KR20090029259A - 노인성 황반변성의 예방 및 치료방법 - Google Patents

노인성 황반변성의 예방 및 치료방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 노인성 황반변성(AMD)의 진단, 예방 및 치료에 대한 방법 및 시약에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 개체의 AMD 진행에 대하여 강력한 보호작용을 하는 것으로 판정된 유전자 결손(gene deletion)에 대한 방법 및 시료에 관한 것이다.
노인성 황반변성, AMD, RNAi

Description

노인성 황반변성의 예방 및 치료방법{PROTECTION AGAINST AND TREATMENT OF AGE RELATED MACULAR DEGENERATION}
본 발명은 노인성 황반변성(AMD)의 진단, 예방 및 치료방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 AMD의 진행에 대하여 공통적이며 강력한 보호작용을 하는 유전자 결손(gene deletion)의 동정 및 상기 유전자들을 사일런싱(silencing)하는 억제제에 관한 것이다.
노인성 황반변성은 고령의 연령층에서 발생하는 시각 장애의 가장 흔한 원인이며, 75세 이상 백인의 거의 10%에 영향을 미치는 심각한 질환이다. 상기 질환은 유전 및 환경적 요인이 감수성(susceptibility)에 영향을 미치는 복합 질환이다. 보체 인자 H(CFH)는 최근 주요한 AMD 감수성 유전자로 동정되었으며, Y402H 다형성(polymorphism)이 원인이 될 가능성이 높은 인자로 제안되었다.
CFH 및 이와 밀접하게 관련된 유전자들 CFHL3, CFHL1, CFHL4, CFHL2 및 CFHL5(또한, CFHR 1-5로도 알려져 있음)는 염색체 1q23 상에 일렬로 배열되어 있는데, 이들은 상기 염색체의 RCA 유전자 클러스터의 근위 말단에서 355kb의 길이로 배열되어 있다. 매우 높은 수준의 상동성, 특히 CFH 및 CFH1의 3' 엑손들 사이(99%) 및 CFHL3 및 CFHL4의 엑손들 사이(88-99%)의 높은 상동성은 이들이 유전자 중복(genomic duplication)에 의해 발생된 것임을 암시한다. 상기 유전자 산물들은 초기 AMD에서 브루크막(Bruch's membrane)과 망막 색소 상피 사이에서 발생하는 드루젠(drusen)의 형성에 관계된 단계적 반응인 보체 활성의 조절에 관여한다1.
본 발명의 요약
AMD의 유전적 요소들의 증거에도 불구하고, 질환 감수성을 테스트하기 위한 용도로 사용되고/되거나 AMD를 예방 및/또는 치료하는 수단으로 사용될 수 있는 특정 유전 마커들이 동정되지 않았다.
본 발명의 제1 측면에 의하면, 본 발명은 AMD의 예방 및/또는 치료용의 약물을 제공하는데, 상기 약물은 유전자 CFHL1 및/또는 유전자 CFHL3 중 적어도 하나를 전체적 또는 부분적으로 사일런싱하는 하나 이상의 억제제를 포함한다.
CFHR1의 참조 서열: NM 002113.2
CFHR1 mRNA 뉴클레오타이드 서열(993 nt): (서열번호 1)
Figure 112009001425858-PCT00001
해독(330 aa): (서열번호 2)
Figure 112009001425858-PCT00002
본원에 사용되는 바와 같이, "유전자(gene)"란 용어는 폴리펩타이드 또는 전구체를 생성하기 위하여 필요한 코딩 서열들을 포함하는 핵산(예, DNA) 서열을 의미한다. 상기 폴리펩타이드는 전장(full-length) 폴리펩타이드이든 단편이든 원하는 활성이나 기능적 특성(예, 효소적 활성, 리간드 결합, 신호 전달 등)이 유지되기만 한다면, 전장 코딩 서열 또는 상기 코딩 서열의 일부에 의하여 코딩될 수 있다. 상기 "유전자"는 유전자의 cDNA 및 게놈 형태 모두를 포함한다. 유전자의 게놈 형태 또는 클론은 "개재 영역(intervening region)" 또는 "개재 서열"로 불리는 비-코딩 서열로 간섭되는 코딩 영역을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "유전자 사일런싱(gene silencing)"이란 용어는 유전자의 기능이 완전히 또는 부분적으로 억제된 현상을 의미한다. 본원 전반에 걸쳐, 유전자 전사의 감소, 단백질 발현의 감소 또는 발현된 단백질 기능의 감소와 관련하여 사용되는 경우, "사일런싱(silencing)", "간섭(inhibition)", "쿠웰링(quelling)", "넉아웃(knockout)" 및 "억제(suppression)"란 용어들이 상호 교환되어 사용될 수 있다.
AMD의 예방이란 한 개체가 후일에 AMD에 걸리게 될 위험성을 감소시키는 것을 의미한다. AMD의 치료란 한 개체의 AMD의 진행을 늦추고/늦추거나 AMD의 증상을 호전시키는 것이다.
본 발명의 적어도 하나의 억제제는 RNAi를 포함할 수 있다.
RNAi
RNA 간섭(RNAi) 또는 전사후 유전자 사일런싱(PTGS)은 이중가닥 RNA가 강력하고 특이적인 유전자 사일런싱을 유도하는 작용이다. RNAi는 RNA-유도된 사일런싱 복합체(RISC)에 의해 매개되는데, 상기 RISC는 사일런싱 트리거(trigger)와 상동인 메신저 RNA를 파괴하는 서열-특이적이며 복합구성요소를 갖는 핵산분해 효소이다. 상기 RISC는 이중가닥 RNA 트리거로부터 유래된 짧은 RNA(약 22 뉴클레오타이드)를 포함한다고 알려져 있다.
일 측면에서, 본 발명은 포유류 내의, 바람직하게는 인간 숙주 내의 표적 유전자, CFHL1 또는 CFHL3의 발현을 바람직하게 감소시키기 위하여 RNAi 제제를 이용하는 방법을 제공한다. 발현을 감소시킨다는 의미는 표적 유전자 또는 코딩 서열의 발현양이 대조군에 비하여 적어도 약 2배, 대개 적어도 약 5배, 예를 들어, 10배, 15배, 20배, 50배, 100배 또는 그 이상 감소되거나 억제됨을 의미한다. 특정 구현예에서, 표적 유전자의 발현은 CFHL1 또는 CFHL3 유전자/코딩 서열의 발현이 효과적으로 억제되는 정도로 감소된다. 표적 유전자의 발현을 조절한다라는 의미는 가령 게놈 DNA, mRNA와 같은 코딩 서열을 단백질, 산물과 같은 폴리펩타이드로 해독함을 변형하는 것, 예를 들어 감소시키는 것을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서 사용될 수 있는 상기 RNAi 제제는 작은 리보핵산 분자들(또한, 본원에서 간섭 리보핵산으로 명명됨)이며, 이들은 이중 구조로 존재하는데, 예를 들어, 서로 혼성화된(hybridized) 2개의 각각의 올리고리보뉴클레오타이드나 또는 이중 구조를 만드는 작은 헤어핀 형태를 취하는 단일 리보올리고뉴클레오타이드로 존재한다. 바람직한 올리고리보뉴클레오타이드는 길이가 100 nt 이하의 리보핵산, 통상적으로 75 nt 이하의 리보핵산이다. 상기 RNA 제제가 siRNA인 경우, 상기 이중 구조의 길이는 통상적으로 약 15 내지 30 bp, 대개는 약 20 내지 29 bp이며, 가장 바람직하게는 21 bp이다. 상기 RNA 제제가 헤어핀 형태 내에 존재하는 단일 리보핵산, 즉, shRNA의 이중 구조인 경우, 상기 헤어핀의 혼성화된 부분의 길이는 siRNA 형태의 제제에 대하여 상술한 바와 동일하거나 4-8 뉴클레오타이드 더 길다.
특정 구현예에서, RNAi 제제가 상술한 바와 같은 siRNA 또는 shRNA 등의 간섭 리보핵산이 되는 대신에, 상기 RNAi 제제가 간섭 리보핵산을 코딩할 수 있다. 이들 구현예에서, 상기 RNAi 제제는 통상적으로 간섭 리보핵산을 코딩하는 DNA이다. 상기 DNA는 벡터 내에 존재할 수 있다.
상기 RNAi 제제는 당해 분야의 공지된 적절한 프로토콜을 사용하여 숙주 내로 투여될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 감염, 마이크로인젝션, 소낭(vesicle)의 융합, 입자 분사 또는 유체역학적 핵산 투여에 의해 핵산들이 조직이나 숙주 세포 내로 주입될 수 있다.
DNA 의존성 RNA 간섭(ddRNAi)은 본 발명의 방법들에 사용될 수 있는 RNAi 기술이다. ddRNAi는 미국 특허 제6,573,099호 및 영국 특허 제2353282호에 개시되어 있다. ddRNAi는 이중가닥 RNA(dsRNA)의 생성을 유발하기 위하여 세포 내로 DNA 구축물을 도입하는 단계를 포함하는, RNAi를 유발하는 방법인데, 상기 dsRNA는 그후 RNAi 프로세스의 일부로서 작은 간섭 RNA(siRNA)로 절단된다. ddRNAi 발현 벡터는 포유동물 세포 내에 주입된 siRNA 표적 서열의 발현을 위하여, 일반적으로 RNA 중합효소 III 프로모터(예, U6 또는 H1)를 사용한다. ddRNAi 발현 카세트 시스템으로부터 생성된 siRNA 표적 서열은 U6 프로모터를 포함하지 않는 벡터 내로 직접 복제될 수 있다. 대안적으로, 헤어핀 siRNA 표적 서열을 포함하는 짧은 단일가닥 DNA 올리고들이 벡터 내에 pol III 프로모터의 하류 위치에 어닐링(annealing)되고 복제될 수 있다. ddRNAi 발현 벡터들의 가장 큰 장점은 장기적인 간섭 효과를 가능하게 하며, 세포 내의 자연적인 인터페론 반응을 최소화하는 점이다.
AMD와 관련된 유전 요소들의 창안자들에 의한 신규하고 독창적인 판정법을 따라 당해 분야의 전문가들에 의해 응용될 수 있도록, siRNA의 고안 및 사용과 관련한 적절한 방법론의 예들은 Soutschek J, Akinc A, Bramlage B, Charisse K, Constien R, Donoghue M, Elbashir S, Geick A, Hadwiger P, Harborth J, John M, Kesavan V, Lavine G, Pandey RK, Racie T, Rajeev KG, Rohl I, Toudjarska I, Wang G, Wuschko S, Bumcrot D, Koteliansky V, Limmer S, Manoharan M, Vornlocher HP의 2004년 발표된 논문인, 변형된 siRNA들의 단계적 투여에 의한 내인성 유전자의 치료적 사일런싱(Nature 432(7014):173-178)에 의해 제공된다. 상기 논문은 마우스 및 인간의 HepG2 간 세포 내의 apoB를 타겟으로 하여, apoB mRNA 및 단백질 발현양을 감소시키는 능력을 보이는 84개의 siRNA들의 선별에 대하여 논의한다. 가장 효과적인 siRNA 2개는 화학적으로 수식되고 콜레스테롤에 결합된 것들인데, 이들은 체내 및 체외에서 siRNA에 개선된 약학적 특성을 부여하는 것으로 밝혀졌다. 이들 siRNA들은 마우스 내에 정맥 주사된 후, 간 및 공장(jejunum)(apo B가 발현되는 최초 장소)에서 apoB mRNA를 감소시키고, apoB 단백질의 혈장 농도를 감소시키며, 총 콜레스테롤을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. apoB mRNA는 현행 RNAi의 모델에 의해 예측된 위치인, siRNA 안티센스 사슬의 5' 말단의 10 nt 하류 지점에서 특이적으로 절단되었음이 밝혀졌다.
