KR20090022139A

KR20090022139A - 리포폴리사카라이드 간독성 해독에 유용한 어성초 함유 한방원료 혼합추출물의 제조방법

Info

Publication number: KR20090022139A
Application number: KR1020070087235A
Authority: KR
Inventors: 권륜희
Original assignee: 세명한방제약 주식회사; 권륜희
Priority date: 2007-08-29
Filing date: 2007-08-29
Publication date: 2009-03-04

Abstract

본 발명은 LPS 간독성 해독에 유용한 어성초 함유 한방원료 혼합추출물의 제조방법, 그에 의해 제조된 어성초 함유 한방원료 혼합추출물 및 그 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 LPS(Lipopolysaccharide)로 유도된 간의 독성을 해독하기 위하여, 어성초를 주성분으로 하여, 오미자, 구기자, 사상자, 음양곽을 혼합하여 추출한 물질인 어성초 함유 한방원료 혼합추출물(HCTM: Houttuynia cordata Thumb and Oriental herb mixture extract-treated group)을 제조하고, 상기 어성초 함유 한방원료 혼합추출물이 LPS로 간독성이 유도된 흰쥐에서 지질대사 및 항산화에 미치는 영향을 관찰함으로써, 본 발명에 의한 어성초 함유 한방원료 혼합추출물이 LPS 간독성 해독에 효과가 있음을 알 수 있었다.

어성초, 오미자, 구기자, 사상자, 음양곽, 혼합추출물

Description

ＬＰＳ 간독성 해독에 유용한 어성초 함유 한방원료 혼합추출물의 제조방법, 그에 의해 제조된 어성초 함유 한방원료 혼합추출물 및 그 용도{Houttuynia cordata thumb and oriental herb mixture extract, process for producing the same, and use}

본 발명은 LPS 간독성 해독에 유용한 어성초 함유 한방원료 혼합추출물의 제조방법, 그에 의해 제조된 어성초 함유 한방원료 혼합추출물 및 그 용도에 관한 것이다.

근래에 들어 현대인들의 불규칙한 식사습관과 생활패턴, 스트레스, 과음, 흡연 등으로 인해 야기되는 간기능의 손상과 더불어 더욱 심할 경우에는 간질환으로까지 발전하는 경우가 빈번하게 일어나고 있다.

LPS(Lipopolysaccharide)와 CCl₄는 간에 독성을 주는 물질 중의 일종이다. LPS는 면역과 더불어 몸 전체의 조직에 패혈성 쇼크를 일으키는 물질이며, 유전자를 활성화시켜 NO의 생성을 증가시키며, NO가 생성될 때 Ca² ⁺의 농도증가로 인해 슈 퍼옥사이드 이온(superoxide anion)(O₂ ^-)과 H₂O₂가 함께 생성된다. 그리고 CCl₄는 간에 특이적으로 손상을 입히는 물질로써 라디칼(radicals)을 생성하여 LPS에 의해 생성된 라디칼(radicals)과 함께 간에 손상을 주는 것으로 알려져 있다.

이에 현대인들은 건강 유지나 생체리듬을 조절하는 효능이 있는 기능성 식품에 대한 관심이 고조되고 있는 가운데 전통 한방원료를 이용한 기능성 식품개발에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

어성초(Houttuynia cordata Thunb)는 삼백초과(Saururaceae)의 여러해살이풀 약모밀의 전초로써 해열, 해독, 폐렴, 말라리아, 수종, 백대하, 치질, 피부병 등의 치료와 항균, 이뇨, 진통, 지혈, 조직 재생 촉진 등의 작용에 쓰이며, 최근에는 항산화성 헬퍼 심플렉스 바이러스 타입 1(herper simplex virus type 1), 인간 면역결어 바이러스 타입 1(human immunodefi-ciency virus type 1) 및 인플루엔자 바이러스(influenza virus)에 대한 억제 효과, 항종양, 항백혈병, 고지혈 억제 효과, 카드뮴에 대한 독성억제효과, 브로모벤젠대사계에 미치는 어성초의 영향등이 보고되었다. 한편, 성분연구로는 포화지방산이 39.8%, 불포화지방산이 59.76%로 주로 정유 성분, 알카로이드(alkaloids), 플라보노이드(flavonoid), 스테로이드(steroid)등이 보고되었다.

