KR20090028048A - 스코파론의 신규 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 스코파론을 유효성분으로 포함하는 혈관평활근세포 증식 억제용 약제학적 조성물, 스코파론의 혈관평활근세포 증식 억제 용도 및 이를 이용한 혈관평활근세포 증식 억제방법을 제공한다.

본 발명을 통해, 스코파론이 AMPK의 활성을 증가시킴으로써 혈관평활근세포의 증식을 억제할 수 있음이 밝혀졌다. 따라서 스코파론은 혈관평활근세포 증식 억제, 특히 혈관재협착의 예방 또는 치료를 위한 의약의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.

스코파론, 혈관평활근세포

Description

스코파론의 신규 용도{NOVEL USE OF SCOPARONE}

본 발명은 스코파론을 유효성분으로 포함하는 혈관평활근세포 증식 억제용 약제학적 조성물, 스코파론의 혈관평활근세포 증식 억제 용도 및 이를 이용한 혈관평활근세포 증식 억제방법에 관한 것이다.

혈관평활근세포의 증식은 죽상동맥경화증을 비롯한 동맥경화증, 혈관재협착증 등을 포함한 심혈관계 질환의 중요한 원인이다(Hidde B., Restenosis: a challenge for pharmacology. Trends. Pharmacol. Sci. 2000;21(7):274-279; Nageswara RM, and Marschall SR, Circ. Res. 2007;100:460-473; Andres V, Castro C. Antiproliferative strategies for the treatment of vascular proliferative disease. Curr Vasc Pharmacol. 2003 Mar;1(1):85-98; Hao H, Gabbiani G, Bochaton-Piallat ML. Arterial smooth muscle cell heterogeneity: implications for atherosclerosis and restenosis development. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003 Sep 1;23(9):1510-20).

이와 같은 심혈관계 질환을 예방하기 위한 최선의 방법은 고혈압, 고지혈증, 비만, 당뇨 등의 대사증후군의 요소를 잘 관리하는 것이다. 그러나 이러한 질환이 한번 발병하게 되면 약물 또는 수술적인 방법을 사용하는 치료가 필요하다. 스타틴계열의 약품과 항고혈압약제를 통해 혈압을 조절하는데 이는 심혈관질환의 약 15-30% 밖에 감소시키지 못해 근본적인 치료법가 될 수 없다. 현재까지 알려진 가장 좋은 치료법은 풍선이 달린 카테타를 막히거나 좁아진 혈관 안으로 넣은 후 풍선을 확장시켜 혈관을 뚫어주는 것이다(Hidde B., Restenosis: a challenge for pharmacology. Trends. Pharmacol. Sci. 2000;21(7):274-279). 하지만 혈관평활근세포의 재증식으로 인해 풍선확장술 시술 후 약 1년 이내에 50% 정도의 재협착률을 보이는 문제가 발생하므로 혈관평활근세포의 증식을 억제하는 것이 필수적이다.

최근 여러 대사성질환과 미토콘드리아의 연계연구가 활발히 이루어지고 있다. 혈관합병증의 발병기전중에 혈관세포에서 산화스트레스가 증가함이 관찰되었는데 이 산화스트레스의 증가는 미토콘드리아의 기능장애에서 유인한다는 의견이 지배적이다(Nageswara RM and Marschall SR, Circ. Res. 2007;100:460-473). 미토콘드리아는 혈관세포 내 여러 산화스트레스 발생 시스템 중 포도당 대사 및 지방대사와 관련하여 활성산소종을 생성하는 기관이고 또한 고혈당, 지방산, 사이토카인, 성장인자등에 의해 발생하는 산화스트레스에 공통적으로 작용하여 혈관합병증의 발생을 더욱 가속화시킬 수도 있기 때문이다. 최근 연구에서 UCP-2, AMPK, PGC-1 등의 유전자의 과발현이 고혈압유발인자에 의한 미토콘드리아의 기능을 개선시키고 혈관평활근세포의 증식 및 이주를 억제하는 것이 관찰되었다(Lee W.J., et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25:2488-2494; Park J.Y., et al., Diabetologia 2005;48:1022-1028; Lee IK, et al., Effects of Recombinant Adenovirus-Mediated Uncoupling Protein 2 Overexpression on Endothelial Function and Apoptosis. Circ Res. 2005 Jun 10;96(11):1200-7; Kim HJ, et al., Effects of PGC-1α on TNF-α Induced MCP-1 and VCAM-1 Expression and NF-κB Activation in Human Aortic Smooth Muscle and Endothelial Cells. ANTIOXIDANTS & REDOX SIGNALING. 2007;9(3): 301-307).