안티센스 RNA
본 발명에 사용되는 CFHL1 또는 CFHL3 억제제들은 RNA와 같은 안티센스 분자들을 발현하는 안티센스 분자들 또는 핵산 구축물들일 수 있다. 상기 안티센스 분자들은 천연적인 것이거나 합성된 것일 수 있다. 합성 안티센스 분자들은 천연적인 핵산으로부터 화학적으로 수식된 것일 수 있다. 안티센스 서열은 표적 CFHL1 또는 CFHL3 유전자의 mRNA에 상보적이며, 표적 유전자 산물의 발현을 억제한다. 안티센스 분자들은 다양한 메커니즘, 예를 들어, 해독에 필요한 mRNA의 양을 줄이거나, RNAse H의 활성화를 통하거나 또는 입체 장애(steric hindrance)를 통하여 유전자 발현을 억제한다. 안티센스 분자들의 하나 또는 조합이 투여될 수 있으며, 상기 조합은 다수의 다른 서열들을 포함할 수 있다.
안티센스 분자들은 적절한 벡터 내의 CFHL1 유전자 또는 CFHL3 유전자의 전체 또는 일부가 발현함으로써 생성될 수 있는데, 여기에서 전사는 안티센스 사슬이 RNA 분자로 생성되는 방향으로 개시된다. 대안적으로, 상기 안티센스 분자는 합성 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 대개 적어도 약 7개, 일반적으로 적어도 약 12개, 보다 일반적으로는 적어도 약 16개의 뉴클레오타이드를 갖는 길이이며, 일반적으로 약 50개 이하, 바람직하게는 약 35개 이하의 뉴클레오타이드를 갖는 길이가 될 것이다.
내인성 CFHL1 또는 CFHL3 센스 사슬 mRNA 서열의 특이적 영역 또는 영역들은 안티센스 서열에 의하여 상보적이 되도록 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 안티센스 서열은 하기 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 및 바람직하게는 적어도 100%의 서열 일치성을 갖는 뉴클레오타이드 서열에 상보적일 수 있다:
CFH: taaggtggacagccaaacagaagctttattcgagaacaggtgaatcagttgaatttgtgtg(서열번호 3) 또는
CFHR1: taaggtggacagccaaacagaagctttatttgagaacaggtgaatcagctgaatttgtgtg(서열번호 4).
(뉴클레오타이드 염기가 다른 것은 밑줄로 표시하였음)
바람직하게는, 억제제의 일 구현예는 ttcaGctgattcacctgttctcAaat(서열번호 5)를 포함하거나 상기의 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 100%의 서열 일치성을 갖는 서열과 같은 CFHR1에 상보적인 안티센스 서열일 수 있다.
올리고뉴클레오타이드에 대한 특정 서열의 선택은 실험적인 방법을 통하여 결정될 수 있는데, 몇몇 후보 서열들이 체외 또는 동물 모델에서 표적 유전자의 발현 억제에 대하여 평가된다. 서열들의 조합도 또한 사용될 수 있는데, mRNA 서열의 몇몇 영역들이 안티센스와의 상보성을 위하여 선택된다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 당해 분야의 공지된 방법으로 화학적으로 합성될 수 있다(참조: Wagner 등 (1993), supra, and Milligan 등, supra.). 바람직한 올리고뉴클레오타이드는 그들의 세포내 안정성 및 결합 친화도를 증가시키기 위하여 천연적인 포스포다이에스터 구조로부터 화학적으로 수식된다. 다수의 이러한 수식들이 문헌에 개시되어 있는데, 이는 주사슬, 당 또는 헤테로사이클릭 염기의 화학구조를 변형한다. 주사슬 화학구조의 유용한 변화들 가운데, 포스포로다이아미데이트 결합, 메틸포스포네이트 포스포로싸이오에이트; 브릿지 결합을 하지 않는 산소들 모두가 황으로 치환된 포스포로다이싸이오에이트; 포스포로아미다이트; 알킬포스포트라이에스터 및 보라노포스페이트가 있다. 아키랄(achiral) 포스페이트 유도체들은 3'-O-5'-S-포스포로싸이오에이트, 3'-S-5'-O-포스포로싸이오에이트, 3'-CH2-5'-O-포스포네이트 및 3'-NH-5'-O-포스포로아미데이트를 포함한다. 펩타이드 핵산들은 전체 리보스 포스포다이에스터 주사슬을 펩타이드 결합으로 치환할 수 있다. 또한, 당의 수식도 안정성 및 친화성을 증가시키기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 제2 측면에 의하면, 본 발명은 약물 내의, 유전자 CFHL1 및/또는 유전자 CFHL3 중 적어도 하나를 전체적 또는 부분적으로 사일런싱하는 적어도 하나의 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명의 제3 측면에 의하면, 본 발명은 AMD의 치료를 위한 약물의 제조에 있어서, 유전자 CFHL1 및/또는 유전자 CFHL3 중 적어도 하나를 전체적 또는 부분적으로 사일런싱하는 적어도 하나의 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명의 제4 측면에 의하면, 본 발명은 유전자 CFHL1 및/또는 유전자 CFHL3 중 적어도 하나를 전체적 또는 부분적으로 사일런싱하는 적어도 하나의 억제제를 이를 필요로 하는 환자에게 제공하는 단계를 포함하는 AMD 치료방법을 제공한다.
본 발명의 제2, 제3 및 제4 측면들의 특정 구현예에서, 적어도 하나의 억제제는 본원에 논의된 바와 같은 안티센스 분자 또는 RNAi일 수 있다.
본 발명의 제1, 제2, 제3 및 제4 측면들의 특정 구현예에서, 유전자 CFHL1 및/또는 유전자 CFHL3 중 적어도 하나를 전체적 또는 부분적으로 사일런싱하는 적어도 하나의 억제제는 다른 치료제와 조합으로 제공될 수 있다.
본 발명의 제1, 제2, 제3 및 제4 측면들의 특정 구현예에서, 유전자 CFHL1 및/또는 유전자 CFHL3 중 적어도 하나를 전체적 또는 부분적으로 사일런싱하는 적어도 하나의 억제제는 항-VEGF 치료제와 조합으로 제공될 수 있다.
항-VEGF 치료제는 신생 혈관의 형성을 돕는 단백질인 VEGF(혈관내피 성장인자: vascular endothelial growth factor)를 표적으로 한다. AMD에서, 신생 혈관이 불안정하여 망막 아래에 체액 및 혈액이 누수되는 경향이 있음이 보고되어 왔다. 이는 비가역적인 시력 손상을 가져오는 흉터가 되는 것으로 생각된다. AMD의 경우에 항-VEGF 치료제는 신생 혈관의 성장을 억제함으로써 흉터가 생길 위험성을 최소화하는 것으로 인식되고 있다.
항-VEGF 치료제는 예를 들어, 마큐젠(Macugen), 아바스틴(Avastin), 루센티스(Lucentis) 등을 포함한다.
바람직하게는, 유전자 CFHL1 및/또는 유전자 CFHL3 중 적어도 하나를 전체적 또는 부분적으로 사일런싱하는 적어도 하나의 억제제는 환자의 흡연 가능성을 최소화하는 약물, 예를 들어, 챔픽스(Champix), 부프로피온(bupropion) 등과 같은 약물과 조합하여 제공될 수 있다.
치료
"치료"는 인간 또는 비-인간 동물에 이로움을 줄 수 있는 특정 투약 계획을 포함한다. 상기 치료는 AMD 상태가 지속되고 있다는 관점에서 이루어지거나 또는 보호의 관점(예방 치료)에서 이루어질 수 있다. 치료는 AMD의 치료 효과, 경감 효과 또는 예방 효과들을 포함할 수 있다.
투여
본 발명에 사용되는 CFHL1 및 CFHL3 억제제들은 어떤 적절한 방법으로 투여될 수 있다. 또한, 이들은 조합으로 사용되거나, 다른 치료제와 병행하여 사용될 수 있다. 이러한 구현예에서, 본 발명의 억제제들 또는 조성물들은 다른 화학요법 제제와 동시 투여, 개별 투여 또는 순차적 투여될 수 있다.
개별적 또는 순차적으로 투여되는 경우, 이들은 서로 어떤 적절한 시간 간격, 예를 들어, 1, 2, 3, 6, 12, 24, 48 또는 72시간 내에 투여될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 이들은 6시간 내, 바람직하게는 2시간 내, 보다 바람직하게는 1시간 내, 가장 바람직하게는 20분 내 투여된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 억제제들 및/또는 조성물들은 약제학적 조성물로 투여되는데, 이는 일반적으로 목적하는 투여 경로에 따라 선택된 적절한 약제학적 부형제, 희석제 또는 담체를 포함할 것이다.
본 발명의 억제제들 및/또는 조성물들은 어떤 적절한 경로를 통하여 치료를 요하는 환자에게 투여될 것이다.
표적 치료는 항체 또는 세포 특이적 리간드와 같은 표적 시스템을 사용함으로써, 활성 제제를 특정 종류의 세포에 보다 특이적으로 전달하는데 사용될 수 있다. 표적 치료는 다양한 전제들, 예를 들어, 제제가 허용 불가능할 정도로 독성이 있는 것은 아닌지, 또는 너무 높은 용량을 요구하지는 않는지, 또는 표적 세포로 진입할 수 없는 것은 아닌지에 대하여 바람직한 결과를 가질 수 있다.
정맥 내 주사 또는 원인 부위에서의 주사에 대하여, 활성 성분은 발열원이 없고 적절한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용가능한 수용액 형태를 취할 것이다. 당해 분야의 적절한 기술을 가진 자들은 예를 들어, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 젖산염 링거 주사액과 같은 등장 매개물을 사용하여 적절한 용액을 잘 제조할 수 있다. 필요한 경우, 보존제, 안정제, 완충액, 항산화제 및/또는 다른 첨가물이 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면의 약물을 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.
경구용 투여를 위한 약제학적 조성물은 태블릿, 캡슐, 파우더 또는 액상의 형태를 취할 수 있다. 태블릿은 젤라틴 또는 보조제와 같은 고상의 담체를 포함할 수 있다. 액상의 약제학적 조성물은 일반적으로 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 미네랄 오일 또는 합성 오일과 같은 액상의 담체를 포함한다. 생리학적 식염수, 포도당 또는 다른 단당류 용액, 또는 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜과 같은 글리콜이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 억제제들 및/또는 조성물들은 마이크로스피어(microsphere), 리포좀 또는 다른 미립자 전달 시스템을 통하여 투여되거나 혈액을 포함하는 특정 조직 내에 위치되어 지속적으로 방출되는 제형으로 투여될 수도 있다. 지속적 방출 담체의 적절한 예들은 좌약이나 미소 캡슐과 같은 공유된 품목의 형태의 반투과성 폴리머 기질을 포함한다. 이식가능하거나 미소 캡슐 형태의 지속적 방출 기질은 폴리락타이드(미국특허 제3,773,919호; EP-A-0058481); L-글루타민산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 코폴리머(Sideman 등, 바이오폴리머 22(1): 547-556, 1985), 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 에틸렌비닐아세테이트(Langer 등, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277, 1981 및 Langer, Chem. Tech. 12:98-105, 1982)를 포함한다. 폴리펩타이드를 포함하는 리포좀들은 하기의 공지된 방법들로 제조된다: DE 3,218,121A; Epstein 등, PNAS USA, 82: 3688-3692, 1985; Hwang 등, PNAS USA, 77: 4030-4034, 1980; EP-A-0052522; E-A-0036676; EP-A-0088046; EP-A-0143949; EP-A-0142541; JP-A-83-11808; 미국특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호. 대개, 상기 리포좀들은 작은(약 200-800 Å) 단일 이중층 형태인데, 지질 함량이 약 30몰% 콜레스테롤 이상이며, 선택된 비율은 폴리펩타이드의 최적 누출 속도에 맞추어 조절된다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 상술한 기술과 방법들 및 다른 기술과 방법들의 예들은 레밍턴의 약학 과학(제16판, Oslo, A.(ed), 1980)에서 찾아볼 수 있다.
