KR20090052148A - 나노수산화아파타이트가 표면고정화된 유/무기 하이브리드지지체 및 이의 제조방법 - Google Patents

나노수산화아파타이트가 표면고정화된 유/무기 하이브리드지지체 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 나노수산화아파타이트가 표면고정화된 유/무기 하이브리드 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 유/무기 하이브리드 지지체는 포스포닉산(phosphonic acid) 작용기를 갖는 폴리(에틸렌글리콜 메타아크릴레이트 포스페이트)[poly(ethylene glycol methacrylate phosphate); PolyEGMP] 또는 카복실산(carboxylic acid) 작용기를 갖는 고분자가 표면에 그라프팅된 나노수산화아파타이트의 표면 산성기와 고분자 지지체 표면의 일차 아민을 EDC(1-ethyl-3-dimethylaminopropyl carbodiimide) 존재 하에 반응시켜 나노수산화아파타이트가 고분자 지지체 표면에 고정화된 것을 특징으로 한다.

Description

나노수산화아파타이트가 표면고정화된 유/무기 하이브리드 지지체 및 이의 제조방법{Organic-inorganic hybrid scaffolds with surface-immobilized nano-hydroxyapatite and preparation method thereof}
본 발명은 나노수산화아파타이트가 표면고정화된 유/무기 하이브리드 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
초미립자 나노수산화아파타이트 (Ca10(PO4)6(OH)2)와 생체 고분자의 조합은 효과적인 골 재생에 이상적인 환경을 제공할 수 있기 때문에, 골 조직공학(bone tissue engineering)을 위한 매력적인 하이브리드 지지체이다. 자연골(spontaneous bone) 구조는 무기물인 나노수산화아파타이트와 콜라겐이 연결된 유기물인 세포외기질(extracellular matrix, ECM)의 혼합구조로 되어 있다. 3차원 다공성 지지체는 골아세포의 기능을 촉진시키는 중요한 역할뿐만 아니라 결함이 있는 부분에 임시적인 골격을 제공해준다. 효율적인 골 재생 소재를 디자인하기 위한 많은 요소들 중, 가장 중요한 요소 중 하나는 세포가 다공성 지지체에 효율적으로 부착, 이동 및 증식할 수 있도록 지지체 표면 성질을 변화시키는 것이다. 따라서, 매우 높은 생활성 화 나노수산화아파타이트를 이용한 다공성 지지체 표면 기능화는 골재생에 응용할 수 있는 효율적인 하이브리드(hybrid) 나노 지지체를 위한 이상적인 접근 방법 중 하나이다.
현재, 3차원 하이브리드 지지체를 제조하는 거의 대부분의 방법은 고분자와 나노수산화아파타이트와의 단순한 물리적인 혼합방법을 이용하고 있다. 그러나, 상기와 같은 방법들은 근본적으로 다공성 지지체 표면에 나노수준(nano-level)으로 나노수산화아파타이트를 노출시키기 어렵다. 이로 인해, 생체재료 표면에서 세포의 부착을 증진시키는 혈청 단백질의 흡착 및 미네랄 유도와 같은 나노수산화아파타이트 본연의 물리화학적 성질을 발현하는데 한계가 있다.
또한, 고분자 지지체 표면에 무기물인 나노수산화아파타이트를 혼합하여 높은 세포-친화성 환경을 가진 표면을 제공하기 위하여, 먼저 나노수산화아파타이트 표면과 고분자 소재 표면 사이의 본질적인 낮은 친화력을 극복해야한다. 나노수산화아파타이트는 표면 반응성이 높지 않으므로, 화학적 결합이나 물리적인 접착에 의해 고분자 표면에 안정적으로 고정화할 수 없다. 또한, 나노수산화아파타이트는 높은 밀도(3.2 g/mL) 뿐만 아니라 입자간 반 데르 발스(van der Waals) 상호작용 및 수소결합에 의해 용액 내에서 응집이 심해 침전으로 분리되는 경향이 있다. 이 두 가지 본질적인 나노수산화아파타이트의 특성으로 인해, 고분자 지지체 표면에 나노단위로 안정되게 고정화하는 기술을 구현하기가 불가능하다.
따라서, 용액 내에서 높은 콜로이드 안정성을 보이며, 나노수준의 분산이 가능하고 높은 표면 반응성을 갖는 나노수산화아파타이트를 이용하면 고분자 지지체 표면에 안정되게 고정화할 수 있을 것으로 생각된다.
