KR20090093684A - 신규한 형광 펩타이드 센서 및 이를 이용한 음이온화합물의 검출방법 - Google Patents

신규한 형광 펩타이드 센서 및 이를 이용한 음이온화합물의 검출방법

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KR20090093684A
KR20090093684A KR1020080019360A KR20080019360A KR20090093684A KR 20090093684 A KR20090093684 A KR 20090093684A KR 1020080019360 A KR1020080019360 A KR 1020080019360A KR 20080019360 A KR20080019360 A KR 20080019360A KR 20090093684 A KR20090093684 A KR 20090093684A
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Abstract

본 발명은 신규한 형광 펩타이드 센서 및 이를 이용한 음이온 화합물의 검출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 특정 음이온 화합물과 반응하여 높은 킬레이트 증폭 형광(chelate enhanced fluorescence CHEF) 효과를 갖는 신규한 형광 펩타이드 센서와, 상기 센서를 이용함으로써, 구리이온(Cu2+)의 존재하에서 피로인산염(pyrophosphate, PPi) 및 아데노신트리포스페이트(ATP)와 같은 음이온 화합물을 효과적으로 검출할 수 있게 되어, 신호 전달 및 에너지 저장과 관련된 연구 분야에 유용하게 적용될 수 있는 음이온 화합물의 검출방법에 관한 것이다.

Description

신규한 형광 펩타이드 센서 및 이를 이용한 음이온 화합물의 검출방법{New fluorescent peptide sensor and detecting method of anion compositions}
본 발명은 특정 음이온 화합물과 반응하여 높은 킬레이트 증폭 형광(chelate enhanced fluorescence CHEF) 효과를 갖는 신규한 형광 펩타이드 센서와, 상기 센서를 이용함으로써, 구리이온(Cu2+)의 존재하에서 음이온 화합물을 효과적으로 검출할 수 있게 되어, 신호 전달 및 에너지 저장과 관련된 연구 분야에 유용하게 적용될 수 있는 음이온 화합물의 검출방법에 관한 것이다.
생체 내 주요물질과 이온들에 대한 새로운 센서의 설계와 연구는 그 동안 활발히 진행되어져 왔다. 최근 초분자(supramolecule)화학에 대한 이해와 연구는 선택적으로 이온 혹은 여러 가지 다른 종류의 손님화합물들과 결합할 수 있는 주인화합물의 설계에 큰 가능성을 보여 왔으며, 최근 이러한 초분자 화합물을 형광물질에 연결시킴으로써 손님화합물과의 선택적 결합을 형광변화를 이용하여 보다 손쉽게 관찰할 수 있는 형광 화학 센서(fluorescent chemosensor)의 개발에 대한 연구에 큰 도움을 주고 있다.
형광이란 특정한 광파장 (여기파장)을 갖는 광자가 표지분자(indicator molecule)와 충돌하고, 그 충돌의 결과로 전자가 고에너지 준위로 여기하면서 일어나는 광화학적 현상이다. 여러 분석 방법 중에서 형광을 이용하는 방법은 아주 뛰어난 감도로 인해 10-9 M 농도에서도 신호를 관찰할 수 있는 큰 장점을 가지고 있다. 최근에는 이러한 성질을 이용하여 양이온, 음이온 그리고 중성유기분자들에 대한 형광화학 센서에 대한 연구들이 발표된 바 있다 (A. P. de Silva 등, Chem. Rev.1997, 97, 1515).
음이온은 화학적 및 생물학적 과정의 넓은 범주에서 중요한 역할을 한다.
따라서, 음이온-유도적 변화에 기초한 형광 센서들은 높은 검출 한계 및 조작 간단성에 기인하여 매우 흥미롭게 여겨지고 있다(R. Martinez-Manez and F. Sancanon, Chem. Rev. 2003, 103, 4419). 특별히, 인산염 이온 및 그의 유도체들은 생물학적 계에서 신호 전달 및 에너지 저장에 있어 중요한 역할을 한다.
특히, 피로인산염(PPi)은 세포 조건 하에서 ATP 가수분해의 산물로서 생물학적으로 중요 목표가 될 수 있다. 또한, 피로인산염 방출의 검출은 실시간 DNA 서열분석 (real-time DNA sequencing) 방법으로서 연구되었다(M. Ronaghi 등, Anal. Biochem. 1996, 242, 84). 또한, 최근에는 PPi의 측정이 암 연구에도 이용되고 있다(S. Xu 등, Anal. Biochem. 2001, 299, 188).
