KR20090039974A - ｎｅｏ５，ｎｅｏ６ 및 ｎｅｏ７ 유전자를 함유하는재조합벡터 및 이를 이용한 ２―데옥시스트렙타민의제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 neo5, neo6 및 neo7 유전자를 함유하는 재조합벡터 및 이를 이용한 2-데옥시스트렙타민의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 2-데옥시스트렙타민 생산에 관여하는 유전자인 neo5, neo6 및 neo7 유전자를 함유하는 재조합벡터가 도입된 형질전환체를 이용하여 2-데옥시스트렙타민을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, neo7, neo6 및 neo5 유전자를 포함하는 재조합벡터를 아미노글리코시드-결핍 균주에 도입한 형질전환체를 이용하여 DOS를 대량생산할 수 있다.

아미노글리코시드, 2-데옥시스트렙타민, 네오마이신

Description

ｎｅｏ５，ｎｅｏ６ 및 ｎｅｏ７ 유전자를 함유하는 재조합벡터 및 이를 이용한 ２―데옥시스트렙타민의 제조방법{Recombinant Vector Containing neo5, neo6 and neo7 Genes and Method for Producing 2-deoxystreptamine Using the Same}

본 발명은 neo5, neo6 및 neo7 유전자를 함유하는 재조합벡터 및 이를 이용한 2-데옥시스트렙타민의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 2-데옥시스트렙타민 생산과 관련된 유전자인 neo5, neo6 및 neo7 유전자를 함유하는 재조합벡터가 도입된 형질전환체를 이용하여 2-데옥시스트렙타민을 제조하는 방법에 관한 것이다.

아미노글리코시드-아미노사이클리톨스(aminoglycoside-aminocyclitolis, AmAcs)는 그람-양성 및 그람 음성 박테리아에 대한 항생물질 중 하나로서, 인체 면역 결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV)에 대해 활성을 나타내며, 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 및 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.)에 의해 생산된다 (Litovchick A. et al ., Biochemistry, 40:15612, 2001; Tok J.B. et al ., Biorg . Med . Chem . Lett., 11:1127, 2001; Li Y. et al ., Chem . Biol., 12:665, 2005).

일반적으로, AmAcs는 글리코시드 결합에 의해 육탄당 아글리콘(hexose aglycon)에 결합된 둘 이상의 아미노당으로 구성된 무색의 화합물로서, 스트렙타민(streptamine)-함유 AmAcs와 2-데옥시스트렙타민(2-deoxystreptamine, DOS)-함유 AmAcs로 나누어진다.

2-데옥시스트렙타민(DOS)은 아미노글리코시드의 백본 형성시 필요한 아글리콘으로서, D-글루코오스로부터 유도되는 것으로 보고되고 있으며(Rinehart, K.L. et al ., J. Am . Chem . Soc. 96:2263, 1974), 네오마이신, 리보스타마이신, 부티로신, 젠타미신, 카나마이신 및 토브라마이신 등을 이용하여 DOS-함유 아미노글리코시드의 생합성 연구가 진행되고 있다 (Kharel, M.K. et al ., Arch . Biochem . Biophys., 429:204, 2004; Kubo, F. et al ., J. Antibiot., 52:81, 1999; Kubo, F. et al ., J. Antibiot., 58:373, 2005a; Kubo, F. et al ., J. Antibiot., 58:766, 2005b; Huang, F. et al ., Org . Biomol . Chem., 3:1410, 2005; Li, Y. et al ., Chem. Biol., 12:665, 2005; Subba, B. et al ., Mol . Cells, 20:90, 2005).

또한, 네오마이신 생산 균주인 스트렙토마이신 프라디에(Streptomyces fradiae)에서 DOS 생합성과 관련된 유전자에 대해 보고되고 있고(Kubo, F. et al ., J. Antibiot., 58:766, 2005b), 네오마이신 생합성 경로에서 D-글루코오스-6-인산염(D-glucose-6-phosphate, G6P)은 2-데옥시-스킬로-이노소스 합성효소(2-deoxy-scyllo-inosose synthetase, DOIS)를 코딩하는 neo7 , 2-데옥시-스킬로-이노소스 아 미노전이효소(2-deoxy-scyllo-inosose aminotransferase, GIA)를 코딩하는 neo6 및 탈수소효소(dehydrogenase)를 코딩하는 neo5 유전자에 의해 DOS로 전환되는 것으로 알려져 있다 (도 1, Huang, F. et al ., Org . Biomol . Chem., 3:1410, 2005; Llewellyn, N.M. et al ., Nat . Prod . Rep., 23:864, 2006).

그러나, in vivo 상에서 생합성 유전자를 이용하여 DOS의 이종 산물을 증명한 바가 없고, DOS 링의 다양한 대체물을 부착함으로써 화학적 변형을 하는 방법도 제한적이다 (Sztaricskai, F. Acta . Pharm . Hung., 71:89, 2001).

이에, 본 발명자들은 DOS를 제조하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, DOS 생합성에 작용하는 neo7, neo6 및 neo5 유전자를 포함하는 재조합벡터를 아미노글리코시드-결핍 균주인 스트렙토마이세스 베네주엘레 YJ003(Streptomyces venezuelae YJ003)에 도입하여 배양한 경우 DOS를 경제적으로 대량생산할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 주된 목적은 neo5, neo6 및 neo7 유전자를 함유하는 재조합벡터를 이용하여 2-데옥시스트렙타민(DOS)을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 neo5, neo6 및 neo7 유전자를 함유하는 재조합벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 2-데옥시스트렙타민(2-deoxystreptamine, DOS)의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 네오마이신 생산 균주인 스트렙토마이신 프라디에(Streptomyces fradiae)의 네오마이신 유전자 클러스터에 위치한 neo5, neo6 및 neo7 유전자를 함유하는 재조합벡터를 아미노글리코시드-결핍 균주에 도입할 경우 2-데옥시스트렙타민을 대량생산할 수 있다.