본 발명자들은 나노수산화아파타이트를 고분자 지지체 표면에 안정되게 고정화할 수 있는 방법에 대해 연구하던 중, 용액 상에서 분산특성이 우수하고 표면반응성을 갖는 표면개질된 나노수산화아파타이트를 고분자 지지체 표면에 화학결합을 통해 나노단위로 고정화하였으며, 상기 유/무기 하이브리드 지지체가 세포 부착 및 성장을 현저하게 증가시키고, 알칼린 포스파타아제(ALP) 활성을 현저히 증가시켜 인간 지방유래 줄기세포의 골아세포로의 분화 및 골아세포의 성장에 우수한 환경을 제공할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 나노수산화아파타이트가 표면고정화된 유/무기 하이브리드 지지체 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 나노수산화아파타이트가 고분자 지지체 표면에 고정화된 유/무기 하이브리드 지지체를 제공한다.
또한, 본 발명은 포스포닉산(phosphonic acid) 작용기를 갖는 폴리(에틸렌글리콜 메타아크릴레이트 포스페이트) [poly(ethylene glycol methacrylate phosphate); PolyEGMP] 또는 카복실산(carboxylic acid) 작용기를 갖는 고분자가 표면에 그라프팅된 나노수산화아파타이트의 표면 산성기와 고분자 지지체 표면의 일차 아민을 EDC(1-ethyl-3-dimethylaminopropyl carbodiimide) 존재 하에 반응시 켜 나노수산화아파타이트를 고분자 지지체 표면에 고정화시키는 것을 특징으로 하는, 유/무기 하이브리드 지지체의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 유/무기 하이브리드 지지체에서, 나노수산화아파타이트는 5~300㎚의 크기, 바람직하게는 길이 120㎚ 및 넓이 20㎚의 크기를 갖는 나노수산화아파타이트 표면에 포스포닉산 작용기를 갖는 PolyEGMP를 그라프팅하여 표면개질시켰으며, 이때 나노수산화아파타이트 표면에 그라프팅된 PolyEGMP의 양은 16 중량%이다(한국특허출원 제 10-2007-9573호 및 Journal of Materials Chemistry, 2007, 17. 174-180). 상기 나노수산화아파타이트는 포스포닉산 작용기를 갖는 PolyEGMP 대신 카복실산 작용기를 갖는 고분자를 사용하여 표면개질할 수도 있다. 상기 카복실산 작용기를 갖는 고분자로는 폴리(아크릴산)[poly(acrylic acid)], 폴리메타아크릴산 [polymethacrylic acid], 폴리(아스파르트산) [poly(aspartic acid)], 폴리(글루탐산)[poly(glutamic acid)], 알긴산(alginic acid), 히알루론산(hyaluronic acid) 등이 있다. 상기 표면개질된 나노수산화아파타이트는 수용액 상에서 뛰어난 콜로이드 분산 안정성(zeta potential = -22~31 mv)과 표면에 반응성이 높은 포스포닉산 기 또는 카복실산 기를 갖고 있으며, 침상구조를 나타낸다.
본 발명의 유/무기 하이브리드 지지체에서, 고분자 지지체는 폴리(L-락타이드)[poly(L-lactide)], 폴리(D-락타이드)[poly(D-lactide)], 폴리(DL-락타이드) [poly(DL-lactide)], 폴리(글리콜릭-코-락트산)[poly(glycolic-co-lactic acid)], 폴리(ε-카프로락톤)[poly(ε-caprolactone)], 폴리카보네이트[polycarbonate], 키 토산, 알기네이트, 히알루론산, 덱스트란, 전분, 메틸셀룰로오스, 젤라틴, 콜라겐, 폴리안하이드라이드[polyanhydride], 폴리(오르토 에스터) [poly(ortho esters)] 및 폴리포스파젠[polyphosphazene]으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 고분자 지지체의 타입은 치밀형, 다공성 블록형, 나노/마이크로 파이버형, 및 마이크로스피어형 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 고분자 지지체의 타입이 다공성 블록형일 경우 고분자 지지체의 기공 크기는 50~500㎛인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 유/무기 하이브리드 지지체의 제조방법을 상세히 설명하면 다음과 같다.
