KR20090053325A - 이온크로마토그래피를 이용한 2종 이상의 아마도리 화합물동시분석법 - Google Patents

이온크로마토그래피를 이용한 2종 이상의 아마도리 화합물동시분석법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 홍삼의 제조 과정 중 메일러드(Maillard) 반응에 의해 생성되는 2종이상의 아마도리(Amadori) 화합물의 분석법으로서, 홍삼추출물, 홍삼추출물 함유 조성물 또는 혈액 시료 내의 아마도리 화합물인 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc) 또는 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru)를 이온크로마토그래피의 고정상 및 이동상을 적절하게 선택함으로써 동시에 빠르고 정확하게 분석하는 방법을 개시한다. 상기 동시분석법은 재현성, 정확성, 분석시간, 비용 및 간편성 등에서 이익이 있으므로 홍삼의 품질관리에 응용할 수 있고, 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru), 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)를 이용한 약동력학 연구에도 널리 응용할 수 있다. 또한 홍삼이외의 다른 천연추출물이나 혈액이외의 다른 생체시료 내의 물질 분석에도 응용가능하며 유사 아마도리(Amadori) 화합물에도 효과적으로 응용될 것이다.
아마도리 화합물, 이온크로마토그래피(IC), 알기닌-프룩토오스(Arginine-Fructose), 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arginine-Fructose-Glucose), 홍삼(Red Ginseng), 혈액

Description

이온크로마토그래피를 이용한 2종 이상의 아마도리 화합물 동시분석법{Simultaneous determination of two or more Amadori compounds by high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection}
본 발명은 홍삼의 제조 과정 중 메일러드(Maillard) 반응에 의해 생성되는 2종이상의 아마도리(Amadori) 화합물의 분석법에 관한 것으로, 구체적으로는 홍삼추출물, 홍삼추출물 함유 조성물 또는 혈액 시료 내의 아마도리 화합물인 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc) 또는 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru)를 이온크로마토그래피의 고정상 및 이동상을 적절하게 선택함으로써 동시에 빠르고 정확하게 분석하는 방법에 관한 것이다.
인삼은 예로부터 동아시아에서 장생, 경신, 강장제의 목적으로 이용되고 있는 전통 약용식물이다. 그 중 홍삼은 생인삼을 가열된 수증기로 찐 후 햇볕 또는 열풍 등으로 건조하여 가공한 것으로서 인삼보다 약리효과가 더 큰 것으로 알려져 있다. 홍삼의 알려진 약리효과로는 순환계에 작용하여 혈압강하 및 혈류증가, 항혈전 등을 일으키는 효과, 항암작용 및 면역기능증강 효과 등이 있다. 또한 노화억제와 관련된 지질산화억제 및 항산화 효과, 방사선에 대한 방어효과 등을 가지는 것 으로 알려져 있다.
여러 가지 홍삼의 성분 중 비사포닌계 성분인 아마도리(Amadori)화합물은 수삼을 쪄서 건조하고 홍삼으로 제조하는 과정 중 열처리에 의하여 아미노산과 당(糖)의 축합반응인 메일러드(Maillard)반응이 일어날 때 생성되는 1-디옥시-아미노-프룩토피라노즈(1-deoxy-1-amino-fructopyranose) 화합물이다. 즉, 아마도리 화합물이란, 비효소적 당화반응(glycation)의 결과로서 최종반응생성물이 생성되는 과정에서 생성되는 중간생성물(intermediate)이다. 일반적으로 당의 알데히드 그룹이 아미노산의 아미노기와 결합하여 이민(imine) 또는 쉬프 베이스(Schiff base)를 형성하고, 상기 쉬프 베이스가 재배열되어 탄소-질소 이중결합 옆의 하이드록실기가 케톤기로 변화되면서 아마도리 화합물이 생성된다. 상기 아마도리 화합물이 산화되면 비효소적 당화반응의 최종반응생성물이 생성된다. 구체적으로는, 수삼 중에는 2 %가량의 유리아미노산이 포함되어 있으며 그 중 알기닌(arginine)의 함량이 60∼70 %로 상당히 높은 비율로 존재하므로, 홍삼 제조시 수삼 중의 알기닌(arginnine)이 열처리 반응에 의하여 당과 결합하여 새로운 아미노산 유도체인 아마도리(Amadori)화합물이 생성된다. 즉 수삼 중의 알기닌(arginine)과 맥아당(maltose), 알기닌(arginnine)과 포도당(glucose)이 결합하여 알기닌-프룩토오스(Arginine-Fructose), 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arginine-Fructose-Glucose)가 생성된다.
