KR20090119023A - Ａｉａ와 상호작용하는 애기장대 유래의 ａｇｂ 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 AIA와 상호작용하는 애기장대 유래의 AGB에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, AIA(ABA(abscisic acid) inducible AP2/ERF transcription factor)와 상호작용하는 애기장대 유래의 AGB(Arabidopsis G protein β subunit) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물체; 상기 식물체의 종자; 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, AIA(ABA(abscisic acid) inducible AP2/ERF transcription factor)와 상호작용을 하는 애기장대 유래의 AGB(Arabidopsis G protein β subunit) 단백질; 상기 AGB 단백질을 코딩하는 유전자; 상기 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터; 상기 유전자를 식물체에서 과발현시켜 식물체의 앱시스산에 대한 과민 반응을 갖게 하는 방법에 관한 것이다.

AIA, AGB, GTP 결합 단백질 β 서브유닛, 앱시스산, 만니톨

Description

ＡＩＡ와 상호작용하는 애기장대 유래의 ＡＧＢ 단백질{AGB protein interacting with AIA originated from Arabidopsis thaliana}

본 발명은 AIA와 상호작용하는 애기장대 유래의 AGB 단백질에 관한 것이다.

ABA 신호 경로에서 AIA (ABA inducible AP2/ERF transcription factor)는 양성적 기능(positive function)을 수행한다. ABI4는 ABA 신호 경로의 AP2/ERF 양성 조절자로서 알려져 있다(Finkelstein et. al.,(1988) Plant Cell 10: 1043-1054.). AIA의 과발현은 ABA 조건에서 발아를 저지시키고, 뿌리의 성장을 저해한다. 이들의 표현형은 ABI4의 경우에서 보여진다. 또한, AIA의 과발현은 가뭄 스트레스에 저항을 나타내므로, AIA는 ABA 및 가뭄 스트레스 신호와 연관이 있는 것으로 추측된다.

이종삼량체 GTP(heterotrimeric GTP) 결합 단백질은 주로 포유동물에서 연구된 바 있다. 이종삼량체 GTP 단백질 복합체는 G_α, G_β 및 G_γ 단위체로 구성되어 있다. G_α 단위체는 구아니딘 뉴클레오티드와 결합하고 GTPase 활성을 갖고 있다고 알려져 있다. G_βγ이량체는 G_β와 G_γ으로 구성되어 작용한다. 전형적으로, 이종삼량체 G 단백질 복합체는 7-막투과 수용체(7-transmembrane receptor)와 상호작용한다. 이러한 수용체는 GPCR (G protein-coupled receptor)로서 알려져 있다. GPCR은 세포밖 신호를 인지하는 기능이 있다. 세포밖 신호로서 활동하는 리간드의 종류는 다양하다. 예를 들어, 시각 신호인 로돕신(rhodopsin)과 성호르몬인 에스트로겐이 잘 알려져 있다. 신호들이 GPCR에 특이적으로 결합할 때, GPCR의 형태는 변할 수도 있다. GPCR의 형태 변화는 G_α의 GTPase 활성 변화를 야기한다. 따라서, 이종삼량체 G 단백질 복합체는 G_α 및 G_βγ으로 해체되고, 이 G_α 및 G_βγ은 작동기들(effectors)과 상호작용한다. 다운스트림 작동기는 다양하게 알려져 있고, 아데닐레이트 사이클라제, cGMP 포스포디에스터라제 포스포리파제 C_β, 포스포리파제 A2 및 포타슘 채널을 포함한다. 포유동물에서 23 G_{α ,} 6 G_β 및 12 G_γ 서브유닛이 동정되었다. G_β는 WD-40 반복 서열(WD-40 repeats)을 컨센서스 도메인(concensus domains)으로 갖는다. 일반적으로 WD-40 반복은 약 40개의 짧은 아미노산 모티브로, 종종 Trp-Asp (W-D) 디펩티드말단을 갖는다. 전형적인 G_β은 7개의 WD-40 반복을 갖고 있다. 각 WD-40 반복은 4개의 β-쉬트를 이룬다. 알려진 G_β의 3차 구조에서, 7개의 WD-40 반복은 7개의 날이 있는 β 프로펠러 구조(7-bladed βpropeller structure)를 형성한다. G 단백질이 포유동물에서 널리 발견되어 온 반면, 식물에서는 매우 드물게 존재한다. 포유동물의 알려진 G-단백질과 식물의 원형의 G-단백질의 서열 동일성(sequence identity)이 낮은 것으로 나타나기 때문에, 식물에서는 아직 입증되지 않았다. 그러나, 옥신, ABA, 지베렐린, 병원균, 산화적 스트레스, 청광 및 적광과 같은 다양 한 신호들에 의한 신호 변환 유도(signal transduction)에서의 약리학적 실험에 기초한 증거들은 이종삼량체 G-단백질의 기능을 추측할 수 있게 한다(Zaina et. al., (1994) J. Plant Physiol. 143: 293-297). 최근에, 앱시스산 (Wang et. al., (2001) Science 292: 2070-2072) 및 브라시노스테로이드 (Ullah et. al., (2002) Plant Physiol. 129: 897-907)는 신호 변환 유도에서 이종삼량체 G-단백질을 이용한다는 유전학적 사실이 밝혀졌다. 애기장대 게놈은 단지 하나의 기준이 되는 G_α 유전자인 GPA1를 포함하고, 또한 포유동물의 G_β 단위체와 약 42%의 유사성을 갖는, 하나의 기준이 되는 G_β 유전자인 AGB1을 포함한다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명은 ABA 신호에서 AIA의 위치와 기능을 밝히기 위해, 효모 이중 하이브리드 분석(yeast two-hybrid screening)을 이용하여 GTP 단백질 β서브유닛으로 추정되는 AGB를 스크리닝하였다. 본 발명은 AGB와 AIA의 결핍 돌연변이체 각각의 표현형을 관찰한 결과, AGB와 AIA은 서로 기능을 공유하는 사실을 밝혀내었고, 이를 통하여 본 발명은 ABA 신호 경로에서 AGB와 AIA는 상호작용한다는 정보를 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, AIA(ABA(abscisic acid) inducible AP2/ERF transcription factor)와 상호작용하는 애기장대 유래의 AGB(Arabidopsis G protein β subunit) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 식물체의 종자를 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, AIA(ABA(abscisic acid) inducible AP2/ERF transcription factor)와 상호작용을 하는 애기장대 유래의 AGB(Arabidopsis G protein β subunit) 단백질을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 AGB 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자를 식물체에서 과발현시켜 식물체의 앱시스산에 대한 과민 반응을 갖게 하는 방법을 제공한다.

