KR20090086554A - 코리네형 박테리아의 ｏｘｙｒ 유전자의 대립유전자 - Google Patents

코리네형 박테리아의 ｏｘｙｒ 유전자의 대립유전자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 oxyR 전사 조절자의 변이체를 코딩하는 코리네형 박테리아의 oxyR 유전자의 돌연변이체 및 대립유전자, 및 이러한 대립유전자를 함유하는 박테리아를 사용해서 아미노산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
코리네형 박테리아, oxyR 유전자, 대립유전자.

Description

코리네형 박테리아의 ＯＸＹＲ 유전자의 대립유전자 {ALLELS OF THE OXYR GENE OF CORYNEFORM BACTERIA}
본 발명은 OxyR 전사 조절자의 변이체를 코딩하는 코리네형(coryneform) 박테리아의 oxyR 유전자의 돌연변이체 및 대립유전자, 및 특히 이들 대립유전자를 포함하는 박테리아를 사용해서 L-리신, L-트립토판, L-프롤린, L-발린, L-이소류신 및 L-호모세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
선행 기술
아미노산은 인간 의학, 제약 산업, 식품 산업 및 매우 특히는 가축 영양에서 사용된다.
아미노산은 코리네형 박테리아, 특히 코리네박테리아 글루타미쿰의 균주의 발효에 의해 제조되는 것으로 알려져 있다. 큰 중요성으로 인해, 아미노산 제조 방법을 개선시키는 것에 대한 연구가 지속적으로 수행되고 있다. 이러한 방법에서의 개선은 예를 들어 교반 및 산소 공급과 같은 발효 기술 수단일 수 있거나, 또는 예를 들어 발효 동안 슈가 농도와 같은 영양 배지의 조성 또는 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피에 의한 생성물 형태에 대한 처리 또는 미생물 자체의 고유의 산출 특성에 관한 것일 수 있다.
이들 미생물의 산출 특성을 개선하는데 사용된 방법으로는 돌연변이유발법, 돌연변이체의 선별 및 선택이 있다. 이러한 방식으로 얻어진 균주는 항대사산물에 대해 내성을 나타내거나 또는 조절상 중요한 대사산물에 대해 영양요구성이며, 아미노산을 생산한다. 공지된 항대사산물은 리신 유사체인 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인 (AEC)이다.
유사하게 재조합 DNA 기술 방법은 개별 아미노산 생합성 유전자를 증폭시키고 아미노산 생산에 대한 효과를 연구함으로써 코리네박테리아의 L-아미노산 생산 균주의 균주 개량을 위해 오랫 동안 사용되어 왔다.
코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체는 몇년전 완전히 서열화되었다 [Kalinowski et al., Journal of Biotechnology 104, 5-25 (2003)]. 마찬가지로 코리네박테리움 에피시엔스의 염색체가 서열화되었다 [Nishio et al., Genome Res. 13 (7), 1572-1579 (2003)].
상응하는 서열 데이터는 공개 데이터베이스로부터 입수할 수 있다. 적합한 데이터베이스로는 예를 들어 유러피언 몰레큘라 바이올러지스 래버러토리즈(European Molecular Biologies Laboratories)(EMBL, Heidelberg, Germany and Cambridge, UK)의 데이터베이스, 내셔널 센터 포 바이오테크놀러지 인포메이션(National Center for Biotechnology Information)(NCBI, Bethesda, MD, USA)데이터베이스, 스위스 인스티튜트 오브 바이오인포매틱스(Swiss Institute of Bioinformatics)(Swissprot, Geneva, Switzerland)의 데이터베이스, 프로틴 인포메이션 리소스 데이터베이스(Protein Information Resource Database)(PIR, Washington, DC, USA) 및 DNA 데이터 뱅크 오브 재팬(DNA Data Bank of Japan) (DDBJ, 1111 Yata, Mishima, 411-8540, Japan)이 있다.
유전학에 대한 설명을 요약하는데 있어서, 코리네박테리움의 대사 및 산업적 중요성은 문헌들 [Ikeda, by Pfefferle et al. and by Mueller and Huebner in the book "Microbial Production of L-Amino Acids" (Advances in Biochemical Engineering 79, (2003), Springer Verlag, Berlin, Germany, editor: T. Scheper), in the special edition "A New Era in Corynebacterium glutamicum Biotechnology" of the Journal of Biotechnology (volume 104 (1-3), 2003, editors: A. Puehler and T. Tauch) and in the "Handbook of Corynebacterium glutamicum (editors: L. Eggeling and M. Bott, CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, USA, 2005)]에서 확인될 것이다.
코리네박테리움 글루타미쿰의 OxyR 전사 조절자를 코딩하는 oxyR 유전자의 뉴클레오티드 서열은 특히 내셔널 라이브러리 오브 메디신(National Library of Medicine)(Bethesda, MD, USA)의 내셔널 센터 포 바이오테크놀러지 인포메이션(NCBI)의 데이터베이스에서 접근 번호 AF697215로 일반적으로 이용할 수 있다. 또한, 상기 서열은 특허 출원 EP1108790에서 서열 2114로 찾을 수 있다.
US 6,916,636은 아미노산 제조에 있어서 OxyR 전사 조절자의 과발현에 대한 효과를 보고한다.
보다 명확히 하면, NCBI 데이터베이스의 데이터에 따른 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 OxyR 전사 조절자를 코딩하는 oxyR 유전자 ("야생형 유전 자")의 뉴클레오티드 서열은 서열 1에 기재되어 있으며, 그로부터 생성된 코딩된 OxyR 전사 조절자의 아미노산 서열은 서열 2 및 4에 기재되어 있다. 추가로, 상류 및 하류에 위치한 뉴클레오티드 서열은 서열 3에 표시되어 있다.
발명의 목적
본 발명의 목적은 아미노산, 특히 L-리신, L-트립토판, L-프롤린, L-발린, L-이소류신 및 L-호모세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산의 개선된 제조를 위한 신규 수단을 제공하는 것이다.
본 발명은 아미노산을 차별적으로 분비하고 OxyR 전사 조절자 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 또는 대립유전자를 포함하며, 상기 폴리펩티드는 L-알라닌을 제외한 단백질성(proteinogenic) 아미노산 중 하나가 아미노산 서열의 위치 89 또는 상응하는 또는 필적하는 위치에 존재하는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 코리네형 박테리아의 생성 및 단리된 돌연변이체에 관한 것이다. L-알라닌을 L-발린으로 교환하는 것이 바람직하다.
코리네형 박테리아 중에서, 코리네박테리움 속이 바람직하다. 코리네박테리움 속에서, 출발 균주로서는 하기 종들이 바람직하며:
코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens)(타입 균주 DSM44549),
코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)(타입 균주 ATCC13032),
코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes)(예를 들어 균주 FERM BP-1539), 및
코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)(타입 균주 ATCC6871),
코리네박테리움 글루타미쿰 종이 매우 특히 바람직하다.
또한 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 몇가지 대표적인 것은 다른 종 명칭으로 당업계에 공지되어 있다. 이들로는 예를 들어 하기 것들을 들 수 있다:
코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870,
코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium) DSM20137,
코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola) ATCC17965,
브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC14067,
브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869,
브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum) ATCC14020, 및
마이크로박테리움 암모니아필룸(Brevibacterium ammoniaphilum) ATCC15354.
코리네박테리움 글루타미쿰에 대해서는 용어 "마이크로코커스 글루타미쿠스(Micrococcus glutamicus)"가 유사하게 사용되어 왔다.
본 발명의 수단을 위해 사용된 코리네형 박테리아의 균주 (출발 균주)는 바람직하게는 세포에서 목적하는 아미노산을 풍부하게 하는 능력 또는 상기 아미노산을 그 주변의 영양 배지로 분비하고 이를 축적시키는 능력을 이미 갖고 있다. 이를 위해 하기에서는 "제조하다"라는 용어가 또한 사용된다. 특히, 본 발명의 수단을 위해 사용된 코리네형 박테리아의 균주는 세포 또는 영양 배지에서 ≤ (최대) 120 시간, ≤ 96 시간, ≤ 48 시간, ≤ 36 시간, ≤ 24 시간 또는 ≤ 12 시간의 시점에서 ≥ (이상) 0.25 g/l, ≥ 0.5 g/l, ≥ 1.0 g/l, ≥ 1.5 g/l, ≥ 2.0 g/l, ≥ 4 g/l 또는 ≥ 10 g/l의 목적하는 아미노산을 풍부화하거나 축적하는 능력을 갖는다. 이와 관련하여, 균주는 돌연변이유발 및 선별, 재조합 DNA 기술, 또는 이들 두 방법의 조합에 의해 생성시킬 수 있다.
코리네형 박테리아의 L-리신-생산 또는 분비 균주의 공지된 대표적인 것으로는 예를 들어 하기와 같은 것들이 있다:
EP 0 358 940에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 DM58-1/pDM6 (= DSM4697),
문헌 [Menkel et al. (Applied and Environmental Microbiology 55(3), 684-688 (1989)]에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 MH20-22B (= DSM16835),
EP 1 108 790에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 AHP-3 (= Ferm BP-7382),
US 4,275,157에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 NRRL B-11474, 및
US 5,250,423에 기재된 코리네박테리움 써모아미노게네스 AJ12521 (= FERM BP-3304).
코리네형 박테리아의 L-트립토판-생산 또는 분비 균주의 공지된 대표적인 것으로는 예를 들어 하기와 같은 것들이 있다:
US 5,563,052에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 K76 (=Ferm BP-1847),
US 5,605,818에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 BPS13 (=Ferm BP-1777), 및
US 5,235,940에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 Ferm BP-3055.
코리네형 박테리아의 L-프롤린-생산 또는 -분비 균주의 공지된 대표적인 것으로는 예를 들어 하기와 같은 것들이 있다:
US 4,224,409에 기재된 브레비박테리움 락토퍼멘툼 NRRL B-11421,
US 4,224,409에 기재된 브레비박테리움 플라붐 NRRL B-11422,
US 5,294,547에 기재된 브레비박테리움 플라붐 FERM BP-2214,
US 4,224,409에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 NRRL B-11423,
US 4,444,885에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21157,
US 4,444,885에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21158,
US 4,444,885에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21159,
US 4,444,885에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21355, 및
US 4,224,409에 기재된 마이크로박테리움 암모니아필룸 NRRL B-11424.
코리네형 박테리아의 L-발린-생산 또는 분비 균주의 공지된 대표적인 것으로는 예를 들어 하기와 같은 것들이 있다:
US 5,188,948에 기재된 브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM BP-1763,
US 5,521,074에 기재된 브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM BP-3007,
US 5,521,074에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM BP-3006, 및
US 5,188,948에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM BP-1764.
코리네형 박테리아의 L-이소류신-생산 또는 분비 균주의 공지된 대표적인 것으로는 예를 들어 하기와 같은 것들이 있다:
US 4,656,135에 기재된 브레비박테리움 플라붐 FERM BP-759,
US 5,294,547에 기재된 브레비박테리움 플라붐 FERM BP-2215, 및
US 4,656,135에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM BP-758.
코리네형 박테리아의 L-호모세린-생산 또는 분비 균주의 공지된 대표적인 것으로는 예를 들어 하기와 같은 것들이 있다:
US 3,189,526에 기재된 마이크로코커스 글루타미쿠스(Micrococcus glutamicus) ATCC 14296 및
US 3,189,526에 기재된 마이크로코커스 글루타미쿠스(Micrococcus glutamicus) ATCC 14297.
상기 박테리아 군의 균주의 분류학적 분류에 대한 데이터는 특히 문헌들 [Seiler (Journal of General Microbiology 129, 1433-1477 (1983)), Kinoshita (1985, Glutamic Acid Bacteria, pp 115-142. In: Demain and Solomon (ed), Biology of Industrial Microorganisms. The Benjamin/Cummins Publishing Co., London, UK), Kaempfer and Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996)), Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41, 255-260 (1991)) 및 US-A-5,250,434]에서 찾을 수 있다.
명칭 "ATCC"를 갖는 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(Manassas, VA, USA)으로부터 구입할 수 있다. 명칭 "DSM"을 갖는 균주는 도이체 잠룽 오프 미크로오르가니스멘 안트 젤쿨투렌(Deutsche Sammlung of Mikroorganismen and Zellkulturen)(DSMZ, Brunswick, Germany)으로부터 구입할 수 있다. 명칭 "NRRL"을 갖는 균주는 애그리컬츄럴 리서치 서비스 페이턴트 컬쳐 콜렉션(Agricultural Research Service Patent Culture Collection)(ARS, Peoria, Illinois, US)으로부터 구입할 수 있다. 명칭 "FERM"을 갖는 균주는 내셔널 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀러지(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)(AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan)로부터 구입할 수 있다.
화학적으로, 유전자 또는 대립유전자는 폴리뉴클레오티드이다. 이에 대한 다른 용어는 핵산이다.
코리네박테리움 글루타미쿰의 oxyR 유전자에 의해 코딩되며 OxyR 전사 조절자 활성을 갖는 폴리펩티드는 이른바 LysR-타입 전사 조절자 (LTTR)의 군에 속한다. LTTR에 대한 검토는 문헌 [Schell (Annual Reviews in Microbiology 47, 597-626 (1993)]에서 찾을 수 있다.
OxyR 전사 조절자는 OxyR 폴리펩티드, OxyR 단백질 또는 OxyR 조절자 단백질로 언급될 수도 있다. 상기 조절자는 DNA 결합 단백질의 활성을 가지며 결핍(starvation)-유도성 DNA 보호 단백질 (Dps)을 코딩하는 dps 유전자의 프로모터 영역에 결합한다. 코리네박테리움 글루타미쿰의 dps 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열 23에 나타나 있다. OxyR 폴리펩티드는 바람직하게는 위치 80 내지 210, 특히 바람직하게는 위치 110 내지 210 사이의 뉴클레오티드 서열, 매우 특히 바람직하게는 서열 23의 위치 167 내지 179 사이의 뉴클레오티드 서열에 결합한다.
결합은 전문가들에게 전기영동 이동성 시프트 분석 검정 (EMSA)으로 공지되어 있으며 예를 들어 문헌 [Kerr (Methods in Enzymology, 254: 619-32 (1995))]에 기재된 검정을 이용해서 검출한다. 이 검정에서는 조사될 DNA 단편이 PCR에 의해 증폭되고 프라이머의 5' 말단에서 형광단을 갖는 변형된 프라이머에 의해 표지되는 것이 필요하다. 사용된 형광단의 예는 인도카르보시아닌 (Cy3)이다. 표지된 DNA는 정제된 OxyR 조절자 단백질과 혼합되며, 전기장에서 DNA 단편의 이동성에 대한 단백질 존재의 영향은 아가로스 겔 전기영동에 이은 형광 검출에 의해 분석된다. EMSA 검정에 대한 방법의 추가의 세부사항은 특히 문헌 [Rey et al. (Molecular Microbiology 56(4), 871-887 (2005)]을 참조할 수 있다.
단백질성 아미노산은 일반적으로 천연 단백질, 즉 미생물, 식물, 동물 및 인간의 단백질에 존재하는 아미노산을 의미한다. 본 발명과 관련하여, 단백질성 아미노산은 L-아스파르트산, L-아스파라긴, L-쓰레오닌, L-세린, L-글루탐산, L-글루타민, 글리신, L-알라닌, L-시스테인, L-발린, L-메티오닌, L-이소류신, L-류신, L-티로신, L-페닐알라닌, L-히스티딘, L-리신, L-트립토판, L-프롤린 및 L-아르기닌 및 적절한 경우 L-셀레노시스테인으로 이루어진 L-아미노산의 군을 의미한다. 유사하게 L-아미노산은 L-호모세린을 포함한다.
본 발명에 따른 돌연변이체는 바람직하게는 L-리신, L-트립토판, L-프롤린, L-발린, L-이소류신 또는 L-호모세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 전술한 단백질성 아미노산을 분비한다. 아미노산이라는 용어는 또한 그의 염, 예를 들어 아미노산 L-리신의 경우 리신 모노하이드로클로라이드 또는 리신 술페이트를 포함한다.
추가로 본 발명은 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고 OxyR 전사 조절자 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 oxyR 대립유전자를 포함하며, L-알라닌을 제외한 전술한 단백질성 아미노산 중 하나가 위치 89에 존재하는 것인, 코리네형 박테리아의 돌연변이체에 관한 것이다. L-알라닌을 L-발린으로 교환하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 서열 2의 아미노산 서열의 위치 89에 상응하는 위치에서 L-알라닌을 제외한 단백질성 아미노산 중 하나, 바람직하게는 L-발린을 포함하고 OxyR 전사 조절자 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 oxyR 대립유전자를 포함하며, 이 유전자는 각 프라이머의 뉴클레오티드 서열이 서열 3 또는 서열 7의 위치 1 내지 750 사이의 뉴클레오티드 서열 및 서열 3 또는 서열 7의 위치 2484 내지 1732 사이의 상보적 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 15개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 쌍을 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 코리네형 박테리아의 돌연변이체에 관한 것이다. 적합한 프라이머 쌍의 예는 서열 9 및 서열 10에 기재되어 있다. 바람직한 출발 물질 ("템플레이트" DNA)은 특히 돌연변이원으로 처리된 코리네형 박테리아의 염색체 DNA이다. 염색체 DNA는 특히 바람직하게는 코리네박테리움 속의 것이며, 매우 특히 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 것이다.
추가로 본 발명은 327개의 L-아미노산에 상응하는 길이를 갖는 아미노산 서열을 포함하고 OxyR 전사 조절자 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 oxyR 대립유전자를 포함하며, L-알라닌을 제외한 단백질성 아미노산 중 하나, 바람직하게는 L-발린이 위치 89에 존재하는 것인, 코리네형 박테리아의 돌연변이체에 관한 것이다.
또한 본 발명은 아미노산 서열의 위치 70 내지 108에서 서열 6 또는 8의 위치 70 내지 108에 상응하는 아미노산 서열을 포함하고 OxyR 전사 조절자 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 oxyR 대립유전자를 포함하는 코리네형 박테리아의 돌연변이체에 관한 것이다. 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열 6 또는 8의 위치 30 내지 148 또는 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 188 또는 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 228 또는 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 268 또는 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 308 또는 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 324 또는 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 325 또는 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 326에 상응하는 아미노산 서열을 포함하며, 적절한 경우 L-발린은 위치 244에서 L-알라닌 대신 존재한다. 코딩된 폴리펩티드의 길이는 매우 특히 바람직하게는 327개의 아미노산을 포함한다.
추가로 본 발명은 아미노산 서열의 위치 89 또는 상응하는 위치에서 L-알라닌(L-발린으로 교환하는 것이 바람직함)을 제외한 단백질성 아미노산 중 하나를 포함하고 OxyR 전사 조절자 활성을 가지며 추가로 아미노산 서열이 서열 6 또는 서열 8의 아미노산 서열과 90％ 이상, 바람직하게는 92％ 이상 또는 94％ 이상 또는 96％ 이상, 매우 특히 바람직하게는 97％ 이상 또는 98％ 이상 또는 99％ 이상 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 oxyR 대립유전자를 포함하는, 코리네형 박테리아의 돌연변이체에 관한 것이며, 적절한 경우 L-발린이 위치 244에 존재한다.
또한 본 발명은 아미노산 서열의 위치 89 또는 상응하는 위치에서 L-알라닌(L-발린으로 교환하는 것이 바람직함)을 제외한 단백질성 아미노산 중 하나를 포함하고 OxyR 전사 조절자 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하며 추가로 뉴클레오티드 서열이 서열 5의 뉴클레오티드 서열과 90％ 이상, 바람직하게는 92％ 이상 또는 94％ 이상 또는 96％ 이상, 매우 특히 바람직하게는 97％ 이상 또는 98％ 이상 또는 99％ 이상 동일한 oxyR 대립유전자(적절한 경우 티민이 시토신 대신 위치 731에 존재함)를 포함하는, 코리네형 박테리아의 돌연변이체에 관한 것이다.
보존적 아미노산 교환은 활성을 실질적으로 변화시키지 않는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명에 따른 돌연변이체에 존재하며 OxyR 전사 조절자 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 oxyR 대립유전자는 서열 6 또는 서열 8에 나타낸 아미노산 서열 이외에 하나 (1) 또는 그보다 많은 보존적 아미노산 교환(들)을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 바람직하게는 2개 (2) 이하, 3개 (3) 이하, 4개 (4) 이하 또는 5개 (5) 이하의 보존적 아미노산 교환을 포함한다. 적절한 경우, L-발린은 서열 21에 나타낸 바와 같이 서열 6 또는 8의 위치 244에 존재한다.
방향족 아미노산의 경우, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신의 상호 교환은 보존적 교환으로서 언급된다. 소수성 아미노산의 경우, 류신, 이소류신 및 발린의 상호 교환은 보존적 교환으로서 언급된다. 극성 아미노산의 경우, 글루타민 및 아스파라긴의 상호 교환은 보존적 교환으로서 언급된다. 염기성 아미노산의 경우, 아르기닌, 리신 및 히스티딘의 상호 교환은 보존적 교환으로서 언급된다. 산성 아미노산의 경우, 아스파르트산 및 글루탐산의 상호 교환은 보존적 교환으로서 언급된다. 히드록실기를 포함하는 아미노산의 경우, 세린 및 쓰레오닌의 상호 교환은 보존적 교환으로서 언급된다.
본 발명을 수행했을 때, 클러스탈(Clustal) 프로그램 [Thompson et al., Nucleic Acids Research 22, 4637-4680 (1994)]을 사용해서 아미노산 서열을 비교함으로써, 예를 들어 에세리키아 콜리(Escherichia coli), 스트렙토마이세스 코엘리콜러(Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis), 코리네박테리움 에피시엔스 및 코리네박테리움 글루타미쿰과 같은 여러 박테리아의 OxyR 전사 조절자의 아미노산 서열이 서열 Leu-Gly-Val-Met/Thr/Gln-Leu-Ile/Leu-Glu-Arg-Thr/Ser-Thr/Ser-Arg-Lys-Val-Ile/Leu로 이루어진 서열 모티프, 서열 Ile-Pro-Thr-Val/Ala-Ala/Gly-Pro-Tyr-Ile/Leu-Leu-Pro로 이루어진 서열 모티프 및 또한 서열 Leu-Leu-Leu/Met-Leu-Glu/Asp-Glu/Asp-Gly-His-Cys-Leu-Arg/His-Asp-Gln로 이루어진 서열 모티프를 포함한다는 것을 밝혀냈다. 명칭 "Met/Thr/Gln", "Ile/Leu", "Thr/Ser", "Val/Ala", "Ala/Gly", "Leu/Met", "Glu/Asp" 및 "Arg/His"는 "Met 또는 Thr 또는 Gln", "Ile 또는 Leu", "Thr 또는 Ser", "Val 또는 Ala", "Ala 또는 Gly", "Leu 또는 Met", "Glu 또는 Asp" 또는 "Arg 또는 His"가 상응하는 위치에 존재함을 의미한다.
따라서, 코리네형 박테리아의 바람직한 돌연변이체는 Leu-Gly-Val-Met/Thr/Gln-Leu-Ile/Leu-Glu-Arg-Thr/Ser-Thr/Ser-Arg-Lys-Val-Ile/Leu, Ile-Pro-Thr-Val/Ala-Ala/Gly-Pro-Tyr-Ile/Leu-Leu-Pro 및 Leu-Leu-Leu/Met-Leu-Glu/Asp-Glu/Asp-Gly-His-Cys-Leu-Arg/His-Asp-Gln의 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하며 아미노산 서열의 위치 89 또는 상응하는 또는 필적하는 위치에서 L-알라닌을 제외한 단백질성 아미노산 중 하나, 바람직하게는 L-발린 및 적절한 경우 위치 244에서 L-발린을 포함하며 OxyR 전사 조절자 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 oxyR 대립유전자를 포함하는 것이다.
아미노산 서열 모티프 Leu-Gly-Val-Met/Thr/Gln-Leu-Ile/Leu-Glu-Arg-Thr/Ser-Thr/Ser-Arg-Lys-Val-Ile/Leu는 예를 들어 서열 2 및 4 또는 6 및 8에서 위치 50부터 63까지 존재한다. 아미노산 서열 모티프 Ile-Pro-Thr-Val/Ala-Ala/Gly-Pro-Tyr-Ile/Leu-Leu-Pro는 예를 들어 서열 2 및 4 또는 6 및 8에서 위치 105부터 114까지 존재한다. 아미노산 서열 모티프 Leu-Leu-Leu/Met-Leu-Glu/Asp-Glu/Asp-Gly-His-Cys-Leu-Arg/His-Asp-Gln은 예를 들어 서열 2 및 4 또는 6 및 8에서 위치 198부터 210까지 존재한다.
마지막으로 본 발명은 서열 6 또는 서열 8의 아미노산 서열을 포함하고 OxyR 전사 조절자 활성을 가지며 L-발린이 적절한 경우 위치 244에 존재하는 폴리펩티드를 코딩하는 oxyR 대립유전자를 포함하는 코리네형 박테리아의 돌연변이체에 관한 것이다.
아미노펩티다제라고 불리는 숙주 자체의 효소는 단백질 합성 동안 말단 메티오닌을 결실시키는 것으로 알려져 있다.
"아미노산 서열의 위치 89에 상응하는 위치" 또는 "아미노산 서열의 위치 89에 필적하는 위치"라는 표현은, 코딩된 폴리펩티드의 N-말단 영역 (서열 6 또는 8의 위치 89에 대해 상대적임)에서 아미노산을 코딩하는 코돈의 삽입 또는 결실을 통해 전술한 위치 및 전술한 길이가 삽입의 경우 한 단위만큼 형식적으로 증가하거나 또는 결실의 경우 한단위 만큼 감소한다는 사실을 나타낸다. 예를 들어, 서열 6 또는 8의 위치 5에서 아미노산 L-글루탐산을 코딩하는 GAG 코돈의 결실은 L-발린을 위치 89로부터 위치 88로 이동시킨다. 이후, 전술한 길이는 326 아미노산이 된다. 동일한 방식으로, 코딩된 폴리펩티드의 C-말단 영역 (위치 89에 대해 상대적임)에서 아미노산을 코딩하는 코돈의 삽입 또는 결실은 전술한 길이를 삽입의 경우 한 단위만큼 형식적으로 증가시키거나 또는 결실의 경우 한 단위만큼 감소시킨다. 상기 필적하는 위치는 클러스탈 프로그램 또는 MAFFT 프로그램을 이용해서 정렬 형태의 아미노산 서열을 비교함으로써 쉽게 확인할 수 있다.