혈관평활근세포 증식이 AMPK의 활성에 의해 지배를 받을 수 있음이 재차 보고되었다(Nagata D, et al., AMP-activated protein kinase inhibits Angiotensin II-stimulated vascular smooth muscle cell proliferation. Circulation. 2004;110:444-451). AMPK가 활성화된 혈관평활근세포는 증식이 억제되고, 또한 이러한 평활근세포에서는 세포증식 억제인자인 p53과 p21의 발현이 증가하며, CDK(cyclin-dependent kinase)의 활성이 감소됨이 관찰된다(Igata M, et al., Adenosine monophosphate-activated protein kinase suppresses vascular smooth muscle cell proliferation through the inhibition of cell cycle progression. Circ Res. 2005;97(8):837-844). AMPK는 식이제한이나 운동에 의해 AMP의 상대적 비율이 ATP보다 높을 때 활성화되는 일종의 인산화효소로서 세포의 복제를 중단시켜 더 이상의 ATP를 소모를 억제시키는 기능을 가진 대사에 관련된 중요한 단백질이다(Hardie DG. AMP-activated protein kinase as a drug target. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2007;47:185-210). 활성화된 AMPK는 당대사와 지질산화를 촉진시키고 당신생성과 지질의 합성을 억제시킨다고 알려져 있다. 또한 AMPK는 대사과정과 상관없이 활성화되기도 하는데 당뇨병치료제로 알려진 메폴민에 의해서도 활성되고 알파-리포산에 의해 활성되기도 한다(Lee W.J., et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25:2488-2494; Lee KM, et al., Alpha-lipoic acid inhibits fractalkine expression and prevents neointimal hyperplasia after balloon injury in rat carotid artery. Atherosclerosis. 2006 Nov;189(1): 104-14).

스코파론(scoparone; 6,7-dimethoxycoumarin)은 식물에서 추출되는 페놀계 물질인 쿠마린(coumarin) 유도체 중 하나로서, 벤젠(benzene)과 피론링 (pyrone-ring)이 결합된 구조를 갖고 있다. 쿠마린은 인진쑥, 사철쑥, 약쑥 등에서 추출되는 성분으로서 다양한 질병의 치료제나 완화제로 사용되고 있으며, 그 중에서도 스코파론은 인진쑥(Artemisia scoparia)에서 주로 추출되며, 면역억제나 혈관 이완, 지질강하 등의 효과가 있는 것으로 보고되고 있다. 스코파론은 또한 사람의 말초 단핵구 세포의 성장을 억제하며, 혈관평활근 세포를 이완시키며 트리글리세리드와 콜레스테롤의 수치도 낮게 함을 고콜레스테롤 모델의 토끼에서 확인하였다. 또한 스코파론은 천식에 탁월한 효과가 있음이 보고되고 있다. 그 밖에 스코파론은 혈압강하작용, 이담작용, 소염작용등 다양한 약리 작용이 보고되고 있다. 또한 대만의 Huang등은 스코파론이 혈관이완작용과 면역 억제작용을 보임을 밝혔다.

본 발명자들은 혈관평활근세포에서 AMPK의 활성을 촉진시키는 물질을 연구한 결과, 스코파론이 혈관평활근세포에서 AMPK의 활성을 촉진시켜 혈관평활근세포의 증식을 억제함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 스코파론을 유효성분으로 포함하는 혈관평활근세포 증식 억제용 약제학적 조성물, 스코파론의 혈관평활근세포 증식 억제 용도 및 이를 이용한 혈관평활근세포 증식 억제방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 스코파론을 유효성분으로 포함하는 혈관평활근세포 증식 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 실시예에 따르면, 스코파론은 혈관평활근세포의 증식을 억제시키고, 풍선확장술 후 생성될 수 있는 신생내막의 형성도 감소시킨다. 하기 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 스코파론은 AMPK를 활성화시켜 혈관평활근세포의 증식을 억제하며, AMPK의 상위 신호전달 네트워크(upstream signaling network)에 영향을 줌으로써 AMPK의 활성화와 이에 따른 ACC2의 인산화/활성 저해를 유발한다. 나아가 스코파론은 세포주기를 억제하는 단백질인 p21, p27, p53 단백질의 발현을 증가시키고, 세포주기를 진행시키는 cyclin D의 발현을 감소시킨다. 또한 스코파론은 혈관 내에서의 ROS의 생성을 감소시키며, ROS의 증가에 따라 발현이 증가되는 VCAM-1 단백질의 발현을 또한 용량의존적으로 감소시키는 것으로 확인되었다.

