포함하는 한 구획 또는 두 구획 (하나는 제 1 제형에서 비-표지된 단클론 항체를 포함하고, 하나는 제 2 제형에서 표지된 단클론 항체를 포함함)으로 이루어질 수 있다. 이러한 조성물은 상기 비-표지된 단클론 항체 및 표지된 단클론 항체의 공동 투여용으로 의도된다.
한 구현예에서, 상기 종양 항원은 EGFR, HER2/neu, HER3, HER4, Ep-CAM, CEA, TRAIL, TRAIL-수용체 1, TRAIL-수용체 2, 림포톡신-베타 수용체, CCR4, CD19, CD20, CD22, CD28, CD33, CD40, CD80, CSF-1R, CTLA-4, 섬유모세포 활성 단백질 (FAP), 헵신, 흑색종-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 (MCSP), 프로스테이트-특이적 막 항원 (PSMA), VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, IGF1-R, TSLP-R, TIE-1, TIE-2, TNF-알파, 세포자멸사의 TNF성 약한 유도제 (TWEAK), IL-1R, 바람직하게는 EGFR, HER2/neu, CEA, CD20, 또는 IGF1-R; 보다 바람직하게는 HER2/neu 또는 EGFR, 보다 더 바람직하게는 HER2/neu로 이루어지는 군에서 선택된다.
또 다른 구현예에서, 비-표지된 단클론 항체는 항-HER2 항체, 바람직하게는 트라스투주맙 또는 페르투주맙, 보다 바람직하게는 트라스투주맙이다.
또 다른 구현예에서, 비-표지된 단클론 항체는 항-EGFR 항체, 바람직하게는 세툭시맙, rhMab ICR62, 니모투주맙 또는 마투주맙, 보다 바람직하게는 세툭시맙 또는 rhMab ICR62이다.
또 다른 구현예에서, 비-표지된 단클론 항체는 항-IGF1R 항체이다.
또 다른 구현예에서, 비-표지된 단클론 항체는 하기의 군에서 선택된다:
알렘투주맙, 아폴리주맙, 세툭시맙, 에프라투주맙, 갈릭시맙, 젬투주맙, 이필리무맙, 라베투주맙, 파니투무맙, 리툭시맙, 트라스투주맙, 니모투주맙, 마파투무맙, 마투주맙, rhMab ICR62 및 페르투주맙, 바람직하게는 트라스투주맙, 세툭시맙, rhMab ICR62 및 페르투주맙, 보다 바람직하게는 트라스투주맙.
조성물은 전형적으로 0.001 mg/kg 체중 이상, 바람직하게는 0.01 mg /kg 체중 이상, 보다 바람직하게는 0.01 mg/kg 체중 이상의 양으로 NIR 형광 표지로 표지된 항체를 포함한다. 정확한 양은 다양할 수 있고 예를 들어 표지 및 his 양 수율에 의존할 수 있다. 상기 양은 단순한 정형적 실험으로써 숙련자에 의해 정의될 수 있다.
트라스투주맙 (상품명 Herceptin
으로 판매됨)은 HER2 과다발현/HER2 유전자 증폭된 전이 유방암의 치료에 사용되는 재조합 인간화된 항-HER2 단클론 항체이다. 트라스투주맙은 [Hudziak, R.M., 등, Mol. Cell. BioL 9 (1989) 1165-1172]에 기재된 쥐과 항-HER2 항체 4D5로서 HER2의 동일한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 트라스투주맙은 쥐과 항-HER2 항체 4D5의 재조합 인간화된 버전 (rhuMAb 4D5 또는 트라스투주맙으서로 나타냄)이며, 광범위한 이전 항암 치료요법을 받았던, HER2-과다발현 전이 유방암 환자에서 임상적으로 활성이었다 (Baselga, J., 등, J. Clin. Oncol. 14 (1996) 737-744). 트라스투주맙 및 이의 제조 방법은 US 5,821,337에 기재된다.
페르투주맙 (Omnitarg
)은 HER2 양성 암의 치료에 사용되는 또 다른 재조합 인간화된 항-HER2 단클론 항체이다. 페르투주맙은 2C4 에피토프, 트라스투주맙으로서 HER2의 세포외 영역 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 페르투주맙은 HER 이량체화 억제제 (HDI)의 신규 클래스 중 최초의 것이다. HER2 세포외 영역에 대한 이의 결합을 통해, 페르투주맙은 다른 HER 패밀리 멤버와 HER2와의 리간드-활성화된 헤테로이량체화를 막음으로써, 하류 신호 통로 및 종양 성장 및 진행과 관련된 세포적 과정을 억제한다 (Franklin, M.C., 등 Cancer Cell 5 (2004) 317-328 및 Friess, T, 등 Clin Cancer Res 11 (2005) 5300-5309). 페르투주맙은 쥐과 항-HER2 항체 2C4의 재조합 인간화된 버전 (rhuMAb 2C4 또는 페르투주맙으로서 나타냄)이며, 이는 각각의 제조 방법과 함께 WO 01/00245 및 WO 2006/007398에 기재된다.
트라스투주맙 및 페르투주맙은 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 및 제 2 단클론 항체의 예이며, 제 1 및 제 2 항체가 교차 반응성을 나타내지 않는 것을 특징으로 한다. 추가적인 예에는 두 항-EGFR 항체, 세툭시맙 및 rhMab ICR62가 포함된다.
세툭시맙은 EGFR 발현 종양의 치료에 사용되는 키메라 단클론 항-EGFR 항체 225 (c MAb 225, U.S 4,943,533 및 EP 0359 282)이다. C225 항체 (세툭시맙)는 EGF-매개되는 종양 세포 캐스케이드를 억제하는 것으로 증명되었다.
rhMab ICR62, 또 다른 항-EGFR 항체는 랫트 ICR62 항체의 재조합 인간화된 버전이며, WO 2006/082515에 기재된다.
