KR20090087748A - 전기수력학 프린팅 기법을 이용한 살아있는 세포의 직접패터닝 방법 및 장치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 살아있는 생물세포의 미세패터닝 기술에 관한 것이다. 본 발명에서는 전기수력학적(electrohydrodynamic) 프린팅방식을 이용하여 직접적이고 빠르며 효율적으로 박테리아를 미세패터닝하는 방법, 이에 의해 형성된 미세패턴화된 생물세포를 포함하는 기판을 제공한다. 또한 살아있는 박테리아 세포의 패터닝형성을 위한 최적조건을 제공한다. 본 발명에 의하여 패터닝된 세포가 생존함을 실험을 통하여 확인하였다. 본 발명은 살아있는 세포의 생존률을 극대화하면서 패턴의 레졸루션을 최대화할 수 있도록 하는 바이오잉크를 제공하며, 또한 생세포를 패턴화하여 배양함으로써 조직공학, 생물-전자적장치, 바이오칩 등에 이용할 수 있는 바이오페이퍼를 제공한다.

EHD, 박테리아세포, 패터닝

Description

전기수력학 프린팅 기법을 이용한 살아있는 세포의 직접 패터닝 방법 및 장치{Method for Direct Patterning of live Cells using Electrohydrodynamic Printing Method and Device therefor}

본 발명은 살아있는 세포를 패터닝하는 방법 및 이를 위한 장치, 이러한 방법에 의하여 패턴화된 세포를 포함하는 제품에 관한 것이다.

생세포(生細胞) 패터닝 기술은 세포성장을 조절하고, 세포를 기반으로 한 고정밀도의 분석방법의 개발, 조직공학, 생물-전자적 장치(bio-electronic devices)의 개발에 사용될 수 있는 중요한 기술이다. 세포의 미세패터닝과 국소공간상 배열은 세포공학 또는 조직공학분야에서 배양접시나 스캐폴드(scaffold) 위에 다양한 종류의 세포를 다루고 배치하는데 쓰여왔다.

생체물질의 미세패터닝 기술에 관련된 많은 연구가 되고 있으며, PDMS 스탬핑(Polydimethylsiloxane stamping), 미세유로법(microfluidic channeling), LGDW(laser guided direct writing) 및 잉크젯프린팅은 세포패터닝과 조직공학 분야의 떠오르는 기술이다.

PDMS 스탬핑과 미세유로 패터닝(microfluidic channel patterning) 방법은 세포나 생체물질의 패터닝을 위해 마이크로 단위의 유로 구조를 이용한다[Noytmer PD 등 J Aero Sci 2000;31:1165-1172; Dertinger SKW 등 Anal Chem 2001;73:1240-1246; Takayama S 등 Proc Natl Acad Sci 1999;96:5545-5548]. 이들 방법은 단일세포 패터닝이 가능한 고해상도를 얻을 수 있는 강력한 방법이나 포토리소그래피 과정을 필요로 한다는 단점이 있다. 포토리소그래피공정을 사용하여야 한다는 것은 제조과정이 오래 걸리고, 복잡하고 정교한 제조과정이 필요하다는 것을 의미한다.

LGDW(laser guided direct writing) 방법도 단일 세포를 조절할 수 있다는 장점이 있으나, 공정이 너무 느리고 장치가 너무 비싸다는 단점이 있다.

잉크젯 프린팅은 상용화되어 있는 잉크젯프린터를 사용하므로 응용이 쉽고 저가이며 속도가 빠르고 조작이 쉽다는 장점이 있다. 따라서 잉크젯프린터를 사용하여 박테리아 콜로니 어레이를 패턴화하려는 시도가 되었으나[Roth EA 등 Biomaterials 2004;25:3707-3715; Xu T 등 Biomaterials 2005;26:93-99 ], 프린터의 노즐이 너무 작아서 노즐막힘현상이 자주 일어나며 버블스프레이를 하기 위한 열처리과정이 열(heat)에 민감한 생체물질에 문제를 일으킨다는 단점이 있다. 열에 의한 생체물질에의 영향은 특히 생세포를 패턴화할 때 더욱 심각하다. 따라서 열에 약한 생물세포의 생존에 영향을 주지 않으면서, 저비용으로 빠르고 쉽게 미세패턴닝을 할 수 있는 기술의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

한편, 프린팅 기법 중에는 직접 쓰기 방식 중의 하나인 전기-수력학적 (electro-hydrodynamic; EHD) 방식이 있는데 이는 몇 가지 장점을 가지고 있다[Regele JD 등 J Aero Sci 2002;33:1471-1479]. 첫째로 이 방식은 공급 전압, 공급 유량, 그리고 분무액의 물리, 전기적인 성질의 조절로 미세하게 분무된 얇은 패턴을 만들 수 있다. 둘째로, 이 방식은 고강도의 전장에 의하여 유도되는 전기동력학적 (electorkinetic) 힘에 의하여 구동되기 때문에, 분사액의 표면장력의 세기가 적절하다면 노즐의 크기가 작을 필요가 없다. 따라서 잉크 젯 방식(약 20 μm)보다 큰 노즐 직경(100 μm)으로도 50 ~ 200 μm 정도 두께의 선폭을 가진 패터닝 구현이 가능하다. 큰 노즐 직경은 노즐의 막힘 현상을 줄이고 열에 의한 문제가 없으며 다양한 생체물질의 패터닝을 가능하게 한다. 세번째로 이 방식은 어떠한 리소그래피(lithography) 공정도 쓰지 않고 기판 위에 직접 패턴을 생성할 수 있다.