활성은 이러한 삽입 및 결실에 의해 실질적으로 영향을 받지 않는다. "실질적으로 영향을 받지 않은"이란 상기 변이체의 활성이 서열 6 또는 8의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 (L-발린은 적절한 경우 위치 244에 존재함)의 활성과 10％ 이하, 7.5％ 이하, 5％ 이하, 2.5％ 이하 또는 1％ 이하 만큼 차이가 남을 의미한다.
따라서 본 발명은 하나 이상의 삽입(들) 또는 결실(들)을 포함하는 서열 6 또는 8의 폴리펩티드 변이체 (L-발린은 적절한 경우 위치 244에 존재함)를 코딩하는 oxyR 대립유전자에 관한 것이다. 폴리펩티드는 바람직하게는 아미노산 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하 또는 2개 이하의 삽입 또는 결실을 포함한다.
상기 언급된 서열 모티프인 Leu-Gly-Val-Met/Thr/Gln-Leu-Ile/Leu-Glu-Arg-Thr/Ser-Thr/Ser-Arg-Lys-Val-Ile/Leu, Ile-Pro-Thr-Val/Ala-Ala/Gly-Pro-Tyr-Ile/Leu-Leu-Pro 및 Leu-Leu-Leu/Met-Leu-Glu/Asp-Glu/Asp-Gly-His-Cys-Leu-Arg/His-Asp-Gln은 바람직하게는 이러한 삽입/결실에 의해 파괴되지 않는다.
본 발명에 따른 돌연변이체는 코리네형 박테리아의 세포 집단에 대해 돌연변이원 물질, 예를 들어 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (MNNG), 에틸 메탄술포네이트 (EMS), 5-브로모우라실 또는 자외선광을 이용하는 통상의 생체내 돌연변이유발 방법에 의해 생성될 수 있다. 돌연변이유발 방법은 예를 들어 문헌 [Manual of Methods for General Bacteriology (Gerhard et al. (Eds.), American Society for Microbiology, Washington, DC, USA, 1981)] 또는 문헌 [Tosaka et al. (Agricultural and Biological Chemistry 42(4), 745-752 (1978))] 또는 문헌 [Konicek et al. (Folia Microbiologica 33, 337-343 (1988))]에 기재되어 있다. MNNG를 사용하는 전형적인 돌연변이유발법은 50 내지 500 mg/l 또는 최대 1 g/l의 훨씬 높은 농도, 5.5 내지 7.5의 pH에서 1 내지 30분의 인큐베이션 시간을 포함한다. 이러한 조건하에, 생존가능한 세포의 수는 대략 50％ 내지 90％ 또는 대략 50％ 내지 99％ 또는 대략 50％ 내지 99.9％ 만큼 또는 그보다 많이 감소된다.
돌연변이체 또는 세포는 돌연변이유발된 세포 집단으로부터 제거되어 증식된다. 추가의 단계에서, 적합한 영양 배지를 사용하는 회분식 배양에서 아미노산, 바람직하게는 L-리신, L-트립토판, L-프롤린, L-발린, L-이소류신 또는 L-호모세린을 분비하는 상기 돌연변이체 또는 세포의 능력을 연구하는 것이 바람직하다. 적합한 영양 배지 및 시험 조건은 특히 US 6,221,636, US 5,840,551, US 5,770,409, US 5,605,818, US 5,275,940 및 US 4,224,409에 기재되어 있다. 예를 들어 문헌 [Zimmermann et al. (VDI Berichte No. 1841, VDI-Verlag, Duesseldorf, Germany 2004, 439-443)] 또는 문헌 [Zimmermann (Chemie Ingenenieur Technik 77 (4), 426-428 (2005))]에 기재된 바와 같은 적합한 로봇 시스템을 사용하는 경우, 다수의 돌연변이체를 단시간내에 조사할 수 있다. 일반적으로, 최대 3000, 최대 10,000, 최대 30,000 또는 최대 60,000 개의 돌연변이체, 적절한 경우 그보다 많은 돌연변이체가 조사된다. 모(parent) 균주 또는 돌연변이유발되지 않은 출발 균주에 비해 영양 배지 또는 세포의 내부로 증가된 아미노산을 분비하는 돌연변이체는 이러한 방식으로 확인된다. 이러한 돌연변이체로는 예를 들어 아미노산 분비가 0.5％ 이상 증가된 돌연변이체를 들 수 있다.
이어서, DNA를 제조하거나 또는 돌연변이체로부터 단리하고, oxyR 유전자 또는 본 발명에 따른 oxyR 대립유전자 또는 본 발명에 따른 위치 89에서의 돌연변이의 증폭을 허용하는 프라이머 쌍을 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 상응하는 폴리뉴클레오티드를 합성한다. DNA는 바람직하게는 아미노산을 증가된 정도로 분비하는 돌연변이체로부터 단리된다.
이러한 목적을 위해 본 발명에 따른 돌연변이의 상류 및 하류에 위치하는 뉴클레오티드 서열 및 이에 상보적인 뉴클레오티드 서열로부터 임의의 프라이머 쌍을 선택할 수 있다. 이 경우 프라이머 쌍 중 하나의 프라이머는 바람직하게는 서열 3 또는 서열 7의 위치 1 내지 1014 사이의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상, 18개 이상, 20개 이상, 21개 이상 또는 24개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 프라이머 쌍에 속하는 제2 프라이머는 서열 3 또는 서열 7의 위치 2484 내지 1018로부터의 상보적 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상, 18개 이상, 20개 이상, 21개 이상 또는 24개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
코딩 영역의 증폭이 필요한 경우, 프라이머 쌍은 바람직하게는 서열 3 또는 서열 7의 위치 1 내지 750 사이의 뉴클레오티드 서열 및 서열 3 또는 서열 7의 위치 2484 내지 1732 사이의 상보적 뉴클레오티드 서열로부터 선택된다. 적합한 프라이머 쌍은 예를 들어 서열 9 및 서열 10으로 표시되는 프라이머 쌍 oxyR_XL_A1 및 oxyR_XL_E1이다.
예를 들어 서열 17 및 19에 나타낸 바와 같은 코딩 영역의 일부의 증폭이 필요한 경우, 프라이머 쌍은 바람직하게는 서열 3 또는 서열 7의 위치 751 내지 1014 사이 또는 위치 1 내지 1014 사이의 뉴클레오티드 서열 및 서열 3 또는 서열 7의 위치 1731 내지 1018 사이 또는 2484 내지 1018 사이의 상보적 뉴클레오티드 서열로부터 선택된다. 또한, 프라이머에는 제한 효소에 대한 인식 부위, 비오틴기 또는 선행기술에 기술된 바와 같은 추가의 액세서리가 구비될 수 있다. 프라이머의 전체 길이는 일반적으로 뉴클레오티드 30개, 40개, 50개 또는 60개를 초과하지 않는다.
폴리뉴클레오티드는 일반적으로 열안정성 DNA 폴리머라제를 이용하는 PCR 증폭에 의해 예를 들어 제공된 염색체 DNA ("템플레이트 DNA")로부터 본 발명에 따른 oxyR 대립유전자와 같은 선택된 서열을 증폭시킴으로써 제조된다. 이러한 DNA 폴리머라제의 예로는, 특히 퀴아젠(Qiagen)(Hilden, Germany)사에서 판매하는 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) 유래의 Taq 폴리머라제, 특히 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)(Frankfurt, Germany)에서 판매하는 써모코커스 리토랄리스(Thermococcus litoralis) 유래의 Vent 폴리머라제, 또는 스트라타진(Stratagene)(La Jolla, USA)사에서 판매하는 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) 유래의 Pfu 폴리머라제가 있다. 교정-판독(proof-reading) 활성을 갖는 폴리머라제가 바람직하다. 교정-판독 활성은 이러한 폴리머라제가 부정확하게 혼입된 뉴클레오티드를 인식하여 재개된 중합에 의해 오류를 제거할 수 있음을 의미한다 [Lottspeich and Zorbas, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany (1998)]. 교정-판독 활성을 갖는 폴리머라제의 예로는 Vent 폴리머라제 및 Pfu 폴리머라제가 있다.
반응 혼합물에서의 조건은 제조자의 정보에 따라 설정된다. 폴리머라제는 일반적으로는 통상적으로 pH 7.5-9.3에서 10-100 mM Tris/HCl 및 6-55 mM KCl의 농도를 갖는 일반적인 완충액과 함께 제조자에 의해 제공된다. 제조자에 의해 제공된 완충액 중에 염화마그네슘이 존재하지 않는다면, 염화마그네슘을 0.5-10 mM의 농도로 첨가한다. 또한, 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트가 반응 혼합물에 0.1-16.6 mM의 농도로 첨가된다. 프라이머는 반응 혼합물 중에 0.1-3 μM의 최종 농도로 도입되며, 템플레이트 DNA는 최적의 경우 102 내지 105의 카피수를 갖는다. 또한 106 내지 107의 카피수를 이용하는 것도 가능하다. 적절한 폴리머라제를 2-5 단위의 양으로 반응 혼합물에 첨가한다. 전형적인 반응 혼합물은 20-100 ㎕의 부피를 갖는다.
반응에 도입될 수 있는 추가의 첨가물로는 소 혈청 알부민, 트윈(Tween) 20, 젤라틴, 글리세롤, 포름아미드 또는 DMSO (Dieffenbach and Dveksler, PCR Primer - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA 1995)가 있다.
전형적인 PCR 수행은 3개의 상이한, 연속적으로 반복되는 온도 단계들로 이루어진다. 처음에, 반응은 도입된 DNA를 변성시키기 위해 4 내지 10분 동안 온도를 92℃ 내지 98℃ 로 상승시킴으로써 개시된다. 이후, 먼저 도입된 DNA를 대략 92℃ 내지 98℃에서 10 내지 60초 동안 변성시키는 단계에 이어서 특정 온도에서 10 내지 60초 동안 프라이머를 도입된 DNA와 결합시키는 단계를 반복하는데, 상기 특정 온도는 프라이머 ("어닐링 온도")에 따라 달라지며 경험에 의하면 50℃ 내지 60℃이고 각 프라이머 쌍에 대해 개별적으로 계산될 수 있다. 당업자라면 이에 관한 상세한 정보를 문헌 [Rychlik et al. (Nucleic Acids Research 18 (21): 6409-6412)]에서 찾을 수 있다. 이후, 폴리머라제에 따라 통상적으로 73℃ 내지 67℃, 바람직하게는 72℃ 내지 68℃의 범위에서 폴리머라제에 대하여 각 경우에 나타낸 최적 활성에서 도입된 프라이머를 연장하는 합성 단계 ("연장")를 수행한다. 이러한 연장 단계의 지속시간은 폴리머라제의 효율 및 증폭될 PCR 생성물의 길이에 따라 달라진다. 전형적인 PCR에서, 상기 단계에는 0.5 내지 8분, 바람직하게는 2 내지 4분이 소요된다. 이러한 3개의 단계를 30 내지 35회, 적절한 경우 50회까지 반복한다. 4 내지 10분의 최종 "연장" 단계로 반응이 종결된다. 이러한 방식으로 제조된 폴리뉴클레오티드는 앰플리콘(amplicon)이라 지칭되며; 핵산 단편이라는 용어가 유사하게 사용된다.
당업자라면 PCR에 대한 추가의 지침 및 정보를 예를 들어 문헌 ["PCR-Strategies" (Innis, Felfand and Sninsky, Academic Press , Inc., 1995)], 문헌 [Diefenbach and Dveksler "PCR Primer - a laboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)], 문헌 [Gait "Oligonucleotide synthesis: A Practical Approach" (IRL Press, Oxford, UK, 1984)] 및 문헌 [Newton and Graham "PCR" (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994)]에서 찾을 수 있다.
이어서, 뉴클레오티드 서열을 예를 들어 문헌 [Zimmermann et al. (Nucleic Acids Research 18, 1067pp (1990))]에 따라 변형된 문헌 [Sanger et al. (Proceedings of the National Academies of Sciences, U.S.A., 74, 5463-5467 (1977))]의 연쇄 종결 방법에 의해 결정하고, 이 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드를 특히 아미노산 서열과 관련하여 분석한다. 이를 위해, DNA 서열을 아미노산 서열로 번역하는 프로그램에 뉴클레오티드 서열을 진입시킨다. 적합한 프로그램으로는 예를 들어 특허청들, 예를 들면 미국특허청(USPTO)으로부터 얻을 수 있는 "페이턴트인(Patentin)" 프로그램, 또는 월드 와이드 웹(World Wide Web)의 ExPASy 프로테오믹스 서버(Proteomics Server) 상에서 이용가능한 "트랜슬레이트 툴(Translate Tool)"이 있다 [Gasteiger et al., Nucleic Acids Research 31, 3784-3788 (2003)].
아미노산 서열의 위치 89 또는 상응하는 또는 필적하는 위치에서 L-알라닌을 제외한 단백질성 아미노산 중 하나를 포함하고 OxyR 전사 조절자 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 oxyR 대립유전자를 갖는 돌연변이체는 이러한 방식으로 확인된다. L-발린으로 교환하는 것이 바람직하다.
적절한 경우 돌연변이체의 완전한 염색체를 결정한다. 이와 관련하여, 문헌 [Margulies et al. (Nature, 437(7057): 376-380 (2005))] 및 문헌 [Velicer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 103(21), 8107-8112 (2006))]에 기재된 방법을 이용할 수 있으며, 이는 당업자에게 "피로-서열화(pyro-sequencing)"라는 표현으로 공지되어 있고, 완전한 게놈을 신속하게 서열화할 수 있다.
따라서, 본 발명은 하기 단계들에 의해 얻어질 수 있음을 특징으로 하는, 코리네형 박테리아의 돌연변이체에 관한 것이다:
a) 아미노산을 분비하는 능력을 갖는 코리네형 박테리아를 돌연변이유발제로 처리하는 단계,
b) 상기 a)에서 생성된 돌연변이체를 단리 및 증식시키는 단계,
c) 바람직하게는 돌연변이체가 a)에서 사용된 코리네형 박테리아 (출발 균주)보다 0.5％ 이상 더 많은 아미노산을 배지에서 분비하는 능력 또는 세포 내부에서 풍부화하는 능력을 결정하는 단계,
d) 상기 b)에서 얻어진 돌연변이체로부터 핵산을 제조하는 단계,
e) 서열 3 또는 서열 7의 위치 1 내지 1014, 바람직하게는 1 내지 750 사이의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 및 서열 3 또는 서열 7의 위치 2484 내지 1018, 바람직하게는 2484 내지 1732 사이의 상보적 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 상기 d)로부터의 핵산의 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 핵산 분자 (또는 앰플리콘 또는 핵산 단편)를 제조하는 단계,
f) 상기 e)에서 얻어진 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 및 코딩된 아미노산 서열을 결정하는 단계,
g) 적절한 경우 상기 f)에서 결정된 아미노산 서열을 서열 6 또는 8과 비교하며, 여기서 적절한 경우 L-발린이 위치 244에 존재하는 것인 단계, 및
h) 위치 89 또는 필적하는 위치에서 L-알라닌을 제외한 단백질성 아미노산 중 하나, 바람직하게는 L-발린 및 적절한 경우 위치 244에서의 L-발린을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돌연변이체를 확인하는 단계.
이러한 방식으로 생성된 돌연변이체는 전형적으로 상기 기재된 OxyR 대립유전자를 1 카피 포함한다.
서열 5는 본 발명에 따른 돌연변이체의 OxyR 대립유전자의 코딩 영역의 예를 나타낸다. 야생형 유전자의 코딩 영역은 서열 1로 나타낸다. 서열 1은 위치 265에 핵염기 구아닌, 위치 266에 핵염기 시토신 및 위치 267에 핵염기 시토신을 포함한다. 따라서, 서열 1은 위치 265 내지 267에 아미노산 L-알라닌을 코딩하는 GCC 코돈을 포함한다. 서열 5는 위치 266에 핵염기 티민을 포함한다. 이러한 시토신에서 티민으로의 전이는 위치 265 내지 267에 아미노산 L-발린을 코딩하는 GTC 코돈을 생성한다.
또한, 서열 5 및 7 또는 서열 21에 기재된 뉴클레오티드 서열은 돌연변이 유발 처리에 의해 발생한 추가의 염기 교환을 포함할 수 있지만, 이는 변경된 아미노산 서열에 의해 발현되지는 않는다. 이러한 유형의 돌연변이는 또한 당업자에게 침묵 또는 중립 돌연변이로 지칭된다. 마찬가지로, 이러한 침묵 돌연변이는 상기 돌연변이 유발 처리에 이용된 코리네형 박테리아에 이미 존재할 수 있다.
바람직하게는, 돌연변이 유발에 사용된 코리네형 박테리아는 그 주변의 영양 배지 또는 발효 브로쓰에서 목적하는 아미노산을 분비하거나 세포의 내부에서 이를 풍부하게 할 수 있는 능력을 이미 갖고 있다.
L-리신-생산 코리네형 박테리아는 전형적으로 피드백-내성 또는 탈감작화 아스파테이트 키나제를 갖는다. 피드백-내성 아스파테이트 키나제는 리신과 쓰레오닌의 혼합물 또는 AEC (아미노에틸시스테인)과 쓰레오닌의 혼합물 또는 리신 단독 또는 AEC 단독에 의한 억제에 대해 야생형에 비해 덜 민감성인 아스파테이트 키나제 (LysC)를 의미한다. 이들 탈감작화 아스파테이트 키나제를 코딩하는 유전자 또는 대립유전자는 또한 lysCFBR 대립유전자로 지칭된다. 수많은 lysCFBR 대립유전자가 당업계에 기재되어 있으며, 이들은 야생형 단백질과 비교할 때 아미노산 교환을 갖는 아스파테이트 키나제 변이체를 코딩한다. NCBI 데이터베이스의 기탁 번호 AX756575에 상응하는 코리네박테리움 글루타미쿰의 야생형 lysC 유전자의 코딩 영역은 서열 11로 기재되며, 이 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 서열 12로 기재된다.
바람직하게는, 본 발명의 방법에 사용되는 L-리신-생산 코리네형 박테리아는 서열 12의 아미노산 서열을 갖는 아스파테이트 키나제 변이체를 코딩하는 lysC 대립유전자를 가지며, 상기 서열은 하기 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 교환을 포함한다:
LysC A279T (서열 12에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 279에서 L-알라닌이 L-쓰레오닌으로 교환됨; US 5,688,671 및 기탁 번호 E06825, E06826, E08178 및 I74588 내지 I74597 참조),
LysC A279V (서열 12에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 279에서 L-알라닌이 L-발린으로 교환됨, JP 6-261766 및 기탁 번호 E08179 참조),
LysC L297Q (서열 12에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 297에서 L-류신이 L-글루타민으로 교환됨; DE 102006026328 참조),
LysC S301F (서열 12에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 301에서 L-세린이 L-페닐알라닌으로 교환됨; US 6,844,176 및 기탁 번호 E08180 참조),
LysC S301Y (서열 12에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 301에서 L-세린이 L-티로신으로 교환됨, 문헌 [Kalinowski et al., Molecular and General Genetics 224, 317-324 (1990)] 및 기탁 번호 X57226 참조),
LysC T308I (서열 12에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 308에서 L-쓰레오닌이 L-이소류신으로 교환됨; JP 6-261766 및 기탁 번호 E08181 참조)
LysC T311I (서열 12에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 311에서 L-쓰레오닌이 L-이소류신으로 교환됨; WO 00/63388 및 US 6,893,848 참조),
LysC S317A (서열 12에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 317에서 L-세린이 L-알라닌으로 교환됨; US 5,688,671 및 기탁 번호 I74589 참조),
LysC R320G (서열 12에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 320에서 L-아르기닌이 글리신으로 교환됨; 문헌 [Jetten et al., Applied Microbiology and Biotechnology 43, 76-82 (995)] 및 기탁 번호 L27125 참조),
LysC G345D (서열 12에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 345에서 글리신이 L-아스파르트산으로 교환됨; 문헌 [Jetten et al., Applied Microbiology and Biotechnology 43, 76-82 (995)] 및 기탁 번호 L16848 참조),
LysC T380I (서열 12에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 380에서 L-쓰레오닌이 L-이소류신으로 교환됨; WO 01/49854 및 기탁 번호 AX192358 참조), 및
LysC S381F (서열 12에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 381에서 L-세린이 L-페닐알라닌으로 교환됨; EP 0435132 참조).
lysCFBR 대립유전자 lysC T311I (서열 12에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 311에서 쓰레오닌이 이소류신으로 교환됨), 및 A279T (서열 12에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 279에서 알라닌이 쓰레오닌으로 교환됨), S381F (서열 12에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 891에서 세린이 페닐알라닌으로 교환됨) 및 S317A (서열 12에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 317에서 세린이 알라닌으로 교환됨)의 군으로부터 선택된 하나 이상의 교환을 포함하는 lysCFBR 대립유전자가 특히 바람직하다.
lysCFBR 대립유전자 lysC T311I (서열 12에 따른 코딩된 아스파테이트 키나제 단백질의 위치 311에서 쓰레오닌이 이소류신으로 교환됨)이 매우 특히 바람직하다.
균주 DSM 16833 (WO 06/063660)은 아미노산 교환 T311I를 포함하는 아스파테이트 키나제 단백질을 코딩하는 lysCFBR 대립유전자를 갖는다.
균주 NRRL B-11474 (US 4,275,157)는 아미노산 교환 A279T 및 S381F를 포함하는 아스파테이트 키나제 단백질을 코딩하는 lysCFBR 대립유전자를 갖는다.
상기 기재된 방식으로, 균주 ATCC 16833으로부터 출발하여, L-발린이 아미노산 서열의 위치 89에 존재하는 폴리펩티드를 코딩하는 OxyR 대립유전자를 포함하는 DM1914으로 지정된 돌연변이체가 단리되었다. 돌연변이체 DM1914의 OxyR 대립유전자의 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열은 서열 5로 기재되고, 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 6 또는 8로 기재된다.
또한, 상기 기재된 방식으로, 서열 2의 위치 89에서 L-알라닌 대신에 L-발린을 포함하고, 추가로 서열 2의 위치 244에서 L-알라닌 대신에 L-발린을 포함하는 돌연변이체가 단리되었다. 이 돌연변이체의 OxyR 대립유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열 21로 기재되고, 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 22로 기재된다.
추가로, 당업계에 공지된 특성을 갖는 L-리신-분비 코리네형 박테리아를 사용하는 것도 가능하다.
L-트립토판-생산 코리네형 박테리아는 전형적으로 피드백-내성 또는 탈감작화 안트라닐레이트 신타제를 갖는다. 피드백-내성 안트라닐레이트 신타제 (TrpE)는 트립토판 또는 5-플루오로트립토판에 의한 억제에 대해 야생형에 비해 민감성인 안트라닐레이트 신타제 (문헌 [Matsui et al., Journal of Bacteriology 169 (11): 5330 - 5332(1987)]), 또는 적어도 5 내지 10％, 또는 적어도 10％ 내지 15％, 또는 적어도 10％ 내지 20％ 덜한 비슷한 유사체를 의미한다. 이들 탈감작화 안트라닐레이트 신타제를 코딩하는 유전자 또는 대립유전자는 또한 trpEFBR 대립유전자로 지칭된다. 이러한 돌연변이체 및 대립유전자의 예는 예를 들어 US 6180373 및 EP0338474에 기재되어 있다.
L-프롤린-생산 코리네형 박테리아는 특히 아미노산 위치 149 또는 필적하는 위치에 글리신 이외의 단백질성 아미노산, 바람직하게는 L-아스파르트산을 갖는 γ-글루타밀 키나제 (ProB)를 보유한다 (WO06066758).
L-발린-생산 코리네형 박테리아는 전형적으로 피드백-내성 또는 탈감작화 아세토락테이트 신타제 (아세토히드록시산 신타제; EC No. 2.2.1.6)를 갖는다.
피드백-내성 아세토락테이트 신타제는 L-발린, L-이소류신 및 L-류신의 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산, 바람직하게는 L-발린에 의한 억제에 대해 야생형에 비해 덜 민감성인 아세토락테이트 신타제를 의미한다.
코리네박테리움의 아세토락테이트 신타제 (IlvB, IlvN)는 ilvB 유전자에 의해 코딩되는 소위 큰 서브유닛 및 ilvN 유전자에 의해 코딩되는 소위 작은 서브유닛으로 이루어진다 (문헌 [Keilhauer et al., Journal of Bacteriology 175(17), 5595-5603 (1993)]). WO 05/003357 및 문헌 [Elisakova et al., Applied and Environmental Microbiology 71(1):207-13 (2005)]에서는 아세토락테이트 신타제에게 L-발린, L-이소류신 및 L-류신에 대한 내성을 부여하는 IlvN 서브유닛의 변이체에 대해 보고하였다. 한 변이체는 아미노산 서열의 위치 21에 L-이소류신 대신에 L-아스파르트산을 포함하고 (IlvN I21D), 위치 22에 L-이소류신 대신에 L-페닐알라닌을 포함한다 (IlvN I22F). 두번째 변이체는 아미노산 서열의 위치 20에 글리신 대신에 L-아스파르트산을 포함하고 (IlvN G20D), 아미노산 서열의 위치 21에 L-이소류신 대신에 L-아스파르트산을 포함하고 (IlvN I21D), 위치 22에 L-이소류신 대신에 L-페닐알라닌을 포함한다 (IlvN I22F).
L-이소류신-생산 코리네형 박테리아는 전형적으로 피드백-내성 또는 탈감작화 쓰레오닌 데히드라타제 (= 쓰레오닌 데아미나제)를 갖는다.
피드백-내성 쓰레오닌 데히드라타제는 L-이소류신에 의한 억제에 대해 야생형에 비해 덜 민감성인 쓰레오닌 데히드라타제 (EC No. 4.3.1.19)를 의미한다. 이 탈감작화 쓰레오닌 데히드라타제를 코딩하는 유전자 또는 대립유전자는 또한 ilvAFBR 대립유전자로 지칭된다.
NCBI 데이터베이스의 기탁 번호 L01508 및 NC_006958에 상응하는 코리네박테리움 글루타미쿰의 야생형 ilvA 유전자의 코딩 영역은 서열 13으로 기재되고, 이 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 서열 14로 기재된다.