먼저, 포스포닉산 작용기를 갖는 폴리(에틸렌글리콜 메타아크릴레이트 포스페이트) (PolyEGMP) 또는 카복실산 작용기를 갖는 고분자가 표면 그라프팅된 나노수산화아파타이트(PolyEGMP-HAp)는 한국특허출원 제 10-2007-9573호에 기재되어 있는 방법에 따라 제조한다.
고분자 수용액은 2% 아세트산용액을 사용하여 준비한다. 고분자 용액을 테프론 원통 몰드에 넣은 후 24시간 동안 -20℃ 냉동고에서 동결시킨다. 동결된 용액을 48시간 동안 동결건조시킨다. 고분자 지지체에 남아있는 아세트산을 중화시키기 위하여 고분자 지지체를 24시간 동안 1N 수산화나트륨 용액에 담근 후 증류수로 세척한다.
포스포닉산 작용기를 갖는 폴리(에틸렌글리콜 메타아크릴레이트 포스페이트) (PolyEGMP) 또는 카복실산 작용기를 갖는 고분자가 표면 그라프팅된 나노수산화아 파타이트(PolyEGMP-HAp)와 고분자 지지체를 다양한 무게비로 증류수에 분산시킨다. 상기 용액을 욕조 타입 초음파 분해 장치에서 처리하고, 1N NaOH 수용액을 이용하여 균일하게 분산된 용액의 pH를 5.8로 맞춘 후, EDC(1-ethyl-3-dimethylaminopropyl carbodiimide)를 반응용액에 첨가하여 48시간 동안 반응시키고, 지지체를 증류수로 반복하여 세척한다. 이후, 48시간 동안 동결건조하여 나노수산화아파타이트가 표면고정화된 유/무기 하이브리드 지지체(SI-Hybrid)를 얻는다.
본 발명에 따른 나노수산화아파타이트가 표면고정화된 유/무기 하이브리드 지지체의 표면과 원소 구조를 각각 SEM 및 XPS로 관찰한 결과, 나노수산화아파타이트가 고분자 지지체 표면에 성공적으로 고정화되었으며(도 2의 (c) 참조), 나노수산화아파타이트 단층형태에 의한 초미립-높이로 표면을 덮은 것을 확인하였다. 고분자 지지체 표면에 나노수산화아파타이트가 고정화된 후, 나노수산화아파타이트의 구성 원소(Ca와 P)가 XPS로 검출되었으며(도 2의 (f) 참조), 표면에 존재하는 Ca의 원소비율은 8.4%이다. 또한, 고분자 지지체 표면에 고정화된 나노수산화아파타이트 양을 열중량분석(TGA)으로 확인한 결과, 나노수산화아파타이트가 지지체 총 중량에 대해 1~50 중량%, 바람직하게는 6~24 중량%로 고분자 지지체 표면에 고정화됨을 확인하였다.
또한, 본 발명에 따른 나노수산화아파타이트가 표면고정화된 유/무기 하이브리드 지지체는 세포 부착 및 성장을 현저하게 증가시키고, 알칼린 포스파타아제 (ALP) 활성을 현저히 증가시켜 인간 지방유래 줄기세포의 골아세포로의 분화 및 골 아세포의 성장에 우수한 환경을 제공한다.
따라서, 본 발명에 따른 나노수산화아파타이트가 표면고정화된 유/무기 하이브리드 지지체의 제조방법은 세포친화적 표면을 갖는 다양한 형태 및 크기의 기능성 생체적합성 지지체 개발에 응용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
제조예 1 : 폴리(에틸렌글리콜 메타아크릴레이트 포스페이트 )로 표면개질된 나노수산화아파타이트( PolyEGMP - HAp )의 제조
1. 표면에 티올기가 도입된 나노수산화아파타이트( HAp - SH )의 제조
표면에 티올기가 도입된 나노수산화아파타이트는 수열합성법을 이용하여 제조하였다. 즉, 수산화칼슘(Ca(OH)2) 0.25M을 600mL의 증류수에 넣고 60℃에서 균일하게 하였다. 300mL의 증류수에 인산(H3PO4) 0.3M과 3-머캅토프로피온산 (HSCH2CH2CO2H) 0.047M을 동시에 넣고 상온에서 균일하게 혼합한 후, 이 혼합액을 수산화칼슘 수용액에 분당 1 mL씩 들어가도록 천천히 적가하였다. 인산과 3-머캅토프로피온산의 혼합용액을 모두 적가한 후, 0.1N NaOH 수용액으로 상기 반응액의 pH를 7로 조절하였다. 반응이 끝난 혼합물을 증류수와 원심분리기를 이용하여 2500 rpm의 속도로 20분간 5회 세척하였다. 이후, 48시간 동안 동결건조하여 표면에 티올기가 도입된 나노수산화아파타이트(HAp-SH)를 얻었다.
