KR20090113449A

KR20090113449A - 유기용매 제거 시간 및 속도 제어를 통한 나노입자 제조방법

Info

Publication number: KR20090113449A
Application number: KR1020080039176A
Authority: KR
Inventors: 장정윤; 권병수; 이혜은; 최광진; 강재선; 이상길; 강호경; 정태성; 윤병재
Original assignee: 인제대학교 산학협력단; 주식회사 셀메디신
Priority date: 2008-04-28
Filing date: 2008-04-28
Publication date: 2009-11-02

Abstract

본 발명은 펩타이드 및 단백질을 함유하는 나노입자의 제조방법에 관한 것이다. 통상의 W₁/O/W₂ emulsion 방법(multiple emulsion 방식) 은 입자크기를 나노 단위로 제어하면서 약물의 봉입효율까지 동시에 높이기가 용이하지 않다는 문제점이 있다. 본 발명에서는 회전감압 방식을 통해 나노입자 제조공정에서 유기용매 제거 시간과 속도를 용이하게 제어함으로써 입자의 크기를 용이하게 제어하면서 수용성 펩타이드 약물의 봉입효율을 높일 수 있었다.

나노입자, 이중유화법, 폴리락티드글리콜라이드공중합체(PLGA), 회전감압방식, 펩타이드, 단백질

Description

유기용매 제거 시간 및 속도 제어를 통한 나노입자 제조방법 {The nanoparticle preparation method using solvent removing rate control}

지금까지 나노입자 제조 시 생분해성 고분자를 많이 사용해 왔으며, 그 중 PLGA는 분자량과 락타이드(lactide)와 글리코라이드(glycolide)의 중합비의 조절을 통해 약물의 방출을 조절할 수 있고, 체내에서 젖산(lactic acid)과 글리코릭엑시드(glycolic acid)로 분해되어서 이산화탄소의 형태로 체외로 용이하게 배출되기 때문에 인체에 무해하여 FDA에서 승인 받은 안전한 고분자로 널리 사용되고 있다.

일반적으로 PLGA를 이용한 입자제조에 있어서 이중 유화 증발법 (W₁/O/W₂ method)이 많이 사용되어 왔으며, 이 방법은 일반적으로 펩타이드나 단백질과 같은 수용성 고분자약물의 봉입에 많이 사용되어 왔다. 제조공정은 약물을 함유한 수용액을 PLGA가 함유되어 있는 유기용매에 분산시켜서 1차 에멀젼을 형성 (W₁/O)한 다음 이를 2차 수상(W₂)에 분산시킨 후 유기용매를 증발시켜 입자를 제조한다. 이 방법은 유기용매상의 고분자가 수상에 분산된 이후 유기용매가 추출 또는 증발 등의 과정을 통해 고분자의 용해도가 감소됨에 따라 고형화되어 입자가 형성되는 원리이다. 그러나 통상의 이중유화 제조방법은 입자를 나노 크기로 제어하기 어려우며 PLGA가 용해되어 있는 유기 용매를 제거하기 위해 24시간 이상의 긴 시간 동안 완만한 조건에서 교반을 하여야 하기 때문에, 용매를 제거하는 과정에서 수용성 약물인 펩타이드나 단백질이 변성될 우려가 높고 1차 수상(W₁)에 녹아 있는 약물이 2차 수상(W₂)으로 빠져나갈 수 있다는 문제점을 가지고 있어 펩타이드나 단백질 약물의 봉입효율을 높이기 어려운 문제점이 있다.

이에 본 발명자들은 연어 칼시토닌을 모델 약물로 하고 생분해성 고분자인 PLGA를 사용하여 기존의 이중 유화 증발법 (W₁/O/W₂ method)에서 유기 용매의 제거 시간, 속도, 그리고 1차 수상(W₁)에서 2차 수상(W₂)으로의 약물이 제거 되는 것을 방지할 수 있는 요인들을 개선하여 용이하게 나노입자를 제조함과 동시에 약물의 함량을 증대시킬 수 있는 공정을 확립하였다.

본 발명은 유기 용매의 제거시간 및 속도 조절을 통해 기존의 이중 유화 증발법 (W₁/O/W₂ method)을 개선하여 나노 크기의 입자를 용이하게 제조하고 약물의 봉입률을 증대 시킬 수 있는 나노입자 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 모델약물로 칼시토닌을 함유하는 나노 입자의 제조방법에 있어서 이중 유화 증발법 (W₁/O/W₂ method)의 제조과정에 회전감압기를 사용하여 유기 용매의 제거속도를 빠르게 조절함으로써 나노입자를 제조하는 방법, 나노입자 제조과정 중 오일상에 존재하는 유기용매가 확산을 통해 충분히 제거될 수 있도록 4℃에서 24시간 동안 방치하는 과정, 봉입된 약물이 외부 수상(W₂)으로 빠져나가는 것을 방지하기 위하여 외부 수상(W₂)에 수용성 고분자를 사용하는 방법으로 구성되어 있다.