약제학적 조성물
본 발명에 따른 약제학적 조성물 및 본 발명에 따른 용도로 사용되는 약제학적 조성물은 활성 성분 이외에, 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 완충액 안정제 또는 당업자들에 공지인 다른 물질들을 포함할 수 있다. 상기 물질들은 독성이 없어야 하며, 활성 성분의 효력을 방해하여서는 안된다. 담체 또는 다른 물질의 정밀한 속성은 경구 투여용 또는 정맥 주사와 같은 주사 투여용 등의 투여 경로에 따라 좌우될 것이다.
제형은 예를 들어, pH 6.8-7.6의 비-인산 완충액을 포함하는 생리염용액과 같은 액상이거나 또는 동결건조된 분말일 수 있다.
약량
본 발명의 억제제들 또는 조성물들은 개체에 "치료학적으로 유효한 양"으로 바람직하게 투여되는데, 이는 각 개체에 도움을 주기에 충분한 양이다. 실제로 투여되는 양 및 투여의 속도와 시간 주기는 치료 대상의 속성 및 중증도에 좌우될 것이다. 치료의 처방, 예를 들어 투여량 등에 관한 결정은 일반 개업의 및 다른 의사들의 책임 및 재량 하에 최종적으로 이루어지며, 통상적으로 치료 대상 질환, 개별 환자의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 일반의에 알려져 있는 다른 변수들을 고려한다.
본 발명자는 AMD와 연관된 유전자들의 신규 다형성(polymorphism)을 결정하였으며, 따라서 본 발명의 제5 측면은 하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 분리된(isolated) 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 프로브(probe)이다:
SNP
번호 SNP 명
1 rs1292487
2 rs512900
3 rs7524776
4 rs529825
5 rs800292
6 rs1329424
7 rs1061147
8 rs1061170
9 rs10801555
10 rs2019727
11 rs2019724
12 rs203685
13 rs1831281
14 rs2274700
15 rs6677604
16 rs3753396
17 rs419137
18 rs2284664
19 rs1065489
20 rs10801560
21 rs460897
22 rs432007
23 rs438781
24 rs408519
25 rs6428372
26 rs10922147
27 rs1971579
28 rs4085749
29 rs10922152
30 rs5998
바람직하게는, 상기 적어도 하나의 프로브는 하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다:
5 rs800292
8 rs1061170
15 rs6677604
16 rs3753396
17 rs419137
18 rs2284664
본원에 사용된 바와 같이, "하나 이상의 다형성을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열"이란 말은 본 발명의 SNP를 포함하며, 천연적인 핵산 공급원에 존재하는 다른 핵산과는 별개의 것이다.
분리된 폴리뉴클레오타이드 서열은 mRNA와 같은 RNA 형태, 또는 게놈 NDA나 cDNA를 포함하는 DNA 형태일 수 있다. 대안적으로, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 화학적 합성 방법으로 수득될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 이중가닥 또는 단일가닥일 수 있다.
AMD의 질환 표현형을 갖는 특정 SNP들의 기여 또는 협력은 SNP들로 하여금 검출가능한 특성을 발현하는 개인들을 식별할 수 있는 우수한 진단 시험을 개발하는데 사용될 수 있도록 하고, 이들이 장차 AMD가 진행될 위험성이 증가될 지/감소될 지를 판정한다. 진단은 단일 SNP 또는 SNP 군들에 기초할 수 있다. 복수의 SNP들을 결합하여 검출하게 되면 정확한 진단을 내릴 확률이 일반적으로 증가한다.
AMD와 관련된 개체를 진단하고, 감수성을 예측하거나 개체를 모니터링하기 위한, 특정 SNP들/일배체형(haplotype)의 유무는 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 개체의 샘플로부터 핵산을 효소적으로 증폭하고, 그후 DNA 서열을 분석하는 방법, 프라이머 신장 방법 또는 질량 분석법을 포함하는 방법들을 사용하여 결정될 수 있다.
질환을 가진 환자 및 정상적인 대조군들의 관계 연구는 어느 다형성 및/또는 일배체형이 질환을 예방하거나 질환의 위험성을 증가시키는 지를 알려줄 수 있다.
당해 분야의 숙련자들에 의해 이해되는 바와 같이, 특정 SNP들이 본원에 예시되어 있으며, 대체 SNP들이 각각의 유전좌위의 일배체형 구조를 규정하는데 사용될 수 있고, 상기 대체 SNP들은 규정된 것들과 완전한 연관불균형(linkage disequilibrium) 상태에 있다.
국제 단일형지도맵(HapMap) 프로젝트 및 다른 게놈 서열의 성과들은 공통의 일배체형에 대한 다형성의 패턴을 밝혔다. 다형 변이들의 가끔씩의 다른 조합들은 개체의 전체 일배체형 정보를 수득하기 위한 전형이 될 수 있다. 이들 마커들의 조합들은 일배체형 표지(tagging) 다형성으로 알려져 있다.
본 발명의 제6 측면에 의하면, 본 발명은 개체의 노인성 황반변성을 진단 및/또는 모니터링하기 위한 진단 키트를 제공하며, 상기 진단 키트는 하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 대한 결합 특이성을 갖거나:
SNP
번호 SNP 명
1 rs1292487
2 rs512900
3 rs7524776
4 rs529825
5 rs800292
6 rs1329424
7 rs1061147
8 rs1061170
9 rs10801555
10 rs2019727
11 rs2019724
12 rs203685
13 rs1831281
14 rs2274700
15 rs6677604
16 rs3753396
17 rs419137
18 rs2284664
19 rs1065489
20 rs10801560
21 rs460897
22 rs432007
23 rs438781
24 rs408519
25 rs6428372
26 rs10922147
27 rs1971579
28 rs4085749
29 rs10922152
30 rs5998
또는, 하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의하여 코딩되는 분자에 결합 특이성을 갖는 검출 시약을 포함한다.
SNP
번호 SNP 명
1 rs1292487
2 rs512900
3 rs7524776
4 rs529825
5 rs800292
6 rs1329424
7 rs1061147
8 rs1061170
9 rs10801555
10 rs2019727
11 rs2019724
12 rs203685
13 rs1831281
14 rs2274700
15 rs6677604
16 rs3753396
17 rs419137
18 rs2284664
19 rs1065489
20 rs10801560
21 rs460897
22 rs432007
23 rs438781
24 rs408519
25 rs6428372
26 rs10922147
27 rs1971579
28 rs4085749
29 rs10922152
30 rs5998
특정 구현예에서, 상기 키트는 하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 대한 결합 특이성을 갖거나;
SNP
번호 SNP 명
1 rs1292487
2 rs512900
3 rs7524776
4 rs529825
5 rs800292
6 rs1329424
7 rs1061147
8 rs1061170
9 rs10801555
10 rs2019727
11 rs2019724
12 rs203685
13 rs1831281
14 rs2274700
15 rs6677604
16 rs3753396
17 rs419137
18 rs2284664
19 rs1065489
20 rs10801560
21 rs460897
22 rs432007
23 rs438781
24 rs408519
25 rs6428372
26 rs10922147
27 rs1971579
28 rs4085749
29 rs10922152
30 rs5998
또는 상기 폴리뉴클레오타이드 서열들 중 적어도 하나에 의해 코딩되는 폴리펩타이드에 대한 결합 특이성을 갖는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 10개, 적어도 15개의 검출 시약들을 포함한다.
바람직하게는, 하나 이상의 검출 시약은 하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 대한 결합 특이성을 갖는다.
5 rs800292
8 rs1061170
15 rs6677604
16 rs3753396
17 rs419137
18 rs2284664
바람직하게는, 상기 검출 시약은 본원에서 동정된 1 내지 30번의 SNP들 중 임의의 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열이거나 또는 유전 마커들의 일배체형 구조를 규정하는 SNP들과 완전한 연관불균형 상태에 있는 대체 SNP들에 상보적인 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
상보적이라는 것은 검출 시약이 뉴클레오타이드 서열인 경우, 1 내지 30번의 SNP들 중 어느 하나를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 적어도 엄격 조건(stringent condition) 하에서 혼성화함을 의미한다.
곧 이해되는 바와 같이, 특정 SNP들에 대한 기준이 만들어진 경우, 핵산은 이중가닥 분자일 수 있으므로, 한 가닥 상의 SNP에 대한 기준은 상보적인 가닥 상의 해당 위치를 또한 적용할 것이다. 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머는 이중가닥 중 어느 한 가닥과 혼성화하도록 고안될 수 있다.
특정 구현예들에서, 상기 검출 시약은 리포터가 표지되어 있다.
특정 구현예들에서, 상기 리포터는 형광이다.
특정 구현예들에서, 상기 검출 시약은 고상의 지지체에 결합된다.
특정 구현예들에서, 상기 검출 시약은 종이, 나일론, 필터 또는 멤브레인, 칩, 유리 슬라이드를 포함하는 고상의 기판에 개별적인 분자들의 어레이(array)로서 결합된다. 특정 구현예들에서, 상기 검출 시약은 고상의 지지체 상에서 합성된다. 어레이는 미국특허 제5,837,832호 및 PCT 출원 WO 95/1995에 개시된 방법에 따라 제공되고 이용된다.
특정 구현예들에서, 상기 검출 시약은 상기 폴리뉴클레오타이드 서열들의 어레이이며, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 컴퓨터 칩 상에 고정되고, 샘플로부터의 핵산이 상기 어레이에 혼성화되는 것은 컴퓨터로 처리되는 기술을 사용하여 검출될 수 있다.
따라서, 본 발명의 제7 측면은 하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 적어도 2개의 유전 마커들과 혼성화할 수 있는 적어도 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열들을 포함하는 적어도 하나의 어레이를 제공한다.
SNP
번호 SNP 명
1 rs1292487
2 rs512900
3 rs7524776
4 rs529825
5 rs800292
6 rs1329424
7 rs1061147
8 rs1061170
9 rs10801555
10 rs2019727
11 rs2019724
12 rs203685
13 rs1831281
14 rs2274700
15 rs6677604
16 rs3753396
17 rs419137
18 rs2284664
19 rs1065489
20 rs10801560
21 rs460897
22 rs432007
23 rs438781
24 rs408519
25 rs6428372
26 rs10922147
27 rs1971579
28 rs4085749
29 rs10922152
30 rs5998
바람직하게는, 상기 어레이는 하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 적어도 2개의 유전 마커들과 혼성화할 수 있는 적어도 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열들을 포함한다.
