KR20090108236A

KR20090108236A - 예시니아 페스티스 코리스메이트 뮤타아제 유전자의신호서열을 이용한 단백질 생산방법, 및 이를 위한 재조합발현벡터

Info

Publication number: KR20090108236A
Application number: KR1020080033551A
Authority: KR
Inventors: 김숙경
Original assignee: 한국표준과학연구원
Priority date: 2008-04-11
Filing date: 2008-04-11
Publication date: 2009-10-15
Also published as: KR100988600B1

Abstract

본 발명은 예시니아 페스티스 코리스메이트 뮤타아제(Yersinia pestis chorismate mutase, YPCM) 유전자의 신호서열(signal sequence)을 이용하여 단백질을 대장균(E. coli)의 세포내 간극(periplasmic space)으로 수송하여 분리하는 단계를 포함하는 단백질 생산방법, 및 이를 위한 재조합 발현벡터에 관한 것으로서, 대장균에서 목적하는 단백질을 세포내 간극으로 수송하여 세포내 간극으로부터 단백질을 분리 정제함으로써, 간단하고 용이하며 경제적인 방법으로 목적 단백질을 높은 효율로 대량 생산할 수 있다. 특히, YPCM 유전자의 신호서열을 포함하는 재조합 발현벡터에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하여 과잉발현시키면, 어떠한 목적 단백질도 간편하고 경제적인 분리·정제 과정을 통해 대량으로 얻을 수 있다.

예시니아 페스티스 코리스메이트 뮤타아제, 신호서열, 대장균, 세포내 간극, 수송, 과잉발현

Description

예시니아 페스티스 코리스메이트 뮤타아제 유전자의 신호서열을 이용한 단백질 생산방법, 및 이를 위한 재조합 발현벡터{Methods for production of proteins using a signal sequence of chorismate mutase gene from Yersinia pestis, and recombinant expression vectors therefor}

본 발명은 신호서열(signal sequence)을 이용한 단백질의 생산에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 예시니아 페스티스 코리스메이트 뮤타아제(Yersinia pestis chorismate mutase, 이하 'YPCM'이라 약칭하기도 함) 유전자의 신호서열을 이용하여 단백질을 대장균(E. coli)의 세포내 간극(periplasmic space)으로 수송하여 분리하는 단계를 포함하는 단백질 생산방법, 및 이를 위한 재조합 발현벡터에 관한 것이다.

과거 자연상태로부터 미량으로 얻을 수밖에 없었던 인간에게 유용한 의료용 단백질이나 산업용 효소 등은 재조합 DNA 기술의 발전에 의해 대량 생산이 가능하게 되었다. 대장균은 이러한 유용 단백질을 대량 생산하는데 가장 널리 이용되고 있는 숙주세포이다. 그러나 생산하고자 하는 유용 단백질이 대장균에서 필요 이상으로 과잉발현(overexpression)되었을 때, 상당수의 단백질들은 완전한 접 힘(folding)을 이루지 못하고 다양한 기작에 의해 활성을 잃은 상태의 불용성 봉입체(inclusion body)를 형성하게 된다. 이 봉입체는 대부분 단백질로서의 활성을 가지지 못하므로 이로부터 생물학적 활성을 가진 가용성(soluble) 단백질을 얻기 위하여 복잡하고 비용이 많이 드는 변성(denaturation) 및 재접힘(refolding) 과정이 필요하다. 따라서 대상 단백질을 세포 내에서 가용성 형태로 대량 생산하는 방법에 대한 관심이 높아지고 있다.

대장균으로부터 합성된 유용 단백질을 세포내 간극으로 분비시키는 방법은 대장균을 이용한 재조합 단백질의 생산 측면에서 여러 가지 장점을 갖는다. 먼저 과잉발현되는 단백질이 세포질 내에서 봉입체로 되기 전에 세포질 밖으로 분비시킴으로써 가용성 형태의 활성 단백질을 만들어 낼 수 있다. 또한, 세포내 간극에는 세포질 내에 비해 적은 종류의 단백질이 존재하기 때문에 원하는 유용 단백질을 분리 정제하는데 보다 용이하며, 대부분의 프로테아제(protease)가 존재하는 세포질로부터 분리가 되기 때문에 세포내 프로테아제에 의한 분해를 막을 수 있다. 또한, 세포내 간극의 경우 세포질보다 더욱 산화된 주변 환경에 의하여 디설파이드(disulfide) 결합의 형성이 훨씬 쉽게 이루어지고 결국 올바른 접힘이 형성되어 봉입체의 형성이 현저히 줄어든다.