이와 같이 스코파론이 AMPK의 활성화를 통해 혈관평활근세포의 증식을 억제함이 확인되었으므로, 스코파론은 혈관평활근세포의 증식을 억제하기 위한 의약의 유효성분으로 사용될 수 있다.

본 발명의 스코파론을 유효 성분으로 함유하는 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다.

본 발명의 스코파론을 유효 성분으로 함유하는 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 스코파론을 유효 성분으로 함유하는 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 관장제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다.

예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕괴제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명은 또한 혈관평활근세포 증식 억제용 의약의 제조를 위한 스코파론의 용도를 제공한다.

상기 혈관평활근세포 증식 억제용 약제학적 조성물은 이러한 의약의 제조를 위해 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 포유동물에게 치료상 유효량의 스코파론을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 혈관평활근세포 증식 억제 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 혈관평활근세포 증식 억제는 혈관평활근세포의 증식의 감소 및 예방을 포함한다.

본 발명의 혈관평활근세포 증식 억제용 약제학적 조성물은 혈관평활근세포의 증식에 의해 유발되는 질환인 죽상동맥경화증을 비롯한 동맥경화증, 혈관재협착 증(Hidde B., Restenosis: a challenge for pharmacology. Trends. Pharmacol. Sci. 2000;21(7):274-279; Nageswara RM, and Marschall SR, Circ. Res. 2007;100:460-4;, Andres V, Castro C. Antiproliferative strategies for the treatment of vascular proliferative disease. Curr Vasc Pharmacol. 2003 Mar;1(1):85-98; Hao H, Gabbiani G, Bochaton-Piallat ML. Arterial smooth muscle cell heterogeneity: implications for atherosclerosis and restenosis development. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003 Sep 1;23(9):1510-20) 등을 포함한 심혈관계 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다.

따라서 본 발명의 혈관평활근세포 증식 억제용 약학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 심혈관계 질환의 치료제도 또한 포함할 수 있다. 예컨대, 스코파론은 당업자에게 잘 알려진 고지혈증 치료제 또는 혈압강하제 등과 함께 사용될 수 있다.

본 발명의 스코파론을 유효 성분으로 함유하는 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 스코파론을 유효 성분으로 함유하는 조성물의 치료상 유효량은 혈관평활근세포의 증식을 억제하는 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다 양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인에게 스코파론을 1일 1회 내지 수회 투여시, 예컨대, 10㎎/kg ~ 1000 ㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명을 통해, 스코파론이 AMPK의 활성을 증가시킴으로써 혈관평활근세포의 증식을 억제할 수 있음이 밝혀졌다. 따라서 스코파론은 혈관평활근세포 증식 억제, 특히 혈관재협착의 예방 또는 치료를 위한 의약의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

[실시예]

<혈관평활근세포의 분리 및 배양>

Sprague-Dawley 백서의 흉부대동맥에서 혈관평활근세포를 분리하여 20% 우태아혈청(fetal bovine serum)을 포함한 DMEM 배지에서 배양하였다. 혈관평활근세포의 특이성은 α-actin 단일클론 항체(Sigma, St Louis, Missouri, USA)로 염색하여 확인하였다. 본 실험에는 5-6회 사이로 계대 배양한 혈관평활근세포를 사용하였다. 배양된 혈관평활근세포를 60 mm 조직배양접시에 80-90% 정도 차게 하여 0.5% FBS DMEM 배지에서 24시간동안 배양하여 세포들을 휴지기로 들어가게 하였다.