5 rs800292
8 rs1061170
15 rs6677604
16 rs3753396
17 rs419137
18 rs2284664
상기 어레이는 노인성 황반변성을 진단하거나 노인성 황반변성의 진행을 모니터링하기 위한 유전 마커들의 유무를 판정하기 위하여 개체로부터의 생물학적 샘플의 유전 특성을 결정함으로써 노인성 황반변성을 진단하는데 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 어레이는 하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 유전 마커들과 혼성화할 수 있는 3개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열들, 예를 들어 4개의 폴리뉴클레오타이드 서열들, 5개의 폴리뉴클레오타이드 서열들, 6개의 폴리뉴클레오타이드 서열들, 10개의 폴리뉴클레오타이드 서열들, 15개의 폴리뉴클레오타이드 서열들을 포함한다.
SNP
번호 SNP 명
1 rs1292487
2 rs512900
3 rs7524776
4 rs529825
5 rs800292
6 rs1329424
7 rs1061147
8 rs1061170
9 rs10801555
10 rs2019727
11 rs2019724
12 rs203685
13 rs1831281
14 rs2274700
15 rs6677604
16 rs3753396
17 rs419137
18 rs2284664
19 rs1065489
20 rs10801560
21 rs460897
22 rs432007
23 rs438781
24 rs408519
25 rs6428372
26 rs10922147
27 rs1971579
28 rs4085749
29 rs10922152
30 rs5998
상기 어레이와의 혼성화는 적절한 엄격도(stringency)를 제공하도록 선택된 조건들 하에서 수행될 수 있다. 숙련자는 특정 샘플에 대한 가장 적절한 엄격도를 선택하기 위하여 혼성화 조건을 바꾸는 기술을 잘 인지하고 있다. 예를 들어, 비-엄격한 세척 완충액 및 엄격한 세척 완충액을 사용하여, 당해 분야의 숙련자는 최적의 혼성화를 위하여, 각각의 세척 수(통상적으로 0-20), 세척 온도(통상적으로 15-50℃) 및 혼성화 온도(통상적으로 15-50℃)를 변경할 수 있다. 혼성화 조건들을 최적화하는 방법들은 당해 분야의 숙련자들에게 잘 알려져 있다(참조: 생화학 및 분자 생물학의 실험 방법, Vol. 24: 핵산 프로브와의 혼성화, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y., (1993)). 당해 분야의 숙련자는 특정 혼성화 절차에 대하여 최적의 혼성화 및 시그널 생성을 제공하고, 다른 유전자들이나 게놈 위치들 사이에 요구되는 분리능을 제공하기 위하여 혼성화 변수들을 조절할 수 있다.
그후, 생물학적 샘플 내, 엄격 조건 하에서 어레이 상의 상보적 서열과 혼성화하거나 결합된 전사물이 검출될 수 있다. 엄격 조건 하의 혼성화란 서로에 대하여 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 그 이상의 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열들이 서로 혼성화되어 있는 조건들을 기술하는 것으로 의도된다. 이러한 엄격 조건들은 예를 들어, 분자 생물학의 최근 프로토콜, John Wiley & Sons, N.Y. (1989)와 같이 당해 분야의 숙련자들에게 잘 알려져 있다. 혼성화 반응의 "엄격도(stringency)"는 당해 분야의 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염의 농도에 좌우되는 실험적인 계산값이다. 대개, 프로브가 길면 적정 어닐링을 위해 보다 높은 온도가 필요한 반면, 프로브가 짧으면 보다 낮은 온도를 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로, 상보 가닥들이 그들의 융점 아래의 환경에 놓이게 되는 경우 변성된 DNA가 재어닐링을 할 수 있는 능력에 좌우된다. 프로브 및 혼성화가능한 서열 사이의 상동성의 기대 정도가 클수록, 사용될 수 있는 상대 온도가 커진다. 그 결과, 더 높은 상대 온도는 반응 조건을 보다 엄격하게 만드는 경향이 있는 반면, 더 낮은 온도는 반응 조건을 보다 덜 엄격하게 한다. 혼성화 반응의 부가적인 상세한 기술 및 설명은 하기 문헌을 참조하라: Ausubel 등, 분자 생물학의 최근 프로토콜, Wiley Interscience Publishers, (1995).
본원에 정의된 바와 같이, "엄격 조건들(stringent conditions)"은 하기들과 같을 수 있다: (1) 세척용으로 낮은 이온 강도 및 높은 온도를 사용하는데, 예를 들어 50℃에서, 0.015M 염화나트륨/0.0015M 시트르산나트륨/0.1% 도데실황산나트륨 사용하고; (2) 혼성화동안 포름아마이드와 같은 변성제를 사용하는데, 예를 들어 42℃에서, 하기들: 0.1% 소혈청알부민/0.1% 피콜(Ficoll)/0.1% 폴리비닐피롤리돈/750mM의 염화나트륨 및 75mM의 시트르산나트륨이 첨가된 pH 6.5의 50mM 인산나트륨 완충액을 포함하는 50%(v/v) 포름아마이드를 사용하고; 또는 (3) 42℃에서, 50% 포름아마이드, 5*SSC(0.75M NaCl, 0.075M 시트르산나트륨), 50mM 인산나트륨(pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5* 덴하트(Denhardt) 용액, 고주파 분쇄된 연어 정자 DNA(50[mu]g/㎖), 0.1% SDS 및 10% 황산덱스트란을 사용하고, 42℃에서 0.2*SSC(염화나트륨/시트르산나트륨)로 세척하며, 55℃에서 50% 포름아마이드를 사용한 후, 55℃에서 EDTA를 포함한 0.1*SSC로 구성된 고도의 엄격 세척을 한다.
"중간 정도의 엄격 조건들(moderately stringent conditions)"은 문헌[Sambrook 등, 분자 클로닝: 실험 매뉴얼, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기술된 바와 동일할 수 있으며, 상술한 엄격 조건들보다는 덜 엄격한 세척 용액 및 혼성화 조건들(예, 온도, 이온 강도 및 %SDS)의 사용을 포함한다. 중간 정도의 엄격 조건들의 예는 37℃에서 하룻밤 20% 포름아마이드, 5*SSC(150mM NaCl, 15mM 시트르산삼나트륨), 50mM 인산나트륨(pH 7.6), 5×덴하트 용액, 10% 황산덱스트란 및 20mg/㎖의 변성되고 파쇄된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 내에 정치하고, 그후 약 37-50℃에서 1*SSC로 필터들을 세척하는 것이다. 숙련자들은 프로브 길이 등과 같은 변수들을 수용하기에 필요한 온도, 이온 강도 등을 조절하는 방법을 분간할 것이다. 매우 엄격한 조건들은 상술한 바에 기초할 수 있으나, 추가로 최종 세척시 약 50℃에서 2*SSC로 필터들을 세척할 수 있다. 보다 더 엄격한 조건들은 최종 세척시 약 65℃에서 6*SSC로 필터들을 세척할 수 있다.
어레이 내에 사용되는 핵산 서열들은 이에 제한되지는 않지만, RNA, DNA, 펩타이드 핵산 또는 이의 혼합물 및/또는 단편들을 포함하는 핵산 또는 핵산 유사체의 어떤 종류일 수 있다. 본원에 사용된 "단편(fragment)"이란 용어는 그 단편이 유래된 전체 서열에 대하여 단편이 특이성 및 선택성을 유지하도록 하는 충분한 핵산 서열을 보유하는, 본원에 제공된 바와 같은 서열의 일부인 핵산 서열을 의미한다.
특정 구현예에서, 다량의 DNA가 효력이 있는 경우, 게놈 DNA가 직접 사용될 수 있다. 대안적으로, 관심 대상의 영역이 적절한 벡터 내로 복제되고 분석을 위해 충분한 양으로 증식될 수 있다. 핵산 서열은 중합효소 연쇄 반응(PCR)과 같은 통상적인 방법으로 증폭될 수 있다(Saiki 등, (1985) Science 239:487). 프라이머들은 관심 대상의 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 증폭하는데 사용될 수 있다. 선택적으로, 검출가능한 표지, 예를 들어 플루오로크롬, 비오틴 또는 방사성 동위원소 표지가 이러한 증폭 반응에 사용될 수 있다. 상기 표지는 프라이머의 하나 또는 모두에 결합될 수 있다. 대안적으로, 상기 표지를 증폭 산물 내로 삽입시키기 위하여 증폭에 사용되는 뉴클레오타이드들의 풀(pool)이 표지된다.
샘플 핵산, 예를 들어 증폭되거나 복제된 핵산은 당해 분야에 공지된 임의의 적절한 방법을 사용하여 분석될 수 있다. 예를 들어, 상기 핵산은 디데옥시 또는 다른 방법들에 의하여 서열이 분석될 수 있으며, 염기들의 서열은 결손된 서열과 비교된다. 또한, 변이 서열과의 혼성화는 서던 블롯, 도트 블롯 등에 의하여 그 존재를 결정하는데 사용될 수 있다. WO95/35505호에 기술된 바와 같이, 고상의 지지체 상에 고정된 올리고뉴클레오타이드 프로브들의 어레이와의 대조군 및 변이 서열의 혼성화 패턴은 서열의 유무를 검출하는 수단으로 사용될 수 있다.
대안적으로, 당해 분야의 표준 방법들을 사용하는 경우, 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산의 존재 또는 그보다 상기 폴리펩타이드에 특이적인 항체가 사용될 수 있다. 또한, 상기 폴리펩타이드에 특이적인 항체의 존재는 상기 폴리펩타이드와의 면역 반응의 존재를 결정하는데 사용될 수 있다.
유전자의 형태로 세포 DNA가 RNA로 전사되고; 코딩 RNA는 단백질로 해독되며; 그리고, RNA는 선택적으로 cDNA로 역전사된다는 것은 당해 분야의 숙련자들에 의해 잘 이해된다.
특정 유전 마커들의 존재는 하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 검출함으로써 판정되거나;
SNP
번호 SNP 명
1 rs1292487
2 rs512900
3 rs7524776
4 rs529825
5 rs800292
6 rs1329424
7 rs1061147
8 rs1061170
9 rs10801555
10 rs2019727
11 rs2019724
12 rs203685
13 rs1831281
14 rs2274700
15 rs6677604
16 rs3753396
17 rs419137
18 rs2284664
19 rs1065489
20 rs10801560
21 rs460897
22 rs432007
23 rs438781
24 rs408519
25 rs6428372
26 rs10922147
27 rs1971579
28 rs4085749
29 rs10922152
30 rs5998
또는, 당해 분야에 알려진 임의의 수단을 사용하여 상기 폴리펩타이드와의 면역 반응을 검출함으로써 판정될 수 있다.
바람직하게는, 상기 수단은 예를 들어, ELISA 분석 또는 RIA를 포함한다.
일 구현예에서, 샘플 내의 폴리펩타이드의 존재가 판정될 수 있는데; 대안적으로 또는 부가적으로 상기 폴리펩타이드에 특이적인 항체의 존재가 판정될 수 있으며; 대안적으로 또는 부가적으로 상기 항체 또는 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 존재가 판정될 수 있다.
따라서, 본 발명의 보다 심화된 측면은 폴리펩타이드 어레이를 제공하는 것인데, 상기 폴리펩타이드 어레이는 하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 임의의 한 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩타이드들로 이루어지거나;
SNP
번호 SNP 명
1 rs1292487
2 rs512900
3 rs7524776
4 rs529825
5 rs800292
6 rs1329424
7 rs1061147
8 rs1061170
9 rs10801555
10 rs2019727
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14 rs2274700
15 rs6677604
16 rs3753396
17 rs419137
18 rs2284664
19 rs1065489
20 rs10801560
21 rs460897
22 rs432007
23 rs438781
24 rs408519
25 rs6428372
26 rs10922147
27 rs1971579
28 rs4085749
29 rs10922152
30 rs5998
또는, 하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 임의의 한 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩타이드들에 결합 특이성을 갖는 적어도 하나의 항체로 이루어진다.