US 6,107,063 및 문헌 [Morbach et al., Applied and Environmental Microbiology 61 (12), 4315-4320 (1995)]에 기재된 쓰레오닌 데히드라타제 변이체는 하기 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 교환을 포함한다:
IlvA M199V (서열 14에 따른 코딩된 쓰레오닌 데히드라타제 단백질의 위치 199에서 L-메티오닌이 L-발린으로 교환됨; US 6,107,063 참조),
IlvA A257G (서열 14에 따른 코딩된 쓰레오닌 데히드라타제 단백질의 위치 257에서 L-알라닌이 L-아르기닌으로 교환됨; US 6,107,063 참조),
IlvA H278R (서열 14에 따른 코딩된 쓰레오닌 데히드라타제 단백질의 위치 278에서 L-히스티딘이 L-아르기닌으로 교환됨; US 6,107,063 참조),
IlvA V323A (서열 14에 따른 코딩된 쓰레오닌 데히드라타제 단백질의 위치 323에서 L-발린이 L-알라닌으로 교환됨; 모바하(Morbach) 등의 문헌 참조),
IlvA L351S (서열 14에 따른 코딩된 쓰레오닌 데히드라타제 단백질의 위치 351에서 L-류신이 L-세린으로 교환됨; US 6,107,063 참조),
IlvA D378G (서열 14에 따른 코딩된 쓰레오닌 데히드라타제 단백질의 위치 378에서 L-아스파르트산이 글리신으로 교환됨; 모바하(Morbach) 등의 문헌 참조)
생성된 돌연변이체는 사용된 출발 균주 또는 모 균주에 비해 발효 공정에서 목적하는 아미노산의 배출 또는 생산의 증가를 나타낸다.
마찬가지로, 본 발명은 OxyR 전사 조절자 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고, 아미노산 서열의 위치 89 또는 상응하는 또는 필적하는 위치에서 L-알라닌을 제외한 단백질성 아미노산 중 하나를 포함하며, 바람직하게는 L-발린으로 교환된 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 따른 돌연변이체로부터 단리된다.
추가로, OxyR 유전자의 돌연변이 유발을 위한 시험관내 방법을 이용하는 것이 가능한다. 시험관내 방법을 이용하는 경우, 코리네형 박테리아의 OxyR 유전자, 바람직하게는 선행 기술에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰의 야생형 유전자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 돌연변이원 처리를 가한다.
단리된 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 단리된 전체 DNA 또는 염색체 DNA이거나, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)의 도움으로 제조된 OxyR 유전자의 증폭산물일 수 있다. 이러한 유형의 증폭산물은 또한 PCR 생성물로 지칭된다. 폴리머라제 연쇄 반응의 도움으로 DNA 서열을 증폭시키는 장비는 특히 문헌 [Gait: Oligonucleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984)] 및 [Newton and Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994)]을 통해 당업자가 확인할 수 있다. 마찬가지로, OxyR 유전자가 벡터, 예를 들어 박테리오파지 또는 플라스미드로 먼저 도입되도록 돌연변이시키는 것이 가능하다.
시험관내 돌연변이 유발에 적합한 방법은 특히 문헌 [Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and OxyRated Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992]에 따라 히드록실아민으로 처리, 돌연변이원 올리고뉴클레오티드의 이용 (문헌 [T. A. Brown: Gentechnologie fuer Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993] 및 [R. M. Horton: PCR-Mediated Recombination and Mutagenesis, Molecular Biotechnology 3, 93-99 (1995)]) 및 오류율이 높은 DNA 폴리머라제를 사용한 폴리머라제 연쇄 반응의 이용이다. 이러한 유형의 DNA 폴리머라제는 예를 들어 스트라타젠(Stratagene, 미국 캘리포니아주 라호야 소재)의 뮤타자임(Mutazyme) DNA 폴리머라제 (젠모르프(GeneMorph) PCR 돌연변이 유발 키트, No. 600550)이다.
생체내 또는 시험관내 돌연변이 발생에 대한 추가의 지침 및 고찰은 선행 기술에서 확인할 수 있고, 유전학 및 분자생물학 교재, 예를 들어 나이퍼스(Knippers) 교재 ("Molekulare Genetik", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995), 위나커(Winnacker) 교재 ("Gene and Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990) 또는 하게만(Hagemann) 교재 ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986)로부터 공지되어 있다.
본 발명은 또한 서열 2의 아미노산 서열을 포함하고, L-알라닌을 제외한 단백질성 아미노산 중 하나가 상기 아미노산 서열의 위치 89에 존재하는 OxyR 전사 조절자 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. L-발린으로 교환된 것이 바람직하다. 적절한 경우, 위치 244에 L-발린이 존재한다.
본 발명은 또한 327개 아미노산 길이의 아미노산 서열을 포함하고, L-알라닌을 제외한 단백질성 L-아미노산 중 하나, 바람직하게는 L-발린이 위치 89에 존재하는 OxyR 전사 조절자 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 아미노산 서열의 위치 70 내지 108에 서열 6 또는 8의 위치 70 내지 108에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 OxyR 전사 조절자 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열 6 또는 8의 위치 30 내지 148, 또는 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 188, 또는 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 228, 또는 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 268, 또는 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 308, 또는 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 324, 또는 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 325, 또는 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 326에 상응하는 아미노산 서열을 포함하고, 적절한 경우 위치 244에 L-알라닌 대신에 L-발린이 존재한다. 매우 특히 바람직하게는, 코딩된 폴리펩티드의 길이가 327개 아미노산이다.
본 발명은 또한 아미노산 서열의 위치 89 또는 상응하는 또는 필적하는 위치에 L-알라닌을 제외한 단백질성 아미노산 중 하나, 바람직하게는 L-발린을 포함하고, 각 프라이머의 뉴클레오티드 서열이 서열 3 또는 서열 7의 위치 1 내지 1014, 바람직하게는 위치 1 내지 750의 뉴클레오티드 서열, 및 서열 3 또는 서열 7의 위치 2484 내지 1018, 바람직하게는 위치 2484 내지 1732의 상보적 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 15개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 쌍을 이용하여 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 수득가능한 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, OxyR 전사 조절자 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 이러한 프라이머 쌍의 한 예는 서열 9 및 서열 10으로 기재된다. 바람직한 출발 물질 ("템플레이트" DNA)은 특히 돌연변이원으로 처리된 코리네형 박테리아의 염색체 DNA이다. 염색체 DNA는 특히 바람직하게는 코리네박테리움 속의 것이고, 매우 특히 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 것이다.
본 발명은 또한 아미노산 서열의 위치 89 또는 상응하는 또는 필적하는 위치에 L-알라닌을 제외한 단백질성 아미노산 중 하나, 바람직하게는 L-발린을 포함하고, 적절한 경우 위치 244에 L-발린을 포함하는 OxyR 전사 조절자 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하며, 엄격 조건하에 서열 5에 상보적인 뉴클레오티드 서열과 혼성화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
핵산 또는 폴리뉴클레오티드의 혼성화에 대한 지침은 특히 뵈링거 만하임 게엠베하(Boehringer Mannheim GmbH)의 문헌 ["The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" (Mannheim, Germany, 1993)] 및 리블(Liebl) 등의 문헌 [International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)]을 통해 당업자가 확인할 수 있다. 상기 혼성화는 엄격 조건하에 이루어지며, 이는 형성된 혼성체만이 프로브, 즉 서열 5에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 표적 서열, 즉 상기 프로브로 처리되거나 그로 확인되는 폴리뉴클레오티드가 90％ 이상 동일한 것을 의미한다. 세척 단계를 비롯한 혼성화의 엄격성은 완충 조성물, 온도 및 염 농도의 변화에 의해 영향을 받거나 그에 의해 결정된다. 혼성화 반응은 일반적으로 세척 단계에 비해 비교적 낮은 엄격 조건하에 수행된다 (문헌 [Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996]).
혼성화 반응을 위해 예를 들어 대략 50℃ 내지 68℃의 온도에서 5x SSC 완충액에 상응하는 완충액을 이용하는 것이 가능하다. 이 경우, 프로브 또한 사용된 프로브의 뉴클레오티드 서열과 90％ 미만의 동일성을 나타내는 폴리뉴클레오티드와 혼성화할 수 있다. 이러한 혼성체는 덜 안정하며, 엄격 조건하에 세척함으로써 제거된다. 이는 예를 들어 염 농도를 2x SSC로 감소시키고, 적절한 경우 후속적으로 0.5x SSC로 감소시키고 (독일 만하임 소재의 뵈링거 만하임의 문헌 ["The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" (1995)]), 온도를 대략 50℃ 내지 68℃, 대략 52℃ 내지 68℃, 대략 54℃ 내지 68℃, 대략 56℃ 내지 68℃, 대략 58℃ 내지 68℃, 대략 60℃ 내지 68℃, 대략 62℃ 내지 68℃, 대략 64℃ 내지 68℃, 대략 66℃ 내지 68℃로 설정함으로써 달성될 수 있다. 대략 64℃ 내지 68℃, 또는 대략 66℃ 내지 68℃의 온도 범위가 바람직하다. 적절한 경우, 염 농도를 0.2x SSC 또는 0.1x SSC에 상응하는 농도로 감소시키는 것도 가능하다. SSC 완충액은 적절한 경우 0.1％ 농도의 나트륨 도데실 술페이트 (SDS)를 포함한다. 혼성화 온도를 50℃에서 68℃로 대략 1℃ 내지 2℃씩 단계적으로 상승시킴으로써, 사용된 프로브의 서열 또는 상보적 서열과 90％ 이상 또는 91％ 이상, 바람직하게는 92％ 이상 또는 93％ 이상 또는 94％ 이상 또는 95％ 이상 또는 96％ 이상, 매우 특히 바람직하게는 97％ 이상 또는 98％ 이상 또는 99％ 이상 동일하고, 본 발명에 따른 아미노산 교환을 포함하는 OxyR 전사 조절자 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편을 단리할 수 있다. 이러한 방식으로 수득한 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 혼성화에 대한 추가의 지침은 시장에서 소위 키트 형태로 입수할 수 있다 (예를 들어, 로체 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics GmbH, 독일 만하임 소재)로부터의 DIG Easy Hyb, 카탈로그 번호 1603558). 이러한 방식으로 수득한 뉴클레오티드 서열은 서열 6 또는 서열 8의 아미노산 서열과 90％ 이상, 바람직하게는 92％ 이상 또는 94％ 이상 또는 96％ 이상, 매우 특히 바람직하게는 97％ 이상 또는 98％ 이상 또는 99％ 이상 동일하고, 본 발명에 따른 아미노산 교환을 포함하며, 적절한 경우 위치 244에 L-발린이 존재하는 OxyR 전사 조절자 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명은 또한 아미노산 서열의 위치 89 또는 상응하는 또는 필적하는 위치에 L-알라닌을 제외한 단백질성 아미노산 중 하나를 갖고, 바람직하게는 L-발린으로 교환되고, 추가로 서열 6 또는 서열 8의 아미노산 서열과 90％ 이상, 바람직하게는 92％ 이상 또는 94％ 이상 또는 96％ 이상, 매우 특히 바람직하게는 97％ 이상 또는 98％ 이상 또는 99％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 적절한 경우 위치 244에 L-발린이 존재하는 OxyR 전사 조절자 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 아미노산 서열의 위치 89 또는 상응하는 또는 필적하는 위치에 L-알라닌을 제외한 단백질성 아미노산 중 하나를 포함하고, 바람직하게는 L-발린으로 교환되고, 추가로 서열 5의 뉴클레오티드 서열과 90％ 이상, 바람직하게는 92％ 이상 또는 94％ 이상 또는 96％ 이상, 매우 특히 바람직하게는 97％ 이상 또는 98％ 이상 또는 99％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 적절한 경우 위치 731에 티민이 존재하는 OxyR 전사 조절자 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
또한, 바람직한 단리된 폴리뉴클레오티드는 아미노산 서열의 위치 89 또는 상응하는 또는 필적하는 위치에 L-알라닌을 제외한 단백질성 아미노산 중 하나, 바람직하게는 L-발린을 포함하고, Leu-Gly-Val-Met/Thr/Gln-Leu-Ile/Leu-Glu-Arg-Thr/Ser-Thr/Ser-Arg-Lys-Val-Ile/Leu, Ile-Pro-Thr-Val/Ala-Ala/Gly-Pro-Tyr-Ile/Leu-Leu-Pro 및 Leu-Leu-Leu/Met-Leu-Glu/Asp-Glu/Asp-Gly-His-Cys-Leu-Arg/His-Asp-Gln의 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 모티프 또는 아미노산 서열을 포함하는 OxyR 전사 조절자 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다.
명칭 "Met/Thr/Gln", "Ile/Leu", "Thr/Ser", "Val/Ala", "Ala/Gly", "Leu/Met", "Glu/Asp" 및 "Arg/His"는 "Met 또는 Thr 또는 Gln", "Ile 또는 Leu", "Thr 또는 Ser", "Val 또는 Ala", "Ala 또는 Gly", "Leu 또는 Met", "Glu 또는 Asp" 또는 "Arg 또는 His"가 상응하는 위치에 존재한다는 것을 의미한다.
본 발명은 또한 서열 6 또는 8의 아미노산 서열을 포함하며, 적절한 경우 위치 244에 L-발린이 존재하는 OxyR 전사 조절자 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 코딩된 폴리펩티드는 적절한 경우 하나 이상의 보존적 아미노산 교환(들)을 포함한다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 또는 5개 이하의 보존적 아미노산 교환을 포함한다.
본 발명은 또한 N 또는 C 말단에서 1개 이상의 아미노산의 연장부를 포함하는 서열 6 또는 8의 아미노산 서열을 포함하는 OxyR 전사 조절자 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 이 연장부는 50, 40, 30, 20, 10, 5, 3 또는 2개 이하의 아미노산 또는 아미노산 잔기를 포함한다. 적절한 경우, 서열 6 또는 8의 위치 244에 L-발린이 존재한다.
본 발명은 또한 마지막으로 서열 6 또는 8의 폴리펩티드 변이체를 코딩하고, 적절한 경우 위치 244에 L-글루탐산이 존재하고, 하나 이상의 삽입 또는 결실을 포함하는 OxyR 대립유전자에 관한 것이다. 바람직하게는, 이들은 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개 또는 최대 2개의 아미노산의 삽입 또는 결실을 포함한다. 바람직하게는, 서열 모티프 Leu-Gly-Val-Met/Thr/Gln-Leu-Ile/Leu-Glu-Arg-Thr/Ser-Thr/Ser-Arg-Lys-Val-Ile/Leu, Ile-Pro-Thr-Val/Ala-Ala/Gly-Pro-Tyr-Ile/Leu-Leu-Pro 및 Leu-Leu-Leu/Met-Leu-Glu/Asp-Glu/Asp-Gly-His-Cys-Leu-Arg/His-Asp-Gln은 이러한 삽입/결실에 의해 방해되지 않는다.
본 발명은 또한 서열 5 또는 서열 7 또는 서열 21에 도시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명은 마지막으로 돌연변이체 DM1914의 OxyR 대립유전자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 OxyR 대립유전자의 코딩 영역의 일부를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 매 경우 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열의 위치 89에 아미노산 교환을 포함한다.
특히, 서열 2의 위치 70 내지 108에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하거나, 서열 2의 위치 30 내지 148에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하거나, 서열 2의 위치 2 내지 188에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하거나, 서열 2의 위치 2 내지 228에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하거나, 서열 2의 위치 2 내지 268에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하거나, 서열 2의 위치 2 내지 308에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하거나, 서열 2의 위치 2 내지 324에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하거나, 서열 2의 위치 2 내지 325에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하거나, 위치 2 내지 326에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하고, L-알라닌을 제외한 단백질성 아미노산 중 하나, 바람직하게는 L-발린이 서열 2의 89에 상응하는 위치에 존재하고, 적절한 경우 위치 244에 L-발린이 존재하는 핵산 분자 또는 DNA 단편을 포함한다.
서열 2에 상응하는 위치 70 내지 108로부터의 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하고, L-알라닌을 제외한 단백질성 아미노산 (Xaa) 중 하나가 상기 아미노산 서열의 89에 상응하는 위치에 존재하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명에 따른 리딩 프레임의 한 예는 다음과 같다:
Figure 112009029233091-PCT00001
마찬가지로, 이는 서열 17로 기재된다. 이 리딩 프레임에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 서열 18로 기재된다. 서열 18에서 위치 20은 서열 2, 4, 6 또는 8의 위치 89에 상응한다.
바람직한 핵산 분자는 서열 6 또는 8의 위치 70 내지 108에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열, 또는 서열 6 또는 8의 위치 30 내지 148에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열, 또는 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 188에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열, 또는 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 228에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열, 또는 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 268에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열, 또는 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 308에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열, 또는 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 324에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열, 또는 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 325에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열, 또는 서열 6 또는 8의 위치 2 내지 326에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하고, 적절한 경우 위치 244에 L-발린이 존재한다.
서열 6 또는 8의 위치 70 내지 108에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명에 따른 리딩 프레임의 한 예는 다음과 같다:
Figure 112009029233091-PCT00002
마찬가지로, 상기 리딩 프레임은 서열 19로 기재된다. 서열 20은 이 리딩 프레임에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 20에서 위치 20은 서열 2, 4, 6 또는 8의 위치 89에 상응한다.
매우 특히 바람직한 핵산 분자는 서열 7의 위치 958 내지 1074에 상응하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 7의 위치 838 내지 1194에 상응하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 7의 위치 718 내지 1314에 상응하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 7의 위치 598 내지 1434에 상응하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 7의 위치 478 내지 1554에 상응하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 7의 위치 358 내지 1674에 상응하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 7의 위치 310 내지 1722에 상응하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 7의 위치 307 내지 1725에 상응하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 7의 위치 303 내지 1728에 상응하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 적절한 경우 위치 731에 티민이 존재한다.
서열 17 및 19에 뉴클레오티드 서열로 예시되고 서열 18 및 서열 20에 코딩된 아미노산 서열의 형태로 예시된 본 발명에 따른 리딩 프레임은 하나 이상의 보존적 아미노산 교환을 유도하는 하나 이상의 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이는 최대 4％, 최대 2％ 또는 최대 1％의 보존적 아미노산 교환을 유도한다. 본 발명에 따른 리딩 프레임은 또한 하나 이상의 침묵 돌연변이를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 리딩 프레임은 4％ 이하, 특히 바람직하게는 2％ 이하, 1％ 이하의 침묵 돌연변이를 포함한다.
본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드는 미생물의 재조합 균주의 제조에 사용될 수 있으며, 이는 초기 또는 모 균주에 비해 개선된 방식으로 그 주변의 배지로 아미노산을 방출하거나, 세포의 내부에 아미노산을 축적시킨다.
코리네형 박테리아의 유전자로 돌연변이를 도입하기 위해 널리 보급된 방법은 대립유전자 교환 방법이며, 이는 또한 "유전자 교체"라는 이름으로 공지되어 있다. 이 방법에서는, 관심 돌연변이를 포함하는 DNA 단편을 코리네형 박테리아의 목적하는 균주로 전달하여, 2회 이상의 재조합 사건 또는 교차 사건에 의해 돌연변이를 목적하는 균주의 염색체로 도입시키거나, 관련 균주에 존재하는 유전자 서열을 돌연변이된 서열로 교환시킨다.
문헌 [Schwarzer and Puehler, Biotechnology 9, 84-87 (1991)]에서는 이 방법을 이용하여 씨. 글루타미쿰의 염색체에 야생형 유전자 대신에 결실을 품고 있는 lysA 대립유전자를 도입하고, 삽입을 품고 있는 lysA 대립유전자를 도입하였다. 문헌 [Schaefer et al., Gene 145, 69-73 (1994)]에서는 이 방법을 이용하여 씨. 글루타미쿰의 hom-thrB 오페론에 결실을 도입하였다. 나까가와(Nakagawa) 등의 EP 1108790 및 문헌 [Ohnishi et al., Applied Microbiology and Biotechnology 58(2), 217-223 (2002)]에서는 이 방법을 이용하여 단리된 대립유전자로부터 출발하여 다양한 돌연변이를 씨. 글루타미쿰의 염색체에 도입하였다. 나까가와(Nakagawa) 등은 이 방법을 이용하여 Val59Ala로 지칭되는 돌연변이를 호모세린 데히드로게나제 유전자 (hom)에, Thr311Ile로 지칭되는 돌연변이를 아스파테이트 키나제 유전자 (lysC 또는 ask)에, Pro458Ser로 지칭되는 돌연변이를 피루베이트 카르복실라제 유전자 (pyc)에, Ala213Thr로 지칭되는 유전자를 씨. 글루타미쿰 균주의 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 유전자 (zwf)에 도입하였다.
본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 서열 5에 도시된 완전한 영역을 포함하거나, 상기 코딩 영역의 일부, 예를 들어 서열 6 또는 8의 위치 70 내지 108에 상응하는 하나 이상의 아미노산 서열을 코딩하며 서열 17 및 18로 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 서열 17 및 18에 상응하는 코딩 영역의 일부는 길이가 117개 이상의 핵염기이다. 바람직한 서열 7의 일부는 위치 1194 내지 838의 하나 이상의 서열을 포함하며, 상응하게는 길이가 357개 이상의 핵염기인 것이다. 특히 바람직한 서열 7의 일부는 위치 1314 내지 718의 하나 이상의 서열을 포함하며, 상응하게는 길이가 597개 이상의 핵염기인 것이다. 매우 특히 바람직한 서열 7의 일부는 위치 1434 내지 598의 하나 이상의 서열을 포함하며, 상응하게는 길이가 837개 이상의 핵염기인 것이다.
관심 돌연변이를 포함하는 DNA 단편은 전형적으로 이러한 방식으로 벡터, 특히 플라스미드에 존재하며, 상기 벡터는 바람직하게는 상기 돌연변이로부터 제공되는 균주에 의해 단지 제한적으로 복제되거나 전혀 복제되지 않는다. 일반적으로, 에세리키아 속의 박테리아, 바람직하게는 에세리키아 콜라이(Escherichia coli) 종은 벡터가 복제될 수 있는 보조 또는 중간 숙주로서 사용된다.
이러한 플라스미드 벡터의 예는 문헌 [Schaefer et al., Gene 145, 69-73 (1994)]에 기재된 pK*mob 및 pK*mobsacB 벡터, 예를 들어 pK18mobsacB, 및 WO 02/070685 및 WO 03/014362에 기재된 벡터이다. 이들은 에세리키아 콜라이에서는 복제되나, 코리네형 박테리아에서는 그렇지 않다. 특히 적합한 벡터는 조건부로 부정적인 우성 효과를 갖는 유전자, 예를 들어 바실러스(Bacillus)의 sacB 유전자 (레반 수크라제 유전자), 또는 에세리키아 콜라이의 galK 유전자 (갈락토스 키나제 유전자)를 포함하는 것이다. (조건부로 부정적인 우성 효과를 갖는 유전자는 특정 조건하에 숙주에게 불리한, 예를 들어 독성이지만, 다른 조건하에서는 그 유전자를 품고 있는 숙주에게 전혀 부정적인 효과를 갖지 않는 유전자를 의미한다.) 이는 벡터가 염색체로부터 제거되는 재조합 사건을 위해 선택하는 것을 가능하게 한다. 또한, 나까무라(Nakamura) 등의 US-A-6,303,383에서는 31℃ 미만에서만 복제할 수 있는 코리네형 박테리아를 위한 온도-민감성 플라스미드를 기재하였다.
그 후, 벡터는 접합에 의해, 예를 들어 문헌 [Schaefer et al., Journal of Bacteriology 172, 1663-1666 (1990)]에 기재된 방법에 의해, 또는 형질변형에 의해, 예를 들어 문헌 [Dunican and Shivnan, Biotechnology 7, 1067-1070 (1989)]에 기재된 방법, 또는 문헌 [Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)]에 기재된 방법에 의해 코리네형 박테리아로 전달된다. 적절한 경우, DNA의 전달은 또한 입자 충격에 의해 달성될 수 있다.
통합을 유발하는 제1 교차 사건, 및 표적 유전자 또는 표적 서열에서 절제를 유발하는 적합한 제2 교차 사건에 의한 상동성 재조합을 통해 돌연변이가 도입되어, 재조합 박테리아가 생성된다.
생성된 균주를 확인하고 특징 분석하는데 이용될 수 있는 방법으로는 특히 써던 블롯팅 혼성화, 폴리머라제 연쇄 반응, 서열 결정, 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 방법 (문헌 [Lay et al. Clinical Chemistry 43, 2262-2267 (1997)]) 또는 효소학적 방법이 있다.
따라서, 본 발명은 또한
a) 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 코리네형 박테리아로 전달하는 단계,
b) 코리네형 박테리아의 염색체에 존재하고, 아미노산 서열의 위치 89 또는 필적하는 위치에 L-알라닌을 가진 아미노산 서열을 코딩하는 OxyR 유전자를, 아미노산 서열의 위치 89 또는 필적하는 위치에서 다른 단백질성 L-아미노산, 바람직하게는 L-발린을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 상기 a)로부터의 폴리뉴클레오티드로 교환하는 단계, 및
c) 상기 단계 a) 및 b)에서 수득한 코리네형 박테리아를 증식시키는 단계
를 포함하는 코리네형 박테리아의 제조 방법에 관한 것이다.
이러한 방식으로, 야생형 OxyR 유전자 대신에 본 발명에 따른 하나의 OxyR 대립유전자를 포함하는 재조합 코리네형 박테리아가 수득된다.
미생물의 제조를 위한 본 발명에 따른 추가의 방법은
a) OxyR 전사 조절자 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 미생물에 전달하는 단계,
b) 상기 미생물에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제시키는 단계, 및
c) 상기 단계 a) 및 b)에서 수득한 미생물을 증식시키는 단계
로 이루어진다.
이러한 방식으로, 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열의 위치 89 또는 필적하는 위치에 L-알라닌을 제외한 단백질성 아미노산 중 하나를 포함하는, 바람직하게는 L-발린으로 교환된 OxyR 전사 조절자를 코딩하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 적어도 한 카피 또는 다수개의 카피로 포함하는 재조합 미생물이 수득된다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 또는 숙수 세포, 바람직하게는 미생물, 특히 바람직하게는 코리네형 박테리아 및 에세리키아 속의 박테리아에 관한 것이다. 마찬가지로, 본 발명은 단리된 폴리뉴클레오티드를 사용하여 제조된 미생물에 관한 것이다. 이러한 유형의 미생물 또는 박테리아는 또한 재조합 미생물 또는 재조합 박테리아로 지칭된다. 마찬가지로, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 마지막으로, 마찬가지로 본 발명은 이들 벡터를 포함하는 숙주에 관한 것이다.