실시예 1: 스코파론에 의한 혈관평활근세포의 증식 억제 효과 확인

일차배양된 혈관평활근세포를 96 웰 배양접시에 배양하고 40% 자랐을 때 0.5% FBS가 포함된 배지로 교환하고 24 시간 동안 배양하여 세포를 휴지기 상태로 두었다. 그 후 20ng/ml의 혈소판 유래 성장 인자 (platelet derived growth factor: PDGF)나 10 ng/ml의 종양괴사인자 (TNF-α)와 함께 0, 5, 10, 20, 또는 50μM의 스코파론을 처리하고 37℃에서 48 시간 동안 반응시켰다. 세포의 수는 WST cell counting kit (WAKO, japan)를 이용하여 계수하였다. 세포증식확인용 시약(WST)을 처리하고 4시간 더 반응시킨 후 ELISA 리더(ELISA reader)로 450nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 증식력을 조사하였다. 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 혈소판 유래 성장인자(PDGF) 또는 TNF-α의 처리는 혈관평활근세포의 증식을 증가시켰으나, 스코파론을 함께 처리한 경우 혈관평활근세포의 증식이 용량의존적으로 유의하게 감소되었다.

실시예 2: 백서에서의 혈관평활근세포의 증식 억제 효과 학인

스코파론이 풍선확장술 시행 후 신생 내막 형성을 억제하는지 확인하기 위해 스코파론이 함유된 먹이를 공급한 Sprague-Dawley 백서로 실험하였다.

실험대상으로는 체중 300 g 전후의 수컷 Sprague-Dawley 백서를 사용하였다. 정상대조군, 고지방식(20% fat, 0.05% cholesterol)만 하는 음성대조군, 및 고지방식이에 10mg/kg 또는 100mg/kg 의 스코파론을 포함한 먹이를 먹인 실험군(각 군 당 ?마리)을 온도가 22℃로 유지되고 12시간 주기로 명암이 조절되는 조건에서 사육하였다. 음성대조군과 실험군은 풍선확장술 실시 3일전부터 위와 같이 정해진 식이를 시작하고 풍선확장술 실시 후 2주동안 동일한 식이를 진행하였다. 2주 후 경동맥을 분리하여 H&E 염색(hematoxylin & Eosin staining)으로 신생내막의 형성을 확인하였다. 도 2는 풍선확장술 실시 2주 후의 래트의 경동맥의 절단면을 보여주는 현미경 사진(ㅧ100)이다. 도 2a는 정상대조군, 도 2b는 음성대조군, 도 2c는10mg/kg 스코파론 투여군, 도 2d는 100mg/kg 스코파론 투여군의 H&E 염색 결과를 보여준다. 도 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 음성대조군에 비해 스코파론 투여군의 신생내막의 형성이 감소되었으며, 증가할수록 더욱 신생내막 형성의 감소율이 증가하였다. 따라서, 상기 실험 결과로부터 스코파론이 혈관평활근세포의 증식을 억제함으로써 풍선확장술 시술 후의 혈관재협착을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인할 수 있다.

실험예 1: 스코파론이 AMPK, ACC의 인산화에 미치는 영향 확인

배양된 혈관평활근세포를 60-mm 조직배양접시에 80-90% 정도 차게한 후 0.5% FBS를 포함한 배지에서 24시간 두어 세포를 휴지기상태로 만들었다. 스코파론을 처리하지 않은 군을 대조군으로 하고, 실험군은 50㎍의 스코파론을 각각 1, 2, 4, 6, 12시간 동안 처리한 5개군으로 나누었다. 각 군으로부터 RIPA 완충용액을 이용하여 전체 단백질을 분리하였다. 분리한 단백질을 완충액과 섞어 5분간 끓인 후 얼음 위에서 식혔다. 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel)에서 전기영동하여 단백질을 크기별로 분리한 후 PVDF 멤브레인으로 옮기고 pACC, pAMPK, AMPK에 대한 모노클로날항체와 반응시켜 단백질의 발현과 인산화를 확인하였다.

도 3으로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 혈관평활근세포에 스코파론을 처리한 결과 AMPK의 인산화된 형태와 그에 따른 ACC의 인산화된 형태가 시간의존적으로 증가하였다.

실험예 2: 스코파론이 세포증식과 관련된 단백질의 발현에 미치는 영향 확인

배양된 혈관평활근세포를 60-mm 조직배양접시에 80-90% 정도 차게한 후 0.5% FBS를 포함한 배지에서 24시간 두어 세포를 휴지기상태로 만들었다. 스코파론을 처리하지 않은 군을 대조군으로 하고, 실험군은 50㎍의 스코파론을 각각 2, 4, 6, 12, 24시간 동안 처리한 5개군으로 나누었다. 각 군으로부터 RIPA 완충용액을 이용하여 전체 단백질을 분리하였다. 분리한 단백질을 완충액과 섞어 5분간 끓인 후 얼음 위에서 식혔다. 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel)에서 전기영동하여 단백질을 크기별로 분리한 후 PVDF 멤브레인으로 옮기고 p53, p27, p21, Cyclin D에 대한 항체와 반응시켜 단백질의 발현을 확인하였다.