SNP
번호 SNP 명
1 rs1292487
2 rs512900
3 rs7524776
4 rs529825
5 rs800292
6 rs1329424
7 rs1061147
8 rs1061170
9 rs10801555
10 rs2019727
11 rs2019724
12 rs203685
13 rs1831281
14 rs2274700
15 rs6677604
16 rs3753396
17 rs419137
18 rs2284664
19 rs1065489
20 rs10801560
21 rs460897
22 rs432007
23 rs438781
24 rs408519
25 rs6428372
26 rs10922147
27 rs1971579
28 rs4085749
29 rs10922152
30 rs5998
바람직하게는, 상기 어레이는 하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 임의의 한 폴리뉴클레오타이드 서열에 의하여 코딩되는 적어도 하나의 폴리펩타이드를 포함하거나;
5 rs800292
8 rs1061170
15 rs6677604
16 rs3753396
17 rs419137
18 rs2284664
또는, 하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 임의의 한 폴리뉴클레오타이드 서열에 의하여 코딩되는 폴리펩타이드들에 결합 특이성을 갖는 적어도 하나의 항체를 포함한다.
5 rs800292
8 rs1061170
15 rs6677604
16 rs3753396
17 rs419137
18 rs2284664
본원에 사용되는 경우, 항체는 당해 분야에 통용되는 용어로 정의되며 모노클론 항체, 폴리클론 항체, 상기 항체들의 단편들, 이에 제한되지는 않지만 Fab, F(ab') 및 Fv 단편들을 포함하는 단편들을 포함한다.
공지의 표적 펩타이드에 대한 항체들의 생성 및/또는 동정을 위한 많은 방법들이 알려져 있다. 당해 분야의 숙련자는 현행 기술들, 예를 들어 면역 반응을 생성하기 위하여, 분리된 펩타이드를 토끼, 랫 또는 마우스를 포함하는 포유동물 유기체에 제공하는 기술들은 적절한 항체들을 제공하는데 용이하게 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 당해 분야의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이, 모노클론 항체들은 하이브리도마에 의해 제조될 수 있다. 하이브리도마는 불사 능력을 갖는 세포주인데, 두가지 다른 종류의 세포를 사용하여 체외에서 만들어질 수 있으며, 두 세포 중 하나는 특정 모노클론 항체를 분비할 수 있는 세포를 만드는 종양 세포이다.
폴리펩타이드의 유무 또는 상기 폴리펩타이드와의 면역 반응의 유무를 검출하는 진단 및 분석 방법은 당해 분야에 알려져 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 유무는 상기 폴리펩타이드에 특이적인 항체의 사용으로 검출될 수 있다.
이용될 수 있는 방법들로는, 이에 제한되지는 않지만, ELISA, 면역조직화학, 전자 현미경, 라텍스 응집, 면역 블로팅, 면역 크로마토그래피, 면역칩, 측방유동 면역측정법 및 딥스틱(Dip Stick) 면역 시험법을 포함한다.
상기 ELISA 시험법(enzyme linked immunoenzymatic assay)은 혈청학 진단에 자주 사용된다. 이 방법은 생물학적 유체 내의 항원 또는 항체들의 확인 및 정량을 가능하게 한다. 통상적인 ELISA는 효소적 활성(페록시데이즈, 알칼리포스파테이즈 등) 분자와 결합된 제2 항체(항원과 반응하는 항체에 대한 항체)에 의하여 복합 항체-항원을 검출하는 방법이다.
라텍스 응집 분석법에서는, 항원을 라텍스 비드(bead)에 고정시켜 준비한다. 그후, 생물학적 샘플을 상기 라텍스 입자를 갖는 슬라이드 상에 직접 정치시킨다. 잠시 후, 반응을 검사하는데, 샘플 내 폴리펩타이드에 대한 항체들의 유무를 알려주는 교차결합되거나 응집된 라텍스 입자들의 존재를 검사한다.
면역칩은 본 발명의 특이적 유전 마커들의 유무를 판정하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 항원에 대한 특이 항체를 변환기, 예를 들어, 전극, 칼로리 미터, 압전 결정, 표면 플라즈몬 공명 변환기, 표면 음향 공명 변환기 또는 다른 광 검출 장치 상에 고정시킨다. 생물학적 샘플 내의 항원이 상기 고정된 특이 항체에 결합하는 것을 전기 신호의 변화로 검출한다.
면역성의 항원의 존재는 항원을 코딩하는 핵산 또는 상기 항원에 대하여 증가된 항체를 코딩하는 핵산을 검출함으로써 파악될 수 있다. 이러한 기술들은 당해 분야에 잘 알려져 있다.
본 발명자에 의한, AMD와 연관된 다형성들의 판정 또한 개체 내의 AMD 진단에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 심화된 측면은 개체 내의 노인성 황반변성에 대한 감수성을 진단하거나 예측하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:
상기 개체로부터의 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
상기 생물학적 샘플 내의 적어도 하나의 유전 마커의 유무를 판정하는 단계로서, 상기 유전 마커는 하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 선택되거나,
SNP
번호 SNP 명
1 rs1292487
2 rs512900
3 rs7524776
4 rs529825
5 rs800292
6 rs1329424
7 rs1061147
8 rs1061170
9 rs10801555
10 rs2019727
11 rs2019724
12 rs203685
13 rs1831281
14 rs2274700
15 rs6677604
16 rs3753396
17 rs419137
18 rs2284664
19 rs1065489
20 rs10801560
21 rs460897
22 rs432007
23 rs438781
24 rs408519
25 rs6428372
26 rs10922147
27 rs1971579
28 rs4085749
29 rs10922152
30 rs5998
또는, 상기 유전 마커는 적어도 하나의 상기 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩타이드인 판정단계이며,
상기 유전 마커의 존재 및/또는 부재는 개체의 노인성 황반변성(AMD)이 진행될 위험도의 지표인 판정 단계.
바람직하게는, 상기 유전 마커들은 상기 동정된 다형성들을 사용하여 검출된다.
바람직하게는, 상기 유전 마커는 하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 선택된다.
5 rs800292
8 rs1061170
15 rs6677604
16 rs3753396
17 rs419137
18 rs2284664
개체 내 질환 발병의 예측은 초기 개입 및 질병 관리, 예를 들어 카운셀링과 같은 환자 지원 서비스의 제공을 가능하게 한다. 따라서, 질병의 조기 검출은 환자 치료 및 관리를 조기에 가능하게 한다.
본 발명은 AMD의 발병을 판정하는데 사용될 수 있는 방법을 제공한다. 상기 방법은 노인성 황반변성의 진단에 통상적으로 사용되는 증상의 출현 전에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에서, AMD의 육체적인 증상이 없는 환자로부터의 생물학적 샘플이 제공될 수 있다.
어떤 적절한 생물학적 샘플이 본 발명의 방법들에 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 생물학적 샘플은 이에 제한되지는 않지만, 가래, 타액, 혈장, 혈액, 소변과 같은 생물학적 체액이나 조직의 절편과 같은 조직을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법들에서, 본 발명자는 복수의 유전 마커들, 예를 들어 적어도 2개의 유전 마커들, 적어도 3개의 유전 마커들, 적어도 4개의 유전 마커들, 적어도 5개의 유전 마커들, 적어도 6개의 유전 마커들, 적어도 10개의 유전 마커들, 적어도 15개의 유전 마커들의 유무를 시험함으로써, 질환 발병의 진단 또는 예측 방법의 민감도가 개선되었다고 생각한다.
본 발명의 바람직한 구현예들에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함한다:
개체로부터의 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
상기 생물학적 샘플 내의 2개 이상의 유전 마커들의 유무를 판정하는 단계로서, 상기 유전 마커는 하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 선택되거나,
SNP
번호 SNP 명
1 rs1292487
2 rs512900
3 rs7524776
4 rs529825
5 rs800292
6 rs1329424
7 rs1061147
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10 rs2019727
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12 rs203685
13 rs1831281
14 rs2274700
15 rs6677604
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19 rs1065489
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24 rs408519
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26 rs10922147
27 rs1971579
28 rs4085749
29 rs10922152
30 rs5998
또는, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열 중 적어도 하나에 의해 코딩되는 폴리펩타이드이며,
상기 유전 마커의 존재 및/또는 부재는 개체의 노인성 황반변성(AMD)이 진행될 위험도의 지표인 판정 단계.
바람직하게는, 상기 유전 마커들은 하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 선택된다.
5 rs800292
8 rs1061170
15 rs6677604
16 rs3753396
17 rs419137
18 rs2284664
본 발명의 심화적인 측면에 의하면, 본 발명은 초기 시점으로부터 후기 시점까지의 노인성 황반변성의 진행을 모니터링하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:
초기 시점에서 수득된 제1 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
상기 제1 생물학적 샘플 내의 적어도 하나의 유전 마커의 유무를 판정하는 단계로서, 상기 유전 마커는 하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 선택되거나,
SNP
번호 SNP 명
1 rs1292487
2 rs512900
3 rs7524776
4 rs529825
5 rs800292
6 rs1329424
7 rs1061147
8 rs1061170
9 rs10801555
10 rs2019727
11 rs2019724
12 rs203685
13 rs1831281
14 rs2274700
15 rs6677604
16 rs3753396
17 rs419137
18 rs2284664
19 rs1065489
20 rs10801560
21 rs460897
22 rs432007
23 rs438781
24 rs408519
25 rs6428372
26 rs10922147
27 rs1971579
28 rs4085749
29 rs10922152
30 rs5998
또는, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열 중 적어도 하나에 의해 코딩되는 폴리펩타이드인 판정 단계;
후기 시점에서 수득된 제2 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
상기 제2 생물학적 샘플 내의 적어도 하나의 유전 마커의 유무를 판정하는 단계로서, 상기 유전 마커는 하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 선택되거나:
SNP
번호 SNP 명
1 rs1292487
2 rs512900
3 rs7524776
4 rs529825
5 rs800292
6 rs1329424
7 rs1061147
8 rs1061170
9 rs10801555
10 rs2019727
11 rs2019724
12 rs203685
13 rs1831281
14 rs2274700
15 rs6677604
16 rs3753396
17 rs419137
18 rs2284664
19 rs1065489
20 rs10801560
21 rs460897
22 rs432007
23 rs438781
24 rs408519
25 rs6428372
26 rs10922147
27 rs1971579
28 rs4085749
29 rs10922152
30 rs5998
또는, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열 중 적어도 하나에 의해 코딩되는 폴리펩타이드인 판정 단계; 및
상기 제1 샘플에 대하여, 상기 제2 샘플 내의 상기 유전 마커 및/또는 폴리펩타이드의 존재 및/또는 부재를 비교하는 단계로서,
상기 제2 샘플과 비교하여, 상기 제1 샘플 내의 유전 마커 및/또는 폴리펩타이드의 존재 및/또는 부재의 차이는 AMD의 진행에 있어서 개체의 위험도 변화의 지표인 비교 단계.
바람직하게는, 상기 유전 마커들은 하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 선택된다.