따라서, 상기 피로인산염(PPi)과 같은 음이온 화합물의 탐지 및 식별은 여러 연구 그룹의 연구 목표가 되어왔다(R. Martinez-Manez, F. Sancanon, Chem. Rev. 2003, 103, 4419; D. Aldakov and P. Anzenbacher, Jr, Chem. Comm. 2003, 1394; T. Gunnlaugsson 등, Org. Lett. 2002, 4, 2449; Y. J. Jang 등, J. Org. Chem. 2005, 70, 9603; Lee, D. H. 등, Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 2004, 43, 4777; L. Fabbrizzi 등, Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 2002, 41, 3811; S. Mizukami 등, J. Am . Chem . Soc . 2002, 124, 3920 Lee, H. N. 등, Org . Lett . 2007, 9, 243).
생체 내 환경과 유사한 수용액 내에서 PPi (Y. J. Jang 등, J. Org . Chem . 2005, 70, 9603; Lee, D. H. 등, Angew . Chem ., Int . Ed . Engl . 2004, 43, 4777; L. Fabbrizzi 등, Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 2002, 41, 3811; S. Mizukami 등, J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 3920)를 인식하는 형광 화학센서는 매우 드문 경우이며, 특히, 수용액 내에서 ATP 및 Pi에 대해 PPi에 선택성을 보이는 형광 센서는(Hong, J.-I. 등, Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 2004, 43, 4777) 더욱더 드문 실정이다. 또한, 음이온 화합물, 특히 피로인산염에 대해 선택적인 형광 증가를 보이는 형광 펩타이드 센서는 보고된 바가 없는 실정이다.
본 발명은 피로인산염(PPi) 및 ATP와 같은 음이온 화합물의 탐지 및 식별을 위한 형광 화학 센서를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 형광 화학 센서를 이용하여 음이온 화합물의 선택적인 검출방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 형광 펩타이드 센서를 제공함으로써, 상기 과제를 해결한다.
상기 화학식 1에서, l과 m은 각각 1 ≤ l ≤ 2, 1 ≤ m ≤ 3인 정수이고,
R은 NH2, NHR1(R1은 탄소수 1 ~ 18 알킬기이다.), OH, OR1(R1은 탄소수 1 ~ 18 알킬기이다.), (OCH2CH2)n-COOH(n은 2 ~ 5000의 정수이다.), (OCH2CH2)n-polystyrene (n은 2 ~ 5000의 정수이다.) 또는 아미노산이다.
또한, 본 발명은 상기 형광 펩타이드 센서를 이용한 음이온 화합물의 검출방법에 관한 것으로써, 상기 검출은 구리이온(Cu2+)의 존재하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 음이온 화합물의 검출방법을 제공함으로써, 상기 과제를 해결한다.
본 발명에 따른 신규한 형광 펩타이드 센서는 구리〔Ⅱ〕이온의 존재하에서 피로인산염(PPi) 및 ATP와 같은 특정 음이온 화합물과 높은 형광증폭 효과를 나타내어, 형광 화학 센서로 유용하게 적용될 수 있는 효과가 있다.
또한, 종래에는 유기용매 존재 하에서만 음이온 화합물을 검출할 수 있었던 반면, 본 발명에 따른 신규한 형광 펩타이드 센서는 100 % 수용액 하에서도 구리이온 존재하에서 음이온 화합물인 피로인산염(PPi) 및 ATP를 검출할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 형광 펩타이드 센서를 이용하여 구리이온 존재하에서 음이온 화합물의 검출방법을 제공함으로써, 생체 내의 신호 전달 및 에너지 저장과 관련된 연구 분야에 유용하게 적용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 형광 펩타이드 센서( Dansyl - Gly - His -CONH 2 )의 질량 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2은 본 발명의 실시예 1에 따른 형광 펩타이드 센서( Dansyl-Gly-Gly-His-COOH) 의 질량 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3는 pH 7.4 (10mM HEPES 완충액)에서, Cu2+ 1당량 존재시, 본 발명의 실시예 1에 따른 Dansyl-Gly-His-CONH 2 (10 μM)에 20당량의 PPi 및 음이온[CH3CO2 -, HSO4 -, H2PO4 -]을 가하였을 때의 형광 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 pH 7.4 (10mM HEPES 완충액)에서, Cu2 + 1당량 존재시, 본 발명의 실시예 1에 따른 Dansyl - Gly - His - CONH 2 (10 μM)에 PPi(1 내지 7당량)를 가하였을 때의 형광 변화를 나타낸 것이다.