두 항-EGFR 항체, 세툭시맙 및 rhMab ICR62는 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 및 제 2 단클론 항체의 추가적인 예를 나타내며, 제 1 및 제 2 항체가 교차 반응성을 나타내지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 측면은 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양을 겪는 환자의 치료용 약제의 제조를 위한, 상기 종양 항원에 특이적으로 결합하는 비-표지된 제 1 단클론 항체의 용도로서, 여기서 비-표지된 제 1 단클론 항체는, 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는, NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체와 함께 공동 투여되고, 제 1 및 제 2 항체가 교차 반응성을 나타내지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 한 측면에서 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양을 겪는 환자의 치료용 약제의 제조를 위한 상기 종양 항원에 특이적으로 결합하는 비-표지된 단클론 항체의 용도는, 상기 환자의 NIR 형광 영상이 수득되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 측면에서 이러한 용도는 고체 종양의 부위에서의 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는, NIR 형광 표지로 표지된 상기 단클론 항체의 NIR 형광 신호가 측정되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 비-표지된 제 1 단클론 항체로 이전에 치료된, 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양을 겪는 환자의 치료용 약제의 제조를 위한, 상기 종양 항원에 특이적으로 결합하는 비-표지된 제 1 단클론 항체, 및 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는, NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체의 용도로서, 이로써 상기 이전 치료 후 고체 종양의 부위에서의 NIR 형광 신호는 상기 비-표지된 제 1 단클론 항체로의 상기 이전 치료 전 고체 종양의 상기 부위에서의 NIR 형광 신호와 비교하여 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상 감소되었으며, 이는 제 1 및 제 2 항체가 교차 반응성을 나타내지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 측면은 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양을 겪는 환자의 치료용 약제의 제조를 위한, 상기 종양 항원에 특이적으로 결합하는 비-표지된 제 1 단클론 항체의 용도로서, 약제의 투여 패턴에는 하기 단계가 포함되고, 하기 제 1 및 제 2 항체가 교차 반응성을 나타내지 않는 것을 특징으로 한다:
a) 환자가 상기 비-표지된 제 1 단클론 항체로 제 1 용량을 받는 단계;
b) 상기 비-표지된 제 1 단클론 항체로의 상기 제 1 용량 후, 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는, NIR 형광 표지로 표지된 제 2 항체의 고체 종양의 부위에서의 NIR 형광 신호가, 상기 비-표지된 제 1 단클론 항체로의 상기 제 1 용량 전 고체 종양의 상기 부위에서의 NIR 형광 신호와 비교하여 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상 감소되는 단계;
c) 환자가 단계 b)의 측정 결과를 기준으로 상기 비-표지된 제 1 단클론 항체로의 제 2 용량을 받는 단계.
바람직하게는 단계 a) 내지 c)는 연속적인 단계 a), b) 및 c)로서 실행된다.
본 발명의 또 다른 측면은 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양을 겪는 환자의 치료용 약제의 제조를 위한, 상기 종양 항원에 특이적으로 결합하는 비-표지된 제 1 단클론 항체의 용도이며, 약제의 투여 패턴에는 하기의 단계가 포함되고, 제 1 및 제 2 항체는 교차 반응성을 나타내지 않는 것을 특징으로 한다:
a) 환자가 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는, NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체로 제 1 용량을 받는 단계;
b) 고체 종양의 부위에서의, NIR 형광 표지로 표지된 상기 제 2 단클론 항체의 NIR 형광 신호가 측정되는 단계;
c) 환자가 상기 비-표지된 제 1 단클론 항체로 제 1 용량을 받는 단계;
d) 환자가 NIR 형광 표지로 표지된 상기 제 2 항체로 제 2 용량을 받는 단계;
e) 고체 종양의 상기 부위에서의 NIR 형광 표지로 표지된 상기 제 2 단클론 항체의 NIR 형광 신호가 측정되고, b) 하에 측정된 신호와 비교하여 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상 감소되는 단계;
f) 환자가 단계 e)의 측정 결과를 기준으로 상기 비-표지된 제 1 단클론 항체로 제 2 용량을 받는 단계.
바람직하게는 단계 a) 내지 f)는 연속적 단계 a), b), c), d), e) 및 f)로서 실행된다.
본 발명의 또 다른 측면은 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양을 겪는 환자의 치료용 약학 조성물의 제조를 위한, 상기 종양 항원에 특이적으로 결합하는, NIR 형광 표지로 표지된 단클론 항체의 용도이다.
본 발명의 또 다른 측면은 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양의 치료용 약제의 제조를 위한, 상기 종양 항원에 특이적으로 결합하는 비-표지된 제 1 단클론 항체의 용도로서, 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는, NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체가 상기 치료에 대한 반응을 측정하는데 사용되며, 제 1 및 제 2 항체가 교차 반응성을 나타내지 않는 것을 특징으로 한다.
본원에서 사용되는 경우 용어 "상기 치료에 대한 반응을 측정함"은 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양을 겪는 환자의, 비-표지된 단클론 항체로의 치료 동안 NIR 형광 신호 또는 영상을 수득함을 나타낸다. 예를 들어 치료의 상이한 시간 지점에서 고체 종양 부위에서의 여러 측정이 수행될 수 있다. 또는 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양을 겪는 환자의 여러 NIR 형광 영상을 수득할 수 있다. 치료에 대한 "반응"은 이후 고체 종양의 상기 부위에서의 NIR 형광 신호의 감소 (증가)에 따라 상기 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양에 대해 카테고리화될 수 있는데, 고체 종양의 상기 부위에서의 종양 항원 발현의 감소 (증가)와 상관 관계가 있다 (예를 들어 실시예 4, 도 4 참고). 이와 관련하여 본 발명의 또 다른 바람직한 측면은 고체 종양의 치료용 약제의 제조를 위한, 종양 항원에 특이적으로 결합하는 비-표지된 제 1 단클론 항체의 용도로서, 여기서 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는, NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체가 상기 종양 항원의 발현을 측정하는데 사용되며, 제 1 및 제 2 항체가 교차 반응성을 나타내지 않는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는 상기 기재된 바와 같은 약학 조성물의 제조를 위한, 종양 항원에 특이적으로 결합하는 비-표지된 단클론 항체의 용도 뿐 아니라 하기 기재된 방법은, 단클론 항체 모두가 특이적으로 결합하는 상기 종양 항원이 하기로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다: EGFR, HER2/neu, HER3, HER4, Ep-CAM, CEA, TRAIL, TRAIL-수용체 1, TRAIL-수용체 2, 림포톡신-베타 수용체, CCR4, CD19, CD20, CD22, CD28, CD33, CD40, CD80, CSF-1R, CTLA-4, 섬유모세포 활성 단백질 (FAP), 헵신, 흑색종-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 (MCSP), 프로스테이트-특이적 막 항원 (PSMA), VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, IGF1-R, TSLP-R, TIE-1, TIE-2, TNF-알파, 세포자멸사의 TNF성 약한 유도제 (TWEAK), IL-1R, 바람직하게는 EGFR, HER2/neu, CEA, CD20 또는 IGF1-R; 보다 바람직하게는 HER2/neu.