도 4로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 혈관평활근세포에 스코파론을 처리한결과 세포주기에 관련된 p53, p27, p21의 발현이 시간의존적으로 증가하였다. 스코파론을 처리하고 시간이 지남에 따라 세포주기를 억제하는 단백질인 p21, p27 의 발현양이 늘어남을 확인할 수 있었고 24시간 후에 가장 높은 발현양을 보였다. 또한 p53 의 경우에는 처리 후 2시간에서 4시간째에 가장 높은 발현을 보였다. 세포주기를 진행하는 cyclin D 의 경우에는 스코파론의 처리에 따라 감소함을 확인 할 수 있었다.

실험예 3: 스코파론이 JNK 및 Erk 인산화에 미치는 영향 확인

스코파론의 신호전달경로(signaling pathway)를 알아 보기 위해서 JNK 와 Erk의 인산화를 확인해보았다.

배양된 혈관평활근세포를 60-mm 조직배양접시에 80-90% 정도 차게한 후 0.5% FBS를 포함한 배지에서 24시간 두어 세포를 휴지기상태로 만들었다. 스코파론을 처리하지 않은 군을 대조군으로 하고, 실험군은 50㎍의 스코파론을 각각 15분, 30분, 45분, 60분, 90분 동안 처리한 5개군으로 나누었다. 각 군으로부터 RIPA 완충용액을 이용하여 전체 단백질을 분리하였다. 분리한 단백질을 완충액과 섞어 5분간 끓인 후 얼음 위에서 식혔다. 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel)에서 전기영동하여 단백질을 크기별로 분리한 후 PVDF 멤브레인으로 옮기고 pJNK, JNK, pErk 및 Erk에 대한 항체와 반응시켜 단백질의 발현 및 인산화를 확인하였다.

시간이 지남에 따라 JNK 의 인산화는 점점 증가함을 확인하였다. Erk의 인산화는 45분에서 가장 많이 됨을 확인하여, 스코파론에 의한 세포주기조절에 JNK 와 Erk의 인산화가 관여함을 예상할 수 있었다.

도 5는 스코파론이 JNK 및 Erk의 인산화에 미치는 영향을 보여주는 웨스턴 블롯 사진이다.

실험예 4: 스코파론이 ROS 생성에 미치는 영향 확인

6 웰 세포배양접시에 90% 가량 자랐을 때 0.5% FBS DMEM 배지에서 24시간동안 배양하였다. 종양괴사인자(TNF-α) 및 스코파론을 처리하지 않은 군을 대조군으로 하고, 실험군은 종양괴사인자(TNF-α)를 포함하는 배지에서 각각 0μM, 100μM, 200μM의 스코파론을 처리한 3군으로 나누었다. 각 군을 1시간 동안 배양한 후 ROS에 예민한 형광 프로브인 2',7'-디클로로플로레신 디아세테이트(2',7'-dichlorofluorecin diacetate, DCF-DA; Invitrogen)을 40 μmol/L 첨가하여 30분간 배양하였다. 488 nm 파장(wavelength)에서 자극되고 515 nm 파장(wavelength)에서 발산되는 AxioCam MRc5 Carl Zeiss 형광 현미경(Thornwood, NY)을 이용하여 ROS 생성을 확인하였다. 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 스코파론 처리군에서 증가된 ROS의 발현이 감소됨을 확인할 수 있다.