본 발명은 일 관점에서, neo5, neo6 및 neo7 유전자를 함유하는 재조합벡터 에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 neo5, neo6 및 neo7은 각각 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 5의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 2-데옥시스트렙타민(2-deoxystreptamine, DOS)의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 미생물은 아미노글리코시드-결핍 균주인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 아미노글리코시드-결핍 균주는 스트렙토마이세스 베네주엘레 YJ003(Streptomyces venezuelae YJ003)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 사용한 neo7, neo6 및 neo5 유전자는 각각 2-데옥시-스킬로-이노소스 합성효소(2-deoxy-scyllo-inosose synthetase, DOIS), 2-데옥시-스킬로-이노소스 아미노전이효소(2-deoxy-scyllo-inosose aminotransferase, GIA) 및 탈수소효소(dehydrogenase)를 코딩하고, S. fradiae의 네오마이신 유전자 클러스터에 위치하고 있으며, DOS 합성에 관여하는 것으로 알려져 있다.

그러나, 현재 미생물을 이용하여 DOS를 생산할 수 있는 방법이 개발되지 않았고, DOS를 생산하기 위해서는 이미 생산된 아미노글리코시드를 화학적으로 분해하여 수득하는 방법이 유일한 실정이다.

본 발명에서는 DOS를 생산하는 균주로서 아미노글리코시드-결핍 균주를 사용하였는바, 데옥시스트렙타민(deoxystreptamine)이 생산되면 아미노글리코시드 유도체로 전환되므로, 데옥시스트렙타민을 생산하기 위해 아미노글리코시드-결핍 균주 를 사용하였다. 또한, 아미노글리코시드-결핍 균주로서 스트렙토마이세스 베네주엘레 YJ003를 사용하였는바, 상기 균주는 항생제 생산 유전자가 제거된 변형 균주로서, 기존의 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)에 비하여 성장 속도가 약 36시간으로 빠르고, 유전자 조작이 월등히 쉬우므로 상기 균주를 형질전환을 위한 미생물로 사용하였다.

본 발명의 일 실시예에서는 neo5 및 neo6 유전자를 클로닝하기 위하여, 스트렙토마이세스 프라디애(Streptomyces fradiae)를 주형으로 하여 PCR법에 의해 neo5 및 neo6을 증폭하였다. 상기 증폭된 PCR 산물을 정제한 후, 제한효소 BamHⅠ 및 HindⅢ로 절단하고, 상기와 동일한 제한효소 BamHⅠ 및 HindⅢ로 절단한 ermE 프로모터를 포함하는 스트렙토마이세스 발현 벡터인 pIBR25 벡터에 연결하여 재조합벡터 pNK101을 제작하였다.

또한, neo7 유전자를 클로닝하기 위하여, S. fradiae를 주형으로 하여 PCR법에 의해 neo7을 증폭하였다. 상기 증폭된 PCR 산물을 정제한 후, 제한효소 XbaⅠ 및 HindⅢ로 절단하고, 상기에서 제작한 재조합벡터 pNK101을 동일한 제한효소 XbaⅠ 및 HindⅢ로 절단하여 연결함으로써 재조합벡터 pNDOS를 제작하였다.

상기에서 제작된 재조합벡터 pNDOS를 스트렙토마이세스 베네주엘레 YJ003(Streptomyces venezuelae YJ003)에 도입하여 형질전환체 S. venezuelae YJ003/pNDOS를 수득하였다.

본 발명에서는 DOS를 생산하기 위한 발현 숙주로서 스트렙토마이세스 베네주엘레 YJ003을 사용하였다. 상기 균주는 D-데소사민 유전자 클러스터(des Ⅰ~des Ⅷ 및 desR)가 결핍된 카나마이신 저항성 유전자로 구성된 균주로서(Hong, J.S. et al., FEMS Microbiol . Lett., 238:392, 2004), 스트렙토마이세스 리비단스(S. lividans) 및 스트렙토마이세스 코에리칼라(S. coelicolor)와 같은 숙주에 비하여 성장이 빠르고 형질전환 효율이 높으며, 대사 산물을 빠르게 수득할 수 있다는 장점을 가지고 있다.

본 발명의 다른 실시예에서는 DOS를 제조하기 위하여, 상기 형질전환체를 배양한 후, 배양액의 pH를 2.5로 조정하여 원심분리한 다음, pH를 7로 조정하여 Amberlite IRC 50 ion-exchange column에 통과시켰다. 이후, 컬럼을 증류수로 세척하여 1N, 2N, 3N 수산화 암모늄으로 분리한 후, SpeedVac 원심분리기를 이용하여 농축한 다음, 메탄올 침전법으로 정제하였다.

상기에서 수득된 화합물을 ESI-MS로 측정한 결과, S. venezuelae YJ003/pNDOS를 배양한 경우 DOS가 생산되었다는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 대조군으로서 표준 DOS와 상기 수득된 화합물에 FMOC-CI를 처리하여 유도한 후, LC-ESI/MS로 분석한 결과, DOS와 마찬가지로 상기 . venezuelae YJ003/pNDOS를 배양하여 수득된 화합물의 총 분자량은 385로 나타났으나, S. venezuelae YJ003/pIBR25를 배양하여 수득된 화합물에 FMOC-CI를 처리한 경우는 상기와 같은 피크를 검출할 수 없었다. 이는 S. venezuelae YJ003/pNDOS가 DOS를 합성하였다는 것을 의미한다.

본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미 한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 Sambrook, et . al ., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann, et . al ., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포 인 경우에는, 재조합벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.

물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: neo5 , neo6 및 neo7 유전자의 클로닝 및 형질전환

neo5(서열번호 1) 및 neo6(서열번호 2) 유전자를 클로닝하기 위하여, 스트렙토마이세스 프라디애 ATCC 10745(Streptomyces fradiae, ATCC 10745)를 주형으로 하고, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머(Geno-Tech, Korea)를 사용하여, PCR법에 의해 neo5 및 neo6을 증폭하였다. PCR 조건은 초기 변성(initial denaturation, 94℃에서 7분)을 수행한 후, 변성(denaturation, 94℃에서 1분), 결합(annealing, 60~70℃에서 1분), 중합(polymerization, 72℃에서 1분) 단계를 총 30회 실시한 다음, 최종적으로 72℃에서 7분 동안 gaps feeling을 실시하였다.