이러한 메일러드(Maillard) 반응은 비효소적 갈색화반응 (nonenzymatic browning reaction)이라고 하여 식품의 색, 풍미, 방향(芳香)에 영향을 주며 그 생성물인 아마도리(Armadori) 화합물들은 항산화(antioxidant), 항생(antibiotic)작용과 같은 생리활성작용이 있는 것으로 보고되고 있다. 또한 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arginine-Fructose-Glucose), 알기닌-프룩토오스(Arginine-Fructose)는 말타제 효소 활성을 억제하여 포도당의 흡수를 억제 또는 지연시킴으로써 급속한 혈당상승을 억제하는 등의 항비만(anti-obesity) 및 항당뇨(anti-diabetes)의 약리활성을 가지는 것으로 연구되고 있다.
본 발명은 홍삼 또는 홍삼가공품의 품질을 평가하고, 생리활성에 대한 다양한 연구목적을 위해 홍삼추출물 및 이를 포함하는 조성물 또는 혈액시료 중 2종 이상의 아마도리 화합물, 특히 알기닌-프룩토오스(Arginine-Fructose) 및 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arginine-Fructose-Glucose)성분들을 동시에 빠르고 정확하게 분석하기 위한 최적의 이온크로마토그래피(IC) 분석법을 제공하고자 한다.
본 발명은 2종 이상의 아마도리(Amadori) 화합물을 동시에 분석하는 방법으로서, a)2종 이상의 아마도리(Amadori) 화합물을 함유하는 시료로부터 아마도리(Amadori)화합물을 분리해내는 단계; b)이온크로마토그래피의 고정상으로서 강염기성 음이온 교환체 컬럼을 준비하고, 상기 분리해낸 아마도리(Amadori) 화합물을 상기 컬럼에 주입하는 단계; 및 c)이온크로마토그래피의 이동상으로서 물 및 수산화나트륨의 혼합용매를 준비하고, 상기 이동상을 이용하여 이온크로마토그래피로 2종 이상의 아마도리(Amadori) 화합물을 분석하는 단계를 포함하는, 아마도리(Amadori) 화합물의 분석법을 제공하고, 상기 아마도리 화합물은 홍삼추출물, 홍삼추출물 함유 조성물 또는 혈액 시료 내의 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc) 또는 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru)일 수 있다.
또한 본 발명은 홍삼 품질 평가 방법으로서, 상기 아마도리 화합물의 분석법을 이용하여 홍삼 내 아마도리 화합물 함량을 검출하는 단계; 및 상기 아마도리 화 합물의 검출량이 많으면 상기 홍삼의 홍삼화 정도가 높은 것으로 평가하는 단계를 포함하는 홍삼 품질 평가 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따른 2종 이상의 아마도리(Amadori) 화합물의 동시분석법은 재현성, 정확성, 분석시간, 비용 및 간편성 등에서 이익이 있으므로 홍삼의 품질관리에 응용할 수 있고, 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru), 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)를 이용한 약동력학 연구에도 널리 응용할 수 있다. 또한 홍삼이외의 다른 천연추출물이나 혈액이외의 다른 생체시료 내의 물질 분석에도 응용가능하며 유사 아마도리(Amadori) 화합물에도 효과적으로 응용될 것이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 일실시예에 따른 알기닌-프룩토오스(Arginine-Fructose), 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arginine-Fructose-Glucose)의 동시분석법은 하기의 단계로 이루어진다.
a)알기닌-프룩토오스(Arginine-Fructose), 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arginine-Fructose-Glucose) 를 함유하는 시료로부터 알기닌-프룩토오스(Arginine-Fructose), 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arginine-Fructose-Glucose) 를 분리해내는 단계;
b)이온크로마토그래피의 고정상으로서 강염기성 음이온 교환체 컬럼을 준비하고, 상기 분리해낸 알기닌-프룩토오스(Arginine-Fructose), 알기닌-프룩토오스- 글루코스(Arginine-Fructose-Glucose) 를 상기 컬럼에 주입하는 단계; 및
c)이온크로마토그래피의 이동상으로서 물 및 수산화나트륨의 혼합용매를 준비하고, 상기 이동상을 이용하여 이온크로마토그래피로 상기 2종의 아마도리(Amadori) 화합물을 정성 및 정량 분석하는 단계.