EHD 방식은 비 생체물질의 전자회로 구성의 핵심 기술로 제시되었으며[Lee DY 등 Appl Phys Lett 2007;90:081905], 20nm지름의 SiO2 입자를 quarts 기판 위에 약 60 μm 두께를 가진 선폭으로 패터닝시키는데 사용되었다[Wang DZ 등 J Nanoparticle Research 2005;3:301-306]. 또한 EHD 방식을 이용하여 은 나노입자를 수십 마이크로미터의 선폭을 가진 패턴으로 만들 수 있음이 보고된 바 있다[Lee DY 등 Appl Phys A 2006;82:671-674]. 생체물질의 경우에는 본 발명자들에 의하여 세포고정용 콜라겐을 기판 위에 패터닝하는데 성공하였으며[Kim HS 등 Experimental Techniques 2007;online publication; 등록특허 10-0740228호], Lee JG 등은 DNA 마이크로패턴을 만들어 낼 수 있음을 보고하였다 [Lee JG 등 Biosensors Bioelectronics 2006; 21:2240-2247].

그러나 살아있는 박테리아 세포를 EHD 방식을 이용하여 직접적으로 패터닝하는 것에 대한 연구는 보고된 바 없다.

직접적이고 빠르며 효율적으로 살아있는 박테리아세포를 미세 패터닝하는 방법을 개발하고, 이를 위한 최적 조건을 찾는 것이 본 발명에서 해결하고자 하는 과제이다.

상기 과제를 해결하기 위하여 지속적인 연구를 한 결과, 본 발명자들은 Electro-hydrodynamic(EHD) 기법을 이용하여 멤브레인 필터 위에 살아있는 박테리아 세포를 원하는 패턴으로 효율적으로 직접 프린팅하는 방법을 개발하여 본 발명에 이르게 되었다. 이렇게 패터닝된 박테리아 세포는 nutrient agar 위에서 생장함을 확인하였다. 또한 본 발명은 생세포 패터닝을 효율적으로 하기 위한 최적조건을 제공한다.

본 발명에 의하여 제공되는 EHD 기법을 이용한 방식은 생세포를 살아있는 상태로 유지하며 미세하게 분무된 얇은 패턴을 만들 수 있도록 한다. 또한 잉크 젯 방식보다 큰 노즐직경으로도 50~200㎛정도 두께의 선폭을 가진 생체물질의 패터닝 구현이 가능하고, 리소그래피공정을 쓰지 않고 기판 위에 직접 패턴을 생성할 수 있다. 따라서 본 발명에서 제공하는 EHD 프린팅 방법은 살아있는 세포를 빠르고 직 접적으로 또한 즉각적으로 저비용으로 고해상도의 패턴형성을 할 수 있도록 한다.

또한 본 발명에 의한 EHD 방법은 non-contact 방법이기 때문에 생세포의 3차원 패터닝에 응용이 가능하다.

본 발명은 살아있는 세포의 생존률을 극대화하면서 패턴의 레졸루션을 최대화할 수 있도록 하는 바이오잉크를 제공하며, 또한 생세포를 패턴화하여 배양함으로써 조직공학, 생물-전자적장치, 바이오칩 등에 이용할 수 있는 바이오페이퍼를 제공한다.

본 발명에 의한 EHD기법은 유전자 발현 연구, 신약 스크리닝, 독성측정 등의 환경 감시 연구 등에 쓰이는 박테리아 세포의 바이오센서에 응용할 수 있으며 또한 세포공학이나 조직공학분야 등에서 다양하게 활용될 수 있다.

본 발명은 상술한 기술적 과제를 달성하기 위한 하나의 태양으로, 살아있는 세포를 기판상에 패터닝하는 방법으로서, 상기 살아있는 세포의 용액을 제조하는 단계; 제조된 세포용액을 일정한 수력학적 압력으로 분사하는 바늘과, 상기 바늘과 대응되는 위치에 소정거리로 이격된 거리에 핀형상의 접지전극을 제공하는 단계; 상기 바늘과 상기 접지전극사이에 멤브레인 필터 기판을 위치시키는 단계; 상기 바늘로부터 상기 용액이 분사될 때 상기 바늘과 상기 접지전극 사이에 전압을 인가하는 단계; 상기 용액이 분사되는 동안 상기 기판을 미리 설정된 패턴형상으로 이동시키면서 상기 용액을 기판에 부착시키는 단계; 및 상기 패턴이 형성된 기판을 영 양아가배지 (nutrient agar media)와 접촉시켜 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 살아있는 세포의 패터닝 방법을 제공한다.

또한, 상기 세포용액이 에틸렌글리콜, 인산완충액, 염화나트륨으로 구성된 군으로부터 하나 이상 선택한 것을 포함하는 것인 살아있는 세포의 패터닝 방법을 제공한다.

또한, 상기 세포용액 내 에틸렌글리콜 함량이 40% 이하인 것인 살아있는 세포의 패터닝 방법을 제공한다.

또한 상기 세포용액 내 인산완충액(phosphate buffer)의 농도가 10mM 이하인 것인 살아있는 세포의 패터닝 방법을 제공한다.

또한 상기 세포용액 내 염화나트륨의 농도가 10mM 이하인 것인 살아있는 세포의 패터닝 방법을 제공한다.

또한 상기 세포의 패터닝 방법에 있어서, 인가하는 전압이 4 내지 8.5 kV인 것인 살아있는 세포의 패터닝 방법을 제공한다.

