KR20090030014A

KR20090030014A - 산화적 스트레스에 저항성을 가지는 애기장대 돌연변이체

Info

Publication number: KR20090030014A
Application number: KR1020070095282A
Authority: KR
Inventors: 임준
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2007-09-19
Filing date: 2007-09-19
Publication date: 2009-03-24
Also published as: KR100907308B1

Abstract

본 발명은 산화적 스트레스에 저항성을 가지는 식물(예를 들어, 애기장대) 돌연변이체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 산화적 스트레스에 저항성을 가지는 애기장대에서 유래한 ugt71c1 -1 돌연변이체에 대한 발명이다.

애기장대, 산화적 스트레스, UGT(UDP-glycosyltransferase), 돌연변이

Description

산화적 스트레스에 저항성을 가지는 애기장대 돌연변이체{Mutant in Arabidopsis with Improved Resistance to Oxidative Stress}

본 발명은 산화적 스트레스에 저항성을 가지는 식물(예를 들어, 애기장대) 돌연변이체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 산화적 스트레스에 저항성을 가지는 애기장대에서 유래한 ugt71c1 -1 돌연변이체 및 이를 이용한 산화적 스트레스에 내성을 갖는 식물체에 대한 발명이다.

일반적으로 여러 발생 단계에서 식물체들은 넓은 범위의 생물적 및 비생물적인 스트레스 조건에 노출된다. 따라서 증가된 스트레스 저항성을 가지는 식물체를 개발하는 것은 경제적인 관점에서도 매우 중요한 일이다.

높은 광밀도,UV-B 조사, 중금속 오염, 높고 낮은 온도, 수분 결핍, 홍수, 상처, 바이러스, 세균,진균에 의한 감염, 곤충 등에 의한 손상과 같은 스트레스 조건 하에서, 산소 독성은 식물체들의 피해에 크게 기여할 수 있다. 싱글렛 산소, 슈퍼옥사이드 래디컬, 하이드록실 래디컬과 과산화수소와 같은 활성산소종은 스트레스받은 식물체의 손상에 크게 기여한다.

일반적으로 글리코실트랜스퍼레이즈는 호르몬, 2차 대사산물 및 생체이물(xenobiotic)을 포함하는 여러 아글리콘(aglycone)에 뉴크레오타이드-다이포스페이트-활성화된 당을 전달한다(Vogt and Jones, 2000,Trends Plant Sci. 5, 380-386). 이들 효소들은 모든 생물체에서 발견되고 이들 효소들에 의한 그러한 변형은 여러 작은 분자들의 생활성, 용해도, 안정성 및 생체이용율을 변경할 수 있다. 특히 플라보노이드와 같은 이차 대사산물은 여러 하이드록실 위치에서 당화(glycosylation)에 의하여 변형될 수 있다(Heller, W., Forkmann, G. (1994) Biosynthesis of flavonoids; in the Flavonoids, Advances in Research since 1986, J. B. Harborne (eds.), pp. 499-535, Chapman & Hall).

14 UGT 군들 중에서, UGT71C1을 포함하는 그룹 E는 22 UGT 멤버로 구성되고 애기장대에서 모노리그놀 및 플라보노이드와 같은 페닐프로파노이드들의 당화와 관련된 것으로 보고되었다(Lim et al., 2003,Glycobiology . 13, 139-145).

일반적으로 호기성 생물체들은 슈퍼옥사이드 디스무테이즈(SODs), 카탈레이즈(CATs), 및 퍼옥시데이즈와 같은 효소적 항산화 보호 성분을 포함하여, 활성산소종(ROS)으로부터 세포가 손상되는 것을 보호하는 것으로 알려졌다(Asada 와 Takahashi, 1987; Production and scanvenging of active oxygen in photosynthesis; In Photoinhibition . Kyle D. J. et al., (eds.), pp. 227-287, Elsevier). 다른 한편, 플라보노오드와 같은 식물 이차 대사산물은 ROS를 스캐비징하는 활성에 대한 비효소적 보호 요소로 알려졌다(상기 Asada 및 Takahashi 참고).

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안을 해결하고, 본 발명의 목적은 산화적 스트레스에 내성을 가지는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 산화적 스트레스에 내성을 가지는 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명에서 사용된 "산화적 스트레스"란 산화적으로 유도된 활성 래디컬들이 검출가능한 역할을 하는 피해 효과를 나타내는 모든 종류의 비생물적인(예를 들어, 여러 화학물질을 처리. 또는 높은 또는 낮은 온도와 같은 극단적인 기후 조건에 노출 또는 가뭄) 및 생물적인(여러 감염원에 의한 감염) 스트레스 조건들을 포함하는 매우 일반적인 용어로 사용된다.

본 발명에서 스트레스에 "내성" 또는 "저항성"을 가진다는 용어는 상기와 같은 스트레스에 대하여 그것의 야생형의 손상에 비하여 검출 가능한 강한 내성을 가지는 것을 의미하며,

본 발명의 형질전환 식물체란 이러한 내성 또는 저항성을 가지는 식물체, 식물체 일부, 식물 조직 또는 식물 세포를 의미한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1에 기재된 UGT71C1 유전자의 ATG 시작 코돈에서 105 bp 업스트림에 T-DNA(Alonso et al., 2003, Science . 301, 653-657)가 삽입된 ugt71c1 -1 돌연변이체를 발굴하여 이 식물체에서 UGT71C1 유전자의 기능이 현저하게 저하되었으며 이로 인해 식물체에서 산 화 스트레스에 내성을 나타내는 방법을 제공한다.