서열번호 3: 5'-CGG ATC CCG GAG GAT TCG GCA CGA TGA AG

서열번호 4: 5'-GTT CTA GAG GGC GGT CAA GTG GCC AGG

상기 증폭된 PCR 산물을 pGEM^R-T Easy(Promega, USA) 벡터를 이용하여 정제하였다. 상기 정제된 DNA를 제한효소 BamHⅠ 및 HindⅢ로 절단하고, 상기와 동일한 제한효소 BamHⅠ 및 HindⅢ로 절단한 pIBR25 벡터(Basundhara, S. et al ., FEBS Lett., 566:201, 2004)에 연결하여 재조합벡터 pNK101을 제작하였다.

또한, neo7(서열번호 5) 유전자를 클로닝하기 위하여, 스트렙토마이세스 프라디애 ATCC 10745(S. fradiae ATCC 10745)를 주형으로 하고, 서열번호 6 및 서열번호 7의 프라이머(Geno-Tech, Korea)를 사용하여, PCR법에 의해 neo7을 증폭하였다. PCR 조건은 초기 변성(initial denaturation, 94℃에서 7분)을 수행한 후, 변성(denaturation, 94℃에서 1분), 결합(annealing, 60~70℃에서 1분), 중 합(polymerization, 72℃에서 1분) 단계를 총 30회 실시한 다음, 최종적으로 72℃에서 7분 동안 gaps feeling을 실시하였다.

서열번호 6: 5'-ATC TAG AGA GGA CCG GGA AGC ATC ATG

서열번호 7: 5'-CGA AGC TTG GCG GTT ACG GCA CGG GTC C

상기 증폭된 PCR 산물을 pGEM^R-T Easy(Promega, USA) 벡터를 이용하여 정제하였다. 상기 정제된 DNA를 제한효소 XbaⅠ 및 HindⅢ로 절단하고, 상기에서 제작한 재조합벡터 pNK101을 상기와 동일한 제한효소 XbaⅠ 및 HindⅢ로 절단하여 연결함으로써 재조합벡터 pNDOS를 제작하였다 (도 2).

상기에서 제작된 재조합벡터 pNDOS를 데소사민 유전자 클러스터-결핍 변이체인 스트렙토마이세스 베네주엘레 YJ003(Streptomyces venezuelae YJ003, Hong, J.S. et al ., FEMS Microbiology Letters, 238:391, 2004)에 도입하여 형질전환체 S. venezuelae YJ003/pNDOS를 수득하였다. 또한, 대조군으로서 상기에서 제작된 재조합벡터 pIBR25를 스트렙토마이세스 베네주엘레 YJ003에 도입하여 형질전환체 S. venezuelae YJ003/pIBR25를 수득하였다.

한편, 상기 PCR에 의해 증폭된 Neo5(서열번호 8), Neo6(서열번호 9) 및 Neo7(서열번호 10)의 아미노산 서열을 BLAST로 확인한 결과, NAD⁺ 및 Co^{2 +}의 존재하에 D-글루코오스-6-인산염(G6P)를 DOI로 전환시키는 Neo7의 경우, 부티로신(butirosin)의 BtrC(서열번호 11)와 38% 상동성을 나타내었고, PLP-의존성 아미노전이효소인 Neo6은 BtrR(서열번호 12)과 40% 상동성을 나타내었으며, 알코올 탈 수소효소인 Neo5는 BtrE(서열번호 13)와 49% 상동성을 나타내었다 (도 3).

또한, S. fradiae의 오픈 리딩 프레임(open reading frames, ORFs)과 다른 종의 오픈 리딩 프레임의 아미노산 상동성을 확인한 결과, Neo7은 리보스타마이신의 RbmA, 토브라마이신의 TbmA, 카나마이신의 KanA 및 젠타미신 유전자 클러스터의 GtmA와 각각 86%, 64%, 63% 및 53% 상동성을 나타내었다. Neo6의 경우, 리보스타마이신의 RbmB, 토브라마이신의 TbmB, 카나마이신의 KanB 및 젠타미신 유전자 클러스터의 GtmB와 각각 88%, 71%, 66% 및 60% 상동성을 나타내었다. Neo5의 경우, 리보스타마이신의 RbmC, 토브라마이신의 TacD, 카나마이신의 KanK 및 젠타미신 유전자 클러스터의 GacH와 각각 90%, 68%, 66% 및 48% 상동성을 나타내었다 (도 4).

실시예 2: DOS 유도체의 정제 및 분석

상기 형질전환체 S. venezuelae YJ003/pNDOS를 1㎎/㎖ 카나마이신 및 500㎍/㎖ 티오스트렙톤이 포함되어 있는 50㎖ SPA(0.1% 효모 추출물, 0.1% beef extract, 0.2% 트립토오스, 1.0% 글루코오스 및 0.01% 황산제1철) 배지에서 배양하였고, 형질전환체 S. venezuelae YJ003/pIBR25를 1㎎/㎖ 카나마이신이 포함되어 있는 배지에서 36시간 동안 28℃에서 230rpm으로 배양한 후, 각각 400㎖ R2YE 배지(5% 수크로오스, 0.02% 황산칼륨, 1% 염화마그네슘, 1% 글루코오스, 0.5% 효모 추출물 및 0.01% Difco 카사미노산), TSB(3% 대두카제인 소화 액체배지, 10.3% 수크로오스, 20.33% 염화마그네슘 6수화물 및 20% 글리신) 및 N-Z 아민(1% 글루코오스, 2% 가용성 녹말, 0.5% 효모 추출물, 0.5% N-Z 아민 및 0.5% 탄산칼슘)에서 5일 동안 28 ℃에서 230rpm으로 배양하였다.

상기 배양액의 pH를 2.5로 조정하여 원심분리한 후, 상등액의 pH를 7로 조정한 다음, Amberlite IRC 50 ion-exchange column(Arcos, USA)에 통과시켰다. 이후, 컬럼을 증류수로 세척한 후, 1N, 2N, 3N 수산화 암모늄(ammonium hydroxide)으로 분리한 다음, SpeedVac 원심분리기를 이용하여 농축하였다.

상기 농축된 화합물을 ice-cold 메탄올을 이용한 메탄올 침전법으로 정제하였다. 이를 위하여, 상기 농축된 화합물의 pH를 4.5로 조정하고, 활성탄을 처리한 후, 침전물이 생길 때까지 ice-cold 메탄올을 서서히 떨어뜨린 다음, 메탄올을 필터링하고 남은 침전물을 증류수에 녹였다.