본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드는 마찬가지로 이들에 의해 코딩된 폴리펩티드의 과발현을 달성하는데 이용될 수 있다.
일반적으로, 과발현은 리보핵산, 단백질 또는 효소의 세포내 농도 또는 활성의 증가를 의미한다. 본 발명의 경우, 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열의 위치 89에 L-알라닌을 제외한 단백질성 아미노산 중 하나를 포함하는, 바람직하게는 L-발린으로 교환된 OxyR 전사 조절자를 코딩하는 OxyR 대립유전자 또는 폴리뉴클레오티드가 과발현된다.
형성된 폴리펩티드로부터 아미노펩티다제로 불리는 숙주 자신의 효소에 의해 N-말단 아미노산, 특히 N-말단 메티오닌이 제거될 수 있다.
유전자 생성물의 농도 또는 활성의 이러한 증가는 예를 들어 적절한 폴리뉴클레오티드의 카피수를 한 카피 이상 증가시킴으로써 달성될 수 있다.
카피수를 증가시키기 위해 널리 이용되는 방법은 적절한 유전자 또는 대립유전자를 벡터, 바람직하게는 코리네형 박테리아에 의해 복제되는 플라스미드에 도입하는 것으로 이루어진다. 적합한 플라스미드 벡터는 예를 들어 pZ1 (문헌 [Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554]) 또는 pSELF 벡터 (문헌 [Tauch et al., Journal of Biotechnology 99, 79-91 (2002)])이다. 코리네박테리움 글루타미쿰 내의 플라스미드를 주제로 하는 고찰은 문헌 [Tauch et al., Journal of Biotechnology 104, 27-40 (2003)]에서 확인할 수 있다.
과발현을 달성하기 위해 널리 이용되는 또다른 방법은 염색체 유전자 증폭 방법이다. 이 방법에서는, 추가의 한 카피 이상의 관심 유전자 또는 대립유전자를 코리네형 박테리아의 염색체에 도입시킨다.
한 실시양태에서, 예를 들어 hom-thrB 오페론에 대해 문헌 [Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)]에 기재된 바와 같이, 씨. 글루타미쿰에서는 복제되지 않으며 관심 유전자를 포함하는 플라스미드를 코리네형 박테리아에 전달한다. 교차 사건에 의한 상동성 재조합 이후 생성된 균주는 2 카피 이상의 관련 유전자 또는 대립유전자를 포함한다.
또다른 실시양태에서, WO 03/040373 및 US-2003-0219881-A1에 기재된 바와 같이, 2회 이상의 재조합 사건에 의해 한 카피 이상의 관심 유전자를 씨. 글루타미쿰의 염색체 내의 목적하는 부위로 도입시킨다. 예를 들어 이러한 방식으로, L-리신-비민감성 아스파테이트 키나제를 코딩하는 한 카피의 lysC 대립유전자를 씨. 글루타미쿰의 gluB 유전자에 도입시켰다.
추가의 실시양태에서, WO 03/014330 및 US-2004-0043458-A1에 기재된 바와 같이, 2회 이상의 재조합 사건에 의해 추가의 한 카피 이상의 관심 유전자를 이미 존재하는 유전자 또는 대립유전자의 천연 부위로 바람직하게는 종열(tandem) 정렬로 도입시킨다. 예를 들어 이러한 방식으로, lysCFBR 대립유전자의 종열 중복을 천연 lysC 유전자 부위에서 달성하였다.
마지막으로, 트랜스포손 및 IS 요소의 도움으로 카피수를 증가시키는 것이 가능하다 (US 5,804,414, US 5,591,577 참조).
과발현을 달성하는 추가의 방법은 적절한 유전자 또는 대립유전자를 프로모터 또는 발현 카세트에 기능적 방식으로 연결 (작동가능하게 연결)하는 것으로 이루어진다. 코리네박테리움 글루타미쿰을 위한 적합한 프로모터는 예를 들어 문헌 [Patek et al., Journal of Biotechnology 104(1-3), 311-323 (2003)]에 기재되어 있다. 동일한 방식으로, 문헌 [Vasicova et al., Journal of Bacteriology 181, 6188-6191 (1999)]에 기재된 dapA 프로모터의 변이체, 예를 들어 프로모터 A25를 사용하는 것이 가능하다. 코리네박테리움 글루타미쿰의 gap 프로모터를 사용하는 것도 가능하다 (EP 06007373). 마지막으로, 문헌 [Amann et al., Gene 69(2), 301-315 (1988)] 및 [Amann and Brosius, Gene 40(2-3), 183-190 (1985)]에 기재되어 있는 널리 공지된 프로모터 T3, T7, SP6, M13, lac, tac 및 trc를 사용할 수 있다. 이러한 유형의 프로모터는 예를 들어 천연적으로 위치 89에 존재하는 아미노산 L-알라닌 대신에 다른 단백질성 아미노산을 포함하는 재조합 코리네형 박테리아의 OxyR 대립유전자의 상류, 전형적으로 출발 코돈으로부터 대략 1 내지 500개 뉴클레오티드 거리에 삽입될 수 있다. 마찬가지로, 이러한 유형의 프로모터는 본 발명에 따른 돌연변이체의 OxyR 대립유전자의 코딩 역역의 상류에 천연적으로 삽입될 수 있다. 또한, OxyR 전사 조절자의 본 발명에 따른 변이체를 코딩하는 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드를 프로모터에 연결하여, 생성된 발현 단위를 여분의 염색체 복제 플라스미드로 또는 코리네형 박테리아의 염색체로 도입하는 것이 가능하다.
구조 유전자의 상류에 위치하는 프로모터 영역 및 조절 영역 또는 리보솜 결합 부위를 돌연변이시키는 것 또한 가능하다. 마찬가지로, mRNA의 수명을 연장시킴으로써 발현이 개선된다. 마찬가지로, 효소 활성 또한 효소 단백질의 파괴를 방지함으로써 개선된다. 추가로 가능한 대안은 배지의 조성 및 배양물 관리의 변경을 통해 관련 유전자 또는 대립유전자를 과발현시키는 것이다.
일반적으로, 적절한 단백질의 활성 또는 농도는 과발현 방법에 의해 출발 미생물 또는 모 균주에서의 단백질 활성 또는 농도에 비해 적어도 10％, 25％, 50％, 75％, 100％, 150％, 200％, 300％, 400％ 또는 500％, 최대 1000％ 또는 2000％까지 증가된다. 출발 미생물 또는 모 균주는 본 발명의 방법이 수행되는 미생물이다.
단백질의 농도는 1-차원 및 2-차원 단백질을 겔 분별화하고, 후속적으로 상기 겔에서 적절한 평가 소프트웨어를 이용하여 단백질 농도를 광학적으로 확인함으로써 측정할 수 있다. 코리네형 박테리아의 경우에 단백질 겔의 제조 및 상기 단백질의 확인에 유용한 방법은 문헌 [Hermann et al., Electrophoresis, 22:1712-23 (2001)]에 기재된 절차이다. 마찬가지로, 단백질 농도는 검출할 단백질에 대해 특이적인 항체를 이용하는 웨스턴 블롯 혼성화를 수행하고 (문헌 [Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]), 후속적으로 농도를 측정하기 위한 적절한 소프트웨어를 사용하여 광학적으로 평가함으로써 측정될 수 있다 (문헌 [Lohaus and Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39; Lottspeich, Angewandte Chemie 38: 2630-2647 (1999)]).
따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 OxyR 전사 조절자를 과발현시키는 방법에 관한 것이다. 과발현을 위한 본 발명에 따른 한 방법은 특히 코딩된 아미노산 서열의 위치 89 또는 상응하는 위치에 L-알라닌을 제외한 단백질성 아미노산 중 하나가 존재하는 OxyR 전사 조절자 변이체를 코딩하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 카피수를 적어도 한 카피 또는 다수개의 카피로 증가시키는 것으로 이루어진다. 본 발명에 따른 추가의 방법은 상기 폴리뉴클레오티드에 프로모터를 기능적으로 연결시키는 것으로 이루어진다.
본 발명은 또한 그들의 세포 내에서 본 발명에 따른 OxyR 전사 조절자 변이체의 농도 또는 활성이 증가된 미생물에 관한 것이다.
추가로, L-아미노산의 생산을 증가시키기 위해, 본 발명에 따른 돌연변이체 또는 재조합 균주에서 다양한 유전자를 과발현시키는 것이 유용할 수 있다. 일반적으로, 내인성 유전자를 사용하는 것이 바람직하다.
"내인성 유전자" 또는 "내인성 뉴클레오티드 서열"은 한 종의 집단 내에 존재하는 유전자 또는 뉴클레오티드 서열, 또는 대립유전자를 의미한다.
따라서, L-리신을 제조하기 위해서는, 하기 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 과발현시키는 것이 가능하다:
* 디히드로디피콜리네이트 신타제를 코딩하는 dapA 유전자 (DapA, EC No. 4.2.1.52), 예를 들어 EP 0 197 335에 기재된 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰의 dapA 유전자,
* 디아미노피멜레이트 데카르복실라제를 코딩하는 lysA 유전자 (LysA, EC No. 4.1.1.20), 예를 들어 US 6,090,597에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869의 lysA 유전자,
* 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 zwf 유전자 (Zwf, EC No. 1.1.1.49), 예를 들어 JP-A-09224661 및 EP-A-1108790에 기재된 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰의 zwf 유전자,
* US-2003-0175911-A1에 기재된 바와 같이 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 활성을 갖는 단백질을 코딩하고, 예를 들어 아미노산 서열의 위치 243의 L-알라닌이 L-쓰레오닌으로 교체되거나, 위치 245의 L-아스파르트산이 L-세린으로 교체된 코리네박테리움 글루타미쿰의 zwf 대립유전자,
* 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 pyc 유전자 (Pyc, EC No. 6.4.1.1), 예를 들어 DE-A-198 31 609 및 EP 1108790에 기재된 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰의 pyc 유전자,
* EP 1 108 790에 기재된 바와 같이 피루베이트 카르복실라제 활성을 갖는 단백질을 코딩하며, 아미노산 서열의 위치 458의 L-프롤린이 L-세린으로 교체된 코리네박테리움 글루타미쿰의 pyc 대립유전자,
* WO 02/31158, 특히 EP1325135B1에 기재된 바와 같이 피루베이트 카르복실라제 활성을 가진 단백질을 코딩하고, 위치 1의 L-발린이 L-메티오닌으로 교체, 위치 153의 L-글루탐산이 L-아스파르트산으로 교체, 위치 182의 L-알라닌이 L-세린으로 교체, 위치 206의 L-알라닌이 L-세린으로 교체, 위치 227의 L-히스티딘이 L-아르기닌으로 교체, 위치 455의 L-알라닌이 글리신으로 교체, 및 위치 1120의 L-아스파르트산이 L-글루탐산으로 교체의 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 교환을 품고 있는 코리네박테리움 글루타미쿰의 pyc 대립유전자,
* 아스파테이트 키나제를 코딩하는 lysC 유전자 (LysC, EC No. 2.7.2.4), 예를 들어 EP-A-1108790에서 서열 281로 기재된 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰의 lysC 유전자 (기탁 번호 AX120085 및 120365 또한 참조) 및 WO 01/00843에서 서열 25로 기재된 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰의 lysC 유전자 (기탁 번호 AX063743 참조),
* 피드백-내성 아스파테이트 키나제 변이체를 코딩하는 lysCFBR 대립유전자, 특히 표 1에 상응하는 것,
* 리신 익스포트 단백질을 코딩하는 lysE 유전자 (LysE), 예를 들어 DE-A-195 48 222에 기재된 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰의 lysE 유전자,
* 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 aat 유전자 (Aat, EC No. 2.6.1.1) (코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 aat 유전자는 예를 들어 문헌 [Kalinowski et al., Journal of Biotechnology 104 (1-3), 5 25 (2003)]에 기재되어 있다. 기탁 번호 NC_006958 또한 참조한다. 상기 문헌에서는 aspB 유전자로 지칭된다. US 6,004,773에서, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자는 aspC로 지칭된다. 문헌 [Marienhagen et al., Journal of Bacteriology 187 (22), 7693-7646 (2005)]에서는 aat 유전자가 aspT 유전자로 지칭된다.),
* Zwa1 단백질을 코딩하는 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰의 zwa1 유전자 (US 6,632,644).
또한, L-리신의 제조를 위해, 적절한 경우 상기 언급한 유전자 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 과발현과 동시에 본 발명에 따른 OxyR 유전자의 대립유전자를 사용하는 것 이외에도, 하기 군으로부터 선택된 하나 이상의 내인성 유전자를 감쇠 또는 차단(switch off)하는 것이 유리할 수 있다:
* 글루코스-6-포스페이트 아이소머라제를 코딩하는 pgi 유전자 (Pgi, EC No. 5.3.1.9), 예를 들어 US 6,586,214 및 US 6,465,238에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰의 pgi 유전자,
* 호모세린 데히드로게나제를 코딩하는 hom 유전자 (Hom, EC No. 1.1.1.3), 예를 들어 EP-A-0131171에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰의 hom 유전자,
* 호모세린 키나제를 코딩하는 thrB 유전자 (ThrB, EC No. 2.7.1.39), 예를 들어 문헌 [Peoples et al., Molecular Microbiology 2 (1988): 63-72]에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰의 thrB 유전자,
* 포스포프럭토키나제를 코딩하는 pfkB 유전자 (PfkB, EC No. 2.7.1.56), 예를 들어 WO 01/00844 (서열 57)에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰의 pfkB 유전자,
* 예를 들어 WO 02/02778에 기재된 말레이트 데히드로게나제를 코딩하는 mdh 유전자 (Mdh, EC No. 1.1.1.37),
* 예를 들어 US 7,094,106 및 PCT/EP2005/057216에 기재된 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제를 코딩하는 mqo 유전자 (Mqo, EC No. 1.1.99.16).
문맥상 용어 "감쇠"는 예를 들어 약한 프로모터를 이용하거나, 활성이 낮은 상응하는 효소를 코딩하거나 상응하는 유전자 또는 효소 (단백질)을 불활성화시키는 유전자 또는 대립유전자를 이용하거나, 이들을 조합하여, 적절한 DNA에 의해 코딩되는 미생물 중 하나 이상의 효소 (단백질)의 세포내 활성을 감소 또는 차단하는 것을 나타낸다.
감쇠 처치는 일반적으로 야생형 단백질의 활성 또는 농도, 또는 출발 미생물에서의 단백질의 활성 또는 농도의 0 내지 75％, 0 내지 50％, 0 내지 25％, 0 내지 10％ 또는 0 내지 5％로 상응하는 단백질의 활성 또는 농도를 감소시킨다.
감쇠를 유발하는 적합한 돌연변이는 하나 이상의 염기쌍 또는 뉴클레오티드의 전위, 전좌, 삽입 및 결실이다. 돌연변이에 의해 초래되는 아미노산 교환이 효소 활성에 미치는 영향에 따라, 미스센스(missense) 돌연변이 또는 넌센스(nonsense) 돌연변이라고 한다. 미스센스 돌연변이는 단백질에서의 해당 아미노산이 또다른 것으로 교환되도록 하며, 상기 아미노산 교환은 특히 비-보존적인 것이다. 이는 단백질의 작용 능력 또는 활성을 손상시키며, 이들 능력 또는 활성을 0 내지 75％, 0 내지 50％, 0 내지 25％, 0 내지 10％ 또는 0 내지 5％의 값으로 감소시킨다. 넌센스 돌연변이는 유전자의 코딩 영역에서 정지 코돈을 유도하여 번역의 비정상적인 종결을 초래한다. 유전자에서의 하나 이상의 염기쌍의 삽입 또는 결실은 부정확한 아미노산이 혼입되게 하거나 번역이 비정상적으로 종결되도록 하는, 틀이동 돌연변이를 초래한다. 상기 돌연변이가 코딩 영역에서 정지 코돈을 생성한다면, 이 또한 번역의 비정상적인 종결을 초래한다. 상기 처치들은 바람직하게는 폴리펩티드의 N 말단을 코딩하는 코딩 영역의 5'-말단부에서 수행된다. 폴리펩티드의 총 길이 (화학적으로 연결된 L-아미노산의 개수로서 측정한 것)를 100％라 하면, 폴리펩티드의 N 말단에 속하는 아미노산 서열 부분은 - 본 발명의 상황에서 - 출발 아미노산 L-포르밀메티오닌 이후의 L-아미노산의 80％를 차지한다.
이러한 돌연변이 발생에 대한 보다 자세한 지침은 당분야의 기술 수준의 일부이며, 유전학 및 분자생물학의 공지 문헌, 예를 들어 문헌 [Knippers, "Molekulare Genetik," 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995], 문헌 [Winnacker, "Gene and Klone," VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990] 또는 문헌 [Hagemann, "Allgemeine Genetik," Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986]에서 찾아볼 수 있다. 추가의 처치가 선행기술로 개시되어 있다.
유전자 발현의 표적화된 감소를 위한 한 방법은 감쇠시킬 유전자를, 계량된 양의 IPTG (이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드)를 첨가함으로써 유도될 수 있는 프로모터, 예를 들어 trc 프로모터 또는 tac 프로모터의 조절하에 두는 것으로 이루어진다. 예를 들어, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 클로닝된 유전자의 IPTG-의존성 발현을 가능하게 하는, 에세리키아 콜라이 발현 벡터 pXK99E (WO0226787; 부다페스트 조약에 따라 2001년 7월 31일자로 DSMZ (Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen; 독일 브런즈윅 소재)에 DH5alpha/pXK99E에서의 DSM14440으로서 기탁됨) 또는 pVWEx2 (문헌 [Wendisch, Ph. D. thesis, Berichte des Forschungszentrums Juelich, Juel-3397, ISSN 0994-2952, Juelich, Germany (1997)])와 같은 벡터가 이러한 목적에 적합하다.
이러한 방법은, 예를 들어 특허 WO0226787에서 벡터 pXK99EdeaD의 코리네박테리움 글루타미쿰의 게놈으로의 융합에 의한 deaD 유전자의 발현 조절에, 또한 문헌 [Simic et al., Applied and Environmental Microbiology 68: 3321-3327 (2002)]에서 벡터 pK18mobglyA'의 코리네박테리움 글루타미쿰으로의 융합에 의한 glyA 유전자의 발현 조절에 이용되었다.
유전자 발현을 특이적으로 감소시키는 또다른 방법은, 짧은 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 벡터를 표적 세포로 유도하여 보다 긴 안티센스 RNA를 합성하는 안티센스 기술이다. 안티센스 RNA는 특정 mRNA의 상보적 절편에 결합하여 그의 안정성을 감소시키거나 또는 번역가능성을 차단할 수 있다. 당업자라면 문헌 [Srivastava et al., Applied Environmental Microbiology 2000 Oct; 66 (10): 4366 - 4371]에서 그 예를 찾아볼 수 있을 것이다.
본 발명의 처치에 의해 얻어지는 단리된 코리네형 박테리아는 발효 공정에서, 이용되는 출발 균주 또는 모 균주와 비교하였을 때 증가한 목적 아미노산의 분비 또는 생산을 보인다.
단리된 박테리아는 아미노산 서열의 위치 89에서 상기 기재된 아미노산 교환을 포함하는 OxyR 전사 조절자를 코딩하는 oxyR 대립유전자를 포함하는, 본 발명에 따라 단리되고 생산된 돌연변이체 및 재조합 박테리아, 특히 코리네형 박테리아를 의미한다.
단리된 박테리아 또는 그를 이용한 발효 공정의 수확량은 생성물 농도 (부피당 생성물), 생성물 수율 (소비된 탄소 공급원당 생산된 생성물) 및 생성물 생산율 (부피 및 시간당 생산된 생성물)의 군으로부터 선택된 파라미터 또는 그외 다른 공정 파라미터 및 이들의 조합 중 하나 이상과 관련하여 출발 균주 또는 모 균주, 또는 그를 이용한 발효 공정에 비해 0.5％ 이상, 1％ 이상, 1.5％ 이상 또는 2％ 이상 개선된다.
본 발명에 따른 단리된 코리네형 박테리아는 L-아미노산을 생산하기 위해, 예를 들어 PCT/EP2004/008882에 개시된 바와 같이 연속적으로, 또는 회분식 공정 (회분식 배양)으로 또는 유가식 또는 반복된 유가식 공정으로 불연속적으로 배양시킬 수 있다. 공지된 배양 방법에 대한 전반적인 특징의 개요는 문헌 [Chmiel, Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)] 또는 문헌 [Storhas, Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)]에서 찾아볼 수 있다.
이용할 배양 배지 또는 발효 배지는 개개의 균주의 요구를 적합한 방식으로 만족시켜야 한다. 여러 미생물의 배양 배지에 관한 설명은 미국 세균학회 (American Society for Bacteriology)의 편람 [Manual of Methods for General Bacteriology] (미국 워싱턴 D.C., 1981)에 있다. 용어 "배양 배지", "발효 배지" 및 "영양 배지" 또는 "배지"는 상호 교환가능하다.
사용가능한 탄소 공급원은 당류 및 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 수크로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 몰라시즈, 사탕무 또는 사탕수수 생성물로부터의 수크로스-함유액, 전분, 전분 가수분해물 및 셀룰로스, 오일 및 지방류, 예를 들어 대두유, 해바라기유, 낙화생유 및 코코넛 지방, 지방산, 예를 들어 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산, 알콜류, 예를 들어 글리세롤, 메탄올 및 에탄올, 및 유기산, 예를 들어 아세트산이다. 이들 물질은 단독으로 또는 혼합물로서 사용가능하다.
사용가능한 질소 공급원은 유기 질소-함유 화합물, 예컨대 펩톤, 효모 추출물, 육류 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두분 및 우레아, 또는 무기 화합물, 예컨대 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이다. 질소 공급원은 단독으로 또는 혼합물로서 사용가능하다.
사용가능한 인 공급원은 인산, 인산 2수소 칼륨 또는 인산 수소 2칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이다.
배양 배지는 추가로 성장에 필요한 염을, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 및 철과 같은 금속의 클로라이드 또는 술페이트 형태로, 예를 들어 마그네슘 술페이트 또는 철 술페이트의 형태로 포함해야 한다. 마지막으로, 상기 언급한 물질들 이외에 아미노산, 예를 들어 호모세린, 및 비타민, 예를 들어 티아민, 비오틴 또는 판토텐산과 같은 필수 성장 인자가 사용될 수 있다. 또한, 각각의 아미노산의 적합한 전구체를 배양 배지에 첨가하는 것도 가능하다.
상기 출발 물질들을 단일 회분식으로 배양물에 첨가하거나 또는 적합한 방식으로 배양 중에 공급할 수 있다.
배양물의 pH를 조절하기 위해서, 염기성 화합물, 예컨대 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 수성 암모니아, 또는 산성 화합물, 예컨대 인산 또는 황산을 적합한 방식으로 이용한다. pH는 일반적으로 6.0 내지 9.0, 바람직하게는 6.5 내지 8의 값으로 조정된다. 발포성을 조절하기 위해서, 소포제, 예를 들어 지방산 폴리글리콜 에스테르를 이용할 수 있다. 플라스미드의 안정성을 유지하기 위해서, 적합한 선택적 작용 물질, 예를 들어 항생제를 배지에 첨가할 수 있다. 호기성 조건을 유지하기 위해서, 산소 또는 산소-함유 기체 혼합물, 예를 들어 공기를 배양물에 혼입한다. 또한 과산화수소가 풍부화된 액체를 사용하는 것도 가능하다. 발효는 적절한 경우 과잉 압력, 예를 들어 0.03 내지 0.2 MPa의 압력으로 수행한다. 배양 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 회분식 공정에서, 배양은 목적 아미노산이 최대로 생성될 때까지 계속된다. 이러한 목적은 통상적으로 10시간 내지 160시간 이내에 달성된다. 연속식 공정에서는 보다 장시간의 배양이 가능하다.
적합한 발효 배지가, 특히 US 6,221,636, US 5,840,551, US 5,770,409, US 5,605,818, US 5,275,940, US 4,275,157 및 US 4,224,409에 개시되어 있다.
L-아미노산의 측정 방법은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어 문헌 [Spackman et al., Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190]에 개시된 바와 같이 음이온 교환 크로마토그래피에 이어서 닌하이드린 유도체화에 의해, 또는 문헌 [Lindroth et al., Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174]에 개시된 바와 같이 역상 HPLC에 의해 분석할 수 있다.
따라서 본 발명은
a) OxyR 전사 조절자 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하며 폴리펩티드의 아미노산 서열 위치 89 또는 상응하는 위치에서의 L-알라닌은 다른 단백질성 아미노산, 바람직하게는 L-발린으로 대체된 것인 단리된 코리네형 박테리아를 적합한 배지에서 발효시키고,
b) L-아미노산이 단리된 코리네형 박테리아의 세포에 또는 발효 브로쓰에 축적되는 것인 L-아미노산의 생산 방법에 관한 것이다.
일반적으로는 상기 방법 이후에 영양 배지에 또는 발효 브로쓰에 및/또는 박테리아의 세포에 축적된 L-아미노산을 수집하여 고체 또는 액체 생성물을 얻는다.
발효 브로쓰는 미생물이 특정 시간 동안 특정 온도에서 배양된 발효 배지를 의미한다. 발효 배지, 또는 발효 중에 이용되는 배지는 미생물이 성장하도록 하고 목적 아미노산이 생성되도록 하는 모든 물질 및 성분을 포함한다.
따라서 발효가 완료되면, 생성된 발효 브로쓰는 a) 미생물 세포의 성장 결과로서 생산된 미생물의 바이오매스, b) 발효 중에 생성된 목적 아미노산, c) 발효 중에 생성된 유기 부산물, 및 d) 발효에 의해 소진되지 않은, 이용된 발효 배지 또는 출발 물질의 구성성분, 예를 들어 비오틴과 같은 비타민, 호모세린과 같은 아미노산 또는 마그네슘 술페이트와 같은 염을 포함한다.