본 발명의 또 다른 측면은 종양 항원에 특이적으로 결합하는 비-표지된 제 1 단클론 항체의 용량, 및 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는 NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체의 용량을 받은, 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양을 겪는 환자의 NIR 형광 영상을 얻는 방법으로서, 고체 종양의 부위에서 NIR 형광 신호를 측정하며, 제 1 및 제 2 항체가 교차 반응성을 나타내지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 측면은 NIR 형광 영상을 얻는 방법으로서, 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양을 겪는 환자를 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는 제 1 단클론 항체로 치료하는 동안 종양 항원에 특이적으로 결합하는 NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체의 고체 종양 부위에서의 신호가 측정되고, 제 1 및 제 2 항체가 교차 반응성을 나타내지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 측면은 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양을 겪는 환자를 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는 비-표지된 제 1 단클론 항체로 치료하는 동안 고체 종양의 부위에서의 종양 항원에 특이적으로 결합하는, NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체의 NIR 형광 신호의 측정 방법으로서, 하기의 단계가 수행되며, 제 1 및 제 2 항체가 교차 반응성을 나타내지 않는 것을 특징으로 한다:
a) 환자가 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는, NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체로 제 1 용량을 받는 단계 (여기서 제 1 및 제 2 항체는 교차 반응성을 나타내지 않음),
b) 고체 종양 부위에서의 NIR 형광 표지로 표지된 상기 제 2 단클론 항체의 NIR 형광 신호가 측정되는 단계,
c) 환자가 상기 비-표지된 제 1 단클론 항체로 제 1 용량을 받는 단계,
d) 환자가 NIR 형광 표지로 표지된 상기 제 2 항체로 제 2 용량을 받는 단계,
e) 고체 종양의 상기 부위에서 NIR 형광 표지로 표지된 상기 제 2 단클론 항체의 NIR 형광 신호를 측정하고, b) 하에 측정한 신호와 비교하여 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상으로 감소되는 단계;
f) 환자가 단계 e)의 측정 결과를 기준으로 상기 비-표지된 제 1 단클론 항체로 제 2 용량을 받는 단계;
바람직하게는 단계 a) 내지 f)는 연속적 단계 a), b), c), d), e) 및 f)로서 실행된다.
바람직하게는 상기 방법에서 신호/배경 비율은 1.5 이상, 바람직하게는 2.0이다.
상기 "NIR 형광 표지로 표지된 단클론 항체"는 고체 종양의 부위에서의 NIR 형광 영상을 얻기에 적절한 근적외선 (NIR) 형광 표지로 표지된다.
근적외선 스펙트럼에서의 여기 및 방출 파장을 갖는 NIR 형광 표지가 사용된다 (즉 640~1300 nm, 바람직하게는 640~1200 nm, 및 보다 바람직하게는 640~900 nm). 전자기 스펙트럼의 상기 부분의 사용은 조직 투과를 최대화하고 헤모글로빈 (<650 nm) 및 물 (>1200 nm)와 같은 생리학적으로 풍부한 흡수제에 의한 흡수를 최소화한다. 체내 사용을 위한 이상적인 근적외선 형광 색소는 하기를 나타낸다:
(1) 좁은 스펙트럼 특징,
(2) 높은 감수성 (양 수율),
(3) 생체 적합성, 및
(4) 분리된 흡수 및 여기 스펙트럼.
다양한 근적외선 (NIR) 형광 표지가 시판되며 본 발명에 따른 프로브를 제조하는데 사용될 수 있다. 예가 되는 NIRF 표지에는 하기가 포함된다: Cy5.5, Cy5 및 Cy7 (Amersham, Arlington Hts., IL; IRD41 및 IRD700 (LI-COR, Lincoln, NE); NIR-1, (Dejindo, Kumamoto, Japan); 라졸라 블루 (Diatron, Miami, FL); 인도시아닌 그린 (ICG) 및 이의 유사체 (Licha, K., 등, Proc.SPIE-Int.Soc.Opt.Eng. 2927 (1996) 192-198; Ito 등, US 5,968,479); 인도트리카르보시아닌 (ITC; WO 98/47538); 및 킬레이트된 란타니드 화합물. 형광 란타니드 금속에는 유로퓸 및 테르븀이 포함된다. 란타니드의 형광 특성은 [Lackowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy 2nd Ed. Kluwar Academic New York (1999)]에 기재된다.
따라서, 상기 "NIR 형광 표지로 표지된 단클론 항체"는 바람직하게는 Cy5.5, Cy5, Cy7, IRD41, IRD700, NIR-1, 라졸라 블루, 인도시아닌 그린 (ICG), 인도트리카르보시아닌 (ITC) 및 SF64, 5-29, 5-36 및 5-41 (WO 2006/072580으로부터)의 군에서 선택된 NIR 형광 표지로 표지되며, 보다 바람직하게는 상기 항체는 Cy5.5, Cy5 및 Cy7의 군에서 선택된 NIRF 표지로 표지된다.
NIR 형광 표지의 결합에 사용되는 방법은 당업계에 잘 공지된다. 항체에 대한 NIR 형광 표지의 컨쥬게이션 기술은 지난 연도 동안 크게 성숙되었으며, [Aslam, M., 및 Dent, A., Bioconjugation, London (1998) 216-363], 및 ["Macromolecule conjugation" in Tijssen, P. "Practice and theory of enzyme immunoassays" (1990) 221-278 Elsevier, Amsterdam]의 챕터에 우수한 개관이 주어진다.
적정한 결합 화학이 상기 언급된 문헌 (상기 Aslam)으로부터 공지된다. 어떤 결합 부분이 존재하는지에 따라, NIR 형광 표지는 수성 또는 유기 배지에서 항체와 직접적으로 반응할 수 있다. 결합 부분은 항체에 대한 형광 색소 표지의 화학적 결합에 사용되는 반응기 또는 활성기이다. 형광 색소 표지는 항체 및 NIR 형광 표지를 포함하는 NIR 형광 표지 컨쥬게이트가 형성되도록 스페이서를 통해 항체에 연결되거나 항체에 직접적으로 결합될 수 있다. 사용된 스페이서는 본질적으로 적절히 긴 체내 지속 (반감기)을 갖도록 선택되거나 설계될 수 있다.
고체 종양 부위에서의 NIR 형광 신호의 "측정" 또는 "측정함"은 환자에게 표지된 항체를 투여한 후 수행된다. 또는, 본 발명에 따른 조성물이 사용된다면, 비-표지된 항체 및 표지된 항체로 이루어진 조성물을 환자에게 투여한 후 수행된다. 측정은 투여 후 정의된 시간 지점, 예를 들어 1일, 2일 또는 3일 이상 또는 고체 종양 부위에서 비교할만한 NIR 형광 신호 또는 영상을 얻기에 적정한 임의 다른 시간 지점에 수행될 수 있다. 투여 후 시간 지점 또는 측정의 지속은 적정한 NIR 형광 신호 또는 영상을 얻기 위한 방법으로 당업자에 의해 조정될 수 있다.
NIR 형광 측정을 위해 상이한 장치 및 기술이 사용될 수 있는데, 예를 들어 유방암과 같은 외부 고체 종양에 대해, ART Advanced Research Technologies Inc.로부터의 SoftScan
기구 (http://www.art.ca/en/products/softscan.html)가 적절하다 (Intes X, Acad. Radiol. 12 (2005) 934-947). 결장직장 또는 폐암과 같은 내부 질환 영역에 대해, 내시경 기술 또는 미세수술-내시경의 조합이 사용될 수 있다.
본 발명의 실행에서 유용한 NIR 형광 측정용 영상화 시스템에는 전형적으로 세 기본 성분이 포함된다: (1) 근적외선 광원, (2) 형광 색소 여기에 사용된 광으로부터 형광 방출을 분리 또는 구분하는 수단, 및 (3) 검출 시스템.