본 발명의 일실시예에서, 시료 중의 알기닌-프룩토오스(Arginine-Fructose), 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arginine-Fructose-Glucose)는 컬럼 충진제에 대한 친화력 차이에 의해 컬럼 통과 시간을 달리하게 된다. 이동에 따른 용리 시간(retention time)의 차이는 각 화합물(이온 상태)의 특징이 되고, 전기 전도도 검출기에 전도도의 증가로 나타나며 이를 피크(peak)라 한다. 분석 대상 물질은 표준 물질과의 용리 시간 비교에 의해 성분 확인이 이루어지며(정성 분석), 피크의 높이 또는 면적에 의해 포함된 양이 계산된다(정량 분석).
상기 아마도리(Amadori)화합물인 알기닌-프룩토오스(Arginine-Fructose, 이하 Arg-Fru) 및 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arginine-Fructose-Glucose, 이하 Arg-Fru-Glc)는 하기의 화학식의 구조를 갖는다.
Figure 112007084359426-PAT00001
본 발명의 일실시예에서, 상기 a 단계에서 상기 시료는 홍삼추출물, 홍삼추출물 함유 조성물 또는 혈액일 수 있다. 상기 시료가 홍삼추출물 또는 홍삼추출물 함유 조성물인 경우에는 상기 a 단계에서 물을 추출용매로 하여 시료로부터 아마도리 화합물을 추출하고, 상기 시료가 혈액인 경우에는 상기 a 단계에서 물 및 트리클로로아세틱애씨드를 9:1(부피비) 혼합한 혼합액을 사용하여 시료로부터 혈액 내 단백질을 제거하고 아마도리 화합물을 분리해낼 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, b 단계에서 사용되는 컬럼은 당(糖)분석에 적합한 강염기성 음이온 교환체의 특성을 갖는 폴리머 레진으로 충진될 수 있으며, 구체적으로는 컬럼의 충진제가 PS/DVB(Polystyrene/Divinyl benzene)의 공중합체 수지일 수 있다. 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru) 및 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)의 분자구조 중 단당구조와 이당구조를 효과적으로 분리하기 위해서는, 일반 액체크로마토그래피에서 당을 분리할 때 사용하는 아민(NH2 작용기가 결합되어 있는 컬럼) 컬럼보다는 강염기성 음이온 교환체의 컬럼을 사용하는 것이 분리도를 높이 므로 정확한 분석을 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, c 단계에서의 이동상으로는 단당구조와 이당구조의 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru) 및 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)를 동시에 이동시킬 수 있도록 하기 위하여, 400 mM 농도의 수산화나트륨 : 물을 9:1(부피비)로 혼합한 물 및 수산화나트륨의 혼합용매를 0.7-1 ml/분의 유속으로 사용할 수 있다. 상기 이동상의 유속이 0.7 ml/분 미만인 경우에는 홍삼추출물 및 홍삼추출물 함유 조성물 시료에서 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)가 시료중의 방해성분과 겹치며, 1 ml/분을 초과하는 경우에는 홍삼추출물, 홍삼추출물 함유 조성물 또는 혈액시료에서 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru) 및 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)가 방해성분과 겹쳐 정확한 분석이 어렵다.
한편, 이온크로마토그래피에서 당(糖)을 분석할 때 사용되는 수산화나트륨+초산나트륨+물의 혼합용매를 사용하는 경우에는, 혈액시료 중의 방해성분과 겹쳐서 정확한 분석이 어렵다.
본 발명의 일실시예에 따른 2종 이상의 아마도리(Amadori) 화합물의 동시분석법을 이용하여 홍삼추출물, 이를 포함하는 조성물 및 혈액시료 중의 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru), 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)들을 정량한 결과, 검량곡선에서 상기 두 가지 성분은 0.05 ~ 20 ㎍/㎖의 농도범위에서 모두 R2=0.999 이상의 양호한 직선성을 나타내었다.
본 발명의 일실시예에서는, 상기 아마도리 화합물 분석방법을 이용하여 홍삼 의 갈색화 정도를 평가할 수 있다. 홍삼의 갈색화 정도는 홍삼 제품의 품질의 중요한 평가 기준으로서, 색의 강도가 커질수록 홍삼화정도가 높은 우수한 품질의 홍삼으로 분류될 수 있다. 즉, 메일러드반응에 의해 그 반응생성물인 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arginine-Fructose-Glucose), 알기닌-프룩토오스(Arginine-Fructose)의 함량이 높을수록 홍삼화정도가 많이 진행된 제품으로 분류될 수 있다. 따라서 상기 두 성분의 함량 분석을 통하여 홍삼의 품질을 평가할 수 있다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예 및 시험예에 관하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 후술하는 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일 뿐, 본 발명이 그러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 분석을 위한 최적 조건 선정
알기닌-프룩토오스(Arg-Fru), 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)를 높은 분리도를 가지고 정확하게 분석하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하여 최적 조건을 결정하였다.