또한 상기 세포의 패터닝 방법에 있어서, 살아있는 세포가 박테리아세포인 것인 살아있는 세포의 패터닝 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 패턴화된 생세포를 포함하는 기판을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 패턴화된 생세포를 포함하는 기판을 포함하는 제품을 제공한다. 상기 제품으로는 항생제 개발을 위한 시약 검색용 바이오센서, 질병 확인을 위한 의료용 바이오센서, 조직공학용 제품 등을 들 수 있 다.

또한 본 발명은 살아있는 세포의 생존률을 극대화하면서 패턴의 레졸루션을 최대화할 수 있도록 하는 바이오잉크를 제공한다.

또한 생세포를 패턴화하여 배양함으로써 조직공학, 생물-전자적장치, 바이오칩 등에 이용할 수 있는 바이오페이퍼를 제공한다.

본 발명의 발명자들은 EHD 프린팅 기법을 이용한 최초의 생존한 박테리아 콜로니 패턴을 형성할 수 있었다. 컴퓨터와 콘트롤러에 의하여 조절되는 EHD 장치를 사용하여 브로쓰 배지(broth media)내의 E. coli 세포를 분사하여 박테리아 콜로니 패턴을 형성시켰다. 멤브레인 필터 위에 패터닝을 하고 agar media 위에서 배양함으로서 박테리아 콜로니 패턴을 만들어 내었다. 생성된 패턴의 넓이는 약 150um 이었으며, 생성된 패턴 내의 박테리아 세포는 살아 있는 상태인 것이 확인되었다. 본 발명에 의한 EHD 프린팅 방법은 살아있는 세포를 빠르고 저비용으로 고해상도의 패턴형성을 할 수 있도록 하는데 성공적이었다. 또한 기존 방법보다 더 큰 직경을 가진 노즐을 통하여 얇은 선폭을 가진 안정적인 분사 액적을 이용하여 직접적이고 효율적이며 빠른 패터닝이 가능하였다. 본 발명에서 제공하는 분사용액은 살아있는 세포의 생존률을 극대화하면서 패턴의 레졸루션을 최대화할 수 있도록 하는 바이오잉크로 사용가능하다.

EHD 분무에 있어서는 인가되는 전압의 크기 및 접지형상의 변화에 따라 분무되는 형태가 변화되어, 적하모드, 마이크로적하모드, 원뿔형 액주모드, 불안정한 액주모드, 스프레이모드 등과 같은 일련의 분무모드를 제어할 수 있게 된다. 이러 한 분무모드는 그 용도에 따라 다양하게 응용이 가능하게 된다. 미세하고 단락없이 원하는 위치에 소정의 패턴을 형성하기 위해서는 원뿔형액주모드(cone-jet mode) 가 바람직하다.

EHD 프린팅용 기판으로서는 보통 폴리마이드 필름, 실리콘 웨이퍼, 현미경에 쓰이는 커버글라스가 사용된다. 생세포를 잉크젯 방식으로 패터닝을 할 경우는 커버글라스 위에 agar 배지를 코팅하여 분사하면 되지만, EHD 방식의 경우 방전의 위험이 있기 때문에 사용할 수가 없다. 따라서 본 발명에서는 멤브레인 필터를 사용하여 박테리아 배양에 필수적인 agar 배지를 흡수하도록 시도하였다. 멤브레인 필터를 사용하면 분사 직후 흡수가 되어 패턴이 옆으로 퍼지지 않고 더욱 가늘게 형성된다는 것을 확인하였다. 본 발명의 기판은 또한 생세포를 패턴화하여 배양함으로써 조직공학, 생물-전자적장치, 바이오칩 등에 이용할 수 있는 바이오페이퍼로 사용가능하다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명의 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되어 지는 것이므로 본 발명의 범위가 아래에서 이들로 인해 한정되어지는 것으로 해석되어서는 안된다.

< 실시예 1> 생세포의 미세패터닝을 위한 프린팅 시스템

본 발명에 따른 생세포의 미세패터닝을 위한 EHD 프린팅 시스템은 용액 분사구와 전극 조정부, 기판 이동부 및 시스템 작동용 컴퓨터와 전원공급 장치의 4개의 중요부분들로 이루어 진다(도 1).

용액분사구는 마이크로 주사 펌프(micro syringe pump)와 5ml주사기, 주사바늘로 이루어져 있다. 용액이 분사되는 액적은 바늘 끝에 공급되는 용액의 공급 유량에 의해 달라질 수 있으며, 이 공급 유량을 직접적으로 주사 펌프의 동작에 연관되어 있다. 상기 주사 펌프(KDscientific, USA)는 공급 유량이 최저 0.06㎕/min. 까지 가능하다. 주사 바늘은 0.15mm, 외경 0.35mm의 스테인리스 스틸 재질이다. 상기 주사펌프는 기판 표면에서 수직 방향으로 조절되게끔 장착되어 주사 바늘과 전극, 기판 간 거리 조절을 가능하다.

전극 조정부는 도 1에서와 같이 3축 병진 이동 스테이지와 아크릴 구조물로 구성된다. 전극은 이 아크릴 구조물의 끝부분에 탑재되며, 주사 바늘의 끝과 일직선을 이루도록 3축 병진 이동 스테이지를 이용하여 조정 가능하다. 상기 전극은 송곳처럼 생긴 알루미늄 재질 구성이며 직경은 2mm이다. 주사 바늘과 전극 간 거리는 EHD 프린팅의 최적화를 위해 조정되어야 하는 중요한 요소이다.

기판 이동부는 기판을 고정하기 위한 아크릴 틀과 리니어 모터를 개조한 2축 병진 전동 스테이지(DCT,Korea)로 구성되며, 2축 병진 전동 스테이지는 최소 2㎛거리를 이동할 수 있으며 이동속도는 이 실험에서 최저 125mm/min에서 최고 500mm/mim까지 조절된다. 상기 기판 이동부는 전동 스테이지의 움직임을 반영하기 위해 기판과 고정된 상태로 움직이며, 2축 병진 전동 스테이지는 컴퓨터와 컨트롤 프로그램(DCT,Korea)에 의해 자동적으로 조절된다.