본 발명은 ABA 신호 경로에서 AGB가 AIA와 상호작용하는 GTP 단백질 β서브유닛으로 기능할 수 있다는 것을 보여준다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, AIA(ABA(abscisic acid) inducible AP2/ERF transcription factor)와 상호작용하는 애기장대 유래의 AGB(Arabidopsis G protein β subunit) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 상기 식물체는 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 쌍자엽 식물일 수 있으나, 바람직하게는 애기장대이다.

본 발명은 상기 식물체의 종자를 제공한다.

본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, AIA(ABA(abscisic acid) inducible AP2/ERF transcription factor)와 상호작용을 하는 애기장대 유래의 AGB(Arabidopsis G protein β subunit) 단백질을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 상기 AGB 단백질은 6개의 WD-40 도메인을 갖고, N 말단에는 헬릭스(helix) 구조가 없는 GTP 결합 단백질 β 서브유닛(GTP binding protein β subunit) 구조인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 AGB 단백질의 범위는 애기장대로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 ABA 신호 경로에서 AIA와 상호작용하는 활성을 의미한다.

본 발명은 상기 AGB 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명은 AIA(ABA(abscisic acid) inducible AP2/ERF transcription factor)와 상호작용하는 애기장대 유래의 AGB(Arabidopsis G protein β subunit) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다. 상기 AGB 단백질 코딩 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 상기 벡터는 도 6의 35S::AGB-His, 도 6의 35S::AGB, 도 10의 pAGB-GUS 및 도 13의 pAGB-MBP로 이루어진 군에서 선택되는 것을 것을 특징으로 한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사 용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해 당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

상기 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명은 상기 재조합 식물 발현벡터를 식물체에 도입하여 AGB 단백질 코딩 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체의 앱시스산에 대한 과민 반응을 갖게 하는 방법을 제공한다. 발현 벡터를 식물체에 도입하는 방법은 전술한 바와 같다. 앱시스산은 식물이 한발과 같은 불리한 생육환경조건에서 적응하는데 필요하다. 따라서 앱시스산에 대한 과민 반응 유도로 식물의 한발에 대한 저항성 증진 효과가 기대된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 실험방법

1. 박테리아 균주, 벡터와 배양 배지

박테리아 균주인 대장균 DH10B [F^- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG λ^-]는 일반적인 분자 클로닝에 사용되었고, 대장균 BL21(DE3) [FompT hsdS_B(r_B m_B) gal dcm(DE3)]은 말토스 결합 단백질에 결합된 AGB 단백질 발현에 사용되었다. 아그로박테리움 튜머파시엔스 균주 CS58C1은 애기장대의 형질전환에 사용되었다. 플 라스미드 pET-30a(+) 벡터 (Novagen, USA), pMAL-c2x 벡터 (New England BioLab, UK) 및 pGEX-5X-1 벡터(GE Healthcare)는 대장균에서 유전자의 발현에 사용되었다. 바이너리 벡터 pCAMBIA 1301 (CAMBIA)은 AGB 유전자의 클로닝과 형질전환에 사용되었다. Luria-Bertani (LB) 배지 (1 % 트립톤, 0.5 % 효모 추출물 및 1 % NaCl)는 대장균 균주의 배양에 사용되었다. 형질전환된 아그로박테리움은 리팜피신 (100 ㎍/㎖), 젠타마이신 (50 ㎍/㎖) 및 카나마이신 (50 ㎍/㎖)을 포함하는 YEP 배지(1 % 박토 펩톤, 1 % 효모 추출물 및 0.5 % NaCl)에서 3일동안, 28 ℃에서 배양하였다.

2. 식물체

멸균된 애기장대(Arabidopsis thaliana) 종자 (콜럼비아 생태형)는 1 % 슈크로스, 0.05 % MES-KOH (pH 5.6) 및 0.7 % 피토아가 (발아 및 화학물질 처리를 위해 사용됨) 또는 1 % 피토아가 (뿌리 신장 분석을 위해 사용됨)을 첨가한 0.5 X MS 배지에서 발아시켰다. 암조건인 4 ℃에서 4일 동안 습적(stratification)시킨 후, 식물체는 23 ℃, 장일 조건(16 시간 명 / 8 시간 암 주기)에서 배양하였다. AGB 돌연변이 종자(SALK_034787)는 오하이오 주립대학의 Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC)에서 제공받았다(Alonso et. al., (2003) Science 301: 653-657). T-DNA는 SALK_034787에서 At2g34260의 13번째 인트론으로 삽입시켰다(도 1). 35S::AGB 형질전환 식물체는 바이너리 벡터인 pCAMBIA1301 (CAMBIA)의 일치하는 위치(NcoII와 BstEIII)에 AGB 코딩 영역을 연결시켰다. 이러한 재조합 구조물은 아그로박테리움 튜머파시엔스 CS58C1에 전기천공법으로 도입시킨 다음 애기장대 식물체(Col-0)에 형질도입시켰다.