도 5는 pH 7.4 (10mM HEPES 완충액)에서, Cu2+ 1당량 존재시, 본 발명의 실시예 2에 따른 Dansyl-Gly-Gly-His-COOH (10 μM)에 20당량의 PPi 및 음이온[CH3CO2 -, HSO4 -, H2PO4 -]을 가하였을 때의 형광 변화를 나타낸 것이다.
도 6는 pH 7.4 (10mM HEPES 완충액)에서, Cu2+ 1당량 존재시, 본 발명의 실시예 2에 따른 Dansyl-Gly-Gly-His-COOH (10 μM)에 PPi(1 내지 8당량)를 가하였을 때의 형광 변화를 나타낸 것이다.
본 발명은 피로인산염(PPi) 및 ATP와 같은 음이온 화합물과 반응하여 높은 킬레이트 증폭 형광(chelate enhanced fluorescence CHEF) 효과를 갖는 신규한 형광 펩타이드 센서를 제공한 데에 가장 큰 기술적인 특징이 있다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
일반적으로 단실(Dansyl) 그룹과, 히스티딘의 이미다졸(imdazole) 그룹을 포함하는 형광 화학 또는 펩타이드 센서는 히스티딘의 이미다졸 그룹으로 인해서 구리와 높은 결합력을 가진다는 것이 알려져 있다. [Shults MD, Pearce DA, Imperiali B: J Am Chem Soc 2003, 125:10591-10597.] 따라서, 상기 화학식 1로 표시되는 형광 펩타이드는 형광을 나타내는 치환기인 단실(Dansyl) 그룹와 글리신(Gly)과 히스티딘(His)으로 이루어진 아미노산의 결합으로 이루어진 화합물로써, 본 발명은 구리이온〔Ⅱ〕의 존재하에서 특정 음이온 화합물을 검출할 수 있는 상기한 신규한 형광 펩타이드 센서를 제공한다.
본 발명에 따른 형광 펩타이드 센서의 보다 바람직한 예로는, 상기 화학식 1에 있어서, l 및 m이 각각 1이고, R은 NH2인 것을 들 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 형광 펩타이드 센서의 보다 바람직한 예로는, 상기 화학식 1에 있어서, l이 1이고, m이 1인 것을 들 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 형광 펩타이드 센서는 히스티딘(His)의 이미다졸 그룹으로 인해서 구리와 높은 결합력을 갖게 되고, 구리와의 결합으로 인한 구조적인 변화로, 형광을 나타내는 치환기인 단실(Dansyl) 그룹의 형광을 소광시키는 특징이 있다.
따라서, 본 발명은 형광이 소광된 형광 펩타이드 센서가 구리이온〔Ⅱ〕의 존재하에서 특정 음이온 화합물과 반응하면 높은 킬레이트 증폭 형광(chelate enhanced fluorescence CHEF) 효과를 갖게 됨으로써, 300 ~ 360 nm 파장으로 여기시켰을 때, 500 ~ 600 nm 파장의 형광을 발광하게 된다는 것을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.
특히, 상기 킬레이트 증폭 형광 효과는 pH 7.0 ~ 8.0의 조건에서 보다 우수하게 일어날 수 있다.
상기한 본 발명에 따른 형광 펩타이드 센서의 제조방법은 당 분야에서 일반적으로 사용되는 제법으로 특별히 한정하지 않으나, 예를 들어, 수동 또는 자동 펩타이드 합성기에서 고체상 합성법릉 사용함으로써, 보다 바람직하게 제조될 수 있다.