대장균에서 세포막 내 또는 세포막 밖으로 수송되는 단백질은 일반적으로 세포막의 트랜스 측에서 신호 펩티다아제(signal peptidase)에 의해 잘려지게 되는 N-말단 서열을 가지고 있다. 이 특정 N-말단 서열을 "신호서열"이라 부른다. 대장균의 경우 각각의 분비(수송)가 가능한 단백질들은 모두 자기만을 위한 특정 신 호서열을 가지고 있다. 각각의 단백질이 가지고 있는 신호서열은 어떤 특별한 상동성을 가지고 있지 않으며, 같은 단백질이라도 유래한 숙주에 따라서 상이한 신호서열을 갖는다.

상기한 바와 같이, 대장균에서 합성된 유용 단백질을 세포막 밖으로 분비시키는 방법은 재조합 단백질의 생산 측면에서 많은 장점이 있기 때문에, 재조합 단백질을 효과적으로 분비시키기 위한 연구가 많이 이루어진바, 인간 성장 호르몬, 인간 인터류킨-6, 이중특이성 항체(bispecific antibody), 인간 인슐린-유사 성장인자(human insulin-like growth factor), 소 성장호르몬(bovine somatotropin), 인간 부갑상선 호르몬(human parathyroid hormone), 글리시닌(glycinin) 등과 같이 많은 유용 단백질을 분비시키는데 성공하였으나, 아직까지 만족할 만한 분비 효율은 보이지 못하고 있다. 일반적으로 단백질의 분비생산을 위해서는 여러 가지 신호서열이 필요하며 현재 여러 가지 신호서열들이 탐색되고 대장균에서 재조합 단백질의 분비생산에 이용되고 있다. 그러나 이러한 신호서열의 이용이 모든 단백질의 분비생산을 보장해주는 것은 아니며 이는 대장균에서 분비기작에 대한 더 많은 이해와 재조합 단백질의 특성과도 연관되어 고려되어야 할 점이며 아직까지도 연구가 활발히 진행되고 있는 부분이다. 이런 점에서 고효율 분비 발현 및 다양한 재조합 단백질에 이용될 수 있는 새로운 신호서열의 탐색 및 효율적인 단백질 분비 시스템의 개발은 매우 중요한 연구 분야라 할 수 있다.

예를 들어, WO2006/093496호는 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 DNA 서열 및 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 DNA 서열을 포함하는 전사 단위, 및 상기 전사단위 에 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터 부위를 포함하고, 제1 및 제2 DNA 서열 중 어느 하나가 작동가능하게 연결된 분비 신호서열을 추가로 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자, 이를 포함하는 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 멀티머(multimeric) 단백질(예를 들어, 경쇄와 중쇄로 이루어지는 면역글로불린) 생산방법을 개시하고 있다. 상기 공개특허는 분비 신호서열을 이용하여 대상 단백질을 세포내 간극으로 수송하는 것에 대해 기술하고 있기는 하나, 대장균에서 단백질을 세포내 간극으로 보다 효율적으로 수송할 수 있는 특정의 신호서열이나 특정의 재조합 발현벡터를 개시한 것은 아니다.

한편, 문헌 [Kim et al., Journal of Bacteriology Vol. 188, No. 24, p. 8638-8648]에는 마이코박테리움 튜버클로시스(Mycobacterium tuberclosis)로부터 분비되는 코리스메이트 뮤타아제(Rv1885c)가 대장균에서 세포내 간극으로 수송되며 M. 튜버클로시스에서는 배양액으로 분비됨이 기재되어 있다. 그러나 M. 튜버클로시스는 대장균과는 매우 이질적인 균주로서 상동성이 매우 낮아 대장균에서 세포내 간극으로의 수송효율이 떨어지므로, 실제로는 대장균에서 발현된 재조합 단백질을 수송하는데 활용하기는 어려운 것이었다.