본 발명이 일 실시예에 있어서, 상기 식물체는 애기장대인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 산화적 스트레스는 화학물질에 의하여 유도된 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 메틸비올로겐에 의하여 유도되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 서열번호 1에 기재된 UGT71C1 유전자의 ATG 시작 코돈에서 105bp 업스트림에 T-DNA가 삽입된 ugt71c1 -1 유전자를 포함하는 산화 스트레스에 내성을 가지는 형질 전환된 식물체를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 식물체는 애기장대인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 산화적 스트레스는 화학물질에 의하여 유도된 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 메틸비올로겐에 의하여 유도되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

이하, 본 발명을 설명한다.

애기장대 유전자에 약 120 UDP-글리고실트랜스퍼레이즈(UGT)가 있고, 그들은 14 개별 군들(A에서 N까지)으로 분류된다. 일반적으로 UGT들은 플라보노이드를 포함하는 여러 분자들에 당의 전달을 촉매한다. 과거에 UGT71C1는 시험관(in vitro)에서 하이드록시시나메이트 및 플라보노이드의 3-OH에 당화할 수 있다는 것이 알려졌다. 생체 내(in vivo)에서 UGT71C1의 생리적 역할을 분석하기 위하여 본 발명자 들은 ugt71c1-1로 명명된 UGT71C1 유전자에서 기능상실 돌연변이체를 분리하였다. 정량적 실시간 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR), 마이크로어레이 데이터 마이닝 및 UGT71C1 프로모터 부위에 의하여 조절되는 GUS 활성의 조직화학적 분석을 사용하여, 본 발명자들은 뿌리에서 최대 발현을 가지는 UGT71C1 유전자의 조직 특이적인 발현패턴을 발견하였다. 또 ugt71c1-1 는 야생형 식물에 비교하여서 메틸 비올로겐(Methyl viologen;제초제의 일종, 패러콰트)으로 처리시에 증가된 산화적 스트레스에 대한 저항성을 나타냈다. 이러한 결과는 야생형 식물과 비교하여서 ugt71c1-1 에서 활성산소종을 제거하는 활성이 증가되었다는 것을 나타낸다. 대사 프로화일링으로 본 발명자들은 야생형 식물과 비교하여 퀘르세틴(quercetin)과 캠페롤(kaempferol) 두 글리코사이드가 ugt71c1 -1에서 감소된 것을 발견하였다. 또한, 활성산소종에 반응하는 8개 대표 유전자들이 메틸 비올로겐에 의해 유도된 산화적 스트레스 조건 하에서 야생 식물들에 비하여 ugt71c1 - 1 에서 낮은 수준으로 발현되어, 이것은 ugt71c1 -1가 더 높은 비효소적 항산화 활성을 가지는 것을 나타낸다.

본 발명은 다음과 같이 구성된다.

1. PCR-based genotyping법을 이용한 UGT71C1 유전자 기능상실 돌연변이체 발굴:

SALK T-DNA 삽입라인들은 pROK2 vector를 이용하여 약 13000 bp(base pair) 길이의 T-DNA를 Agrobacteria를 이용하여 애기장대 (Arabidopsis thaliana)에 무작위적으로 도입하여 유전자의 기능이 상실되도록 만든 기능상실 돌연변이체들의 집 단이며 각 돌연변이체들의 T-DNA 삽입위치의 염기서열을 확인하여 애기장대 연구를 위해 데이터베이스 (http://signal.salk.edu)화 하였다. 본 발명자들은 이들의 기능상실 돌연변이체들 중 유전자 UGT71C1 (At2g29750) 기능상실 돌연변이체를 탐색 및 발굴하여 Arabidopsis Biological Research Center로부터 해당 돌연변이체 종자를 확보 (SALK_111765)하여 PCR을 통해 UGT71C1 유전자의 5' UTR부위에 T-DNA가 삽입되어 있음을 확인하여 이를 ugt71c1 - 1으로 명명하였다. Genotyping은 총 4가지 종류의 primer를 이용하여 수행하였으며, 하나는 T-DNA left border;서열번호 2 (LB1 5'-GGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTG-3')이고, 나머지 3개 primer는 UGT71C1유전자 특이적이다 (서열번호 3;F1 5'-tctcgttccgatgagtccaaa-3', 서열번호 4;R1 5'-gatcaacaactgcgttgcaca-3', 서열번호 5;nested F2 5'-aatccggacaacgatcgaaat-3'). 위의 4가지 primer의 조합으로 PCR을 수행한 결과, ugt71c1 -1의 경우 오직 LB1과 F1, LB1과 F2 primer를 이용한 경우에서만 PCR 산물을 얻었으며 이 PCR 산물의 염기서열을 확인한 결과 SALK_111765은 UGT71C1 (At2g29750) 유전자의 기능이 상실된 돌연변이체임이 입증되었다.

2. Backcrossing통한 안정적인 UGT71C1 유전자 기능상실 돌연변이체 확보:

Genotyping을 통해 확인된 ugt71c1 -1 돌연변이체들을 혹시 존재할지 모르는 다른 돌연변이들을 제거하기 위하여 야생형 (Columbia accession)과 여러 차례 계대 교배를 수행하였으며, 각각의 교배 후 얻은 F1세대를 자가수정하여 F2 종자를 확보하였다. 자가수정 후 얻은 F2 종자를 발아 및 생장시켜 약 20개체를 배양토에 심은 뒤 각각의 개체를 genotyping하여 F2세대에서 ugt71c1 -1 돌연변이체 homozygous line을 최종 확보하였다.