광원은 단색 (또는 실질적으로 단색) 근적외선광을 제공한다. 광원은 적절히 여과된 백색광, 즉 광대역원으로부터의 주파수폭일 수 있다. 예를 들어, 150-와트 할로겐 램프로부터의 광은 Omega Optical (Brattleboro, VT)에서 시판되는 적절한 주파수폭 필터를 통해 통과될 수 있다. 일부 구현예에서, 광원은 레이저이다. 예를 들어 [Boas, D.A., 등, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 4887-4891; Ntziachristos, V., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 2000 2767-2772; Alexander, W., 1991, J. Clin. Laser Med. Surg. 9 416-418]를 참고한다.
고역 필터 (700 nm)가 또한 여기광으로부터 형광 방출을 분리하는데 사용될 수 있다. 적절한 고역 필터가 Omega optical에서 시판된다.
일반적으로, 광 검출 시스템은 광 집적/영상 형성 성분 및 광 검출/영상 기록 성분을 포함하는 것으로서 일견될 수 있다. 광 검출 시스템이 두 성분을 합하는 단일 통합 장치일 수 있지만, 광 집적/영상 형성 성분 및 광 검출/영상 기록 성분이 개별적으로 토의될 것이다.
특히 유용한 광 집적/영상 형성 성분은 내시경이다. 복막 (Gahlen, J., 등, J. Photochem. Photobiol. B 52 (1999) 131-135), 난소암 (Major, A.L., 등, Gynecol. Oncol. 66 (1997) 122-132), 결장 (Mycek, M.A., 등, Gastrointest. Endoscopy. 48 (1998) 390-394; Stepp, H., 등, Endoscopy 30 (1998) 379-386) 담관 (Izuishi, K., 등, Hepatogastroenterology 46 (1999) 804-807), 위 (Abe, S., 등, Endoscopy 32 (2000) 281-286), 방광 (Kriegmair, M., 등, Urol. Int. 63 (1999) 27-31; Riedl, C.R., 등, J. Endourol. 13 755-759), 및 뇌 (Ward, H.A.,
J. Laser Appl. 10 (1998) 224-228)를 포함하는 많은 조직 및 기관의 체내 광학 영상화에 사용되어 온 내시경 장치 및 기술이 본 발명의 실행에 사용될 수 있다.
본 발명에 유용한 광 집적 성분의 다른 유형은 섬유 광학 장치를 포함하는 카테터 기반 장치이다. 이러한 장치는 특히 혈관내 영상화에 적절하다. 예를 들어 [Tearney, G.J., 등, Science 276 (1997) 2037-2039; Boppart, S.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 4256-4261]를 참고한다.
위상 배열 기술 (Boas, D.A., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 19 USA 91 (1994)4887-4891; Chance, B., Ann. NY Acad. Sci. 838 (1998) 29-45), 확산 광학 단층 촬영 (Cheng, X., 등, Optics Express 3 (1998) 118-123; Siegel, A., 등, Optics Express 4 (1999) 287-298), 생체 현미경 검사 (Dellian, M., 등, Br.LT. 암 82 (2000) 1513-1518; Monsky, W.L., 등, Cancer Res. 59 (1999) 4129-4135; Fukumura, D., 등, Cell 94 (1998) 715-725), 및 동일초점 영상화 (Korlach, J., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 8461-8466; Rajadhyaksha, M., 등, J. Invest. Dermatol. 104 (1995)946-952; Gonzalez, S., 등, J. Med. 30 (1999) 337-356)를 포함하는 다른 영상화 기술이 본 발명의 실행에 사용될 수 있다.
임의 적절한 광 검출/영상 기록 성분, 예를 들어 전하 결합 장치 (CCD) 시스템 또는 사진 필름이 본 발명에 사용될 수 있다. 광 검출/영상 기록의 선택은 사용되는 광 집적/영상 형성 성분의 유형을 포함하는 인자에 의존할 것이다. 적절한 성분을 선택하고 이를 근적외선 영상화 시스템에 집합시키고, 시스템을 작동하는 것은 당업계의 통상의 지식 내에 있다.
NIR 형광 영상을 얻기에 유용한 기구는 예를 들어 ART Advanced Research Technologies Inc.로부터의 SoftScan
기구; Image Station In-Vivo F; Image Station In-Vivo FX; Molecular Imaging Systems, Carestream Health, Inc. (이전에는 Kodak Molecular Imaging Systems)로부터의 In-Vivo Imaging System FX Pro; LI-COR Biosciences로부터의 AeriusTM Automated Infrared Imaging System 및 Odyssey Infrared Imaging SystemTM; BERTHOLD TECHNOLOGIES로부터의 LB 983 NightOWL II 또는 다른 적정한 장치이다.
하기의 실시예 및 도면이 제공되어 본 발명의 이해를 도우며, 참된 취지가 첨부된 청구항에 설명된다. 본 발명의 취지에서 벗어남 없이, 설명된 방법에서 수정이 만들어질 수 있다는 것이 이해된다.
도 1 -
HER2
종양 항원을 과다발현 및 과다발현하지 않는 상이한 고체 종양의
NIR
형광 영상:
하기와 같은 마우스에서,
a) BT474 s.c (피하). 모델, 강하게 HER2를 과다발현하는 종양 모델 (DAKO HercepTest
에 따라 3+) (도 1a),
b) A549 s.c. 모델 HER2 과다발현이 없는 종양 모델 (DAKO HercepTest
에 따라 0) (도 1b) 및
c) 종양이 없는 마우스 (도 1c)에서, Cy5로 표지된 페르투주맙을 마우스 당 20 마이크로그램의 단일 용량으로 정맥내 주사하고, NIR 형광 신호를 24시간 후 측정하였다. 획득 시간은 2초였다. NIR 형광 영상을 하기와 같이 나타낸다:
도 1a에서, i) BT474 종양 세포는 HER2 종양 항원을 과다발현하고, ii) 비-종양성 조직과 비교하여 고체 종양의 부위에서 유의한 NIR 형광 신호가 측정될 수 있으며; 도 1b에서, i) A549 종양 세포는 HER2 종양 항원의 유의한 과다발현을 나타내지 않고, ii) 비-종양성 조직과 비교하여 고체 종양의 부위에서 유의한 NIR 형광 신호가 검출될 수 없으며; 도 1c에서, i) 종양이 없는 마우스에서의 비-종양성 세포는 HER2 종양 항원의 유의한 과다발현을 나타내지 않고, ii) 유의한 NIR 형광 신호가 검출될 수 없다.
도 2 -
HER2
종양 항원을 과다발현하는 고체 종양의
NIR
형광 영상:
KPL4 모델, 강하게 HER2를 과다발현하는 종양 모델 (DAKO HercepTest
에 따라 3+)을 갖는 네 마리 마우스에서, 모두 마우스 당 50 마이크로그램의 단일 용량으로, Cy5로 표지된 트라스투주맙 (도 2a)을 2마리 마우스에 정맥 주사하고, Cy5 표지된 페르투주맙 (도 2b)을 다른 2마리 마우스에 정맥 주사하고, NIR 형광 신호를 24시간 후 측정하였다. 획득 시간은 4초였다. NIR 형광 영상은 i) KPL4 종양 세포가 HER2 종양 항원을 과다발현하고, ii) 비-종양성 조직과 비교하여 고체 종양의 부위에서의 유의한 NIR 형광 신호가 Cy5로 표지된 트라스투주맙 (도 2a) 또는 Cy5로 표지된 페르투주맙 (도 2b)을 사용하여 측정될 수 있다는 것을 나타낸다.