본 발명에 있어서 기판은 멤브레인 필터를 사용한다. 사용 가능한 멤브레인 필터로는 Durapore membrane ( Milipore , USA ) 등을 들 수 있으며 이에 제한되는 것은 아니다. 잉크젯 기법에서는 박테리아 세포 패터닝을 위해 nutrient agar가 코팅된 cover glass가 기판으로 쓰였다. 하지만 본 발명의 발명자들은 높은 직류전압을 쓰는 EHD 프린팅 기법에서는 이 nutrient agar의 높은 전기 전도도에 의해 코로나 방전이 발생하기 때문에 주사 바늘과 전극 사이에 위치하는 기판의 재질로서 적합하지 않다고 판단하여 멤브레인 필터(HVLP 04700, Durapore membrane, Millipore, USA)를 기판의 재질로써 채택하였다. 이 멤브레인 필터는 부도체로서 작용하며, 친수성이고 생체친화적인 성질을 가지고 있으며, 약 0.45㎛ 직경의 수 백만 개의 천공으로 만들어져 있다. 이 천공 구조에 의해 멤브레인 필터는 배양기간 동안 박테리아 세포 성장을 위한 agar media의 흡수가 쉽게 이루어진다. 상용화된 멤브레인 필터는 직경 47mm에 125㎛의 두께를 가진 원 모양이지만 cover glass(24mm ×60mm ×1mm)에 맞게 부착하기 위해 절단되었다.

전원 공급 장치(KSC,Korea)는 최대 30kV의 전류전압을 공급할 수 있다. 또한 이 장치에 의한 전류는 코로나 방전을 방지히고 거의 순수한 전기장에 의한 인력을 발생하게 하기 위해 수 uA의 전류로 고정한다. 이러한 고전압 환경하에서는 아주 미약한 전류라도 박테리아 세포에 유해할 수 있고, 공급전압은 분사액적의 형성을 결정짓는 가장 중요한 요소 중의 하나이므로 최적 전압의 결정이 주요하다.

< 실시예 2> 생세포를 패터닝하기 위한 용액

생세포를 EHD 분무 방식으로 패터닝하기 위한 용액의 한 예로 박테리아인 E.coli 를 포함하는 용액을 제조하였다. E. coli(ATCC 47013: 항생제 저항성 strain임)를 Difco^TM broth(BD, USA)에 24시간 동안 37℃에서 배양하였고 앰피실린(ampicillin; Sigma Aldrich cat.A0166)를 1mL당 1㎕씩 첨가하였다. 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 모든 박테리아 용액의 농도를 2.5×10⁸ cells/ml로 고정하였다. 이 용액에는 글리세린, 에틸렌글리콜, 인산완충액, 염화나트륨 등이 포함될 수 있다.

EHD 프린팅 방법은 용액의 점도, 용액의 전기전도도, 용액의 유량 및 인가된 전압 등에 의하여 영향을 받는다. 점도가 높을수록 더 작은 직경의 안정된 제트를 갖는 원뿔형 액주모드(cone-jet mode)에서의 분무가 가능하다. 이를 위하여 젤라틴, 글리세린, 에틸렌글리콜 등이 추가될 수 있다. 또한 패터닝 용액에 소정의 전기전도도를 부여할 수 있도록 염화나트륨이 첨가될 수 있다. 또한 세포 생존과 에틸렌글리콜의 독성을 완화하기 위하여 인산완충액 또는 염화나트륨을 첨가할 수 있다.

< 실시예 3> 생세포의 EHD 프린팅 기법에 의한 패터닝 과정

EHD 프린팅 장치를 이용하여 생세포를 기판 상에 패터닝하는 과정은 다음과 같다. 전극을 통하여 주사바늘에 적절한 전압을 인가하며, 미리 입력된 패턴형상에 따라 기판을 이동시키면서 패터닝할 생세포 용액을 마이크로 주사펌프를 이용하여 주사바늘로부터 분무시킨다.

주사기에 용액을 충전하기에 앞서 주사기와 주사 바늘을 70%알코올로 소독 및 건조하였다. 주사 바늘과 전극 간 거리는 전기력 발생과 전기장 발생과 깊게 연관되어 있다. Coulomb 법칙에 의해 두 전극 사이의 정전기력의 양은 대전된 전극 간 거리의 제곱에 반비례한다. 하지만 몇 번의 실험의 결과 액적 분사는 두 전극 간 거리가 너무 가까운 경우 불안정해지는 경향을 보였다. 이러한 현상은 두 전극이 cover glass에 너무 근접하였을 경우 발생하는 cover glass 표면 상의 강한 분극 현상 때문일 수 있다. 이 실험에서 주사 바늘과 전극 간 거리는 3mm로 하였으며, 기판은 이 두 전극 가운데에 위치하게 되어 주사 바늘과 기판 간 거리는 1mm, 기판과 전극 간 거리 또한 1mm 었다. 2축 병진 진동 스테이지를 조정함으로써 E.coli 혼합 용액의 액적이 일정 경로를 따라 멤브레인 필터 표면 위에 분사되었다. 상기 경로의 설정을 위해 Motion Control Unit(MCU) 프로그램이 사용되었다. 공급유량은 1.5㎕/min, 스테이지 이동속도는 500mm/min 이었다. 인가전압은 6.5kV 이었다.