이와 같은 형광 펩타이드 센서 제조방법의 바람직한 예를 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
형광 펩타이드센서 제조방법은 1) 아미노 말단과 반응성 있는 곁사슬이 보호기에 의해 보호된 아미노산으로 카복시 말단이 수지에 결합된 펩타이드를 고체상 합성법으로 합성하는 단계; 2) 상기 수지와 결합된 펩타이드를 피페리딘과 반응시켜 아미노 말단의 보호기를 제거시킨 후, 5-디메틸아미노-1-나프타렌설포닐(Dansyl) 클로라이드와 반응시키는 단계; 및 3) 상기 반응 결과물을 곁사슬 보호기 및 수지 제거 용액과 반응시키는 단계를 포함하여 이루어진 방법으로 합성될 수 있다. 이 때, 상기 펩타이드는 각각 독립적으로 Gly, (L)-His, (D)-His 또는 이들의 2 종 이상의 펩타이드이다.
또한, 상기 보호기는 당 분야에서 통상적으로 사용할 수 있는 것으로, 특별히 한정하지 않으나, 구체적으로, 아미노 말단을 보호하는 보호기로써, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기를 보다 바람직하게 사용할 수 있고, 반응성 있는 곁사슬을 보호하는 보호기로써, 트리페닐메틸, 부틸옥시카르보닐, 및 t-부틸에스테르 중에서 선택된 어느 하나의 잔기를 보다 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 상기 수지는 당 분야에서 통상적으로 사용할 수 있는 것으로, 특별히 한정하지 않으나, 예를 들어, 링크드 아마이드 메틸벤즈하이드릴 아민(rinked amide MBHA) 수지 또는 왕(Wang) 수지를 보다 바람직하게 사용할 수 있다.
또한, 상기 수지에 결합된 펩타이드를 고체상 합성법으로 합성하는 단계에 있어서, 상기 수지 및 펩타이드는 1 : 2 ~ 10의 몰비로 결합되어 이루어진 것을 사용하는 것이 좋다. 보다 바람직하기로는 경제성을 고려하여, 수지 및 펩타이드가 1 : 3 ~ 7의 몰비로 결합되어 이루어진 것을 사용하는 것이 좋다.
이상과 같은 방법으로 형광 펩타이드 센서는 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 형광 펩타이드 센서를 이용한 음이온 화합물의 검출방법은 반드시 구리이온(Cu2+)의 존재하에서 수행되는 데에 가장 큰 기술적인 특징이 있다. 이 때, 상기 음이온 화합물은 피로인산염(pyrophosphate, PPi) 및 ATP 중에서 선택된 화합물일 경우에 보다 바람직하게 검출될 수 있다.
상기 합성된 화학식 1의 형광 펩타이드는 높은 친수성의 특성을 갖고, 구리 이온(Cu2+)은 인체 내 존재하는 중금속 이온 중 세 번째로 그 양이 많은 바, 생체 내에 형광 펩타이드가 투입되는 경우, 생체 내에 존재하는 구리 이온 (Cu2+)과 자연스럽게 결합하여, 특정 음이온 화합물을 검출할 수 있는 것이다.
한편, 구리 이온(Cu2+)이 존재하지 않는 시료의 경우에는 당분야에서 일반적으로 사용되는 구리 이온(Cu2+)의 도입 방법으로 구리 이온(Cu2+)을 도입할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 형광 펩타이드 센서와 구리전구체를 동일한 당량으로 용매와 함께 혼합함으로써, 이루어질 수 있는 바, 상기 구리 전구체는 당 분야에서 통상적으로 사용할 수 있는 것으로, 특별히 한정하지 않으나, 예를 들어, 과염소산 구리〔Ⅱ〕를 보다 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 상기 용매는 당 분야에서 통상적으로 사용할 수 있는 것으로, 특별히 한정하지 않고, 통상적인 유기용매도 사용이 가능하나, 생체 내 조건과 유사한 10 mM의　HEPES 완충 용액을 보다 바람직하게 사용할 수 있다.
상기 형광 펩타이드 센서를 이용한 음이온 화합물의 보다 구체적인 검출 방법의 예로써, 형광 펩타이드 센서와 구리이온(Cu2+)의 존재하에, 피로인산염(pyrophosphate, PPi) 및 ATP와 같은 음이온 화합물을 포함하는 샘플을 혼합하는 단계, 상기 혼합물에 일정 파장의 광을 조사하는 단계 및 형광 증폭 효과를 확인하는 단계를 포함하여 이루어진 방법으로 검출되어질 수 있다.