3. ugt71c1 -1 돌연변이체분석:

1) 실시간 정량 PCR (quantitative real-time RT-PCR; qRT-PCR) 방법을 이용한 유전자 발현 양상 분석

ugt71c1 -1 돌연변이체 homozygous line을 대상으로 본 유전자의 기능상실 유무 및 정도를 파악하기 위하여 야생형과 함께 실시간 정량 PCR을 수행하였다. 실시간 정량 PCR은 약 110-130bp정도의 PCR product를 갖도록 유전자 특이적으로 제작된 primer를 사용하였으며, SYBR Premix ExTaq (Takara, Japan)을 이용 Mx3000P®QPCR System (Stratagene, USA)을 이용하여 유전자 발현정도를 확인하였다. 또한, actin2 (At3g18780)을 internal standard로 사용하여 ugt71c1 -1과 야생형에서의 UGT71C1 유전자의 발현정도의 차이를 비교하였다. qRT-PCR결과 UGT71C1 유전자 발현정도는 야생형에 비해 ugt71c1 -1 돌연변이체에서 약 1/4 감소한것으로 밝혀졌다.

2) 산화스트레스하에서의 표현형 분석

다양한 농도 (0.5, 1, 1.5 μM)의 Methyl viologen (paraquat; 1, 1'dimethyl-4, 4' bipyridinium dichloride, Aldrich, USA) 을 이용하여 산화 스트레스 (oxidative stress) 환경을 조성한 결과, ugt71c1 -1은 모든 농도조건하에서 야생형에 비해 산화스트레스에 저항성을 갖는 것으로 나타났다. 산화스트레스환경은 0, 0.5, 1, 1.5 μM의 methyl viologen을 각각 첨가한 식물배양배지 (MS)에 ugt71c1-1 돌연변이체와 야생형을 심어 약 10일 동안 배양실에서 생장하도록 조성 하였다.

본 발명의 돌연변이체는 야생형 식물과 비교하여서 ugt71c1-1 에서 활성산소종(ROS) 스캐빈징 활성이 증가되어 산화적 스트레스에 대한 증가된 저항성을 나타낸다.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

애기장대 Arabidopsis thaliana ecotype Columbia (Col-0) 및 그 유도체들이 본 발명에 사용되었다. UGT71C1 (At2g29750) (SALK_111765)에서 기능상실 돌연변이가 SIGnAL database (http://signal.salk.edu)에서 동정되고, 그것의 종자들은 Arabidopsis Biological Resources Center (ABRC)로부터 얻었다. 종자들을 3분 동안 5% sodium hypochlorite 및 0.15% Tween 20에서 표면 살균처리하고, 증류수로 세척한 후 MS 플레이트(1X Murashige-Skoog salts, pH 5.7; 1% sucrose; 및 0.8% 아가)에 놓았다. 그 후 그들을 연속적인 광 조건 하에서 수직으로 성장하기 전 3일 동안 4℃에서 냉동-처리하였다. 그 후 그들을 3일 동안 4℃에서 춘화 처리한 후 연속적인 광조건 하에서 수직으로 생장시켰다.

실시예 1: T- DNA 삽입 돌연변이체의 분리

개별 돌연변이체 식물들이 T-DNA 삽입에 대하여 동형접합성(homozygous)인지를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 총 4가지 종류의 primer를 이용하여 수행하였으며, 이중 하나는 T-DNA left border (LB15'-GGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTG-3') 이고, 나머지 3개 primer는 UGT71C1유전자 특이적이다 (F1 5'-tctcgttccgatgagtccaaa-3', R1 5'-gatcaacaactgcgttgcaca-3', nested F2 5'-aatccggacaacgatcgaaat-3'). 유전자 -특이적인 프라이머와 T-DNA border 프라이머의 결합으로, 본 발명자들은 PCR-기반 유전자형 분석을 수행하고, 그 PCR-증폭된 산물들을 T-DNA 삽입 위치의 확인을 위하여 시퀀싱하였다. 야생형(Col-0) 식물에 동종접합성 돌연변이체 식물의 수차례 역교배 후, 동종접합성 식물이 동정되고 본 발명에 사용되었다.

실시예 2: 형질전환체의 제조 및 GUS 활성의 조직화학적 검출

그 프로모터::GUS 리포터 유전자를 설계하기 위하여, UGT71C1 (At2g29750)의 ATG 시작 코돈으로부터 1kb 업스트림 지역을 PCR반응에서 한 쌍의 프라이머(서열번호 6;F1 5'-AACTGCAGAACCAATGCATTGGTTCATGACTTTCTACATTTTTC-3', 서열번호 7;R1 5'-GCTCTAGAGCACTAGGGATTTTCTGAGAAACTC-3')로 증폭하였다. 프로모터 부위를 클로닝하기위해 사용된 제한효소(PstI 와 XbaI) 염기서열들은 밑줄로 나타냈고, UGT71C1 업스트림 지역에 해당하는 서열들은 이탤리체로 표시하였다. 그 PCR 증폭된 산물들은 제한효소(PstI 와 XbaI)로 처리되고 pBI101의 해당 제한 효소 자리에 PstI-XbaI 절편으로 삽입되었다. UGT71C1 프로모터::GUS 리포터 컨스트럭트를 포함하는 형질전환 주들을 선택하고 GUS 활성을 분석하였다. 각 샘플(3-과 10-일된 묘목(seedling), 꽃, 줄기, 줄기에 나는 잎, 및 로제트 잎)을 암실에서 GUS 염색 버퍼(5 mM potassium hexocyanine Ferrate II; 5 mM potassium hexocyanine ferrate III; 0.5 M EDTA, pH 8.0; 1 M sodium phosphate buffer, pH 7.0; 0.1 % Triton X-100; 및 20 mM X-Glc A, cyclohexylammonium)에 37℃에서 3에서 5 시간 처리하였다. 그 염색은 70% 에탄올 용액으로 염색 용액을 대체하여 종결하였고, 샘플들을 Stemi 2000-C 스테레오 현미경(Carl Zeiss, Germany)으로 관찰할 때까지 4℃에 저장하였다.