1. 분석방법의 선정
알기닌-프룩토오스(Arg-Fru), 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)를 높은 분리도로 분리하기 위하여, 여러 가지 분석방법을 사용하여 보았다. 우선, 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru), 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)는 분자 중에 알기닌이라는 아미노산과 당(糖)이 결합된 형태의 화합물로 매우 극성이 크고, 분 자 내에 특별한 자외선흡수 기능기가 없어 기존의 일반적인 액체크로마토그래피에서 사용되는 역상 비극성 컬럼(C18)과 자외부흡광광도계(UV)를 이용한 분석방법은 그대로 적용하기 어려웠다. 또한 아미노산 유도체화 이용시에도, 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru), 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)의 경우 분자 내의 당(糖)구조로 인해 아미노산 유도체화를 위한 형광시약의 반응성이 크게 감소하여 일반 아미노산의 유도체화 반응보다 감도가 떨어지고 두 화합물간의 분리도가 낮아질 뿐만 아니라, 유도체화라는 전처리 과정으로 분석 과정이 단순하지 않고 복잡해졌다. 분자 내의 당(糖)구조를 이용하여 당(糖)을 분리분석하기 위하여, 아민컬럼(NH2 작용기가 결합되어 있는 컬럼)과 시차굴절률검출기(Refractive Index detector)를 이용한 액체크로마토그래피를 적용한 경우에는, 단당구조의 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru)와 이당구조의 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)의 분리도가 떨어져 두 성분의 동시분석에 적당하지 않았으며 시차굴절률검출기의 특성상 검출감도가 좋지 않아 혈액시료 중에서와 같은 미량분석에 적용하기 어려웠다. 기체 크로마토그래피(GC)를 이용한 방법으로 분자 내 당(糖)부분을 트리메틸실릴레이션(trimethylsilylation)으로 유도체화하여 분석하는 방법에서도, 아마도리(Amadori) 화합물을 휘발성 화합물로 전환시키기 위해서는 유도체화라는 전처리과정이 반드시 필요하고 반응 부생성물로 호변체(tautomer)가 생성되므로 분리가 복잡해졌다.
따라서, 본 발명의 일실시예에서는 pH 조건에 따라 양이온성 또는 음이온성 전하를 띄는 아마도리(Amadori) 화합물의 구조적 특성을 이용하여 이온을 분석할 수 있는 이온크로마토그래피에 전기화학적 검출기(Electrochemical detector)를 이용한 고성능 이온교환크로마토그래피/펄스전류검출 (high performance anion exchange chromatography/pulsed amperometric detection, HPAEC-PAD) 방법을 적용하였으며, 펄스전류검출(pulsed amperometric detection)방식은 전기화학적 검출기(Electrochemical detector)의 한 방식이다. 본 발명의 일실시예에서는 고성능 이온교환크로마토그래피/전기화학검출기의 고정상으로 강염기성 음이온 교환체를 사용하여 여러 무기물과 유기물중의 음이온을 높은 선택성과 감도로 분석할 수 있도록 하고, 염기성 pH의 이동상을 이용하여 당(糖)을 약한 음이온성을 갖도록 이온화시켜, 컬럼 고정상과의 친화력을 이용하여 각각의 성분들을 분리하였다.
2. 최적의 컬럼 선정
이온 크로마토그래피에서 사용되는 고정상은 폴리스티렌이나 실리카겔에 이온교환능을 가진 기능기를 도입한 것으로, 골격을 이루는 기재와 이온교환능을 갖는 교환기로 이루어진다. 이온 교환기는 강산성, 약산성, 약염기성, 강염기성의 4가지 종류가 있으나, 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru) 및 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)를 분석하기 위해서는 강염기조건에서 당을 약한 음이온성을 띄도록 이온화하여 강염기성 음이온 교환체로 이루어진 컬럼과의 결합력을 이용하는 분리 메카니즘을 적용하였다.
한편, 강염기조건(높은 pH)에서는 기존의 고전적인 방식의 액체크로마토그래 피(HPLC)에 사용되는 실리카기제의 컬럼 주기제가 녹기 때문에 적용할 수 없고, pH적용범위가 0∼14로서 높은 pH에서도 안정한 폴리머기제로 이루어진 컬럼 주기제를 사용할 수 있다. 구체적으로 컬럼의 주기제를 PS/DVB(Polystyrene/Divinyl benzene)의 공중합체 수지로 할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 Carbopac PA1 컬럼을 선정하여 사용하였다.