< 실시예 4> 패터닝된 박테리아의 콜로니 배양

멤프레인 필터 위에 패터닝된 박테리아의 배양을 위해 영양아가배지 (nutrient agar media; Difco, USA)를 사용하였다. 배지를 고화시킨 후 앰피실린을 표면에 처리하였다. 프린팅이 완료된 멤브레인 필터를 상기 고체 배치 위에 부착하 고, 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 멤브레인 필터가 nutrient agar를 흡수할 수 있기 때문에, 패터닝된 박테리아가 손상을 받지 않고 생존해 있다면 배양 동안 박테리아 세포가 생존할 수 있다.

박테리아 콜로니가 형성된 후에 E. coli colonoy를 공초점레이저주사현미경 (confocal laser scanning microscope)와 wide-field optical microscope로 관찰하였다. 모든 이미지를 저장하고 길이, 선폭 및 두께를 측정하였다.

< 실시예 5> 패터닝 과정에서의 최적 인가전압의 결정

인가한 전압을 변화시킬 때 최소액적(minimal droplet)을 만드는 최적 조건을 찾았다. Electrokinetic force는 인가 전압이 너무 낮으면 너무 약하고, 전압이 높아질 수록 강해져서 노즐팁에서의 액적의 표면장력을 극복할 수 있을 정도가 된다. 그러나 인가 전압이 최적 조건을 넘어가면 고전압이 떨어지는 운동(dripping motion)을 불안정하게 하고 액적을 크게 만든다.

도 2는 Glass 기판 또는 Kapton® 폴리이미드필름 기판을 사용하였을 때 인가전압을 3kV에서 8.5kV로 변화시킬 때 액적의 평균크기이다. 액적의 평균 크기는 120-950 um이었다. 상기 결과로부터 가장 작은 크기의 안정된 액적을 형성하도록 하기 위해서는 4 내지 8.5 kV가 바람직하며, 4kV -6.5 kV가 더욱 바람직함을 알 수 있다.

< 실시예 7> 생세포 용액 내의 점성부가물의 최적 농도

생세포 용액의 점성물질로 글리세린 등 다른 점성물질보다 에틸렌글리콜(EG)이 액적의 크기면에서 해상도가 더 높았다. EG는 세포의 장기간 보존에 부동액으로서 사용되지만 일반적으로 생세포에 독성이 있는 것으로 알려져 있기 때문이다. 부동용액 하에서 세포 생존은 시간이 지날수록 감소한다. 분사 실험을 시작하기 전에 세포의 생존 시간을 확인하였다. 실시예2에서 제조된 박테리아 용액에 에틸렌글리콜(EG)을 추가하여, E. coli, 증류수(DW), 에틸렌글리콜의 혼합물(E. coli-EG-DW)을 만들었다. E. coli-EG-DW 혼합물의 EG의 부피비를 6단계(0, 20, 40, 60, 80, 그리고 100 vol%)로 나누어 준비하였다. E. coli-EG-DW 용액 하에서 세포 생존 시간을 알아보기 위해 관찰을 수행하였다. 보통 세포는 생존에 가혹하고 독성이 있는 환경에서 서로 뭉치기 시작한다 (cell aggregation). 세포의 aggregation 현상을 식별하기 위해, 용액을 만들기 전에 형광 염색 (SYTO9, Molecular Probe)을 E. coli에 처리하였다. 이 관찰을 통해 100 vol%의 EG 혼합용액의 조건 하에서는 용액을 혼합하자마자 세포의 aggregation이 일어남을 확인할 수 있었다. 용액 혼합 후 4시간까지 60 vol% 이하의 EG가 혼합된 용액에서는 세포의 aggregation이 관찰되지 않았다. 이 결과를 통해 적어도 1시간 이내에 EG 용액 조건 하에서 세포가 사멸치 않고 생존함을 확인할 수 있었다.

EHD 프린팅을 위한 최적의 EG혼합비를 찾아내기 위하여 EG의 상기 부피비에 따른 프린팅 결과를 비교하였다.

프린팅된 E. coli를 EG의 조성 변화를 통해 선형 혹은 원형의 콜로니로 배양해낼 수 있었다. MCU프로그램을 통해 2축 병진 전동 스테이지를 컨트롤하여 패턴을 디자인하였다. 도 3에서 이상적으로 디자인된 선형 패턴을 구현하였을 때 각기 다른 EG 조성 변화에 따라 콜로니 패턴이 달라진 모습을 볼 수 있다.

도 3의 (A)에서 EG 조성이 0 vol% 즉 EG가 포함되어 있지 않은 용액을 분사했을 때, 배양 후 성긴 모양의 콜로니가 형성되었음이 관찰되었다. 이 패턴에서는 종종 패턴이 이루어지지 않은 부분이 있으며 가장 얇은 선폭을 형성한 EHD 패턴에 비해 선폭이 두껍다. 이 완전치 않은 패턴은 DW만 포함하고 EG를 포함하지 않은 박테리아 용액의 낮은 점도가 원인일 수 있다.

EG의 조성이 20 vol% (도 3의 B)와 40 vol% (도 3의 C)에서는 의도했던 대로 얇고 촘촘한 박테리아 콜로니의 선형 패턴이 형성되었음을 확인할 수 있다. EG 조성이 60 vol% (도 3의 D)에서는 콜로니 선폭이 B와 C에서와 비교해서 더 굵어졌다. 따라서 EG조성 60 vol% 미만에서 최적의 조건이 존재함을 예측할 수 있다.