실시예 3: RNA 분리 및 qRT - PCR 분석

전체 RNA는 RNeasy Plant 미니 키트(Qiagen, USA)를 사용하여 여러 식물 조직으로부터 분리하고, 전에 기재한 것(Lim et al ., 2006,J. Plant Biol. 49, 309-314.)과 같이 cDNA로 변환하였다. qRT-PCR 실험을 위하여, 그 합성된 cDNA들을 주형으로 사용하였고, 유전자 특이적인 프라이머들은 Mx3000P®QPCR System (Stratagene, USA)을 사용하여 각 유전자에 독특한 약 110에서 130bp 절편을 증폭하게 고안되었다. SYBR Premix ExTaq를 제조업자의 지시(타카라, 일본)에 따라 사용하였다. 애기장대 ROS 반응 유전자들의 발현 분석을 위하여, 8 대표적인 유전자들을 선택하였다: ALTERNATIVE OXIDASE (AOX; At5g64210), BON ASSOCIATION PROTEIN I (BAP1; At3g61190), CATALASE1 (CAT1; At1g20630), CATALASE 2 (CAT2; At4g35090), COPPER/ZINC SUPEROXIDE DISMUTASE (CSD1; At1g08830), Fe SUPEROXIDE DISMUTASE I (FSD1; At4g25100), FERRETIN1 (FER1; At5g01600), 및 PEROXIREDOXIN (PEROX; At3g06050) (표 1). 개별 타겟 유전자들의 상대적인 발현 수준을 계산하기 위하여, 액틴2 (At3g18780)를 내부 표준으로 사용하였다(표 1). 발현은 RNA 샘플들을 3회 독립적으로 수행하였다. 3회의 평균값들을 계산하고, 그 표준 오차(±SE)를 엑셀 화일(마이크로소프트, USA)을 사용하여 나타내었다.

실시예 4: Methyl viologen ( MV ) 처리

메틸 비올로겐(MV) 처리를 위하여, 돌연변이체와 야생형 식물을 다양한 농도 (0.5, 1, 및 1.5μM)의 메틸 비올로겐(제초제; 1, 1'-dimethyl-4, 4'-bipyridinium dichloride, Aldrich, USA) 을 포함하는 1X MS 플레이트에서 각각 성장시켰다. 10 일 후, 돌연변이체 및 야생형 묘목의 뿌리 길이를 윈도우 용 Scion Image(vers. Beta 4.0.2, Scion, USA)을 통하여 측정하였다. 돌연변이체 및 야생형 식물의 카로티노이드 및 클로로필 양은 전에 기재한 것(Lim et al ., 2006,J. Plant Biol. 49, 309-314.)과 같이 470nm, 648nm 및 664nm에서 결정하였다.

실시예 6: DPPH 래디컬 스캐비징 활성의 측정

안정한 자유 래디컬 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, Sigma, USA)을 사용하여 전에 기재된 과정(Burda와 Oleszek, 2001,J. Agric . Food Chem . 49 , 2774-779)를 일부 변형하여 스캐비징 활성을 측정하였다. 샘플과 DPPH 용액 혼합물을 37℃에서 30 분 배양 후, 흡광도를 Apollo LB 911 Microplate Absorbance Reader (Berhold Technologies GmbH & Co., Germany)를 사용하여 517nm에서 측정하였다. 레퍼런스는 100㎕의 80% 메탄올로 제조하였고, L-아스코르브산을 포지티브 콘트롤로 사용하였다.

실시예 7: HPLC 와 질량 분광기에 의한 대사산물 프로화일링

플라보노이드는 전에 기재된 것(Graham, 1991,Plant Physiol . Biochem. 36, 135-144)과 같이 액체질소에서 마쇄된 10일된 애기장대 묘목(3g)으로부터 추출하였 다. HPLC를 위하여, 포토 다이오드 어레이(PDA) 디텍터 시스템을 갖춘 Hitachi LaChrom Elite HPLC를 사용하였다. 각 농축된 추출물 동량(20㎕)을 YMC Pack-Pro C18 I.D column (250 x 4.6 mm, 5㎛) (YMC, Tokyo, CA)에 투여하고, 유속 1mL min^-1에서 5 % 아세토나이트릴/95 % 증류수로부터 90% 아세토나이트를까지의 60분 리니어 그래디언트를 사용하여 분리하였다. 대사산물들의 용출을 포토다이오드 어레이 디텍터로 모니터하였고 각 샘플들의 유지시간과 UV 스펙트럼을 비교하였다. 각 프로화일은 독자적으로 3회 수행하였다. LC-ESI/MS 분석은 여러 플라보노이드 및 이소플라보노이드 대사산물의 동정을 확인하기 위하여 사용되었다. 질량 스펙트럼은 Finnigan Surveyor Modular HPLC 시스템을 갖춘 Finnigan LCQ Advantage MAX 이온 트랩 질량 분광기(Thermo Electron Co., USA)로 직접 주입하거나 액체 크로마토그래피 주입을 통하여 얻었다. 그 화합물들의 크로마토그래피 분리는 유속 0.2 mL min^-1에서 YMC-Hydrosphere C18 컬럼(2.0 x 50 mm, 5㎛)을 사용하여 수행하였다. 유동상 A와 B는 각각 물과 아세토나이트릴이었고, 모두 0.1 % 포름산을 포함한다. 구배 용출은 다음과 같이 수행되었다: 리니어 그래디언트로 5에서 80 % B로 0에서 30분간, 그 후 100 % B로 30분에서 45분.