도 3 - 비-
표지된
트라스투주맙으로 환자를 치료하는 동안
HER2
종양 항원을 과다발현하는 고체 종양의
NIR
형광 영상 (초기 상태 - 제 1 트라스투주맙 적용 후 48시간) -
NIR
형광 영상화를 위한
Cy5
표지된
페르투주맙
(트라스투주맙과의 교차 반응성 없음)의 사용:
KPL4 모델, 강하게 HER2를 과다발현하는 종양 모델 (DAKO HercepTest
에 따라 3+)에서, 제 1 투여에서 30 mg/kg의 단일 용량으로 비-표지된 트라스투주맙을 복강내 주사하고, 48시간 후 제 2 투여에서 마우스 당 50 마이크로그램의 단일 용량으로 Cy5로 표지된 트라스투주맙 (도 3a) 또는 Cy5로 표지된 페르투주맙 (도 3b)을 정맥내 주사하고, 제 2 투여 후 24시간 후에 NIR 형광 신호를 측정하였다. 획득 시간은 4초였다. NIR 형광 영상은 i) 트라스투주맙으로 HER2 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양 (또는 HER2 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양을 겪는 환자)을 치료하는 동안, Cy5로 표지된 트라스투주맙 (비-표지된 트라스투주맙과의 교차 반응성 없음)은 고체 종양의 부위에서의 유의한 NIR 형광 신호의 검출에 적절하지 않으며 (도 3a); ii) 트라스투주맙으로 HER2 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양을 치료하는 동안, Cy5로 표지된 페르투주맙 (비-표지된 트라스투주맙과의 교차 반응성 없음)은 고체 종양의 부위에서의 유의한 NIR 형광 신호의 검출에 적절하다 (도 3b)는 것을 나타낸다.
도 4 - 비-
표지된
페르투주맙으로
주 단위 치료하는 동안
HER
종양 항원을 과다발현하는 고체 종양의
NIR
형광 영상 (제 2
페르투주맙
적용 후) -
NIR
형광 영상화를 위한
Cy5
로
표지된
트라스투주맙 (
페르투주맙과의
교차 반응성 없음)의 사용:
KPL-4 모델에서, 페르투주맙을 주 2회 복강내 주사하였다. 제 1 주사 (로딩 용량)는 30 mg/kg이었고 제 2 적용 (유지 용량)은 15 mg/kg이었다. 대조군 동물에게 PBS를 주었다. 제 2 투여 후 48시간 후에 두 군의 마우스에 Cy5로 표지된 트라스투주맙을 주사하고, 4일 후 3초의 획득 시간을 사용하여 NIR 형광 신호를 측정하였다. NIR 형광 영상은 i) 페르투주맙 치료된 마우스에서의 NIR 형 광 신호 (도 4a)가 PBS 치료된 마우스에서의 NIR 형광 신호 (도 4b)와 비교하여 감소하였으며, ii) 따라서, 고체 HER2 과다발현 KPL-4 종양에서 HER2에 대해 특이적으로 결합하는 페르투주맙으로의 치료에 대한 반응이 검출가능하다는 것을 나타낸다.
도 5 - 비-
표지된
세툭시맙으로
치료하는 동안
EGFR
종양 항원을 발현하는 고체 종양의
NIR
형광 영상화 -
NIR
형광 영상화를 위한
Cy5
로
표지된
rhMab
ICR62
(세
툭시맙과의
교차 반응성 없음)의 사용:
Calu3 종양을 갖는 암컷 Balb/c 누드 마우스를 2.5 mg/kg 세툭시맙의 용량으로 4주 동안 주 1회 복강내 주사하였다. 마지막 치료 후 2일에 마우스에 2 mg/kg Cy5 표지된 rhMab ICR62를 주었다. 247시간 후 획득 시간 4초로 NIR 형광 신호를 측정하였다. 결과는, 비-표지된 세툭시맙으로의 예비 주사가 EGFR 발현 종양 세포의 후속 검출 및 종양 조직의 정확한 국소화를 가능하게 한다 (Cy5 표지된 rhMab ICR62가 적용되는 경우)는 것을 증명한다. 이는 rhMab ICR62가 세툭시맙에 의해 인지되는 에피토프와 상이한 에피토프에 결합하는 것을 나타내며, 세툭시맙 및 rhICR62가 동일한 EGFR 종양 항원에 대해 교차 반응성을 나타내지 않는다는 것을 보여준다. 따라서 NIR 형광 영상은, 고체 EGFR 발현 Calu3 종양에서 HER2에 특이적으로 결합하는 세툭시맙으로의 치료에 대한 반응이 비-교차반응성 CY5 표지된 rhMab ICR62로 검출가능하다는 것을 나타낸다.
개요
최근의 연구는, 종양 항원이 과다발현되거나 과다발현되지 않은 상이한 인간 이종이식 모델에서, 종양 항원에 단독으로 특이적으로 결합하는 NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체의, 또는 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는 비-표지된 제 1 단클론 항체로의 이전의 치료 후 또는 동안, NIR 형광 영상화를 검사하였다 (제 1 및 제 2 항체는 교차 반응성을 나타내지 않음).
세포주 및 배양 조건
J. Kureabashi에 의해 제공된 인간 유방암 세포주 KPL-4를, 염증성 피부 전이를 가지며 ErbB 패밀리 수용체를 과다발현하는 유방암 환자의 악성 흉막 삼출로부터 확립시켰다 (Kurebayashi, J., 등, Br. J. Cancer 79 (1999) 707-17). 10% 태아 소과 혈청 (PAA) 및 2 mM L-글루타민 (Gibco)이 보충된 DMEM 배지 (PAA Laboratories, Austria)에서, 5% CO2에서 수-포화된 대기 중 37℃에서 종양 세포를 관례대로 배양하였다. 트립신/EDTA 1x (PAA)로 주 당 2회 분배하여 배양 계대를 수행하였다. 세포 계대 P6을 체내 연구에 사용하였다.
Her2를 과다발현하는 인간 유방암 세포주 BT474를 ATCC로부터 수득하였다. 10% FBS (PAA), 2 mM L-글루타민, 1 mM Na-피루베이트 및 10 mM Hepes를 함유하는 RPMI 1640 배지에서, 5% CO2에서 수-포화된 대기 중 37℃에서 세포를 체외 성장시켰다. 3차 계대의 세포를 마우스에 피하 주사하는데 사용하였다.