상기에서 수득된 화합물의 분자량을 ESI-MS로 측정한 결과, 형질전환체 S. venezuelae YJ003/pNDOS를 배양한 경우 DOS(분자량: 163)가 생산되었다는 것을 확인할 수 있었다 (도 5).

또한, 대조군으로서 표준 DOS와 상기 수득된 화합물에 UV로 검출하기 위하여 UV-활성 화합물인 9-플루오리닐메틸 클로로포르메이트(9-fluorenylmethyl chloroformate, FMOC-CI)를 처리하여 유도한 후(Stead D.A. et al ., J. Chromatogr. B. 693:415, 1997), LC-ESI/MS로 분석하였다. FMOC-CI를 처리한 경우, 표준 DOS의 분자량은 222가 증가된다. 260㎚ 및 280㎚에서 검출된 산물의 분석은 C-18 컬럼(Mightysil RP-18 Gp, Japan)을 이용하여 수행하였다.

LC-ESI/MS로 분석한 결과, DOS와 마찬가지로 상기 수득된 화합물의 총 분자량은 385로 나타났다 (도 6). 그러나, 형질전환체 S. venezuelae YJ003/pIBR25를 배양하여 수득된 화합물에 FMOC-CI를 처리한 경우, 상기와 같은 피크를 검출할 수 없었다. 이는 형질전환체 S. venezuelae YJ003/pNDOS가 DOS를 합성할 수 있는 것을 의미한다.

한편, 상기 형질전환체 S. venezuelae YJ003/pNDOS를 각각 R2YE, TSB 및 N-Z 아민 배지에서 배양하여 DOS의 농도를 LC-MS로 분석한 결과, N-Z 아민 배지에서 배양한 경우가 TSB 배지에서 배양한 경우보다 DOS가 약 5배 더 많이 생산되었고, R2YE 배지에서 배양한 경우보다는 약 2배 더 많은 DOS를 생산할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 형질전환체 S. venezuelae YJ003/pNDOS를 가용성 녹말을 첨가하지 않은 배지와 가용성 녹말이 함유된 배지에서 각각 배양하여 세포 성장률을 측정한 결과, 1% 가용성 녹말이 함유된 배지에서 24시간 동안 배양한 경우 세포 성장률이 증가하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 DOS 생합성 경로를 나타낸 모식도이다.

도 2는 네오마이신(Neo5, Neo6 및 Neo7)로부터 DOS 생산에 관여하는 유전자 클러스터와 뷰티로신(BtrE, BtrR 및 BtrC)의 아미노산 서열의 상동성을 확인한 결과이다.

도 3은 S. fradiae 및 다른 종의 DOS 유전자 클러스터를 나타낸 것이다.

도 4는 재조합벡터 pNDOS의 구조를 나타낸 것이다.

도 5는 표준 DOS(A) 및 S. venezuelae YJ003/pNDOS(B)로부터 분리된 화합물을 ESI-MS로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 FMOC-Cl를 이용하여 유도체를 제조한 후, 표준 DOS(A) 및 S. venezuelae YJ003/pNDOS(B)로부터 분리된 화합물을 LC-ESI/MS로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

