KR20090122769A - Method for delivering proteins into cells and peptide therefor - Google Patents
Method for delivering proteins into cells and peptide therefor Download PDFInfo
- Publication number
- KR20090122769A KR20090122769A KR1020080048727A KR20080048727A KR20090122769A KR 20090122769 A KR20090122769 A KR 20090122769A KR 1020080048727 A KR1020080048727 A KR 1020080048727A KR 20080048727 A KR20080048727 A KR 20080048727A KR 20090122769 A KR20090122769 A KR 20090122769A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- protein
- domain
- amino acid
- intracellular delivery
- acid sequence
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
Abstract
Description
본 발명은 세포내로 단백질을 전달하는 방법 및 이를 위한 펩타이드에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 단백질과 물리적으로 컨쥬게이션(physical conjugation)되지 않은 상태에서 세포내로 단백질을 전달하는 펩타이드 및 이러한 펩타이드를 이용하여 단백질을 효율적이면서 용이하게 세포내로 전달하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for delivering a protein into a cell and a peptide therefor, and more particularly, to a peptide that delivers a protein into a cell without physical conjugation with the protein and a protein using the peptide. The present invention relates to a method for efficiently and easily delivering intracellularly.
세포막은 반투과성 지질의 이중막으로서 세포내 구성요소(intracellular components)와 세포 외부 환경(extracellular environment) 사이의 물리적 장벽으로 작용한다. 세포막은 선택적 투과성을 갖으며, 특정 물질에 대해 세포내로 들어가게 할 것인가 아니면 세포 밖으로 나가게 할 것인가를 조절한다. 작은 분자이거나 지용성 물질, 즉 소수성이면서 비극성인 물질은 빠르게 지질의 이중막을 통과하여 세포내로 확산되지만, 대전된 분자, 즉 이온은 세포막의 통과가 어렵다. 특히, 신약개발에 있어서 관심대상이 되는 펩타이드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, DNA, RNA, 나노입자 등과 같은 친수성 분자는 세포내로 전달되기 어렵다. 이는 결국 이 들을 치료목적으로 사용하기 어렵게 제한하는 요소가 된다. The cell membrane is a bilayer of semipermeable lipids that acts as a physical barrier between intracellular components and the extracellular environment. Cell membranes have selective permeability and control whether they enter or exit the cell for a particular substance. Small molecules or fat-soluble substances, i.e., hydrophobic and nonpolar substances, quickly pass through the lipid bilayer and diffuse into the cell, but charged molecules, ie ions, are difficult to pass through the cell membrane. In particular, hydrophilic molecules such as peptides, proteins, oligonucleotides, DNA, RNA, nanoparticles, and the like, which are of interest in the development of new drugs, are difficult to be delivered into cells. This, in turn, makes them difficult to use for therapeutic purposes.
현재 개발된 약물들 중 상당수는 세포 표면 수용체에 작용하는 것들이지만, 최근에는 세포내 영역의 표적이 주목을 받고 있다. 이들 세포내 표적에 대한 접근은 새로운 치료약의 개발 뿐만아니라 생물학적 메카니즘의 이해를 위해서 중요한 것이다. 이와 같은 필요성에 의해, 목적하는 물질이 생물학적 장벽인 세포막을 통과할 수 있게 하는 수 많은 기술들이 개발되었는데, 그 예로서 일렉트로포레이션(electroporation), 마이크로인젝션(microinjection), 비-바이러스성 벡터 및 바이러스 벡터 등을 들 수 있다.Many of the drugs currently being developed are those that act on cell surface receptors, but in recent years targets in intracellular regions have attracted attention. Access to these intracellular targets is important not only for the development of new therapeutics but also for the understanding of biological mechanisms. Due to this need, a number of technologies have been developed that allow the material of interest to cross cell membranes, which are biological barriers, such as electroporation, microinjection, non-viral vectors and viruses. Vector etc. can be mentioned.
일렉트로포레이션은 세포에 고전압 전기 펄스를 주어 세포막에 나노미터 크기의 작은 구멍을 형성하게 함으로써 DNA, 단백질이나 나노입자와 같은 외부 물질을 세포내로 전달하는 기술이다. 그러나, 전기적 충격에 의해 세포가 충격을 받아 죽게 되는 문제와 전기장비 등이 고가이어서 적용을 위한 비용이 비싸지게 되는 문제가 있다. 따라서, 신약후보물질을 스크린하기 위한 초고속 분석(high throughput analysis) 구현에는 적합하지 않다. Electroporation is a technology that delivers intracellular materials such as DNA, proteins or nanoparticles by giving high voltage electric pulses to cells to form nanometer-sized holes in the cell membrane. However, there is a problem in that the cell is shocked to die by the electric shock and the electrical equipment is expensive, so the cost for the application becomes expensive. Therefore, it is not suitable for implementing high throughput analysis for screening drug candidates.
또한, 마이크로인젝션은 마이크로 니들을 이용하여 현미경 하에서 살아 있는 단일세포에 단백질이나 나노입자와 같은 외부 물질을 세포에 직접 도입할 수 있는 기술이다. 그러나, 특수 장비가 필요하고 조작이 어려우며 세포 하나하나에 외부물질을 도입하므로 초고속 작업 수행(high throughput process)을 할 수 없는 한계가 있다.In addition, microinjection is a technology that can directly introduce foreign substances such as proteins or nanoparticles into a single cell living under a microscope using a microneedle. However, since special equipment is required, manipulation is difficult, and foreign materials are introduced into each cell, there is a limitation that a high throughput process cannot be performed.
양이온성 리피드를 이용한 리포펙션(lipofection)은 올리고뉴클레오티드, 플 라스미드 DNA, 단백질, 나노입자 등을 세포내로 전달하는데 널리 사용되고 있다. 인공적으로 합성된 양이온성 리피드는 DNA, 단백질 등과 같이 음전하를 띄는 생체 분자들과 복합체를 형성하여 이들 분자들이 세포내로 전달되게 한다. 그러나, 리포펙션은 세포 배양 배지 내에 혈청이나 항생제의 존재 유무에 민감하게 영향을 받으며, 세포 독성을 나타내기도 하는 등의 단점을 갖는다. Lipofection using cationic lipids is widely used to deliver oligonucleotides, plasmid DNA, proteins, nanoparticles, and the like into cells. Artificially synthesized cationic lipids form complexes with negatively-charged biomolecules such as DNA, proteins and the like to allow these molecules to be delivered intracellularly. However, lipofection is susceptible to the presence or absence of serum or antibiotics in the cell culture medium, and has disadvantages such as cytotoxicity.
바이러스 벡터는 핵산을 세포내로 도입하는데 매우 우수한 기술로 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector) 및 레트로바이러스 벡터(retroviral vector) 등이 연구 목적으로 유전 물질을 세포내로 전달하는 데 널리 사용되고 있을 뿐만 아니라, 유전자 치료를 목적으로 임상 시험이 진행 중이기도 하다. 그러나, 유전자 치료를 위한 바이러스 벡터의 사용은 잠재적인 안전성 문제를 안고 있다.Viral vectors are an excellent technique for introducing nucleic acids into cells. Adenoviral vectors and retroviral vectors are widely used to deliver genetic material into cells for research purposes. Clinical trials are in progress for this purpose. However, the use of viral vectors for gene therapy poses potential safety issues.
최근에는 단백질 전달 도메인[Protein Transduction Domains (PTDs)]이 개발되어 단백질과 같은 생리활성물질을 살아 있는 세포내로 유효하게 전달할 수 있게 되었다. PTD는 세포 침투 펩타이드[Cell-penetrating peptides (CPPs)], 세포막 전이 시퀀스[membrane translocation sequences (MTSs)], 트로이 펩타이드["Trojan" peptides], 세포막 전달 펩타이드[membrane transduction peptides (MTPs)] 등으로 불리기도 한다. 단백질 전달 도메인은 HIV-1 Tat 트랜스액티베이터(HIV-1 Tat transactivator)에 의해 최초 확인되었다. 그런데, 단백질 전달 도메인의 세포내 물질 전달 메카니즘은 아직까지 연구의 대상이다. 최근의 연구에 따르면, 단백질 전달 도메인(PTD)은 독특한 전달 메카니즘 및 동시적인 비-특이적 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 세포내로 도입되는 것으로 알려져 있다[Patel, L. N., Zaro, J. L., & Shen, W.-C. Cell penetrating peptides: intracellular pathways and pharmaceutical perspectives. Pharm. Res. 24, 1977-1992 (2007)]. 즉, PTD-전달하고자 하는 물질(cargoes)은 세포막을 통해 직접 세포내로 전달되거나, 또는 세포막의 외부방향으로의 돌출에 의한 마크로피노좀(macropinosomes) 형성을 통한 마크로피노사이토시스(macropinocytosis)에 의해 세포내로 전달되거나, 또는 세포막의 함입에 의한 PTD-전달하고자 하는 물질(cargoes)의 엔도사이토시스에 의해 세포내로 전달되는 것으로 알려져 있다. PTD는 저분자 화합물, 단백질, 핵산, 나노입자나 리포좀 등과 같이 그 크기가 다양한 전달물질(cargoes)을 세포내로 전달할 수 있기 때문에, 치료 목적의 전달 벡터로 사용될 잠재적 가능성을 인정받고 있으며 현재 많은 관심의 대상이 되고 있다.Recently, protein transduction domains (PTDs) have been developed to enable effective delivery of bioactive substances such as proteins into living cells. PTDs are called cell-penetrating peptides (CPPs), membrane translocation sequences (MTSs), trojan peptides ("Trojan" peptides), membrane transduction peptides (MTPs), etc. Also do. Protein transduction domains were first identified by the HIV-1 Tat transactivator. However, the intracellular mass transfer mechanism of the protein transfer domain is still under study. Recent studies have shown that protein delivery domains (PTDs) are introduced intracellularly through unique delivery mechanisms and simultaneous non-specific endocytosis [Patel, LN, Zaro, JL, & Shen, W.-C. Cell penetrating peptides: intracellular pathways and pharmaceutical perspectives . Pharm. Res. 24, 1977-1992 (2007). That is, PTD-cargoes are delivered to cells directly through the cell membrane, or by macropinocytosis through the formation of macropinosomes by outward protrusion of the cell membrane. It is known to be delivered intracellularly or by endocytosis of PTD-cargoes to be delivered by incorporation of a cell membrane into the cell. PTD has the potential to be used as a therapeutic vector for delivery because of its ability to deliver cells of varying sizes, such as small molecule compounds, proteins, nucleic acids, nanoparticles, or liposomes, into cells. It is becoming.
한편, 전달하고자 하는 물질(전달물질)을 단백질 전달 도메인을 이용하여 세포내로 전달하기 위해서는 상기 전달물질을 단백질 전달 도메인에 결합시키는 것이 요구된다. 이를 위해 유전자 재조합, 동일 사슬 합성(same chain synthesis), 화학적 결합(chemical coupling), 라이게이션(ligation) 등이 사용된다. 그런데, 유전자 재조합, 동일 사슬 합성, 화학적 결합, 라이게이션 등과 같은 물리적 결합을 이용하는 방식은 합성 및 정제과정에서 시간이 소요되고 주의를 요하는 방식이다. Meanwhile, in order to deliver a substance (transfer substance) to be delivered into a cell using a protein transfer domain, it is required to bind the transfer substance to the protein transfer domain. Genetic recombination, same chain synthesis, chemical coupling, ligation and the like are used for this purpose. However, the method of using physical binding such as genetic recombination, identical chain synthesis, chemical bonding, ligation, etc. is a time-consuming and careful method in the synthesis and purification process.
최근 들어, 전하를 띄는 물질 간의 상호작용이나 소수성 상호작용을 이용한 비공유결합성 상호작용에 의해 전달물질을 세포에 전달할 수 있는 PTD가 보고되고 있다[Hou, Y.-W. et al., Transdermal delivery of proteins mediated by non-covalent associated arginine-rich intracellular delivery peptides. Exp. Dermatol. 16, 999-1006 (2007); Siprashvili, Z., Reuter, J. A., & Khavari, P. A. Intracellular delivery of functional proteins via decoration with transporter peptides. Mol. Ther. 9, 721-728 (2004); Gros, E. et al., A non-covalent peptide-based strategy for protein and peptide nucleic acid transduction. Biochim. Biophys. Acta 1758, 384-393 (2006); Myrberg, H., Lindgren, M., & Langel, U. Protein delivery by the cell-penetrating peptide YTA2. Bioconjug. Chem. 18, 170-174 (2007)]. 즉, PTD와 전달물질을 물리적으로 컨쥬게이션시키지 않고, 단순히 혼합하여 반응시킨 후, 세포에 처리하면 전달물질의 세포내 전달이 증가되는 PTD가 보고되고 있다. PTD와 전달물질을 물리적으로 컨쥬게이션시키지 않고, PTD와 전달물질 간의 비공유결합성 상호작용에 의해 전달물질을 세포내로 전달할 경우, 다음과 같은 장점을 갖는다. (1) 물리적 컨쥬게이션에 의해 PTD 혹은 전달물질의 성질이 변형될 가능성을 배제할 수 있다, (2) 물리적 컨쥬게이션을 위해 필요한 합성 및 정제 등의 추가적인 과정에 소요되는 시간과 노력을 배제할 수 있다. 그 결과, 전달물질의 기능을 손쉽게 평가할 수 있으며, 전달물질과 PTD의 조합 등과 같은 유연성도 증가시킬 수 있다.Recently, a PTD capable of delivering a delivery material to a cell by noncovalent interactions using a hydrophobic or hydrophobic interaction has been reported [Hou, Y.-W. et al., Transdermal delivery of proteins mediated by non-covalent associated arginine-rich intracellular delivery peptides. Exp. Dermatol. 16, 999-1006 (2007); Siprashvili, Z., Reuter, JA, & Khavari, PA Intracellular delivery of functional proteins via decoration with transporter peptides. Mol. Ther. 9, 721-728 (2004); Gros, E. et al., A non-covalent peptide-based strategy for protein and peptide nucleic acid transduction. Biochim. Biophys. Acta 1758, 384-393 (2006); Myrberg, H., Lindgren, M., & Langel, U. Protein delivery by the cell-penetrating peptide YTA2. Bioconjug. Chem. 18, 170-174 (2007). In other words, PTD has been reported to increase intracellular delivery of a transporter when the cells are treated without reacting the PTD and the transporter, but simply mixed and reacted. When the delivery material is delivered intracellularly by the non-covalent interaction between the PTD and the delivery material without physically conjugating the PTD and the delivery material, it has the following advantages. (1) the possibility of modifying the properties of the PTD or transporter by physical conjugation can be ruled out. have. As a result, the function of the carrier can be easily assessed and flexibility, such as the combination of carrier and PTD, can be increased.