EG 조성이 80 vol% (도 3의 E)에서는 콜로니 패턴이 매우 흐트러지고 거대한 액적으로 형성되어 의도했던 선형 패턴과 거리가 멀고, 세포가 주사 바늘을 막아버렸을 수도 있다. 왜냐하면 뭉쳐진 세포 덩어리는 주사 바늘의 내경인 150 μm 보다 클 수 있기 때문이다.

EHD 프린팅 기법의 성능을 분석하기 위해 confocal laser scanning microscope를 통해 패턴의 높이를 사용하였다. 도 4의 G에서 콜로니 패턴의 3차원 사진을 볼 수 있으며 이 3차원 사진의 밑의 그래프는 G에 표시된 붉은 선을 따라 측정한 단면 높이를 나타내고 있다. 이러한 3차원 사진을 통해 프린트된 E. coli가 성공적으로 멤브레인 필터 위에서 배양되었고 높이 약 50 μm 의 콜로니로 잘 자라 나왔음을 확인할 수 있었다.

또한 EG 조성에 따라 달라진 선형 패턴의 길이와 높이를 현미경으로 측정하였다. 측정 데이터는 8개의 15 mm 박테리아 콜로니 선형 패턴(총합 120 mm)으로부터 분석되었다. 도 5의 그래프 (A)에서 선형 콜로니 패턴의 길이가 EHD 기법에 의해 만들어진 경로 대 실제 구현된 콜로니 구역의 비로 표현되었다. 이 결과에서 EG 조성이 약 20과 40 vol%일 때 가장 높은 구현비를 보였으며, EG조성이 40 vol%일 때 가장 얇은 선폭이 구현됨을 확인하였다(도 5-(B)). 따라서 EG 조성 40 vol%에 의한 선형 콜로니 패턴이 가장 우수한 결과임을 알 수 있었다. 이 조건 하에서 평균 선폭은 약 160 μm 였다.

패턴의 넓이는 EG 농도에 따라 변화하였다. EG 농도가 증가할수록 점도는 증가한다. 그러나 전도도는 감소한다. 이러한 조건이 박테리아 세포의 선명한 패턴을 만들기 위한 안정한 cone-jet mode 에 유리하다. 그러나 EG의 농도가 더 높아지면 세포응집(aggregation)이 일어난다.

< 실시예 8> 생세포 용액 내의 염화나트륨 또는 인산완충액의 최적농도 결정

생세포 용액 내에는 세포의 생존 환경을 조성하고 에틸렌글리콜의 독성을 감소시키기 위하여 염화나트륨 또는 인산완충액을 첨가할 수 있다. 그러나 이들은 용액의 전도도에 영향을 미칠 수 있다. 프린팅 솔루션의 전기전도도와 점도는 분사 액적의 안정도를 결정하는 중요한 두 가지 변수이며, 전기전도도가 낮고 점도가 높을수록 안정된 cone-jet이 만들어지는 경향이 있다[Jayasinghe SN 등 Master Res Inno 2002;6:92 -95]. 따라서 본 발명에서는 염화나트륨 및 인산완충액의 최적의 농도조건을 조사하였다. 점도와 전기전도도는 각각 viscosity meter(SV-10, AND)와 conductivity meter(F-54W, Horiba)에 의하여 측정하였다.

실시예2의 박테리아 용액에 인산완충액(phosphate buffer(PB)),염화나트륨 (NaCl)을 처리하여, E. coli, 증류수, 인산완충액 혼합물(E. coli-EG-PB-DW), E. coli, 증류수, 염화나트륨 혼합물(E. coli-EG-NaCl-DW)을 만들었다.

0.1M, pH 7.4의 인산완충액은 0.9g의 Na₂HPO₄(anhydrous, Phosphate dibasic)와 3.2g의 NaH₂PO₄(anhydrous, Phosphate monobasic)를 증류수(DW)에 녹여 1L로 제조하였다.

PB와 NaCl을 6단계의 다른 농도(0, 10, 20, 40, 80, 그리고 160 mM)로 혼합한 또 다른 혼합물(E. coli-EG-PB-DW, 그리고 E. coli-EG-NaCl-DW)도 준비하였다. E.coli-EG-PB-DW, 와 E. coli-EG-NaCl-DW 혼합물의 점도와 전기전도도를 표 1,2,3,4에 표시하였다.

일정 비율로 혼합된 이 혼합물의 특성을 비교해 보면 EG의 농도 증가가 용액의 전기전도도의 감소와 점도의 증가의 원인이 됨을 알 수 있다.

본 발명의 발명자들은 서로 다른 EG와 PB 조성비에 따른 각 패턴형성을 비교하여 보았다. 도 6은 이의 결과를 광학현미경으로 촬영한 사진이다. 가로방향으로 세 종류로 분류된 사진은 왼쪽부터 차례로 EG 조성 20과 40, 60 vol%를 의미하며 세로방향으로 6종류로 분류된 사진은 위쪽부터 차례로 0과 20, 40, 80, 160mM의 PB가 첨가되었음을 의미한다. EG 조성에 따른 두드러진 변화는 관찰되지 않았고, PB의 첨가량이 증가함에 따라 패턴이 심하게 흐트러짐이 관찰되었다. 이 결과는 PB의 첨가가 전기전도도를 증가시킴으로서 분사 액적을 불안정하게 만들고 이것이 콜로니 패턴 형성을 결과적으로 흐트러뜨렸음을 보여준다. 도 7에서 각 조건에 따른 선폭과 구현비를 그래프로 표현하였다.