<110> Genechem <120> AMINOGLYCOSIDE-DEFICIENT RECOMBINANT MICROORGANISM TRANSFORMED RECOMBINANT VECTOR CONTAINING NEO5, NEO6 AND NEO7 GENES AND METHOD FOR PRODUCING 2-DEOXYSTREPTAMINE USING THE SAME <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1023 <212> DNA <213> neo5 <400> 1 atgaaggctc tggtgttcga ggcccccgag cgggccgtcc tcacccaccg cgacataccc 60 gccccggcgc ccggcgaggc gctcgtccgc gtcgcctaca actccgtctg cggcagcgac 120 ctctccttct acaagggcgt ctggcacggc ttcacctacc ccgtcgtccc cggccacgag 180 tggagcggct ccgtggtgga cgtcaacggc ccgcgcggcg ccgacctggt cggccgcaac 240 gtggtcggcg acctgacctg ctcctgcggc acctgcgcgc actgcgcggc cggcaccccg 300 acgctctgcg aggacctcgg ggagctgggc ttcacccgcg acggcgcctg cgccgagtac 360 atgaccgtcc ccgtcgccaa cctgcgtccg ctgcccgaca cgctgccgct gcgtaccgcc 420 tgccaggtcg agccgctggc ggtcgcgctc aacgcggtgg accggctcgg cgtcaccccc 480 ggcgagaagg tggccgtcat gggcgccggc ggcatcgggc tgctcctcgt gcaggcggtg 540 cggctgcggg gcggcaccgt cacggcggtg gccgagccgg tgcccgagcg ccgcgccgcc 600 gccctcgccc tgggcgtgcc cgccgcggtc ggcggcgatc cgggcgcgct ggtcgagctg 660 acccgctccg accccgcggc ggtgccggac gtcgtcctgg aggcgtccgg ctaccccacg 720 gcggtgcagg aggcggtgga ggccgtccgc cccggcggac gcgtcggcct ggtcggctac 780 cgcatcgagg aggccgcggt gatggccccg caccacatcg tgctcaaggt gctcaccgtc 840 cgggcgtcca tgggccccgg cacccgcttc gaggaggcgg tcgacgtcct ggcctccggc 900 gccgtcgacg tggacgccct gctcagccac gaattcgcgc tcgacgacta cgccaaggcc 960 ctggacgtgg cgctgcgccg cgccgacggc aacacccgct cctacttcaa cctccgggcc 1020 tga 1023 <210> 2 <211> 1275 <212> DNA <213> neo6 <400> 2 atggtctccc cgttggcagt gaagggcggc gaggcgttac gcacccgccc ctggcccgcc 60 tggccgcagc ccgcccccgg agtccccgcc gcggtggcgg aggtgctcgg ctcgggccgg 120 tggtccatca gcggcccgta ccgcggcacg gactcccacg agcggcgctt cgcgcgggcg 180 ttcgccgact accacggcgt gccgtactgc gtccccgccg cgagcggcac cgccggcctg 240 atgctggccc tggaggcgtg cggggtcggc gccggcgacg aggtgatcgt ccccggcctg 300 tcctgggtcg cctccggctc caccgtcctg ggcgtcaacg ccgtcccggt cttctgcgac 360 gtcgacccgg acacgctgtg cgtctccccc gaggccgtcg aagcgctgat caccgagcgg 420 accagggccg tcgtggtggt ccacctctac tcggccgtcg cggacatgga cggcctcacc 480 cgcgtcgccg agcgccacgg cctgcccctc gtcgaggact gcgcccaggc ccacggggcc 540 tcctaccggg gcgtcaaggt cggtgcgctg gccaccgccg gcaccttcag catgcagcac 600 agcaaggtgc tcaccagcgg cgagggcggc gcggtcatca cccgcgacgc ggacctcgcc 660 cgccgggtcg agcacctgcg ggccgacggc cgctgcctgt ccgacggccc gcccgcgccg 720 ggcgccatgg agctggtcga gaccggcgag ctgatgggca gcaaccgctg cctgtccgag 780 ttccaggccg ccatcctcac cgagcagctc accctgctcg acgagcagaa ccgcacccgc 840 cgcgccaacg ccgcccgcct cgacggcctc ctcggcgagc tgggcctgcg cccccaggcg 900 acctccgagg gcaccacctc ccgtacgtac tacacctacg cggcgcggct ccccgagggc 960 gcgctggagg acgtcccgct caccgacgtc accggcgccc tcaccgccga gctcggcttc 1020 cccgtccagc cctgctacgc cccgatcccg gcgaaccggc tgtacgcccc gcagacccgc 1080 aggcgctaca cgctcggccc ggaccacgag gcgcgcatcg accccaagcg cttcgccctc 1140 ccggtgtgcg aggacaccgc gcggcggacc gtcaccctgc accacgccgc cctgctcggc 1200 gacgccgagg acatggccga catcgccgcg gccttcgcga aggtcctgcg gcacggcgcc 1260 gacctggcca cttga 1275 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cggatcccgg aggattcggc acgatgaag 29 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gttctagagg gcggtcaagt ggccagg 27 <210> 5 <211> 1293 <212> DNA <213> neo7 <400> 5 atgcagacca cccgcatcgc gatggaagac gcgtcattcc cctaccgact gggcaccgac 60 tgcgccgagg acgtcgtcgc gcgcctcgcc gccctcgaag ccagcagcta cctggtggtg 120 gccgacacca ccgtcgccga gctctacgga gccgcgctca ccgcccacat cgacaaggag 180 gccgggccgt cccacctcct cacccacgag gtgggagagg tccacaagac cctcgccacc 240 gtctccgccc tcgccgagca ggcgctcgga cggggcgcgg accgccgctc cgtcgtcgtc 300 gccctcggcg gcggggtcac cgggaacatc gccggactga tggcctcgct gctcttccgc 360 ggcatccgcc tcgtccacgt gcccaccacc gtggtcgcca tgctggactc ggtcctctcg 420 ctcaagcagg ccgtcaacac caccttcggc aagaacctgg ccgggacctt ctaccagccc 480 gtcgaggtcc tcgcggacac ggcggcgctg cgcacgctgc cgccccgcga gatacggtcc 540 ggaatgggcg aggtcgtcaa gaacgccctg gccatccggc ccgccatgct cgaccggctg 600 gccggcgcgc tgcggcccga cacccgctac gacgacgaga ccatgcgctg gatcatcgcc 660 gagagcctgg ccgccaaggc cgacgtcacc agcggcgaca agcacgagcg gcgctccggc 720 ctcgtcctgg agtacgggca caccgcggga cacgccatcg agcacgcgtc ccgcggcgcg 780 gtcgcccacg gcgcgggagt cgccgtgggc atgaccctcg cagcggaggt gtcccgacgc 840 ctcggccacg ccgacgcggg gctcgtcgcc ctccaccgcg aactggtcgc