KR20090045599A

KR20090045599A - 혈액내 일인산 갈락토오스를 검출하는 방법

Info

Publication number: KR20090045599A
Application number: KR1020070111503A
Authority: KR
Inventors: 홍선표; 정지선
Original assignee: 주식회사 에이치브이엘에스
Priority date: 2007-11-02
Filing date: 2007-11-02
Publication date: 2009-05-08

Abstract

본 발명은 고성능 음이온 교환 크로마토그래피와 펄스식 전기 화학 검출기를 이용하여 일인산갈락토오스(Galactose 1-phosphate)의 정량을 통해 갈락토오스혈증을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 갈락토오스혈증 진단 방법은 기존의 방법에 비해 유도체화 과정 없이 빠르고 간단한 전처리가 가능하며, 분석 시간 또한 매우 짧다. 갈락토오스혈증의 진단 마커중 하나인 일인산갈락토오스의 분석을 통해, 갈락토오스 혈증의 빠른 스크리닝을 할 수 있다. 이 방법은 선택적 스크리닝과 갈락토오스혈증의 차후 식이치료의 모니터링에 있어서 뛰어난 장점을 지닌다.

갈락토오스혈증, 고성능 음이온 교환 크로마토그래피, 펄스식 전기 화학 검출기, 일인산갈락토오스

Description

혈액내 일인산 갈락토오스를 검출하는 방법{Method for detection of blood Galactose 1-phosphate}

본 발명은 고성능 음이온 교환 크로마토그래피와 펄스식 전기화학 검출기를 이용하여 갈락토오스혈증을 진단하는 방법에 관한 것이다.

갈락토오스혈증은 아주 드문 유전질환으로서 인체 내의 중요한 효소 대사의 결핍으로 체내에 갈락토오스(유당) 와 그 대사산물이 축적되어 생후 즉시 발육부전, 구토, 황달, 설사증상 등이 나타나고 치료하지 않으면 백내장, 정신지체 등을 보이다가 결국은 간경변으로 사망하게 되는 질환이다. 갈락토오스 혈증은 각 단계의 갈락토오스 대사과정에 관여하는 효소에 따라, 제 1형 갈락토오스혈증(galactose-1-phosphate uridyltransferase; GALT 결핍증), 제 2형 갈락토오스혈증(galactokinase 결핍증) 및 제 3형 갈락토오스혈증(uridine diphosphate galactose-4-epimerase 결핍증)으로 구분된다. 제 1형 갈락토오스혈증은 갈락토오스를 글루코오스로 분해하는 효소인 GALT의 결핍으로 인해 체내에 갈락토오스와 그의 대사산물인 일인산갈락토오스(Gal-1-P)가 축적되며, 제 2형 갈락토오스혈증은 갈락토키나제(galactokinase)의 결합으로 체내에 갈락토오스가 축적된다. 이로 인 하여 신장, 간, 뇌의 선조직 세포에 이상이 생기게 되고, 일반 우유(분유와 모유)나 갈락토오스가 함유된 모든 음식들이 체내에서 독성으로 작용한다.

이러한 갈락토오스혈증 진단을 위하여, 효소의 결핍을 측정하는 뷰틀러(Beutler) 법, 생물학적 억제 요법에 의한 체내 갈락토오스와 대사물을 반정량하는 파이젠(Paigen) 법(biological inhibition assay) 및 효소비색법(enzymatic colorimetric methods)이 많이 사용되고 있다. 우수한 재현성, 정확성, 정밀성을 획득하기 위해, 질량분석기가 일인산갈락토오스의 정량에 사용되고 있는데, 최근에 연속질량 분석법(Tandem Mass Spectrometry : MS/MS)를 이용하여 일인산갈락토오스를 정량한 논문이 발표되었다. 하지만, 이 방법 역시 긴 시간의 유도체화 반응이 필요하며, 고가의 기자재를 써야 한다는 단점이 있다. 유도체화 없이 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에서 유리딜이인산 갈락토오스(uridyldiphosphate (UDP)-galactose)를 정량 한 몇 개의 논문들이 있으나, 혈액내 일인산갈락토오스의 정량에 적용하기 힘들 정도의 낮은 감도가 문제가 된다.