5 rs800292
8 rs1061170
15 rs6677604
16 rs3753396
17 rs419137
18 rs2284664
본 발명의 방법들의 특정 구현예들에서, 상기 방법들은 상기 제1 및 제2 샘플들 내의 적어도 3개의 유전 마커들 및/또는 폴리펩타이드들, 적어도 4개의 유전 마커들 및/또는 폴리펩타이드들, 적어도 5개의 유전 마커들 및/또는 폴리펩타이드들, 적어도 6개의 유전 마커들 및/또는 폴리펩타이드들, 적어도 10개의 유전 마커들 및/또는 폴리펩타이드들, 적어도 15개의 유전 마커들 및/또는 폴리펩타이드들의 존재 및/또는 부재를 판정하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 특정 구현예들에서, 개체는 제1 및 제2 샘플을 제공한 시점 사이에 유효한 치료제를 제공받을 수 있으며, 각각의 생물학적 샘플의 유전 마커/폴리펩타이드의 검출은 노인성 황반변성에 관한 상기 유효한 치료제에 대하여, 상기 개체의 유효성 및 반응성에 관한 데이터와의 상관 관계가 입증될 수 있다.
바람직하게는, 이는 치료제들을 스크리닝하고 선택하기 위한 방법 및 또한, 특정 치료제에 대하여 반응을 하기 쉬운 개체들을 동정하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 약물에 대한 반응 또는 약물에 대한 비정상적인 작용에 있어서 상세한 유전적 편차를 제공하기 위하여 개체의 약물유전학적 감수성이 평가될 수 있다.
본 발명의 각 측면의 바람직한 특성 및 구현예들은 본문에서 달리 요구하지 않는 한, 다른 측면들 각각에 대해서도 준용된다.
본 발명의 구현예는 첨부하는 도면들을 참조하여 일례로서 예시된다.
도 1은 CFH 내의 일배체형들 사이에서의 블록 구조 및 관계를 도시한다.
도 2는 CFH, CFHL3, CFHL1 및 CFHL4의 구조를 도시한다. 서열들은 2개의 유전좌위에서 공동 증폭되는 산물들의 일배체형 5(하부 그래프) 및 그외 다른 모든 일배체형들(상부 그래프)의 전형을 분석한 것을 나타낸다. 일배체형 5에서, 유전자들 아래의 PCR 산물들은 CFHL3 또는 CFHL1의 증폭이 아닌, CFH 및 CFHL4의 증폭(유전자-특이 프라이머들을 사용)을 나타낸다.
본 발명자는 중증의 신생혈관 AMD 질환을 앓는 172명의 환자군 및 AMD 증상을 보이지 않는 173명의 노인 대조군에서 염색체 1q23 상의 CFH 및 5개의 CFH-유사 유전자들의 클러스터에 걸친 다형성들을 제노타이핑(genotyping)하였다. 모든 일배체형들을 자세히 분석한 결과, 대조군들의 염색체 중 20%에서 발견된 CFHL1 및 CFHL3의 공통적인 결손이 AMD의 진행에 대하여 강력한 보호작용을 하며, 이는 Y402H보다 훨씬 유의미한 것임을 밝혔다.
본 연구 대상의 환자들은 안과 클리닉으로부터 모집되었으며, 보다 중증의 삼출형 또는 습식형 AMD와 연관된 맥락막 신생혈관증을 앓고 있었다. 연령별로 짝지워진 대조군들은 노인성 황반변성의 증상을 보이지 않았다. 본 발명자는 가장 통상적인 cSNP들을 포함하는, CFH 영역 내의 24개의 SNP들을 유전자형 분석하였으며, 전체 일배체형 정보를 확실히하기 위하여 선택된 추가적인 인트론 부위의 SNP들 및 유전자 사이의 SNP들을 분석하였다. 데이터를 통하여 CFH 및 AMD 사이에 강한 연관 관계가 있음을 확인하였는데2-5, 이는 SNP들을 개별적 및 일배체형에 의해 평가함으로써 증명되었다(참조: 표 1a 및 표 1b). 상기 영역 전반에 걸쳐 광범위한 연관불균형(LD)이 있었다. rs1065489를 제외하고, CFH 내에 분류된 모든 SNP들은 45, 19 및 84kb에 걸친 3개의 큰 일배체형 블록 내에 위치하였다(참조: 도 1). 블록 3 마커들은 CFH의 인트론 21로부터 CFHL1까지 확장되었다. 제노타이핑을 통하여 최종 일배체형 맵(HapMap) 데이터에서 발견된 1% 이상 빈도의 모든 일배체형들을 식별하도록 하였다6. 블록 3 내의 SNP들은 현저히 낮은 일루미나 제노타이핑 질 점수(quality score)로 회귀하였는데, 이는 이 영역의 반복적 속성에 의해 영향받을 수 있는 동일한 유전자형의 샘플들의 밀집도가 떨어짐을 의미하지만, 그러나, 이들 마커들에서의 유전자형은 하디-바인베르크(Hardy-Weinberg) 균형 내에 해당되며, 그들의 일배체형 블록 내에서 완전한 LD를 보이고, 이웃하는 블록 2의 일배체형들과는 강한 LD를 나타내었다.
각 블록 내에, AMD로부터 강력하게 보호하는 능력에 대하여 실질적으로 매우 불리한 작용을 하는 일배체형들이 분포되었다. 블록 1에서, rs1061170(Y402H)은 AMD에 걸릴 위험을 증가시키는 것과 관련된 2개의 일배체형들 중 하나로 밝혀졌다. 그러나, AMD 상태에 있어 보다 중요한 것은 모든 블록들에 걸친 거의 고른 LD 분포를 나타낸 강력한 보호 일배체형이었다. 이러한 공통적인 일배체형은 대조군들의 염색체의 20%에서 확인되었고, 블록 3에서 최상의 보호적인 3.06의 대응위험도(odds ratio)를 최소한도로 나타내었다. 이는 블록 3 내의 rs460897의 C 대립유전자 또는 블록 2 내의 rs6677604의 A 대립유전자에 의해 고유하게 식별될 수 있었다. 개별적으로, 일배체형 블록 2 내의 rs2274700은 환자군 상태를 최상으로 예측하는 단일 예측자였다(p=1.68×10-9). rs2274700의 G 및 A 대립유전자들 모두는 코돈 473에서 알라닌을 코딩하며, 다형성은 스플라이싱(splicing)에 영향을 주는 어떠한 기능적인 역할도 갖지 않는 것으로 생각되나, 이는 불리한 일배체형 및 유리한 일배체형들의 군 사이에서 그 차이가 최적으로 식별되었다.
본 발명자는 강력한 보호 일배체형 5(블록 2:11112; 블록 3:22221)의 유전적 기초를 식별하는데 목표를 두었다. 흥미로운 것은 CFH의 최종 엑손 내에 c.3572C>T(S119L)를 코딩하는 것으로 보고된, 종래 증명이 된 비-동의적(non-synonymous) SNP인 rs460897의 연구에 있어서의 명백히 신뢰할 만한 유전자형이었다. 상기 엑손의 기준 코딩 서열은 CFHL1의 최종 엑손과 99% 상동성을 공유하는데, 단지 c.3572 및 c.3590에서만 차이가 있으며, rs460897의 제노타이핑은 CFH의 엑손 23 및 CFHL1의 엑손 6 모두에서 결손 또는 전환이 발생하는 유전자형 결과를 갖는, 대립유전자들의 기여를 설명할 가능성이 높았다. 블록 2 내의 5개의 일배체형들 각각 및 블록 3 내의 관련 일배체형에 대하여, 동형접합 개체들로부터 DNA 내의 상기 엑손들의 서열을 분석하기 위하여 유전자-특이 프라이머들을 선택하였다. 상기 엑손들은 임의의 일배체형과 관련된 CFH의 엑손 23에서 어떠한 변이도 보이지 않았다. CFHL1의 엑손 6은 보호적인 일배체형 5에 대한 동형접합체에서 증폭되지 않았다(참조: 도 2). 모든 다른 일배체형들에서, CFHL1의 엑손 6은 예상된 부위에서 CFH와 달랐으며, 또한 rs4320(c.906G>T) 및 rs414628(c.942A>T) SNP들에서 일배체형-특이 변이를 보였다. 일배체형 5의 한 카피를 보유하며, 희귀 대립유전자에 대하여는 엑손 10을 포함하는 이형접합 개체들로부터 서열 분석된 모든 28개의 샘플들은 모든 CFHL1 엑손 6 SNP 부위들에서 동형접합임이 밝혀졌다. 어떠한 이형접합도 없다는 것은 일배체형 5 상의 CFHL1 엑손 6가 결손되었음을 강하게 시사한다. 일배체형 5 동형접합체 내의 결손은 CFH 및 CFHL1 모두에 공통인 부위들에 어닐링되는 프라이머들을 사용하여 공동-증폭함으로써 확인되었다. PCR 산물들의 서열분석은 일배체형 5가 CFH만을 증폭시킨 반면, 다른 모든 일배체형들은 두 유전자 모두를 증폭시켰음을 알려주는데, 이는 CFH 및 CFHL1 사이의 부위들에서 유사 SNP들이 다름을 말해준다(참조: 도 2). 324 및 380bp의 산물들을 각각 증폭시키는 CFH 인트론 21 및 CFHL1 인트론 4에 공통적인 프라이머들을 사용하여 공동-증폭함으로써 CFHL1 인트론 4의 결손이 유사하게 밝혀졌다(참조: 도 2). 결손의 정확한 위치 및 크기는 측정되지 않았지만, 염색체의 물리지도에서 2개의 큰 중복 영역들 사이 의 간격에 위치한 약 80kb로 추정된다7. CFHL4까지는 확장되지 않았지만, rs2274700 주위의 CFH 엑손 11 서열의 불완전한 카피가 모든 일배체형들에 삽입되어 보유되어 있다(참조: 도 2). 상기 중복은 신장을 위한 역방향 프라이머를 사용하여 rs2274700의 유전자형과 상충되지 않았다. CFH 인트론 15에만 위치한 SNP rs1410996은 rs2274700과 완전한 LD 상태에 있었다(데이터 미도시).
매우 복잡한 중복 영역 내에서의 게놈 집합체를 만드는 것은 간단하지가 않다. 물리지도에 기초한 서열 데이터를 검토하였는데, 이는 CFH 및 관련 유전자들의 배열과 일치하였다. CFHL3 및 CFHL4 사이에서도 유사한 관계를 갖는, CFH의 말단 엑손들이 CFHL1의 대립유전자라는 대안적인 셀레라(Celera)사의 구성은 본원의 데이터에 의해 뒷받침되지 못하며, 또한 CFH로부터의 CFHL1의 유전자 전환도 지지받지 못한다. 본 발명자는 CFH 엑손 23 및 CFHL1 엑손 6의 카피 수를 측정하기 위하여, 다중 라이게이션-의존성 프로브 증폭(MLPA)8을 사용하였다. 분석들은 CFH c.3572C/CFHL1 c.869T에 초점을 맞추었고, 유전자-특이 프로브들의 혼성화 부분들은 하나의 핵심 염기에서만 변화가 있었다. CFH 엑손 23의 카피 수는, MORF4L1의 엑손 9에서의 상염색체 마커 및 남성에 대해 보정된 BCAP31의 엑손 6에서의 X-연관 마커를 기준으로 하는 경우, 일배체형 5의 0, 1 또는 2의 카피 수를 보유하는 개체들로부터의 남성 및 여성 DNA 샘플에서 일정(1.00/1.04/1.06)하게 유지되었다. 예상된 바와 같이, CFHL1의 카피 수는 1에서 시작하여, 일배체형 5에 대한 이형접합체 및 동형접합체에서 각각 0.44 및 0으로 떨어졌다.