상기 실시예들의 결과는 다음과 같다.

애기장대 UGT71C1 유전자는 481 아미노산 잔기의 폴리펩타이드를 코딩한다(도 1A). 애기장대에서 UGT71C1의 생리적 기능을 잘 이해하기 위하여, 본 발명자들은 역 유전학적 접근을 채택하였다. SIGnAL데이터베이스(http://signal.salk.edu) 에서, 본 발명자들은 UGT71C1 유전자의 기능상실 돌연변이를 동정하였다. UGT71C1에서 T-DNA의 삽입을 확인하기 위하여, Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC)으로부터 얻은 약 20 식물체들을 PCR-기반 방법에 의하여 유전자형분석을 하였다. 그 후, 그 PCR 산물들을 T-DNA 삽입의 위치를 확인하기 위하여 시퀀싱하였다. 결과적으로, 본 발명자들은 T-DNA 삽입이 ATG 시작 코돈에서 105bp 업스트림에 위치한다는 것을 알았다(도 1B). T-DNA가 UGT71C1 5' UTR (비번역 지역)에서 삽입되므로, 본 발명자들은 ugt71c1 -1 은 널(null) 대립형질이다고 생각했다. 그러나 ugt71c1-1에서 UGT71C1 발현 수준은 야생형 레벨보다 30 % 이하 감소하였고, 이것은 ugt71c1 -1이 널 대립형질이 아니라는 것을 암시한다(도 1C).

또 UGT71C1의 조직 특이적인 발현 패턴을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 세 가지 접근을 택하였다: i) 줄기에서 나온 잎, 꽃, 묘목, 줄기, 뿌리 및 로제트 잎으로부터 유래한 RNA 샘플의 qRT-PCR, ii)AtGenExpress 데이터베이스 (http://www.weigelworld.org/resources/microarray/AtGenExpress)로부터 온 마이크로어레이 데이터 마이닝, 및 iii) UGT71C1 프로모터::GUS 리포터의 조직화학적 분석.

qRT-PCR 분석으로 본 발명자들은 UGT71C1이 뿌리에서 매우 높게 발현되나 다른 조직에서 발현은 매우 낮다는 것을 발견하였다(도 2A). 또 본 발명자들은 qRT-PCR 결과를 AtGenExpress 컨소시움에서 온 마이크로어레이 결과와 비교하였다(도 2B). 두 독립적인 플랫폼으로부터 온 UGT71C1 발현패턴은 합동이었다. 또 본 발명자들은 식물 내에서 그것의 조직 특이적 발현을 모니터하기 위하여 GUS 리포터 가 융합된 UGT71C1 프로모터 지역을 가지는 형질전환 식물을 만들었다. GUS의 조직화학적 분석은 UGT71C1 발현이 주로 뿌리에서 나타나는 반면 가지의 기초마디(basal node), 로제트 잎의 잎꼭지, 및 장각과의 기저부(basal part)에서는 약한 발현이 관찰되었다(도 3).

또한 본 발명자들은 UGT71C1 발현의 변화가 ROS 생성을 촉진하는 것으로 알려진 메틸비올로겐(MV)에 의하여 야기된 산화적 스트레스에 대한 식물 반응에 영향을 미치는지를 조사하였다. 다른 농도의 MV (0, 0.5, 1, 및 1.5 uM)를 가지는 MS 플레이트에서 성장하면, 양 ugt71c1 -1 및 WT 식물체 모두 MV 농도가 증가함에 따라 점차적인 왜소한 성장을 보였다(도 4A). 흥미롭게, MV에 의한 성장 저해의 정도는 ugt71c1-1에서 더 작고, 이것은 ugt71c1 -1이 산화적 스트레스에 저항성을 증가시킨다는 것을 나타낸다(도 4A). 총체적으로, ugt71c1 -1은 테스트한 모든 농도를 통하여 야생형 묘목보다 더 높은 뿌리 성장을 보였다(도 4A). 묘목에 대한 MV의 효과는 돌연변이체와 야생형 묘목에서 클로로필과 카로티노이드의 양을 측정하여 정량하였다. 1uM MV에 노출된 ugt71c1 -1에서 클로로필 a 양은 야생형보다 두 배 이상 높았다(도 4B). 또 클로로필 b 양은 MV 농도가 증가함에 따라 야생형에서 크게 감소되었다(도 4C). 1 uM의 MV를 가지는 MS 플레이트에서 성장한 ugt71c1 - 1 에서 클로로필 b 양은 야생형에 비하여 약 4배 정도 높았다(도 4C). 또한 카로티노이드 함량분석 결과 1uM MV에서 야생형의 카로티노이드 함량은 ugt71c1-1 의 약 절반이었다(도 4D). 이상으로 MV-유도된 산화적 스트레스에 대한 ugt71c1 - 1 의 이들 표현형들은 UGT71C1이 산화적 스트레스에 대한 당화 경로에서 중요한 역할을 한다는 것 을 나타낸다.