게다가 혈액내 일인산갈락토오스의 정량에 있어 가장 중요한 문제점은 일인산글루코오스(Glucose 1-P)와의 분리이다. 일인산글루코오스는 갈락토오스 대사과정의 마지막 단계에 존재하는 성분으로 혈액 내에 존재하여 병을 유발하는 일인산갈락토오스와는 다르다. 하지만, 일인산글루코오스는 일인산갈락토오스와 에피머(epimer)의 관계로 분자량과 구조가 동일할 뿐더러 그 특성도 아주 유사하다. 그런 이유로, 현재까지의 진단법이나 분석법에서 일인산갈락토오스와 일인산글루코오스가 완전 분리된 보고는 없다.

이에, 본 발명자들은 고성능 음이온 교환 크로마토그래피와 펄스식 전기화학 검출기를 사용하여 유도체화 과정을 생략하여 간단한 전처리를 수행하며, 일인산글루코오스와 일인산갈락토오스의 분리를 통한 우수한 감도를 지닌 일인산갈락토오스의 분석법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 혈액내 일인산갈락토오스 정량하여 갈락토오스혈증을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 자연에서 혹은 혈액 내에서의 탄수화물 정량에 매우 효과적인 고성능 음이온 교환 크로마토그래피와 펄스식 전기화학 검출기의 조합을 제공한다.

상기 고성능 음이온 교환 크로마토그래피 분석방법은, 이동상으로는 수산화나트륨 용액 및 탄산나트륨 용액을 사용하고, 등용매 용리법(isocratic elution method)으로 일인산갈락토오스의 정량법을 제공한다.

또한, 본 발명은 혈액내 갈락토오스를 직접 분석하는 대신, 여지(Guthrie Paper)에 묻힌 혈액을 이용한 새로운 갈락토오스혈증의 진단 방법을 제공한다.

본 발명에 따른, 고성능 음이온 교환 크로마토그래피와 펄스식 전기화학 검출기를 이용한 갈락토오스의 분석방법은 유도체화 과정을 생략하여 전처리가 빠르 고 간단하며, 분석 시간이 짧으며, 일인산글루코오스와 일인산갈락토오스의 분리를 통해 감도가 우수하여 매우 유용하다.

또한 여지에 묻힌 혈액을 이용한 갈락토오스혈증 진단 방법은 샘플들의 수집, 취급, 이동, 저장에 매우 편리한 장점을 지닌다.

본 발명의 갈락토오스혈증 진단 방법은 혈액내 일인산갈락토오스를 고성능 음이온 교환 크로마토그래피와 펄스식 전기화학 검출기를 이용하여 정량하는 방법으로서, 여지에 묻힌 후 건조시킨 여지에서 혈액을 추출하여 제단백하는 제 1단계, 단백질이 제거된 검체를 수산화나트륨 용액 및 탄산나트륨 용액을 이동상으로 하여 등용매 용리법으로 분석 컬럼을 통과시키는 제 2단계 및 펄스식 전기 화학 검출기를 사용하여 혈액내 일인산갈락토오스를 검출하는 제 3단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 갈락토오스혈증 진단 방법의 보다 상세한 설명은 다음과 같다.

1. 제 1단계: 샘플 처리 단계

검체인 혈액을 여지에 묻힌 후, 건조시킨 여지를 지름이 약 3.2 mm의 조각을 샘플로 취한다(2.00 ± 0.0005 mg, n=20). 내부표준물질로서 600 μM 6-인산 수크로오스(Sucrose 6-phosphate) 5 μL를 첨가한 후, 각각의 시료에 95 μL의 1%(w/v) TCA(trichloroacetic acid)를 추출 용매로 첨가하여 밀봉하였다. 추출은 진탕기(shaker)에서 30분간 행하였다. 제단백을 위해 10 μL의 10%(w/v) TCA를 첨가한 후, 다시 밀봉하여 12,000 rpm에서 10분간 원심분리 후, 상징액을 취하여 2 M 수산 화나트륨 용액 10 μL을 첨가하여 중화시킨 후, MFS 13 일회용 실린지 필터로 여과하였다.

2. 제 2단계: 분석 단계

40 mM 수산화나트륨용액에 40 mM에 해당하는 탄산나트륨을 첨가한 것을 이동상으로 사용하여, 등용매 용리 조건으로 1 mL/min의 유속으로 분석하였다.

컬럼은 음이온 교환 컬럼 4×250 mm Carbopac PA1과 4×50 mm Carbopac PA1 Guard(CA, USA)를 사용하였다.