3. 효소, 화학물질 및 키트

제한 효소인 T4 DNA 리가제와 아가로스는 프로메가(매디슨, 미국)에서 구입하였다. pfu-Turbo DNA 중합체는 스트라타진(미국)에서 구입하였다. SuperScript^TM III RNase H^- 역전사효소는 인비트로진에서 구입하였다. Top-Taq 중합체와 dNTP 혼합물을 코아-바이오 시스템(서울, 한국)에서 구입하였다. MS 배지(Murashige and Skoog medium)와 LB 배지를 제조하기 위한 시약은 듀쉐파(Duchefa)에서 구입하였다. 항생제와 ABA(abscisic acid)은 시그마 알드리치에서 구입하였고, 만니톨은 듀쉐파에서 구입하였다. Redivue [α-³²P] dCTP 수성 용액은 아머샴 바이오사이언스(Amersham Bioscienses)에서 구입하였다. RNeasy 식물 미니 키트와 원-스텝 RT-PCR(one-step RT-PCR) 키트는 큐아젠(발렌시아, 미국)에서 구입하였다. X-gluc(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid)은 GUS 분석을 위해 bioPLUS^TM에서 구입하였다. 단백질 농도를 결정하기 위한 단백질 분석 키트는 바이오-라드(헤라클레스, 미국)에서 구입하였다. RNA 젤 블럿 분석을 위한 양성 전기를 띤 나일론 전이 막은 아머샴 바이오사이언스(Amersham Bioscienses)에서 구입하였다. ECL^TM 단백질-젤 블럿 분석 시스템은 아머샴 바이오사이언스(Amersham Bioscienses)에서 구입하였다. 항-MBP 모노클로날 항체와 아밀로스 레진은 뉴 잉글랜드 바이오랩(New England Biolab, UK)에서 구입하였다. 면역침강 키트 (protein G)는 로쉐 디아그노스틱스 코퍼레이션(Roche Diagnostics Corporation, 만하임, 독일)에서 구입하였 다. 재조합 DNA 구조물, PCR 및 RT-PCR을 위한 모든 올리고뉴클레오티드는 바이오니어에서 합성하였다 (청원, 한국).

4. AIA 와 추정의 AGB 유전자의 클로닝

총 RNA는 2주동안 자란 애기장대 식물체로부터 분리하였다. RNA 분리는 RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)을 이용하여 수행하였다. AIA(At1g53910) 및 추정의 AGB(At2g34260)의 cDNA는 두 단계의 RT-PCR로 증폭하였다. 첫 번째 가닥의 cDNA는 SuperScript^TMIII RNase H^- 역전사 효소 (Invitrogen)를 이용하여 합성하였다. 1 ㎍의 총 RNA, 2 pmole 역방향 프라이머 (AIA의 jinw-ara 프라이머(서열번호 3) 및 AGB의 At2g34260-TGA 프라이머(서열번호 6)) 및 10 nmol의 각각의 dNTPs를 첨가하여 최종 부피가 13 ㎕가 되게 하였고, 이 혼합물은 65℃에서 5분동안 반응시킨 다음 1분 동안 얼음에서 냉각시켰다.

앞선 혼합물에 4 ㎕의 5X 첫 번째-가닥 버퍼(5X first-strand buffer), 1 ㎕의 0.1 M DTT, 1 ㎕의 RNase 저해제 및 20 유닛(units)의 역전사 효소를 첨가하였고, 50℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 역전사 효소 반응은 72℃에서 15분 동안 가열하여 불활성화시켰다. PCR 반응은 1 ㎕의 첫 번째 가닥 반응물, 20 pmole의 각각의 프라이머 (AIA : jinw-ara(서열번호 3) 및 ap3-ara(서열번호 4) ; AGB : At2g34260-ATG-long(서열번호 5) 및 At2g34260-TGA-long(서열번호 6)), 2.5 nmol dNTPs 및 1유닛의 pfu-Turbo DNA 중합효소(Stratagene)을 첨가한 최종 부피 20 ㎕로 수행하였다. PCR 증폭은 95℃에서 2분 동안 초기 변성과정을 거친 후, 다음 조 건으로 수행하였다[94℃:30초, 52℃:30초, 72℃:80초, 35회 수행].

5. 35S:: AGB 재조합 플라스미드 제조

삽입 DNA는 AGB로 추정되는 cDNA를 주형으로 다음의 두 개의 프라이머로 합성하였다. 프라이머 1: 5’-AGG TGA CCC TAT AAG TCT GCA AAG AAA TTA -3’(서열번호 7) 및 프라이머 2: 5’- ATA CCA TGG AGA TCG ATT TGG GA -3’(서열번호 8). PCR 산물은 NcoI와 BstEII로 절단하였고, NcoI와 BstEII로 자른 pCAMBIA1301 벡터에 재조합하였다.