이에 본 발명자들은 전달물질로 사용되는 단백질과 컨쥬게이션되지 않은 상태에서 전달물질(단백질)을 유효하게 세포내로 도입시킬 수 있는 새로운 단백질 전달 도메인으로서 세포내 전달 도메인(intracellular transduction domain; ITD)을 개발하기에 이르렀다.In this regard, the present inventors have developed an intracellular transduction domain (ITD) as a new protein transfer domain capable of effectively introducing a transporter (protein) into a cell without conjugation with a protein used as a transporter. Reached.
따라서, 본 발명은 전술한 바와 같은 종래기술의 문제점을 해결하는데 그 목적이 있는 것으로서, 단백질과 물리적으로 컨쥬게이션되지 않은 상태에서 전달물질인 단백질을 유효하게 세포내로 도입할 수 있는 새로운 세포내 전달 도메인(intracellular transduction domain; ITD) 및 이를 이용한 단백질 전달 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.Accordingly, the present invention is to solve the problems of the prior art as described above, a new intracellular delivery domain that can effectively introduce into the cell a protein that is a transporter without physically conjugated with the protein The purpose of the present invention is to provide an intracellular transduction domain (ITD) and a protein delivery method using the same.
본 발명의 세포내로 단백질을 전달하기 위한 펩타이드는 세포내 전달 도메인을 포함하되, 상기 세포내 전달 도메인은 전하를 띄는 물질 간의 상호작용 (charge-charge interaction) 및/또는 상기 세포내 전달 도메인-상기 단백질 복합체의 수용성(solubility)을 높일 수 있는 친수성 도메인과, 소수성 상호작용 (hydrophophic interaction) 및/또는 세포막과의 상호작용에 이용될 수 있는 소수성 도메인을 포함하는 펩타이드이며, 상기 단백질과 물리적으로 컨쥬게이션되지 않은 상태에서 상기 단백질을 세포내로 전달하는 것을 특징으로 한다.Peptides for delivery of proteins into cells of the invention include intracellular delivery domains, wherein the intracellular delivery domains are charge-charge interaction and / or the intracellular delivery domain-the protein A peptide comprising a hydrophilic domain that can increase the solubility of the complex and a hydrophobic domain that can be used for hydrophophic interaction and / or interaction with the cell membrane, and is not physically conjugated with the protein. It is characterized in that the delivery of the protein into the cell in the absence.
상기 친수성 도메인은 RRRQRRKKRG, YARAAARQARA, YARVRRRGPRR, RQIKIWFQNRRMKWKK, RRRRRRRRR, PKKKRKV 및 GRKKRRQRRR로 구성된 아미노산 서열 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열인 것이 바람직하다. The hydrophilic domain is preferably at least one amino acid sequence selected from the group of amino acid sequences consisting of RRRQRRKKRG, YARAAARQARA, YARVRRRGPRR, RQIKIWFQNRRMKWKK, RRRRRRRRR, PKKKRKV and GRKKRRQRRR.
또한, 상기 소수성 도메인은 GLFGAIAGFIENGWEGMIDG, GDIMGEWGNEIFGAIAGFLG, KETWWETWWTE, TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK, DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD, KLAKLAKKLAKLAK, PLSSIFSRIGDG, GGRLAYLRRRWAVLGR, GLFEAIAEFIEGGWEGLIEG, GLFKAIAKFIKGGWKGLIKG, FFGAVIGTIALGVATA, GALFLGFLGAAGSTMGA, VTVLALGALAGVGVG, AAVLLPVLLAAP, 및 GAAIGLAWIPYFGPAA로 구성된 아미노산 서열 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열인 것이 바람직하다.Further, it is the hydrophobic domain is at least one amino acid sequence selected from the amino acid sequence of the group consisting of GLFGAIAGFIENGWEGMIDG, GDIMGEWGNEIFGAIAGFLG, KETWWETWWTE, TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK, DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD, KLAKLAKKLAKLAK, PLSSIFSRIGDG, GGRLAYLRRRWAVLGR, GLFEAIAEFIEGGWEGLIEG, GLFKAIAKFIKGGWKGLIKG, FFGAVIGTIALGVATA, GALFLGFLGAAGSTMGA, VTVLALGALAGVGVG, AAVLLPVLLAAP, and GAAIGLAWIPYFGPAA desirable.
상기 친수성 도메인 및/또는 상기 소수성 도메인은 펩타이드의 아미노 말단 혹은 카르복시 말단, 또는 그 근방에 위치할 수 있다. 또한, 상기 친수성 도메인 및/또는 상기 소수성 도메인은 그 아미노산 서열이 레트로 형태로 합성될 수 있다.The hydrophilic domain and / or the hydrophobic domain may be located at or near the amino or carboxy terminus of the peptide. In addition, the hydrophilic domain and / or the hydrophobic domain can be synthesized in the amino acid sequence of the retro form.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포내 전달 도메인은 서열번호 2 내지 서열번호 23의 아미노산 서열들 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드인 것이 바람직하다.In one embodiment of the present invention, the intracellular delivery domain is preferably a peptide comprising at least one amino acid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 23.
또한, 상기 세포내 전달 도메인은 N-말단이 아세틸화되고 C-말단에 시스테아민이 부가되는 방식으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 상기 세포내 전달 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열은 N-말단이 아세틸화되고 C-말단에 시스테아민이 부가되는 방식으로 변형될 수 있다.In addition, the intracellular delivery domain can be modified in such a way that the N-terminus is acetylated and cysteamine is added to the C-terminus. For example, the intracellular delivery domain may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, wherein the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 may be modified in such a way that the N-terminus is acetylated and cysteamine is added to the C-terminus .
또한, 본 발명의 세포내로 단백질을 전달하기 위한 세포내 전달 도메인은 서열번호 2 내지 서열번호 23으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함한다. In addition, the intracellular delivery domain for delivering a protein into a cell of the present invention comprises at least one amino acid sequence having at least 70% sequence identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2-SEQ ID NO: 23.
바람직하기로는 상기 세포내 전달 도메인은 서열번호 2 내지 서열번호 23으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함한다. Preferably said intracellular delivery domain comprises at least one amino acid sequence having at least 90% sequence identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2 to 23.
또한, 상기 세포내 전달 도메인은 N-말단이 아세틸화되고 C-말단에 시스테아민이 부가되는 방식으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 상기 세포내 전달 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열은 N-말단이 아세틸화되고 C-말단에 시스테아민이 부가되는 방식으로 변형될 수 있다.In addition, the intracellular delivery domain can be modified in such a way that the N-terminus is acetylated and cysteamine is added to the C-terminus. For example, the intracellular delivery domain may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, wherein the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 may be modified in such a way that the N-terminus is acetylated and cysteamine is added to the C-terminus .
본 발명의 세포내로 단백질을 전달하는 방법은, 세포내 전달 도메인을 준비하는 단계와, 세포내로 도입할 단백질을 준비하는 단계와, 상기 단백질과 상기 세포내 전달 도메인을 물리적으로 컨쥬게이션하지 않은 상태에서 세포에 처리하는 단계와, 상기 단백질을 세포내로 도입하는 단계를 포함한다.The method of delivering a protein into a cell of the present invention comprises the steps of preparing an intracellular delivery domain, preparing a protein to be introduced into the cell, and without physically conjugating the protein and the intracellular delivery domain. Treating the cells and introducing the protein into the cells.
본 발명의 세포내로 단백질을 전달하는 방법의 일실시예에 있어서, 상기 세포내 전달 도메인은 전하를 띄는 물질 간의 상호작용(charge-charge interaction) 및/또는 상기 세포내 전달 도메인-상기 단백질 복합체의 수용성(solubility)을 높일 수 있는 친수성 도메인과, 소수성 상호작용 (hydrophophic interaction) 및/또는 세포막과의 상호작용에 이용될 수 있는 소수성 도메인을 포함하는 펩타이드인 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the method for delivering a protein into a cell of the invention, the intracellular delivery domain is a charge-charge interaction between the charged material and / or the intracellular delivery domain-soluble in the protein complex. and a hydrophilic domain capable of increasing solubility and a hydrophobic domain that can be used for hydrophophic interaction and / or interaction with the cell membrane.
또한, 상기 친수성 도메인은 RRRQRRKKRG, YARAAARQARA, YARVRRRGPRR, RQIKIWFQNRRMKWKK, RRRRRRRRR, PKKKRKV 및 GRKKRRQRRR로 구성된 아미노산 서열 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열인 것이 바람직하다. In addition, the hydrophilic domain is preferably at least one amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid sequence consisting of RRRQRRKKRG, YARAAARQARA, YARVRRRGPRR, RQIKIWFQNRRMKWKK, RRRRRRRRR, PKKKRKV and GRKKRRQRRR.
또한, 상기 소수성 도메인은 GLFGAIAGFIENGWEGMIDG, GDIMGEWGNEIFGAIAGFLG, KETWWETWWTE, TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK, DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD, KLAKLAKKLAKLAK, PLSSIFSRIGDG, GGRLAYLRRRWAVLGR, GLFEAIAEFIEGGWEGLIEG, GLFKAIAKFIKGGWKGLIKG, FFGAVIGTIALGVATA, GALFLGFLGAAGSTMGA, VTVLALGALAGVGVG, AAVLLPVLLAAP, 및 GAAIGLAWIPYFGPAA로 구성된 아미노산 서열 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열인 것이 바람직하다.Further, it is the hydrophobic domain is at least one amino acid sequence selected from the amino acid sequence of the group consisting of GLFGAIAGFIENGWEGMIDG, GDIMGEWGNEIFGAIAGFLG, KETWWETWWTE, TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK, DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD, KLAKLAKKLAKLAK, PLSSIFSRIGDG, GGRLAYLRRRWAVLGR, GLFEAIAEFIEGGWEGLIEG, GLFKAIAKFIKGGWKGLIKG, FFGAVIGTIALGVATA, GALFLGFLGAAGSTMGA, VTVLALGALAGVGVG, AAVLLPVLLAAP, and GAAIGLAWIPYFGPAA desirable.
상기 친수성 도메인 및/또는 상기 소수성 도메인은 펩타이드의 아미노 말단 혹은 카르복시 말단, 또는 그 근방에 위치할 수 있다. 또한, 상기 친수성 도메인 및/또는 상기 소수성 도메인은 그 아미노산 서열이 레트로 형태로 합성될 수 있다.The hydrophilic domain and / or the hydrophobic domain may be located at or near the amino or carboxy terminus of the peptide. In addition, the hydrophilic domain and / or the hydrophobic domain can be synthesized in the amino acid sequence of the retro form.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 세포내 전달 도메인은 서열번호 2 내지 서열번호 23의 아미노산 서열들 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드인 것이 바람직하다.In a preferred embodiment of the invention, the intracellular delivery domain is preferably a peptide comprising at least one amino acid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 23.
또한, 상기 세포내 전달 도메인은 N-말단이 아세틸화되고 C-말단에 시스테아민이 부가되는 방식으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 상기 세포내 전달 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열은 N-말단이 아세틸화되고 C-말단에 시스테아민이 부가되는 방식으로 변형될 수 있다.In addition, the intracellular delivery domain can be modified in such a way that the N-terminus is acetylated and cysteamine is added to the C-terminus. For example, the intracellular delivery domain may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, wherein the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 may be modified in such a way that the N-terminus is acetylated and cysteamine is added to the C-terminus .
또한, 본 발명의 세포내로 단백질을 전달하는 방법의 다른 실시예에 있어서, 상기 세포내 전달 도메인은 서열번호 2 내지 서열번호 23으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함한다. Further, in another embodiment of the method of delivering a protein into a cell of the present invention, the intracellular delivery domain is at least one having at least 70% sequence identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2-SEQ ID NO: 23 Amino acid sequence of a.
바람직하기로는 상기 세포내 전달 도메인은 서열번호 2 내지 서열번호 23으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함한다. Preferably said intracellular delivery domain comprises at least one amino acid sequence having at least 90% sequence identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2 to 23.
또한, 상기 세포내 전달 도메인은 N-말단이 아세틸화되고 C-말단에 시스테아민이 부가되는 방식으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 상기 세포내 전달 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열은 N-말단이 아세틸화되고 C-말단에 시스테아민이 부가되는 방식으로 변형될 수 있다.In addition, the intracellular delivery domain can be modified in such a way that the N-terminus is acetylated and cysteamine is added to the C-terminus. For example, the intracellular delivery domain may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, wherein the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 may be modified in such a way that the N-terminus is acetylated and cysteamine is added to the C-terminus .
본 발명에 있어서, 상기 세포내로 전달되는 단백질은 두 개 또는 그 이상의 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드인 것이 바람직하다.In the present invention, the protein delivered into the cell is preferably a polypeptide consisting of two or more amino acids.