유기 부산물은 적절한 경우 각각의 목적 L-아미노산 이외에 발효에 이용된 미생물에 의해 생산된 물질을 포함하고, 적절한 경우 분비된다. 여기에는 목적 아미노산에 비해 30％, 20％ 또는 10％ 적게 차지하는 L-아미노산이 포함된다. 여기에는 또한 1 내지 3개의 카르복실기를 갖는 유기산, 예를 들어 아세트산, 락트산, 시트르산, 말산 또는 푸마르산이 포함된다. 마지막으로 트레할로스와 같은 당류가 포함된다.
산업적 목적에 적합한 통상의 발효 브로쓰는 보통 아미노산 함량이 30 g/kg 내지 200 g/kg 또는 40 g/kg 내지 175 g/kg 또는 50 g/kg 내지 150 g/kg이다. 바이오매스 함량 (무수 바이오매스로서)은 일반적으로 20 내지 50 g/kg이다.
아미노산 L-리신의 경우에는, 실질적으로 4종의 상이한 생성물 형태가 당분야에 공지되어 있다.
L-리신-함유 생성물의 한 그룹은 정제된 L-리신의 농축된 알칼리성 수용액을 포함한다 (EP-B-0534865). 예를 들어 US 6,340,486 및 US 6,465,025에 개시된 또다른 그룹은 L-리신-함유 발효 브로쓰의 산성 바이오매스-함유 수성 농축물을 포함한다. 고체 생성물의 가장 잘 공지된 그룹은 보통은 염, 예를 들어 L-리신 모노하이드로클로라이드의 형태인 정제된 또는 순수한 L-리신의 분말 또는 결정질 형태를 포함한다. 고체 생성물 형태의 또다른 그룹은, 예를 들어 EP-B-0533039에 개시되어 있다. L-리신 이외에, 상기 특허에 개시된 생성물 형태는 발효 생산 동안 사용되지만 소진되지는 않은 출발 물질 대부분을 포함하고, 적절한 경우, 이용된 미생물의 바이오매스를 > 0％-100％의 함량으로 포함한다.
아미노산 L-발린, L-이소류신, L-프롤린, L-트립토판 및 L-호모세린의 경우에, 선행기술에서 공지된 생성물 형태는 실질적으로 관련 아미노산을 정제된 형태 또는 순수한 형태로 함유하는 것들이다 (≥ 95 중량％ 또는 ≥ 98 중량％).
여러 생성물 형태에 상응하여, L-아미노산-함유 생성물 또는 정제된 L-아미노산을 생산하기 위해 L-아미노산을 발효 브로쓰로부터 수집하거나, 단리하거나 또는 정제하는 다양한 공정이 공지되어 있다.
고체 형태의 순수한 L-아미노산은 실질적으로, 적절한 경우 활성탄의 사용과 함께 이온 교환 크로마토그래피법을 사용함으로써, 또한 결정화법을 사용함으로써 생산된다. 리신의 경우에는, 상응하는 염기 또는 상응하는 염, 예를 들어 모노하이드로클로라이드 (Lys-HCl) 또는 리신 술페이트 (Lys2-H2SO4)가 이러한 방식으로 얻어진다.
리신의 경우에, EP-B-0534865에 발효 브로쓰로부터 염기성 L-리신-함유 수용액을 생산하는 방법이 개시되어 있다. 상기 특허에 개시된 방법에서, 바이오매스는 발효 브로쓰로부터 제거하여 버린다. 염기, 예를 들어 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 수산화물을 사용하여 9 내지 11의 pH를 조정한다. 무기 구성성분 (무기염)은 농축 후에 브로쓰로부터 제거하고 결정화에 의해 냉각시켜 비료로서 사용하거나 버린다.
본 발명에 따른 박테리아를 사용하여 리신을 생산하는 방법에서, 발효 브로쓰의 성분을 포함하는 생성물을 생산하는 방법 또한 이용된다. 상기 방법은 특히 동물 사료 첨가제로서 사용된다.
필요에 따라, 바이오매스는, 예를 들어 원심분리, 여과, 경사분리 또는 이들의 조합과 같은 분리 방법에 의해 발효 브로쓰로부터 전체가 또는 부분적으로 제거될 수 있거나, 또는 발효 브로쓰 내에 온전히 남아있을 수 있다. 적절한 경우, 바이오매스 또는 바이오매스-함유 발효 브로쓰를 적합한 공정 단계 동안, 예를 들어 열처리 (가열) 또는 산의 첨가에 의해 불활성화시킨다.
바이오매스의 화학적 구성성분은, 특히 세포 외막, 예를 들어 펩티도글리칸 및 아라비노갈락탄, 단백질 또는 폴리펩티드, 예를 들어 OxyR 전사 조절자 폴리펩티드, 지질 및 인지질, 및 핵산 (DNA 및 RNA), 예를 들어 본 발명에 따른 돌연변이가 일어난 폴리뉴클레오티드이다. 불활성화 및/또는 추가의 공정 단계의 처치 (예를 들어 산성화, 분무 건조, 과립화 등) 결과로서, 핵산은 통상적으로 특히 길이가 ≥ 40 - 60 bp, > 60 - 80 bp, > 80 - 100 bp, > 100 - 200 bp, > 200 - 300 bp, > 300 - 400 bp, > 400 - 500 bp, > 500 - 750 bp, > 750 - 1000 bp, > 1000 - 1250 bp, > 1250 - 1500 bp, > 1500 - 1750 bp, > 1750 - 2000 bp, > 2000 - 2500 bp, > 2500 - 3000 bp, > 3000 - 4000 bp, > 4000 - 5000 bp인 단편으로서 존재한다.
한 절차로, 바이오매스를 완전히 또는 거의 완전히 제거하여, 생산된 생성물에 바이오매스가 존재하지 않거나 (0％) 또는 30％ 이하, 20％ 이하, 10％ 이하, 5％ 이하, 1％ 이하 또는 0.1％ 이하의 바이오매스가 남아 있도록 한다. 또다른 절차로, 바이오매스를 제거하지 않거나, 또는 적은 비율로만 제거하여, 생산된 생성물에 모든 바이오매스가 남아 있거나 (100％) 또는 70％, 80％, 90％, 95％, 99％ 또는 99.9％ 초과의 바이오매스가 남아 있도록 한다. 따라서, 본 발명에 따른 한 방법에서, 바이오매스를 ≥ 0％ 내지 ≤ 100％의 비율로 제거한다.
마지막으로, 발효 후에 얻어진 발효 브로쓰를, 바이오매스의 완전한 또는 부분적 제거 전에 또는 그 후에, 무기산, 예를 들어 염산, 황산 또는 인산, 또는 유기산, 예를 들어 프로피온산 (GB 1,439,728 또는 EP 1 331 220)으로 산성 pH로 조정할 수 있다. 온전한 함량의 바이오매스를 갖는 발효 브로쓰를 산성화하는 것 또한 가능하다 (US 6,340,486 또는 US 6,465,025). 마지막으로, 브로쓰를 또한 나트륨 비술파이트 (NaHSO3, GB 1,439,728) 또는 또다른 염, 예를 들어 아황산의 암모늄, 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 첨가함으로써 안정화시킬 수 있다.
바이오매스의 제거 중에, 적절한 경우 발효 브로쓰에 존재하는 유기 또는 무기 고체를 부분적으로 또는 완전히 제거한다. 발효 브로쓰에 용해된 유기 부산물 및 발효 배지의 소진되지 않은 용해 성분 (출발 물질)은 적어도 부분적으로 (> 0％), 바람직하게는 25％ 이상, 특히 바람직하게는 50％ 이상, 매우 특히 바람직하게는 75％ 이상의 정도로 생성물에 남아있다. 적절한 경우, 이들은 또한 생성물에 온전히 남아있거나 (100％), 또는 > 95％ 또는 > 98％를 의미하는 거의 온전히 남아있다. 이러한 의미에서, "발효 브로쓰를 기준으로"라는 어구는 생성물이 발효 브로쓰 성분의 적어도 일부를 포함한다는 것을 의미한다.
이어서, 공지된 방법, 예를 들어 회전식 증발기, 박막 증발기, 강하 경막 증발기를 이용하여, 역삼투에 의해, 또는 나노여과에 의해 브로쓰로부터 물을 제거하거나 증점시키거나 농축시킨다. 이렇게 농축된 발효 브로쓰를 이어서 동결 건조, 분무 건조, 분무 과립화, 또는 예를 들어 PCT/EP2004/006655에 따른 순환 유동층에서의 개시된 바와 같은 다른 방법에 의해 자유-유동성 생성물로, 특히 미립자 분말 또는 바람직하게는 굵은 과립으로 후처리할 수 있다. 목적 생성물을 적절한 경우 스크리닝 또는 분진 제거에 의해 생성 과립으로부터 단리시킨다.
발효 브로쓰를 직접, 즉 선행 농축 없이, 분무 건조 또는 분무 과립화에 의해 건조시키는 것 또한 가능하다.
"자유-유동성"이란 다양한 크기의 오리피스를 갖는 일련의 유리 오리피스 용기로부터, 적어도 5 mm (밀리미터) 오리피스를 갖는 용기로부터 방해받지 않고 유동하는 분말을 의미한다 (문헌 [Klein: Seifen, Oele, Fette, Wachse 94, 12 (1968)]).
"미립자"란 주로 (> 50％) 입자 크기가 직경 20 내지 200 ㎛인 분말을 의미한다.
"굵은"이란 주로 (> 50％) 입자 크기가 직경 200 내지 2000 ㎛인 생성물을 의미한다.
입자 크기 측정은 레이저 회절 분광법으로 수행할 수 있다. 상응하는 방법이 문헌 ["Teilchengroeßenmessung in der Laborpraxis," R. H. Mueller and R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996)] 또는 문헌 ["Introduction to Particle Technology," M. Rhodes, Wiley & Sons (1998)]에 개시되어 있다.
자유-유동성 미립자 분말은 이어서 적합한 압착 또는 과립화 방법에 의해 굵고, 충분한 자유-유동성을 가지며, 보관가능하며, 실질적으로 분진이 없는 생성물로 전환될 수 있다.
"분진이 없는"이라는 어구는 생성물이 입자 크기가 직경 100 ㎛ 미만인 것을 단지 적은 비율 (< 5％)로 포함한다는 것을 의미한다.
본 발명의 상황에서 "보관가능한"이란 건조하고 냉각된 환경에서 적어도 1년 이상, 바람직하게는 적어도 1.5년 이상, 특히 바람직하게는 2년 이상 동안 각각의 아미노산의 어떠한 실질적인 손실도 발생하지 않은 채로 (< 5％) 보관될 수 있는 생성물을 의미한다.
따라서 본 발명은 추가로
a) OxyR 전사 조절자 활성을 가지며, L-알라닌을 제외한 단백질성 아미노산 중 하나, 바람직하게는 L-발린이 위치 89 또는 필적하는 위치에 존재하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 oxyR 대립유전자를 포함하는, L-아미노산-분비 코리네형 박테리아를 발효 배지에서 배양 및 발효시키는 단계,
b) 발효시키는 동안 생성된 바이오매스를 0 내지 100 중량％의 양으로 제거하는 단계, 및
c) a) 및/또는 b)에서 얻어진 발효 브로쓰를 건조시켜 목적하는 분말 또는 과립 형태의 생성물을 얻는 단계
로 특징화되며, 여기서 황산, 인산 또는 염산의 군으로부터 선택된 산을 적절한 경우 b) 또는 c) 단계 이전에 첨가하는, L-아미노산, 바람직하게는 L-리신 또는 L-트립토판, 함유 생성물, 바람직하게는 동물 사료 첨가제를 발효 브로쓰로부터 생산하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 a) 또는 b) 단계 이후에 L-아미노산-함유 발효 브로쓰로부터 물을 제거한다 (농축).
본 발명은 또한 기본적으로 DE 102006016158에 개시되어 있는 리신 술페이트-함유 생성물의 생산 방법에 관한 것이며, 여기서 본 발명에 따른 미생물을 사용하여 얻어지며, 바이오매스가 적절한 경우 완전히 또는 부분적으로 제거된 발효 브로쓰는 적어도 하기 a) 및 b) 단계를 포함하는 공정을 수행함으로써 추가로 가공되고, 하기 c) 및 d) 단계 중 하나 또는 둘 모두를, 적절한 경우, a) 단계 이전에 수행한다:
a) 황산을 첨가함으로써 pH를 4.0 내지 5.2, 특히 4.9 내지 5.1로 낮추고, 적절한 경우, 추가의 또는 복수의 술페이트-함유 화합물(들)을 첨가함으로써 브로쓰 내의 0.85 내지 1.2, 바람직하게는 0.9 내지 1.0, 특히 바람직하게는 > 0.9 내지 < 0.95의 술페이트/L-리신의 몰비를 조정하는 단계,
b) 이러한 방식으로 얻어진 혼합물을 물을 제거함으로써 농축시키고, 적절한 경우 과립화하는 단계,
c) 술페이트/L-리신의 몰비를 측정하여 술페이트-함유 화합물(들)의 필요량을 확인하는 단계,
d) 암모늄 술페이트, 암모늄 비술페이트 및 황산의 군으로부터 선택된 술페이트-함유 화합물을 적절한 비율로 첨가하는 단계.
적절한 경우, 또한 b) 단계 이전에, 아황산 염, 바람직하게는 알칼리 금속 비술파이트, 특히 바람직하게는 나트륨 비술파이트를 발효 브로쓰를 기준으로, 0.01 내지 0.5 중량％, 바람직하게는 0.1 내지 0.3 중량％, 특히 바람직하게는 0.1 내지 0.2 중량％의 농도로 첨가한다.
상기 언급한 공정 단계의 상황에서 언급되어야 하는 바람직한 술페이트-함유 화합물은 특히 암모늄 술페이트 및/또는 암모늄 비술페이트 또는 상응하는 암모니아와 황산의 혼합물 및 황산 그자체이다.
술페이트/L-리신의 몰비 V는 방정식: V = 2 x [SO4 2-] / [L-리신]으로 계산한다. 상기 방정식은 SO4 2- 음이온이 2개의 전하를 갖는다는 사실을 고려한 것이다. V = 1의 비율은 화학량론적 조성 Lys2(SO4)이 존재함을 의미하고, 반면 V = 0.9의 비율은 술페이트가 10％ 부족한 것이고 V = 1.1의 비율은 술페이트가 10％ 과잉임을 나타낸다.
과립화 또는 압착 동안에, 식품 또는 사료의 가공에서 결합제, 겔화제 또는 증점제로서 통상 사용되는 바와 같이 통상의 유기 또는 무기 보조제 또는 담체, 예컨대 전분, 젤라틴, 셀룰로스 유도체 또는 유사 물질을 이용하거나, 또는 추가 물질, 예를 들어 실리카, 실리케이트 (EP0743016A) 또는 스테아레이트를 이용하는 것이 유리하다.
생성된 과립의 표면에 WO 04/054381에 개시된 바와 같이 오일을 제공하는 것 또한 유리하다. 사용가능한 오일은 광유, 식물성 오일 또는 식물성 오일의 혼합물이다. 이러한 오일의 예로는 대두유, 올리브유, 대두유/레시틴 혼합물이 있다. 동일한 방식으로, 실리콘유, 폴리에틸렌 글리콜 또는 하이드록시에틸셀룰로스 또한 적합하다. 표면을 상기 오일로 처리함으로써 생성물의 내마모성 증가 및 분진 함량의 감소를 달성한다. 생성물 내 오일 함량은 사료 첨가제의 총량을 기준으로 0.02 내지 2.0 중량％, 바람직하게는 0.02 내지 1.0 중량％, 매우 특히 바람직하게는 0.2 내지 1.0 중량％이다.
바람직한 생성물은 ≥ 97 중량％의 비율로 직경 100 내지 1800 ㎛의 입자 크기를 갖거나 또는 ≥ 95 중량％의 비율로 직경 300 내지 1800 ㎛의 입자 크기를 갖는다. 분진, 즉 입자 크기가 < 100 ㎛인 입자의 비율은 바람직하게는 > 0 내지 1 중량％이고, 특히 바람직하게는 0.5 중량％를 초과하지 않는다.
그러나, 별법으로, 생성물은 또한 사료의 가공에서 공지되어 있고 전통적인 유기 또는 무기 담체, 예를 들어 실리카, 실리케이트, 곡분, 겨, 밀가루, 전분, 당류 등에 흡수될 수 있고/있거나 전통적인 증점제 및 결합제와 혼합되어 안정화될 수 있다. 이러한 용도 및 공정은 예를 들어 문헌 [Die Muehle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, page 817]에 개시되어 있다.
마지막으로, 생성물은 또한 DE-C-4100920에 개시된 바와 같이 막-형성제, 예를 들어 금속 탄산염, 실리카, 실리케이트, 알기네이트, 스테아레이트, 전분, 검 및 셀룰로스 에테르로의 코팅 공정에 의해 동물의 위, 특히 반추동물의 위에 의한 소화에 안정한 상태가 될 수 있다.
생성물 내의 목적 아미노산 농도를 조정하기 위해서, 필요에 따라 공정 중에 적절한 아미노산을 농축물의 형태로, 또는 적절한 경우 실질적으로 순수한 물질 또는 그의 염을 액체 또는 고체 형태로 첨가할 수 있다. 이들은 단독으로 또는 혼합물로서 생성되었거나 또는 농축된 발효 브로쓰에 첨가되거나, 또는 건조 또는 과립화 공정 중에 첨가될 수 있다.
본 발명은 또한 기본적으로 US 20050220933에 개시된 바와 같은 고체 리신-함유 생성물의 생산 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 하기 단계의 본 발명에 따른 미생물을 사용하여 얻어지는 발효 브로쓰의 후처리를 포함한다:
a) 발효 브로쓰를, 바람직하게는 막 필터로 여과하여 바이오매스-함유 슬러지 및 여과물을 얻는 단계,
b) 여과물을, 바람직하게는 48 내지 52 중량％의 고체 함량을 초래하도록 농축시키는 단계,
c) b) 단계에서 얻어진 농축물을, 바람직하게는 50℃ 내지 62℃의 온도에서 과립화하는 단계, 및
d) c)에서 얻어진 과립을 하나 이상의 코팅제(들)로 코팅하는 단계.
d) 단계에서의 코팅에 사용되는 코팅제는 바람직하게는
d1) a) 단계에서 얻어진 바이오매스,
d2) 바람직하게는 L-리신 하이드로클로라이드 또는 L-리신 술페이트의 군으로부터 선택된 L-리신-함유 화합물,
d3) 바람직하게는 전분, 카라기난, 아가, 실리카, 실리케이트, 곡분, 겨 및 밀가루의 군으로부터 선택된, L-리신 함량이 < 1 중량％, 바람직하게는 < 0.5 중량％인 실질적으로 L-리신을 함유하지 않는 물질, 및
d4) 바람직하게는 오일, 폴리에틸렌 글리콜 및 액체 파라핀의 군으로부터 선택된 발수성 물질
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
리신의 경우에, 리신-함유 생성물의 생산 중에 이온의 비율을 쿠쉬키(Kushiki) 등의 US 20030152633에 개시된 바와 같이, 바람직하게는 하기 방정식에 상응하는 이온 당량비가 0.68 내지 0.95, 바람직하게는 0.68 내지 0.90이 되도록 조정한다 (몰농도가 "[]" 안에 주어짐):
2x[SO4 2-] + [Cl-] - [NH4 +] - [Na+] - [K+] - 2x[Mg2+] - 2x[Ca2+] / [L-Lys]
리신의 경우에, 이러한 방식으로 생산된 고체 생성물은, 발효 브로쓰를 기준으로, 리신 함량 (리신 베이스로서)이 10 중량％ 내지 70 중량％ 또는 20 중량％ 내지 70 중량％, 바람직하게는 30 중량％ 내지 70 중량％, 매우 특히 바람직하게는 40 중량％ 내지 70 중량％이다 (생성물의 건조 물질 기준). 71 중량％, 72 중량％, 73 중량％의 리신 베이스의 최대 함량 또한 가능하다.
전기적으로 중성인 아미노산, 예컨대 L-트립토판의 경우에, 이러한 방식으로 생산된 고체 생성물은, 발효 브로쓰를 기준으로, 아미노산 함량이 5 중량％, 10 중량％, 20 중량％, 30 중량％ 이상 내지 50 중량％, 60 중량％, 70 중량％, 80 중량％, 90 중량％ 이하 또는 95 중량％ 이하이다.
고체 생성물의 함수량은 5 중량％ 이하, 바람직하게는 4 중량％ 이하, 특히 바람직하게는 3 중량％ 미만이다.
따라서 본 발명은 하기 특징을 나타내는 발효 브로쓰 기재의 L-리신-함유 사료 첨가제에 관한 것이다:
a) 10 중량％ 이상 내지 최대 73 중량％ 이하의 (베이스로서의) 리신 함량,
b) 5 중량％를 초과하지 않는 함수량, 및
c) 발효 브로쓰 내에 존재하는 바이오매스의 적어도 0.1％에 상응하는 바이오매스 함량 (바이오매스는 적절한 경우 불활성화되며 본 발명에 따른 코리네형 박테리아에 의해 형성됨).
따라서 본 발명은 또한 하기 특징을 나타내는 발효 브로쓰 기재의 L-트립토판-함유 사료 첨가제에 관한 것이다:
a) 5 중량％ 이상 내지 최대 95 중량％ 이하의 트립토판 함량,
b) 5 중량％를 초과하지 않는 함수량, 및
c) 발효 브로쓰 내에 존재하는 바이오매스의 적어도 0.1％에 상응하는 바이오매스 함량 (여기서, 바이오매스는 적절한 경우 불활성화되며 본 발명에 따른 코리네형 박테리아에 의해 형성됨).
균주 MH20-22B는 2004년 10월 28일자로 DSMZ (독일 브런즈윅 소재)에 DSM 16835로서 기탁되었다.
OxyR 폴리펩티드의 아미노산 서열의 위치 89에 L-발린을 포함하는, 본 발명에 따른 코리네박테리움 글루타미쿰 돌연변이체 DM1914는 2006년 5월 15일자로 DSMZ (독일 브런즈윅 소재)에 DSM 18259로서 기탁되었다.
본 발명은 예시적 실시양태에 의해 하기에서 더욱 상세히 설명된다.
실시예 1
L-리신-생산 균주 DM1797의 돌연변이 유발
코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DM1797을 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (MNNG)으로의 돌연변이 유발을 위한 출발 균주로서 이용하였다. 균주 DM1797은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 아미노에틸시스테인-내성 돌연변이체이고 수탁번호 DSM16833로서 DSMZ (독일 브런즈윅 소재)에 기탁되었다.
균주 DM1797을 100 ml 용량의 삼각 플라스크 내의 LB 브로쓰 (머크(Merck), 독일 다름슈타트 소재) 10 ml 중에서, 세르토매트(Certomat) BS-1형 (베. 브라운 바이오테크 인터내쇼날(B. Braun Biotech International), 독일 멜순겐 소재) 궤도형 진탕기에서 200 rpm으로 33℃에서 24시간 동안 배양시켰다. 이어서 배양물을 원심분리하고, 침전물을 0.9％ NaCl 용액 10 ml에 재현탁시키고, 생성 현탁액을 다시 원심분리하여 생성 침전물을 0.9％ NaCl 용액 10 ml에 녹였다. 상기 세포 현탁액 5 ml를 400 ㎍/ml의 MNNG로 진탕기 (상기 참조)에서 200 rpm으로 30℃에서 15분 동안 처리하였다. 이어서, 돌연변이 유발 혼합물을 원심분리하고 침전물을 0.9％ NaCl 완충액 (pH = 6.0) 중의 2％ Na 티오술페이트 10 ml에 녹였다. 그 후에, 세포 현탁액을 0.9％ NaCl 용액으로 1:1000, 1:10,000 및 1:100,000의 비율로 희석시키고, 분취물을 BH(brain-heart) 아가 (머크, 독일 다름슈타트 소재)에 플레이팅하였다. 대략 2500개의 돌연변이체가 이러한 방식으로 단리되었다.
실시예 2
균주 DM1797의 돌연변이체를 이용한 수확량 시험
실시예 1에서 얻어진 돌연변이체를 리신을 생산하는데 적합한 영양 배지에서 배양시키고 배양 상청액 중의 리신 함량을 측정하였다.
이러한 목적을 위해, 클론을 우선 BH 아가 플레이트 (머크, 독일 다름슈타트 소재)에서 24시간 동안 33℃에서 성장시켰다. 예비배양물을 각각의 상기 아가 플레이트 배양물로 출발하여 접종시켰다 (100 ml 용량의 삼각 플라스크 내 배지 10 ml). 예비배양을 위해 사용한 배지는 MM 배지였다. 예비배양물을 진탕기에서 240 rpm으로 33℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 주 배양물을 주 배양물의 초기 OD (660 nm)가 0.1 OD가 되도록 하는 방식으로 상기 예비배양물로부터 접종시켰다. MM 배지는 또한 주 배양을 위해서도 사용되었다.
MM 배지
CSL 5 g/l
MOPS 20 g/l
글루코스 (별도로 오토클레이빙함) 50 g/l
염:
(NH4)2SO4 25 g/l
KH2PO4 0.1 g/l
MgSO4 * 7 H2O 1.0 g/l
CaCl2 * 2 H2O 10 mg/l
FeSO4 * 7 H2O 10 mg/l
MnSO4 * H2O 5.0 mg/l
비오틴 (여과에 의해 멸균시킴) 0.3 mg/l
티아민 * HCl (여과에 의해 멸균시킴) 0.2 mg/l
CaCO3 25 g/l
CSL (옥수수 침지액), MOPS (모르폴리노프로판술폰산) 및 염 용액을 수성 암모니아로 pH 7로 조정하고 오토클레이빙하였다. 멸균 기질 및 비타민 용액, 및 무수 오토클레이빙 CaCO3를 이어서 첨가하였다.
배양은 배플을 갖춘 100 ml 용량의 삼각 플라스크에서 10 ml의 부피로 실시하였다. 온도는 33℃이고, 회전수는 250 rpm이고, 습도는 80％였다.
24시간 후에, 660 nm의 측정 파장에서의 광학 밀도 (OD)를 바이오메크(Biomek) 1000 (베크만 인스트루먼츠 게엠베하(Beckmann Instruments GmbH), 독일 뮌헨 소재)을 사용하여 측정하였다. 생성된 리신의 양을 에펜도르프-바이오트로니크(Eppendorf-BioTronik; 독일 함부르크 소재)로부터의 아미노산 분석기를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피 및 용리후 닌하이드린으로의 유도체화 검출에 의해 측정하였다. 리신 생성의 증가에 의해 식별되는 돌연변이체를 DM1914라고 하였다.