본 발명자들은 예시니아 페스티스로부터 분비되는 코리스메이트 뮤타아제(YPCM) 유전자의 생화학적 및 구조적 특성분석을 수행하던 중, 대장균에서 YPCM 유전자를 재조합 발현벡터에 도입하여 발현 시 YPCM이 세포내 간극으로 매우 효율 적으로 수송됨을 확인하였다. 이에 기초하여, 본 발명자들은 상기 YPCM 유전자의 신호서열을 포함하는 재조합 발현벡터를 이용하면 대장균에서 단백질을 고효율로 간단하고 경제적으로 분리 정제할 수 있음에 착안하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서 본 발명의 목적은 YPCM 유전자의 신호서열을 이용하여 단백질을 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 YPCM 유전자의 신호서열을 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하기 위한 것이다.

첫째, 본 발명은

1) 단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 유전자에 작동가능하게 연결되어 있는 예시니아 페스티스 코리스메이트 뮤타아제(YPCM) 유전자로부터의 신호서열을 포함하는 재조합 발현벡터를 대장균에서 발현시켜 발현된 단백질을 세포내 간극으로 수송하고;

2) 세포내 간극으로부터 수송된 단백질을 분리하는:

단계를 포함하는, 단백질의 생산방법을 제공한다.

둘째, 본 발명은 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명에 따르면, 대장균에서 목적하는 단백질을 세포내 간극으로 수송하여 세포내 간극으로부터 단백질을 분리 정제함으로써, 간단하고 용이하며 경제적인 방법으로 목적 단백질을 높은 효율로 대량 생산할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 재조합 발현벡터에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하여 과잉발현시키면, 간단하고 경제적인 분리·정제 과정을 통해 목적 단백질을 대량으로 얻을 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

정의

본 명세서에서 사용된 용어 "신호서열"은 세포막 내 또는 세포막 밖으로 수송되는 단백질에서 세포막의 트랜스 측에서 신호 펩티다아제에 의해 잘려지게 되는 N-말단 서열을 가리키며, "리더(leader)서열" 또는 "신호 펩티드"와 동일한 의미를 갖는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "벡터"는 DNA 단편(들)을 세포로부터 다른 세포로 운반하는 핵산 분자를 가리킨다.

본 명세서에서 사용된 용어 "발현벡터"는 원하는 코딩 서열 및 특정 숙주 기관 내에서 작동가능하게 결합된 코딩 서열을 발현시키는데 필요한 적절한 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 가리킨다. 원핵생물 내 발현에 필요한 핵산 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열, 리보솜 결합 부위 및 임의로 기타 서열을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "프로모터"는 목적하는 뉴클레오티드 서열과 연결된 경우 목적하는 뉴클레오티드 서열이 mRNA로 전사되는 것을 조절할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 통상적으로, 프로모터는 모든 경우에 적용되는 것은 아니나 mRNA로 전사될 목적하는 뉴클레오티드 서열의 5'(즉, 상류)에 존재하고 RNA 폴리머라제 및 기타 전사 개시를 위한 전사 인자가 특이적으로 결합하는 부위를 제공한다. 프로모터는 구성적(constitutive)이거나 조절가능(inducible)하다. 프로모터와 관련하여 사용되는 용어 "구성적"은 프로모터가 자극(예, 열 쇼크, 화학물질 등) 없이도 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사를 지시할 수 있는 것을 의미한다. 반면, "조절가능한" 프로모터는 자극(예, 열 쇼크, 화학물질 등)이 존재하는 경우 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사 수준을 자극없는 경우와는 구별되게 지시할 수 있는 프로모터이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"(operably linked)은 핵산 서열들이 이들의 의도된 기능을 수행하도록 연결된 상태를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터 서열을 목적하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결시킨다는 것은 프로모터 서열이 목적하는 뉴클레오티드 서열의 전사 및(또는) 목적하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 합성을 지시할 수 있게 하는 방식으로 프로모터 서열과 목적하는 뉴클레오티드 서열을 연결하는 것을 의미한다. 유사하게, 신호서열을 목적하는 단백질을 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결시킨다는 것은 신호서열이 목적하는 단백질을 세포내 간극으로 수송하게 할 수 하는 방식으로 신호서열 및 목적하는 단백질을 코딩하는 유전자를 연결하는 것을 의미한다.