본 발명의 세포내 전달 도메인(ITD) 및 방법은 세포내 전달 도메인과 단백질이 물리적으로 컨쥬게이션되지 않은 상태에서 세포내로 단백질을 도입할 수 있어 복잡한 물리적 결합 과정, 정제 과정 및 분리 과정 없이 바로 단백질을 효율적으로 그리고 용이하게 세포내로 도입할 수 있는 장점이 있다.Intracellular delivery domains (ITDs) and methods of the present invention can introduce proteins into cells in a state where the intracellular delivery domains and proteins are not physically conjugated, thereby providing the protein directly without complex physical binding, purification and separation processes. There is an advantage that can be introduced into the cell efficiently and easily.
또한, 본 발명의 세포내 전달 도메인(ITD) 및 방법은 단백질과 세포내 전달 도메인의 물리적 결합(컨쥬게이션) 없이 세포내로 단백질을 도입할 수 있음으로써 단백질 및 세포내 전달 도메인의 특성에 변화를 주지 않고 단백질을 유효하게 세포내로 전달할 수 있다.In addition, the intracellular delivery domains (ITDs) and methods of the present invention allow for the introduction of proteins into cells without physical binding (conjugation) between the proteins and the intracellular delivery domains, thereby altering the properties of the proteins and intracellular delivery domains. Protein can be effectively delivered intracellularly.
따라서, 본 발명은 신약개발 및 치료분야에 있어서 효과적으로 세포내로 단백질을 전달하는 방법을 제공한다. Accordingly, the present invention provides a method for effectively delivering proteins into cells in the field of drug development and treatment.
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한 정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples. The following examples of the present invention are not intended to limit or limit the scope of the present invention, but are intended to embody the present invention. From the detailed description and examples of the present invention, those skilled in the art to which the present invention pertains can easily be interpreted as belonging to the scope of the present invention. References cited in the present invention are incorporated herein by reference.
실시예 1: 세포내 전달 도메인(Intracellular Transduction Domain; ITD)의 합성Example 1 Synthesis of Intracellular Transduction Domain (ITD)
본 발명의 실시예에서 거론된 모든 펩타이드는 고체상 합성(solid-phase synthesis)에 의해 합성하였고, 합성은 본 발명자들이 제공한 아미노산 서열정보에 기초하여 시그마제노시스(Sigma Genosys)(1442 Lake Front Circle The Woodlands TX 77380, USA에 소재) 및 애니젠(주)(Anygen Co., Ltd.)(대한민국 광주광역시 소재)에 의뢰하여 수행하였다. All peptides discussed in the examples of the present invention were synthesized by solid-phase synthesis, and the synthesis was based on amino acid sequence information provided by the inventors of Sigma Genosys (1442 Lake Front Circle The Woodlands TX 77380, USA) and Anygen Co., Ltd. (Gwangju Metropolitan City, Korea).
전달하고자 하는 단백질과 물리적 컨쥬게이션을 시켜야만 단백질을 세포내로 전달하는 것으로 알려진 단백질 전달 도메인(PTD)들을 선별하였다. 그리고, 이들이 물리적으로 컨쥬게이션시키지 않은 조건에서 전달하고자 하는 단백질을 세포내로 전달할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 다음과 같은 펩타이드를 합성하였다(표 1).Protein conjugation domains (PTDs), known to deliver proteins intracellularly, were selected only by physical conjugation with the protein to be delivered. In addition, the following peptides were synthesized to confirm whether they can deliver the protein to be delivered into cells under conditions that are not physically conjugated (Table 1).
[표 1] 물리적 컨쥬게이션이 필요한 단백질 전달 도메인들의 아미노산 서열TABLE 1 Amino Acid Sequences of Protein Delivery Domains Requiring Physical Conjugation
한편, 전달하고자 하는 단백질과 물리적 컨쥬게이션 없이 단백질을 전달할 수 있는 새로운 세포내 전달 도메인(ITD)을 개발하기 위하여 기존에 알려진 단백질 전달 도메인들(PTDs)을 분석하여 새로운 세포내 전달 도메인(ITD)을 포함하는 펩타이드를 합성하였다. 전달하고자 하는 단백질과의 물리적 컨쥬게이션 없이도 세포내로 단백질을 도입할 수 있는 새로운 세포내 전달 도메인은 전하를 띄는 물질 간의 상호작용(charge-charge interaction) 및/또는 세포내 전달 도메인-단백질 복합체의 수용성(solubility)을 높일 수 있는 친수성 도메인과, 소수성 상호작용 (hydrophophic interaction) 및/또는 세포막과의 상호작용에 이용될 수 있는 소수성 도메인을 갖는 펩타이드이다. 표 2에는 이와 같이 방식으로 선정되어 합성된 세포내 전달 도메인들(ITDs)의 아미노산 서열이 예시되어 있다. Meanwhile, in order to develop a new intracellular delivery domain (ITD) capable of delivering a protein without physical conjugation with the protein to be delivered, previously known protein delivery domains (PTDs) are analyzed to analyze the new intracellular delivery domain (ITD). Peptides were synthesized. New intracellular delivery domains, which can introduce proteins into cells without physical conjugation with the protein to be delivered, provide for charge-charge interaction and / or water solubility of intracellular delivery domain-protein complexes. It is a peptide having a hydrophilic domain that can increase solubility and a hydrophobic domain that can be used for hydrophophic interaction and / or cell membrane interaction. Table 2 shows the amino acid sequences of the intracellular delivery domains (ITDs) selected and synthesized in this manner.
[표 2] 세포내 전달 도메인들(ITDs)의 아미노산 서열 예시Table 2 Example Amino Acid Sequences of Intracellular Delivery Domains (ITDs)
** 표시는 펩타이드의 N-말단이 아세틸화되고 C-말단에 시스테아민이 부가되는 방식으로 변형된 펩타이드를 의미한다. ** indicates a peptide that has been modified in such a way that the N-terminus of the peptide is acetylated and cysteamine is added to the C-terminus.
실시예 2: 본 발명의 세포내 전달 도메인(ITD)에 의한 단백질의 세포 전달 기능 확인Example 2: Confirmation of Cell Delivery Function of Protein by Intracellular Delivery Domain (ITD) of the Present Invention
본 발명의 세포내 전달 도메인(ITD)을 이용하여 물리적인 컨쥬게이션 과정 없이 전달하고자 하는 단백질을 세포내로 전달할 수 있는지 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 물리적인 컨쥬게이션을 통해 단백질을 세포내로 전달하는 과정과 물리적인 컨쥬게이션 없이 단백질을 세포내로 전달하는 과정을 비교하 기 위하여 전달하고자 하는 단백질로 스트렙타비딘을 선택하였다(ImmunoPure Streptavidin, Pierce Biotechnology에서 구입). 스트렙타비딘은 비오틴과 결합할 수 있으며, 해리 상수(dissociation constant)가 Kd = 4 X 10-14 M 으로 높은 결합력을 갖는 것으로 알려져 있다[Laitinen, O. H. et al., Genetically engineered avidins and streptavidins. Cell Mol. Life Sci. 63, 2992-3017 (2006)]. 따라서, 세포내 전달 도메인(ITD)의 아미노 말단(N-terminus) 혹은 카르복시 말단(C-terminus)에 비오틴을 화학적으로 결합시켜 합성(비오틴-ITD)한 후, 스트렙타비딘과 비오틴-ITD를 시험관에서 반응시키면 ITD와 스트렙타비딘을 물리적으로 컨쥬게이션시킨 ITD-스트렙타비딘을 모사할 수 있다. 이를 위해 비오틴이 아미노 말단에 화학적으로 결합된 ITD(서열번호 1, Biotin-P07, Biotin-CKYGRRRQRRKKRGGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG)를 합성하였다.In order to check whether the protein to be delivered can be delivered intracellularly without physical conjugation process using the intracellular delivery domain (ITD) of the present invention, the following experiment was performed. Streptavidin was selected as the protein to be delivered to compare the intracellular delivery of the protein through physical conjugation with the intracellular delivery of the protein without physical conjugation (ImmunoPure Streptavidin, purchased from Pierce Biotechnology). . Streptavidin is capable of binding to biotin and has a high dissociation constant of Kd = 4 x 10 -14 M [Laitinen, OH et al., Genetically engineered avidins and streptavidins. Cell Mol. Life Sci. 63, 2992-3017 (2006). Therefore, biotin is chemically bound to the amino terminus (N-terminus) or carboxy terminus (C-terminus) of the intracellular delivery domain (ITD) to synthesize (biotin-ITD), and then streptavidin and biotin-ITD are in vitro. Reactions at can mimic ITD-streptavidin, which is a physical conjugate of ITD and streptavidin. For this purpose, it was synthesized ITD (SEQ ID NO: 1, Biotin-P07, Biotin-CKYGRRRQRRKKRGGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG) in which the biotin is chemically bound to the amino terminal.
세포내 전달 도메인(ITD)이 물리적인 컨쥬게이션 과정없이 스트렙타비딘을 세포내로 전달할 수 있는지 확인하기 위하여 펩타이드 코드 P071, P072, P073, P074 (서열번호 2 내지 5)로 명명된 4종의 ITD를 합성하여 실험을 수행하였다. 펩타이드 P073은 비오틴(Biotin)-P07과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 세포내 전달 도메인(ITD)이다. 다만, 비오틴(Biotin)과의 화학적 결합을 위해 링커로서 사용되는 CKYG 서열이 결실되어 있는 점만 비오틴(Biotin)-P07과 상이하다. 펩타이드 P074는 펩타이드 P073과 동일한 친수성 도메인과 소수성 도메인을 포함하고 있으나, P073과는 달리 소수성 도메인을 아미노 말단에 위치시키고 친수성 도메 인을 카르복시 말단에 위치시켜 소수성 도메인과 친수성 도메인의 위치를 달리한 것이다. 펩타이드 P071은 펩타이드 P073의 아미노산 서열을 레트로 형태(아미노산 서열이 역으로 합성된 형태)로 합성한 것이고, 펩타이드 P072는 펩타이드 P074의 아미노산 서열을 레트로 형태로 합성한 것이다.Four ITDs designated peptide peptides P071, P072, P073, and P074 (SEQ ID NOS: 2 to 5) were used to confirm that the intracellular delivery domain (ITD) can deliver streptavidin intracellularly without physical conjugation. The experiment was carried out by synthesis. Peptide P073 is an intracellular delivery domain (ITD) comprising an amino acid sequence substantially identical to Biotin-P07. However, it differs from Biotin-P07 only in that the CKYG sequence used as a linker for chemical bonding with Biotin is deleted. Peptide P074 includes the same hydrophilic domain and hydrophobic domain as peptide P073, but unlike P073, the hydrophobic domain is positioned at the amino terminus and the hydrophilic domain is positioned at the carboxy terminus to change the position of the hydrophobic domain and the hydrophilic domain. Peptide P071 synthesizes the amino acid sequence of the peptide P073 in retro form (the form in which the amino acid sequence is reversely synthesized), peptide P072 synthesizes the amino acid sequence of the peptide P074 in retro form.
한편, 세포내로 전달된 스트렙타비딘을 가시화하기 위하여 비오틴-SS-FITC(biotin-SS-FITC; biotin-GGAAGAGGK-FITC)를 합성하였다. 합성된 비오틴-SS-FITC은 화학적으로 결합된 비오틴에 의해 스트렙타비딘에 특이적으로 결합할 수 있으며, 녹색 형광을 내는 형광물질인 FITC에 의해 세포내에 전달된 스트렙타비딘을 가시화할 수 있다.Meanwhile, biotin-SS-FITC (biotin-SS-FITC; biotin-GGAAGAGGK-FITC) was synthesized to visualize the streptavidin delivered into cells. The synthesized biotin-SS-FITC can specifically bind streptavidin by chemically bound biotin and can visualize the streptavidin delivered intracellularly by FITC, a green fluorescence fluorescent substance.
스트렙타비딘(ImmunoPure Streptavidin, Pierce Biotechnology에서 구입)은 사량체(tetramer)를 이루며, 사량체의 분자량은 약 53 kDa이다. 반응 시 스트렙타비딘의 몰 농도는 사량체를 기준으로 계산하였다. 스트렙타비딘 단백질의 전달 대상이 되는 헬라 세포(HeLa cells; ATCC에서 구입)는 단백질을 전달하기 전날 웰당 5,000개의 세포(5,000 cells/well)로 96-well μClear Black Plate (Greiner에서 구입)에 계대배양한 후 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다.Streptavidin (ImmunoPure Streptavidin, purchased from Pierce Biotechnology) forms a tetramer, and the tetramer has a molecular weight of about 53 kDa. The molar concentration of streptavidin in the reaction was calculated based on tetramers. HeLa cells (purchased from ATCC) to which streptavidin proteins are delivered are passaged in 96-well μClear Black Plates (purchased from Greener) at 5,000 cells per well (5,000 cells / well) the day before protein delivery. After incubation in a 37 ℃ CO 2 incubator.