6. 전기천공법에 의한 대장균의 형질전환

우선, 전기천공 대장균(E. coli) 숙주세포는 절차에 따라 준비하였다. 밤새 배양한 500 ㎕의 대장균을 500 ㎖ LB 액체 배지에 2차 배양(subculture)하였다. 37℃에서 대략 OD₆₀₀가 0.4~0.6가 되도록 배양한 뒤 20분 동안 얼음에서 냉각시켰다. 배양물은 미리 냉각시킨 500 ㎖의 원심분리 병에 담아서 4,000 g, 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 얼음 냉각한 50 ㎖의 10 % 글리세롤을 펠렛에 첨가하여 현탁시켰다. 펠렛은 얼음에서 앞뒤로 교반하여 완전하게 현탁시켰다. 세포를 완전히 현탁시킨 후, 미리 얼음 냉각해 둔 다른 50 ㎖의 10 % 글리세롤을 첨가하였다. 병은 상기와 같은 조건에서 원심분리하였다. 현탁 및 원심분리는 두 번을 반복하였다. 마지막으로, DH10B 세포는 얼음 냉각한 700 ㎕의 10 % 글리세롤로 섞었다. 세포는 50 ㎕로 분주하여 액체 질소에서 냉각시킨 다음 -70℃에서 저장하였다. 50 ㎕의 숙주세포는 라이겐이션 산물과 섞었다. 세포와 DNA 혼합물은 1mm 겝(gap) 전기천공 큐 벳에 넣은 다음, 혼합물은 대장균 펄스(E. coli pulser, Bio-Rad, 헤라클레스, 미국)를 이용하여 1.8 kV로 4초 동안 전기충격을 가하였다. 37℃에서 1h 동안 SOC 배지에서 배양한 후, 적절한 항생제를 포함하는 LB 아가 배지에서 도말하였다(p35S::AGB : 카나마이신, pAIA-GST : 암피실린).

7. 아그로박테리움을 이용한 애기장대의 형질전환

배양한 단일 콜로니를 리팜피신(rifampicin), 젠타마이신(gentamycin) 및 카나마이신(kanamycin)을 포함하는 5 ㎖ YEP 배지에 접종하여 28℃에서 밤새 현탁 배양하였다. 항생제를 포함하는 500 ㎖ YEP 배지에 2차 배양한 1㎖의 배양물을 넣고 OD₆₀₀가 2.0 이상이 되도록 배양하였다. 배양물은 원심분리한 후, 500 ㎖의 감염배지 (0.22 % MS 염, 5 % 슈크로스, 0.05 % MES, 0.044 μM BA 및 200 ㎕ Silwet L-77 ; pH 5.7)에 현탁시킨다. 5~15 cm에 해당하는 줄기를 갖는 4~6주 동안 자란 애기장대를 식물 재료로 사용하였다. 감염 배지에 잠기도록 식물화분을 거꾸로 하고 다음의 단계를 3회 실시하였다. 식물 화분을 10초간 침지시키고, 10초간 감염 배지로부터 분리시켰다. 화분의 물기를 간단히 제거한 후, 습도를 유지시키기 위해 플라스틱 덥개로 트레이를 덮어 배양기에서 배양하였다.

8. 동형접합 돌연변이체를 선별하기 위한 염색체 DNA 분리 및 PCR

3주 자란 로제트 잎을 모아서 액체 질소를 넣고 막자사발로 갈아서 분말화하였다. 400 ㎕의 DNA 추출 버퍼 (0.2 M Tris-HCl; pH 9.0, 0.4 M LiCl, 25 mM EDTA 및 1 % SDS)를 첨가하고, 56℃에서 10 분 동안 반응시켰다. 그런 다음, 14000rpm에 서 5분동안 원심분리하였다. 상층액은 새로운 튜브로 옮긴 후, 350 ㎕ 이소프로판올을 넣고 섞었다. 혼합물은 4 ℃, 13,000 rpm에서 15분 동안 원심분리한 뒤 상층액은 제거하고, DNA 펠렛은 200 ㎕의 TE 버퍼를 넣고 현탁시켰다. 동형접합자를 선별하기 위해 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 3 ㎕ 염색체 DNA, 15 pmole의 각각의 프라이머 (At2g34260 : SALK_034787-LP(서열번호 9) 및 RP(서열번호 10)), 15 pmole 의 LB_6313R 프라이머(서열번호11), 2.5 nmole 의 각 dNTPs 및 0.5 유닛 Top-taq 중합효소를 포함하는 20 ㎕ 반응물로 수행하였다. PCR 반응은 95 ℃에서 5분 동안 초기 변성반응을 수행한 후 다음과 같은 조건에서 수행하였다[94 ℃:30초, 55℃:30초, 72 ℃:1분, 30회 수행].

9. 식물호르몬( Phytohormone )과 스트레스 처리

화학물질을 처리하기 전에, 애기장대 종자는 1% 슈크로스, 0.05% MES-KOH (pH 5.6) 및 0.7% 피토아가가 첨가된 0.5X MS 배지에서 발아시켰다. 4 ℃에서 4일 동안 암조건으로 키운 후, 식물은 23 ℃에서 장일 조건(16 시간 명 / 8 시간 암)으로 키웠다. 화학물질 처리는 2주 동안 키운 식물체에 100 μM MeJA, 100 μM ABA, 400 mM 만니톨, 200 mM NaCl, 1 mM 에틸렌 및 2 mM SA을 각각 분사하여 처리하였다. 화학물질 처리 후 식물은 6시간 동안 키웠다.

10. RT - PCR 및 RNA 젤- 블럿 분석

RT-PCR은 동형접합 돌연변이체에서 AGB로 추정되는 유전자를 넉아웃시킨 것을 확인하기 위하여 수행하였고, 다양한 조건에서 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해 수행하였다. 총 RNA는 2주 자란 식물체로부터 RNeasy Plant Mini kit (QIAGEN)을 이용하여 분리하였다. 700 ng의 총 RNA에 4 ㎕ 5X QIAGEN OneStep RT-PCR 버퍼, 10 ml의 각각의 dNTPs, 0.6 μM 유전자 특이적 프라이머(At2g34260-ATG-long, 서열번호 5), 0.12 μM의 각각의 β-Tubulin 프라이머(서열번호12, 13), 4.8 유닛의 RNase 저해제, 1 ㎕ RT-PCR 효소 혼합물 및 증류수를 첨가시켜 최종 부피 20 ㎕로 만들었다. RT-PCR은 초기 역전사 반응을 50℃에서 30분 동안 수행한 뒤, 일반적인 PCR 조건으로 PCR 반응을 수행하였다. RNA 젤-블럿 분석을 위해, 10 ㎍의 총 RNA는 RNA 로딩 버퍼 [50 % 포름아마이드, 1X MOPS, 16 % 포름알데히드]와 섞었고, 65℃에서 5분 동안 반응시켰다. 1.1 % (v/v) 포름알데히드/아가로스 젤에서 전기영동으로 분리하고 나일론 막에 블럿팅하였다. 혼성화는 [α-³²P] dCTP로 라벨링한 추정의 AGB 유전자 프로브로 수행하였다.