YPCM 의 분리·정제, 세포내 간극으로의 수송 및 신호서열의 확인

시키메이트 경로(shikimate pathway) 효소는 방향족 아미노산의 생합성을 담당한다. 이 경로는 세균에만 독특하게 존재하므로 이 경로의 효소는 감염성 세균의 새로운 치료제 개발을 위한 매력적인 표적이 되고 있다. 이 경로의 중추적인 효소인 코리스메이트 뮤타아제(CM)는 코리스메이트를 페닐알라닌과 타이로신 생합성을 위한 전구체인 프레페네이트로 재배열하는 것을 촉매하는 효소이다(반응식 1 참조).

본 발명자들은 예시니아 페스티스로부터의 코리스메이트 뮤타아제를 생화학적 및 구조적으로 특성분석하기 위하여, YPCM 유전자를 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 증폭하고 대장균 발현벡터인 pET15b로 클로닝하였다. YPCM을 대장균 BL21(DE3) 세포로부터 생산하고 분리 정제하였다. 그 결과, YPCM은 186개 아미노산으로 이루어지며(서열번호 4 참조), 단백질의 목적지를 세포내 간극으로 향하게 하는 N-말단 신호펩티드를 갖는 것으로 확인되었다. 성숙 단백질의 질량 분광분석에 의해, 절단 위치는 30번 알라닌과 31번 글루타민 사이인 것으로 확인되었다(서열번호 1 참조).

YPCM 유전자의 신호서열을 이용한 단백질의 수송

위와 같은 결과에 기초하여, 본 발명에서는 YPCM 유전자의 신호서열을 이용하여 목적 단백질을 대장균의 세포내 간극으로 수송함으로써 보다 간편하고 경제적으로 분리 정제하고자 하였다. 이를 위해, 목적 단백질을 코딩하는 유전자에 YPCM 유전자의 신호서열을 작동가능하게 연결하여 목적 단백질이 대장균의 세포내 간극으로 향하도록 하였다. 이때, 예시니아 페스티스는 마이코박테리움 튜버클로시스에 비해 대장균과 근연의 종으로서, 마이코박테리움 튜버클로시스 코리스메이트 뮤타아제 유전자의 신호서열에 비해 현저히 높은 효율로 목적 단백질을 수송하여 목적 단백질의 분비 및 생산성을 높일 수 있는 것으로 확인되었다(도 3 참조).

이렇게 수송된 단백질은 세포내 간극으로부터 보다 간편하고 경제적으로 분리 정제될 수 있는바, 세포내 간극에 모인 단백질은 당업계에 알려진 통상적인 방법, 예를 들어, 삼투압 충격(osmotic shock), 특히 고농도(예: 10~30%, 특히 20%)의 슈크로스 용액을 가하여, 한 단계로(one-step) 간단하게 분리될 수 있다. 나아가, 분리된 단백질은 당업계에 알려진 통상적인 방법에 의해 순수하게 정제될 수 있는바, 이때 종래의 His-tag과 Ni-NTA의 친화력을 이용한 고가의 Ni-NTA 크로마토그래피에 비해 훨씬 경제적인 크기-배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography), 특히 크기-배제 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 한 단계로 간편하게 정제될 수 있다.

YPCM의 신호서열 및 이를 포함하는 재조합 발현벡터

YPCM의 신호서열은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 것, 특히 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이것으로 특별히 제한되는 것은 아니며, 목적 단백질을 대장균의 세포내 간극으로 수송하는 활성을 보유하는 한, 그의 변이체(variants), 단편(fragments), 유도체(derivatives), 유사체(analogues), 기능적 균등물(functional equivalents) 등을 모두 포함하는 것이다.

본 발명에 따른 YPCM 신호서열을 포함하는 재조합 발현벡터는 YPCM 신호서열 자체만을 포함할 수도 있으나, 일반적으로 신호서열의 효율은 인접한 아미노산의 실체(identity)에 의해 영향을 받게 되므로, 신호서열의 마지막 코드 + 1 코드까지 포함하는 것이 보다 바람직하다.