3. 제 3단계: 검출 단계

펄스식 전기 화학 검출기는 활동전극으로 Au-Flow cell, 스테인리스 스틸 보조 전극, 그리고 Ag/AgCl 표준 전극을 장착한 Dionex의 4000i모델을 사용하였다. 작동전위는 E1= ＋0.05 V; t1= 0.4 s, E2= ＋0.75 V; t2= 0.3 s, E3= －0.20 V; t3= 0.6 s로, 검출기의 감도는 1 μA full-scale이며 분석 결과는 (주)도남인스트루먼트에서 제공받은 Dschrom 프로그램에 의해 처리되었다.

본 발명의 실시 예에 사용된 시약은 다음과 같다. 일인산갈락토오스, 일인산글루코오스, 50% 수산화나트륨(NaOH), 탄산나트륨(Na₂CO₃), TCA(trichloroacetic acid), 6-인산 수크로오스(Sucrose 6-phosphate)는 Sigma사 (St. Louis, MO)에서 구입하였다. 다른 시약과 시액들은 분석등급이상의 인증된 것을 사용하였다. 표준 시료의 준비를 위한, 샘플 용액과 기기 이동상은 모두 실험실의 증류장치와 18 MΩ 정제 장치 Automatic aquarius AW-1001 (Top Trading Co., Seoul, Korea)를 사용하 였다. 용액 여과는 밀리포어(Millipore) 멤브레인 필터(type HA, pore size 0.45 μm)를 사용하여 행하였다. 모든 샘플들은 MFS 13 일회용 실린지 필터를 사용하여 기기 주입 전에 여과하였다.

본 발명의 실시예를 위한 정도 관리용 표준 혈액시료의 조제법는 다음과 같다. 일인산갈락토오스가 포함되지 않은 정상인의 혈액에 3, 5, 10, 20, 50 mg/dL이 되도록 일인산갈락토오스 표준품을 첨가한다. 고르게 잘 섞은 후, 50 μL를 취하여 Bio-Rad Diagnostics Group(CA, USA)에서 구입한 여지(Guthrie Paper)에 흡수시킨 후, 음지에서 실온 건조시킨 것을 표준 혈액시료로 하였다.

본 발명의 실시예를 위한 실제 혈액시료는 갈락토오스혈증 환자의 대조군으로서 정상의 한국인 신생아 샘플 190개를 일선의 병원에서 제공받았다. 효소비색법을 통하여 갈락토오스혈증으로 진단받은 13개의 양성 샘플은 서울의과학연구소 유전성대사질환 분석팀과 사우디아라비아의 king faisal specialist hospital & research center에서 제공받았다. 분석법의 검증을 위해 따로 7개의 샘플은 독일 뮌헨대학으로부터 제공받았다. 모든 혈액 샘플은 여지(Guthrie Paper)에 묻혀있으며, 분석 전까지 -20˚C 에 저장되었다.

실시예

실시예 1

검량선은 표준 혈액 샘플을 사용하여, 3, 5, 10, 20 그리고 50 mg/dL의 일인산갈락토오스 농도에 대해 6번에 걸쳐 작성되었다. 검량선은 일인산갈락토오스 농도와 그에 대한 피크 면적 비율(내부표준물질 피크 면적과 일인산갈락토오스 피크 면적의 비율)로 도출하였으며, 측정 범위에서 뛰어난 직선성을 보였다. 평균 기울기, 절편, 직선계수는 각각 0.1075, -0.0533 그리고 0.9999를 나타냈다(도 1). 검체의 정량은 검출 피크 면적을 검량선에 대입하여 일인산갈락토오스 함량을 구했다. 표준 시료의 검량선은 검체의 분석과 같은 날 행하였다. 일인산갈락토오스의 검출한계(LOD)와 정량한계(LOQ)는 각각 30 μg/dL 과 100 μg/dL이었으며, 신호대잡음비(signal to noise ratio)는 각각 3 과 10이다.