또한 ugt71c1-1은 MV-유도된 산화적 스트레스 환경에서 야생형 묘목보다 더 좋은 성장 표현형을 보이므로, 본 발명자들은 야생형 식물보다 ugt71c1-1 이 더 나은 활성산소종(ROS) 스캐빈징 활성을 가지는지를 실험하였다. DPPH 분석에 의한 야생형과 ugt71c1-1 식물체의 스캐빈징 활성에서, ugt71c1-1은 명백하게 더 높은 활성산소종(ROS) 스캐빈징 활성을 나타내었다(도 5). 심지어 1.5μM MV와 같은 높은 농도에서도 ugt71c1-1 에서 활성산소종(ROS) 스캐빈징 활성은 큰 변화가 없었지만 야생형의 경우에는 미처리 대조군의 50%로 그 활성이 감소하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 1.5μM MV에서 ugt71c1-1은 야생형과 비교하여 2배 이상의 활성산소종(ROS) 스캐빈징 활성을 나타내었다. 이것은 산화적 스트레스 하에서 ugt71c1-1 의 개선된 성장 표현형과 일치하였다. 하이드록시신나메이트 및 플라보노이드와 같은 식물 이차 대산산물은 O₂ ^-, O₂, 및 H₂O₂ 와 같은 자유 래디컬을 스캐빈징하는 항산화제로 작용한다(Cotelle et al., 1992,Free Radic. Biol. Med. 13, 211-219). 비록 아글리콘과 카페익산의 두 O-배당체가 동일한 수준의 항산화 활성을 가지지만(Nishimura et al., 1995,J. Ferment. Bioeng. 80, 18-23.), 그 플라보노이드 아글리콘은 플라보노이드 배당체에 비하여 강한 항산화제로 예측된다(Lee, 2004, Ph. D. thesis, University of Florida, Gainesville). 글리코사이드보다 아글리콘의 상대적인 풍부함은 산화적 스트레스 하에서 활성산소종(ROS)을 스캐빈징하는 능력을 증가시키게 할 것으로 예상되어, 본 발명자들은 HPLC와 질량 분광기 에 의한 대사산물 프로화일링을 수행하여 ugt71c1-1 과 야생형 식물 사이에 정량적으로 차이가 있는 두 주된 플라보노이드 화합물을 발견하였다(도 6). ugt71c1-1에서 케르세틴(quercetin) 3,7-O-배당체, 람노사이드(rhamnoside)의 양은 25 % 감소하였고, 캠페롤(kaempferol) 3,7-O-배당체, 람노사이드의 양은 각각 야생형 수준의 단지 약 70%이었다(도 6). 이들 프로화일링 결과는 본 발명의 DPPH 분석결과에서 ugt71c1-1 의 활성산소종(ROS) 스캐빈징 활성이 더 높다는 것을 또 지지한다. 이러한 결과는 일반적으로 아글리콘이 여러 반응(하이드록시레이션, 메틸레이션 및 글리코실레이션)에 의하여 계속 변환되는 것을 예측한다. 따라서 플라보노이드의 아글리콘 풀의 동적인 변화가 산화적 스트레스에 대한 반응에 중요한 역할을 한다.

또한 슈퍼옥사이드 디스무테이즈(SODs), 카탈레이즈(CATs), 및 퍼옥시데이즈와 같은 ROS 분해 효소들을 코딩하는 유전자들의 발현이 산화적 스트레스 하에서 빠르게 유도죄는 것으로 알려졌다(Scandalios, 2005, Braz. J. med. Biol. Res. 38, 995-1014). 감소된 UGT71C1 활성 및 활성산소종(ROS) 생산과의 상호관계를 더 잘 이해하기 위하여, 본 발명자들은 산화적 스트레스 하에서 ugt71c1-1 과 야생형 식물 모두에서 활성산소종(ROS) 반응의 발현을 모니터하였다(도 7). 본 발명자들은 애기장대에서 모두 8개의 대표적인 활성산소종(ROS) 반응 유전자들을 선택하였다: ALTERNATIVE OXIDASE (AOX; At5g64210), BON ASSOCIATION PROTEIN I (BAP1; At3g61190), CATALASE1 (CAT1; At1g20630), CATALASE 2 (CAT2; At4g35090), COPPER/ZINC SUPEROXIDE DISMUTASE (CSD1; At1g08830), Fe SUPEROXIDE DISMUTASE I (FSD1; At4g25100), FERRETIN1 (FER1; At5g01600), and PEROXIREDOXIN (PEROX; At3g06050) (표 1). 다른 MV 농도에서 성장한 10일된 묘목의 세 독립적인 실험군에서 RNA 샘플들을 정제하여 그 활성산소종(ROS) 반응 유전자들의 발현 수준을 qRT-PCR 실험을 통하여 분석하였다. 동일 조건 하에서, 그 활성산소종 반응 유전자들은 야생형 식물보다 ugt71c1-1에서 더 감소된 수준의 발현을 보였다(도 7). 과거에 SOD와 CAT는 산화적 스트레스 동안에 과량의 ROS를 제거하는데 중추적인 역할을 하는 것으로 알려졌다(Mittler, 2002,Trends Plant Sci. 7, 405-410). MV 농도가 증가할수록 야생종 및 ugt71c1-1 모두에서 CAT1 및 CAT2 발현이 증가되어 1μM에서 최고 수준에 이른다(도 7C 및 7D). 그러나 1μM MV에서 야생형 식물체들의 CAT1 및 CAT2 발현량에 비하여 ugt71c1-1에서의 발현량은 낮은 것으로 관찰된다. 이와 유사하게, 1μM MV 조건에서 성장한 야생형 CSD1 및 FSD1 발현 수준은 ugt71c1-1 것의 약 2배 이상이었다(도 7E 및 7G). AOX 와 PEROX 는 미토콘드리아 산화환원 항상성에 관여하는데(Maxwell et al., 1999,. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 8271-8276). AOX와 PEROX 발현은 각 MV 처리시 야생형 식물에서 크게 증가하나, ugt71c1-1 에서는 그 증가양상이 현저히 감소된 것으로 관찰된다(도 7A 및 7H). 또 싱글렛 산소 마커 유전자(BAP1)와 슈퍼옥사이드 마커 유전자(FER1)의 발현 수준은 MV 농도가 증가함에 따라 야생형에서 증가하였다(도 7B와 7F). ugt71c1-1에서 BAP1 발현은 MV 농도가 증가함에 따라 증가하였지만, FER1 발현은 천천히 감소하였다(도 7B 및 7F). 전체적으로 야생형 식물에서 ROS 반응 유전자들의 발현은 MV 농도가 증가함에 따라 증가되었고, 이것은 활성산소종의 생성이 ROS 반응 유전자들 의 발현을 유도한다는 것을 나타낸다(도 7). ugt71c1-1에서 여러 ROS 반응 유전자들의 더 낮은 발현양상은 ugt71c1-1이 적용된 동일 농도의 MV에서 야생형보다 더 적은 산화적 스트레스를 경험하고 있다는 것을 나타낸다. 이러한 결과들은 ugt71c1-1 이 더 높은 활성산소종(ROS) 스캐빈징 활성을 가지고 있다는 본 발명의 DPPH 분석 결과와도 일치하고, 따라서 야생형에 비하여 더 적은 양의 활성산소종을 가지고 있을 것으로 분석된다. 또 ugt71c1-1 에서 8개의 대표적인 활성산소종(ROS) 반응 유전자들의 감소된 발현 수준은 플라보노이드와 같은 비효소적 항산화제가 산화적 스트레스에 대한 반응에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다.