음성대조구는 DPBS(웰진에서 구입)에 녹여진 0.007 mM(3.7 mg/ml)의 스트렙타비딘 용액 9 ㎕, DPBS에 희석된 0.1 mM의 비오틴-SS-FITC 용액 3 ㎕, 멸균 증류수에 희석된 0.1 mM의 비오틴 용액 3 ㎕, 및 DPBS 15 ㎕를 혼합하여 상온에서 30분간 반응시킨 후, 추가로 DPBS 30 ㎕를 혼합하여 상온에서 30분간 반응시켰다. 세포 내 전달 펩타이드와 스트렙타비딘이 물리적으로 컨쥬게이션된 조건을 모사하기 위하여 DPBS(웰진에서 구입)에 녹여진 0.007 mM(3.7 mg/ml)의 스트렙타비딘 용액 9 ㎕, DPBS에 희석된 0.1 mM의 비오틴-SS-FITC 용액 3 ㎕, DPBS(웰진에서 구입)에 녹여진 0.1 mM의 비오틴-P07 3 ㎕, 및 DPBS 15 ㎕를 혼합하여 상온에서 30분간 반응시킨 후, 추가로 DPBS 30 ㎕를 혼합하여 상온에서 30분간 반응시켰다. 물리적으로 컨쥬게이션시키지 않은 ITD에 의한 스트렙타비딘의 세포내 전달을 확인하기 위해 DPBS(웰진에서 구입)에 녹여진 0.007 mM(3.7 mg/ml)의 스트렙타비딘 용액 9 ㎕, DPBS에 희석된 0.1 mM의 비오틴-SS-FITC 용액 3 ㎕, 멸균 증류수에 희석된 0.1 mM의 비오틴 용액 3 ㎕, 및 DPBS 15 ㎕를 혼합하여 상온에서 30분간 반응시킨 후, 추가로 DPBS에 0.1 mM로 희석된 펩타이드 P071, P072, P073, 또는 P074를 각각 3 ㎕ 또는 6 ㎕씩 첨가하고 DPBS를 27 ㎕ 또는 24 ㎕ 첨가하여 혼합한 후 상온에서 30분간 반응시켰다. 전날 준비된 헬라 세포를 DPBS로 1회 세척한 후, 스트렙타비딘과 ITD 반응액을 웰당 20 ㎕(20 ㎕/well)씩 넣어준 후, OPTI MEM I 배지(Invitrogen에서 구입)를 웰당 80 ㎕ (80 ㎕/well)씩 첨가하고 37℃ CO2 배양기에서 2시간 동안 배양하였다. 2시간 배양 후, 웰당 100 ㎕(100 ㎕/well)의 DPBS로 3회 세척한 후, OPTI MEM I을 웰당 100 ㎕(100 ㎕/well)씩 첨가하고, UPLAPO 40X 대물렌즈와 EGFP 형광필터(BP 505-530)가 장착된 FV1000 공초점형광현미경(올림푸스사에서 구입, 대전바이오벤처타운 소장)을 이용하여 살아있는 세포의 형광이미지를 얻었다 (도 1).Negative controls were 9 μl of 0.007 mM (3.7 mg / ml) streptavidin solution dissolved in DPBS (purchased from Weljin), 3 μl of 0.1 mM biotin-SS-FITC solution diluted in DPBS, 0.1 diluted in sterile distilled water. 3 μl of a biotin solution of mM and 15 μl of DPBS were mixed and reacted at room temperature for 30 minutes, and then 30 μl of DPBS was further mixed and reacted at room temperature for 30 minutes. 9 μl of 0.007 mM (3.7 mg / ml) streptavidin solution dissolved in DPBS (purchased in Welzin) to simulate the physically conjugated conditions of intracellular delivery peptide and streptavidin, 0.1 mM diluted in DPBS 3 μl Biotin-SS-FITC solution, 3 μl of 0.1 mM Biotin-P07 dissolved in DPBS (purchased in Weljin), and 15 μl of DPBS were reacted at room temperature for 30 minutes, and then 30 μl of DPBS was further mixed. The reaction was carried out at room temperature for 30 minutes. 9 μl of a 0.007 mM (3.7 mg / ml) solution of streptavidin dissolved in DPBS (purchased from Welzin) to confirm intracellular delivery of streptavidin by physically unconjugated ITD, 0.1 diluted in DPBS Peptide P071 diluted to 0.1 mM in DPBS was further reacted with 3 μl of biotin-SS-FITC solution, 3 μl of 0.1 mM biotin solution diluted in sterile distilled water, and 15 μl of DPBS. 3 μl or 6 μl of P072, P073, or P074 were added respectively, and 27 μl or 24 μl of DPBS was added and mixed, followed by reaction at room temperature for 30 minutes. After washing the prepared HeLa cells with DPBS once the day before, add 20 μl (20 μl / well) of streptavidin and ITD reaction solution per well, and add 80 μl (80 μl) of OPTI MEM I medium (available from Invitrogen). Μl / well) and incubated for 2 hours in a 37 ° C. CO 2 incubator. After 2 hours of incubation, the cells were washed three times with 100 μl (100 μl / well) of DPBS per well, and then 100 μl (100 μl / well) of OPTI MEM I was added per well, followed by UPLAPO 40X objective lens and EGFP fluorescent filter (BP). 505-530) equipped with FV1000 confocal fluorescence microscope (purchased from Olympus, Daejeon Bioventure Town director) to obtain a fluorescent image of the living cells (Fig. 1).
도 1에 도시된 바와 같이, 음성대조구로 비오틴-SS-FITC가 결합된 스트렙타 비딘만을 처리한 경우는 세포내에서 형광이 관찰되지 않는 반면, 양성대조구로 비오틴-SS-FITC와 비오틴-P07이 결합된 스트렙타비딘을 처리한 경우는 세포내에서 형광이 관찰되었다. 또한, 비오틴-SS-FITC가 결합된 스트렙타비딘에 세포내 전달 도메인(ITD) P071, P072, P073 또는 P074를 각각 혼합하여 처리한 경우에도 세포내에서 형광이 관찰되어 물리적 컨쥬게이션 과정 없이 본 발명의 세포내 전달 도메인(ITD)에 의해 스트렙타비딘 단백질이 세포내로 전달됨을 확인하였다. As shown in FIG. 1, when only streptavidin conjugated with biotin-SS-FITC was treated as a negative control, fluorescence was not observed in cells, whereas biotin-SS-FITC and biotin-P07 were positive as controls. Fluorescence was observed in cells treated with bound streptavidin. In addition, even when treated with a combination of biotin-SS-FITC bound streptavidin intracellular delivery domain (ITD) P071, P072, P073 or P074, respectively, the fluorescence is observed in the cell without the physical conjugation process It was confirmed that streptavidin protein is delivered intracellularly by the intracellular delivery domain (ITD).
실시예 3: 본 발명의 세포내 전달 도메인(ITD)에 의한 FITC-스트렙타비딘의 농도 의존적 세포내 전달 확인Example 3: Confirmation of Concentration-dependent Intracellular Delivery of FITC-Streptavidin by Intracellular Delivery Domain (ITD) of the Invention
물리적 컨쥬게이션 과정 없이 세포내 전달 도메인(ITD)에 의해 FITC로 표지된 스트렙타비딘(FITC-스트렙타비딘)이 단백질의 농도에 따라 세포내에 전달되는 것을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. In order to confirm that the FITC-labeled streptavidin (FITC-streptavidin) was delivered intracellularly according to the protein concentration without the physical conjugation process, the intracellular delivery domain (ITD) was performed as follows.
1) 헬라 세포는 실시예 2에서와 같이 준비하였다. 1) HeLa cells were prepared as in Example 2.
2) 스트렙타비딘 단백질 용액을 DPBS로 희석하여 최종 농도가 20 μM이 되도록 준비하였다. 2) The streptavidin protein solution was diluted with DPBS to prepare a final concentration of 20 μΜ.
3) 비오틴-SS-FITC를 DPBS로 희석하여 최종 농도가 200 μM이 되도록 준비하였다. 3) Biotin-SS-FITC was diluted with DPBS to prepare a final concentration of 200 μΜ.
4) 2)와 3)에서 준비된 스트렙타비딘과 비오틴-SS-FITC를 1:1로 혼합하여 상온에서 30분간 반응시켜, FITC로 표지된 스트렙타비딘(FITC-스트렙타비딘)을 준비하였다.4) Streptavidin prepared in 2) and 3) and biotin-SS-FITC were mixed 1: 1 to react at room temperature for 30 minutes to prepare streptavidin (FITC-streptavidin) labeled with FITC.
5) 4)에서 준비된 스트렙타비딘을 각각 다음과 같이 희석하여 준비하였다: 5) The streptavidin prepared in 4) was prepared by diluting as follows:
6) 세포내 전달 도메인(ITD) P071, P072, P073, P074를 DPBS로 각각 20 μM로 희석하여 준비하였다.6) Intracellular Delivery Domains (ITD) P071, P072, P073, P074 were prepared by diluting with DPBS to 20 μM each.
7) 5)에서 준비된 FITC-스트렙타비딘 희석액 각 10㎕ 당, 6)에서 준비된 세포내 전달 도메인 희석액 각 10 ㎕를 혼합한 후 상온에서 30분간 반응시켰다. 음성대조구로는 5 μM의 비오틴-SS-FITC 용액 10 ㎕ 당 DPBS 10 ㎕를 혼합하여 상온에서 30분간 반응시킨 것(FITC only)과 FITC-스트렙타비딘 희석액 10 ㎕ 당 DPBS 10 ㎕를 혼합하여 상온에서 30분간 반응시킨 것을 사용하였다.7) 10 μl of each of the intracellular delivery domain dilutions prepared in 6) and 10 μl of the FITC-streptavidin dilutions prepared in 5) were reacted at room temperature for 30 minutes. As a negative control, mix 10 μl of DPBS per 10 μl of 5 μM Biotin-SS-FITC solution and react at room temperature for 30 minutes (FITC only) and 10 μl of DPBS per 10 μl of FITC-streptavidin diluted solution. The reaction was used for 30 minutes at.
8) 1)에서 준비된 헬라 세포를 DPBS로 2회 세척 후, 7)에서 준비된 FITC-스트렙타비딘과 ITD 혼합액을 20 ㎕/웰로 처리하고, OPTI MEM I을 80 μM/웰로 첨가한 후 37℃ 5% CO2 배양기에서 2시간 동안 배양하였다.8) After washing the HeLa cells prepared in 1) twice with DPBS, treated with 20 μl / well of the FITC-streptavidin and ITD mixture prepared in 7), and adding OPTI MEM I at 80 μM / well, Incubated for 2 hours in a% CO 2 incubator.
9) 2시간 후 헬라 세포를 웰당 100 ㎕의 DPBS로 3회 세척한 후, OPTI MEM I을 100 ㎕/웰로 첨가하고 실시예 2에서와 같이 세포 형광 이미지를 얻었다.9) After 2 hours, the HeLa cells were washed three times with 100 μl of DPBS per well, and then OPTI MEM I was added at 100 μl / well and cell fluorescence images were obtained as in Example 2.
도 2에 도시된 바와 같이, 음성대조구로 비오틴-SS-FITC 0.5 μM을 헬라 세포에 처리한 것(FITC only)과 FITC-스트렙타비딘 1 μM을 헬라 세포에 처리한 것(no ITD)은 세포내에서 형광이 관찰되지 않았다. 반면, 본 발명의 세포내 전달 도메인을 첨가한 경우, FITC-스트렙타비딘이 세포내에 전달되어 세포내에서 형광이 관찰되는 것을 확인하였다.As shown in FIG. 2, treatment of HeLa cells with 0.5 μM of biotin-SS-FITC as a negative control (FITC only) and 1 μM of FITC-streptavidin in HeLa cells (no ITD) were performed. No fluorescence was observed within. On the other hand, when the intracellular delivery domain of the present invention was added, it was confirmed that FITC-streptavidin was delivered intracellularly and fluorescence was observed in the cell.
실시예 4: 본 발명의 세포내 전달 도메인(ITD)에 의한 FITC-스트렙타비딘의 세포내 전달 확인Example 4 Confirmation of Intracellular Delivery of FITC-Streptavidin by Intracellular Delivery Domain (ITD) of the Invention
형광 물질이 컨쥬게이션된 단백질 전달 도메인(PTD)을 세포에 처리한 경우, 세포내로 전달되지 않고 단지 세포막에 결합되어 있는 PTD로 인해 마치 PTD가 세포내로 전달된 것으로 오인되는 것이 보고되어 있다[Richard, J. P., et al. Cell-penetrating peptides: a reevaluation of the mechanism of cellular uptake. J. Biol. Chem. 278, 585-590 (2003)]. 한편, 트립판 블루는 세포막에 결합된 형광을 제거하기 위해 널리 사용되어 왔다[Weller, K., et al. Biophysical and biological studies of end-group-modified derivatives of Pep-1. Biochemistry 44, 15799-15811 (2005)]. 트립판 블루는 손상된 세포를 특이적으로 염색하는 데 사용되는데, 이는 건강한 세포는 트립판 블루가 세포막을 투과하지 못하여 염색이 되지 않는 반면에 세포막이 손상된 세포는 트립판 블루에 의해 염색되기 때문이다.When cells are treated with conjugated protein delivery domains (PTDs), it is reported that PTDs that are not delivered intracellularly but are bound to the cell membrane are mistaken as if they were delivered intracellularly [Richard, JP, et al. Cell-penetrating peptides: a reevaluation of the mechanism of cellular uptake. J. Biol. Chem. 278, 585-590 (2003). On the other hand, trypan blue has been widely used to remove fluorescence bound to the cell membrane [Weller, K., et al. Biophysical and biological studies of end-group-modified derivatives of Pep-1. Biochemistry 44, 15799-15811 (2005)]. Trypan blue is used to specifically stain damaged cells because healthy cells are not stained because trypan blue does not penetrate the cell membrane, while cells with damaged cell membrane are stained by trypan blue.
FITC-스트렙타비딘을 실시예 3에서와 같이 세포에 처리한 후, 2시간 후에 배양 배지와 동일한 양의 0.4% 트립판 블루를 배지에 혼합하고, 실시예 2에서와 같이 세포 형광 이미지를 얻었다.After FITC-streptavidin was treated with the cells as in Example 3, 2 hours later, the same amount of 0.4% trypan blue as the culture medium was mixed into the medium, and cell fluorescence images were obtained as in Example 2.
도 3에 도시된 바와 같이, 트립판 블루 처리 후에도 세포내에서 형광이 관찰되는 것을 확인할 수 있었다. As shown in FIG. 3, fluorescence was observed in cells even after trypan blue treatment.