정밀성과 정확성, 회수율의 측정을 하였다. 일중(Intra-day) 분석은 표준 혈액 시료를 사용하여 각각 9개의 샘플에 대해 행하였다. 일간(Inter-day) 분석에서는 위의 표준혈액 샘플 (5, 10, 20, 50 mg/dL)에 대해 9일에 걸쳐 같은 실험을 행하였다. 표준 혈액 샘플에서의 일중 분석 결과는 표 1에 나타내었다. 5 mg/dL 의 표준 샘플에서의 일중 분석의 회수율은 102.01%에서 104.98%의 범위를 보이며, 평균 회수율은 103.78%이다. 20 mg/dL의 샘플에서는 95.21% 에서 100.48%의 범위이며, 평균 회수율은 97.55%이다.

[표 1]

각각의 샘플에서의 일중 표준편차(standard deviation: SD) 및 상대표준편차(relative standard deviation: RSD)는 5 mg/dL에서 0.06, 1.19%이고, 20 mg/dL에서 0.51, 2.60% 이다.

표준 혈액 샘플(3, 5, 10, 20, 50 mg/dL)에서의 일간(inter-day) 분석 결과는 표 2에 나타내었다. 일인산갈락토오스 3 mg/dL을 포함하는 표준시료에서의 회수율의 범위는 98.67% 에서 105.33% 이며, 평균 회수율은 102.19%이었고, 50 mg/dL 의 표준샘플에 대한 회수율 범위는 99.82%에서 101.34%, 평균 회수율은 100.40%이다. 각각에 대한 일간 정밀도는 3 mg/dL에서 2.09%, 50 mg/dL 에서 0.49%을 나타냈다.

[표 2]

실시예 2

상기의 분석 조건이 혈액내 존재하는 수많은 인산화당과 유리 아미노산의 방해없이 일인산갈락토오스를 정량할 수 있는지 평가하기 위해, (A)인산화당들의 혼합 시료와 (C)유리 아미노산 혼합물 시료를 분석하였다. 또한 갈락토오스혈증의 또다른 진단마커인 갈락토오스와의 분리를 확인하기 위해, (B) 갈락토오스와 일인산갈락토오스를 혼합한 시료를 분석하였다. 각각의 크로마토그램은 도 2에 도시하였다. 도 2에서 보는 바와 같이, 깨끗한 베이스라인을 얻었으며, 일인산글루코오스를 포함하여 다른 인산화당 및 갈락토오스 그리고 유리 아미노산 혼합물과의 방해가 없어, 오진을 유발할 수 있는 물질들과의 완전한 분리가 가능함을 확인할 수 있다.

실시예 3

본 발명의 갈락토오스혈증 진단방법을 사용하여 (A) 표준 혈액 샘플(10 mg/dL), (B) 대조군으로서 정상인의 혈액 샘플 및 (C) 갈락토오스혈증 환자의 혈액샘플을 분석하였으며, 도 3에 각각의 크로마토그램이 도시되어있다. 도 3의 (B)에서 도시한 정상 혈액 샘플의 경우 일인산갈락토오스의 피크가 거의 검출되지 않았다. 하지만 (C)의 일인산갈락토오스 양성 샘플에서는 정상과 비교하여 일인산갈락토오스의 수치가 눈에 띄게 높은 결과를 나타내었으며, 정확한 수치를 통해 그 정도를 가늠할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 4

새로운 분석법의 유의성을 검토하기 위해, 본 발명에 따라 분석된 결과와 기존의 효소비색법을 통해 분석된 혈액 시료에 대한 결과를 비교하였다. 7개의 저농도 시료에 대해 비교한 결과 도 4에 나타나는 것처럼 80%의 유사성을 보이고 있다.

실시예 5

정상 범위의 산출을 위하여, 생후 7일 이내의 한국인 신생아 190명의 혈액 여지를 분석하였다. 분석 결과 정상샘플에서의 일인산갈락토오스 농도는 10 mg/dL이하에 분포하였다. 또한 본 발명의 갈락토오스혈증 진단법을 실제 갈락토즈혈증(GALT deficiency)으로 진단된 13명의 신생아 환자 시료에 대하여 적용하여 분석하였다(표 3).