보다 더 구체적인 검출 방법의 예로써, 1) 본 발명의 형광 펩타이드 센서 및 구리이온(Cu2+)이 용해된 완충 용액을 각각 제조한 후, 혼합하는 단계, 2) 상기 혼합된 완충 용액과, 음이온 화합물을 포함하는 샘플을 혼합하는 단계, 3) 상기 혼합물에 300 ~ 360 nm의 여기 파장을 조사하는 단계 및 4) 상기 여기 파장에 의한 형광 증폭 신호를 검출하여, 상기 펩타이드 센서와 반응하는 음이온 화합물의 존재를 검출하는 단계를 포함하여 이루어진 방법으로 검출되어질 수 있다.
본 발명에 따른 형광 펩타이드 센서는 형광 특성이 우수한 단실(Dansyl) 그룹이 펩타이드에 결합되어 있는 형광 펩타이드가, 구리〔Ⅱ〕이온이 존재하는 환경에서 구리〔Ⅱ〕이온과 일종의 복합체를 형성하면서, 단실형광체의 형광을 감소시키게 된다. 이러한 구리〔Ⅱ〕이온과 결합된 형광 펩타이드 센서는 특정 음이온 화합물에 대해 선택적인 결합에 의하여 구리이온의 단실과의 결합이 약화되며 이로 인하여의 단실 형광체의 증폭 형광 효과를 나타내게 되는 것이다.
상기 증폭 형광 효과는 pH 7.0 ~ 8.0의 수용액 환경 조건에서 보다 우수하여 보다 바람직하게 피로인산염(pyrophosphate, PPi) 및 ATP과 같은 음이온 화합물을 검출할 수 있다. 이 때, 상기 형광 펩타이드 센서의 킬레이트 증폭을 위한 여기 파장은 300 ~ 360 nm 범위일 때, 500 ~ 600 nm 파장의 형광을 발광하여 보다 바람직하게 상기 음이온 화합물을 검출할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 신규한 형광 펩타이드는 구리〔Ⅱ〕이온의 존재하에서 피로인산염(pyrophosphate, PPi) 및 ATP과 같은 음이온 화합물과 반응하여 높은 형광증가를 나타내어, 형광 화학 센서로 유용하게 적용될 수 있는 효과가 있다. 또한, 종래에는 유기용매 존재 하에서만 음이온을 검출할 수 있었던 반면, 본 발명에 따른 신규한 형광 펩타이드 센서는 100 % 수용액 하에서도 음이온 화합물을 검출할 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명은 상기 펩타이드 센서를 이용한 음이온 화합물의 검출방법을 제공함으로써, 생체 내의 신호 전달 및 에너지 저장과 관련된 연구 분야에 유용하게 적용될 수 있는 효과가 있다.
이하, 본 발명을 다음의 실시 예에 의하여 더욱 상세하게 설명하겠는 바, 본 발명의 실시 예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
형광 펩타이드 센서(Dansyl-Gly-His-CONH 2 )의 제조
링크 아마이드 메틸벤즈하이드릴 아민 수지(147 mg, 0.1 mmol)를 3 ml의 디메틸포름아마이드(DMF) 무수(anhydrous) 유기용매에 넣고, 약 30 분간 팽윤 시켰다. 별도로, 1.5 mL의 DMF 무수 유기 용매에 0.3 mmol의 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc)-L-Histidine acid(158 mg), 카르복실기 활성제인 N,N-Diisopropyl carbodiimde(DIC,48 ㎕), 및 첨가보조제인 N-Hydrobenzotriazole(HOBt, 40 mg)를 첨가 및 혼합하여 약 20 분간 활성화시켰다. 상기 활성화시킨 용액과 수지를 2시간 교반 하여 반응 시킨 후 반응 용액을 걸러내고, 수지를 DMF와 메탄올로 수차례 세척한 후, kaiser 테스트를 실행한다. kaiser 테스트가 양성으로 나오면 상기의 활성화 용액을 다시 만들어 첨가하다. 음성이 나올 경우 DMF 용매에 50 중량% 농도로 녹아있는 피페리딘 용액 3 ml와 혼합하여 약 15 분간 반응시켜, N-말단의 Fmoc 그룹을 제거한 후, 다음 순서의 아미노산을 동일한 방법으로 활성화 하여 고체상 수지에 붙어 있는 아미노산과 반응시킨다.