실시예 5: 세포내 전달 도메인(ITD)에 의한 베타-갈락토시데이즈 단백질의 세포내 전달 확인Example 5: Confirmation of intracellular delivery of beta-galactosidase protein by intracellular delivery domain (ITD)
물리적 컨쥬게이션 과정 없이 세포내 전달 도메인(ITD)에 의해 베타-갈락토시데이즈(beta-galactosidase) 단백질이 세포내로 전달되는지 여부를 확인하였다. 일반적으로 세포내에 전달된 베타-갈락토시데이즈 단백질의 활성은 세포를 고정한 후 X-gal 염색을 수행하여 확인한다. 그런데, 세포막에 붙어 있던 단백질 전달 도메인은 세포 고정 과정에서 인위적으로 전달(artifactual uptake)되어 세포질 혹은 핵으로 들어갈 수 있게 되는 것으로 알려졌다[Richard, J. P., et al. Cell-penetrating peptides: a reevaluation of the mechanism of cellular uptake. J. Biol. Chem. 278, 585-590 (2003)]. 즉, 단백질 전달 도메인에 의해 베타-갈락토시데이즈 단백질이 세포내로 전달되지 않은 경우에도, 세포 고정의 결과 마치 베타-갈락토시데이즈 단백질이 세포내로 전달된 것과 같은 잘못된 결과를 얻을 수 있는 것이다. 이를 방지하기 위한 방법으로 세포내 전달 도메인(ITD)과 베타-갈락토시데이즈 단백질 복합체를 세포에 처리한 후 트립신 효소를 처리하여 세포막에 결합된 ITD/단백질 복합체를 제거한 후, 세포내에 전달된 베타-갈락토시데이즈 단백질의 활성을 확인하였다.Whether or not the beta-galactosidase protein is delivered intracellularly by the intracellular delivery domain (ITD) without physical conjugation process. In general, the activity of beta-galactosidase protein delivered intracellularly is confirmed by performing X-gal staining after fixing the cells. However, the protein transfer domains attached to the cell membranes are known to be artificially uptake during cellular fixation and enter the cytoplasm or nucleus [Richard, J. P., et al. Cell-penetrating peptides: a reevaluation of the mechanism of cellular uptake. J. Biol. Chem. 278, 585-590 (2003). In other words, even when the beta-galactosidase protein is not intracellularly delivered by the protein delivery domain, the result of cell fixation may be as erroneous as the beta-galactosidase protein is intracellularly delivered. In order to prevent this, the intracellular delivery domain (ITD) and the beta-galactosidase protein complex were treated to cells, followed by trypsin enzyme to remove the ITD / protein complexes bound to the cell membrane, and then the intracellular beta delivered. -The activity of galactosidase protein was confirmed.
우선 정제된 베타-갈락토시데이즈 단백질을 얻기 위하여, 대장균의 베타-갈락토시데이즈 유전자(GenBank Acc. No. U02445)를 PCR 증폭하여 pDONR201 (Invitrogen에서 구입)에 클로닝하였다. 이를 다시 LR 재조합 클로닝 효소를 이용하여 pDEST17 (Invitrogen에서 구입) 벡터와 재조합하여 베타-갈락토시데이즈 단백 질 발현 벡터를 얻었다. 베타-갈락토시데이즈 단백질 발현 벡터를 BL21(DE3)pLysS 대장균에 형질전환한 후, IPTG 처리에 의해 단백질을 과발현시키고, HisTrapTM HP column이 장착된 AKTAexploerTM 단백질 정제 시스템(대전바이오벤처타운 소장, GE Healthcare에서 구입)을 이용하여 베타-갈락토시데이즈 단백질을 정제한 후, 10% 글리세롤이 포함된 1X PBS 완충용액에 투석하였다. First, to obtain purified beta-galactosidase protein, E. coli beta-galactosidase gene (GenBank Acc. No. U02445) was PCR amplified and cloned into pDONR201 (purchased from Invitrogen). This was recombined with pDEST17 (purchased from Invitrogen) vector using LR recombinant cloning enzyme to obtain beta-galactosidase protein expression vector. A beta-galactosidase protein expression vector was transformed into BL21 (DE3) pLysS Escherichia coli, followed by overexpression of the protein by IPTG treatment, and an AKTAexploer ™ protein purification system equipped with HisTrapTM HP column Beta-galactosidase protein) was purified and then dialyzed in IX PBS buffer containing 10% glycerol.
헬라 세포는 실시예 2에서와 같이 준비하였다. 2 μM의 베타-갈락토시데이즈 단백질 용액 12 ㎕/well을 20 μM의 ITD 용액 12 ㎕/well과 혼합하여 상온에서 30분간 반응시켰다. 전날 준비된 헬라 세포를 DPBS로 세척하고, 베타-갈락토시데이즈 단백질과 ITD 혼합액을 20 ㎕/well로 헬라 세포에 처리한 후, 80 ㎕의 OPTI-MEM I을 첨가하였다. 처리된 세포를 37℃ 5% CO2 배양기에서 5분 ~ 4시간 동안 배양하였다. 배양 후, 트립신을 처리하지 않는 실험군은 DPBS로 세포를 세척한 후, In Situ beta-Galactosidase Staining Kit (Stratagene에서 구입)에 포함되어 있는 세포 고정액을 이용하여 10분간 세포를 고정시켰다. 한편, 트립신을 처리하는 실험군은 우선 세포를 DPBS로 세척하고 30 ㎕/well의 트립신-EDTA (Welgene에서 구입)를 10~30초간 처리하였다. 그런 다음, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지를 150 ㎕/well로 첨가한 후 파이펫팅하여 세포를 떼어내고, 이를 다시 새로운 96-well μClear Black Plate (Greiner에서 구입)에 계대배양한 후 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다. 다음날, 세포를 DPBS로 세척한 후, In Situ beta-Galactosidase Staining Kit (Stratagene에 서 구입)에 포함되어 있는 세포 고정액을 이용하여 10분간 세포를 고정시켰다. X-gal 염색은 In Situ beta-Galactosidase Staining Kit에 첨부된 방법에 따라 1시간 동안 수행하였다. X-gal 염색 후 투과광 이미지는 캐논사의 파워샷 A640 디지털 카메라가 장착된 니콘사의 이클립스 TS100-F 현미경을 사용하여 얻었다.HeLa cells were prepared as in Example 2. 12 μl / well of 2 μM beta-galactosidase protein solution was mixed with 12 μl / well of 20 μM ITD solution for 30 minutes at room temperature. Hela cells prepared the previous day were washed with DPBS, treated with beta-galactosidase protein and ITD mixture at 20 μl / well of HeLa cells, and 80 μl of OPTI-MEM I was added. Treated cells were incubated for 5 minutes to 4 hours in a 37 ° C. 5% CO 2 incubator. After incubation, the experimental group not treated with trypsin was washed with DPBS, and the cells were fixed for 10 minutes using a cell fixative solution included in In Situ beta-Galactosidase Staining Kit (purchased from Stratagene). Meanwhile, the experimental group treated with trypsin was first washed with DPBS and treated with 30 μl / well of trypsin-EDTA (from Welgene) for 10-30 seconds. Then, add DMEM medium containing 10% FBS to 150 μl / well and pipette to remove the cells, which are then subcultured on a new 96-well μClear Black Plate (purchased from Greener) and then at 37 ° C. CO Incubated in 2 incubators. The next day, after washing the cells with DPBS, the cells were fixed for 10 minutes using a cell fixer included in the In Situ beta-Galactosidase Staining Kit (purchased from Stratagene). X-gal staining was performed for 1 hour according to the method attached to the In Situ beta-Galactosidase Staining Kit. Transmitted light images after X-gal staining were obtained using a Nikon Eclipse TS100-F microscope equipped with a Canon PowerShot A640 digital camera.
도 4에 도시된 바와 같이, 트립신 처리에 의하여 세포막에 비특이적으로 결합되어 있는 베타-갈락토시데이즈/ITD 복합체를 제거할 수 있으며, 그 결과 ITD에 의해 세포내로 전달된 베타-갈락토시데이즈 단백질의 활성을 구분할 수 있었다. As shown in FIG. 4, beta-galactosidase / ITD complexes that are nonspecifically bound to cell membranes can be removed by trypsin treatment, resulting in beta-galactosidase proteins delivered intracellularly by ITD. It was able to distinguish the activity of.
실시예 6: 세포내 전달 도메인(ITD)과 단백질 전달 도메인에 의한 베타-갈락토시데이즈 단백질의 세포내 전달 비교Example 6: Comparison of intracellular delivery of beta-galactosidase protein by intracellular delivery domain (ITD) and protein delivery domain
기존에 알려진 단백질 전달 도메인(PTD)과 본 발명에서 고안된 세포내 전달 도메인(ITD)이 각기 물리적 컨쥬게이션 과정 없이 베타-갈락토시데이즈 단백질을 세포내로 전달할 수 있는지 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 기존에 알려진 단백질 도메인은 표 1에 예시된 바와 같이 합성하였다. 베타 갈락토시데이즈 단백질은 2 μM 용액을 준비하였다. PTD 혹은 ITD 용액은 5, 10, 20, 40 μM 농도 용액을 준비하였다. 준비된 단백질 용액과 PTD 혹은 ITD 용액을 각각 12 ㎕/well씩 혼합하여 상온에서 30분간 반응시켰다. 실시예 2에서와 같이 준비된 헬라 세포를 DPBS로 세척한 후, PTD 혹은 ITD와 베타-갈락토시데이즈 단백질 혼합액을 헬라 세포에 20 ㎕/well로 처리한 후 80 ㎕/well의 OPTI MEM I 배지를 첨가하고, 처리된 세포를 37℃ 5% CO2 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포막에 결합된 PTD/단백질 복합체 혹은 ITD/단백질 복합체는 실시예 5에서와 같이 트립신 처리하여 제거하였다. 세포 고정과 X-gal 염색은 실시예 5에서와 같이 수행하였다. 단, X-gal 염색은 4~24시간 동안 수행하였다. X-gal 염색 후 투과광 이미지는 캐논사의 파워샷 A640 디지털 카메라가 장착된 니콘사의 이클립스 TS100-F 현미경을 사용하여 얻었다.In order to confirm whether the known protein delivery domain (PTD) and the intracellular delivery domain (ITD) designed in the present invention can deliver beta-galactosidase protein into cells without physical conjugation process, the following experiments are performed. It was. Known protein domains were synthesized as illustrated in Table 1. Beta galactosidase protein prepared 2 μM solution. PTD or ITD solution was prepared 5, 10, 20, 40 μM concentration solution. The prepared protein solution and PTD or ITD solution were mixed with 12 μl / well, respectively, and reacted at room temperature for 30 minutes. Hela cells prepared as in Example 2 were washed with DPBS, treated with 20 μl / well of PTD or ITD and beta-galactosidase protein mixture to the cells, and 80 μl / well of OPTI MEM I medium. The treated cells were added and incubated for 4 hours in a 37 ° C. 5% CO 2 incubator. After incubation, the PTD / protein complex or ITD / protein complex bound to the cell membrane was removed by trypsin treatment as in Example 5. Cell fixation and X-gal staining were performed as in Example 5. However, X-gal staining was performed for 4 to 24 hours. Transmitted light images after X-gal staining were obtained using a Nikon Eclipse TS100-F microscope equipped with a Canon PowerShot A640 digital camera.
도 5에 도시된 바와 같이, 전달하고자 하는 물질과 물리적 컨쥬게이션이 되어 있어야 전달 물질을 세포내로 전달하는 것으로 알려진 단백질 전달 도메인(PTD)들은 물리적 컨쥬게이션이 되어 있지 않은 조건에서는 베타-갈락토시데이즈 단백질을 세포내로 전달하지 못하는 반면, 본 발명의 세포내 전달 도메인(ITD)은 물리적 컨쥬게이션 없이도 베타-갈락토시데이즈 단백질을 세포내로 전달하는 것을 확인하였다.As shown in FIG. 5, protein delivery domains (PTDs), which are known to deliver a delivery material intracellularly, must be in physical conjugation with the material to be delivered, beta-galactosidase under conditions that are not physically conjugated. While the protein could not be delivered intracellularly, the intracellular delivery domain (ITD) of the present invention was found to deliver beta-galactosidase protein intracellularly without physical conjugation.
실시예 7: 세포내 전달 도메인(ITD)에 의한 베타-갈락토시데이즈 단백질의 세포내 전달 비교Example 7: Comparison of intracellular delivery of beta-galactosidase protein by intracellular delivery domain (ITD)
본 발명에 따른 세포내 전달 도메인(ITD)에 의한 베타-갈락토시데이즈 단백질의 세포내 전달을 비교하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 세포내 전달 도메인은 표 2에 예시된 바와 같이 합성하였다. 베타 갈락토시데이즈 단백질은 2 μM 용액을 준비하였다. ITD 용액은 10, 20, 40 μM 농도 용액을 준비하였다. 준비 된 단백질 용액과 ITD 용액을 각각 12 ㎕/well씩 혼합하여 상온에서 30분간 반응시켰다. 실시예 2에서와 같이 준비된 헬라 세포를 DPBS로 세척한 후, ITD와 베타-갈락토시데이즈 단백질 혼합액을 헬라 세포에 20 ㎕/well로 처리한 후 80 ㎕/well의 OPTI MEM I 배지를 첨가하고, 처리된 세포를 37℃ 5% CO2 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포막에 결합된 ITD/단백질 복합체는 실시예 5에서와 같이 트립신 처리하여 제거하였다. 세포 고정과 X-gal 염색은 실시예 5에서와 같이 수행하였다. 단, X-gal 염색은 4~24시간 동안 수행하였다. X-gal 염색 후 투과광 이미지는 캐논사의 파워샷 A640 디지털 카메라가 장착된 니콘사의 이클립스 TS100-F 현미경을 사용하여 얻었다.In order to compare the intracellular delivery of beta-galactosidase protein by the intracellular delivery domain (ITD) according to the present invention, the following experiment was performed. Intracellular delivery domains were synthesized as illustrated in Table 2. Beta galactosidase protein prepared 2 μM solution. ITD solution prepared 10, 20, 40 μM concentration solution. The prepared protein solution and the ITD solution were mixed with 12 μl / well, respectively, and reacted at room temperature for 30 minutes. After washing the prepared HeLa cells with DPBS as in Example 2, treated the HeLa cells with 20 μl / well of the ITD and beta-galactosidase protein mixture, and then added 80 μl / well of OPTI MEM I medium. Treated cells were incubated for 4 hours in a 37 ° C. 5% CO 2 incubator. After incubation, the ITD / protein complex bound to the cell membrane was removed by trypsin treatment as in Example 5. Cell fixation and X-gal staining were performed as in Example 5. However, X-gal staining was performed for 4 to 24 hours. Transmitted light images after X-gal staining were obtained using a Nikon Eclipse TS100-F microscope equipped with a Canon PowerShot A640 digital camera.