예를 들어, YPCM 신호서열을 포함하는 재조합 발현벡터는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것이 바람직하다. 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드는 YPCM 유전자의 1번 메티오닌부터 30번 알라닌을 거쳐 31번 글루타민을 코딩하는 유전자를 포함하는 것이다. 또한, 다양한 제한위치(restrction sites), NcoⅠ, PvuⅡ, PstⅠ, XhoⅠ 및 BamHⅠ을 포함함으로써 보다 다양한 종류의 단백질을 효율적으로 발현시킬 수 있도록 설계된 것이다. 즉, 목적 단백질의 아미노산 서열에 따라 그를 코딩하는 유전자를 적당한 위치에 클로닝하여 발현시킬 수 있다. 도 1에 서열번호 3의 염기서열 및 각각의 제한위치를 나타내었다. 종래 신호서열을 가진 외래 단백질을 강한 프로모터를 사용하여 다량 발현시킬 경우, 일반적으로 신호서열과 외래 단백질의 유전자 사이에 링커(linker)를 두어 두 가지를 서로 연결시킨다. 그러나, 본 발명의 재조합 발현벡터는 신호서열의 3'-말단에 존재하는 다양한 제한위치에 생산 하고자 하는 목적 단백질의 유전자를 링커 없이 직접 연결시킴으로써, 신호서열과 목적 단백질의 유전자 서열에 변화를 초래하지 않을 수 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 발현벡터는 생산하고자 하는 단백질의 N-말단에 링커에 해당하는 아미노산의 첨가 없이, 목적 단백질을 생산할 수 있는 장점이 있는바, 이는 산업적으로 유용한 단백질의 생산에 매우 유용하다.

본 발명의 재조합 발현벡터는 추가로 대장균에서 그 하류에 존재하는 유전자의 전사 및 발현을 지시할 수 있는 작동가능하게 연결된 프로모터 및 임의로 오퍼레이터를 포함한다. 상기 발현은 구성적이나 조절가능한 것일 수 있으나, 바람직하게는 조절가능한 것이며, 예를 들어, 발현유도인자, 예를 들어 IPTG(isopropyl-β-thiogalactoside) 첨가에 의해 고효율로 유도되어 목적 단백질을 과잉발현할 수 있는 것이 바람직하다. 대표적으로, T7 프로모터 및 lac 오퍼레이터에 의해 발현이 조절되는 pET15b 벡터를 사용할 수 있으나, 이것으로 특별히 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것이 아니다.

실시예 1: 대장균에서 YPCM의 발현 및 분리 정제

YPCM을 코딩하는 유전자를 정향방 프라이머로서 서열번호 5(5'-G GAA TTC CAT ATG CAA CCC ACT CAT ACG CTA ACA AG-3', 굵은체: NdeⅠ 제한 인식 서열) 및 역방향 프라이머로서 서열번호 6(5'-CG GGA TCC TTA TTT TAA TTT TAC CTG ATT GAA GGT TGA G-3', 굵은체: BamHⅠ 제한 인식 서열)의 프라이머를 사용하여 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 증폭하였다. PCR 조건은 아래와 같았다: 95 ℃ 60 초 DNA의 초기 용융; 95 ℃ 45 초 용융, 55 ℃ 45 초 어닐링, 및 72 ℃ 60 초 중합의 30 주기: 72 ℃ 10 분간 중합. 200 ng의 예시니아 페스티스 염색체 DNA와 100 ng의 프라이머를 증폭에 사용하였다.

증폭된 YPCM 유전자를 pET15b 벡터(노바젠, 미국)로 클로닝하고, 이를 대장균 BL21(DE3) 세포(노바젠, 미국)에 형질전환하였다. 형질전환된 대장균을 지수기(early log phase)까지 배양한 후 단백질을 과량발현하기 위하여 IPTG(10, 30, 100 μM)를 처리하여 발현을 유도하고 3 시간 배양하였다. 세포를 원심분리에 의해 수확하고 25 mM Tris-HCl 완충액(pH: 7.5)으로 세척하였다. 세포(1 g 습윤 중량)를 10 ㎖의 5 mM Tris-HCl(pH: 7.5) 1 mM DTT(dithiothreitol), 1 mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), 및 1 mM PMSF(phenylmethanesulphonylfluoride, 용균 완충액)에 현탁하였다. 세포 현탁액을 프렌치 프레스(French Press)에 2회 통과시키고 100,000×g에서 1 시간 원심분리하여 무세포 추출물을 제조하였다. 세포 총 추출액 및 상등액 각각에 대해 13% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행하였다.