CFH 및 CFHL1은 보체 활성의 보다 중요한 조절자이며, 다른 CFH 관련 단백질보다 더 높은 수준으로 발현되기 때문에, AMD에 대한 보호작용에 있어서, CFHL1의 결손이 CFHL3 보다 더 중요할 것으로 예상할 수 있다. CFH 및 CFHL1은 높은 수준으로 순환계 내에 존재하며, 이들 모두는 C3b의 인자 I-매개의 분해에 대한 보조 인자들로 작용한다9,10. CFHL1 결손이 AMD에 대한 보호를 할 수 있게 하는 기작에 대한 일부 통찰은 용혈성 요독 증후군7(HUS; OMIM #235400)을 일으키는 CFH의 돌연변이에 대한 연구로부터 나왔다. 75% 이상의 알려진 HUS 돌연변이들은 CFHL1과의 상동성을 공유하는 CFH의 엑손들에 밀집되었다11-13. 보다 앞선 엑손들의 돌연변이들은 CFH 단백질의 기능보다는 상기 단백질의 혈장 내 안정성에 영향을 주는 경향이 있다. 엑손 23 내에서, c3572C>T(S1191L) 및 c.3590T>C(V1197A)는 각각 또는 함께 확인된다. 상기 2개 모두의 돌연변이들을 갖는 HUS 환자들은 AMD에 대하여 보호하는 것과 유사한 결손을 가질 수 있는데, 그러나 보다 앞선 분기점들에서 가질 수 있다. 이는 AMD에 대하여 보호하는 CFHL3 및 CFHL1의 제거 대신에, CFH의 CFHL1으로의 전환 및 CFHL3의 제거를 가져온다. 이들 HUS 돌연변이들은 C3b의 결합 능력을 감소시키고, 세포 표면들 상의 보체 활성화를 조절하는 능력을 감소시킨다7. HUS 환자들에 있어서, 최종 CFH 엑손이 CFHL1의 엑손으로 치환된 영향은 미세혈관병성 신장병을 일으키는데, 이는 망막 내에서 신생혈관 출혈로부터 고통받는 중증의 AMD 환자들의 경우와 유사하다. 상기 CFH 유전자 클러스터는 수많은 대체 스플라이싱된 전사물들 및 단백질들을 맡고 있다. CFHL1의 최종 엑손은 CFH 내로 대체 스플라이싱될 수 있고, CFHL3 및 CFHL1의 엑손들은 추가적인 전사물들에 참여할 수 있다. DNA 수준에서 이들 유전자들의 복잡성, 및 고도로 중복된 상기 유전자 클러스터로부터 발생하는 전사물들 및 단백질들의 복잡성을 해명하기 위해서는 많은 연구가 요구된다. 다른 결손들 또는 재배치들도 예상해 볼 수 있다. 종합적으로, 현재의 데이터는 건강한 미세혈관을 유지하는데 CFH가 필요하며, CFHL1은 유해한 간섭 단편으로 대부분 간주된다는 모델을 뒷받침한다. 노인성 황반변성은 개체 수명이 증가함에 따라 점점 만연되고 있다. 유효한 치료가 없이는 AMD는 크나큰 난제가 될 수 있다. AMD가 발병하기 쉬운 소질에 있어서 CFH 및 관련된 유전자들의 복합적인 역할을 규명하기 위한 시도는 AMD의 원인 분석에 해결의 실마리를 제공할 수 있으며, 유전자 사일런싱을 위한 유용한 치료적 타겟들을 장차 제공할 것이다.
방법
DNA 추출, 제노타이핑 및 서열분석
모든 참여자들은 영국의 북아일랜드에서 모집되었으며 모두 백인종이었다. DNA를 표준 방법에 의하여 말초 혈액으로부터 추출하였다. 더 큰 프로젝트의 일환으로 다중 PCR 및 프라이머 신장(일루미나사, San Diego, USA)에 기초한 일루미나 비드 기술을 사용한 고속 처리 SNP 제노타이핑을 외주에 맡겨 분석하였다. 추가적인 SNP들은 다중 PCR 및 연이은 다중 SNaPshot(ABI) 기술을 사용하여 자체적으로 유전자형 분석하였다. 프라이머들은 프라이머 탐지(Primer Detective)(Clontech사)를 사용하여 고안되었다. CFH 및 관련 유전자들의 특이적 및 비-특이적 증폭을 위 한 프라이머 서열들은 온라인상에서 찾아볼 수 있다. 서열은 ABI 염료 종결자 화학결합 v3를 사용하여 결정하였으며, 분석은 ABI3100 유전자 분석기로 분석하였다. DNA 서열들을 비교하기 위하여 Sequencher 프로그램(Genecodes사)을 사용하였다. SNP 유전자형들을 A 또는 T 대립유전자인 경우에는 1로, C 또는 G 대립유전자인 경우에는 2로 지정하였다. 정방향에서의 A 대립유전자는 2개의 A/T SNP들 rs2019727 및 rs438781에서 1로 지정하였다.
통계적 방법
환자군과 대조군의 대립유전자와 일배체형 수 및 비율, 그리고 대립유전자 또는 일배체형 빈도들과 관련된 카이제곱검정에 기초한 유의확률(P value)을 생성하는 포맷과 연결된 Haploview(www.broad.mit.edu/mpg/haploview/) 내에 유전자형 데이터가 입력되었다. 172명의 환자군 및 173명의 대조군들로부터의 데이터가 환자군:대조군 연구에 사용되었다.
MLPA
MRC 네덜란드로부터 이들의 프로토콜에 따른 완충액, 효소 및 PCR 프라이머들을 사용하여 100ng의 DNA 상에서 수행되었다. 혼성화 프로브 서열들 X-CFH-1191C 또는 X-CFHL1-1191T가 공통의 PHO-표지된 올리고 CFH1191-Y와의 각각의 반응들에 사용되었다. 모든 반응들에 MORF4L1 및 BCAP31을 사용한 대조군들이 포함되었다. 피크 높이에 기초하여 분석하였으며, 이는 피크 면적들과 상호 관련도가 높았다. 모든 MLPA 올리고들은 온라인상에서 입수가능하다.
GenBank 등록번호
CFH NM000186; CFHL1 BC016755; CFHL2 BC022283; CFHL3 AK124051; CFHL4 BC074957. CFH 엑손들은 본 유전자의 더 짧은 전사물 내로 대체 스플라이싱된 엑손 10을 포함하여 번호가 매겨져 있다. 전사물들의 번호는 개시 ATG로부터 시작한다.
참고문헌
Figure 112009001425858-PCT00003
Figure 112009001425858-PCT00004
Figure 112009001425858-PCT00005
Figure 112009001425858-PCT00006
Figure 112009001425858-PCT00007
Figure 112009001425858-PCT00008
<110> THE QUEEN'S UNIVERSITY OF BELFAST <120> PROTECTION AGAINST AND TREATMENT OF AGE RELATED MACULAR DEGENERATION <150> GB0611606.5 <151> 2006-06-13 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 993 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgtggctcc tggtcagtgt aattctaatc tcacggatat cctctgttgg gggagaagca 60 acattttgtg attttccaaa aataaaccat ggaattctat atgatgaaga aaaatataag 120 ccattttccc aggttcctac aggggaagtt ttctattact cctgtgaata taattttgtg 180 tctccttcaa aatcattttg gactcgcata acatgcacag aagaaggatg gtcaccaaca 240 ccaaagtgtc tcagactgtg tttctttcct tttgtggaaa atggtcattc tgaatcttca 300 ggacaaacac atctggaagg tgatactgtg caaattattt gcaacacagg atacagactt 360 caaaacaatg agaacaacat ttcatgtgta gaacggggct ggtccacccc tcccaaatgc 420 aggtccactg acacttcctg tgtgaatccg cccacagtac aaaatgctca tatactgtcg 480 agacagatga gtaaatatcc atctggtgag agagtacgtt atgaatgtag gagcccttat 540 gaaatgtttg gggatgaaga agtgatgtgt ttaaatggaa actggacaga accacctcaa 600 tgcaaagatt ctacgggaaa atgtgggccc cctccaccta ttgacaatgg ggacattact 660 tcattcccgt tgtcagtata tgctccagct tcatcagttg agtaccaatg ccagaacttg 720 tatcaacttg agggtaacaa gcgaataaca tgtagaaatg gacaatggtc agaaccacca 780 aaatgcttac atccgtgtgt aatatcccga gaaattatgg aaaattataa catagcatta 840 aggtggacag ccaaacagaa gctttatttg agaacaggtg aatcagctga atttgtgtgt 900 aaacggggat atcgtctttc atcacgttct cacacattgc gaacaacatg ttgggatggg 960 aaactggagt atccaacttg tgcaaaaaga tag 993 <210> 2 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Trp Leu Leu Val Ser Val Ile Leu Ile Ser Arg Ile Ser Ser Val 1 5 10 15 Gly Gly Glu Ala Thr Phe Cys Asp Phe Pro Lys Ile Asn His Gly Ile 20 25 30 Leu Tyr Asp Glu Glu Lys Tyr Lys Pro Phe Ser Gln Val Pro Thr Gly 35 40 45 Glu Val Phe Tyr Tyr Ser Cys Glu Tyr Asn Phe Val Ser Pro Ser Lys 50 55 60 Ser Phe Trp Thr Arg Ile Thr Cys Thr Glu Glu Gly Trp Ser Pro Thr 65 70 75 80 Pro Lys Cys Leu Arg Leu Cys Phe Phe Pro Phe Val Glu Asn Gly His 85 90 95 Ser Glu Ser Ser Gly Gln Thr His Leu Glu Gly Asp Thr Val Gln Ile 100 105 110 Ile Cys Asn Thr Gly Tyr Arg Leu Gln Asn Asn Glu Asn Asn Ile Ser 115 120 125 Cys Val Glu Arg Gly Trp Ser Thr Pro Pro Lys Cys Arg Ser Thr Asp 130 135 140 Thr Ser Cys Val Asn Pro Pro Thr Val Gln Asn Ala His Ile Leu Ser 145 150 155 160 Arg Gln Met Ser Lys Tyr Pro Ser Gly Glu Arg Val Arg Tyr Glu Cys 165 170 175 Arg Ser Pro Tyr Glu Met Phe Gly Asp Glu Glu Val Met Cys Leu Asn 180 185 190 Gly Asn Trp Thr Glu Pro Pro Gln Cys Lys Asp Ser Thr Gly Lys Cys 195 200 205 Gly Pro Pro Pro Pro Ile Asp Asn Gly Asp Ile Thr Ser Phe Pro Leu 210 215 220 Ser Val Tyr Ala Pro Ala Ser Ser Val Glu Tyr Gln Cys Gln Asn Leu 225 230 235 240 Tyr Gln Leu Glu Gly Asn Lys Arg Ile Thr Cys Arg Asn Gly Gln Trp 245 250 255 Ser Glu Pro Pro Lys Cys Leu His Pro Cys Val Ile Ser Arg Glu Ile 260 265 270 Met Glu Asn Tyr Asn Ile Ala Leu Arg Trp Thr Ala Lys Gln Lys Leu 275 280 285 Tyr Leu Arg Thr Gly Glu Ser Ala Glu Phe Val Cys Lys Arg Gly Tyr 290 295 300 Arg Leu Ser Ser Arg Ser His Thr Leu Arg Thr Thr Cys Trp Asp Gly 305 310 315 320 Lys Leu Glu Tyr Pro Thr Cys Ala Lys Arg 325 330 <210> 3 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 taaggtggac agccaaacag aagctttatt cgagaacagg tgaatcagtt gaatttgtgt 60 g 61 <210> 4 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 taaggtggac agccaaacag aagctttatt tgagaacagg tgaatcagct gaatttgtgt 60 g 61 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense polynucleotide <400> 5 ttcagctgat tcacctgttc tcaaat 26

Claims (19)

  1. 유전자 CFHL1 및/또는 유전자 CFHL3 중 적어도 하나를 전체적 또는 부분적으로 사일런싱하는 적어도 하나의 억제제를 포함하는, 노인성 황반변성(AMD)의 예방 및/또는 치료를 위한 약물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 억제제는 RNAi를 포함하는 것인, 노인성 황반변성의 예방 및/또는 치료를 위한 약물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 억제제는 상기 유전자 CFHL1 및 유전자 CFHL3 중 적어도 하나의 mRNA에 상보적인 안티센스 분자로서, 상기 각각의 유전자 산물이 감소되도록 하는 것인, 노인성 황반변성의 예방 및/또는 치료를 위한 약물.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 적어도 하나의 억제제는 매우 엄격한 혼성화 조건들 하에서 상기 유전자 CFHL1 및 유전자 CFHL3 중 적어도 하나의 mRNA에 상보적인 안티센스 분자로서, 상기 각각의 유전자 산물이 감소되도록 하는 것인, 노인성 황반변성의 예방 및/또는 치료를 위한 약물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 적어도 하나의 억제제는 ttcaGctgattcacctgttctcAaat (서열번호 5)와 적어도 90% 이상의 서열 일치성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포 함하는 것인, 노인성 황반변성의 예방 및/또는 치료를 위한 약물.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 적어도 하나의 억제제는 ttcaGctgattcacctgttctcAaat(서열번호 5)를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, 노인성 황반변성의 예방 및/또는 치료를 위한 약물.