도 6에 도시된 바와 같이, 본 발명의 세포내 전달 도메인(ITD)은 물리적 컨쥬게이션 없이도 베타-갈락토시데이즈 단백질을 세포내로 전달하는 것을 확인하였다.As shown in Figure 6, the intracellular delivery domain (ITD) of the present invention was confirmed to deliver beta-galactosidase protein intracellularly without physical conjugation.
실시예 8: 세포내 전달 도메인(ITD)에 의한 스트렙타비딘-Cy3 단백질의 세포내 전달 비교Example 8: Comparison of intracellular delivery of streptavidin-Cy3 protein by intracellular delivery domain (ITD)
본 발명에 따른 세포내 전달 도메인(ITD)에 의한 스트렙타비딘-Cy3 단백질의 세포내 전달을 비교하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 헬라 세포는 실시예 2에서와 같이 준비하였다. Cy3 염료가 컨쥬게이션된 스트렙타비딘(스트렙타비딘-Cy3)는 Zymed Laboratories에서 구입하였다. 1 μM의 스트렙타비딘-Cy3 용액 12 ㎕를 각각 10, 20, 40 μM의 ITD 용액 각 12 ㎕와 혼합한 후 상온에서 30분간 반응시켰다. 전날 준비된 세포를 DPBS로 세척 후, 스트렙타비딘-Cy3/ITD 반응액을 20 ㎕/well로 처리하고, 80 ㎕의 OPTI MEM I을 첨가한 후, 처리된 세포는 37℃ 5% CO2 배양기에서 2시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포막에 결합된 ITD/단백질 복합체는 실시예 5에서와 같이 트립신 처리하여 제거하였다. 세포 형광 이미지는 실시예 2에서와 같이 얻었다.In order to compare intracellular delivery of streptavidin-Cy3 protein by the intracellular delivery domain (ITD) according to the present invention, the following experiment was performed. HeLa cells were prepared as in Example 2. Streptavidin (Streptavidin-Cy3) conjugated with Cy3 dye was purchased from Zymed Laboratories. 12 μl of 1 μM streptavidin-Cy3 solution was mixed with 12 μl of 10, 20, and 40 μM of ITD solution, respectively, and reacted at room temperature for 30 minutes. The cells prepared the previous day were washed with DPBS, treated with 20 μl / well of streptavidin-Cy3 / ITD reaction solution, 80 μl of OPTI MEM I was added, and the treated cells were treated in a 37 ° C. 5% CO 2 incubator. Incubated for 2 hours. After incubation, the ITD / protein complex bound to the cell membrane was removed by trypsin treatment as in Example 5. Cell fluorescence images were obtained as in Example 2.
도 7에 도시된 바와 같이, 본 발명의 세포내 전달 도메인(ITD)에 의해 스트렙타비딘-Cy3 단백질이 세포내에 전달되어 세포내에서 Cy3에 의한 적색 형광이 관찰됨을 확인하였다.As shown in FIG. 7, it was confirmed that streptavidin-Cy3 protein was delivered intracellularly by the intracellular delivery domain (ITD) of the present invention to observe red fluorescence by Cy3 in the cells.
실시예 9: 세포내 전달 도메인(ITD)에 의한 GUS 단백질의 세포내 전달 비교Example 9 Comparison of Intracellular Delivery of GUS Proteins by Intracellular Delivery Domain (ITD)
본 발명에 따른 세포내 전달 도메인(ITD)에 의한 GUS 단백질의 세포내 전달을 비교하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. In order to compare the intracellular delivery of GUS protein by the intracellular delivery domain (ITD) according to the present invention, the following experiment was performed.
우선 정제된 GUS 단백질을 얻기 위하여, 대장균의 GUS 유전자(GenBank Acc. No. NP_416134)를 PCR 증폭하여 pDONR201 (Invitrogen에서 구입)에 클로닝하였다. 이를 다시 LR 재조합 클로닝 효소를 이용하여 pDEST17 (Invitrogen에서 구입) 벡터와 재조합하여 GUS 단백질 발현 벡터를 얻었다. GUS 단백질 발현 벡터를 BL21(DE3)pLysS 대장균에 형질전환한 후, IPTG 처리에 의해 단백질을 과발현시키고, HisTrapTM HP column이 장착된 AKTAexploerTM 단백질 정제 시스템(대전바이오벤 처타운 소장, GE Healthcare에서 구입)을 이용하여 GUS 단백질을 정제한 후, 10% 글리세롤이 포함된 1X PBS 완충용액에 투석하였다. First, to obtain purified GUS protein, E. coli GUS gene (GenBank Acc. No. NP_416134) was PCR amplified and cloned into pDONR201 (purchased from Invitrogen). This was recombined with pDEST17 (purchased from Invitrogen) vector using LR recombinant cloning enzyme to obtain a GUS protein expression vector. After transforming the GUS protein expression vector into BL21 (DE3) pLysS Escherichia coli, the protein was overexpressed by IPTG treatment, and an AKTAexploer ™ protein purification system equipped with HisTrapTM HP column (commercially prepared by Daejeon Bioventure Town, GE Healthcare) GUS protein was purified using and then dialyzed in IX PBS buffer containing 10% glycerol.
헬라 세포는 실시예 2에서와 같이 준비하였다. 2 μM의 GUS 단백질 용액 12 ㎕를 각각 10, 20, 40, 80 μM의 ITD 용액 각 12 ㎕와 혼합한 후 상온에서 30분간 반응시켰다. 전날 준비된 헬라 세포를 DPBS로 세척 후, GUS 단백질/ITD 반응액을 20 ㎕/well로 처리하고 80 ㎕의 OPTI MEM I을 첨가한 후, 처리된 세포는 37℃ 5% CO2 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포막에 결합된 ITD/단백질 복합체는 실시예 5에서와 같이 트립신 처리하여 제거하였다. 다음날, 세포를 DPBS로 세척한 후, 1 mM FDGlcu(Fluorescein di-beta-D-Glucuronide, di-methyl ester; Marker Gene Technologies Inc.에서 구입)과 OPTI MEM I을 동량으로 혼합한 용액을 50 ㎕/well로 처리하고, 37℃ 5% CO2 배양기에서 5분 동안 배양하였다. 세포를 DPBS로 세척한 후, 세포 형광 이미지는 실시예 2에서와 같이 얻었다.HeLa cells were prepared as in Example 2. 12 μl of 2 μM GUS protein solution was mixed with 12 μl of 10, 20, 40, and 80 μM of ITD solution, respectively, and reacted for 30 minutes at room temperature. Hela cells prepared the day before were washed with DPBS, treated with 20 μl / well of GUS protein / ITD reaction solution and 80 μl of OPTI MEM I was added, and then the treated cells were treated for 4 hours in a 37 ° C. 5% CO 2 incubator. Incubated. After incubation, the ITD / protein complex bound to the cell membrane was removed by trypsin treatment as in Example 5. The next day, after washing the cells with DPBS, 50 μl / ml of a solution of 1 mM FDGlcu (Fluorescein di-beta-D-Glucuronide, di-methyl ester; purchased from Marker Gene Technologies Inc.) and OPTI MEM I in the same amount Treated with wells and incubated for 5 minutes in a 37 ° C. 5% CO 2 incubator. After washing the cells with DPBS, cell fluorescence images were obtained as in Example 2.
도 8에 도시된 바와 같이, 본 발명의 세포내 전달 도메인(ITD)에 의해 GUS 단백질이 세포내에 전달되었고 세포내에서 GUS 단백질에 의해 FDGLcu 기질이 분해되어 녹색 형광이 관찰됨을 확인하였다.As shown in FIG. 8, it was confirmed that the GUS protein was delivered intracellularly by the intracellular delivery domain (ITD) of the present invention and the green fluorescence was observed by the degradation of the FDGLcu substrate by the GUS protein in the cell.
실시예 10: 세포내 전달 도메인(ITD) 및 베타-갈락토시데이즈 단백질의 농도에 따른 세포내 전달Example 10 Intracellular Delivery According to Concentration of Intracellular Delivery Domain (ITD) and Beta-Galactosidase Protein
본 발명에 따른 세포내 전달 도메인(ITD) 및 베타-갈락토시데이즈 단백질의 농도에 따른 세포내 전달을 확인하였다. 헬라 세포는 실시예 2에서와 같이 준비하였다. 베타-갈락토시데이즈 단백질과 세포내 전달 도메인은 농도를 달리하여 실시예 7에서와 같이 준비하였다. 트립신 처리와 X-gal 염색은 실시예 7에서와 같이 수행하였다.Intracellular delivery according to the concentration of the intracellular delivery domain (ITD) and beta-galactosidase protein according to the present invention was confirmed. HeLa cells were prepared as in Example 2. Beta-galactosidase protein and intracellular delivery domains were prepared as in Example 7 at different concentrations. Trypsin treatment and X-gal staining were performed as in Example 7.
도9에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 세포내 전달 도메인은 베타-갈락토시데이즈 단백질의 농도에 의존적으로 베타-갈락토시데이즈 단백질을 세포내로 전달하는 것을 확인하였다.As shown in Figure 9, the intracellular delivery domain according to the present invention was confirmed to deliver beta-galactosidase protein intracellularly depending on the concentration of beta-galactosidase protein.
실시예 11: 시간 경과에 따른 베타-갈락토시데이즈 단백질의 세포내 전달Example 11: Intracellular Delivery of Beta-galactosidase Protein Over Time
본 발명에 따른 세포내 전달 도메인에 의하여 베타-갈락토시데이즈 단백질이 시간 경과에 따라 세포내로 전달되는 것을 확인하였다. 2 μM의 베타-갈락토시데이즈 단백질을 20 μM의 본 발명의 세포내 전달 도메인과 반응시킨 후, 실시예 5에서와 같이 헬라 세포에 처리하였다. 트립신 처리와 X-gal 염색은 실시예 7에서와 같이 수행하였다.It was confirmed that the beta-galactosidase protein was delivered intracellularly over time by the intracellular delivery domain according to the present invention. 2 μM of beta-galactosidase protein was reacted with 20 μM of the intracellular delivery domain of the invention and then treated with HeLa cells as in Example 5. Trypsin treatment and X-gal staining were performed as in Example 7.
도10에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 세포내 전달 도메인은 시간이 경과함에 따라 베타-갈락토시데이즈 단백질을 세포내로 전달하는 것을 확인하였다.As shown in Figure 10, the intracellular delivery domain according to the present invention was confirmed to deliver beta-galactosidase protein intracellularly over time.
실시예 12: 물리적 컨쥬게이션이 필요하지 않은 세포 전달 도메인과 본 발명에 따른 세포내 전달 도메인의 비교Example 12 Comparison of Intracellular Delivery Domains According to the Invention with Cell Delivery Domains That Do Not Require Physical Conjugation
Pep-1과 YTA2으로 불리는 단백질 전달 도메인은 베타-갈락토시데이즈 단백질 등을 물리적 컨쥬게이션 과정 없이 세포내로 전달하는 것으로 보고되었다[Morris, M. C., et al. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat. Biotechnol. 19, 1173-1176 (2001); Myrberg, H., et al. Protein deliery by the cell-penetrating peptide YTA2. Bioconjug. Chem. 18, 170-174 (2007)]. 이들 단백질 전달 도메인과 본 발명에 따른 세포내 전달 도메인에 의하여 베타-갈락토시데이즈 단백질이 세포내로 전달되는 것을 비교하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. Protein delivery domains, called Pep-1 and YTA2, have been reported to deliver beta-galactosidase proteins and the like intracellularly without physical conjugation processes [Morris, M. C., et al. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat. Biotechnol. 19, 1173-1176 (2001); Myrberg, H., et al. Protein deliery by the cell-penetrating peptide YTA2. Bioconjug. Chem. 18, 170-174 (2007). In order to compare the intracellular delivery of beta-galactosidase proteins by these protein delivery domains and the intracellular delivery domain according to the present invention, the following experiment was performed.
헬라 세포는 실시예 2에서와 같이 준비하였다. 1 μM의 베타-갈락토시데이즈 단백질을 각각 10, 20, 40 μM의 세포내 전달 도메인(Ac-P072), Pep-1, YTA2와 30분간 반응시킨 후, DPBS로 세척한 헬라 세포에 각각의 반응액 20 ㎕를 처리하고, 80 ㎕의 OPTI MEM I을 첨가하였다. 처리된 세포를 2시간 동안 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양한 후, 실시예 7에서와 같이 트립신 처리와 X-gal 염색을 수행하였다.HeLa cells were prepared as in Example 2. 1 μM of beta-galactosidase protein was reacted with 10, 20, and 40 μM of intracellular delivery domain (Ac-P072), Pep-1, and YTA2 for 30 minutes, respectively, and then to each of the HeLa cells washed with DPBS. 20 μl of reaction solution was treated and 80 μl of OPTI MEM I was added. The treated cells were incubated for 2 hours in a 37 ° C. 5% CO 2 incubator, followed by trypsin treatment and X-gal staining as in Example 7.
도 11에 도시된 바와 같이, 트립신을 처리한 경우에 있어서는 본 발명에 따른 세포내 전달 도메인만이 베타-갈락토시데이즈 단백질을 세포내로 전달하는 것으로 확인되었다.As shown in FIG. 11, in the case of trypsin treatment, only the intracellular delivery domain according to the present invention was found to deliver beta-galactosidase protein intracellularly.