실험예 5: 스코파론이 VCAM-1 발현에 미치는 영향 확인

배양된 혈관평활근세포를 60-mm 조직배양접시에 80-90% 정도 차게한 후 0.5% FBS를 포함한 배지에서 24시간 두어 세포를 휴지기상태로 만들었다. 스코파론 및 종양괴사인자 TNF-α를 처리하지 않은 군을 대조군으로 하고, 실험군은 종양괴사인자 TNF-α를 포함하는 배지에서 각각 0μM, 10μM, 20μM, 50μM, 100μM의 스코파론을 24시간 동안 처리한 5군으로 나누었다. 50㎍의 스코파론을 각각 15분, 30분, 45분, 60분, 90분 동안 처리한 5개군으로 나누었다. 각 군으로부터 RIPA 완충용액을 이용하여 전체 단백질을 분리하였다. 분리한 단백질을 완충액과 섞어 5분간 끓인 후 얼음 위에서 식혔다. 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel)에서 전기영동하여 단백질을 크기별로 분리한 후 PVDF 멤브레인으로 옮기고 VCAM 및 PAI-1에 대한 항체와 반응시켜 단백질의 발현을 확인하였다. 멤브레인을 항 액틴 항체와 다시 반응시켜 일정한 양의 단백질을 사용하였는지 확인하였다.

ROS의 증가는 동맥경화의 주요한 원인이 되는 물질인 VCAM-1 단백질의 발현을 현저히 증가시키는데, 혈관평활근세포에 스코파론을 처리하는 경우 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이 증가된 VCAM-1의 발현이 용량의존적으로 감소된다.

실험예 6: 스코파론이 AP-1 및 NFκB의 DNA 결합 활성에 미치는 영향 확인

세포주기 조절단백질 또는 케모카인 등의 단백질은 각각의 전사인자에 의해 조절을 받는다. 따라서 세포주기 조절 단백질의 발현을 조절하는 전사인자인 AP-1 과 케모카인의 발현을 조절하는 전사인자인 NF-kB 의 DNA 결합 활성을 겔지연분석법(EMSA) 를 사용하여 확인하였다.

혈관내피세포를 0.5% FBS를 함유하는 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 스코파론 및 종양괴사인자 TNF-α를 처리하지 않은 군을 대조군으로 하고, 실험군은 10ng의 종양괴사인자 TNF-α를 포함하는 배지에서 각각 0μM, 10μM, 20μM, 50μM, 100μM의 스코파론을 24시간 동안 처리한 5군으로 나누었다. 핵산 추출물(nuclear extracts)을 혈관 평활근세포로부터 분리하고, AP-1 과 NF-kB에 대한 방사선 표지된 프로브로 레이블링한 후 단백질-DNA 반응을 20분 동안 실온에서 수행하였다. 반응을 시킨 후 샘플을 4% 천연 폴리아릴아마이드 겔에 로딩하고, 150 볼트에서 2시간 동안 전기영동을 시행한 후 분석하였다.

그 결과, 도 8로부터 알 수 있는 바와 같이 TNF-α 에 의해 증가되었던 각각의 전사인자의 DNA 결합은 스코파론을 처리함에 따라 농도의존적으로 감소하며, 스코파론의 억제물질인 CompC (Competitor, AMPK 저해제, MERCK, Cat. # 171260)를 처리하면 평활근세포의 증식 억제가 다시 회복됨을 확인할 수 있었다.

도 1은 PDGF 또는 TNF-α와 함께 스코파론을 농도별로 처리한 경우 혈관평활근세포의 증식이 스코파론의 농도에 의존적으로 유의하게 감소함을 보여주는 그래프이다.

도 2는 풍선확장술 실시 2주 후의 래트의 경동맥의 절단면을 보여주는 현미경 사진(× 100)이다.

도 3는 스코파론이 AMPK와 ACC 인산화에 미치는 영향을 보여주는 웨스턴 블롯 사진이다.

도 4는 스코파론이 세포 증식과 관련된 단백질인 p53, p21, p27 및 cyclin D의 발현에 미치는 영향을 보여주는 웨스턴 블롯 사진이다.

도 5는 스코파론이 JNK 및 Erk의 인산화에 미치는 영향을 보여주는 웨스턴 블롯 사진이다.

도 6은 스코파론이 ROS 생성 저해에 미치는 영향을 보여주는 형광 현미경 사진이다.

도 7은 스코파론이 VCAM-1 단백질의 발현에 미치는 영향을 보여주는 웨스턴 블롯 사진이다.

도 8은 전사인자 AP-1 및 NF-kB 의 DNA 결합 활성에 미치는 영향을 보여주는 겔 지연 분석의 결과이다.

Claims (2)

1. 스코파론을 유효성분으로 포함하는 혈관평활근세포 증식 억제용 약제학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 혈관재협착(blood vessel restenosis)의 예방 또는 치료를 위한 것인 혈관평활근세포 증식 억제용 약제학적 조성물.

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