11. 뿌리 신장 분석

멸균한 종자는 MS 배지 (0.5X MS, 1% 슈크로스, 0.05% MES-KOH (pH 5.6) 및 1% 피토아가)가 담긴 네모 모양의 플레이트에서 발아시켰고, 암조건에서 4일 동안 개화결실을 촉진시켰다(vernalized). 식물체는 수직으로 세워, 23℃에서 16 시간 명/ 8시간 암 조건으로 10일 동안 키웠다.

12. 조직화학적인 GUS 분석

AGB의 프로모터 영역을 증폭하기 위해, PCR은 다음의 프라이머로 수행하였다: 정방향 프라이머 (5’-GCGGATCCACAGCTCCAGC AAGGTAAT -3’, 서열번호 14): 밑줄은 BamHI 제한효소 자리), 역방향 프라이머 (5’-CATGCCATGGGCGCCGAATTGAGACTT -3, 서열번호 15) : 밑줄은 NcoI 제한효소 자리). BamHI 및 NcoI 제한 효소로 절단한 뒤에 1850 bp PCR 절편은 GUS 발현 벡터 pCAMBIA1391Z로 삽입시켰다. 애기장대 형질전환은 앞선 Clough and Bent (1998)(Steven J. Clough and Andrew F, Bent (1998) The plant Journal 16(6), 735-743)의 방법으로 수행하였고, 조직화학적인 GUS 분석은 Hermerly et al (Hemerly AS, Ferreira P, Engler JA, Montagu MV, Engler G and Inze D (1993) Plant Cell 5 1711-1723)의 방법으로 수행하였다. 여러 발달 단계의 AGB 프로모터::GUS 형질전환 식물체 (T2)는 90 % 아세톤에서 15분 동안 고정시켰고, 0.1 M 소듐 포스페이트 버퍼(pH 7.0)로 3번 헹구었다. 그런 다음, X-gluc 버퍼 [0.1M 소듐 포스페이트 버퍼, pH 7.0, 0.05 % (w/v) 5-브로모-4-클로로-3-인돌-β-글루쿠론산(X-gluc), 0.1 % 트리톤 X-100, 0.5mM K₃(Fe[CN]₆), 0.5 mM K₄(Fe[CN]₆), 10mM EDTA]로 37 ℃에서 6시간 동안 암조건에서 반응시켰다. 엽록체는 70 % 에탄올 세정에 의해 제거되었다.

<실시예 1: 효모 2중 하이브리드 분석(Yeast two-hybrid assay)를 이용한 AIA-상호작용 단백질의 선별

선행 연구자들은 AIA (ABA Inducible AP2/ERF transcription factor)가 ABA 신호 경로에서 기능을 하는 것으로 밝혀내었다. 그러나, ABA 신호에서 AIA의 세부적인 기능은 아직 명확하지 않다. AIA의 역할을 밝히기 위해, 우선 AIA-상호작용 단백질을 밝혔다. AIA-상호작용 단백질은 효모 2중 하이브리드 분석으로 선별하였 다. AIA cDNA 및 400,000 cDNA 클론은 GAL4 DNA-결합 부위 및 전사-활성 부위와 연결시켰다. 두 개의 재조합체로 효모를 공동 형질전환 시켰고, 최소배지(His- 및 Leu-)에서 배양한 후 60개의 블루 콜로니로 시퀀스 분석을 수행하였다(도 2). 이것들 중 6개는 애기장대 G 단백질 β 서브유닛(At2g34260)으로 추정되었고, 13개는 발현 단백질로 밝혀졌다.

<실시예 2: 유전자 구조와 단백질 형태>

TIGR (The Institute for Genomic Research)의 데이터베이스를 검색한 결과, AGB는 14개의 액손을 갖고 있는 것으로 밝혀졌다(도 1). InterProScan 시퀀스 서치를 이용하여, AGB는 6개의 WD-40 반복 서열을 갖고 있고, 하나의 YD-40 부위가 있는 것으로 밝혀졌다(도 3A). 첫 번째 WD-40 부위는 다른 WD-40 부위보다 더 짧다. AGB의 3차 구조는 SWISS-MODEL 서버에서 자동 모델링을 이용하여 예상하였다(도 3B). 예상되는 AGB의 영역은 WD-40 반복 서열을 포함하는 영역이다. 전형적인 G 단백질 β 서브유닛은 7개의 프로펠러 구조와 N-말단 헬릭스 구조를 갖고 있다. 반면에, 예상되는 AGB 구조는 6개의 프로펠러 구조를 갖고 있고, N-말단 헬릭스 구조는 없다. 그리고, AGB의 C-말단은 알려진 기능적 도메인과 상동성(homology)이 없다.

<실시예 3: WD-40 반복 서열 정렬>

WD-40 반복 서열을 포함하는 AGB 시퀀스는 AGB1(Arabidopsis G protein β subunit 1)와 지브라 피쉬(zebra fish)의 G 단백질 β 서브유닛과 비교하였고, 이것은 AGB의 3차 구조를 예상할 때 주형 구조로 이용되었다. 다중의 시퀀스 정렬은 CLUSTALW로 수행하였다(도 4). AGB와 AGB1의 시퀀스 상동성(homology)은 22.9 %이 고, AGB와 지브라 피쉬의 G 단백질 β 서브유닛의 상동성은 27.6%이다. 그러나, AGB와 AGB1의 유사성(similarity)은 63.3 % 이고, AGB와 지브라 피쉬의 G 단백질 β 단위체의 유사성은 54.8 %이다.