실시예 13: 배양 온도에 따른 베타-갈락토시데이즈 단백질의 세포내 전달 확인Example 13: Confirmation of intracellular delivery of beta-galactosidase protein according to culture temperature
헬라 세포는 실시예 2에서와 같이 준비하였다. 1 μM의 베타-갈락토시데이즈 단백질을 각각 20 μM의 본 발명의 세포내 전달 도메인과 상온에서 30분 간 반응시킨 후, 반응액을 전날 준비된 헬라 세포에 실시예 5에서와 같이 처리하였다. 처리된 세포를 각각 90분 동안 37℃ 5% CO2 배양기 혹은 4℃ 냉장고에서 배양한 후, 실시예 7에서와 같이 트립신 처리와 X-gal 염색을 수행하였다.HeLa cells were prepared as in Example 2. After 1 μM of beta-galactosidase protein was reacted with 20 μM of the intracellular delivery domain of the present invention for 30 minutes at room temperature, the reaction solution was then treated with HeLa cells prepared the day before as in Example 5. The treated cells were incubated in a 37 ° C. 5% CO 2 incubator or 4 ° C. refrigerator for 90 minutes each, followed by trypsin treatment and X-gal staining as in Example 7.
도12에 도시된 바와 같이, 본 발명의 세포내 전달 도메인은 배양 온도와 무관하게 베타-갈락토시데이즈를 세포내로 전달하는 것을 확인하였다. As shown in Figure 12, the intracellular delivery domain of the present invention was confirmed to deliver beta-galactosidase intracellularly regardless of the culture temperature.
실시예 14: BSA 및 FBS 첨가에 따른 베타-갈락토시데이즈 단백질의 세포내 전달 확인Example 14: Confirmation of intracellular delivery of beta-galactosidase protein upon addition of BSA and FBS
헬라 세포는 실시예 2에서와 같이 준비하였다. 세포내 전달 도메인과 베타-갈락토시데이즈 단백질 반응액은 실시예 13에서와 같이 준비하였다. 세포내 전달 도메인과 베타-갈락토시데이즈 단백질 반응액을 헬라 세포에 20 ㎕/well로 처리한 후, 다음과 같이 배지를 첨가하여 주었다: HeLa cells were prepared as in Example 2. Intracellular delivery domain and beta-galactosidase protein reaction solution were prepared as in Example 13. After intracellular delivery domain and beta-galactosidase protein reaction solution were treated with HeLa cells at 20 μl / well, medium was added as follows:
1) OPTI MEM I: OPTI MEM I을 80 ㎕/well로 첨가; 1) OPTI MEM I: Add OPTI MEM I at 80 μl / well;
2) OPTI MEM I/BSA: 각각 20, 10, 5%의 BSA(bovine serum albumin; Amresco에서 구입)가 포함된 OPTI MEM I을 80 ㎕/well로 첨가; 2) OPTI MEM I / BSA: Add 80 μl / well of OPTI MEM I containing 20, 10 and 5% BSA (bovine serum albumin; purchased from Amresco), respectively;
3) DMEM/BSA: 각각 20, 10, 5%의 BSA가 포함된 DMEM을 80 ㎕/well로 첨가;3) DMEM / BSA: Add 80 μl / well of DMEM containing 20, 10 and 5% BSA, respectively;
4) DMEM/FBS: 각각 20, 10, 5%의 FBS(fetal bovine serum; Invitrogen에서 구입)가 포함된 DMEM을 80 ㎕/well로 첨가; 4) DMEM / FBS: Add 80 μl / well of DMEM containing 20, 10, and 5% FBS (fetal bovine serum; purchased from Invitrogen), respectively;
5) DMEM/FBS/BSA: 각각 20, 10, 5%의 FBS 및 BSA가 포함된 DMEM을 80 ㎕/well로 첨가. 5) DMEM / FBS / BSA: Add 80 μl / well of DMEM with 20, 10 and 5% of FBS and BSA, respectively.
전술한 바와 같이 처리된 세포를 3~4시간 동안 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양한 후, 실시예 7에서와 같이 트립신 처리와 X-gal 염색을 수행하였다.Cells treated as described above were incubated in a 37 ° C. 5% CO 2 incubator for 3-4 hours, followed by trypsin treatment and X-gal staining as in Example 7.
도13에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 세포내 전달 도메인은 BSA 혹은 FBS가 존재하는 배지에서도 베타-갈락토시데이즈 단백질을 세포내로 전달함을 확인하였다.As shown in Figure 13, the intracellular delivery domain according to the present invention was confirmed to deliver beta-galactosidase protein intracellularly in the medium in which BSA or FBS is present.
실시예 15: 다양한 세포주에 대한 베타-갈락토시데이즈 단백질의 세포내 전달 확인Example 15 Confirmation of Intracellular Delivery of Beta-Galactosidase Proteins for Various Cell Lines
헬라, U2-OS, BJ, MDBK, Hep3B, RKO, T98G 세포(ATCC에서 구입)는 10% FBS가 함유된 DMEM에서 배양하였다. Saos-2 세포(한국세포주은행에서 구입)는 10% FBS가 함유된 RPMI1640 배지(Welgen에서 구입)에서 배양하였다. H1299 세포(한국세포주은행에서 구입)는 5% FBS가 함유된 RPMI1640 배지에서 배양하였다. 각각의 세포는 실시예 2에서와 같이 웰당 4,000~8,000개 세포(4,000~8,000 cells/well)로 준비하였다. 본 발명에 따른 세포내 전달 도메인과 베타-갈락토시데이즈 단백질 복합체의 준비와 처리는 실시예 13에서와 같이 수행하였다. 처리된 세포를 4시간 동안 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양한 후, 실시예 7에서와 같이 트립신 처리와 X-gal 염색을 수행하였다.Hela, U2-OS, BJ, MDBK, Hep3B, RKO, T98G cells (purchased from ATCC) were incubated in DMEM containing 10% FBS. Saos-2 cells (purchased from Korea Cell Line Bank) were cultured in RPMI1640 medium (purchased from Welgen) containing 10% FBS. H1299 cells (purchased from Korea Cell Line Bank) were cultured in RPMI1640 medium containing 5% FBS. Each cell was prepared at 4,000-8,000 cells (4,000-8,000 cells / well) per well as in Example 2. Preparation and treatment of the intracellular delivery domain and beta-galactosidase protein complex according to the present invention were carried out as in Example 13. The treated cells were incubated in a 37 ° C. 5% CO 2 incubator for 4 hours, followed by trypsin treatment and X-gal staining as in Example 7.
도14에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 세포내 전달 도메인은 다양한 세포주에 대하여 베타-갈락토시데이즈 단백질을 세포내로 전달하는 것을 확인하였다.As shown in FIG. 14, the intracellular delivery domain according to the present invention was confirmed to deliver beta-galactosidase protein intracellularly for various cell lines.
실시예 16: 기능성 단백질 p27의 세포내 전달에 의한 세포 생장 억제 효과Example 16: Inhibition of Cell Growth by Intracellular Delivery of Functional Protein p27
p27 단백질은 세포주기를 조절하는 단백질로서 세포내에서 과발현시키거나 정제된 단백질을 세포내로 전달할 경우 세포 생장을 억제하거나 세포 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다[Snyder, E. L., et al. Anti-cancer protein transduction strategies: reconstitution of p27 tumor suppressor function. J. Control. Release 91, 45-51 (2003)]. 본 발명에 따른 세포내 전달 도메인을 이용하여 재조합 p27 단백질을 세포내로 전달하였을 때, 세포의 생장을 억제하는 효과가 있는지 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.p27 protein is a protein that regulates the cell cycle and is known to inhibit cell growth or induce cell death when intracellularly overexpressed or purified protein is delivered intracellularly [Snyder, E. L., et al. Anti-cancer protein transduction strategies: reconstitution of p27 tumor suppressor function. J. Control. Release 91, 45-51 (2003). When the recombinant p27 protein was delivered intracellularly using the intracellular delivery domain according to the present invention, the following experiment was performed to determine whether there is an effect of inhibiting the growth of cells.
인간의 폐암 세포주인 H1299 세포(한국세포주은행에서 구입)는 5% FBS가 함유된 RPMI1640 (Welgen에서 구입) 배지에서 배양하였다. H1299 세포를 웰당 3,000개의 세포(3,000 cells/well)로 96-well μClear Black Plate (Greiner에서 구입)에 계대배양한 후 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 각각 0.5, 0.25, 0.125 μM 농도의 재조합 GST-p27 단백질(SignalChem에서 구입) 12 ㎕를 각각 10, 5, 2.5 μM 농도의 세포내 전달 도메인 Ac-P072 12 ㎕와 혼합하여 상온에서 30분간 반응시킨 후, 이중 20 ㎕를 전날 배양된 H1299 세포에 처리하였다. 음성대조구로는 세포내 전달 도메인이 포함되지 않은 GST-p27 단백질 만이 처리된 것과, GST-p27 단백질이 포함되지 않은 세포내 전달 도메인 만이 처리된 것을 사용하였다. 5% FBS가 함유된 RPMI1640 배지를 80 ㎕/well씩 첨가한 후, 37℃ 5% CO2 배양기에서 약 72 시간 동안 배양하였다. 세포 생장은 CellTiter96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit(Promega에서 구입)를 이용하여 측정하였다. 세포의 수를 환산하기 위하여, 같은 날 H1299 세포를 20,000, 10,000, 5,000, 2,500, 1,250, 625, 312, 156, 79, 39 세포/웰(cells/well)로 분주하여 표준 곡선을 그려 사용하였다.Human lung cancer cell line H1299 cells (purchased from Korea Cell Line Bank) were cultured in RPMI1640 (purchased in Welgen) medium containing 5% FBS. H1299 cells were passaged in 96-well μClear Black Plate (purchased from Greener) at 3,000 cells per well (3,000 cells / well) and then cultured in a 37 ° C. 5% CO 2 incubator. 12 μl of recombinant GST-p27 protein (purchased from SignalChem) at concentrations of 0.5, 0.25, and 0.125 μM, respectively, was mixed with 12 μl of intracellular delivery domain Ac-P072 at concentrations of 10, 5, and 2.5 μM, respectively, and reacted at room temperature for 30 minutes. Of these, 20 μl of H1299 cells were cultured the previous day. As a negative control, only the GST-p27 protein without the intracellular delivery domain was treated and only the intracellular delivery domain without the GST-p27 protein were treated. RPMI1640 medium containing 5% FBS was added at 80 μl / well, followed by incubation for about 72 hours in a 37 ° C. 5% CO 2 incubator. Cell growth was measured using CellTiter96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit (purchased from Promega). In order to convert the number of cells, H1299 cells were divided into 20,000, 10,000, 5,000, 2,500, 1,250, 625, 312, 156, 79, 39 cells / well on the same day and used as a standard curve.
도15에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 세포내 전달 도메인에 의하여 세포내로 전달된 GST-p27 단백질에 의해 H1299 세포주의 생장이 억제됨을 확인하였다.As shown in FIG. 15, it was confirmed that the growth of the H1299 cell line was inhibited by the GST-p27 protein delivered intracellularly by the intracellular delivery domain according to the present invention.
이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.Although the present invention has been described with reference to the above embodiments, the present invention is not limited thereto. Those skilled in the art can make modifications and changes without departing from the spirit and scope of the present invention, and it will be appreciated that such modifications and changes also belong to the present invention.
도1은 본 발명의 세포내 전달 도메인(ITD) P071, P072, P073 및 P074을 물리적 컨쥬게이션없이 사용하여 비오틴-SS-FITC로 형광 표지된 스트렙타비딘 단백질을 세포내로 전달하는 기능을 확인한 세포 형광 사진이다. 1 is a cell fluorescence confirming the function of intracellular delivery of streptavidin protein fluorescently labeled with biotin-SS-FITC using the intracellular delivery domains (ITD) P071, P072, P073 and P074 of the present invention without physical conjugation. It is a photograph.
도2는 본 발명의 세포내 전달 도메인(ITD) P071, P072, P073 및 P074에 의한 FITC-스트렙타비딘의 농도 의존적 세포내 전달을 확인한 세포 형광 사진이다.2 is a cell fluorescence photograph confirming concentration dependent intracellular delivery of FITC-streptavidin by the intracellular delivery domains (ITD) P071, P072, P073 and P074 of the present invention.
도3은 트립판 블루 처리 후 세포내에 전달된 FITC-스트렙타비딘의 세포 형광 사진이다.Figure 3 is a cell fluorescence picture of FITC-streptavidin delivered intracellularly after trypan blue treatment.
도4는 트립신 처리 여부에 따른 세포내 베타-갈락토시데이즈 단백질 활성을 보여주는 세포 사진이다. 사진 위 숫자는 ITD/단백질 복합체의 세포 처리 시간을 나타낸다.Figure 4 is a cell photograph showing intracellular beta-galactosidase protein activity according to trypsin treatment. The numbers above show the cell treatment time of the ITD / protein complex.
도5는 물리적 컨쥬게이션이 없는 경우에 있어서 기존의 단백질 전달 도메인 또는 본 발명의 세포내 전달 도메인에 의한 베타-갈락토시데이즈 단백질의 세포내 전달을 비교한 세포 사진이다.Figure 5 is a cell photograph comparing intracellular delivery of beta-galactosidase protein by existing protein delivery domains or intracellular delivery domains in the absence of physical conjugation.
도6은 본 발명의 다양한 세포내 전달 도메인에 의해 물리적 컨쥬게이션 없이 베타-갈라토시데이즈 단백질이 세포내로 전달되는 것을 보여주는 세포 사진이다.FIG. 6 is a cell photograph showing the delivery of beta-galactosidase protein intracellularly without physical conjugation by the various intracellular delivery domains of the present invention. FIG.
도7은 본 발명의 세포내 전달 도메인에 의하여 스트렙타비딘-Cy3 단백질이 세포내로 전달되는 것을 보여주는 세포 형광 사진이다.Figure 7 is a cell fluorescence picture showing that the intracellular delivery of streptavidin-Cy3 protein by the intracellular delivery domain of the present invention.