펩타이드 부분의 합성이 완료되면, 50 중량% 피페리딘/DMF을 이용해 N-말단의 Fmoc 그룹을 제거하고, 무수 DMF용매 내에 단실 클로라이드(Dansyl Cholride) 0.3 mmol과 디아이소프로필에틸아민(DIPEA) 0.6 mmol을 혼합한 혼합용액을 상기의 수지와 혼합한 후, 상온에서 3시간 동안 적절한 속도로 교반시킨다.
수지에 붙어있는 형광 펩타이드는 cleavage 용액(trifluoroacetic acid (90%), trimethylsilane(5%), Water(5%))과 상온에서 반응시켜 (4hr) 아미노산의 곁사슬(side chain) 보호기(protection group)의 제거와 수지(resin)로부터 펩타이드를 분리한다.
여과된 형광 펩타이드 용액의 트리플루오로아세틸산(trifluoroacetic acid)은 질소 기체를 통과시켜 제거하였고, - 20℃로 냉각된 디에틸에테르(diethyl ether)를 첨가한 후, 침전된 펩타이드를 원심분리기(3,000 rpm, 20min)로 분리하였다. 이렇게 얻어진 형광 펩타이드는 역상 HPLC (C-18 칼럼delta pak C18-300A, 1.9* 30cm)을 이용하여 정제하였다.(Eluent : water/acetonitrile in 0.1% TFA (gradient) : Flow Rate 2.5mL/min). 도 1에서 나타난 바와 같이 형광 펩타이드는 ESI-Mass 질량분석기를 이용하여 444.34 분자량의 Dans-Gly-His-NH2 센서 물질을 확인할 수 있었다.
실시예 2
형광 펩타이드 센서(Dansyl-Gly-Gly-His-COOH)의 제조
실시예 1에서 사용한 링크 아마이드 메틸벤즈하이드릴 아민 수지 대신 wang 수지를 사용하였으며 해당 형광 펩타이드 제조 방법은 상기 실시예 1과 동일하게 수행하였다. 도 2에서 나타난 바와 같이 형광 펩타이드는 ESI-Mass 질량분석기를 이용하여 501.11 분자량의 Dans-Gly-Gly-His-NH2 센서 물질을 확인할 수 있었다.
실험예 1: 형광 실험
구리이온(Cu 2+ ) 존재하에, 실시예 1의 Dansyl-Gly-His-CONH 2 와 여러 음이온들의 결합 분석을 위한 형광 실험
상기 실시예 1에서 제조된 형광 펩타이드의 구리 이온 존재하에서 피로인산염(PPi) 또는 여러 가지 음이온(ATP, ADP, AMP, Pi, HSO4 -, CH3COO-, I-, Br-, Cl- 및 F-) 간의 결합 성질을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
상기 음이온 (TP, ADP, AMP, Pi, HSO4 -, CH3COO-, I-, Br-, Cl- 및 F-)을 갖는 테트라부틸암모늄염의 저장용액(10mM)과 구리이온을 갖는 과산화염소염의 저장용액(1mM)을 10 mM HEPES (pH 7.4) 완충액을 사용하여 제조하였다. 상기 실시예 1의 형광펩타이드( Dansyl-Gly-His-CONH 2 )의 저장액 (1 mM)은 이중으로 증류한 탈염수를 사용하여 제조하였다. 상기 저장액들은 제조 당일에 사용하였다.
시험 용액은 시험관 내로 탐침 저장 용액(본 발명의 화학식 1의 화합물 저장 용액)의 최종 농도가, 10 mM HEPES (pH 7.4) 완충액으로 2 ㎖용액에서 10 μM이 되도록 20μl 을 넣고, 여기에 최종 구리이온 농도가 10 μM이 되게 20μl을 넣고 10 분 후, 위 시험용액에 PPi 및 각 음이온 (ATP, ADP, AMP, Pi, HSO4 -, CH3COO-, I-, Br-, Cl- 및 F-) 저장 용액의 앨리쿼트를 20 당량(200μM) 되도록 40 ㎕ 첨가한 후, 모든 형광변화는 형광분광광도계 (ParkinElmer LS 55 Luminescence Spectrometer)를 사용하고, 여기 파장은 330 ㎚, 여기 및 방출 슬릿폭은 3 ㎚로 측정하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 나타난 바와 같이, pH 7.4에서, 구리이온(1당량) 존재 하에, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물의 최종 농도가 10 μΜ 일 때, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물의 방출 스펙트럼은 PPi 20 당량 첨가에 대해 선택적인 형광 증폭 효과를 나타내며 ATP 20 당량 첨가에 대해서도 약간의 형광증가를 보이는 반면, 20당량의 다른 음이온의 첨가에 대해서는 어떠한 변화도 나타내지 않았다.