3. 분리도 향상을 위한 이동상 조건 설정
이온 크로마토그래피에서의 이동상으로는 주로 수용액을 사용하며 이동상의 이온 강도와 pH를 조절함으로써 이온의 머무름 시간을 조절할 수 있다. 양이온 교환체에는 음이온성 용매를, 음이온 교환체에는 양이온성 용매를 사용한다. 이동상의 이온강도가 커지는 경우, 이온교환체의 이온교환기에 대한 시료이온과 이동상 염의 대립이온과의 경쟁이 커지게 되어 시료이온의 머무름 시간이 감소한다. 이동상의 pH를 바꾸어 시료의 해리도를 조절하는 경우 시료 중의 이온종의 비율이 변화하며, 높은 pH의 경우 음이온 교환 크로마토그래피에서 시료이온의 머무름 시간이 증가한다.
본 발명자들은 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru)와 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)를 동시에 이동시킬 수 있도록 시료이온의 머무름 시간을 증가시키기 위하여 이동상으로서 높은 pH의 수산화나트륨+초산나트륨+물의 혼합용매 및 물+수산화나트륨의 혼합용매를 적용해 보았다. 첫 번째로 수산화나트륨+초산나트륨+물의 혼합용매를 사용한 경우 100 mM에서 500 mM의 농도범위에서 이동상 이온강도를 조절하였을 때 혈장시료에서 내인성 물질과 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)가 분리되지 않았고, 내부표준물질 또한 시료의 방해성분과 잘 분리되지 않아 정확한 분석조건을 설정하지 못했다.
두 번째로 물+수산화나트륨의 혼합용매를 사용한 경우 수산화나트륨의 농도를 100 mM에서 500 mM의 범위에서 점차적으로 증가시키면서 혈장시료중의 내인성 물질과 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc) 및 내부표준물질이 분리되는 농도를 실험하였다. 그 결과 400 mM의 농도에서 가장 효과적으로 분석된 것을 확인할 수 있었다. 또한 시료 중에 존재하는 불순물들을 효과적으로 용출시켜 시료의 다음 주입시 분석에 영향을 주지 않았다. 또한 이온의 머무름 시간 및 분리도의 향상을 위해 이동상의 유속을 조절했을 때 분당 0.7-1 ml의 속도, 바람직하게는 분당 0.7 ml의 속도에서 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru)와 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc) 및 내부표준물질이 15분 이내에 만족스러운 분리도와 머무름 시간을 가지고 분리되었다.
4. 분석을 위한 최적 조건
따라서, 2종의 아마도리(Amadori) 성분인 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru)와 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)는 고성능 이온교환크로마토그래피/펄스전류검출(high performance anion exchange chromatography/pulsed amperometric detection, HPAEC-PAD)로 분석하였다. 구체적 조건은 하기 표 1에 기재되어 있는데, 시료로부터 분리해낸 상기 성분들을 이온크로마토그래피에 주입시키고, 고정상 으로는 Carbopac PA1(길이: 25 cm, 내경 : 4.0 mm) 컬럼, 이동상으로는 400 mM 수산화나트륨과 물을 사용하였다. 이동상의 유속은 0.7 mL/분이고, 시료 주입량은 25 ㎕이며, 펄스전류검출에 사용되는 작업전극(금)과 기준전극(은/염화은)으로 구성된 전극을 이용하여 전기화학적 검출기를 이용하였다. 분석시 컬럼의 온도는 30 ℃였으며, 전기화학적 검출을 위해 사용한 펄스전류검출(pulsed amperometric detection)방식은 사중전위차파동형(quadruple potential waveform) 방법으로서, 그 조건은 표 2에 나타난 바와 같다. 즉, 0.1 V의 전위에서 0.2분간 지연시간을 유지한 후 0.2~0.4 분동안 0.1 V의 전위로 작업전극(금)의 표면에서 당(糖)이 산화되면서 발생된 전류를 적분하여 측정한다. 0.41~0.5 분간은 당의 산화반응에 의해 생성된 전극표면의 금산화물을 다시 원래의 금으로 환원시키기 위해 표 2의 전위차변화에 따라 전극 표면을 세정하는 과정을 거친다.