2. 수산화아파타이트 표면에 PolyEGMP 그라프팅 [ PolyEGMP - HAp ]
상기 1에서 제조한 표면에 티올기(SH)가 도입된 나노수산화아파타이트 (HAp-SH) 2.5g을 N,N-디메틸포름아미드(DMF) 50mL에 넣은 다음, 30분간 욕조 타입 초음파 분해 장치(bath-type ultrasonicator)에 넣고 분산시켰다. 균일하게 분산된 용액을 질소 가스를 이용하여 30분간 버블링하여 산소 가스를 제거하였다. 이 용액에, 에틸렌글리콜 메타아크릴레이트 포스페이트(EGMP) 1g과 개시제인 2,2'-아조비스이소부티로니트릴(2,2'-azobisisobutyronitrile, AIBN) 0.02g을 60℃에서 첨가하고 질소가스 분위기 하에 18시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 1M 수산화나트륨 수용액과 원심분리기를 이용하여 3000rpm의 속도로 20분간 5회 세척하였다. 이후, 48시간 동안 동결건조하여 폴리(에틸렌글리콜 메타아크릴레이트 포스페이트) (PolyEGMP)가 표면 그라프팅된 나노수산화아파타이트(PolyEGMP-HAp)를 얻었다.
제조예 2 : 다공성 키토산 지지체의 제조
키토산 수용액(3 중량%)은 2% 아세트산용액(10mL)을 사용하여 준비하였다. 키토산 용액을 테프론 원통 몰드(지름: 13㎜, 두께: 12㎜)에 넣은 후 24시간 동안 -20℃ 냉동고에서 동결시켰다. 동결된 용액을 48시간 동안 동결건조하였다. 세포 배양을 위하여 원형 타입의 키토산 지지체를 직경 12㎜, 두께 3㎜로 준비하였다. 키토산 지지체에 남아있는 아세트산을 중화시키기 위하여, 키토산 지지체를 24시간 동안 1N 수산화나트륨 용액에 담근 후 증류수로 세척하였다.
실시예 1 : 나노수산화아파타이트가 표면고정화된 다공성 키토산 지지체의 제조 [ SI - Hybrid ]
상기 제조예 1에서 제조한 표면개질된 나노수산화아파타이트 : 상기 제조예 2에서 제조한 다공성 키토산 지지체를 다양한 무게비(10:0, 7:3, 3:7)로 증류수 (2mL)에 분산시켰다. 상기 용액을 30분 동안 욕조 타입 초음파 분해 장치에서 처리하였고, 1N NaOH 수용액을 이용하여 균일하게 분산된 용액의 pH를 5.8로 맞춘 후, EDC(1-ethyl-3-dimethylaminopropyl carbodiimide)를 반응용액에 첨가하였다. 상기 반응용액을 48시간 동안 반응시킨 후, 지지체를 증류수로 반복하여 세척하였다. 이후, 48시간 동안 동결건조하여 나노수산화아파타이트가 표면고정화된 다공성 키토산 지지체(SI-Hybrid)를 얻었다.
본 발명에 따른 표면개질된 나노수산화아파타이트를 다공성 키토산 표면에 고정화시키는 방법을 도 1에 나타내었다.
비교예 1 : 벌크상에서 키토산과 나노수산화아파타이트가 복합화된 다공성 키토산 지지체의 제조 [ BM - Hybrid ]
3 중량% 키토산 수용액은 2% 초산용액(10mL)을 사용하여 준비하였다. 균일한 키토산 용액에 24 중량%(또는 6 중량%) 나노수산화아파타이트(0.095g)를 첨가하였다. 키토산/나노수산화아파타이트 수용액을 테프론 원통 몰드(지름: 13㎜, 두께: 12㎜)에 넣은 후 24시간 동안 -20℃ 냉동고에서 동결시켰다. 그 다음 3일 동안 동결건조하여 벌크 혼합된 다공성 키토산 지지체(BM-Hybrid)를 얻었다.