본 발명의 나노입자 제조공정을 통해 종래의 이중 유화 제조 방법 (W₁/O/W₂ double emulsion) 이 갖는 입자도 제어의 어려움과 약물의 봉입효율 저하를 극복할 수 있는 방안이며, 약물을 지속적으로 방출할 수 있고 경구투여를 통해 혈중 칼슘 농도를 낮출 수 있는 효과적인 방법을 제공할 수 있었다. 이 방법을 통해 칼시토닌을 포함한 다양한 단백질 및 펩타이드 약물의 경구전달을 위한 나노입자 제조에 폭넓게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명에서 제공하는 유기용매 제거 방법은 회전감압기를 이용하여 짧은 시간에 유기용매를 신속히 제거하는 공정을 적용하기 때문에 통상의 이중 유화 증발법 (W₁/O/W₂ method)처럼 하루 이상 교반하여 유기 용매를 제거하지 않아 제조시간이 짧고 용매제거를 위해 경우에 따라서는 온도를 상승시키거나 교반속도를 증가시키는 공정이 없어 단백질이나 펩타이드 약물의 활성유지에 바람직하며 봉입된 약물이 역 확산되어 나옴에따른 봉입효율 저하 문제점을 극복할 수 있다. 또한 유기용매가 충분히 제거되지 않을 경우 회수한 입자 내부 및 표면에 잔존하는 유기용매에 의해 동결건조 후 입자간 심한 응집현상이 나타날 수 있다는 단점이 있지만 본 발명에서 제공하는 회전감압방식을 이용할 경우 유기 용매를 신속히 제거함으로써 입자제조 시간을 단축시킬 수 있었고, 약물의 봉입효율을 높일 수 있으며, 입자간 응집현상을 억제할 수 있다. 또한 이중유화증발법 (W₁/O/W₂ method)으로 나노입자를 제조한 뒤 4℃의 조건에서 방치한 과정을 거침으로써 추가로 유기용매를 완벽하게 제거 할 수 있었으며, 이를 통해 입자의 응집현상을 최소화 할 수 있었다.

본 발명의 이중 유화 증발법 (W₁/O/W₂ method)에서 외부 수상(W₂)에 첨가될 수 있는 고분자 물질로는 폴리비닐알콜(polyvinylalcohol)이나 폴리비닐피롤리돈(Polyvinylpyrrolidone)등이 사용될 수 있으며, 외부수상에 고분자량의 폴리비닐알콜(polyvinylalcohol)을 사용하였을 때 분자량이 낮은 폴리비닐알콜을 사용한 경우에 비하여 봉입효율이 증대되는 결과를 얻었다. 이는 외부수상(W₂)에 폴리비닐알콜(polyvinylalcohol)과 같은 고분자 물질을 첨가함으로써 PLGA 나노입자의 표면에 약물의 확산이행을 억제할 수 있는 확산억제 막을 형성함으로써 이중 유화 증발 과정에서 약물이 최외상으로 확산될 가능성을 줄였기 때문이다.

이하 본 발명을 실시예와 함께 상세히 설명하고자 하며, 본 발명이 실시예에 의하여 제한 되는 것은 아니다.

실시예

<실시예 1> 회전감압방식을 이용한 칼시토닌 나노 입자의 제조

증류수 (W₁)에 연어칼시토닌 10 mg을 용해시켜 W₁ 내부수상을 제조한 후, dichloromethane(O) 20 ml 에 PLGA 300 mg과 Tween 20 100㎕를 첨가하여 오일상(O)을 제조하였다. 제조된 1차 수상과 오일상을 고속균질기를 이용하여 13,000 rpm에서 1분간 교반하여 W₁/O 1차 유제를 형성시켰다. 다음 분자량 86,000인 폴리비닐알콜 1%(W/V)를 함유한 2차수상을 제조하고 W₁/O 1차 유제를 syringe에 넣은 후 등속주입펌프를 이용하여 30 gage 주사기를 통과시켜 1.5 ml/min 의 속도로 미리 제조 한 1%(W/V) 폴리비닐알콜 용액 200 ml에 주입한 뒤 고속균질기를 이용하여 20분간 5,200 rpm에서　교반하였다. 형성된 W₁/O/W₂double emulsion을 회전감압기 (Buchi Rotavapor R-210/215)로 옮겨 20 rpm으로 회전하면서 40℃ 이상의 온도에서 거품이 생기지 않을 때까지 약 20분 정도의 시간으로 유기용매 (dichloromethane)를 제거하고 제조된 W₁/O/W₂ double emulsion을 4℃ 냉암소로 옮겨 24시간 동안 방치하여 숙성함으로써 유기용매를 충분히 제거하였다. 그 후 얻어진 나노입자를 13,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 입자를 회수하고 증류수로 2회 세척한 후 동결 건조하여 입자도 또는 함량 분석전까지 냉장보관 하였다.