컬럼 Carbopac PA1컬럼(4.0 mm x 25 cm) Carbopac PA1가드컬럼(4.0 mm x 5 cm)
이동상 용매 A (물) : 용매 B (400 mM 수산화나트륨) = 10:90
유속 0.7 mL/분
컬럼온도 30℃
주입량 25 ㎕
검출기 ECD
작업전극 금(gold)
기준전극 Ag/AgCl
시간(분) 전위(V) Integration
0.0 +0.1
0.2 +0.1 시작
0.4 +0.1 끝
0.41 -2.0
0.42 -2.0
0.43 +0.6
0.44 -0.1
0.50 -0.1
[실시예 2] 알기닌-프룩토오스(Arginine-Fructose), 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arginine-Fructose-Glucose)의 동시분석
상기 실시예 1에서 선정한 최적 조건을 이용하여 실제로 홍삼추출물 또는 이를 포함하는 조성물, 및 혈액 중에 존재하는 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru)와 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc) 화합물들을 동시에 분석하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
1. 분석기기(HPAEC-PAD)
본 실시예에서 사용된 이온크로마토그래피는 다이오넥스(Dionex)사의 ICS2500로서, 여기에 ED50의 전기화학적 검출기(ECD)가 연결된 시스템을 사용하였다. 컬럼은 다이오넥스(Dionex)사의 CarboPac PA1 가드컬럼 (4.0 mm x 5 cm)과 Carbopac PA1 컬럼(4.0 mm x 25cm)을 연결하여 사용하였고, 데이터 처리는 다이오넥스(Dionex)사의 Chromeleon 6.5 프로그램을 사용하였다.
알기닌-프룩토오스(Arg-Fru)와 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)의 표준품으로부터 얻어진 이온크로마토그램은 도 1에 나타내었다. 용출순서는 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru), 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc), 내부표준물질로 사용한 엔아세틸뉴라미닉애씨드(N-acetylneuraminic acid)의 순이었다.
2. 표준품
알기닌-프룩토오스(Arg-Fru)와 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)의 표준품은 따로 합성하고 컬럼크로마토그래피로 분리, 핵자기공명기(NMR) 및 액체크로마토그래피/질량분석기를 이용하여 동정한 것을 사용하였다. 구체적으로는 하기와 같이 수행되었다.
알기닌(arginnin) 10 g과 맥아당(maltose) 20 g, 알기닌(arginnine) 10 g과 포도당(glucose) 20 g을 각각 빈 플라스크에 넣은 후 초산 50 ㎖씩을 가하여 80℃에서 20분간 가열하였다. 실온에서 냉각 후 반응물을 1000 g, 10분간 원심분리하여 침전물을 제거하고 상등액만을 취하여 감압 농축하였다. 농축액에 증류수 50 ㎖을 가하여 용해시키고 이온 교환체 컬럼에 로딩하여 나온 용출액을 동결건조하였다. 다시 실리카겔 컬럼을 이용하여 분리정제하고 컬럼 용출액을 TLC로 확인하여 각 분획물을 감압농축하였다. 얻어진 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru)와 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)를 300 MHz 핵자기공명기(Gemini 2000, Varian社)와 액체크로마토그래피/질량분석기(LCQ-Deca XP, Thermo Fisher Scientific社)를 통하여 동정하고 분자량을 확인하였으며 순도는 95 %이상임을 확인하였다. 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru)와 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)의 질량스펙트럼은 도 2에 나타내었다.
3. 홍삼추출물 및 홍삼추출물 포함 조성물에서 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru) 및 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)의 동시분석
시중에서 상용화되고 있는 홍삼제품들 및 자체적으로 제조한 홍삼추출물을 대상으로 각 시료를 20 ㎎ 씩 취하여 내부표준물질인 엔아세틸뉴라미닉애씨드(N-acetylneuraminic acid)를 가하고 내부표준물질의 최종농도가 5 ㎍/㎖가 되도록 증류수로 희석하였다. 상기 시료들을 15분간 초음파로 추출하여 잘 분산시킨 후 다른 전처리 과정없이 0.2 ㎛ PVDF 멤브레인 필터로 여과하여 상기 시료용액 25 ㎕를 고성능 이온교환크로마토그래피/전기화학검출기에 주입하고 분석하였다. 상기 분석결과로 나온 크로마토그램을 도 4에 도시하였으며, 함량 측정 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
시료 Arg-Fru의 함량(%) Arg-Fru-Glc(%)
홍삼추출물 1 0.95 2.64
홍삼추출물 2 1.51 2.33
제품 1(JL) 2.51 1.32
제품 2(JG) 1.80 0.96
제품 3(LTJS) 1.62 1.05
제품 4(DH) 0.35 0.29
제품 5(NH) 1.57 0.25
제품 6(RGHK) 0.85 0.77
알기닌-프룩토오스(Arg-Fru)와 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)화합물을 정량하기 위한 검량곡선은 0.05 ∼ 20 ㎍/㎖의 범위에서 작성되었으며 두 화합물 모두 R=0.99이상의 양호한 직선성을 나타내었고 도 3에 나타내었다.