Her2 음성 인간 A549 폐 암종 세포를 DSMZ로부터 수득하였다. BT474 세 포주에 대한 것과 동일한 프로토콜을 사용하나, Hepes는 첨가하지 않고 세포를 관례대로 배양하였다. 트립신/EDTA 1x (PAA)로 주 당 2회 분배하여 배양 계대를 수행하였다. 세포 계대 P3을 체내 연구에 사용하였다.
EGF1R 양성 인간 Calu3 폐 종양 세포를 Roche, Kamakura로부터 수득하였다. 얼 BSS, 10% FCS, 1 mM Na-피루베이트 및 0.1 mM NEAA를 갖는 이글 MEM에서, 5% CO2에서 수-포화된 대기 중 37℃에서 세포를 체외 성장시켰다. 3차 계대의 세포를 마우스에 피하 주사하는데 사용하였다.
동물
암컷 SCID 베이지 (C.B.-17) 마우스 및 암컷 Balb/c 누드 마우스 (; 10~12주령; 체중 18~20 g) (Charles River, Sulzfeld, Germany)를 국제 지침 (GV-Solas; Felasa; TierschG)에 따라 12시간 명환경/12시간 암환경의 일간 주기로, 특이적 무병원체 조건 하에 유지시켰다. 도착 후, 새로운 환경에 적응시키고 관찰을 위해 1주 동안 동물 시설의 격리부에서 동물을 사육하였다. 정기적으로 지속적인 건강 모니터링을 실행하였다. 식이요법식 (Alltromin) 및 물 (pH 2.5~3로 산성화된)을 원하는 대로 제공하였다.
종양 세포 주사
종양 세포를 배양 플라스크 (Greiner TriFlask)로부터 수획 (트립신-EDTA)하고 50 ml 배양 배지에 옮기고, PBS에서 1회 세척 및 재현탁하였다. PBS로의 추가적인 세척 단계 및 여과 후 (세포 여과기; Falcon 100 ㎛) 최종 세포 역가를 적 정하게 조정하였다. 세포 응집을 방지하기 위해 종양 세포 현탁액을 이동 피펫으로 주의 깊게 혼합하였다. 폐쇄 순환 시스템에서, 예비인큐베이션 챔버 (plexiglas), 개별 마우스 코-마스크 (silicon) 및 이소플루란 (Pharmacia-Upjohn, Germany)으로, 작은 동물용 스티븐 흡입 단위를 사용하여 마취를 수행하였다. 주사 2일 전에 동물의 털을 면도하였다.
각각의 마취된 마우스의 우측 전종단 서혜부 지방 패드 (i.m.f.p.)에 KPL-4 종양 세포 (20 ㎕ PBS 중 3 x 10e6)를 동소적으로 주사하였다. 이러한 동소적 이식을 위해, 세포 현탁액을 유두 밑 피부를 통해 주사하였다. 종양 세포 주사는 실험의 1일에 상응한다.
동물의 우측 옆구리에 BT474 종양 세포 (5 x 10e6 )를 100 ㎕ 마트리겔 (Becton Dickinson) 중에서 피하 주사하였다. 식수를 통해 17 베타 에스트라디올을 보충하였다. 초기에, 연구의 1일부터 33일까지 식수를 2.5 ㎍ 17 베타 에스트라디올/ ml 물로 보충하였다.
동물의 우측 옆구리에 A549 종양 세포 (100 ㎕ PBS 중 1 x 10e7)를 피하 주사하였다.
동물의 우측 옆구리에 Calu3 종양 세포 (100 ㎕ PBS 중 5 x 10e6)를 피하 주사하였다.
임상적 증상 및 체중의
모니터링
부작용의 임상적 증상의 검출을 위해 동물을 매일 관리하였다. 실험 동 안 내내 모니터링하기 위해, 동물의 체중을 주 2회 기록하였다.
NIR
형광 영상의 획득
적절한 NIR 형광 표지로 단클론 항체를 표지함으로써 NIR 형광 신호의 비침습적 측정 또는 결정을 성취할 수 있다. 예를 들어, 고체 종양을 갖는 마우스에 정맥내 주사한 후의 NIR 형광 영상 획득을 모니터링하고, 상기 종양 항원에 특이적으로 결합하는 비-표지된 항체로 치료하는 동안 상기 종양에서의 원래 과다발현된 종양 항원의 발현 및 상기 고체 종양의 발달을 모니터링하기 위해, 상이한 단클론 항체를 Cy5 또는 Cy5.5 또는 Cy7 염료로 표지하였다. 그 후 Siemens Medizintechnik, Germany로부터의 BonSAI 영상화 시스템을 사용하여, 상이한 시간 지점에서 항체의 적용 후 NIR 형광 측정을 수행하였다. 고체 종양 부위에서의 픽셀의 평균 세기를 합하여, 예를 들어 종양 항원의 발현 수준, 특정 NIR 형광 영상으로 표지된 항체, 획득 시간, 표지된 항체의 적용 후 시간 및 상기 고체 종양의 치료용으로 의도된 비-표지된 항체의 적용 후 시간 등에 따라 고체 종양에 특이적인 NIR 형광 신호를 측정할 수 있다.
결과
실시예
1:
HER2
종양 항원을 과다발현 및 과다발현하지 않는 상이한 고체 종양의
NIR
형광 영상화
BT474 또는 A549 종양을 갖는 암컷 SCID 베이지 마우스에, 종양 크기가 약 500 mm3인 시간 지점에서 페르투주맙의 20 ㎍/마우스의 단일 용량을 정맥내 주사하 였다. 또한 무종양 SCID 베이지 마우스에 표지된 단클론 항체를 주사하고 대조군으로 역할하게 하였다. 그 후 1일에 BONSAI 시스템 (Siemens Medizintechnik)을 사용하여 NIR 형광 신호를 측정하였다. 획득 시간은 항상 2초였다. 도 1a에 표현된 결과는 Cy5로 표지된 단클론 항체 페르투주맙이 Her2 과다발현 종양 세포 BT474를 검출되게 한다는 것을 나타낸다. 이와 반대로, Her2 항원을 발현하지 않는 A549 세포로는 (도 1b), NIR 형광 신호가 검출가능하지 않았으며 또한 무종양 마우스에서 NIR 형광 신호가 생성될 수 없었다 (도 1c).
실시예
2:
HER2
종양 항원을 과다발현하는 고체 종양의
NIR
형광 영상화
KPL-4 종양을 갖는 암컷 SCID 베이지 마우스에 Cy5 표지된 트라스투주맙 (도 2a) 또는 Cy5 표지된 페르투주맙 (도 2b)을 주사하였다. 표지된 항체를 50 ㎍/마우스의 용량으로 정맥내 주사하였다. 그 후 1일에 4초의 획득 시간으로 NIR 형광 신호를 측정하였다. 결과는 (도 2), Cy5 표지된 트라스투주맙 (도 2a) 또는 Cy5 표지된 페르투주맙 (도 2b)을 사용하여 Her2 과다발현 세포주 KPL-4에서 비교할만한 NIR 형광 신호가 검출가능하다는 것을 나타낸다.