<실시예 4: agb T-DNA가 삽입된 돌연변이체의 동정>

SALK_034787, At2g34260의 T-DNA 삽입 돌연변이체는 ABRC (Arabidopsis Biological Resource Center)로부터 받았다. 돌연변이체의 염색체 DNA에서 T-DNA 삽입 위치는 도 1에 나타내었다. 동형 접합 돌연변이체 식물(Homozygous mutant lines)은 위치-특이적인 유전자형 스크리닝(site-specific genotypic screening)으로 선별하였다(도 5A). AGB의 넉아웃은 RT-PCR로 확인하였다(도 5B).

<실시예 5: AGB -과발현 식물체>

AGB의 cDNA는 pCAMBIA 1301과 결합시켰다(도 6A). 재조합 DNA는 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법으로 야생형 애기장대를 형질전환시켰다. AGB의 과발현은 노던 블럿 분석으로 확인하였다(도 6B).

<실시예 6: 전사 수준에서 AGB 발현 패턴>

AGB와 연관된 신호를 알아보기 위해, 몇 가지의 화학물질을 2주동안 자란 야생형 식물체에 처리하였다. 전사 수준은 RT-PCR로 측정하였다. ABA와 만니톨 처리 후에 AGB 전사 수준은 증가하는 반면 에틸렌, NaCl 및 SA의 처리 후에는 AGB 전사 수준은 감소하였다(도 7A). ABA와 만니톨의 처리 후에, 시간에 따른 전사체 발현 수준을 노던 블럿 분석으로 분석하였다. AGB 전사체는 ABA와 만니톨 처리 후 6시간째에 유도되었다(도 7B).

종자 및 발아 단계에서 AGB 발현양을 RT-PCR로 측정하였다. 습적(stratification) 후 이틀째에, 전사체 수준은 감소하였다(도 8). 이것은 AGB는 발아 단계와 연관이 있다는 것을 추측할 수 있게 하나, AGB의 기능은 명확하지 않다.

AGB의 기관 특이적 발현을 관찰하기 위해, 4주 자란 식물체의 기관들(organs)을 준비하였다. 전체 식물체의 기관은 뿌리, 로제트(rosette), 경생(cauline), 줄기, 실리크(silique) 및 꽃으로 나누었다. AGB는 뿌리에서 고도로 발현되었고, 꽃에서는 적은 양이 발현되었다(도 9A). 앞선 연구에서, AIA는 꽃과 뿌리에서 고도로 발현되었고, 로제트와 실리크에서는 거의 발현되지 않았다(도 9B). AIA와 AGB은 같은 기관에서 발현되어 공유하였고, 그 기관에서 정확히 같은 위치에 존재하는 것은 아니었다.

다음으로, 1.85-kb의 AGB 프로모터-GUS 융합 구조물을 형질전환 시킨 형질전환 식물체에서 AGB의 시간적, 공간적인 발현 패턴을 분석하기 위해서 조직화학적인 β-글루쿠로니다제 염색(histochemical β-glucuronidase (GUS) staining)을 수행하였다(도 10A). 시간적 발현 양상을 조사하기 위해 파종(sowing) 후 매일같이 같은 식물 샘플을 수집하였다. 건조 시킨 종자와 물을 흡수한 종자는 GUS 활성을 보이지 않았다. 발아 후, GUS 염색은 자엽과 뿌리에서 관찰되었다(도 10B). 이러한 결과는 AGB 프로모터는 발아단계에서 자엽과 뿌리에서 조절되는 것으로 추측하게 한다.

<실시예 7: 돌연변이체와 형질전환 식물체의 표현형>

ABA 또는 만니톨 처리조건에서 AGB의 영향을 관찰하기 위해, 뿌리의 신장 분석을 수행하였다. ABA 처리 조건에서, AGB 넉아웃 돌연변이체(agb)는 야생형(col-0 wild-type plant)보다 비교적 덜 민감하였다. 반면에, AGB 과발현 식물체는 초민감성을 나타내었다(도 11). 이러한 표현형은 AIA 돌연변이체 및 과발현체의 표현형과 매우 유사하였다. 이것은 AIA와 AGB는 기능적으로 연관이 있다는 것을 암시한다. 만니톨 처리 조건에서, 표현형의 특이한 차이점은 관찰되지 않았다(도 12).

도 1은 SALK_034787에서 T-DNA의 위치이다. 붉은색의 직사각형은 At2g34260의 엑손이고, 두꺼운 라인은 인트론이다. 하늘색의 직사각형은 SALK 돌연변이 식물체에서 삽입된 T-DNA이다.

도 2는 AIA 상호작용 단백질을 선별하기 위한 효모 2중 하이브리드 분석(Yeast two-hybrid assay) 결과이다. GAL4 DNA-결합 부위에 연결된 AIA cDNA와 전사-활성화 부위에 연결된 애개장대 cDNA 클론을 동시-형질도입시킨 콜로니를 스크리닝하는 것이다. 도면에서는 총 60개의 공동 형질전환체 중에서 두 개의 블루 콜로니(원형)를 보여준다.

도 3은 AGB의 도메인과 예상되는 AGB의 3차 구조이다. A. InterProScan 시퀀스 서칭을 이용하여 도메인을 조사한 것이다. 예상되는 시퀀스는 블루 박스로 표시하였다. B. SWISS-MODEL 서버에서 자동 모델링을 이용하여 3차 구조를 예상하였다. a, 예상되는 AGB의 구조, b. 알려진 지브라 피쉬의 G 단백질의 β 서브유닛, c. AGB1의 예상구조(애기장대 G 단백질 β 서브유닛 1).