비교예 2 : 벌크상에서 키토산과 표면개질된 수산화아파타이트가 복합화된 다공성 키토산 지지체의 제조
상기 비교예 1에서 나노수산화아파타이트 대신 제조예 1에서 제조한 표면개질된 나노수산화아파타이트를 사용한 것을 제외하고는, 비교예 1과 동일한 방법으로 하여 벌크상에서 키토산과 표면개질된 수산화아파타이트가 복합화된 다공성 키토산 지지체를 제조하였다.
실험예 1 : 본 발명의 나노수산화아파타이트가 표면고정화된 다공성 키토산 지지체의 물성 측정
본 발명에 따른 나노수산화아파타이트가 표면고정화된 다공성 키토산 지지체의 표면과 원소 구조는 각각 주사전자 현미경(scanning electron microscopy; SEM)과 X-선 광전자 분광기(X-ray photoelectron spectroscopy, XPS)로 관찰하였으며, 다공성 지지체 표면에 고정화된 나노수산화아파타이트 양은 열중량분석 (Thermogravimetric analysis, TGA)으로 확인하였다.
본 발명에 따른 나노수산화아파타이트가 표면고정화된 다공성 키토산 지지체의 표면과 원소 구조를 주사전자 현미경(SEM) 및 X-선 광전자 분광기(XPS)로 관찰한 결과는 도 2에 나타내었다[SEM 결과 - (a) 키토산 지지체, (b) BM-Hybrid, (c) SI-Hybrid; XPS 결과 - (d) 키토산 지지체, (e) BM-Hybrid, (f) SI-Hybrid].
도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 나노수산화아파타이트가 표면고정 화된 다공성 키토산 지지체(SI-Hybrid)는 침상구조의 표면개질된 나노수산화아파타이트가 키토산 지지체 다공성 표면에 성공적으로 고정화되었으며(c), 나노수산화아파타이트 단층형태에 의한 초미립-높이로 표면을 덮은 것을 확인하였다. 키토산 표면에 나노수산화아파타이트가 고정화된 후, 나노수산화아파타이트의 구성 원소(Ca와 P)가 XPS로 검출되었으며(f), 표면에 존재하는 Ca의 원소비율은 8.4%로 측정되었다. 이에 비해, BM-Hyrid 지지체의 경우, 나노수산화아파타이트가 표면에 노출되지 않았으며 고분자 키토산에 덮여있는 현상을 확인하였고(b), 나노수산화아파타이트의 성분인 Ca 이온의 피크가 상대적으로 SI-Hybrid 지지체에 비해 작게 관찰되었으며, 표면에 존재하는 Ca의 원소비율은 0.8%로 낮게 측정되었다.
또한, 다공성 키토산 지지체 표면에 고정화된 나노수산화아파타이트 양은 키토산에 대한 표면개질된 나노수산화아파타이트의 feed 양에 의해서 손쉽게 조절할 수 있으며, 6~24 중량%의 나노수산화아파타이트가 다공성 키토산 지지체 표면에 고정화되었다.
실험예 2 : 본 발명의 나노수산화아파타이트가 표면고정화된 다공성 키토산 지지체 내의 세포증식 측정( MTT assay )
본 발명에 따른 나노수산화아파타이트가 표면고정화된 다공성 키토산 지지체 내의 세포증식을 측정하기 위하여 MTT 분석을 이용하였다. 즉, NIH3T3 섬유아세포 (5×105 cells/mL)를 포함하는 배양 배지를 상기 제조예 2, 실시예 1, 비교예 1 및 2에서 제조한 다공성 키토산 지지체에 로딩하고, 7일 동안 배양하였다 (n=3). MTT분석 전, 상기 다공성 키토산 지지체를 PBS(phosphate buffered saline) 수용액으로 3번 세척하였다. 20㎕의 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] 용액 (패놀 레드가 없는 RPMI-1640에 5 mg/mL MTT)과 500㎕의 DMEM(Dulbecco's modified Ealge's medium)을 각 지지체에 첨가하였으며, 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 형성된 포마잔(formazan)을 DMSO(500㎕)에 용해시킨 후, 96-웰 플레이트에 200㎕씩 넣었다. 각 웰의 흡광도는 570㎚에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader) (Spectra Max 250, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 측정하였다.