cgccgccggg 900 gtggagcccg cggtgccgga ccacgtcgac accgcgctcg tcaagaactg gctggcgtac 960 gacaacaagc gcggctacct cgacagcccg cccggccaca ccccgatggt gctgctctcc 1020 gcgccgggcg aggtgctgca caccggcacc atgccgctcg tacccgtgcc cctggcgctg 1080 ctggaggagg tcgtcgacga gtcggccgcc cgcggcgggg ccgggggcgg ggccgccgag 1140 ccggcggcgg cgcgcacggg ccccgtaccg gacggaccgg aggcggcggt accggcgacg 1200 ccggggcccg tgccggccgg acccgcggcg gcggcccccc tgccgagcgg acccgccccg 1260 accgcgcccg cggcggccgg acccgtgccg taa 1293 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 atctagagag gaccgggaag catcatg 27 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cgaagcttgg cggttacggc acgggtcc 28 <210> 8 <211> 340 <212> PRT <213> NEO5 <400> 8 Met Lys Ala Leu Val Phe Glu Ala Pro Glu Arg Ala Val Leu Thr His 1 5 10 15 Arg Asp Ile Pro Ala Pro Ala Pro Gly Glu Ala Leu Val Arg Val Ala 20 25 30 Tyr Asn Ser Val Cys Gly Ser Asp Leu Ser Phe Tyr Lys Gly Val Trp 35 40 45 His Gly Phe Thr Tyr Pro Val Val Pro Gly His Glu Trp Ser Gly Ser 50 55 60 Val Val Asp Val Asn Gly Pro Arg Gly Ala Asp Leu Val Gly Arg Asn 65 70 75 80 Val Val Gly Asp Leu Thr Cys Ser Cys Gly Thr Cys Ala His Cys Ala 85 90 95 Ala Gly Thr Pro Thr Leu Cys Glu Asp Leu Gly Glu Leu Gly Phe Thr 100 105 110 Arg Asp Gly Ala Cys Ala Glu Tyr Met Thr Val Pro Val Ala Asn Leu 115 120 125 Arg Pro Leu Pro Asp Thr Leu Pro Leu Arg Thr Ala Cys Gln Val Glu 130 135 140 Pro Leu Ala Val Ala Leu Asn Ala Val Asp Arg Leu Gly Val Thr Pro 145 150 155 160 Gly Glu Lys Val Ala Val Met Gly Ala Gly Gly Ile Gly Leu Leu Leu 165 170 175 Val Gln Ala Val Arg Leu Arg Gly Gly Thr Val Thr Ala Val Ala Glu 180 185 190 Pro Val Pro Glu Arg Arg Ala Ala Ala Leu Ala Leu Gly Val Pro Ala 195 200 205 Ala Val Gly Gly Asp Pro Gly Ala Leu Val Glu Leu Thr Arg Ser Asp 210 215 220 Pro Ala Ala Val Pro Asp Val Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Pro Thr 225 230 235 240 Ala Val Gln Glu Ala Val Glu Ala Val Arg Pro Gly Gly Arg Val Gly 245 250 255 Leu Val Gly Tyr Arg Ile Glu Glu Ala Ala Val Met Ala Pro His His 260 265 270 Ile Val Leu Lys Val Leu Thr Val Arg Ala Ser Met Gly Pro Gly Thr 275 280 285 Arg Phe Glu Glu Ala Val Asp Val Leu Ala Ser Gly Ala Val Asp Val 290 295 300 Asp Ala Leu Leu Ser His Glu Phe Ala Leu Asp Asp Tyr Ala Lys Ala 305 310 315 320 Leu Asp Val Ala Leu Arg Arg Ala Asp Gly Asn Thr Arg Ser Tyr Phe 325 330 335 Asn Leu Arg Ala 340 <210> 9 <211> 424 <212> PRT <213> NEO6 <400> 9 Met Val Ser Pro Leu Ala Val Lys Gly Gly Glu Ala Leu Arg Thr Arg 1 5 10 15 Pro Trp Pro Ala Trp Pro Gln Pro Ala Pro Gly Val Pro Ala Ala Val 20 25 30 Ala Glu Val Leu Gly Ser Gly Arg Trp Ser Ile Ser Gly Pro Tyr Arg 35 40 45 Gly Thr Asp Ser His Glu Arg Arg Phe Ala Arg Ala Phe Ala Asp Tyr 50 55 60 His Gly Val Pro Tyr Cys Val Pro Ala Ala Ser Gly Thr Ala Gly Leu 65 70 75 80 Met Leu Ala Leu Glu Ala Cys Gly Val Gly Ala Gly Asp Glu Val Ile 85 90 95 Val Pro Gly Leu Ser Trp Val Ala Ser Gly Ser Thr Val Leu Gly Val 100 105 110 Asn Ala Val Pro Val Phe Cys Asp Val Asp Pro Asp Thr Leu Cys Val 115 120 125 Ser Pro Glu Ala Val Glu Ala Leu Ile Thr Glu Arg Thr Arg Ala Val 130 135 140 Val Val Val His Leu Tyr Ser Ala Val Ala Asp Met Asp Gly Leu Thr 145 150 155 160 Arg Val Ala Glu Arg His Gly Leu Pro Leu Val Glu Asp Cys Ala Gln 165 170 175 Ala His Gly Ala Ser Tyr Arg Gly Val Lys Val Gly Ala Leu Ala Thr 180 185 190 Ala Gly Thr Phe Ser Met Gln His Ser Lys Val Leu Thr Ser Gly Glu 195 200 205 Gly Gly Ala Val Ile Thr Arg Asp Ala Asp Leu Ala Arg Arg Val Glu 210 215 220 His Leu Arg Ala Asp Gly Arg Cys Leu Ser Asp Gly Pro Pro Ala Pro 225 230 235 240 Gly Ala Met Glu Leu Val Glu Thr Gly Glu Leu Met Gly Ser Asn Arg 245 250 255 Cys Leu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Ile Leu Thr Glu Gln Leu Thr Leu 260 265 270 Leu Asp Glu Gln Asn Arg Thr Arg Arg Ala Asn Ala Ala Arg Leu Asp 275 280 285 Gly Leu Leu Gly Glu Leu Gly Leu Arg Pro Gln Ala Thr Ser Glu Gly 290 295 300 Thr Thr Ser Arg Thr Tyr Tyr Thr Tyr Ala Ala Arg Leu Pro Glu Gly 305 310 315 320 Ala Leu Glu Asp Val Pro Leu Thr Asp Val Thr Gly Ala Leu Thr Ala 325 330 335 Glu Leu Gly Phe Pro Val Gln Pro Cys Tyr Ala Pro Ile Pro Ala Asn 340 345 350 Arg Leu Tyr Ala Pro Gln Thr Arg Arg Arg Tyr Thr Leu Gly Pro Asp 355 360 365 His Glu Ala Arg Ile Asp Pro Lys Arg Phe Ala Leu Pro Val Cys Glu 370 375 380 Asp Thr Ala Arg Arg Thr Val Thr Leu His His Ala Ala