도 4는 CLUSTALW을 이용한 WD-40 반복 서열을 포함하는 시퀀스들의 정렬을 나타낸다. 보라색을 제외한 모든 박스는 WD-40 반복 서열이다. 보라색 박스는 단지 AGB에만 존재하는 YD-40 반복을 의미한다. 각각의 칼라는 예상되는 3차 구조에서 WD-40 반복서열의 위치를 보여준다.

도 5는 agb의 유전자형 스크리닝과 RT-PCR 분석을 나타낸다. A는 위치-특이적인 유전형 스크리닝에 의한 동형접합 돌연변이체 선별을 나타낸다. B는 스크리닝 한 동형접합 돌연변이체에서 AGB 전사체의 손실을 RT-PCR로 확인한 결과이다. β- Tubulin은 대조구로 사용되었다.

도 6은 AGB-과발현 식물체를 확인한 결과이다. A는 AGB의 과발현 구조체이고, B는 형질전환 식물체에서 AGB의 과발현을 확인하기 위한 노던 블럿 분석을 나타낸다.

도 7은 여러 화학물질을 처리한 후, AGB의 전사체 발현 수준을 나타내는 그림이다. A는 몇 개의 화학물질-100μM MeJA, 100μM ABA, 400mM 만니톨, 200mM NaCl, 1mM 에틸렌 및 2mM SA를 각각 처리한 후 AGB의 전사체 발현 수준을 나타내고, B는 H₂O, 100 μM ABA 및 400 mM 만니톨 처리 후 시간에 따른 AGB 전사체 발현 수준의 변화를 나타낸다. 전사체의 발현 수준은 노던 블럿 분석으로 조사하였다.

도 8은 건조시킨 종자와 발아된 종자의 AGB 전사체 발현 수준을 시간에 따라 조사한 결과이다. 모든 발아된 씨앗은 젖은 여과지에서 배양하였다. 발아된 씨앗은 4℃에서 4일 동안 습적시켜 준비하였다. ‘1 day’ 라고 쓰여진 5번째 레인은 습적 없이 발아된 종자의 AGB 전사체 수준을 보여준다.

도 9는 AGB 및 AIA의 기관-특이적인 발현을 나타낸다. A는 AGB의 기관-특이적인 발현이다. 정상 조건에서 다양한 조직의 AGB 전사체 발현 수준은 RT-PCR로 확인하였다. 로제트와 경생(cauline)은 4주된 식물체에서 얻었고, 뿌리, 줄기, 실리크(silique) 및 꽃은 6주된 식물체에서 얻었다. Tubulin 은 대조구로 사용하였다. B. AIA의 기관-특이적인 발현을 나타낸다. AIA의 전사체 발현 수준은 노던 블럿 분 석으로 조사하였다.

도 10은 AGB 프로모터의 GUS 다운스트림을 포함하는 형질전환 식물체의 조직화학적인 GUS 염색결과이다. A는 GUS 유전자를 갖는 AGB 프로모터 구조물이다. 1.85-kb 업스트림의 AGB ORF 시퀀스는 AGB 프로모터를 사용한다. B는 애기장대의 성장단계를 보여준다. C는 GUS 염색 후의 AGB::GUS 형질전환 식물체이다. 습적(stratification) 종결 후 2일이 지난 뒤에, GUS 염색은 유묘의 자엽과 뿌리에서 관찰되었다.

도 11은 ABA에 반응하는 agb- 및 AGB-과발현 식물체의 뿌리 신장 분석을 나타낸다. 종자는 0.5 μM ABA, 3 μM ABA을 포함하는 0.5 X MS 배지와 ABA를 포함하지 않는 0.5 X MS 배지에서 키웠다. Col-0 및 abi4는 표현형을 비교하기 위해 대조구로서 사용되었다.

도 12는 만니톨에 반응하는 agb- 및 AGB-과발현 식물체의 뿌리 신장 분석을 나타낸다. 종자는 50 mM 만니톨, 100 mM 만니톨을 포함하는 0.5 X MS 배지에서 키웠고, 만니톨을 포함하지 않는 0.5 X MS 배지에서 키웠다. Col-0 및 AIA 과발현은 표현형을 비교하기 위한 대조구로 사용되었다.