구리이온(Cu 2+ ) 존재 하에, 실시예 1의 Dansyl-Gly-His-CONH 2 와 PPi의 결합 성질 분석을 위한 형광 적정 실험
구리이온 존재 하에, 본 발명의 실시예 1의 화합물 Dansyl-Gly-His-CONH 2 와 PPi간의 결합 성질을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. PPi를 갖는 테트라부틸 암모늄염의 저장 용액 (10mM)을 10mM HEPES (pH 7.4) 완충액을 사용하여 제조하였다. 또한, 상기 실시예 1 에서 제조한 화학식 1의 화합물의 저장액 (1mM)과 구리이온(Cu2+)을 갖는 저장용액(1mM)은 이중으로 증류한 탈염수를 사용하여 제조하였다. 상기 저장액들은 제조 당일에 사용하였다.
시험 용액은 시험관 내로 탐침 저장 용액 (본 발명의 화학식 1의 화합물 저장 용액)의 최종 농도가 10 μM 되도록 20 ㎕ 담고, 구리이온(Cu2+) 저장용액의 앨리쿼트를 1 당량이 되도록 20 ㎕ 담아 복합체를 형성한 후, PPi 저장 용액의 앨리쿼트를 1 ~ 8당량이 되도록 20 ~ 160 ㎕ 첨가한다. 10 mM HEPES (pH 7.4) 완충액으로 용액을 2 ㎖로 희석하여 사용하였으며, 모든 형광변화는, 여기 파장은 330 ㎚, 여기 및 방출 슬릿폭은 3 ㎚로 측정하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, pH 7.4에서 구리이온 존재 하에, 본 발명의 화학식 1 화합물(최종 농도가 10 μM)은, PPi의 첨가량이 1에서 20당량까지 늘어남에 따라 점차적인 형광 증폭 효과를 나타냈다. PPi와의 적정실험을 통해, 본 발명의 실시예 1의 화합물 Dansyl - Gly - His - CONH 2 , 구리(Ⅱ)이온과 PPi와의 결합 상수는 2.8× 104 M-1임을 알 수 있었다.
구리이온(Cu 2+ ) 존재하에, 실시예 2의 Dansyl-Gly-Gly-His-COOH 와 여러 음이온들의 결합 분석을 위한 형광 실험
상기 실시예 2에서 제조된 형광 펩타이드의 구리 이온존재하에서 피로인산염(PPi) 또는 여러 가지 음이온(ATP, ADP, AMP, Pi, HSO4 -, CH3COO-, I-, Br-, Cl- 및 F-) 간의 결합 성질을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
상기 음이온 (ATP, ADP, AMP, Pi, HSO4 -, CH3COO-, I-, Br-, Cl- 및 F-)을 갖는 테트라부틸암모늄염의 저장용액(10mM)과 구리이온을 갖는 과산화염소염의 저장용액(1mM)을 10mM HEPES (pH 7.4) 완충액을 사용하여 제조하였다. 화학식1의 형광펩타이드( Dansyl-Gly-Gly-His-COOH )의 저장액 (1 mM)은 이중으로 증류한 탈염수를 사용하여 제조하였다. 상기 저장액들은 제조 당일에 사용하였다.