<실시예 2> 숙성과정을 거치지 않은 칼시토닌 나노입자의 제조

제조된 W₁/O/W₂ double emulsion을 4℃에서 24시간 동안 숙성하는 과정을 제외하고 실시예 1과 동일한 공정을 거쳐 W₁/O/W₂ double emulsion을 제조한 뒤 나노입자를 제조하였다.

<실시예 3> 회전감압방식을 이용한 칼시토닌 나노 입자의 제조

W₂상에 분자량이 66,000인 폴리비닐알콜을 사용한 것을 제외하고 실시예 1과 동일 방법으로 제조하였다.

<실시예 4> 회전감압 방식을 이용한 칼시토닌 나노입자의 제조

회전감압기의 회전 속도를 280rpm으로 상승시킨 것을 제외하고 실시예 1과 동일 방법으로 제조하였다.

<비교예 1> 단순교반을 통한 칼시토닌 나노 입자의 제조

실시예 1과 동일한 방법으로 W₁/O/W₂ double emulsion을 제조하였다. 제조한 W₁/O/W₂double emulsion을 magnetic bar를 사용하여 24시간 동안 930 rpm으로 교반시켜 유기용매 (dichloromethane)를 제거한 뒤 4℃ 조건에서 24시간 동안 방치하였다. 그 후 13,000 rpm에서 30분간 원심분리를 통해 나노입자를 회수하고 이를 증류수로 2회 세척한 후 동결 건조하여 분말상의 입자를 제조한 뒤 냉장보관 하였다.

제조한 나노입자의 약물 함량 (%), 입자크기(nm), 다분산도(PI) 등을 표 1에 요약하였다.

[표 1] 제조한 나노입자의 물리적 특성

	NS-C	NS-L	NS-H	NS-F	NS-P
Incubation time (hr)	-	24	24	24	24
Molecular weight of PVA	86,000	66,000	86,000	86,000	86,000
Solvent removing rate (rpm)	20	20	20	280	-
Encapsulation efficiency (%)	11.4±1.3	19.5±3.8	28.8±3.0	52.5±6.5	8.8±3.0
Particle size (nm)	1049.0 ±145.1	580.0 ±81.2	718.3 ±65.3	383.2 ±8.7	2753.9?BR/>±485.2
Poly dispersity index (PI)	0.310 ±0.003	0.280 ±0.050	0.250 ±0.008	0.250 ±0.004	0.110 ±0.180

회전감압기를 사용하여 제조한 입자(NS-H)는 718.3±65.3 nm의 크기와 28.8±3.0 %의 봉입효율을 나타낸 반면 일반적인 교반방법에 의해 유기용매를 제거한 입자(NS-P) 경우에는 입자크기가 2,753.9±485.2 nm 이었고, 봉입효율이 8.8±3.0 %로 매우 낮음을 알 수 있었다. 즉, 회전감압기를 사용하여 입자를 제조하였을 때 입자의 크기가 더 작아지고 봉입효율도 높아짐을 알 수 있었다. 24시간 동안의 숙성시간을 거친 입자(NS-H)의 경우 입자의 크기가 718.3±65.3 nm였으며, 봉입효율은 28.8±3.0 % 이었다. 이와 비교하여 숙성공정을 거치지 않은 입자(NS-C)의 경우 입자도가 1,049±145.06 nm, 봉입효율은 11.4±1.3 % 로 나타났다. 즉, 숙성공정을 거친 입자들이 입자 크기가 더 작았으며 봉입효율 역시 증가함을 알 수 있었다.

W₂ 상에 첨가되는 폴리비닐알콜의 분자량에 따른 입자도와 봉입효율을 비교해본 결과 폴리비닐알콜의 분자량이 클수록 입자의 크기와 봉입효율이 증대됨을 알 수 있었다. 회전감압기를 사용한 경우 회전 rpm을 20에서 280으로 증가시켰을 때 입자도가 작아지면서 봉입효율은 증대되는 결과를 얻을 수 있었다.