결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 세포 성장은 대조군 키토산 지지체(검은색 막대)보다 나노수산화아파타이트가 함유된 키토산 지지체에서 많은 성장을 보였으며, 점진적인 세포 성장이 배양 시간에 따라 증가됨을 관찰할 수 있었다. 비교예 2 및 1에서 제조한 벌크 혼합에 의해서 제조된 키토산 지지체 Ⅱ(녹색 막대)와 키토산 지지체 Ⅲ(빨간색 막대; BM-Hybrid)는 효과적으로 세포 성장을 위한 표면 친화력을 제공하지 못하였다. 이는 벌크 제조과정 특성상, 다공성 키토산 지지체 표면에 나노단위로 나노수산화아파타이트를 위치시키기 못하기 때문이다. 또한, 대조군 키토산 지지체 보다 나노수산화아파타이트가 표면에 부착된 키토산 지지체 Ⅳ(노란색 막대; SI-Hybrid)에서 세포 부착 및 성장이 현저하게 증가되는 것을 확인하였다. 배양 7일 후, 본 발명의 다공성 키토산 지지체 IV(SI-Hybrid)에서 비교예 2 및 1에 서 제조한 벌크 혼합에 의해서 제조된 키토산 지지체 Ⅱ(녹색 막대)와 키토산 지지체 Ⅲ(빨간색 막대; BM-Hybrid) 보다 100% 이상 세포가 증식되었음을 확인하였다. 표면에 그라프팅된 나노수산화아파타이트의 양이 6 중량%부터 24 중량%로 증가됨에 따라, 세포 부착 및 성장이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3 : 본 발명의 나노수산화아파타이트가 표면고정화된 다공성 키토산 지지체의 알칼린 포스파타아제( alkaline phosphatase ; ALP ) 활성 측정
본 발명에 따른 나노수산화아파타이트가 표면고정화된 다공성 키토산 지지체 내에서 인간 지방유래 줄기세포(human adipose-derived stem cell)의 골아세포 (osteoblast)로의 골분화 거동을 평가하기 위하여, 세포-지지체 구성체의 알칼린 포스파타아제(ALP) 활성을 측정하였다.
인간 지방유래 줄기세포가 배양된 지지체의 측정을 위하여 10% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 지지체를 고정화하였다. 상기 제조예 2, 실시예 1, 비교예 1 및 2에서 제조한 다공성 키토산 지지체를 PBS로 세척하였으며, 2분 동안 2 mL의 세포용해 완충용액(lysis buffer solution)(0.02% Triton X-100, Sigma)을 이용하여 분쇄하였다. 분쇄된 지지체는 15분 동안 14000 rpm에서 원심분리한 후, 상등액을 1주와 5주 후에 채취하였다. 효소 반응은 1M 트리스-염화수소(Tris-HCl, Sigma, pH 9.0) 100㎕, 5mM 염화마그네슘(MgCl2) 200㎕ 및 5mM 파라-니트로페닐-2-포스페이트(para-nitrophenyl-2-phosphate; PNPP, Sigma) 20㎕ 용액이 포함된 0.02% 세포용해 완충용액 54㎕와 샘플용액 6㎕를 섞은 후 배열하였다. 상기 용액을 37℃에서 30분 동안 방치하였으며, 1N 수산화나트륨 용액을 이용하여 반응을 중지시켰다. 알칼린 포스파타아제 활성도를 위해 파라-니트로페놀의 농도를 마이크로플레이트 리더를 이용하여 405㎚에서 용액의 흡광도를 측정하였다. 결과는 유니트/분/밀리그람 단백질/지지체 (unit/min/mg protein)로 표현하였다.
결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, SI-Hybrid 지지체에서 인간 지방유래 줄기세포는 5주 배양기간 동안 눈에 띄게 분화되었으며, SI-Hybrid 지지체에서 분화된 골형성 거동은 대조군 키토산 지지체 및 BM-Hybrid 지지체에서 분화된 골형성 거동보다 현저하게 나타났다. 배양 1주 후, SI-Hybrid 지지체의 알칼린 포스파타아제 활성은 키토산 지지체 및 BM-Hybrid 지지체보다 높은 것을 확인하였다(*P<0.05). 5주 후, SI-Hybrid 지지체의 알카라인 포스파타아제 활성은 BM-Hybrid 지지체보다 매우 높은 것을 확인하였다(**P<0.01).