균주 OD (660) 리신 HCl (g/l)
DM1797 9.2 2.23
DM1914 9.2 2.40
실시예 3
돌연변이체 DM1914의 oxyR 대립유전자의 서열화
염색체 DNA를 문헌 [Eikmanns, et al., Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994)]의 방법에 의해 클론 DM1914로부터 단리시켰다. 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하여 oxyR 유전자 또는 대립유전자를 갖고 있는 DNA 절편을 증폭시켰다. 씨. 글루타미쿰에 대한 oxyR 유전자의 공지된 서열 (EP1108790로부터의 서열 2114)을 토대로, PCR을 위해 하기 프라이머 올리고뉴클레오티드를 선택하였다:
oxyR_XL_A1 (서열 9):
5` gcgaattcgg gcatttacca tcatggtg 3`
oxyR_XL_A2 (서열 10):
5` gcgaattccg ctaatgcagt aggcattc 3`
상기 프라이머는 MWG 바이오테크(Biotech) (독일 에버스베르크 소재)에 의해 합성된 것이고, PCR 반응은 문헌 [Innis et al., PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press]의 표준 PCR 방법에 의해 수행하였다. 프라이머는 길이가 약 1.6 kb이고 oxyR 유전자 또는 대립유전자를 갖고 있는 DNA 절편 증폭을 가능하게 하였다. 또한, 프라이머는 상기 나타낸 뉴클레오티드 서열에서 밑줄로 표시한 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI의 절단 부위에 대한 서열을 갖는다.
길이가 약 1.6 kb이고 균주 DM1914의 oxyR 대립유전자를 갖고 있는 증폭된 DNA 단편을 0.8％ 아가로스 겔에서의 전기영동에 의해 확인하고, 겔로부터 단리시켜, 통상의 방법에 의해 정제하였다 (퀴아퀵(QIAquick) 겔 추출 키트, 퀴아젠(Qiagen), 독일 힐덴 소재).
증폭된 DNA 단편 또는 PCR 산물의 뉴클레오티드 서열을 아고바(Agowa; 독일 베를린 소재)에 의한 서열화에 의해 확인하였다. PCR 산물의 서열은 서열 15로 나타낸다. 코딩 영역의 서열은 또한 서열 5로 나타낸다. Patentin 프로그램을 이용하여 얻어진 관련 OxyR 전사 조절자 단백질의 아미노산 서열은 서열 6으로 나타낸다.
염기 티민은 균주 DM1914의 oxyR 대립유전자의 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 5)의 위치 266에 위치한다. 염기 시토신은 야생형 유전자 (서열 1)의 상응하는 위치에 위치한다.
아미노산 발린은 균주 DM1914의 OxyR 전사 조절자 단백질의 아미노산 서열 (서열 6)의 위치 89에 위치한다. 아미노산 알라닌은 야생형 단백질 (서열 2)의 상응하는 위치에 위치한다.
코딩 영역의 위치 266에 염기 티민을 포함하고, 따라서 아미노산 서열의 위치 89에 아미노산 발린을 포함하는 OxyR 전사 조절자 단백질을 코딩하는 oxyR 대립유전자를 이하 oxyR_A89V 대립유전자라고 한다. "oxyR_A89V" 명칭에서 A는 L-알라닌을 나타내고, V는 L-발린을 나타내고, 89는 아미노산 교환 위치를 나타낸다 (서열 2 및 6 참조).
OxyR 폴리펩티드의 아미노산 서열의 위치 89에 L-발린을 포함하는 코리네박테리움 글루타미쿰 돌연변이체 DM1914는 2006년 5월 15일자로 DSMZ (독일 브런즈윅 소재)에 DSM 18259로서 기탁되었다.
실시예 4
균주 DM1797의 oxyR 야생형 유전자의 oxyR_A89V 대립유전자로의 교환
4.1 교환 벡터 pK18mobsacB_oxyR_A89V의 구조
길이가 약 1.6 kb이고 oxyR_A89V 대립유전자를 갖고 있으며 PCR에 의해 제조되었고 실시예 3에 기재된 DNA 단편을 문헌 [Schaefer et al., Gene, 14, 69-73 (1994)]에 개시된 sacB 시스템을 이용하여 교환 돌연변이 유발에 의해 실시예 1에 기재된 씨. 글루타미쿰 균주 DM1797의 염색체로 혼입하였다. 상기 시스템은 상동 재조합에 의해 달성되는 대립유전자 교환을 일으키고 선택할 수 있도록 한다.
이러한 목적을 위해, 크기가 약 1.6 kb인 oxyR_A89V 단편을 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI로 절단하고, 0.8％ 아가로스 겔에서의 전기영동에 의해 확인한 후에, 겔로부터 단리시켜 통상의 방법으로 정제하였다 (퀴아퀵 겔 추출 키트, 퀴아젠, 독일 힐덴 소재).
이동성 클로닝 벡터 pK18mobsacB를 제한 효소 EcoRI로 소화시키고, 말단을 알칼리성 포스파타제 (Alkaline Phosphatase, 베링거 만하임(Boehringer Mannheim), 독일 소재)를 이용하여 탈인산화하였다. 이러한 방식으로 제조된 벡터를 대략 1.6 kb의 oxyR_A89V 단편과 혼합하고, 혼합물을 T4-DNA 리가제 (아머샴-파마시아(Amersham-Pharmacia), 독일 프라이부르크 소재)로 처리하였다.
이. 콜라이 균주 S17-1 (문헌 [Simon et al., Bio/Technology 1: 784-791, 1993])을 이어서 라이게이션 혼합물 (문헌 [Hanahan, In. DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989])로 형질전환시켰다. 형질전환 혼합물을 25 mg/l의 카나마이신이 보충된 LB 아가 (문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989])에 플레이팅함으로써 플라스미드를 갖고 있는 세포를 선별하였다.
플라스미드 DNA를 형질전환체로부터 퀴아젠의 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(QIAprep Spin Miniprep Kit)를 이용하여 단리시켜 효소 XbaI로의 제한 절단 및 후속 아가로스 겔 전기영동으로 시험하였다. 플라스미드를 pK18mobsacB_oxyR_A89V라고 하고 도 1에 나타냈다.
4.2 대립유전자 교환
실시예 4.1에 언급된 벡터 pK18mobsacB_oxyR_A89V를 문헌 [Schaefer et al., Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990)]의 프로토콜에 따라 접합에 의해 씨. 글루타미쿰 균주 DM1797로 전달하였다. 벡터는 DM416에서 독립적 복제를 할 수 없으며 재조합 사건의 결과로서 염색체로 융합되는 경우에만 세포 내에 남는다. 피전달접합체, 즉 융합된 pK18mobsacB_oxyR_A89V를 갖는 클론은 접합 혼합물을 15 mg/l의 카나마이신 및 50 mg/l의 날리딕스산이 보충된 LB 아가 (문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor, New York, 1989])에 플레이팅함으로써 선별하였다. 카나마이신-내성 피전달접합체를 25 mg/l의 카나마이신이 함유된 LB 아가 플레이트 상으로 도말시키고 33℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 플라스미드가 제2 재조합 사건의 결과로서 절단된 돌연변이체를, LB 액체 배지에서 비선택적으로 클론을 30시간 동안 배양한 후에, 10％ 수크로스가 함유된 LB 아가 상에 도말하고 16시간 동안 인큐베이션함으로써 선별하였다.
플라스미드 pK18mobsacB_oxyR_A89V는, 최초 플라스미드 pK18mobsacB와 마찬가지로, 카나마이신-내성 유전자 외에 바실루스 수브틸리스(Bacillus subtilis)로부터의 레반 수크라제를 코딩하는 sacB 유전자의 카피를 포함한다. 수크로스-유도성 발현은 씨. 글루타미쿰에 대해 독성인 산물 레반의 합성을 촉매하는 레반 수크라제의 생성을 초래한다. 따라서, 수크로스가 함유된 LB 아가 상에서 성장하는 유일한 클론은 융합된 pK18mobsacB_oxyR_A89V가 제2 재조합 사건의 결과로서 절단된 것이다. 돌연변이 부위에 대한 제2 재조합 사건의 위치에 따라, 대립유전자 교환 또는 돌연변이의 도입이 절단시에 일어나거나, 또는 원래의 카피가 숙주의 염색체에 남아있다.
대략 40 내지 50개의 콜로니를 "수크로스 존재하의 성장" 및 "카나마이신 존재하에 성장 없음"의 표현형에 대해 시험하였다. "수크로스 존재하의 성장" 및 "카나마이신 존재하에 성장 없음"의 표현형을 나타내는 4개의 콜로니의 경우에, A89V 돌연변이를 포함하고 서열화 프라이머 ox1-2로부터 시작하는 oxyR 유전자의 영역 (서열 1의 oxyR 유전자의 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열 위치 79-98에 상응함)을 아고바 (독일 베를린 소재)에 의해 서열화하여 oxyR_A89V 대립유전자의 돌연변이가 염색체에 존재함을 확인하였다. 사용된 프라이머 ox1-2는 이러한 목적을 위해 아고바에 의해 합성된 것이다:
ox1-2:
5` act gct gcc acc aag ctg tc 3`
oxyR 유전자의 코딩 영역의 위치 266에 염기 티민을 함유하고, 따라서 oxyR_A89V 대립유전자를 갖는 클론을 이러한 방식으로 확인하였다. 이 클론을 DM1797oxyR_A89V 균주라 한다.
실시예 6
DM1797oxyR_A89V 균주의 수확량의 출발 균주 DM1797의 수확량과의 비교
실시예 5에서 얻어진 씨. 글루타미쿰 균주 DM1797oxyR_A89V의 수확량 시험을 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다. 시험 결과를 표 2에 나타냈다.
균주 OD (660 nm) 리신 HCl (g/l)
DM1797 9.2 2.17
DM1797oxyR_A89V 9.2 2.38
<도면의 간단한 설명>
도 1: 플라스미드 pK18mobsacB_oxyR_A89V 맵.
사용된 약어 및 명칭은 하기 의미를 갖는다. 명시된 염기쌍 개수는 측정의 재현성 범위 내에서 얻어지는 근사치이다.
Kan: 카나마이신-내성 유전자
EcoRI: 제한 효소 EcoRI의 절단 부위
XbaI: 제한 효소 XbaI의 절단 부위
oxyR: oxyR_A89V 대립유전자
sacB: sacB 유전자
RP4-mob: 전달을 위한 복제 시작점 (oriT)을 갖는 mob 영역
oriV: 복제 시작점 V
SEQUENCE LISTING <110> Evonik Degussa GmbH <120> Alleles of the oxyR gene from coryneform bacteria <130> 200600763 <160> 24 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 984 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1)..(981) <223> oxyR wild type gene <220> <221> misc_feature <222> (266)..(266) <223> cytosine <220> <221> misc_feature <222> (731)..(731) <223> cytosine <400> 1 atg agc aat aaa gag tac cgg ccc aca ctc gcc cag ctt cgc acc ttt 48 Met Ser Asn Lys Glu Tyr Arg Pro Thr Leu Ala Gln Leu Arg Thr Phe 1 5 10 15 gtc acc atc gca gaa tgc aag cac ttt ggt act gct gcc acc aag ctg 96 Val Thr Ile Ala Glu Cys Lys His Phe Gly Thr Ala Ala Thr Lys Leu 20 25 30 tcc att tcg cag cca tcc ctc tcc cag gca ctt gtc gca tta gaa aca 144 Ser Ile Ser Gln Pro Ser Leu Ser Gln Ala Leu Val Ala Leu Glu Thr 35 40 45 ggc ctg gga gtt cag ctg att gaa cgc tcc acc cgc aag gtc att gtc 192 Gly Leu Gly Val Gln Leu Ile Glu Arg Ser Thr Arg Lys Val Ile Val 50 55 60 acc cca gcg ggc gag aag ttg ctg cca ttc gcc aaa tcc acc ctt gac 240 Thr Pro Ala Gly Glu Lys Leu Leu Pro Phe Ala Lys Ser Thr Leu Asp 65 70 75 80 gcg gcg gag tct ttc ctc tcc cac gcc aag ggc gcc aac ggt tcg ctc 288 Ala Ala Glu Ser Phe Leu Ser His Ala Lys Gly Ala Asn Gly Ser Leu 85 90 95 act gga ccg ttg acc gta ggc atc atc ccc acg gcg gct cct tac att 336 Thr Gly Pro Leu Thr Val Gly Ile Ile Pro Thr Ala Ala Pro Tyr Ile 100 105 110 ttg ccg tca atg ctg tcc atc gtg gat gaa gaa tat cca gat ctg gaa 384 Leu Pro Ser Met Leu Ser Ile Val Asp Glu Glu Tyr Pro Asp Leu Glu 115 120 125 cct cac atc gtc gag gac caa acc aag cat ctt ctc gcg ttg ctg cgc 432 Pro His Ile Val Glu Asp Gln Thr Lys His Leu Leu Ala Leu Leu Arg 130 135 140 gac ggc gcc atc gac gtc gcc atg atg gcc ctg cct tct gag gca cca 480 Asp Gly Ala Ile Asp Val Ala Met Met Ala Leu Pro Ser Glu Ala Pro 145 150 155 160 ggc atg aag gaa atc ccc ctc tac gac gaa gac ttt atc gtc gtt aca 528 Gly Met Lys Glu Ile Pro Leu Tyr Asp Glu Asp Phe Ile Val Val Thr 165 170 175 gct agc gat cac ccc ttc gcc ggc cgc caa gac tta gaa cta tcc gcc 576 Ala Ser Asp His Pro Phe Ala Gly Arg Gln Asp Leu Glu Leu Ser Ala 180 185 190 tta gaa gac ctc gat ctg ctg ctt ctc gac gac gga cac tgc ctc cac 624 Leu Glu Asp Leu Asp Leu Leu Leu Leu Asp Asp Gly His Cys Leu His 195 200 205 gac caa att gtg gac ctg tgc cgc cgc gga gac atc aac ccc att agc 672 Asp Gln Ile Val Asp Leu Cys Arg Arg Gly Asp Ile Asn Pro Ile Ser 210 215 220 tcc act act gct gtc acc cgc gca tcc agc ctt acc acc gtc atg cag 720 Ser Thr Thr Ala Val Thr Arg Ala Ser Ser Leu Thr Thr Val Met Gln 225 230 235 240 ctc gtc gtc gcc ggc ctt gga tcc acc ttg gtc cca atc agc gca atc 768 Leu Val Val Ala Gly Leu Gly Ser Thr Leu Val Pro Ile Ser Ala Ile 245 250 255 cca tgg gaa tgc acc cga cca gga ctg gca aca gcc aac ttc aac tct 816 Pro Trp Glu Cys Thr Arg Pro Gly Leu Ala Thr Ala Asn Phe Asn Ser 260 265 270 gat gtc acc gca aac cgc cgc att gga ttg gtg tac cgt tcc tct tct 864 Asp Val Thr Ala Asn Arg Arg Ile Gly Leu Val Tyr Arg Ser Ser Ser 275 280 285 tct cgc gcc gaa gag ttc gaa cag ttt gca ctc att ttg cag cgc gct 912 Ser Arg Ala Glu Glu Phe Glu Gln Phe Ala Leu Ile Leu Gln Arg Ala 290 295 300 ttc caa gaa gcc gtc gcg ctt gct gcc tca act ggc atc acc ttg aag 960 Phe Gln Glu Ala Val Ala Leu Ala Ala Ser Thr Gly Ile Thr Leu Lys 305 310 315 320 caa aat gtc gcg gta gcg cag taa 984 Gln Asn Val Ala Val Ala Gln 325 <210> 2 <211> 327 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Met Ser Asn Lys Glu Tyr Arg Pro Thr Leu Ala Gln Leu Arg Thr Phe 1 5 10 15 Val Thr Ile Ala Glu Cys Lys His Phe Gly Thr Ala Ala Thr Lys Leu 20 25 30 Ser Ile Ser Gln Pro Ser Leu Ser Gln Ala Leu Val Ala Leu Glu Thr 35 40 45 Gly Leu Gly Val Gln Leu Ile Glu Arg Ser Thr Arg Lys Val Ile Val 50 55 60 Thr Pro Ala Gly Glu Lys Leu Leu Pro Phe Ala Lys Ser Thr Leu Asp 65 70 75 80 Ala Ala Glu Ser Phe Leu Ser His Ala Lys Gly Ala Asn Gly Ser Leu 85 90 95 Thr Gly Pro Leu Thr Val Gly Ile Ile Pro Thr Ala Ala Pro Tyr Ile 100 105 110 Leu Pro Ser Met Leu Ser Ile Val Asp Glu Glu Tyr Pro Asp Leu Glu 115 120 125 Pro His Ile Val Glu Asp Gln Thr Lys His Leu Leu Ala Leu Leu Arg 130 135 140 Asp Gly Ala Ile Asp Val Ala Met Met Ala Leu Pro Ser Glu Ala Pro 145 150 155 160 Gly Met Lys Glu Ile Pro Leu Tyr Asp Glu Asp Phe Ile Val Val Thr 165 170 175 Ala Ser Asp His Pro Phe Ala Gly Arg Gln Asp Leu Glu Leu Ser Ala 180 185 190 Leu Glu Asp Leu Asp Leu Leu Leu Leu Asp Asp Gly His Cys Leu His 195 200 205 Asp Gln Ile Val Asp Leu Cys Arg Arg Gly Asp Ile Asn Pro Ile Ser 210 215 220 Ser Thr Thr Ala Val Thr Arg Ala Ser Ser Leu Thr Thr Val Met Gln 225 230 235 240 Leu Val Val Ala Gly Leu Gly Ser Thr Leu Val Pro Ile Ser Ala Ile 245 250 255 Pro Trp Glu Cys Thr Arg Pro Gly Leu Ala Thr Ala Asn Phe Asn Ser 260 265 270 Asp Val Thr Ala Asn Arg Arg Ile Gly Leu Val Tyr Arg Ser Ser Ser 275 280 285 Ser Arg Ala Glu Glu Phe Glu Gln Phe Ala Leu Ile Leu Gln Arg Ala 290 295 300 Phe Gln Glu Ala Val Ala Leu Ala Ala Ser Thr Gly Ile Thr Leu Lys 305 310 315 320 Gln Asn Val Ala Val Ala Gln 325 <210> 3 <211> 2484 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(750) <223> nucleotide sequence upstream of CDS <220> <221> CDS <222> (751)..(1731) <223> oxyR wild type gene <220> <221> misc_feature <222> (1016)..(1016) <223> cytosine <220> <221> misc_feature <222> (1481)..(1481) <223> cytosine <220> <221> misc_feature <222> (1732)..(2484) <223> nucleotide sequence downstream of CDS <400> 3 cctacggtgt ggccaggtca gagggtgttg cgctgcgcta cctcaccgat gcctggcgta 60 ctctccaaca ctcactgcct acggaagctc gcaccgagga acttgatgat gttgtggtgt 120 ggttgggcga actgatcaaa caggtcgact cctccctggt ggatgagtgg gctcagatgg 180 cggatccaga agcaccgatc agcaaggaag cgctggaacg agagctcgcc ttcggcgtgg 240 aagacccaac agcacttacc gccaaccgca gggcatttac catcatggtg cgcaacgcca 300 tgttccgcct tgtggagcta tttgcttatg aaaaggaaga tcagcttagt cagatgactg 360 aatacctgga tgaggctcct gatttcggtg ctgcgatgga tgcgtacttt gatgaatatg 420 cggatcttga taccggcccg gcagctcgtg gaccagagtt cttcaaggta gagcacacgg 480 gaagaatgtg ggaggtgcgt caggtggtga aggatccaga aggtgataat tccttcgcgt 540 ttgttgccac cattgatctt gatgcctctg atgatgcagg tgaggtgcgt tttggatcgc 600 tgtcgattga ccacaactag gggtttgcgt cgaaaagcaa gcacgcctgg tgcctgattt 660 gagcggtttt acctatggcg ctttggcgcc gtcaaactgt cccagcgatt tcattattat 720 tttcgtgcat tcaccgttat agttataggc atg agc aat aaa gag tac cgg ccc 774 Met Ser Asn Lys Glu Tyr Arg Pro 1 5 aca ctc gcc cag ctt cgc acc ttt gtc acc atc gca gaa tgc aag cac 822 Thr Leu Ala Gln Leu Arg Thr Phe Val Thr Ile Ala Glu Cys Lys His 10 15 20 ttt ggt act gct gcc acc aag ctg tcc att tcg cag cca tcc ctc tcc 870 Phe Gly Thr Ala Ala Thr Lys Leu Ser Ile Ser Gln Pro Ser Leu Ser 25 30 35 40 cag gca ctt gtc gca tta gaa aca ggc ctg gga gtt cag ctg att gaa 918 Gln Ala Leu Val Ala Leu Glu Thr Gly Leu Gly Val Gln Leu Ile Glu 45 50 55 cgc tcc acc cgc aag gtc att gtc acc cca gcg ggc gag aag ttg ctg 966 Arg Ser Thr Arg Lys Val Ile Val Thr Pro Ala Gly Glu Lys Leu Leu 60 65 70 cca ttc gcc aaa tcc acc ctt gac gcg gcg gag tct ttc ctc tcc cac 1014 Pro Phe Ala Lys Ser Thr 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Asp Leu Glu Leu Ser Ala Leu Glu Asp Leu Asp Leu Leu Leu 185 190 195 200 ctc gac gac gga cac tgc ctc cac gac caa att gtg gac ctg tgc cgc 1398 Leu Asp Asp Gly His Cys Leu His Asp Gln Ile Val Asp Leu Cys Arg 205 210 215 cgc gga gac atc aac ccc att agc tcc act act gct gtc acc cgc gca 1446 Arg Gly Asp Ile Asn Pro Ile Ser Ser Thr Thr Ala Val Thr Arg Ala 220 225 230 tcc agc ctt acc acc gtc atg cag ctc gtc gtc gcc ggc ctt gga tcc 1494 Ser Ser Leu Thr Thr Val Met Gln Leu Val Val Ala Gly Leu Gly Ser 235 240 245 acc ttg gtc cca atc agc gca atc cca tgg gaa tgc acc cga cca gga 1542 Thr Leu Val Pro Ile Ser Ala Ile Pro Trp Glu Cys Thr Arg Pro Gly 250 255 260 ctg gca aca gcc aac ttc aac tct gat gtc acc gca aac cgc cgc att 1590 Leu Ala Thr Ala Asn Phe Asn Ser Asp Val Thr Ala Asn Arg Arg Ile 265 270 275 280 gga ttg gtg tac cgt tcc tct tct tct cgc gcc gaa gag ttc gaa cag 1638 Gly Leu Val Tyr Arg Ser Ser Ser Ser Arg Ala Glu Glu Phe Glu Gln 285 290 295 ttt gca ctc att ttg cag cgc gct ttc caa gaa gcc gtc gcg ctt gct 1686 Phe Ala Leu Ile Leu Gln Arg Ala Phe Gln Glu Ala Val Ala Leu Ala 300 305 310 gcc tca act ggc atc acc ttg aag caa aat gtc gcg gta gcg cag 1731 Ala Ser Thr Gly Ile Thr Leu Lys Gln Asn Val Ala Val Ala Gln 315 320 325 taagtttttc tagaggtttt ccagagtcag ctacaagcaa aaagcccttt ccattgatgc 1791 acaccaacgt gagattcaag ggaaagggct ttattgattg cagaatgcct actgcattag 1851 cggcgctcca ccggaatatt tccaccactg atctggcggt aaatatgaac ggtagacagc 1911 atcattactg gcagcacgat gatcaggccg aaaccgatcg tgaaaatacc gatgatgagt 1971 gtggcaaacc cgccaaccag ggagaacagc aacaacattg ggtagttgcg cagcgagtcc 2031 ttgaaaccag tttgaacagc gcttcctgca gtgtggtgac catcagctgt gtagtacacc 2091 cagtaggagt acagaggatt gatgaagaac aacaccaggt agacgatgaa gaacatgcct 2151 aaaccgctgt tattgacctc aacggtaccg gcagcgtcat taaacgacac cagattttga 2211 gtgagaaaag tggtgaaggt gcccaggatg atgccgaaga tacccagccc caccatcaga 2271 atcactgttt gaccaacatt gatgggttta aagaaatcac cgaagcgaac tttgtgtcca 2331 tcaacagaaa gcagtgcacc gcgcatgacg caaatggtta ttgcgaaggt gatgattccg 2391 atagctacgt tcaacagggt ctcggaaacc gaaaaaccag aagtcgtcgt gcccgcatta 2451 gggtcgatca aaaatgataa gtagccaagc aac 2484 <210> 4 <211> 327 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 4 Met Ser Asn Lys Glu Tyr Arg Pro Thr Leu Ala Gln Leu Arg Thr Phe 1 5 10 15 Val Thr Ile Ala Glu Cys Lys His Phe Gly Thr Ala Ala Thr Lys Leu 20 25 30 Ser Ile Ser Gln Pro Ser Leu Ser Gln Ala Leu Val Ala Leu Glu Thr 35 40 45 Gly Leu Gly Val Gln Leu Ile Glu Arg Ser Thr Arg Lys Val Ile Val 50 55 60 Thr Pro Ala Gly Glu Lys Leu Leu Pro Phe Ala Lys Ser Thr Leu Asp 65 70 75 80 Ala Ala Glu Ser Phe Leu Ser His Ala Lys Gly Ala Asn Gly Ser Leu 85 90 95 Thr Gly Pro Leu Thr Val Gly Ile Ile Pro Thr Ala Ala Pro Tyr Ile 100 105 110 Leu Pro Ser Met Leu Ser Ile Val Asp Glu Glu Tyr Pro Asp Leu Glu 115 120 125 Pro His Ile Val Glu Asp Gln Thr Lys His Leu Leu Ala Leu Leu Arg 130 135 140 Asp Gly Ala Ile Asp Val Ala Met Met Ala Leu Pro Ser Glu Ala Pro 145 150 155 160 Gly Met Lys Glu Ile Pro Leu Tyr Asp Glu Asp Phe Ile Val Val Thr 165 170 175 Ala Ser Asp His Pro Phe Ala Gly Arg Gln Asp Leu Glu Leu Ser Ala 180 185 190 Leu Glu Asp Leu Asp Leu Leu Leu Leu Asp Asp Gly His Cys Leu His 195 200 205 Asp Gln Ile Val Asp Leu Cys Arg Arg Gly Asp Ile Asn Pro Ile Ser 210 215 220 Ser Thr Thr Ala Val Thr Arg Ala Ser Ser Leu Thr Thr Val Met Gln 225 230 235 240 Leu Val Val Ala Gly Leu Gly Ser Thr Leu Val Pro Ile Ser Ala Ile 245 250 255 Pro Trp Glu Cys Thr Arg Pro Gly Leu Ala Thr Ala Asn Phe Asn Ser 260 265 270 Asp Val Thr Ala Asn Arg Arg Ile Gly Leu Val Tyr Arg Ser Ser Ser 275 280 285 Ser Arg Ala Glu Glu Phe Glu Gln Phe Ala Leu Ile Leu Gln Arg Ala 290 295 300 Phe Gln Glu Ala Val Ala Leu Ala Ala Ser Thr Gly Ile Thr Leu Lys 305 310 315 320 Gln Asn Val Ala Val Ala Gln 325 <210> 5 <211> 984 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1)..(981) <223> oxyR allele <220> <221> mutation <222> (266)..(266) <223> C -> T transition <220> <221> misc_feature <222> (731)..