E. coli-EG-PB-DW 용액 분사 실험과 유사하게, 박테리아 세포의 생존환경을

개선시키기 위해 염화나트륨(NaCl)을 PB대신 첨가하였다. 마찬가지로 3종류의 EG

조성비와 6단계의 염화나트륨 첨가량을 이용하여 총 18 종류의 혼합물을 준비하였다. 도 8은 서로 다른 EG 조성비와 염화나트륨 첨가량에 따른 패턴 결과를 촬영한 사진이다. 가로방향은 EG 조성비 20과 40, 60 vol%를 의미하며 세로방향은 염화나트륨 첨가량 0과 20, 40 ,80, 160mM을 의미한다. PB 첨가량 변화 실험과 마찬가지로 EG 조성비에 따른 콜로니 패턴 형성은 그 변화의 폭이 미미하였고 염화나트륨 첨가량이 증가함에 따라 패턴의 불안정성도 증가하였다. 도 9에서 각 조성에 따른 선폭과 구현비를 그래프로 표현하였다.

이 실험에서 모든 조성의 용액이 프린팅 및 배양된 후 생존한 박테리아 콜로니 패턴으로 구현되었으나 비교적 높은 PB와 염화나트륨 첨가량을 가진 용액의 콜로니 패턴들은 불안정하거나 서로 겹치는 굵은 원형 모양으로 구현되었다(도 6 및 8). 이러한 결과들은 PB와 염화나트륨의 첨가가 비록 박테리아 세포의 생존에 유리한 환경을 조성하는 데 도움이 되더라도 용액 자체의 전기 전도도를 증가시킴을 의미한다. 이러한 전기 전도도의 증가는 분사 액적의 불안정성을 유발한다. 하지만 PB와 염화나트륨의 첨가는 용액의 점도에는 영향을 미치지 않는 것으로 보인다(도 6 및 8). 왜냐하면 EG가 용액의 점도 특성을 결정짓는 가장 주된 물질이기 때문이다.

도 6 내지 9의 결과는 표 1 내지 4의 전기 전도도와 점도의 측정치와 매우 밀접한 관련이 있다. 표에서 프린팅 용액에 PB와 염화나트륨의 첨가량이 증가할수록 전기 전도도가 빠르게 증가함을 확인할 수 있으며 이러한 함량 변화에 따른 선폭 및 구현비 변화가 긴밀하게 연관됨을 알 수 있다.

결과적으로, 최적의 E. coli-EG-PB-NaCl-DW 프린팅 용액 조성비는 이러한 실험적 방법으로 결정되었다. 우리는 패터닝에서 EG 조성비가 40 vol% 이하일 때, 그리고 최소한의 PB와 염화나트륨 첨가량일 때 최적의 결과를 보임을 확인하였다.

< 실시예 9 > 생세포의 복잡한 패턴 프린팅의 실연

생세포의 복잡한 패턴 프린팅의 예시로서 나선형의 선형 패턴을 형성하였다(도 10). E. coli 용액을 EHD 기법으로 멤브레인 필터 위에 분사한 직후 용액이 흡수되고 agar media 또한 흡수되어 패턴의 육안 식별이 어렵기 때문에 분사 전 형광 염색을 통하여 이를 식별하고자 했다. 밝게 보이는 점이 형광 염색된 박테리아 세포이다. EHD 장비를 통해 멤브레인 필터 표면에 패터닝된 직후의 박테리아 세포의 배열은 의도했던 디자인으로 패턴을 형성했다. 형광염색을 하지 않은 채 분사된 박테리아 세포들은 24시간 동안 37℃ 온도 하에서 배양을 통해 콜로니가 형성되어 육안 식별이 가능하게 성장하였다. 도 10은 EHD 직접 패터닝에 의한 EG 조성 40 vol%의 E. coli-EG-DW 용액의 분사 결과의 광학 현미경 사진이다.

EHD 프린팅 기법의 일반적인 정확도를 실험적인 의도로 분석하였다. 실험 조건에 기반하여 1.5μl/min의 유량과 500 mm/min의 기판 이송 속도, EG 조성 40 vol%의 E. coli-EG-DW 용액을 이용, 약 165 μm 의 최소선폭을 가진 선형 콜로니 패턴을 만들었다. 이러한 패턴의 형성엔 주사 펌프의 공급 유량과 공급 전압, 주사 바늘의 두께, 용액의 점도와 전기 전도도가 영향을 미친다.

본 발명의 EHD 장치는 초당 10 mm 의 선형 패턴을 만들 수 있다. 또한 12분 내로 145개의 선폭 165 μm 와 길이 60 mm 의 선형 패턴을 microscope cover glass 안에 만들 수 있다. 만약 같은 속도로 점 패턴을 형성할 경우 1분 안에 지름 165 μm 의 콜로니 점을 2175개 만들 수 있다. 기존 장비(genetix Qbot)는 시간당 10만개의 콜로니 생성이 가능하고, 잉크젯 시스템의 경우 500 μm 의 지름의 콜로니를 분당 5만개 생성 가능하다[Xu T. 등, Biotechnology Bioengineering 2004;85(1):29-33]. EHD는 기존 장비보다 빠른 콜로니 패턴 생성이 가능하며, 잉크젯보다는 다소 느릴 수 있으나 잉크젯보다 큰 노즐 지름에도 불구하고 콜로니의 지름을 더욱 작게 만들 수 있다.

도 1은 본 발명의 EHD 프린팅 시스템의 개략도이다.

도 2는 인가전압을 변화시킬 때 분사되는 액적의 평균 크기이다.

도 3는 EG 조성을 변화시킨 E. coli-EG-DW 용액을 이용한 E. coli 콜로니 패턴의 사진이다. (A) 0 vol% EG, 100 vol% DW; (B) 20 vol% EG; (C) 40 vol% EG; (D) 60 vol% EG; (E) 80 vol% EG;(F) 100 vol% EG

도 4는 (G) 40 vol% EG solution pattern 의 공초점레이저주사(confocal laser scanning)현미경 사진이다.