도8은 본 발명의 세포내 전달 도메인에 의하여 GUS 단백질이 세포내로 전달되는 것을 보여주는 세포 형광 사진이다.8 is a cell fluorescence photograph showing that GUS protein is intracellularly delivered by the intracellular delivery domain of the present invention.
도9는 본 발명의 세포내 전달 도메인 및 베타-갈락토시데이즈 단백질의 농도에 따른 세포내 전달을 보여주는 세포 사진이다.9 is a cell photograph showing intracellular delivery according to the concentration of the intracellular delivery domain and beta-galactosidase protein of the present invention.
도10은 본 발명의 세포내 전달 도메인을 처리한 경우에 있어서 시간 경과에 따른 베타-갈락토시데이즈 단백질의 세포내 전달을 보여주는 세포 사진이다.Figure 10 is a cell photograph showing intracellular delivery of beta-galactosidase protein over time when treated with the intracellular delivery domain of the present invention.
도11은 물리적 컨쥬게이션 없이 단백질을 세포내로 전달하는 것으로 알려진 단백질 전달 도메인과 본 발명에 따른 세포내 전달 도메인에 의한 베타-갈락토시데이즈 단백질의 세포내 전달을 보여주는 세포 사진이다.11 is a cell photograph showing intracellular delivery of beta-galactosidase protein by a protein delivery domain known to deliver proteins intracellularly without physical conjugation and the intracellular delivery domain according to the present invention.
도12는 본 발명의 세포내 전달 도메인을 처리한 경우에 있어서 처리 온도에 따른 베타-갈락토시데이즈 단백질의 세포내 전달을 보여주는 세포 사진이다.12 is a cell photograph showing intracellular delivery of beta-galactosidase protein according to treatment temperature when treated with the intracellular delivery domain of the present invention.
도13은 본 발명의 세포내 전달 도메인을 처리한 경우에 있어서 BSA 및 FBS의 농도에 따른 베타-갈락토시데이즈 단백질의 세포내 전달을 보여주는 세포 사진이다.Figure 13 is a cell photograph showing intracellular delivery of beta-galactosidase protein according to the concentrations of BSA and FBS when treated with the intracellular delivery domain of the present invention.
도14는 본 발명의 세포내 전달 도메인에 의해 베타-갈락토시데이즈 단백질이 다양한 세포주의 세포내로 전달되는 것을 보여주는 세포 사진이다.Figure 14 is a cell photograph showing the delivery of beta-galactosidase protein into cells of various cell lines by the intracellular delivery domain of the present invention.
도15는 본 발명의 세포내 전달 도메인에 의하여 세포내로 전달된 p27 단백질에 의한 세포생장 억제 효과를 보여주는 그래프이다.Figure 15 is a graph showing the effect of inhibiting cell growth by p27 protein delivered intracellularly by the intracellular delivery domain of the present invention.
<110> CGK CO.,LTD. <120> Method for delivering proteins into cells and peptide therefor <130> P07-0075KR <160> 23 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-P07: N-terminal biotinylated <400> 1 Cys Lys Tyr Gly Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Gly Asp 1 5 10 15 Ile Met Gly Glu Trp Gly Asn Glu Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 20 25 30 Leu Gly <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P071 <400> 2 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Met Ile Asp Gly Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 20 25 30 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P072 <400> 3 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile 1 5 10 15 Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly 20 25 30 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P073 <400> 4 Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Gly Asp Ile Met Gly Glu 1 5 10 15 Trp Gly Asn Glu Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Gly 20 25 30 <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P074 <400> 5 Gly Asp Ile Met Gly Glu Trp Gly Asn Glu Ile Phe Gly Ala Ile Ala 1 5 10 15 Gly Phe Leu Gly Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly 20 25 30 <210> 6 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0721 <400> 6 Lys Lys Lys Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala Gly Leu 1 5 10 15 Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile 20 25 30 Asp Gly <210> 7 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0722 <400> 7 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Leu Phe Gly Ala 1 5 10 15 Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly 20 25 30 <210> 8 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0723 <400> 8 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 20 25 30 Met Ile Asp Gly 35 <210> 9 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0724 <400> 9 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala 1 5 10 15 Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly 20 25 <210> 10 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0725 <400> 10 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 1 5 10 15 Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly 20 25 <210> 11 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0801 <400> 11 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Glu Thr Trp Trp Glu 1 5 10 15 Thr Trp Trp Thr Glu 20 <210> 12 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0802 <400> 12 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Thr Arg Ser Ser Arg Ala 1 5 10 15 Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu Leu Arg Lys 20 25 30 <210> 13 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0803 <400> 13 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Asp Pro Lys Gly Asp Pro 1 5 10 15 Lys Gly Val Thr Val Thr Val Thr Val Thr Val Thr Gly Lys Gly Asp 20 25 30 Pro Lys Pro Asp 35 <210> 14 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0804 <400> 14 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Leu Ala Lys Leu Ala 1 5 10 15 Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys 20 <210> 15 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0805 <400> 15 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Leu Ser Ser Ile Phe 1 5 10 15 Ser Arg Ile Gly Asp Gly 20 <210> 16 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0806 <400> 16 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Leu Ala 1 5 10 15 Tyr Leu Arg Arg Arg Trp Ala Val Leu Gly Arg 20 25 <210> 17 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0807 <400> 17 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Leu Phe Glu Ala Ile 1 5 10 15 Ala Glu Phe Ile Glu Gly Gly Trp Glu Gly Leu Ile Glu Gly 20 25 30 <210> 18 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0808 <400> 18 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Ala Ile 1 5 10 15 Ala Lys Phe Ile Lys Gly Gly Trp Lys Gly Leu Ile Lys Gly 20 25 30 <210> 19 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0809 <400> 19 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Phe Phe Gly Ala Val Ile 1 5 10 15 Gly Thr Ile Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala 20 25 <210> 20 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0810 <400> 20 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Ala Leu Phe Leu Gly 1 5 10 15 Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala 20 25 <210> 21 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0811 <400> 21 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Val Thr Val Leu Ala Leu 1 5 10 15 Gly Ala Leu Ala Gly Val Gly Val Gly 20 25 <210> 22 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0812 <400> 22 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Ala Val Leu Leu Pro 1 5 10 15 Val Leu Leu Ala Ala Pro 20 <210> 23 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0813 <400> 23 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Ala Ala Ile Gly Leu 1 5 10 15 Ala Trp Ile Pro Tyr Phe Gly Pro Ala Ala 20 25 <110> CGK CO., LTD. <120> Method for delivering proteins into cells and peptide therefor <130> P07-0075KR <160> 23 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-P07: N-terminal biotinylated <400> 1 Cys Lys Tyr Gly Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Gly Asp 1 5 10 15 Ile Met Gly Glu Trp Gly Asn Glu Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 20 25 30 Leu gly <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P071 <400> 2 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Met Ile Asp Gly Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 20 25 30 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P072 <400> 3 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile 1 5 10 15 Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly 20 25 30 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P073 <400> 4 Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Gly Asp Ile Met Gly Glu 1 5 10 15 Trp Gly Asn Glu Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Gly 20 25 30 <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P074 <400> 5 Gly Asp Ile Met Gly Glu Trp Gly Asn Glu Ile Phe Gly Ala Ile Ala 1 5 10 15 Gly Phe Leu Gly Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly 20 25 30 <210> 6 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0721 <400> 6 Lys Lys Lys Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala Gly Leu 1 5 10 15 Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile 20 25 30 Asp gly <210> 7 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0722 <400> 7 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Leu Phe Gly Ala 1 5 10 15 Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly 20 25 30 <210> 8 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0723 <400> 8 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 20 25 30 Met Ile Asp Gly 35 <210> 9 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0724 <400> 9 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala 1 5 10 15 Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly 20 25 <210> 10 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0725 <400> 10 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 1 5 10 15 Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly 20 25 <210> 11 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0801 <400> 11 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Glu Thr Trp Trp Glu 1 5 10 15 Thr Trp Trp Thr Glu 20 <210> 12 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0802 <400> 12 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Thr Arg Ser Ser Arg Ala 1 5 10 15 Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu Leu Arg Lys 20 25 30 <210> 13 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0803 <400> 13 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Asp Pro Lys Gly Asp Pro 1 5 10 15 Lys Gly Val Thr Val Thr Val Thr Val Thr Val Thr Gly Lys Gly Asp 20 25 30 Pro Lys Pro Asp 35 <210> 14 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0804 <400> 14 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Leu Ala Lys Leu Ala 1 5 10 15 Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys 20 <210> 15 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0805 <400> 15 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Leu Ser Ser Ile Phe 1 5 10 15 Ser Arg Ile Gly Asp Gly 20 <210> 16 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0806 <400> 16 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Leu Ala 1 5 10 15 Tyr Leu Arg Arg Arg Trp Ala Val Leu Gly Arg 20 25 <210> 17 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0807 <400> 17 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Leu Phe Glu Ala Ile 1 5 10 15 Ala Glu Phe Ile Glu Gly Gly Trp Glu Gly Leu Ile Glu Gly 20 25 30 <210> 18 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0808 <400> 18 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Ala Ile 1 5 10 15 Ala Lys Phe Ile Lys Gly Gly Trp Lys Gly Leu Ile Lys Gly 20 25 30 <210> 19 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0809 <400> 19 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Phe Phe Gly Ala Val Ile 1 5 10 15 Gly Thr Ile Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala 20 25 <210> 20 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0810 <400> 20 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Ala Leu Phe Leu Gly 1 5 10 15 Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala 20 25 <210> 21 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0811 <400> 21 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Val Thr Val Leu Ala Leu 1 5 10 15 Gly Ala Leu Ala Gly Val Gly Val Gly 20 25 <210> 22 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0812 <400> 22 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Ala Val Leu Leu Pro 1 5 10 15 Val Leu Leu Ala Ala Pro 20 <210> 23 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0813 <400> 23 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Ala Ala Ile Gly Leu 1 5 10 15 Ala Trp Ile Pro Tyr Phe Gly Pro Ala Ala 20 25
Claims (21)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020080048727A KR20090122769A (en) | 2008-05-26 | 2008-05-26 | Method for delivering proteins into cells and peptide therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020080048727A KR20090122769A (en) | 2008-05-26 | 2008-05-26 | Method for delivering proteins into cells and peptide therefor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20090122769A true KR20090122769A (en) | 2009-12-01 |
Family
ID=41685209
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020080048727A KR20090122769A (en) | 2008-05-26 | 2008-05-26 | Method for delivering proteins into cells and peptide therefor |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20090122769A (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018088734A3 (en) * | 2016-11-10 | 2018-08-09 | 주식회사 바이오셀트란 | Globular structure containing novel protein transduction domain |
| KR20200126069A (en) * | 2019-04-29 | 2020-11-06 | 주식회사 바이오셀트란 | Composition for anti-wrinkle with high skin or cell penetration capacity |
| WO2022025319A1 (en) * | 2020-07-30 | 2022-02-03 | 주식회사 바이오셀트란 | Soluble microneedle patch containing skin-permeable recombinant neuropeptide complex |
-
2008
- 2008-05-26 KR KR1020080048727A patent/KR20090122769A/en not_active Application Discontinuation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018088734A3 (en) * | 2016-11-10 | 2018-08-09 | 주식회사 바이오셀트란 | Globular structure containing novel protein transduction domain |
| KR20200126069A (en) * | 2019-04-29 | 2020-11-06 | 주식회사 바이오셀트란 | Composition for anti-wrinkle with high skin or cell penetration capacity |
| WO2022025319A1 (en) * | 2020-07-30 | 2022-02-03 | 주식회사 바이오셀트란 | Soluble microneedle patch containing skin-permeable recombinant neuropeptide complex |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2377660T3 (en) | New peptide that penetrates cells | |
| US9907857B2 (en) | Peptide having cell membrane penetrating activity | |
| Derossi et al. | The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. | |
| KR100608558B1 (en) | Cytoplasmic Transduction Peptides and Uses thereof | |
| US8207293B2 (en) | Peptides derived from maurocalcine used as vectors for intracellular addressing of molecules of interest | |
| KR101258279B1 (en) | Development of the macromolecule transduction domain with improved cell permeability and its applications | |
| US9694087B2 (en) | Development of novel macromolecule transduction domain with improved cell permeability and method for using same | |
| WO2014046481A1 (en) | Cell penetrating peptide, conjugate comprising same, and composition comprising conjugate | |
| CN106255699B (en) | Cell penetrating peptides and methods of using the same to deliver biologically active substances | |
| KR101695792B1 (en) | Novel cell membrane penetrating peptides and uses thereof | |
| US20230048338A1 (en) | Novel cellular delivery methods | |
| KR20090122769A (en) | Method for delivering proteins into cells and peptide therefor | |
| Buyanova et al. | Discovery of a cyclic cell-penetrating peptide with improved endosomal escape and cytosolic delivery efficiency | |
| Doh | Validation of heterodimeric TAT-NLS peptide as a gene delivery enhancer | |
| KR20140046994A (en) | Cell penetrating peptide comprising np2 polypeptide or dnp2 polypeptide derived from human nlbp and cargo delivery system using the same | |
| Takyo et al. | Oligoarginine-conjugated peptide foldamers inhibiting vitamin D receptor-mediated transcription | |
| JP2024045244A (en) | Breast cancer therapeutic drug containing PHB2-derived peptide that inhibits BIG3-PHB2 interaction | |
| KR20210017183A (en) | Polypeptide for targeting mitochondria and uses thereof | |
| Todorova | Methods of protein delivery into mammalian cells for gene therapy and genetic studies | |
| Beerens | Intercellular spread of the transgene product to improve the efficiency of cancer gene therapy | |
| KR20140046995A (en) | Cell penetrating peptide comprising np1 polypeptide derived from human nlbp protein and cargo delivery system using the same | |
| KR20010001214A (en) | Peptides that control intracellular signal transduction and Pharmaceutical compositions thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application |