Leu Leu Gly 385 390 395 400 Asp Ala Glu Asp Met Ala Asp Ile Ala Ala Ala Phe Ala Lys Val Leu 405 410 415 Arg His Gly Ala Asp Leu Ala Thr 420 <210> 10 <211> 430 <212> PRT <213> NEO7 <400> 10 Met Gln Thr Thr Arg Ile Ala Met Glu Asp Ala Ser Phe Pro Tyr Arg 1 5 10 15 Leu Gly Thr Asp Cys Ala Glu Asp Val Val Ala Arg Leu Ala Ala Leu 20 25 30 Glu Ala Ser Ser Tyr Leu Val Val Ala Asp Thr Thr Val Ala Glu Leu 35 40 45 Tyr Gly Ala Ala Leu Thr Ala His Ile Asp Lys Glu Ala Gly Pro Ser 50 55 60 His Leu Leu Thr His Glu Val Gly Glu Val His Lys Thr Leu Ala Thr 65 70 75 80 Val Ser Ala Leu Ala Glu Gln Ala Leu Gly Arg Gly Ala Asp Arg Arg 85 90 95 Ser Val Val Val Ala Leu Gly Gly Gly Val Thr Gly Asn Ile Ala Gly 100 105 110 Leu Met Ala Ser Leu Leu Phe Arg Gly Ile Arg Leu Val His Val Pro 115 120 125 Thr Thr Val Val Ala Met Leu Asp Ser Val Leu Ser Leu Lys Gln Ala 130 135 140 Val Asn Thr Thr Phe Gly Lys Asn Leu Ala Gly Thr Phe Tyr Gln Pro 145 150 155 160 Val Glu Val Leu Ala Asp Thr Ala Ala Leu Arg Thr Leu Pro Pro Arg 165 170 175 Glu Ile Arg Ser Gly Met Gly Glu Val Val Lys Asn Ala Leu Ala Ile 180 185 190 Arg Pro Ala Met Leu Asp Arg Leu Ala Gly Ala Leu Arg Pro Asp Thr 195 200 205 Arg Tyr Asp Asp Glu Thr Met Arg Trp Ile Ile Ala Glu Ser Leu Ala 210 215 220 Ala Lys Ala Asp Val Thr Ser Gly Asp Lys His Glu Arg Arg Ser Gly 225 230 235 240 Leu Val Leu Glu Tyr Gly His Thr Ala Gly His Ala Ile Glu His Ala 245 250 255 Ser Arg Gly Ala Val Ala His Gly Ala Gly Val Ala Val Gly Met Thr 260 265 270 Leu Ala Ala Glu Val Ser Arg Arg Leu Gly His Ala Asp Ala Gly Leu 275 280 285 Val Ala Leu His Arg Glu Leu Val Ala Ala Ala Gly Val Glu Pro Ala 290 295 300 Val Pro Asp His Val Asp Thr Ala Leu Val Lys Asn Trp Leu Ala Tyr 305 310 315 320 Asp Asn Lys Arg Gly Tyr Leu Asp Ser Pro Pro Gly His Thr Pro Met 325 330 335 Val Leu Leu Ser Ala Pro Gly Glu Val Leu His Thr Gly Thr Met Pro 340 345 350 Leu Val Pro Val Pro Leu Ala Leu Leu Glu Glu Val Val Asp Glu Ser 355 360 365 Ala Ala Arg Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ala Ala Glu Pro Ala Ala Ala 370 375 380 Arg Thr Gly Pro Val Pro Asp Gly Pro Glu Ala Ala Val Pro Ala Thr 385 390 395 400 Pro Gly Pro Val Pro Ala Gly Pro Ala Ala Ala Ala Pro Leu Pro Ser 405 410 415 Gly Pro Ala Pro Thr Ala Pro Ala Ala Ala Gly Pro Val Pro 420 425 430 <210> 11 <211> 368 <212> PRT <213> BtrC <400> 11 Met Thr Thr Lys Gln Ile Cys Phe Ala Asp Arg Cys Phe Asn Phe Ala 1 5 10 15 Phe Gly Glu His Val Leu Glu Ser Val Glu Ser Tyr Ile Pro Arg Asp 20 25 30 Glu Phe Asp Gln Tyr Ile Met Ile Ser Asp Ser Gly Val Pro Asp Ser 35 40 45 Ile Val His Tyr Ala Ala Glu Tyr Phe Gly Lys Leu Ala Pro Val His 50 55 60 Ile Leu Arg Phe Gln Gly Gly Glu Glu Tyr Lys Thr Leu Ser Thr Val 65 70 75 80 Thr Asn Leu Gln Glu Arg Ala Ile Ala Leu Gly Ala Asn Arg Arg Thr 85 90 95 Ala Ile Val Ala Val Gly Gly Gly Leu Thr Gly Asn Val Ala Gly Val 100 105 110 Ala Ala Gly Met Met Phe Arg Gly Ile Ala Leu Ile His Val Pro Thr 115 120 125 Thr Phe Leu Ala Ala Ser Asp Ser Val Leu Ser Ile Lys Gln Ala Val 130 135 140 Asn Leu Thr Ser Gly Lys Asn Leu Val Gly Phe Tyr Tyr Pro Pro Arg 145 150 155 160 Phe Val Phe Ala Asp Thr Arg Ile Leu Ser Glu Ser Pro Pro Arg Gln 165 170 175 Val Lys Ala Gly Met Cys Glu Leu Val Lys Asn Met Leu Ile Leu Glu 180 185 190 Asn Asp Asn Lys Glu Phe Thr Glu Asp Asp Leu Asn Ser Ala Asn Val 195 200 205 Tyr Ser Pro Lys Gln Leu Glu Thr Phe Ile Asn Phe Cys Ile Ser Ala 210 215 220 Lys Met Ser Val Leu Ser Glu Asp Ile Tyr Glu Lys Lys Lys Gly Leu 225 230 235 240 Ile Phe Glu Tyr Gly His Thr Ile Gly His Ala Ile Glu Leu Ala Glu 245 250 255 Gln Gly Gly Ile Thr His Gly Glu Ala Ile Ala Val Gly Met Ile Tyr 260 265 270 Ala Ala Lys Ile Ala Asn Arg Met Asn Leu Met Pro Glu His Asp Val 275 280 285 Ser Ala His Tyr Trp Leu Leu Asn Lys Ile Gly Ala Leu Gln Asp Ile 290 295 300 Pro Leu Lys Ser Asp Pro Asp Ser Ile Phe His Tyr Leu Ile His Asp 305 310 315 320 Asn Lys Arg Gly Tyr Ile Lys Leu Asp Glu Asp Asn Leu Gly Met Ile 325 330 335 Leu Leu Ser Gly Val Gly Lys Pro Ala Met Tyr Asn Gln Thr Leu Leu 340 345 350 Thr Pro Val Arg Lys Thr Leu Ile Lys Glu Val Ile Arg Glu Gly Leu 355 360 365 <210> 12 <211> 418 <212> PRT <213> BtrR <400> 12 Met Thr Ile Pro Phe Asp His Trp Pro Glu Trp Pro Gln His Ser Asp 1 5 10 15 Arg Thr Arg Arg Lys Ile Glu Glu Val Phe Gln Ser Asn Arg Trp Ala 20 25 30 Ile Ser Gly Tyr Trp Thr Gly Glu