그 결과를 도 2에 나타내었다(레인 1: 분자 질량 마커, 레인 2, 3: pET15b 발현벡터(대조)의 총 추출물 및 상등액, 레인 4, 5: IPTG 부재 하에 YPCM 발현의 총 추출물 및 상등액, 레인 6, 7: IPTG(10 μM) 존재 하에 YPCM 발현의 총 추출물 및 상등액, 레인 8, 9: IPTG(30 μM) 존재 하에 YPCM 발현의 총 추출물 및 상등액, 레인 10, 11: IPTG(100 μM) 존재 하에 YPCM 발현의 총 추출물 및 상등액). 도 2에 나타난 바와 같이, YPCM은 상등액이 아닌 총 추출물 내에 존재하는 것으로 확인되어 세포막 밖으로 분비되지는 않으며, 총 추출물에서는 IPTG의 농도가 높아질수록 YPCM이 과잉발현됨을 확인할 수 있었다. 생산된 YPCM을 HPLC에 의해 순수하게 정제하였다. 서열번호 4에 나타낸 바와 같이, YPCM은 186개의 아미노산으로 이루어졌다.

실시예 2: YPCM 신호서열의 목적 단백질의 세포내 간극으로의 수송 활성 확인 및 신호서열의 동정

상기 실시예 1에서 얻은 배양액을 원심분리하여 미생물 세포만을 모으고 20% 의 슈크로스 용액을 상온에서 10 분간 처리한 후 다시 원심분리하여 세포만을 수확하였다. 이를 슈크로스가 없는 5 mM MgSO₄ 용액에 현탁하여 4 ℃에서 15 분간 교반한 후 원심분리하여 상등액만을 모아 주변세포질액(periplasmic fluid)을 분리하고, 주변세포질액 분리 후 세포 추출물 및 주변세포질액에 대해 13% SDS-PAGE를 수행하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었다(레인 1: 세포 추출물, 레인 2: 주변세포질액 제거 후 세포 추출물, 레인 3: 주변세포질액, 레인 4: HPLC 정제된 YPCM). 도 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 대부분의 YPCM 단백질이 발현 후 세포내 간극에 모여 있는 것을 확인할 수 있었다.

도 4에 YPCM 단백질의 친수도 도표(hydropathy plot)를 나타내고, 예상되는 절단 위치를 화살표로 나타내었다. 성숙 단백질의 질량 분광분석에 의해, 절단 위치는 30번 알라닌과 31번 글루타민 사이인 것으로 확인되었다. 위 결과로부터, YPCM의 신호서열은 서열번호 1에 나타낸 30개 아미노산을 코딩하는 것을 알 수 있었다.

실시예 3: 목적 단백질을 세포내 간극으로 수송하기 위한 재조합 발현벡터의 제작

YPCM 유전자로부터 1번 메티오닌부터 31번 글루타민을 코딩하는 93개의 염기서열(30번 알라닌까지의 신호서열 포함)을 포함하고, 제한위치 NcoⅠ, PvuⅡ, PstⅠ, XhoⅠ 및 BaHⅠ을 포함하도록 설계된 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드(113 bp)를 pET15b 벡터의 NcoⅠ-BamHⅠ 위치에 클로닝하여 재조합 발현벡터 pET15b-sig를 제작하였다. pET15b-sig의 지도를 도 5에 나타내었다. pET15b-sig 벡터는 목적 단백질을 그 아미노산 서열에 따라 적당한 위치에 클로닝하여 목적 단백질을 세포내 간극으로 수송하여 분리 정제하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 YPCM 유전자의 신호서열(서열번호 2)을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열(서열번호 3) 및 각각의 제한위치를 나타낸 도면이고;

도 2는 대장균에서 YPCM 발현 후 세포 추출물 및 상등액의 SDS-PAGE 사진이며;

도 3은 대장균에서 YPCM 발현 후 주변세포질액이 제거된 세포 추출물 및 주변세포질액의 SDS-PAGE 사진이고;

도 4는 대장균에서 발현 후 분리 정제된 YPCM의 친수도 도표이며;