유전자	유전자 코드	Forward primer	Reverse primer
Actin2	At3g18780	TCGCTGACCGTATGAGCAAAGAA(서열번호8)	TGGAATGTGCTGAGGGAAGCA(서열번호9)
AOX	At5g64210	GATGTTGTAACGGTGATTCGTGCTG(서열번호10)	GTGATAACCAATCGGAGCTGCTG (서열번호11)
BAP1	At3g61190	TGGTTAAATCGGATCCCACCAGA (서열번호12)	TAACAGTCCGGCCACCGTATCC (서열번호13)
CAT1	At1g20630	CGCCATGCCGAAAAATACCC (서열번호14)	CTTGCCTGTCTGAATCCCAGGAC (서열번호15)
CAT2	At4g35090	TCCGCCTGCTGTCTGTTCTG (서열번호16)	TGGGTCGGATAGGGCATCAA (서열번호17)
CSD1	At1g08830	TGATGGAACTGCCACCTTCACA (서열번호18)	ATGGCCTCCCTTTCCGAGGT (서열번호19)
FER1	At5g01600	GCCTTACTCTTGCCGTGCTGGT (서열번호20)	TGAGAACAAACCCTTCACCAATCTG (서열번호21)
FSD1	At4g25100	GCTCGGCTCTTTCCCATTGC(서열번호22)	CAGCTTCCCAAGACACAAGATTGG(서열번호23)
PEROX	At3g06050	CAAGGATCTCTCTGCTGCATTGCTC (서열번호24)	TGACTTCTGCCCCTGTAACCTTGA (서열번호25)
UGT71C1	At2g29750	AGCCTTGGAGATGCGGTTGG(서열번호26)	GCTTCTTTTCCCGCCTCAGC(서열번호27)

표 1은 qRT-PCR에 사용된 프라이머 서열이다.

도 1은 애기장대 UGT71C1 유전자를 나타낸 그림. (A)는 UGT71C1 , UGT71C2, 및 UGT71C3의 아미노산 서열 비교, PSPG 모티프는 박스처리됨. (B) T-DNA 삽입을 나타내는 화살표를 가지는 UGT71C1에서 기능상실 돌연변이. (C) 야생형(WT) 및 ugt71c1-1 식물체에서 UGT71C1 발현.

도 2는 UGT71C1의 조직 특이적인 발현을 나타냄. (A) qRT-PCR 결과. (B) AtGenExpress 데이터베이스로부터 얻은 마이크로어레이 결과.

도 3은 GUS의 조직화학적 검출. (A) 꽃 (B) 장각과(Silique) (C) 줄기 (D) 줄기 잎(Cauline leaf) (E) 로제트 잎(Rosette leaf) (F) 3일된 묘목 (G) 3일된 근단(root tip) (H) 10일된 묘목 (I) 10일된 묘목의 곁뿌리(Lateral root).

도 4는 WT 및 ugt71c1 -1 묘목들에 대한 MV 효과를 나타낸 그림. (A) 여러 다른 농도에서 10일 된 빛에서 성장한 묘목의 표현형 (B) 클로로필 a 양, (C) 클로로필 b 양, (D) 카로티노이드 양.

도 5는 산화적 스트레스 하에서 WT 및 ugt71c1 -1 묘목의 활성산소종(ROS) 스캐비징 활성을 나타내는 그림. 심지어 1.5μM MV와 같은 높은 농도에서도 ugt71c1-1 에서 ROS 스캐비징 활성은 큰 변화가 없었지만 야생형의 경우에는 미처리 대조군의 50%로 그 활성이 감소하였다. 1.5μM MV에서 ugt71c1 -1은 야생형과 비교하여 2배 이상의 ROS 스캐비징 활성을 나타내었다.