분석결과 홍삼추출물 및 제품 중에 존재하는 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru)와 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)화합물의 검출한계는 각각 0.1 ㎍/g이었다.
한편, 시료 중의 함량분석결과를 확인하기 위하여 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru)와 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)화합물의 함량을 알고 있는 홍삼추출물에 일정량의 표준품을 첨가하여 분석함으로써 회수율을 구하였다. 하기 표 4에 홍삼추출물 중의 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru)와 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)화합물의 초기농도, 첨가된 표준품의 농도 및 회수율결과가 나타나 있다.
화합물 초기농도 (㎍/㎖) 첨가한양 (㎍/㎖) 측정된 양 (㎍/㎖) 회수율(%)
Arg-Fru 4.8 16.0 21.14 102.1
10.0 14.78 99.8
1.0 5.82 101.5
0.2 4.99 94.7
Arg-Fru-Glc 4.5 16.0 20.40 99.4
10.0 14.56 100.6
1.0 5.52 101.5
0.2 4.69 94.5
4. 혈액 중에서 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru) 및 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)의 동시분석
랫트의 혈액 중에서 두 화합물을 동시분석하기 위하여 6 ∼ 8주령의 수컷랫트(270±30 g)의 혈액을 채취하여 4 ℃, 13,000 rpm에서 5 분간 원심분리하여 혈장을 따로 분리하고 -20 ℃에서 보관하였다.
상기 혈장 490 ㎕에 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc), 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru)의 표준품 혼합용액 10 ㎕을 스파이크(spike)하여 표준품의 최종농도가 0.5, 1, 5, 10 ㎍/㎖의 농도가 되도록 한 후, 표준품이 스파이크(spike)된 상기 혈장을 100 ㎕ 취하여 100 ㎍/㎖ 농도의 엔아세틸뉴라미닉애씨드(N-acetylneuraminic acid) 10 ㎕ 을 넣었다. 그리고 혈장 중의 단백질을 제거하기 위하여 10 % 트리클로로아세틱애씨드 90 ㎕를 넣어 혼합한 후 4 ℃, 12,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 상등액을 분리하였다.
분리한 상등액은 0.2 ㎛ PVDF 멤브레인 필터로 여과한 후 25 ㎕를 고성능 이온교환크로마토그래피/전기화학검출기에 주입하고 분석하였다. 혈액시료의 매트릭스에 존재할 수 있는 방해성분 또는 내인성물질 등의 존재 하에서 분석대상물의 정확한 측정이 가능한지 검증하기 위하여, 혈장(blank plasma) 시료와 표준액을 스파이크한 혈장시료를 비교 분석하여 두 크로마토그램에서 간섭현상이 없는지를 관찰하였다. 도 5는 혈장(blank plasma) 시료에 대한 크로마토그램(상) 및 표준액을 스파이크한 혈장시료에 대한 크로마토그램(하)를 나타낸다. 성분들의 피크 머무름 위치를 표준액(도 1의 크로마토그램)으로부터 확인하고, 혈액 내 매트릭스 영향이 있는지를 관찰한 결과, 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru) 및 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc) 성분들의 위치에 다른 특이할 만한 피크가 없음을 확인할 수 있었다. 혈액 중에 존재하는 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc), 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru) 화합물의 검출한계는 각각 0.1 ㎍/㎖이었다.
또한, 분석결과를 확인하기 위하여 혈액에 스파이크(spike)한 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc) 및 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru)의 회수율을 확인하고자, 각 농도에 대하여 5개의 샘플링 시료를 이용하여 일내(intraday) 및 일간(interday) 측정하고 그 평균을 내었다. 하기 표 5에는 혈액 중의 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru), 표 6에는 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)화합물의 회수율결과를 나타내었다.