실시예
3: 비-
표지된
트라스투주맙으로 환자를 치료하는 동안
HER2
종양 항원을 과다발현하는 고체 종양의
NIR
형광 영상화 (초기 - 제 1 트라스투주맙 적용 후 48시간) -
NIR
형광 영상화를 위한
Cy5
로
표지된
페르투주맙
(트라스투주맙과의 교차 반응성 없음)의 사용
KPL-4 종양을 갖는 암컷 SCID 베이지 마우스에 30 mg/kg 트라스투주맙의 단일 용량을 복강내 주사하였다. 그 후 2일에, 한 군의 마우스는 Cy5 표지된 트 라스투주맙을 받았고 (도 3a) 및 두 번째 군의 마우스는 Cy5 표지된 페르투주맙을 받았다 (도 3b). 두 군에서의 종양 크기에서 큰 차이점은 없었으며, 50 ㎍/마우스의 투약량으로 표지된 항체를 정맥내 주사하였다. 24시간 후에 4초의 획득 시간으로 NIR 형광 신호를 측정하였다. 배경 신호는 500 MFI (평균 NIR 형광 (NIRF) 신호 세기 [임의 단위])를 4초의 획득 시간으로 측정하였다. 관심 부위 (ROI)에서의 픽셀의 수 및 신호 세기를 합하여 NIR 형광 세기를 정량화하였다. 결과는, Cy5 표지된 트라스투주맙이 종양이 측정된 부위에서의 530 MFI의 신호 (이는 배경 신호 500 MFI를 단지 약간 초과함)로서 적용되는 경우 비-표지된 트라스투주맙으로의 예비 주사가 Her2 발현 종양 세포의 이후 유의한 검출을 방지한다는 것을 증명한다 (도 3a). 따라서 트라스투주맙으로의 이전의 치료 후 유의한 NIR 형광 신호가 검출될 수 없으므로, Cy5 표지된 트라스투주맙은 트라스투주맙으로 환자를 치료하는 동안 치료요법을 모니터링하는데 적절하지 않다. 이와 반대로, Cy5 표지된 페르투주맙 (또 다른 에피토프와 결합하며 트라스투주맙과 교차반응하지 않음)의 적용은 종양 부위에서 1440 MFI의 신호를 주었다 (도 3b). 따라서 신호/배경 비율 1.06 (=530MFI/500MFI 트라스투주맙 치료 후 Cy5 표지된 트라스투주맙)과 비교하여 명백히 개선된 신호/배경 비율 2.88 (=1440MFI/500MFI 트라스투주맙 치료 후 Cy5 표지된 페르투주맙)을 나타내는 바와 같이, 트라스투주맙으로의 이전의 치료 후 유의한 NIR 형광 신호가 검출될 수 있었으므로, Cy5 표지된 페르투주맙은 트라스투주맙으로 환자를 치료하는 동안 치료요법을 모니터링하는데 적절하다. 이는 심지어 덜 NIRF 표지된 항체가 주어지는 경우에도, 교차 반응성 항체 의 사용보다 종양 부위의 명백히 양호한 국소화를 가능하게 한다. 또한 결과는 페르투주맙이 트라스투주맙에 의해 인지되는 에피토프와 상이한 에피토프에 결합하며, 따라서 트라스투주맙 및 페르투주맙이 동일한 HER2 종양 항원에 대해 교차 반응성을 나타내지 않는다는 것을 명백히 보여준다 (반면 트라스투주맙 및 Cy5 표지된 트라스투주맙은 교차 반응성을 나타내며, 트라스투주맙으로의 이전의 치료 후 유의한 NIR 형광 신호가 검출될 수 없었으므로, Cy5 표지된 트라스투주맙은 트라스투주맙으로 치료하는 동안 치료요법을 모니터링하는데 적절하지 않다).
실시예
4: 비-
표지된
페르투주맙으로
주 단위 치료하는 동안
HER2
종양 항원을 과다발현하는 고체 종양의
NIR
형광 영상화 (제 2
페르투주맙
적용 후 48시간) - NIR 형광 영상화를 위한 Cy5 표지된 트라스투주맙 (
페르투주맙과의 교차 반응성
없음)의 사용
KPL-4 종양을 갖는 암컷 SCID 베이지 마우스를 주 2회 페르투주맙 복강내 주사 치료하였다. 제 1 주사 (로딩 용량)는 30 mg/kg이었고 제 2 적용 (유지 용량)은 15 mg/kg이었다 (도 4a). 대조군 동물에는 오직 PBS만을 주었다 (도 4b). 48시간 후 두 군의 마우스에 50 ㎍/마우스로 Cy5 표지된 트라스투주맙을 주사하고 4일 후 3초의 획득 시간을 사용하여 NIR 형광 신호를 측정하였다. 도 4a는 페르투주맙 치료된 마우스에서의 NIRF 신호가 PBS 치료된 마우스에서의 NIR 신호와 비교하여 감소된 것을 나타낸다 (도 4b). 따라서, 고체 HER2 과다발현 KPL-4 종양에서 HER2에 특이적으로 결합하는 페르투주맙으로의 치료에 대한 반응이 검출가능하다.
실시예 5: 비-표지된 세툭시맙으로 환자를 치료하는 동안
EGFR
종양 항원을 발현하는 고체 종양의
NIR
형광 영상화 -
NIR
형광 영상화를 위한
Cy5
표지된
rhMab
ICR62
(
세툭시맙과의
교차 반응성 없음)의 사용
Calu3 종양을 갖는 암컷 Balb/c 누드 마우스에 5주 동안 주 1회 2.5 mg/kg의 용량으로 세툭시맙을 복강내 주사하였다. 마지막 치료 후 2일에, 마우스에 Cy5 표지된 rhMab ICR62 2 mg/kg을 정맥내 주사하였다 (도 5 ). 24시간 후 4초의 획득 시간으로 NIR 형광 신호를 측정하였다. 결과는 비-표지된 세툭시맙으로의 예비 주사가 EGFR 발현 종양 세포의 후속 검출 및 종양 조직의 정확한 국소화를 가능하게 한다 (Cy5 표지된 rhMab ICR62가 적용되는 경우)는 것을 증명한다. 이는 rhMab ICR62가 세툭시맙에 의해 인지되는 에피토프와 상이한 에피토프에 결합하는 것을 나타내며, 세툭시맙 및 rhICR62가 동일한 EGFR 종양 항원에 대해 교차 반응성을 나타내지 않는다는 것을 보여준다.
Claims (17)
- 하기 제 1 및 제 2 항체가 교차 반응성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는, 하기를 포함하는 약학 조성물:a) 종양 항원에 특이적으로 결합하는 비-표지된 제 1 단클론 항체 및b) 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는, NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체.