도 6은 WT 및 ugt71c1 -1 식물체 사이의 세 주된 플라보노이드 화합물의 상대적 풍부함을 나타낸 그림. ugt71c1 -1에서 케르세틴 3,7-O-배당체, 람노사이드는 25 %로 감소하였고, 캠페롤 3,7-O-배당체, 람노사이드는 야생형 레벨의 단지 약 70% 정도였다.

도 7은 산화적 스트레스 하에서 야생형과 ugt71c1-1 묘목들에서 8개의 대표적인 활성산소종(ROS) 반응 유전자들의 발현을 나타낸 그림. 회색 바는 WT의 수준을, 흰색 바는 ugt71c1-1수준을 나타냄. (A) AOX. (B) BAP1. (C) CAT1. (D) CAT2. (E) CSD1. (F) FER1. (G) FSD1. (H) PEROX.

도 8은 ugt71c1 유전자의 ATG 시작 코돈에서 105bp 업스트림에 T-DNA가 삽입된 위치를 보여주는 그림.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Mutant in Arabidopsis with improved resistance to oxidative stress <160> 27 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1621 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UGT71C1 <400> 1 agttgtgttt aaatttaact aattcgctgc ctcttactaa tagttgtata aattatccaa 60 caatcatcaa cacatacaaa acaaaacttt ctcaacaact cttgcacaat ctctgtttca 120 tttttatttt tgtcttctcc tattgacttt ttgagtttct cagaaaatcc ctagtatggg 180 gaagcaagaa gatgcagagc tcgtcatcat acctttccct ttctccggac acattctcgc 240 aacaatcgaa ctcgccaaac gtctcataag tcaagacaat cctcggatcc acaccatcac 300 catcctctat tggggattac cttttattcc tcaagctgac acaatcgctt tcctccgatc 360 cctagtcaaa aatgagcctc gtatccgtct cgttacgttg cccgaagtcc aagaccctcc 420 accaatggaa ctctttgtgg aatttgccga atcttacatt cttgaatacg tcaagaaaat 480 ggttcccatc atcagagaag ctctctccac tctcttgtct tcccgcgatg aatcgggttc 540 agttcgtgtg gctggattgg ttcttgactt cttctgcgtc cctatgatcg atgtaggaaa 600 cgagtttaat ctcccttctt acattttctt gacgtgtagc gcagggttct 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1500 gaagagtaaa gtgaaggaga ttgctgaggc gggaaaagaa gctgtggacg gtggatcttc 1560 gtttcttgcg gttaaaagat tcatcggtga cttgatcgac ggcgtttcta taagtaagta 1620 g 1621 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB1 Promoter <400> 2 ggcaatcagc tgttgcccgt ctcactggtg 30 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F1 Promoter <400> 3 tctcgttccg atgagtccaa a 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1 Promoter <400> 4 gatcaacaac tgcgttgcac a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nested F2 Promoter <400> 5 aatccggaca acgatcgaaa t 21 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F1 Promoter <400> 6 aactgcagaa ccaatgcatt ggttcatgac tttctacatt tttc 44 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1 Promoter <400> 7 gctctagagc actagggatt ttctgagaaa ctc 33 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Actin 2 <400> 8 tcgctgaccg tatgagcaaa gaa 23 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Actin2 <400> 9 tggaatgtgc tgagggaagc a 21 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for AOX <400> 10 gatgttgtaa cggtgattcg tgctg 25 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for AOX <400> 11 gtgataacca atcggagctg ctg 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for BAP1 <400> 12 tggttaaatc ggatcccacc aga 23 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for BAP1 <400> 13 taacagtccg gccaccgtat cc 22 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CAT1 <400> 14 cgccatgccg aaaaataccc 20 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CAT1 <400> 15 cttgcctgtc tgaatcccag gac 23 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CAT2 <400> 16 tccgcctgct gtctgttctg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CAT2 <400> 17 tgggtcggat agggcatcaa 20 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CSD1 <400> 18 tgatggaact gccaccttca ca 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CSD1 <400> 19 atggcctccc tttccgaggt 20 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for FER1 <400> 20 gccttactct tgccgtgctg gt 22 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for FER1 <400> 21 tgagaacaaa cccttcacca atctg 25 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for FSD1 <400> 22 gctcggctct ttcccattgc 20 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for FSD1 <400> 23 cagcttccca agacacaaga ttgg 24 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for PEROX <400> 24 caaggatctc tctgctgcat tgctc 25 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for PEROX <400> 25 tgacttctgc ccctgtaacc ttga 24 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for UGT71C1 <400> 26 agccttggag atgcggttgg 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for UGT71C1 <400> 27 gcttcttttc ccgcctcagc 20

Claims

서열번호 1에 기재된 UGT71C1 유전자의 ATG 시작 코돈에서 105bp 업스트림에 T-DNA가 삽입된 ugt71c1 -1 유전자를 식물체에 도입시켜서 식물체에서 산화 스트레스에 내성을 나타내는 방법.
제1항에 있어서, 상기 식물체는 애기장대인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 산화적 스트레스는 화학물질에 의하여 유도된 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 화학물질은 메틸비올로겐인 것을 특징으로 하는 방법.
서열번호 1에 기재된 UGT71C1 유전자의 ATG 시작 코돈에서 105bp 업스트림에 T-DNA가 삽입된 ugt71c1 -1 유전자를 포함하는 산화 스트레스에 내성을 가지는 형질 전환된 식물체.
제5항에 있어서, 상기 식물체는 애기장대인 것을 특징으로 하는 식물체.
제1항에 있어서, 상기 산화적 스트레스는 화학물질에 의하여 유도된 것을 특징으로 하는 식물체.
제 7항에 있어서, 화학물질은 메틸비올로겐인 것을 특징으로 하는 식물체.