Glu Ser Met Glu Arg Lys Phe Ala 35 40 45 Lys Ala Phe Ala Asp Phe Asn Gly Val Pro Tyr Cys Val Pro Thr Thr 50 55 60 Ser Gly Ser Thr Ala Leu Met Leu Ala Leu Glu Ala Leu Gly Ile Gly 65 70 75 80 Glu Gly Asp Glu Val Ile Val Pro Ser Leu Thr Trp Ile Ala Thr Ala 85 90 95 Thr Ala Val Leu Asn Val Asn Ala Leu Pro Val Phe Val Asp Val Glu 100 105 110 Ala Asp Thr Tyr Cys Ile Asp Pro Gln Leu Ile Lys Ser Ala Ile Thr 115 120 125 Asp Lys Thr Lys Ala Ile Ile Pro Val His Leu Phe Gly Ser Met Ala 130 135 140 Asn Met Asp Glu Ile Asn Glu Ile Ala Gln Glu His Asn Leu Phe Val 145 150 155 160 Ile Glu Asp Cys Ala Gln Ser His Gly Ser Val Trp Asn Asn Gln Arg 165 170 175 Ala Gly Thr Ile Gly Asp Ile Gly Ala Phe Ser Cys Gln Gln Gly Lys 180 185 190 Val Leu Thr Ala Gly Glu Gly Gly Ile Ile Val Thr Lys Asn Pro Arg 195 200 205 Leu Phe Glu Leu Ile Gln Gln Leu Arg Ala Asp Ser Arg Val Tyr Cys 210 215 220 Asp Asp Ser Ser Glu Leu Met His Gly Asp Met Gln Leu Val Lys Lys 225 230 235 240 Gly Asp Ile Gln Gly Ser Asn Tyr Cys Leu Ser Glu Phe Gln Ser Ala 245 250 255 Ile Leu Leu Asp Gln Leu Gln Glu Leu Asp Asp Lys Asn Ala Ile Arg 260 265 270 Glu Lys Asn Ala Met Phe Leu Asn Asp Ala Leu Ser Lys Ile Asp Gly 275 280 285 Ile Lys Val Met Lys Arg Pro Pro Gln Val Ser Arg Gln Thr Tyr Tyr 290 295 300 Gly Tyr Val Phe Arg Phe Asp Pro Val Lys Phe Gly Gly Leu Asn Ala 305 310 315 320 Asp Gln Phe Cys Glu Ile Leu Arg Glu Lys Leu Asn Met Gly Thr Phe 325 330 335 Tyr Leu His Pro Pro Tyr Leu Pro Val His Lys Asn Pro Leu Phe Cys 340 345 350 Pro Trp Thr Lys Asn Arg Tyr Leu Lys Ser Val Arg Lys Thr Glu Ala 355 360 365 Tyr Trp Arg Gly Leu His Tyr Pro Val Ser Glu Arg Ala Ser Gly Gln 370 375 380 Ser Ile Val Ile His His Ala Ile Leu Leu Ala Glu Pro Ser His Leu 385 390 395 400 Ser Leu Leu Val Asp Ala Val Ala Glu Leu Ala Arg Lys Phe Cys Val 405 410 415 Thr His <210> 13 <211> 349 <212> PRT <213> BtrE <400> 13 Met Glu Ile Leu Thr Tyr Thr Gly Pro Ser Arg Leu Ile Val Glu Thr 1 5 10 15 Ala Glu Glu Leu Pro Leu Lys Ser Gly Glu Cys Arg Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Tyr Ser Gly Ile Ser His Gly Thr Glu Met Gly Ala Tyr Arg Gly Ile 35 40 45 Ala Pro Tyr Phe Thr Arg Asp Met Asp Ser Glu Thr Arg Leu Phe Glu 50 55 60 Asp Leu Ala Glu Glu His Lys Val Lys Tyr Pro Ile Arg Ser Cys Glu 65 70 75 80 Asp Asp Ala Trp Phe Ile Gly Tyr Ser Asn Val Gly Lys Ile Ile Glu 85 90 95 Val Gly Ala Glu Val Glu Gly Phe Thr Val Gly Asp Ile Val Phe Ser 100 105 110 His Gly Arg His Gln Thr Ile Val Cys Lys His His Lys Lys Ile Phe 115 120 125 Lys Leu Pro Gln Lys Leu Glu Pro Glu Leu Gly Ile Phe Tyr Thr Asn 130 135 140 Leu Met Thr Ala Tyr Asn Ala Val Leu Asp Thr Arg Ile Lys Ile Gly 145 150 155 160 Asp Val Val Val Val Ser Gly Leu Gly Val Val Gly Gln Leu Ile Ala 165 170 175 Gln Leu Ala Lys Leu Ser Gly Ala Thr Val Val Gly Val Asp Pro Leu 180 185 190 Glu Asn Arg Leu Asn Ile Ala Arg Glu Val Glu Ile Asp Tyr Val Phe 195 200 205 Asn Pro Asn Arg Thr Asp Val Ala Lys Glu Ile Arg Glu Ile Thr Asn 210 215 220 Asn Arg Gly Ala Asp Ala Val Phe Glu Val Ser Gly His Ser Thr Ala 225 230 235 240 Leu Asn Gln Ala Ile Arg Ile Ala Ala Pro Asp Thr Val Ile Thr Ala 245 250 255 Val Gly Trp Tyr Gln Gly Gly Gln Ser Val Leu Asn Leu Ser Glu Glu 260 265 270 Phe His Gln Asn Arg Ile Thr Ile Arg Ala Ser Gln Thr Leu Gly Ile 275 280 285 Asp Pro Ser Ile Ser His Met Tyr Asp Asp Ala Arg Arg Arg Asn Ile 290 295 300 Gly Lys Asp Leu Leu Leu Lys Leu Lys Leu Arg Asn Leu Ile Ser His 305 310 315 320 Arg Ile Pro Phe Gly Asp Ala Pro Lys Ala Tyr Glu Met Ile Asp Lys 325 330 335 His Pro His Glu Val Leu Gln Val Val Leu Thr Tyr Ser 340 345

Claims (8)

1. neo5, neo6 및 neo7 유전자를 함유하는 재조합벡터.
2. 제1항에 있어서, 상기 neo5는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합벡터.
3. 제1항에 있어서, 상기 neo6은 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합벡터.
4. 제1항에 있어서, 상기 neo7은 서열번호 5의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합벡터.
5. 제1항 내지 제4항의 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
6. 제5항에 있어서, 상기 미생물은 아미노글리코시드-결핍 균주인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
7. 제6항에 있어서, 상기 아미노글리코시드-결핍 균주는 스트렙토마이세스 베네주엘레 YJ003(Streptomyces venezuelae YJ003)인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
8. 제5항의 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 2-데옥시스트렙타민(2-deoxystreptamine, DOS)의 제조방법.

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