시험 용액은 시험관 내로 탐침 저장 용액(본 발명의 화학식 1의 화합물 저장 용액)의 최종 농도가, 10 mM HEPES (pH 7.4) 완충액으로 2 ㎖용액에서 10 μM이 되도록 20μl 을 넣고, 여기에 최종 구리이온 농도가 10 μM이 되게 20μl을 넣고 10 분 후, 위 시험용액에 PPi 및 각 음이온 (ATP, ADP, AMP, Pi, HSO4 -, CH3COO-, I-, Br-, Cl- 및 F-) 저장 용액의 앨리쿼트를 20 당량(200μM) 되도록 40 ㎕ 첨가한 후, 모든 형광변화는 형광분광광도계 (ParkinElmer LS 55 Luminescence Spectrometer)를 사용하고, 여기 파장은 330 ㎚, 여기 및 방출 슬릿폭은 3㎚로 측정하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 나타난 바와 같이, pH 7.4에서, 구리이온(1당량) 존재 하에, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물의 최종 농도가 10 μΜ 일 때, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물의 방출 스펙트럼은 PPi 20 당량 첨가에 대해 강한 형광 증폭 효과를 나타내며 ATP 및 ADP 20 당량 첨가에 대해서도 약간의 형광증가를 보이는 반면, 20 당량의 다른 음이온의 첨가에 대해서는 어떠한 변화도 나타내지 않았다.
구리이온(Cu 2+ ) 존재 하에, 실시예 2의 Dansyl-Gly-Gly-His-COOH와 PPi의 결합 성질 분석을 위한 형광 적정 실험
구리이온 존재 하에, 본 발명의 실시예 2의 화합물 Dansyl-Gly-Gly-His-COOH 와 PPi간의 결합 성질을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. PPi를 갖는 테트라부틸 암모늄염의 저장 용액 (10mM)을 10mM HEPES (pH 7.4) 완충액을 사용하여 제조하였다. 또한, 상기 실시예 2에서 제조한 화합물의 저장액 (1mM)과 구리이온(Mn2+)을 갖는 저장용액(1mM)은 이중으로 증류한 탈염수를 사용하여 제조하였다. 상기 저장액들은 제조 당일에 사용하였다.
시험 용액은 시험관 내로 탐침 저장 용액 (본 발명의 실시예 2의 화합물 저장 용액)의 최종 농도가 10 μM 되도록 20 ㎕ 담고, 구리이온(Cu2 +) 저장용액의 앨리쿼트를 1 당량이 되도록 20 ㎕ 담아 복합체를 형성한 후, PPi 저장 용액의 앨리쿼트를 1 ~ 8당량이 되도록 20~ 160 ㎕ 첨가한다. 10 mM HEPES (pH 7.4) 완충액으로 용액을 2 ㎖로 희석하여 사용하였으며, 모든 형광변화는, 여기 파장은 330 ㎚, 여기 및 방출 슬릿폭은 3 ㎚로 측정하여 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, pH 7.4에서 구리이온 존재 하에, 본 발명의 화학식 1의 화합물(최종 농도가 10 μM)은, PPi의 첨가량이 1에서 20당량까지 늘어남에 따라 점차적인 형광 증폭 효과를 나타냈다. PPi와의 적정실험을 통해, 본 발명의 실시예 2의 화합물 Dansyl - Gly - Gly - His - COOH , 구리(Ⅱ)이온과 PPi와의 결합 상수는 5.2× 104 M-1임을 알 수 있었다.

Claims (5)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 형광 펩타이드 센서.
    [화학식 1]
    상기 화학식 1에서, l과 m은 각각 1 ≤ l ≤ 2, 1 ≤ m ≤ 3인 정수이고,
    R은 NH2, NHR1(R1은 탄소수 1 ~ 18 알킬기이다.), OH, OR1(R1은 탄소수 1 ~ 18 알킬기이다.), (OCH2CH2)n-COOH(n은 2 ~ 5000의 정수이다.), (OCH2CH2)n-polystyrene (n은 2 ~ 5000의 정수이다.) 또는 아미노산이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 형광 펩타이드 센서는 l 및 m이 각각 1이고, R은 -NH2인 것을 특징으로 하는 형광 펩타이드 센서.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 형광 펩타이드 센서는 l이 2이고, m이 1인 것을 특징으로 하는 형광 펩타이드 센서.
  4. 제 1 항 내지 3 항 중에서 선택된 형광 펩타이드 센서를 이용한 음이온 화합물의 검출방법으로써, 상기 검출은 구리이온(Cu2+)의 존재하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 음이온 화합물의 검출방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 음이온 화합물은 피로인산염(pyrophosphate, PPi) 및 아데노신트리포스페이트(ATP) 중에서 선택된 화합물인 것을 특징으로 하는 음이온 화합물의 검출방법.
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