- 제 1 항에 있어서, 상기 종양 항원이 EGFR, HER2/neu, HER3, HER4, Ep-CAM, CEA, TRAIL, TRAIL-수용체 1, TRAIL-수용체 2, 림포톡신-베타 수용체, CCR4, CD19, CD20, CD22, CD28, CD33, CD40, CD80, CSF-1R, CTLA-4, 섬유모세포 활성 단백질 (FAP), 헵신, 흑색종-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 (MCSP), 프로스테이트-특이적 막 항원 (PSMA), VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, IGF1-R, TSLP-R, TIE-1, TIE-2, TNF-알파, 세포자멸사의 TNF성 약한 유도제 (TWEAK), IL-1R, 바람직하게는 EGFR, HER2/neu, CEA, CD20 또는 IGF1-R로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 비-표지된 단클론 항체가 항-HER2 항체, 바람직하게는 트라스투주맙 또는 페르투주맙인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 비-표지된 단클론 항체가 항-EGFR 항체, 바람직하게는 세툭시맙 또는 rhMab ICR62인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 비-표지된 단클론 항체가 항-IGF1R 항체인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 비-표지된 단클론 항체가 하기의 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물:알렘투주맙, 아폴리주맙, 세툭시맙, 에프라투주맙, 갈릭시맙, 젬투주맙, 이필리무맙, 라베투주맙, 파니투무맙, 리툭시맙, 트라스투주맙, 니모투주맙, 마파투무맙, 마투주맙 및 페르투주맙, rhMab ICR62.
- 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양을 겪는 환자의 치료용 약제의 제조를 위한, 상기 종양 항원에 특이적으로 결합하는 비-표지된 제 1 단클론 항체의 용도로서, 비-표지된 제 1 단클론 항체가, 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는 NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체와 공동 투여되고, 상기 제 1 및 제 2 항체가 교차 반응성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 7 항에 있어서, 상기 환자의 NIR 형광 영상이 수득되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 7 항에 있어서, 고체 종양 부위에서의, 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는 NIR 형광 표지로 표지된 상기 단클론 항체의 NIR 형광 신호가 측정되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 비-표지된 제 1 단클론 항체로 이전에 치료된, 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양을 겪는 환자의 치료용 약제의 제조를 위한, 상기 종양 항원에 특이적으로 결합하는 상기 비-표지된 제 1 단클론 항체, 및 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는 NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체의 용도로서, 그로 인해 상기 이전 치료 후 고체 종양의 부위에서의 NIR 형광 신호가, 상기 비-표지된 제 1 단클론 항체를 사용한 상기 이전 치료 전 고체 종양의 상기 부위에서의 NIR 형광 신호와 비교하여 10% 이상 감소되고, 상기 제 1 및 제 2 항체가 교차 반응성을 갖지 않는 것을 특징으로 하는 용도.
- 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양을 겪는 환자의 치료용 약제의 제조를 위한, 종양 항원에 특이적으로 결합하는 비-표지된 제 1 단클론 항체의 용도로서, 약제의 투여 패턴이 하기의 단계를 포함하고, 제 1 및 제 2 항체가 교차 반응성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 용도:a) 환자가, 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는 NIR 형광 표지로 표지 된 제 2 단클론 항체로 제 1 용량 (dose)을 받는 단계;b) 고체 종양의 부위에서의 NIR 형광 표지로 표지된 상기 제 2 단클론 항체의 NIR 형광 신호를 측정하는 단계;c) 환자가 상기 비-표지된 제 1 단클론 항체로 제 1 용량을 받는 단계;d) 환자가 NIR 형광 표지로 표지된 상기 제 2 항체로 제 2 용량을 받는 단계;e) 고체 종양의 상기 부위에서 NIR 형광 표지로 표지된 상기 제 2 단클론 항체의 NIR 형광 신호를 측정하고, b) 하에 측정한 신호와 비교하여 10% 이상 감소되는 단계;f) 환자가 단계 e)의 측정 결과를 기준으로 상기 비-표지된 제 1 단클론 항체로 제 2 용량을 받는 단계.
- 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양의 치료용 약제의 제조를 위한, 상기 종양 항원에 특이적으로 결합하는 비-표지된 제 1 단클론 항체의 용도로서, 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는 NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체가 상기 치료에 대한 반응을 측정하는데 사용되며, 상기 제 1 및 제 2 항체가 교차 반응성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 7 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 항원이 EGFR, HER2/neu, HER3, HER4, Ep-CAM, CEA, TRAIL, TRAIL-수용체 1, TRAIL-수용체 2, 림 포톡신-베타 수용체, CCR4, CD19, CD20, CD22, CD28, CD33, CD40, CD80, CSF-1R, CTLA-4, 섬유모세포 활성 단백질 (FAP), 헵신, 흑색종-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 (MCSP), 프로스테이트-특이적 막 항원 (PSMA), VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, IGF1-R, TSLP-R, TIE-1, TIE-2, TNF-알파, 세포자멸사의 TNF성 약한 유도제 (TWEAK), IL-1R, 바람직하게는 EGFR, HER2/neu, CEA, CD20 또는 IGF1-R로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 종양 항원에 특이적으로 결합하는 비-표지된 제 1 단클론 항체의 용량, 및 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는 NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체의 용량을 받은, 상기 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양을 겪는 환자의 NIR 형광 영상을 얻는 방법으로서, 고체 종양 부위에서의 NIR 형광 신호가 측정되고, 상기 제 1 및 제 2 항체는 교차 반응성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
- NIR 형광 영상을 얻는 방법으로서, 종양 항원을 과다발현하는 고체 종양을 겪는 환자를 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는 단클론 항체로 치료하는 동안 상기 고체 종양 부위에서 종양 항원에 특이적으로 결합하는 NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체의 신호를 측정하고, 상기 제 1 및 제 2 항체가 교차 반응성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
- 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는 비-표지된 제 1 단클론 항체로 종 양 항원을 과다발현하는 고체 종양을 겪는 환자를 치료하는 동안 고체 종양의 부위에서 상기 종양 항원에 특이적으로 결합하는 NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체의 NIR 형광 신호를 측정하는 방법으로서, 하기 단계가 수행되고, 제 1 및 제 2 항체가 교차 반응성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 방법:a) 환자가 동일한 종양 항원에 특이적으로 결합하는, NIR 형광 표지로 표지된 제 2 단클론 항체로 제 1 용량을 받는 단계 (여기서, 제 1 및 제 2 항체는 교차 반응성을 나타내지 않음);b) 고체 종양의 부위에서의, NIR 형광 표지로 표지된 상기 제 2 단클론 항체의 NIR 형광 신호가 측정되는 단계;c) 환자가 상기 비-표지된 제 1 단클론 항체로 제 1 용량을 받는 단계;d) 환자가 NIR 형광 표지로 표지된 상기 제 2 항체로 제 2 용량을 받는 단계;e) 고체 종양의 상기 부위에서의 NIR 형광 표지로 표지된 상기 제 2 단클론 항체의 NIR 형광 신호가 측정되고, b) 하에 측정된 신호와 비교하여 10% 이상 감소되는 단계;f) 환자가 단계 e)의 측정 결과를 기준으로 상기 비-표지된 제 1 단클론 항체로 제 2 용량을 받는 단계.
- 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 신호/배경 비율이 1.5 이상인 방법.
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