측정 스파이크한 농도 (㎍/㎖) 측정된 농도 (㎍/㎖) (평균±표준편차) 회수율(%, n=5)
일내 측정 (Intraday) 10 10.21±0.14 102.1
5 4.97±0.12 99.4
1 1.03±0.03 102.6
0.5 0.48±0.02 96.4
일간 측정 (Interday) 10 10.24±0.19 102.4
5 5.02±0.13 100.3
1 1.02±0.02 101.5
0.5 0.48±0.02 95.5
측정 스파이크한 농도 (㎍/㎖) 측정된 농도 (㎍/㎖) (평균±표준편차) 회수율(%, n=5)
일내 측정 (Intraday) 10 9.88±0.15 98.8
5 4.80±0.10 96.1
1 1.02±0.03 101.7
0.5 0.49±0.02 97.6
일간 측정 (Interday) 10 9.95±0.15 99.5
5 4.94±0.13 98.7
1 1.01±0.03 100.8
0.5 0.48±0.02 95.4
도 1은 2종의 아마도리(Amadori) 화합물인 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru) 및 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc), 및 내부표준물질(I.S.)인 엔아세틸뉴라미닉애씨드(N-acetylneuraminic acid)의 표준액 이온크로마토그램을 나타낸다.
도 2는 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru) 및 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc)의 표준품의 질량스펙트럼을 나타낸다.
도 3은 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc) 및 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru)의 농도와 신호세기(피크면적)에 대한 검량곡선을 나타낸다.
도 4는 홍삼추출물 시료에서 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc) 및 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru)를 동시분석한 크로마토그램을 나타낸다.
도 5는 혈액시료에서 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc) 및 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru)의 분석 정확도를 검증하기 위하여, 표준품을 스파이크한 혈장시료 및 혈장시료(blank plasma)에서 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc) 및 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru)를 동시분석한 크로마토그램을 나타낸다.

Claims (9)

  1. 2종 이상의 아마도리(Amadori) 화합물을 동시에 분석하는 방법으로서,
    a)2종 이상의 아마도리(Amadori) 화합물을 함유하는 시료로부터 아마도리(Amadori)화합물을 분리해내는 단계;
    b)이온크로마토그래피의 고정상으로서 강염기성 음이온 교환체 컬럼을 준비하고, 상기 분리해낸 아마도리(Amadori) 화합물을 상기 컬럼에 주입하는 단계; 및
    c)이온크로마토그래피의 이동상으로서 물 및 수산화나트륨의 혼합용매를 준비하고, 상기 이동상을 이용하여 이온크로마토그래피로 2종 이상의 아마도리(Amadori) 화합물을 분석하는 단계를 포함하는, 아마도리(Amadori) 화합물의 분석법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 a 단계에서 상기 시료는 홍삼추출물, 홍삼추출물 함유 조성물 및 혈액으로 구성된 군으로부터 선택된 것인, 아마도리(Amadori) 화합물의 분석법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 a 단계에서 상기 시료가 홍삼추출물 또는 홍삼추출물 함유 조성물인 경우에는 물을 추출용매로 하여 시료로부터 아마도리 화합물을 추출하는, 아마도리(Amadori) 화합물의 분석법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 a 단계에서 상기 시료가 혈액인 경우에는 물 및 트리클로로아세틱애씨드 혼합액을 사용하여 시료로부터 혈액 내 단백질을 제거하고 아마도리 화합물을 분리해내는, 아마도리(Amadori) 화합물의 분석법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 a 단계에서 상기 아마도리(Amadori) 화합물은 알기닌-프룩토오스-글루코스(Arg-Fru-Glc) 또는 알기닌-프룩토오스(Arg-Fru)인, 아마도리(Amadori) 화합물의 분석법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 b 단계에서 상기 컬럼의 충진제가 PS/DVB(Polystyrene/Divinyl benzene)의 공중합체 수지인, 아마도리(Amadori) 화합물의 분석법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 c 단계에서 상기 물 및 수산화나트륨의 혼합용매는 400 mM 농도의 수산화나트륨 : 물의 부피비가 9:1이 되도록 혼합한 용매인, 아마도리(Amadori) 화합물의 분석법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 c 단계에서 상기 이동상의 유속은 0.7-1 ml/분인, 아마도리(Amadori) 화합물의 분석법.
  9. 홍삼 품질 평가 방법으로서,
    제1항 내지 제3항 및 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 아마도리 화합물의 분석법을 이용하여 홍삼 내 아마도리 화합물 함량을 검출하는 단계; 및
    상기 아마도리 화합물의 검출량이 많으면 상기 홍삼의 홍삼화 정도가 높은 것으로 평가하는 단계를 포함하는 홍삼 품질 평가 방법.
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