[표 3]

표 3에서 보는 바와 같이, 갈락토오스혈증 환자의 일인산갈락토오스 농도의 범위는 13.02에서 62.77 mg/dL사이에 분포한다. 현재 한국 신생아의 1차 진단에서의 일인산갈락토오스에 대한 컷-오프(cut-off) 수치는 10 mg/dL이상으로 규정하고 있다. 도 5에 정상 혈액 샘플군과 갈락토오스혈증 환자의 혈액 샘플의 분석 결과를 분포도를 도시하였다. 도 5에서 보는 바와 같이, 정상 샘플군과 비교하였을 때, 갈락토오스혈증 환자의 혈액 샘플에서 매우 높은 농도의 일인산갈락토오스가 검출되는 것을 확인 할 수 있었다. 본 발명의 갈락토오스혈증 진단법이 실용 의학적 측면에의 적용에 있어 매우 유용함을 알 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 갈락토오스혈증 진단 방법은 유도체화 과정을 생략하여 전처리가 빠르고 간단하며, 분석 시간이 짧아 갈락토오스 혈증의 빠른 스크리닝에 매우 유용하다. 또한 일인산글로코오스와 일인산갈락토오스의 분리가 가능해짐에 따라 갈락토오스혈증의 오진의 위험을 줄였다. 본 발명의 갈락토오스혈증 진단방법은 선택적 스크리닝과 갈락토오스혈증의 차후 식이치료의 모니터링에 있어서 뛰어난 장점을 갖는다.

도 1은 본 발명의 갈락토오스혈증 진단방법으로 표준 혈액 샘플을 사용하여, 3, 5, 10, 20 그리고 50 mg/dL의 일인산갈락토오스 농도와 그에 대한 피크 면적 비율로 도출한 검량선을 도시한 도면이다.

도 2는 본 발명의 갈락토오스혈증 진단방법으로 (A)인산화당들의 혼합 시료, (B) 갈락토오스와 일인산갈락토오스의 혼합 시료 및 (C)유리 아미노산 혼합물 시료를 분석한 결과이다(1; 일인산갈락토오스 , 2; 일인산글루코오스, 3; 6-인산 수크로오스, 4; 6-인산 글루코오스, 5; 6-인산만노오스, 6; 5-인산리보오스, 7; 갈락토오스, 8; 유리 아미노산 혼합물).

도 3은 본 발명의 갈락토오스혈증 진단방법으로 (A) 표준 혈액 샘플(10 mg/dL), (B) 대조군으로서 정상인의 혈액 샘플 및 (C) 갈락토오스혈증 환자의 혈액샘플을 분석한 결과이다. (I.S; 6-인산 수크로오스, 1; 일인산 갈락토오스)

도 4는 본 발명에 따라 분석된 결과와 기존의 효소비색법을 통해 분석된 혈액 시료에 대한 비교 결과를 도시한 도면이다.

도 5는 본 발명에 따른 갈락토오스혈증 진단방법으로 정상 혈액 샘플군과 갈락토오스혈증 환자의 혈액 샘플을 분석한 결과의 분포도를 도시한 도면이다.

Claims

혈액내 갈락토오스를 고성능 음이온교환 크로마토그래피와 펄스식 전기화학 검출기를 이용하여 진단하는 방법으로서,

(a) 혈액샘플로부터 단백질을 제거하는 단계;

(b) 단백질이 제거된 검체를 수산화나트륨 용액과 탄산나트륨의 혼합 용액을 이동상으로 하여 등용매 용리법으로 분석 컬럼을 통과시키는 단계; 및

(c) 펄스식 전기 화학 검출기를 사용하여 혈액내 일인산갈락토오스를 검출하는 단계를 포함하는 갈락토오스혈증의 진단 방법.
제 1항에 있어서, 상기 이동상은 40 mM 수산화나트륨 용액에 40 mM에 해당하는 탄산나트륨을 첨가한 혼합용액임을 특징으로 하는 갈락토오스혈증의 진단 방법.
제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 이동상의 흐름속도가 1 mL/min인 것을 특징으로 하는 갈락토오스혈증의 진단 방법.
고성능 음이온교환 크로마토그래피를 이용하여 일인산갈락토오스를 함유하는 시료로부터 수산화나트륨 용액과 탄산나트륨의 혼합 용액을 이동상으로 하여 등용매 용리법으로 일인산갈락토오스를 분리하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 이동상은 40 mM 수산화나트륨 용액에 40 mM에 해당하는 탄산나트륨을 첨가한 혼합용액임을 특징으로 하는 일인산갈락토오스를 함유하는 샘플로부터 일인산갈락토오스를 분리하는 방법.
제 4항 또는 5항에 있어서, 상기 이동상의 흐름속도가 1 mL/min인 것을 특징으로 하는 일인산갈락토오스를 함유하는 샘플로부터 일인산갈락토오스를 분리하는 방법.