(731) <223> cytosine <400> 5 atg agc aat aaa gag tac cgg ccc aca ctc gcc cag ctt cgc acc ttt 48 Met Ser Asn Lys Glu Tyr Arg Pro Thr Leu Ala Gln Leu Arg Thr Phe 1 5 10 15 gtc acc atc gca gaa tgc aag cac ttt ggt act gct gcc acc aag ctg 96 Val Thr Ile Ala Glu Cys Lys His Phe Gly Thr Ala Ala Thr Lys Leu 20 25 30 tcc att tcg cag cca tcc ctc tcc cag gca ctt gtc gca tta gaa aca 144 Ser Ile Ser Gln Pro Ser Leu Ser Gln Ala Leu Val Ala Leu Glu Thr 35 40 45 ggc ctg gga gtt cag ctg att gaa cgc tcc acc cgc aag gtc att gtc 192 Gly Leu Gly Val Gln Leu Ile Glu Arg Ser Thr Arg Lys Val Ile Val 50 55 60 acc cca gcg ggc gag aag ttg ctg cca ttc gcc aaa tcc acc ctt gac 240 Thr Pro Ala Gly Glu Lys Leu Leu Pro Phe Ala Lys Ser Thr Leu Asp 65 70 75 80 gcg gcg gag tct ttc ctc tcc cac gtc aag ggc gcc aac ggt tcg ctc 288 Ala Ala Glu Ser Phe Leu Ser His Val Lys Gly Ala Asn Gly Ser Leu 85 90 95 act gga ccg ttg acc gta ggc atc atc ccc acg gcg gct cct tac att 336 Thr Gly Pro Leu Thr Val Gly Ile Ile Pro Thr Ala Ala Pro Tyr Ile 100 105 110 ttg ccg tca atg ctg tcc atc gtg gat gaa gaa tat cca gat ctg gaa 384 Leu Pro Ser Met Leu Ser Ile Val Asp Glu Glu Tyr Pro Asp Leu Glu 115 120 125 cct cac atc gtc gag gac caa acc aag cat ctt ctc gcg ttg ctg cgc 432 Pro His Ile Val Glu Asp Gln Thr Lys His Leu Leu Ala Leu Leu Arg 130 135 140 gac ggc gcc atc gac gtc gcc atg atg gcc ctg cct tct gag gca cca 480 Asp Gly Ala Ile Asp Val Ala Met Met Ala Leu Pro Ser Glu Ala Pro 145 150 155 160 ggc atg aag gaa atc ccc ctc tac gac gaa gac ttt atc gtc gtt aca 528 Gly Met Lys Glu Ile Pro Leu Tyr Asp Glu Asp Phe Ile Val Val Thr 165 170 175 gct agc gat cac ccc ttc gcc ggc cgc caa gac tta gaa cta tcc gcc 576 Ala Ser Asp His Pro Phe Ala Gly Arg Gln Asp Leu Glu Leu Ser Ala 180 185 190 tta gaa gac ctc gat ctg ctg ctt ctc gac gac gga cac tgc ctc cac 624 Leu Glu Asp Leu Asp Leu Leu Leu Leu Asp Asp Gly His Cys Leu His 195 200 205 gac caa att gtg gac ctg tgc cgc cgc gga gac atc aac ccc att agc 672 Asp Gln Ile Val Asp Leu Cys Arg Arg Gly Asp Ile Asn Pro Ile Ser 210 215 220 tcc act act gct gtc acc cgc gca tcc agc ctt acc acc gtc atg cag 720 Ser Thr Thr Ala Val Thr Arg Ala Ser Ser Leu Thr Thr Val Met Gln 225 230 235 240 ctc gtc gtc gcc ggc ctt gga tcc acc ttg gtc cca atc agc gca atc 768 Leu Val Val Ala Gly Leu Gly Ser Thr Leu Val Pro Ile Ser Ala Ile 245 250 255 cca tgg gaa tgc acc cga cca gga ctg gca aca gcc aac ttc aac tct 816 Pro Trp Glu Cys Thr Arg Pro Gly Leu Ala Thr Ala Asn Phe Asn Ser 260 265 270 gat gtc acc gca aac cgc cgc att gga ttg gtg tac cgt tcc tct tct 864 Asp Val Thr Ala Asn Arg Arg Ile Gly Leu Val Tyr Arg Ser Ser Ser 275 280 285 tct cgc gcc gaa gag ttc gaa cag ttt gca ctc att ttg cag cgc gct 912 Ser Arg Ala Glu Glu Phe Glu Gln Phe Ala Leu Ile Leu Gln Arg Ala 290 295 300 ttc caa gaa gcc gtc gcg ctt gct gcc tca act ggc atc acc ttg aag 960 Phe Gln Glu Ala Val Ala Leu Ala Ala Ser Thr Gly Ile Thr Leu Lys 305 310 315 320 caa aat gtc gcg gta gcg cag taa 984 Gln Asn Val Ala Val Ala Gln 325 <210> 6 <211> 327 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum 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<222> (1732)..(2484) <223> nucleotide sequence downstream of CDS <220> <221> primer_bind <222> (1834)..(1853) <223> bindung site for primer oxyR_XL_E1 <400> 7 cctacggtgt ggccaggtca gagggtgttg cgctgcgcta cctcaccgat gcctggcgta 60 ctctccaaca ctcactgcct acggaagctc gcaccgagga acttgatgat gttgtggtgt 120 ggttgggcga actgatcaaa caggtcgact cctccctggt ggatgagtgg gctcagatgg 180 cggatccaga agcaccgatc agcaaggaag cgctggaacg agagctcgcc ttcggcgtgg 240 aagacccaac agcacttacc gccaaccgca gggcatttac catcatggtg cgcaacgcca 300 tgttccgcct tgtggagcta tttgcttatg aaaaggaaga tcagcttagt cagatgactg 360 aatacctgga tgaggctcct gatttcggtg ctgcgatgga tgcgtacttt gatgaatatg 420 cggatcttga taccggcccg gcagctcgtg gaccagagtt cttcaaggta gagcacacgg 480 gaagaatgtg ggaggtgcgt caggtggtga aggatccaga aggtgataat tccttcgcgt 540 ttgttgccac cattgatctt gatgcctctg atgatgcagg tgaggtgcgt tttggatcgc 600 tgtcgattga ccacaactag gggtttgcgt cgaaaagcaa gcacgcctgg tgcctgattt 660 gagcggtttt acctatggcg ctttggcgcc gtcaaactgt cccagcgatt tcattattat 720 tttcgtgcat tcaccgttat agttataggc atg agc aat aaa gag tac cgg ccc 774 Met Ser Asn Lys Glu Tyr Arg Pro 1 5 aca ctc gcc cag ctt cgc acc ttt gtc acc atc gca gaa tgc aag cac 822 Thr Leu Ala Gln Leu Arg Thr Phe Val Thr Ile Ala Glu Cys Lys His 10 15 20 ttt ggt act gct gcc acc aag ctg tcc att tcg cag cca tcc ctc tcc 870 Phe Gly Thr Ala Ala Thr Lys Leu Ser Ile Ser Gln Pro Ser Leu Ser 25 30 35 40 cag gca ctt gtc gca tta gaa aca ggc ctg gga gtt cag ctg att gaa 918 Gln Ala Leu Val Ala Leu Glu Thr Gly Leu Gly Val Gln Leu Ile Glu 45 50 55 cgc tcc acc cgc aag gtc att gtc acc cca gcg ggc gag aag ttg ctg 966 Arg Ser Thr Arg Lys Val Ile Val Thr Pro Ala Gly Glu Lys Leu Leu 60 65 70 cca ttc gcc aaa tcc acc ctt gac gcg gcg gag tct ttc ctc tcc cac 1014 Pro Phe Ala Lys Ser Thr Leu Asp Ala Ala Glu Ser Phe Leu Ser His 75 80 85 gtc aag ggc gcc aac ggt tcg ctc act gga ccg ttg acc gta ggc atc 1062 Val Lys Gly Ala Asn Gly Ser Leu Thr Gly Pro Leu Thr Val Gly Ile 90 95 100 atc ccc acg gcg gct cct tac att ttg ccg tca atg ctg tcc atc gtg 1110 Ile Pro Thr Ala Ala Pro Tyr Ile Leu Pro Ser Met Leu Ser Ile Val 105 110 115 120 gat gaa gaa tat cca gat ctg gaa cct cac atc gtc gag gac caa acc 1158 Asp Glu Glu Tyr Pro Asp Leu Glu Pro His Ile Val Glu Asp Gln Thr 125 130 135 aag cat ctt ctc gcg ttg ctg cgc gac ggc gcc atc gac gtc gcc atg 1206 Lys His Leu Leu Ala Leu Leu Arg Asp Gly Ala Ile Asp Val Ala Met 140 145 150 atg gcc ctg cct tct gag gca cca ggc atg aag gaa atc ccc ctc tac 1254 Met Ala Leu Pro Ser Glu Ala Pro Gly Met Lys Glu Ile Pro Leu Tyr 155 160 165 gac gaa gac ttt atc gtc gtt aca gct agc gat cac ccc ttc gcc ggc 1302 Asp Glu Asp Phe Ile Val Val Thr Ala Ser Asp His Pro Phe Ala Gly 170 175 180 cgc caa gac tta gaa cta tcc gcc tta gaa gac ctc gat ctg ctg ctt 1350 Arg Gln Asp Leu Glu Leu Ser Ala Leu Glu Asp Leu Asp Leu Leu Leu 185 190 195 200 ctc gac gac gga cac tgc ctc cac gac caa att gtg gac ctg tgc cgc 1398 Leu Asp Asp Gly His Cys Leu His Asp Gln Ile Val Asp Leu Cys Arg 205 210 215 cgc gga gac atc aac ccc att agc tcc act act gct gtc acc cgc gca 1446 Arg Gly Asp Ile Asn Pro Ile Ser Ser Thr Thr Ala Val Thr Arg Ala 220 225 230 tcc agc ctt acc acc gtc atg cag ctc gtc gtc gcc ggc ctt gga tcc 1494 Ser Ser Leu Thr Thr Val Met Gln Leu Val Val Ala Gly Leu Gly Ser 235 240 245 acc ttg gtc cca atc agc gca atc cca tgg gaa tgc acc cga cca gga 1542 Thr Leu Val Pro Ile Ser Ala Ile Pro Trp Glu Cys Thr Arg Pro Gly 250 255 260 ctg gca aca gcc aac ttc aac tct gat gtc acc gca aac cgc cgc att 1590 Leu Ala Thr Ala Asn Phe Asn Ser Asp Val Thr Ala Asn Arg Arg Ile 265 270 275 280 gga ttg gtg tac cgt tcc tct tct tct cgc gcc gaa gag ttc gaa cag 1638 Gly Leu Val Tyr Arg Ser Ser Ser Ser Arg Ala Glu Glu Phe Glu Gln 285 290 295 ttt gca ctc att ttg cag cgc gct ttc caa gaa gcc gtc gcg ctt gct 1686 Phe Ala Leu Ile Leu Gln Arg Ala Phe Gln Glu Ala Val Ala Leu Ala 300 305 310 gcc tca act ggc atc acc ttg aag caa aat gtc gcg gta gcg cag 1731 Ala Ser Thr Gly Ile Thr Leu Lys Gln Asn Val Ala Val Ala Gln 315 320 325 taagtttttc tagaggtttt ccagagtcag ctacaagcaa aaagcccttt ccattgatgc 1791 acaccaacgt gagattcaag ggaaagggct ttattgattg cagaatgcct actgcattag 1851 cggcgctcca ccggaatatt tccaccactg atctggcggt aaatatgaac ggtagacagc 1911 atcattactg gcagcacgat gatcaggccg aaaccgatcg tgaaaatacc gatgatgagt 1971 gtggcaaacc cgccaaccag ggagaacagc aacaacattg ggtagttgcg cagcgagtcc 2031 ttgaaaccag tttgaacagc gcttcctgca gtgtggtgac catcagctgt gtagtacacc 2091 cagtaggagt acagaggatt gatgaagaac aacaccaggt agacgatgaa gaacatgcct 2151 aaaccgctgt tattgacctc aacggtaccg gcagcgtcat taaacgacac cagattttga 2211 gtgagaaaag tggtgaaggt gcccaggatg atgccgaaga tacccagccc caccatcaga 2271 atcactgttt gaccaacatt gatgggttta aagaaatcac cgaagcgaac tttgtgtcca 2331 tcaacagaaa gcagtgcacc gcgcatgacg caaatggtta ttgcgaaggt gatgattccg 2391 atagctacgt tcaacagggt ctcggaaacc gaaaaaccag aagtcgtcgt gcccgcatta 2451 gggtcgatca aaaatgataa gtagccaagc aac 2484 <210> 8 <211> 327 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 8 Met Ser Asn Lys Glu Tyr Arg Pro Thr 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EcoRI restriction site <400> 10 gcgaattccg ctaatgcagt aggcattc 28 <210> 11 <211> 1263 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1)..(1263) <223> lysC wild type gene <400> 11 gtg gcc ctg gtc gta cag aaa tat ggc ggt tcc tcg ctt gag agt gcg 48 Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala 1 5 10 15 gaa cgc att aga aac gtc gct gaa cgg atc gtt gcc acc aag aag gct 96 Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala 20 25 30 gga aat gat gtc gtg gtt gtc tgc tcc gca atg gga gac acc acg gat 144 Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp 35 40 45 gaa ctt cta gaa ctt gca gcg gca gtg aat ccc gtt ccg cca gct cgt 192 Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg 50 55 60 gaa atg gat atg ctc ctg act gct ggt gag cgt att tct aac gct ctc 240 Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu 65 70 75 80 gtc gcc atg gct att gag tcc ctt ggc gca gaa gcc caa tct ttc acg 288 Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr 85 90 95 ggc tct cag gct ggt gtg ctc acc acc gag cgc cac gga aac gca cgc 336 Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg 100 105 110 att gtt gat gtc act cca ggt cgt gtg cgt gaa gca ctc gat gag ggc 384 Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly 115 120 125 aag atc tgc att gtt gct ggt ttc cag ggt gtt aat aaa gaa acc cgc 432 Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg 130 135 140 gat gtc acc acg ttg ggt cgt ggt ggt tct gac acc act gca gtt gcg 480 Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160 ttg gca gct gct ttg aac gct gat gtg tgt gag att tac tcg gac gtt 528 Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val 165 170 175 gac ggt gtg tat acc gct gac ccg cgc atc gtt cct aat gca cag aag 576 Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys 180 185 190 ctg gaa aag ctc agc ttc gaa gaa atg ctg gaa ctt gct gct gtt ggc 624 Leu Glu Lys Leu Ser 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12 <211> 421 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 12 Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala 1 5 10 15 Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala 20 25 30 Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp 35 40 45 Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg 50 55 60 Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu 65 70 75 80 Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr 85 90 95 Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg 100 105 110 Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly 115 120 125 Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg 130 135 140 Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160 Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val 165 170 175 Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys 180 185 190 Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu 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Gly Ala Leu Ser Ile Ala Gly Leu Lys Glu Met Ser Phe Ala Pro 305 310 315 320 ggt tct gtc gtg gtg tgc atc atc tct ggt ggc aac aac gat gtg ctg 1008 Gly Ser Val Val Val Cys Ile Ile Ser Gly Gly Asn Asn Asp Val Leu 325 330 335 cgt tat gcg gaa atc gct gag cgc tcc ttg gtg cac cgc ggt ttg aag 1056 Arg Tyr Ala Glu Ile Ala Glu Arg Ser Leu Val His Arg Gly Leu Lys 340 345 350 cac tac ttc ttg gtg aac ttc ccg caa aag cct ggt cag ttg cgt cac 1104 His Tyr Phe Leu Val Asn Phe Pro Gln Lys Pro Gly Gln Leu Arg His 355 360 365 ttc ctg gaa gat atc ctg gga ccg gat gat gac atc acg ctg ttt gag 1152 Phe Leu Glu Asp Ile Leu Gly Pro Asp Asp Asp Ile Thr Leu Phe Glu 370 375 380 tac ctc aag cgc aac aac cgt gag acc ggt act gcg ttg gtg ggt att 1200 Tyr Leu Lys Arg Asn Asn Arg Glu Thr Gly Thr Ala Leu Val Gly Ile 385 390 395 400 cac ttg agt gaa gca tca gga ttg gat tct ttg ctg gaa cgt atg gag 1248 His Leu Ser Glu Ala Ser Gly Leu Asp Ser Leu Leu Glu Arg Met Glu 405 410 415 gaa tcg gca att gat tcc cgt cgc ctc gag ccg ggc acc cct gag tac 1296 Glu Ser Ala Ile Asp Ser Arg Arg Leu Glu Pro Gly Thr Pro Glu Tyr 420 425 430 gaa tac ttg acc taa 1311 Glu Tyr Leu Thr 435 <210> 14 <211> 436 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 14 Met Ser Glu Thr Tyr Val Ser Glu Lys Ser Pro Gly Val Met Ala Ser 1 5 10 15 Gly Ala Glu Leu Ile Arg Ala Ala Asp Ile Gln Thr Ala Gln Ala Arg 20 25 30 Ile Ser Ser Val Ile Ala Pro Thr Pro Leu Gln Tyr Cys Pro Arg Leu 35 40 45 Ser Glu Glu Thr Gly Ala Glu Ile Tyr Leu Lys Arg Glu Asp Leu Gln 50 55 60 Asp Val Arg Ser Tyr Lys Ile Arg Gly Ala Leu Asn Ser Gly Ala Gln 65 70 75 80 Leu Thr Gln Glu Gln Arg Asp Ala Gly Ile Val Ala Ala Ser Ala Gly 85 90 95 Asn His Ala Gln Gly Val Ala Tyr Val Cys Lys Ser Leu Gly Val Gln 100 105 110 Gly Arg Ile Tyr Val Pro Val Gln Thr Pro Lys Gln Lys Arg Asp Arg 115 120 125 Ile Met Val His Gly Gly Glu Phe Val Ser Leu Val Val Thr Gly Asn 130 135 140 Asn Phe Asp Glu Ala Ser Ala Ala Ala His Glu Asp Ala Glu Arg Thr 145 150 155 160 Gly Ala Thr Leu Ile Glu Pro Phe Asp 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cgtactttga tgaatatgcg gatcttgata ccggcccggc 180 agctcgtgga ccagagttct tcaaggtaga gcacacggga agaatgtggg aggtgcgtca 240 ggtggtgaag gatccagaag gtgataattc cttcgcgttt gttgccacca ttgatcttga 300 tgcctctgat gatgcaggtg aggtgcgttt tggatcgctg tcgattgacc acaactaggg 360 gtttgcgtcg aaaagcaagc acgcctggtg cctgatttga gcggttttac ctatggcgct 420 ttggcgccgt caaactgtcc cagcgatttc attattattt tcgtgcattc accgttatag 480 ttataggc atg agc aat aaa gag tac cgg ccc aca ctc gcc cag ctt cgc 530 Met Ser Asn Lys Glu Tyr Arg Pro Thr Leu Ala Gln Leu Arg 1 5 10 acc ttt gtc acc atc gca gaa tgc aag cac ttt ggt act gct gcc acc 578 Thr Phe Val Thr Ile Ala Glu Cys Lys His Phe Gly Thr Ala Ala Thr 15 20 25 30 aag ctg tcc att tcg cag cca tcc ctc tcc cag gca ctt gtc gca tta 626 Lys Leu Ser Ile Ser Gln Pro Ser Leu Ser Gln Ala Leu Val Ala Leu 35 40 45 gaa aca ggc ctg gga gtt cag ctg att gaa cgc tcc acc cgc aag gtc 674 Glu Thr Gly Leu Gly Val Gln Leu Ile Glu Arg Ser Thr Arg Lys Val 50 55 60 att gtc acc cca gcg ggc gag aag ttg ctg cca 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ggc cgc caa gac tta gaa cta 1058 Val Thr Ala Ser Asp His Pro Phe Ala Gly Arg Gln Asp Leu Glu Leu 175 180 185 190 tcc gcc tta gaa gac ctc gat ctg ctg ctt ctc gac gac gga cac tgc 1106 Ser Ala Leu Glu Asp Leu Asp Leu Leu Leu Leu Asp Asp Gly His Cys 195 200 205 ctc cac gac caa att gtg gac ctg tgc cgc cgc gga gac atc aac ccc 1154 Leu His Asp Gln Ile Val Asp Leu Cys Arg Arg Gly Asp Ile Asn Pro 210 215 220 att agc tcc act act gct gtc acc cgc gca tcc agc ctt acc acc gtc 1202 Ile Ser Ser Thr Thr Ala Val Thr Arg Ala Ser Ser Leu Thr Thr Val 225 230 235 atg cag ctc gtc gtc gcc ggc ctt gga tcc acc ttg gtc cca atc agc 1250 Met Gln Leu Val Val Ala Gly Leu Gly Ser Thr Leu Val Pro Ile Ser 240 245 250 gca atc cca tgg gaa tgc acc cga cca gga ctg gca aca gcc aac ttc 1298 Ala Ile Pro Trp Glu Cys Thr Arg Pro Gly Leu Ala Thr Ala Asn Phe 255 260 265 270 aac tct gat gtc acc gca aac cgc cgc att gga ttg gtg tac cgt tcc 1346 Asn Ser Asp Val Thr Ala Asn Arg Arg Ile Gly Leu Val Tyr Arg Ser 275 280 285 tct tct tct cgc gcc gaa gag ttc gaa cag ttt gca ctc att ttg cag 1394 Ser Ser Ser Arg Ala Glu Glu Phe Glu Gln Phe Ala Leu Ile Leu Gln 290 295 300 cgc gct ttc caa gaa gcc gtc gcg ctt gct gcc tca act ggc atc acc 1442 Arg Ala Phe Gln Glu Ala Val Ala Leu Ala Ala Ser Thr Gly Ile Thr 305 310 315 ttg aag caa aat gtc gcg gta gcg cag taagtttttc tagaggtttt 1489 Leu Lys Gln Asn Val Ala Val Ala Gln 320 325 ccagagtcag ctacaagcaa aaagcccttt ccattgatgc acaccaacgt gagattcaag 1549 ggaaagggct ttattgattg cagaatgcct actgcattag cggaattcgc 1599 <210> 16 <211> 327 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 16 Met Ser Asn Lys Glu Tyr Arg Pro Thr Leu Ala Gln Leu Arg Thr Phe 1 5 10 15 Val Thr Ile Ala Glu Cys Lys His Phe Gly Thr Ala Ala Thr Lys Leu 20 25 30 Ser Ile Ser Gln Pro Ser Leu Ser Gln Ala Leu Val Ala Leu Glu Thr 35 40 45 Gly Leu Gly Val Gln Leu Ile Glu Arg Ser Thr Arg Lys Val Ile Val 50 55 60 Thr Pro Ala Gly Glu Lys Leu Leu Pro Phe Ala Lys Ser Thr Leu Asp 65 70 75 80 Ala Ala Glu Ser Phe Leu Ser His Val Lys Gly 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Gln Arg Ala 290 295 300 Phe Gln Glu Ala Val Ala Leu Ala Ala Ser Thr Gly Ile Thr Leu Lys 305 310 315 320 Gln Asn Val Ala Val Ala Gln 325 <210> 17 <211> 117 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1)..(117) <223> part of the coding region of the oxyR allele <220> <221> misc_feature <222> (58)..(60) <223> n is a, c, g, or t <400> 17 aag ttg ctg cca ttc gcc aaa tcc acc ctt gac gcg gcg gag tct ttc 48 Lys Leu Leu Pro Phe Ala Lys Ser Thr Leu Asp Ala Ala Glu Ser Phe 1 5 10 15 ctc tcc cac nnn aag ggc gcc aac ggt tcg ctc act gga ccg ttg acc 96 Leu Ser His Xaa Lys Gly Ala Asn Gly Ser Leu Thr Gly Pro Leu Thr 20 25 30 gta ggc atc atc ccc acg gcg 117 Val Gly Ile Ile Pro Thr Ala 35 <210> 18 <211> 39 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> The 'Xaa' at location 20 stands for Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Gly, Val, Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys, or Phe. <400> 18 Lys Leu Leu Pro Phe Ala Lys Ser Thr Leu Asp Ala Ala Glu Ser Phe 1 5 10 15 Leu Ser His Xaa Lys Gly Ala Asn Gly Ser Leu Thr Gly Pro Leu Thr 20 25 30 Val Gly Ile Ile Pro Thr Ala 35 <210> 19 <211> 117 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1)..(117) <223> part of the coding region of the oxyR allele <400> 19 aag ttg ctg cca ttc gcc aaa tcc acc ctt gac gcg gcg gag tct ttc 48 Lys Leu Leu Pro Phe Ala Lys Ser Thr Leu Asp Ala Ala Glu Ser Phe 1 5 10 15 ctc tcc cac gtc aag ggc gcc aac ggt tcg ctc act gga ccg ttg acc 96 Leu Ser His Val Lys Gly Ala Asn Gly Ser Leu Thr Gly Pro Leu Thr 20 25 30 gta ggc atc atc ccc acg gcg 117 Val Gly Ile Ile Pro Thr Ala 35 <210> 20 <211> 39 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 20 Lys Leu Leu Pro Phe Ala Lys Ser Thr Leu Asp Ala Ala Glu Ser Phe 1 5 10 15 Leu Ser His Val Lys Gly Ala Asn Gly Ser Leu Thr Gly Pro Leu Thr 20 25 30 Val Gly Ile Ile Pro Thr Ala 35 <210> 21 <211> 984 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1)..(981) <223> oxyR allele <220> <221> mutation <222> (266)..(266) <223> C -> T transition <220> <221> mutation <222> (731)..