본 발명에 따른 나노수산화아파타이트가 표면고정화된 유/무기 하이브리드 지지체는 세포 부착 및 성장을 현저하게 증가시키고, 알칼린 포스파타아제(ALP) 활성을 현저히 증가시켜 인간 지방유래 줄기세포의 골아세포로의 분화 및 골아세포의 성장에 우수한 환경을 제공한다. 따라서, 본 발명에 따른 나노수산화아파타이트가 표면고정화된 유/무기 하이브리드 지지체의 제조방법은 세포친화적 표면을 갖는 다양한 형태 및 크기의 기능성 생체적합성 지지체 개발에 응용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 표면개질된 나노수산화아파타이트를 다공성 키토산 지지체 표면에 고정화시키는 방법을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 나노수산화아파타이트가 표면고정화된 다공성 키토산 지지체의 표면과 원소 구조를 주사전자 현미경(SEM) 및 X-선 광전자 분광기(XPS)로 관찰한 도이다 [SEM 결과 - (a) 키토산 지지체, (b) BM-Hybrid, (c) SI-Hybrid; XPS 결과 - (d) 키토산 지지체, (e) BM-Hybrid, (f) SI-Hybrid].
도 3은 본 발명에 따른 나노수산화아파타이트가 표면고정화된 다공성 키토산 지지체 내의 세포증식을 MTT 분석을 통해 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명에 따른 나노수산화아파타이트가 표면고정화된 다공성 키토산 지지체의 알칼린 포스파타아제(ALP) 활성을 나타낸 도이다.

Claims (11)

  1. 나노수산화아파타이트가 고분자 지지체 표면에 고정화된 유/무기 하이브리드 지지체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 나노수산화아파타이트는 나노수산화아파타이트 표면에 포스포닉산(phosphonic acid) 작용기를 갖는 폴리(에틸렌글리콜 메타아크릴레이트 포스페이트)[PolyEGMP] 또는 카복실산(carboxylic acid) 작용기를 갖는 고분자를 그라프팅하여 표면개질한 것을 특징으로 하는 유/무기 하이브리드 지지체.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 카복실산 작용기를 갖는 고분자는 폴리(아크릴산) [poly(acrylic acid)], 폴리메타아크릴산[polymethacrylic acid], 폴리(아스파르트산)[poly(aspartic acid)], 폴리(글루탐산)[poly(glutamic acid)], 알긴산(alginic acid) 및 히알루론산(hyaluronic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 유/무기 하이브리드 지지체.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 나노수산화아파타이트의 크기는 5~300㎚인 것을 특징으로 하는 유/무기 하이브리드 지지체.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 나노수산화아파타이트의 고정화된 양은 지지체 총 중량에 대해 1~50 중량%인 것을 특징으로 하는 유/무기 하이브리드 지지체.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 고분자 지지체는 폴리(L-락타이드)[poly(L-lactide)], 폴리(D-락타이드)[poly(D-lactide)], 폴리(DL-락타이드)[poly(DL-lactide)], 폴리(글리콜릭-코-락트산)[poly(glycolic-co-lactic acid)], 폴리(ε-카프로락톤)[poly(ε-caprolactone)], 폴리카보네이트[polycarbonate], 키토산, 알기네이트, 히알루론산, 덱스트란, 전분, 메틸셀룰로오스, 젤라틴, 콜라겐, 폴리안하이드라이드[polyanhydride], 폴리(오르토 에스터)[poly(ortho esters)] 및 폴리포스파젠[polyphosphazene]으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 유/무기 하이브리드 지지체.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 고분자 지지체는 키토산인 것을 특징으로 하는 유/무기 하이브리드 지지체.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 고분자 지지체의 타입은 치밀형, 다공성 블록형, 나노/마이크로 파이버형, 및 마이크로스피어형으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 유/무기 하이브리드 지지체.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 고분자 지지체의 타입은 다공성 블록형인 것을 특징으로 하는 유/무기 하이브리드 지지체.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 고분자 지지체의 기공 크기는 50~500㎛인 것을 특징으로 하는 유/무기 하이브리드 지지체.
  11. 포스포닉산 작용기를 갖는 폴리(에틸렌글리콜 메타아크릴레이트 포스페이트) [poly(ethylene glycol methacrylate phosphate); PolyEGMP] 또는 카복실산 작용기를 갖는 고분자가 표면에 그라프팅된 나노수산화아파타이트의 표면 산성기와 고분자 지지체 표면의 일차 아민을 EDC(1-ethyl-3-dimethylaminopropyl carbodiimide) 존재 하에 반응시켜 나노수산화아파타이트를 고분자 지지체 표면에 고정화시키는 것을 특징으로 하는, 청구항 1의 유/무기 하이브리드 지지체의 제조방법.
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