도 5는 본 발명에 따른 재조합 발현벡터의 일례인 pET15b-sig의 지도이다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF STANDARDS AND SCIENCE <120> Methods for production of proteins using a signal sequence of chorismate mutase gene from Yersinia pestis, and recombinant expression vectors therefor <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Yersinia pestis <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(30) <400> 1 Met Gln Pro Thr His Thr Leu Thr Arg Leu Thr Val Ile Gly Lys Leu 1 5 10 15 Ile Ile Ala Ser Ser Phe Phe Leu Ser Leu Ala Val Gln Ala 20 25 30 <210> 2 <211> 90 <212> DNA <213> Yersinia pestis <400> 2 atggaaccca ctcatacgct aacaaggtta actgttatcg gtaaattaat tatcgccagt 60 agcttttttc tttccctggc cgtacaggca 90 <210> 3 <211> 113 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YPCM signal sequence containing region of pET15b-sig <400> 3 ccatggaacc cactcatacg ctaacaaggt taactgttat cggtaaatta attatcgcca 60 gtagcttttt tctttccctg gccgtacagg cacagctgca gctcgaggga tcc 113 <210> 4 <211> 186 <212> PRT <213> Yersinia pestis <400> 4 Met Gln Pro Thr His Thr Leu Thr Arg Leu Thr Val Ile Gly Lys Leu 1 5 10 15 Ile Ile Ala Ser Ser Phe Phe Leu Ser Leu Ala Val Gln Ala Gln Gln 20 25 30 Cys Gly Gln Thr Ala Pro Leu Ile Asn Glu Arg Leu Ser Tyr Met Lys 35 40 45 Asp Val Ala Gly Tyr Lys Ala Glu Asn His Leu Pro Ile Glu Asp Arg 50 55 60 Ile Gln Glu Glu Lys Val Ile Asn Ser Ala Met Ala Gln Ala Glu Ser 65 70 75 80 Leu Gly Leu Asn Gly Glu Ser Ile Lys Pro Leu Met Val Ala Gln Ile 85 90 95 Asn Ala Ala Lys Ala Ile Gln Tyr Arg Tyr Arg Ala Asp Trp Leu Ser 100 105 110 Gln Pro Glu Pro Gly Trp Gln Pro Lys Pro Leu Asp Asp Val Arg Ala 115 120 125 Asn Ile Gly Glu Leu Ser Thr Lys Ile Leu Glu Gln Ile Ala Glu Glu 130 135 140 Leu Lys Thr Cys Lys Pro Ala Glu Met Gly Asp Lys Ala His Phe Ile 145 150 155 160 Asn Thr Ile Arg Gln His Asn Leu Thr Ser Ala Asp Val Glu Ala Ile 165 170 175 Phe Ser Thr Phe Asn Gln Val Lys Leu Lys 180 185 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 5 ggaattccat atgcaaccca ctcatacgct aacaag 36 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 6 cgggatcctt attttaattt tacctgattg aaggttgag 39

Claims

1) 단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 유전자에 작동가능하게 연결되어 있는 예시니아 페스티스 코리스메이트 뮤타아제(Yersinia pestis chorismate mutase, YPCM) 유전자로부터의 신호서열(signal sequence)을 포함하는 재조합 발현벡터를 대장균(E. coli)에서 발현시켜 발현된 단백질을 세포내 간극(periplasmic space)으로 수송하고;

2) 세포내 간극으로부터 수송된 단백질을 분리하는:

단계를 포함하는, 단백질의 생산방법.

제1항에 있어서, YPCM 유전자로부터의 신호서열은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 것인 방법.

제2항에 있어서, YPCM 유전자로부터의 신호서열은 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 것인 방법.

제1항에 있어서, 재조합 발현벡터는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 것인 방법.

제1항에 있어서, 재조합 발현벡터는 단백질을 코딩하는 유전자 및 신호서열 에 작동가능하게 연결된 프로모터 및 오퍼레이터를 추가로 포함하는 것인 방법.

제1항에 있어서, 단계 2)에서 단백질을 삼투압 충격(osmotic shock)에 의해 분리하는 방법.

제1항에 있어서, 분리된 단백질을 크기-배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)에 의해 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

서열번호 3의 염기서열을 포함하는 재조합 발현벡터.