(731) <223> C -> T transition <400> 21 atg agc aat aaa gag tac cgg ccc aca ctc gcc cag ctt cgc acc ttt 48 Met Ser Asn Lys Glu Tyr Arg Pro Thr Leu Ala Gln Leu Arg Thr Phe 1 5 10 15 gtc acc atc gca gaa tgc aag cac ttt ggt act gct gcc acc aag ctg 96 Val Thr Ile Ala Glu Cys Lys His Phe Gly Thr Ala Ala Thr Lys Leu 20 25 30 tcc att tcg cag cca tcc ctc tcc cag gca ctt gtc gca tta gaa aca 144 Ser Ile Ser Gln Pro Ser Leu Ser Gln Ala Leu Val Ala Leu Glu Thr 35 40 45 ggc ctg gga gtt cag ctg att gaa cgc tcc acc cgc aag gtc att gtc 192 Gly Leu Gly Val Gln Leu Ile Glu Arg Ser Thr Arg Lys Val Ile Val 50 55 60 acc cca gcg ggc gag aag ttg ctg cca ttc gcc aaa tcc acc ctt gac 240 Thr Pro Ala Gly Glu Lys Leu Leu Pro Phe Ala Lys Ser Thr Leu Asp 65 70 75 80 gcg gcg gag tct ttc ctc tcc cac gtc aag ggc gcc aac ggt tcg ctc 288 Ala Ala Glu Ser Phe Leu Ser His Val Lys Gly Ala Asn Gly Ser Leu 85 90 95 act gga ccg ttg acc gta ggc atc atc ccc acg gcg gct cct tac att 336 Thr Gly Pro Leu Thr Val Gly Ile Ile Pro Thr Ala Ala Pro Tyr Ile 100 105 110 ttg ccg tca atg ctg tcc atc gtg gat gaa gaa tat cca gat ctg gaa 384 Leu Pro Ser Met Leu Ser Ile Val Asp Glu Glu Tyr Pro Asp Leu Glu 115 120 125 cct cac atc gtc gag gac caa acc aag cat ctt ctc gcg ttg ctg cgc 432 Pro His Ile Val Glu Asp Gln Thr Lys His Leu Leu Ala Leu Leu Arg 130 135 140 gac ggc gcc atc gac gtc gcc atg atg gcc ctg cct tct gag gca cca 480 Asp Gly Ala Ile Asp Val Ala Met Met Ala Leu Pro Ser Glu Ala Pro 145 150 155 160 ggc atg aag gaa atc ccc ctc tac gac gaa gac ttt atc gtc gtt aca 528 Gly Met Lys Glu Ile Pro Leu Tyr Asp Glu Asp Phe Ile Val Val Thr 165 170 175 gct agc gat cac ccc ttc gcc ggc cgc caa gac tta gaa cta tcc gcc 576 Ala Ser Asp His Pro Phe Ala Gly Arg Gln Asp Leu Glu Leu Ser Ala 180 185 190 tta gaa gac ctc gat ctg ctg ctt ctc gac gac gga cac tgc ctc cac 624 Leu Glu Asp Leu Asp Leu Leu Leu Leu Asp Asp Gly His Cys Leu His 195 200 205 gac caa att gtg gac ctg tgc cgc cgc gga gac atc aac ccc att agc 672 Asp Gln Ile Val Asp Leu Cys Arg Arg Gly Asp Ile Asn Pro Ile Ser 210 215 220 tcc act act gct gtc acc cgc gca tcc agc ctt acc acc gtc atg cag 720 Ser Thr Thr Ala Val Thr Arg Ala Ser Ser Leu Thr Thr Val Met Gln 225 230 235 240 ctc gtc gtc gtc ggc ctt gga tcc acc ttg gtc cca atc agc gca atc 768 Leu Val Val Val Gly Leu Gly Ser Thr Leu Val Pro Ile Ser Ala Ile 245 250 255 cca tgg gaa tgc acc cga cca gga ctg gca aca gcc aac ttc aac tct 816 Pro Trp Glu Cys Thr Arg Pro Gly Leu Ala Thr Ala Asn Phe Asn Ser 260 265 270 gat gtc acc gca aac cgc cgc att gga ttg gtg tac cgt tcc tct tct 864 Asp Val Thr Ala Asn Arg Arg Ile Gly Leu Val Tyr Arg Ser Ser Ser 275 280 285 tct cgc gcc gaa gag ttc gaa cag ttt gca ctc att ttg cag cgc gct 912 Ser Arg Ala Glu Glu Phe Glu Gln Phe Ala Leu Ile Leu Gln Arg Ala 290 295 300 ttc caa gaa gcc gtc gcg ctt gct gcc tca act ggc atc acc ttg aag 960 Phe Gln Glu Ala Val Ala Leu Ala Ala Ser Thr Gly Ile Thr Leu Lys 305 310 315 320 caa aat gtc gcg gta gcg cag taa 984 Gln Asn Val Ala Val Ala Gln 325 <210> 22 <211> 327 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 22 Met Ser Asn Lys Glu Tyr Arg Pro Thr Leu Ala Gln Leu Arg Thr Phe 1 5 10 15 Val Thr Ile Ala Glu Cys Lys His Phe Gly Thr Ala Ala Thr Lys Leu 20 25 30 Ser Ile Ser Gln Pro Ser Leu Ser Gln Ala Leu Val Ala Leu Glu Thr 35 40 45 Gly Leu Gly Val Gln Leu Ile Glu Arg Ser Thr Arg Lys Val Ile Val 50 55 60 Thr Pro Ala Gly Glu Lys Leu Leu Pro Phe Ala Lys Ser Thr Leu Asp 65 70 75 80 Ala Ala Glu Ser Phe Leu Ser His Val Lys Gly Ala Asn Gly Ser Leu 85 90 95 Thr Gly Pro Leu Thr Val Gly Ile Ile Pro Thr Ala Ala Pro Tyr Ile 100 105 110 Leu Pro Ser Met Leu Ser Ile Val Asp Glu Glu Tyr Pro Asp Leu Glu 115 120 125 Pro His Ile Val Glu Asp Gln Thr Lys His Leu Leu Ala Leu Leu Arg 130 135 140 Asp Gly Ala Ile Asp Val Ala Met Met Ala Leu Pro Ser Glu Ala Pro 145 150 155 160 Gly Met Lys Glu Ile Pro Leu Tyr Asp Glu Asp Phe Ile Val Val Thr 165 170 175 Ala Ser Asp His Pro Phe Ala Gly Arg Gln Asp Leu Glu Leu Ser Ala 180 185 190 Leu Glu Asp Leu Asp Leu Leu Leu Leu Asp Asp Gly His Cys Leu His 195 200 205 Asp Gln Ile Val Asp Leu Cys Arg Arg Gly Asp Ile Asn Pro Ile Ser 210 215 220 Ser Thr Thr Ala Val Thr Arg Ala Ser Ser Leu Thr Thr Val Met Gln 225 230 235 240 Leu Val Val Val Gly Leu Gly Ser Thr Leu Val Pro Ile Ser Ala Ile 245 250 255 Pro Trp Glu Cys Thr Arg Pro Gly Leu Ala Thr Ala Asn Phe Asn Ser 260 265 270 Asp Val Thr Ala Asn Arg Arg Ile Gly Leu Val Tyr Arg Ser Ser Ser 275 280 285 Ser Arg Ala Glu Glu Phe Glu Gln Phe Ala Leu Ile Leu Gln Arg Ala 290 295 300 Phe Gln Glu Ala Val Ala Leu Ala Ala Ser Thr Gly Ile Thr Leu Lys 305 310 315 320 Gln Asn Val Ala Val Ala Gln 325 <210> 23 <211> 698 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (167)..(179) <220> <221> CDS <222> (201)..(695) <223> dps wild type gene <400> 23 tcttggtgag ttccccagct agtcgatgaa tcacgtgtcc ttcaggcata atcaccaacc 60 ttagtagccg gtgtgccgat ttgataaaaa actaagcgtg gcctgcggga atcggcactt 120 tcaggatagg acaacctaat ataaataagc ttaggctaag ggccggtgac aatttatcaa 180 gcagtgctat aataggggtc atg gca aac tac aca gtc cct gga atc aac gag 233 Met Ala Asn Tyr Thr Val Pro Gly Ile Asn Glu 1 5 10 aat gac gca aag cag ctt att gat gga ctg cag gag cgt ctc acc gac 281 Asn Asp Ala Lys Gln Leu Ile Asp Gly Leu Gln Glu Arg Leu Thr Asp 15 20 25 tac aac gat ctt cac ctc atc ttg aag cac gtg cac tgg aac gtc act 329 Tyr Asn Asp Leu His Leu Ile Leu Lys His Val His Trp Asn Val Thr 30 35 40 ggc ccc aac ttc att gct gtt cac gaa atg ctc gac cca cag gtt gac 377 Gly Pro Asn Phe Ile Ala Val His Glu Met Leu Asp Pro Gln Val Asp 45 50 55 ctt gtt cgt ggc tat gct gac gaa gtt gca gag cgc att tcc acc ctc 425 Leu Val Arg Gly Tyr Ala Asp Glu Val Ala Glu Arg Ile Ser Thr Leu 60 65 70 75 gga ggc gca cca gtt gga acc cca gaa ggc cac gtt gct gac cgc acc 473 Gly Gly Ala Pro Val Gly Thr Pro Glu Gly His Val Ala Asp Arg Thr 80 85 90 cca ctg caa tat gag cgc aat gcc gga aat gtc caa gca cac ctc act 521 Pro Leu Gln Tyr Glu Arg Asn Ala Gly Asn Val Gln Ala His Leu Thr 95 100 105 gac ctc aat cgc gtg tac acc caa gtg ctg acc gga gtt cgc gag tcc 569 Asp Leu Asn Arg Val Tyr Thr Gln Val Leu Thr Gly Val Arg Glu Ser 110 115 120 atg gca tca gcc ggc cca gtg gat cca gta act gaa gac atc tac atc 617 Met Ala Ser Ala Gly Pro Val Asp Pro Val Thr Glu Asp Ile Tyr Ile 125 130 135 agc cag gcc gcg gag ctg gag aaa ttc cag tgg ttc atc cgc gca cac 665 Ser Gln Ala Ala Glu Leu Glu Lys Phe Gln Trp Phe Ile Arg Ala His 140 145 150 155 att gtt gat gta gac gga aac atc caa gag taa 698 Ile Val Asp Val Asp Gly Asn Ile Gln Glu 160 165 <210> 24 <211> 165 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 24 Met Ala Asn Tyr Thr Val Pro Gly Ile Asn Glu Asn Asp Ala Lys Gln 1 5 10 15 Leu Ile Asp Gly Leu Gln Glu Arg Leu Thr Asp Tyr Asn Asp Leu His 20 25 30 Leu Ile Leu Lys His Val His Trp Asn Val Thr Gly Pro Asn Phe Ile 35 40 45 Ala Val His Glu Met Leu Asp Pro Gln Val Asp Leu Val Arg Gly Tyr 50 55 60 Ala Asp Glu Val Ala Glu Arg Ile Ser Thr Leu Gly Gly Ala Pro Val 65 70 75 80 Gly Thr Pro Glu Gly His Val Ala Asp Arg Thr Pro Leu Gln Tyr Glu 85 90 95 Arg Asn Ala Gly Asn Val Gln Ala His Leu Thr Asp Leu Asn Arg Val 100 105 110 Tyr Thr Gln Val Leu Thr Gly Val Arg Glu Ser Met Ala Ser Ala Gly 115 120 125 Pro Val Asp Pro Val Thr Glu Asp Ile Tyr Ile Ser Gln Ala Ala Glu 130 135 140 Leu Glu Lys Phe Gln Trp Phe Ile Arg Ala His Ile Val Asp Val Asp 145 150 155 160 Gly Asn Ile Gln Glu 165

Claims (63)

  1. OxyR 전사 조절자 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 폴리펩티드는 L-알라닌을 제외한 단백질성(proteinogenic) 아미노산 중 하나가 위치 89 또는 상응하는 또는 필적하는 위치에 존재하는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 코리네형(coryneform) 박테리아의 단리된 돌연변이체.
  2. 제1항에 있어서, 코리네형 박테리아가 코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes) 및 코리네박테리움 아미노게네스(Corynebacterium aminogenes)의 군으로부터 선택된 박테리아 형태를 취함을 특징으로 하는 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  3. 제2항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰의 형태를 취함을 특징으로 하는 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, L-아미노산-분비 박테리아임을 특징으로 하는 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  5. 제4항에 있어서, L-리신, L-발린, L-이소류신, L-트립토판 또는 L-호모세린을 분비하는 박테리아임을 특징으로 하는 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 위치 89 또는 필적하는 위치에서 L-발린을 포함함을 특징으로 하는 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 서열 2의 아미노산 서열을 포함하며 L-알라닌을 제외한 단백질성 아미노산 중 하나가 위치 89에 존재하고 L-발린이 적절한 경우 위치 244에 존재함을 특징으로 하는 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자가, 코리네형 박테리아로부터 얻어진 DNA를 사용하고 서열 3 또는 서열 7의 위치 1 내지 750 사이의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 및 서열 3 또는 서열 7의 위치 2484 내지 1731 사이의 상보적 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍을 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 얻어질 수 있는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함함을 특징으로 하는 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  9. 제1항 내지 제6항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 327개의 L-아미노산에 상응하는 길이를 갖는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  10. 제1항 내지 제6항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 서열 6의 위치 70 내지 108에 상응하는 아미노산 서열을 아미노산 서열의 위치 70으로부터 108까지 포함함을 특징으로 하는 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  11. 제1항 내지 제6항 및 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 서열 6의 아미노산 서열과 90％ 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하며 L-발린이 적절한 경우 위치 244에 존재함을 특징으로 하는 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  12. 제1항 내지 제6항 및 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자가 서열 5의 뉴클레오티드 서열과 90％ 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하며 티민이 적절한 경우 위치 731에 존재함을 특징으로 하는 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  13. 제6항에 있어서, 코딩된 단백질이
    a) 서열 6에 따른 아미노산 서열,
    b) 하나 이상의 보존적 아미노산 교환(들)을 포함하는 서열 6에 따른 아미노산 서열, 및
    c) 아미노산의 하나 이상의 삽입 또는 결실을 포함하는 서열 6에 따른 아미노산 서열의 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며 L-발린이 적절한 경우 위치 244에 존재함을 특징으로 하는 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  14. 제7항에 있어서, 서열 2의 아미노산 서열이 위치 89에서 L-발린을 포함함을 특징으로 하는 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  15. 제14항에 있어서, 유전자가 서열 5 또는 서열 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하며 서열 5의 위치 731의 시토신 또는 서열 7의 위치 1481의 시토신이 적절한 경우 티민에 의해 대체됨을 특징으로 하는 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  16. a) 아미노산을 분비하는 능력을 갖는 코리네형 박테리아를 돌연변이유발제로 처리하는 단계,
    b) 상기 a)에서 생성된 돌연변이체를 단리 및 증식시키는 단계,
    c) 상기 b)에서 얻어진 돌연변이체로부터 핵산을 제조하는 단계,
    d) 서열 3 또는 서열 7의 위치 1 내지 1014 사이의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 및 서열 3 또는 서열 7의 위치 2484 내지 1018 사이의 상보적 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍 및 상기 c)로부터의 핵산의 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 핵산 분자를 제조하는 단계,
    e) 상기 d)에서 얻어진 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 및 코딩된 아미노산 서열을 결정하는 단계,
    f) 적절한 경우 상기 e)에서 결정된 아미노산 서열을 서열 6과 비교하며, 여기서 L-발린이 적절한 경우 위치 244에 존재하는 것인 단계, 및
    g) 위치 89 또는 필적하는 위치에서 L-알라닌을 제외한 단백질성 아미노산 중 하나, 바람직하게는 L-발린 및 적절한 경우 위치 244에서 L-발린을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돌연변이체를 확인하는 단계에 의해 얻어질 수 있음을 특징으로 하는 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 단계 b)에 이어서 제16항의 단계 a)에서 사용된 코리네형 박테리아보다 0.5％ 이상 더 많은 L-아미노산을 배지내로 분비하거나 또는 세포의 내부에 축적하는 능력을 갖는 돌연변이체를 선택하는 단계가 수행됨을 특징으로 하는 코리네형 박테리아의 돌연변이체.
  18. 아미노산 서열의 위치 89 또는 상응하는 또는 필적하는 위치에서 L-알라닌을 제외한 단백질성 아미노산 중 하나를 포함하며 OxyR 전사 조절자 활성을 갖는 폴리 펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  19. 제18항에 있어서, 단백질성 아미노산이 L-발린임을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  20. 제18항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 서열 2의 아미노산 서열을 포함하며 L-알라닌을 제외한 단백질성 아미노산 중 하나가 아미노산 서열의 위치 89에 존재하고 L-발린이 적절한 경우 위치 244에 존재함을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  21. 제18항 또는 제19항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 327개의 아미노산의 길이를 갖는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  22. 제19항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 서열 6의 위치 70 내지 108에 상응하는 아미노산 서열을 아미노산 서열의 위치 70으로부터 108까지 포함함을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  23. 제18항 또는 제19항에 있어서, 코리네형 박테리아로부터 얻어진 DNA를 사용하고 서열 3 또는 서열 7의 위치 1 내지 750 사이의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 및 서열 3 또는 서열 7의 위치 2484 내지 1732 사이의 상보적 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍을 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 얻어질 수 있는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열과 동일함을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  24. 제18항 또는 제19항에 있어서, 엄격 조건하에 서열 5에 상보적인 뉴클레오티드 서열과 혼성화함을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  25. 제18항 또는 제19항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가, 서열 6의 아미노산 서열과 90％ 이상 동일하며 L-발린이 적절한 경우 위치 244에 존재하는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  26. 제18항 또는 제19항에 있어서, 서열 5의 뉴클레오티드 서열과 90％ 이상 동일하며 티민이 적절한 경우 위치 731에 존재하는 뉴클레오티드 서열을 포함함을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  27. 제18항 또는 제19항에 있어서, 코딩된 단백질이
    a) 서열 6에 따른 아미노산 서열,
    b) 하나 이상의 보존적 아미노산 교환(들)을 포함하는 서열 6에 따른 아미노산 서열, 및
    c) 아미노산의 하나 이상의 삽입 또는 결실을 포함하며 L-발린이 적절한 경우 위치 244에 존재하는 서열 6에 따른 아미노산 서열의 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  28. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 폴리펩티드가 서열 6의 아미노산 서열을 포함하며 L-발린이 적절한 경우 위치 244에 존재함을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  29. 제28항에 있어서, 서열 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하며 티민이 적절한 경우 위치 731에 존재함을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  30. 서열 2의 위치 70 내지 108에 상응하는 아미노산 서열을 가지며 L-알라닌을 제외한 단백질성 아미노산 중 하나가 서열 2의 위치 89에 상응하는 위치에 존재하는 하나 이상의 리딩 프레임(reading frame)을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  31. 제30항에 있어서, 서열 6의 위치 70 내지 108에 상응하는 아미노산 서열을 가지며 L-발린이 적절한 경우 위치 244에 존재하는 하나 이상의 리딩 프레임을 코딩함을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  32. 제30항에 있어서, 아미노산 서열이 하나 이상의 보존적 아미노산 교환을 포함하며 보존적 아미노산 교환이 위치 89 및 적절한 경우 위치 244에 영향을 주지 않음을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  33. 제30항에 있어서, 하나 이상의 침묵 돌연변이를 포함함을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  34. 제31항에 있어서, 서열 7의 위치 958 내지 1074에 상응하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하며 티민이 적절한 경우 위치 731에 존재함을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  35. a) 제18항 내지 제29항 및 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드를 코리네형 박테리아로 전달하고,
    b) 코리네형 박테리아의 염색체에 존재하며 위치 89에서 L-알라닌을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 oxyR 유전자를, 위치 89 또는 필적하는 위치에서 다른 단백질성 L-아미노산을 가지며 적절한 경우 위치 244에서 L-발린을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 a)로부터의 폴리뉴클레오티드로 교환하고,
    c) 단계 a) 및 b)에서와 같이 얻어진 코리네형 박테리아를 증식시키는 것을 특징으로 하는 재조합 코리네형 박테리아의 생산 방법.
  36. 제35항에 있어서, 제18항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  37. 제35항에 있어서, 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  38. 제35항에 있어서, 위치 89에서의 다른 L-아미노산이 L-발린임을 특징으로 하는 방법.
  39. a) 제18항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드를 미생물로 전달하고,
    b) 단리된 폴리뉴클레오티드를 미생물에서 복제하고,
    c) 단계 a) 및 b)에서 얻어진 미생물을 증식시킴을 특징으로 하는 재조합 미생물의 생산 방법.
  40. 제18항 내지 제29항 및 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물.
  41. 제40항에 있어서, 코리네형 박테리아 또는 에세리키아(Escherichia) 속의 박테리아임을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  42. 제41항에 있어서, 코리네형 박테리아가 코리네박테리움 속의 형태를 취함을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  43. 제42항에 있어서, 코리네박테리움 속의 박테리아가 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 형태를 취함을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  44. 제18항 내지 제29항 및 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  45. 제44항에 따른 벡터를 포함하는 재조합 미생물.
  46. 제45항에 있어서, 코리네형 박테리아 또는 에세리키아 속의 박테리아임을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  47. 제46항에 있어서, 코리네형 박테리아가 코리네박테리움 속의 형태를 취함을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  48. 제47항에 있어서, 코리네박테리움 속의 박테리아가 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 형태를 취함을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  49. 미생물에서 제18항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드의 카피수가 한 (1) 카피 이상 증가함을 특징으로 하는, 미생물에서 OxyR 전사 조절자를 과발현시키는 방법.
  50. 프로모터 또는 발현 카세트가, OxyR 전사 조절자 활성을 가지며 L-알라닌을 제외한 단백질성 아미노산 중 하나가 아미노산 서열의 위치 89 또는 필적하는 위치에 존재하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 기능적으로 연결됨을 특징으로 하는, 미생물에서 OxyR 전사 조절자를 과발현시키는 방법.
  51. a) OxyR 전사 조절자 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 1 카피 이상 포함하며, 폴리펩티드의 아미노산 서열내 위치 89 또는 필적하는 위치에서의 L-알라닌이 다른 단백질성 아미노산에 의해 대체되고 위치 244의 L-알라닌이 적절한 경우 L-발린에 의해 대체되는 것인, 단리된 코리네형 박테리아를 적합한 배지 중에서 발효시키고,
    b) L-아미노산이 발효 브로쓰 또는 박테리아의 세포내에 축적됨을 특징으로 하는 L-아미노산의 제조 방법.
  52. 제51항에 있어서, 단리된 코리네형 박테리아가 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이체임을 특징으로 하는 방법.
  53. 제51항에 있어서, 단리된 코리네형 박테리아가, 제19항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 또는 이를 사용해서 생산된 재조합 코리네형 박테리아임을 특징으로 하는 방법.
  54. 제51항에 있어서, L-아미노산이 단리 또는 수집됨을 특징으로 하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, L-아미노산이 정제됨을 특징으로 하는 방법.
  56. 제51항에 있어서, L-아미노산이 발효 브로쓰 및/또는 바이오매스 (> 0 내지 100％)의 구성성분들과 함께 단리 또는 수집됨을 특징으로 하는 방법.
  57. 제51항에 있어서,
    a) 제51항의 단계 b)에서 얻어진 발효 브로쓰로부터 형성된 바이오매스가 0 내지 100％의 양으로 제거되고,
    b) 실질적으로 건조된 성형 생성물이, 단계 a)에서 얻어진 브로쓰로부터 과립화, 압착, 분무 건조 및 압출의 군으로부터 선택된 방법에 의해 생산됨을 특징으로 하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 황산, 염산 및 인산의 군으로부터 선택된 산이 단계 a)의 이전 또는 이후에 발효 브로쓰에 첨가됨을 특징으로 하는 방법.
  59. 제57항에 있어서, 물이 단계 a)의 이전 또는 이후에 얻어진 브로쓰로부터 제거됨을 특징으로 하는 방법.
  60. 제57항에 있어서, 단계 b)에서 또는 단계 b) 동안 얻어진 성형 생성물이 오일과 함께 분무됨을 특징으로 하는 방법.
  61. 제51항에 있어서,
    a) 발효 브로쓰를 바람직하게는 막 필터로 여과해서 바이오매스-함유 슬러지 및 여과물을 생성시키는 단계,
    b) 여과물을 농축시켜 바람직하게는 48 내지 52 중량％의 고체 함량을 생성시키는 단계,
    c) 단계 b)에서 얻어진 농축물을 바람직하게는 50℃ 내지 62℃의 온도에서 과립화하는 단계, 및
    d) 단계 c)에서 얻어진 과립을 하나 이상의 코팅제(들)로 코팅하는 단계를 수행함을 특징으로 하는 방법.
  62. a) 10 중량％ 이상 내지 최대 73 중량％ 이하의 (베이스로서의) 리신 함량,
    b) 5 중량％를 초과하지 않는 함수량, 및
    c) 발효 브로쓰에 존재하는 바이오매스의 0.1％ 이상에 상응하는 바이오매스 함량의 특징을 나타내며, 바이오매스는 적절한 경우 불활성화되며 제1항 내지 제17항 및 제40항 내지 제43항 및 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 박테리아에 의해 형성되는 것인, 발효 브로쓰 기재의 L-리신-함유 사료 첨가제.
  63. a) 5 중량％ 이상의 트립토판 함량,
    b) 5 중량％을 초과하지 않는 함수량, 및
    c) 발효 브로쓰에 존재하는 바이오매스의 0.1％ 이상에 상응하는 바이오매스 함량의 특징을 나타내며, 바이오매스는 적절한 경우 불활성화되며 제1항 내지 제17항 및 제40항 내지 제43항 및 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 박테리아에 의해 형성되는 것인, 발효 브로쓰 기재의 L-트립토판-함유 사료 첨가제.
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