도 5는 E. coli-EG-DW 용액을 이용한 EHD 프린팅 결과 (A) 의도된 패턴 대 실제 구현된 패턴의 구현비, (B) 구현된 패턴의 평균 선폭. 오차 범위는 표준 편차(n=8)를 나타낸다.

도 6은 에틸렌글리콜 및 인산완충액을 포함하는 E.coli 용액의 선형 콜로니 패턴 사진이다.

(A) 20 vol% EG, 0mM PB; (B) 20 vol% EG, 10mM PB; (C)20 vol% EG, 20mM PB; (D)20 vol% EG, 40mM PB; (E)20 vol% EG, 80mM PB; (F)20 vol% EG, 160mM PB; (G)40 vol% EG, 0mM PB; (H)40 vol% EG, 10mM PB; (I)40 vol% EG, 20mM PB; (J)40 vol% EG, 40mM PB; (K) 40 vol% EG, 80mM PB; (L)40 vol% EG, 160mM PB; (M)60 vol% EG, 0mM PB; (N)60 vol% EG, 10mM PB; (O)60 vol% EG, 20mM PB; (P)60 vol% EG, 40mM PB; (Q)60 vol% EG, 80mM PB; (R)60 vol% EG, 160mM PB; 검은 선은 2 mm 를 의미한다.

도 7은 E. coli-EG-PB-DW 용액을 이용한 EHD 프린팅 결과 (A)의도된 패턴 대 실제 구현된 패턴의 구현비, (B) 구현된 패턴의 평균 선폭. 오차 범위는 표준 편차(n=8)를 나타낸다.

도 8은 에틸렌글리콜 및 염화나트륨을 포함하는 E.coli 용액의 선형 콜로니 패턴 사진이다.

(A) 20vol% EG, 0mM NaCl; (B) 20vol% EG, 10mM NaCl; (C)20vol% EG, 20mM NaCl; (D)20vol% EG, 40mM NaCl; (E)20vol% EG, 80mM NaCl; (F)20vol% EG, 160mM NaCl; (G)40vol% EG, 0mM NaCl; (H)40vol% EG, 10mM NaCl; (I)40vol% EG, 20mM NaCl; (J)40vol% EG, 40mM NaCl; (K) 40vol% EG, 80mM NaCl; (L)40vol% EG, 160mM NaCl;

(M)60vol% EG, 0mM NaCl; (N)60vol% EG, 10mM NaCl; (O)60vol% EG, 20mM NaCl; (P)60vol% EG, 40mM NaCl; (Q)60vol% EG, 80mM PB; (R)60vol% EG, 160mM NaCl;검은 선은 2 mm 를 의미한다.

도 9는 E. coli-EG-NaCl-DW 용액을 이용한 EHD 프린팅 결과이다. (A)의도된 패턴 대 실제 구현된 패턴의 구현비, (B) 구현된 패턴의 평균 선폭. 오차 범위는 표준 편차(n=8)를 나타낸다.

도 10은 EG 조성 40 vol%를 가진 E. coli-EG-DW 용액을 이용한 패턴 구현을 나타낸 것이다. (A) 분사 전 형광 염색된 박테리아 사진, (B) 같은 모양으로 패턴된 박테리아의 배양 후 모습. 검은 선은 2mm를 의미한다.

Claims (10)

1. 살아있는 세포를 기판상에 패터닝하는 방법에 있어서,

   상기 살아있는 세포의 용액을 제조하는 단계;

   제조된 세포용액을 일정한 수력학적 압력으로 분사하는 바늘과, 상기 바늘과 대응되는 위치에 소정거리로 이격된 거리에 핀형상의 접지전극을 제공하는 단계;

   상기 바늘과 상기 접지전극사이에 멤브레인 필터 기판을 위치시키는 단계;

   상기 바늘로부터 상기 용액이 분사될 때 상기 바늘과 상기 접지전극 사이에 전압을 인가하는 단계;

   상기 용액이 분사되는 동안 상기 기판을 미리 설정된 패턴형상으로 이동시키면서 상기 용액을 기판에 부착시키는 단계;

   및

   상기 패턴이 형성된 기판을 영양아가배지(nutrient agar media)와 접촉시켜 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 살아있는 세포의 패터닝 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 세포용액이 에틸렌글리콜, 인산완충액, 염화나트륨으로 구성된 군으로부터 하나 이상 선택한 것을 포함하는 것인 살아있는 세포의 패터닝 방법.
3. 제2항에 있어서, 세포용액 내 에틸렌글리콜 함량이 40% 이하인 것인 살아있는 세포의 패터닝 방법.
4. 제2항에 있어서, 세포용액 내 인산완충액(phosphate buffer)의 농도가 10mM 이하인 것인 살아있는 세포의 패터닝 방법.
5. 제2항에 있어서, 세포용액 내 염화나트륨의 농도가 10mM 이하인 것인 살아있는 세포의 패터닝 방법.
6. 제1항에 있어서, 인가하는 전압이 4 내지 8.5 kV인 것인 살아있는 세포의 패터닝 방법.
7. 제1항에 있어서, 살아있는 세포가 박테리아세포인 것인 살아있는 세포의 패터닝 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 패턴화된 생세포를 포함하는 기판.
9. 제8항의 기판을 포함하는 바이오센서.
10. 살아있는 세포, 40 부피% 이하의 에틸렌글리콜, 10mM 이하의 인산완충액, 10mM 이하의 염화나트륨을 포함하는 생세포 패터닝용 용액

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