시험예

<시험예 1> 칼시토닌이 봉입된 나노입자의 in vitro 방출실험

실시예 1~4의 칼시토닌 나노 입자로 부터 칼시토닌이 방출되는 형태를 알아보고자 in vitro 방출실험을 실시하였다. 칼시토닌이 봉입된 나노입자 20 mg 을 2% SDS 0.05%가 포함된 pH 7.4 인산완충용액 1ml에 넣고 37 ℃ 에서 incubation 시켰다. 그 후 일정 시간 간격으로 4℃ 조건에서 4분간 10,000 rpm으로 원심분리한 뒤 상층액 800ul를 빼어내고, 새로운 인산완충용액 800ul를 넣어주었다. Bicinchonic Acid (BCA) Assay로 분석한 결과 도면 5에서 보는 것과 같이 칼시토닌이 약 15일간 방출됨을 알 수 있었다.

<시험예 2> 칼시토닌이 봉입된 나노입자의 in vivo 동물실험

칼시토닌이 봉입된 나노입자를 실험용 쥐 (7주령 SD Rat)에게 경구 투여하여 경정맥 수술을 통해 카테터를 삽관하였다. 수술 후 회복시킨 후 각각 칼시토닌으로써 500IU/kg의 나노입자를 경구투여 하였으며, 이와 비교하기 위하여 500 IU/kg의 연어 칼시토닌 용액을 경구 및 경정맥으로 투여하였다. 투여 후 일정시간 간격으로 경정맥을 통해 혈액을 채취하여 혈장중 칼슘의 양을 측정하였다. 도 6에서 보는 바와 같이 칼시토닌 나노 입자의 경우 단순 용액에 비하여 칼슘강하효과가 우수함을 알 수 있었으며, 그 효과가 약 6시간이상 지속됨을 알 수 있었다.

도1은 본 발명에 따른 회전감압기를 사용하여 제조한 칼시토닌 나노 입자의 주사전자현미경 (scanning emission microscopy) 이미지이다.

도2는 본 발명에 따른 PLGA를 이용하여 제조한 칼시토닌 나노입자를 숙성과정을 거치지 않고 제조한 나노입자의 주사전자현미경 이미지이다.

도3은 본 발명에 따른 PLGA를 이용하여 제조한 칼시토닌 나노입자의 2차 수상에 분자량 66,000 인 폴리비닐알콜 (polyvinylalcohol) 1%(W/V)를 첨가하였을 때의 주사전자현미경 이미지이다.

도4는 회전감압기를 이용하여 제조한 칼시토닌 나노입자의 주사전자현미경 이미지이다.

도5는 회전감압장치를 이용하여 제조된 칼시토닌 나노입자의 방출 실험 결과이다.

도6은 회전감압장치를 이용하여 제조된 칼시토닌 500IU/kg에 해당하는 양을 정 맥주사 한 것과, 액상 및 나노입자의 형태로 래트에 경구투여 하여 얻은 혈중 칼슘농도 프로파일이다.

Claims

이중유화 (W₁/O/W₂ double emulsion) 공정에서 유기용매를 제거하기 위해 회전감압기를 사용하여 둥근플라스크를 회전하면서 감압 조건하에 나노입자를 제조하는 방법
제1항에 있어서 이중유화 공정에 사용되는 벽막물질이 생분해성 고분자인 방법
제1항에 있어서 봉입약물이 단백질 및 펩타이드를 사용한 제조방법
제2항에 있어서 생분해성 합성고분자로써 폴리글리콜라이드, 폴리락타이드, 폴리락타이드글리콜라이드, 폴리오르쏘에스터, 폴리카프로락톤, 폴리안하이드라이드, 폴리부틸렌석시네이트, 폴리에틸렌석시네이트 폴리하이드록시뷰틸레이트, 폴리프로필렌퓨마네이트, 폴리아마이드(나일론), 폴리시아노아크릴레이트, 폴리우레탄, 폴리하이드록시메타크릴레이트, 폴리메틸메타크릴레이트를 폴리하이드록시알카노에이트, 폴리에스터카보네이트를 사용하는 방법
제1항에 있어서 유기용매를 제거하기 위해 회전감압기를 사용하여 입자를 제조한 뒤 4^oC 냉소에서 숙성과정을 거쳐 유기용매를 완벽히 제거하는 방법