<110> Seoul National University Academic Corporation Foundation <120> AGB protein interacting with AIA originated from Arabidopsis thaliana <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1062 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atggagatcg atttgggagc taacgcgttt ggtatcgact tccatccatc gacgaatcta 60 gtagctgctg gtctcatcga tggccacttg catctatacc gatacgactc agattcttca 120 cttgtcaggg aacgtaaagt tcgtgcccat aaggagtctt gtagagctgt tcggttcatt 180 gatgatggcc aaagaatcgt cactgcttca gctgattgtt caattctagc aactgatgta 240 gagactggtg cgcaggttgc acatcttgag aatgctcacg aggatgctgt taatactttg 300 attaatgtta ctgagacaac tatcgcttca ggagatgata aaggctgcgt taagatttgg 360 gatacaagac agcgctcttg ctctcatgag tttaatgcac acgaggatta catttctggc 420 atgacctttg catctgattc aatgaagcta gtggtaacaa gtggagacgg gactttgtct 480 gtctgtaatc ttagaacgag taaggtccaa tctcagtccg aattttctga agatgaacta 540 ctttctgttg ttataatgaa gaatggccgt aaagttatct gtggaactca gaatggtact 600 ctcttgttgt attcatgggg atttttcaag gattgcagcg atcggtttgt tgatctcgct 660 ccaaattccg ttgatgctct actgaagctc gatgaggaca gacttatcac tggatgtgat 720 aatggaataa ttagccttgt tggaatactg cccaacagaa tcatacagcc gattgggtca 780 cacgactacc ctatcgaaga tctcgctctc tcgcatgata agaaatttct cggtagcaca 840 gctcatgaca gtatgctgaa gttgtggaac ctagaagaga ttctagaagg ttctaatgtc 900 aactctggga atgcatctgg agctgcagaa gacagtgaca gcgacaatga tgggatggac 960 cttgacaatg atccttccaa gtcttccaaa ggcagcaaga ggaaaacaaa aagtaaagcg 1020 aatacgctga acgctacaaa taatttcttt gcagacttat ag 1062 <210> 2 <211> 353 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Glu Ile Asp Leu Gly Ala Asn Ala Phe Gly Ile Asp Phe His Pro 1 5 10 15 Ser Thr Asn Leu Val Ala Ala Gly Leu Ile Asp Gly His Leu His Leu 20 25 30 Tyr Arg Tyr Asp Ser Asp Ser Ser Leu Val Arg Glu Arg Lys Val Arg 35 40 45 Ala His Lys Glu Ser Cys Arg Ala Val Arg Phe Ile Asp Asp Gly Gln 50 55 60 Arg Ile Val Thr Ala Ser Ala Asp Cys Ser Ile Leu Ala Thr Asp Val 65 70 75 80 Glu Thr Gly Ala Gln Val Ala His Leu Glu Asn Ala His Glu Asp Ala 85 90 95 Val Asn Thr Leu Ile Asn Val Thr Glu Thr Thr Ile Ala Ser Gly Asp 100 105 110 Asp Lys Gly Cys Val Lys Ile Trp Asp Thr Arg Gln Arg Ser Cys Ser 115 120 125 His Glu Phe Asn Ala His Glu Asp Tyr Ile Ser Gly Met Thr Phe Ala 130 135 140 Ser Asp Ser Met Lys Leu Val Val Thr Ser Gly Asp Gly Thr Leu Ser 145 150 155 160 Val Cys Asn Leu Arg Thr Ser Lys Val Gln Ser Gln Ser Glu Phe Ser 165 170 175 Glu Asp Glu Leu Leu Ser Val Val Ile Met Lys Asn Gly Arg Lys Val 180 185 190 Ile Cys Gly Thr Gln Asn Gly Thr Leu Leu Leu Tyr Ser Trp Gly Phe 195 200 205 Phe Lys Asp Cys Ser Asp Arg Phe Val Asp Leu Ala Pro Asn Ser Val 210 215 220 Asp Ala Leu Leu Lys Leu Asp Glu Asp Arg Leu Ile Thr Gly Cys Asp 225 230 235 240 Asn Gly Ile Ile Ser Leu Val Gly Ile Leu Pro Asn Arg Ile Ile Gln 245 250 255 Pro Ile Gly Ser His Asp Tyr Pro Ile Glu Asp Leu Ala Leu Ser His 260 265 270 Asp Lys Lys Phe Leu Gly Ser Thr Ala His Asp Ser Met Leu Lys Leu 275 280 285 Trp Asn Leu Glu Glu Ile Leu Glu Gly Ser Asn Val Asn Ser Gly Asn 290 295 300 Ala Ser Gly Ala Ala Glu Asp Ser Asp Ser Asp Asn Asp Gly Met Asp 305 310 315 320 Leu Asp Asn Asp Pro Ser Lys Ser Ser Lys Gly Ser Lys Arg Lys Thr 325 330 335 Lys Ser Lys Ala Asn Thr Leu Asn Ala Thr Asn Asn Phe Phe Ala Asp 340 345 350 Leu <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tcagaagact cctccaatca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 atgtgtggag ctataatatc 20 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 atggagatcg atttgggagc taac 24 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ctataagtct gcaaagaaat tatttgtagc gt 32 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 aggtgaccct ataagtctgc aaagaaatta 30 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ataccatgga gatcgatttg gga 23 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tggttgctgt aacattaggg g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 caacacattt tggcaccttt c 21 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tcaaacagga ttttcgcctg ct 22 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ctcaagaggt tctcagcagt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tcaccttctt catccgcagt 20 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gcggatccac agctccagca aggtaat 27 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 catgccatgg gcgccgaatt gagactt 27

Claims (11)

1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, AIA(ABA(abscisic acid) inducible AP2/ERF transcription factor)와 상호작용하는 애기장대 유래의 AGB(Arabidopsis G protein β subunit) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물체.
2. 제1항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 식물체.
3. 제2항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 애기장대인 것을 특징으로 하는 식물체.
4. 제1항에 따른 식물체의 종자.
5. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, AIA(ABA(abscisic acid) inducible AP2/ERF transcription factor)와 상호작용을 하는 애기장대 유래의 AGB(Arabidopsis G protein β subunit) 단백질.
6. 제5항에 있어서, 상기 AGB 단백질은 6개의 WD-40 도메인을 갖고, N 말단에는 헬릭스(helix) 구조가 없는 GTP 결합 단백질 β 서브유닛(GTP binding protein β subunit) 구조인 것을 특징으로 하는 AGB 단백질.
7. 제5항 또는 제6항의 AGB 단백질을 코딩하는 유전자.
8. 제7항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 유전자.
9. 제7항의 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터.
10. 제9항에 있어서, 상기 벡터는 도 6의 35S::AGB 또는 도 10의 pAGB-GUS인 것을 특징으로 하는 벡터.
11. 제9항의 재조합 식물 발현 벡터를 식물체에 도입하여 AGB 단백질 코딩 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물체의 앱시스산에 대한 과민 반응을 갖게 하는 방법.

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