  7. 약물에 있어서, 유전자 CFHL1 및/또는 유전자 CFHL3 중 적어도 하나를 전체적 또는 부분적으로 사일런싱하는 적어도 하나의 억제제의 용도.
  8. AMD의 치료를 위한 약물의 제조에 있어서, 유전자 CFHL1 및/또는 유전자 CFHL3 중 적어도 하나를 전체적 또는 부분적으로 사일런싱하는 적어도 하나의 억제제의 용도.
  9. 유전자 CFHL1 및/또는 유전자 CFHL3 중 적어도 하나를 전체적 또는 부분적으로 사일런싱하는 적어도 하나의 억제제를 이를 필요로 하는 환자들에게 제공하는 단계를 포함하는, 노인성 황반변성의 치료방법.
  10. 제9항에 있어서, 항-VEGF 치료제 및 개체의 흡연 가능성을 최소화하는 약물 중 적어도 하나를 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 노인성 황반변성의 치료방법.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항-VEGF 치료제 및 개체의 흡연 가능성을 최소화하는 약물 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 것인, 노인성 황반변성의 예방 및/또는 치료를 위한 약물.
  12. 제7항 또는 제8항에 있어서, 항-VEGF 치료제 및 개체의 흡연 가능성을 최소화하는 약물 중 적어도 하나와 조합으로 사용하는, 유전자 CFHL1 및 CFHL3 중 적어도 하나를 전체적 또는 부분적으로 사일런싱하는 적어도 하나의 억제제의 용도.
  13. 하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브(probe).
    SNP 번호 SNP 명 1 rs1292487 2 rs512900 3 rs7524776 4 rs529825 5 rs800292 6 rs1329424 7 rs1061147 8 rs1061170 9 rs10801555 10 rs2019727 11 rs2019724 12 rs203685 13 rs1831281 14 rs2274700 15 rs6677604 16 rs3753396 17 rs419137 18 rs2284664 19 rs1065489 20 rs10801560 21 rs460897 22 rs432007 23 rs438781 24 rs408519 25 rs6428372 26 rs10922147 27 rs1971579 28 rs4085749 29 rs10922152 30 rs5998
  14. 제13항에 있어서, 상기 분리된 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하는 것인 프로브.
    5 rs800292 8 rs1061170 15 rs6677604 16 rs3753396 17 rs419137 18 rs2284664
  15. 개체의 노인성 황반변성을 진단 및/또는 모니터링하기 위한 진단용 키트로 서, 상기 키트는 하기를 포함하는 진단용 키트:
    하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 대한 결합 특이성을 갖거나;
    SNP 번호 SNP 명 1 rs1292487 2 rs512900 3 rs7524776 4 rs529825 5 rs800292 6 rs1329424 7 rs1061147 8 rs1061170 9 rs10801555 10 rs2019727 11 rs2019724 12 rs203685 13 rs1831281 14 rs2274700 15 rs6677604 16 rs3753396 17 rs419137 18 rs2284664 19 rs1065489 20 rs10801560 21 rs460897 22 rs432007 23 rs438781 24 rs408519 25 rs6428372 26 rs10922147 27 rs1971579 28 rs4085749 29 rs10922152 30 rs5998
    또는, 하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩타이드에 대한 결합 특이성을 갖는 검출 시약.
    SNP 번호 SNP 명 1 rs1292487 2 rs512900 3 rs7524776 4 rs529825 5 rs800292 6 rs1329424 7 rs1061147 8 rs1061170 9 rs10801555 10 rs2019727 11 rs2019724 12 rs203685 13 rs1831281 14 rs2274700 15 rs6677604 16 rs3753396 17 rs419137 18 rs2284664 19 rs1065489 20 rs10801560 21 rs460897 22 rs432007 23 rs438781 24 rs408519 25 rs6428372 26 rs10922147 27 rs1971579 28 rs4085749 29 rs10922152 30 rs5998
  16. 하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 적어도 2개의 유전 마커들과 혼성화할 수 있는 적어도 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열들을 포함하는 어레이(array).
    SNP 번호 SNP 명 1 rs1292487 2 rs512900 3 rs7524776 4 rs529825 5 rs800292 6 rs1329424 7 rs1061147 8 rs1061170 9 rs10801555 10 rs2019727 11 rs2019724 12 rs203685 13 rs1831281 14 rs2274700 15 rs6677604 16 rs3753396 17 rs419137 18 rs2284664 19 rs1065489 20 rs10801560 21 rs460897 22 rs432007 23 rs438781 24 rs408519 25 rs6428372 26 rs10922147 27 rs1971579 28 rs4085749 29 rs10922152 30 rs5998
  17. 하기로 구성되는 폴리펩타이드 어레이:
    하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩타이드들;
    SNP 번호 SNP 명 1 rs1292487 2 rs512900 3 rs7524776 4 rs529825 5 rs800292 6 rs1329424 7 rs1061147 8 rs1061170 9 rs10801555 10 rs2019727 11 rs2019724 12 rs203685 13 rs1831281 14 rs2274700 15 rs6677604 16 rs3753396 17 rs419137 18 rs2284664 19 rs1065489 20 rs10801560 21 rs460897 22 rs432007 23 rs438781 24 rs408519 25 rs6428372 26 rs10922147 27 rs1971579 28 rs4085749 29 rs10922152 30 rs5998
    또는, 하기 목록으로부터 선택되는 다형성들을 하나 이상 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩타이드들에 결합 특이성을 갖는 적어도 하나의 항체.
    SNP 번호 SNP 명 1 rs1292487 2 rs512900 3 rs7524776 4 rs529825 5 rs800292 6 rs1329424 7 rs1061147 8 rs1061170 9 rs10801555 10 rs2019727 11 rs2019724 12 rs203685 13 rs1831281 14 rs2274700 15 rs6677604 16 rs3753396 17 rs419137 18 rs2284664 19 rs1065489 20 rs10801560 21 rs460897 22 rs432007 23 rs438781 24 rs408519 25 rs6428372 26 rs10922147 27 rs1971579 28 rs4085749 29 rs10922152 30 rs5998
  18. 하기 단계들을 포함하는, 개체의 노인성 황반변성에 대한 감수성을 진단하거나 예측하는 방법:
    개체로부터의 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
    상기 생물학적 샘플 내의 적어도 하나의 유전 마커의 유무를 판정하는 단계로서, 상기 유전 마커는 하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 선택되거나,
    SNP 번호 SNP 명 1 rs1292487 2 rs512900 3 rs7524776 4 rs529825 5 rs800292 6 rs1329424 7 rs1061147 8 rs1061170 9 rs10801555 10 rs2019727 11 rs2019724 12 rs203685 13 rs1831281 14 rs2274700 15 rs6677604 16 rs3753396 17 rs419137 18 rs2284664 19 rs1065489 20 rs10801560 21 rs460897 22 rs432007 23 rs438781 24 rs408519 25 rs6428372 26 rs10922147 27 rs1971579 28 rs4085749 29 rs10922152 30 rs5998
    또는, 적어도 하나의 상기 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩타이드인 판정단계이며,
    상기 유전 마커의 존재 및/또는 부재는 개체의 노인성 황반변성(AMD)이 진행될 위험도의 지표인 판정단계.
  19. 하기 단계들을 포함하는, 초기 시점으로부터 후기 시점까지의 노인성 황반변성의 진행을 모니터링하는 방법:
    초기 시점에서 수득된 제1 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
    상기 제1 생물학적 샘플 내의 적어도 하나의 유전 마커의 유무를 판정하는 단계로서, 상기 유전 마커는 하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 선택되거나,
    SNP 번호 SNP 명 1 rs1292487 2 rs512900 3 rs7524776 4 rs529825 5 rs800292 6 rs1329424 7 rs1061147 8 rs1061170 9 rs10801555 10 rs2019727 11 rs2019724 12 rs203685 13 rs1831281 14 rs2274700 15 rs6677604 16 rs3753396 17 rs419137 18 rs2284664 19 rs1065489 20 rs10801560 21 rs460897 22 rs432007 23 rs438781 24 rs408519 25 rs6428372 26 rs10922147 27 rs1971579 28 rs4085749 29 rs10922152 30 rs5998
    또는, 적어도 하나의 상기 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩타이드인 판정단계;
    후기 시점에서 수득된 제2 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
    상기 제2 생물학적 샘플 내의 적어도 하나의 유전 마커의 유무를 판정하는 단계로서, 상기 유전 마커는 하기 목록으로부터 선택된 다형성들을 하나 이상 포함 하는 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 선택되거나,
    SNP 번호 SNP 명 1 rs1292487 2 rs512900 3 rs7524776 4 rs529825 5 rs800292 6 rs1329424 7 rs1061147 8 rs1061170 9 rs10801555 10 rs2019727 11 rs2019724 12 rs203685 13 rs1831281 14 rs2274700 15 rs6677604 16 rs3753396 17 rs419137 18 rs2284664 19 rs1065489 20 rs10801560 21 rs460897 22 rs432007 23 rs438781 24 rs408519 25 rs6428372 26 rs10922147 27 rs1971579 28 rs4085749 29 rs10922152 30 rs5998
    또는, 적어도 하나의 상기 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩타이드인 판정단계; 및
    상기 제1 샘플에 대하여, 상기 제2 샘플 내의 상기 유전 마커 및/또는 폴리펩타이드의 존재 및/또는 부재를 비교하는 단계로서,
    상기 제2 샘플과 비교하여, 상기 제1 샘플 내의 유전 마커 및/또는 폴리펩타이드의 존재 및/또는 부재의 차이는 AMD의 진행에 있어서 개체의 위험도 변화의 지표인 비교단계.
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