오미자(Schizandra chinensis Baillon, Omija)는 목련과에 속하는 낙엽성 만성 목본식물로 한방과 민간에서 거담, 자양, 강장제 등으로 이용되어 왔으며, 그 외에 약리 기능이 다양하여 대뇌 피질의 기능 향상, 심혈관 기능 조절, 혈액 순환 장애 개선, 분만 능력 향상, 신경쇠약, 정신분열증, 시력감퇴, 소양성 피부병, 홍진 등의 질병에 사용되어 왔다. 지금까지 오미자에 관한 연구는 성분에 관한 연구로 일반성분, 유기산과 안토시아닌(anthocyanin) 색소, 유리당, 유기산 조성, 아미노산 조성, 지방산 조성과 항산화 활성, 휘발성 성분, 리그난(Lignan) 함량 등에 대하여 보고된 바 있다.

구기자 나무(Lycium chinensis Mill)는 가지과에 속하는 낙엽송 소관목으로 예로부터 구기자로 조제되는 보익방제는 대단히 많으며, 자보효능이 있으며 부인의 체질을 강장케 하고 유아의 영양보충도 되며, 산후에 복용하면 보익강신에 도움이 된다고 한다. 구기자는 외신경의 쇠약 시 복용하면 효과가 있고, 혈관연화, 혈압강하, 콜레스테롤 저감 작용이 있다고 한다. 관상동맥을 연화시켜 항상 혈압이 높고 콜레스테롤이 많거나 기타의 심장병증이 있는 경우는 일상적으로 복용케 함으로써 병상의 진행을 억제할 수 있다고 하며, 간장 질환을 치유하는 좋은 약제로 간 기능 개선에 도움이 된다고 하였다. 또한 시력을 증진시키는 작용이 있어 각종의 만성안질환으로 시력이 감퇴하였을 때에는 구기자를 복용하면 좋다고 한다. 구기자는 빈혈을 치유하는 작용이 있는데 이것에 함유되는 비타민, 니코틴산, 철 등의 성분이 모두 빈혈을 치료하는 주요한 근원물질이라고 한다. 구기자의 성분은 지방간의 저해작용과 간세포 신생의 촉진작용이 있으며, 구기자의 수침액은 중성지방의 침착을 억제하고 혈청과 간의 콜레스테롤의 과다를 억제한다고 보고되고 있다. 그 외에도 항산화작용 및 혈당수치를 낮추는 효능이 있다고 보고되고 있다.

사상자(Torils japonica A.P.DC)는 미나리과에 속하는 월년초로써 한방에는 예로부터 남자의 음위, 보신강양, 조습살충, 요술통, 자궁냉감, 산한거풍, 사지습비 등의 목적으로 사용하여 왔으며 사상자 탕에 배합하여 고환염에 사용하여 왔다. 사상자의 약리작용에 대한 기존 연구를 살펴보면 무라야마(Murayama) A등은 수렴성 소염작용이 있다고 보고했으며, 이토카와(Itokawa) H 등은 에탄올 추출물(ethanol extract)에서 히스타민(histamine)이나 바륨 클로라이드(barium chloride)로 야기된 기니 피그(guinea pigs)의 회장수축에 대해 강한 억제작용을 갖고 있음을 확인하여 경련진정 활성도(antispasmodic activity)가 있음을 보고했으며, 세스쿼터펜 유도화합물(sesquiterpene derivatives)의 작용이라고 추정하고 있다.

음양곽(Epimedium Koreanum Nakai)은 매자나무과에 속하는 다년생초본식물로서 강장, 거풍강정, 이뇨 및 신경성 강장제로 귀히 여겨온 동양의 약제이다. 음양곽의 주요성분은 프레닐페이본 글리코사이드(prenylfavone glycoside)라는 보고도 있고, 지상부에서 이카린(icariin), 이카리사이드(icariside) A, 2",5-람노실 이카리사이드(rhamnosyl icariside) A, 2"-람노실 이카리사이드(rhamnosyl icariside) Ⅱ, 4'-메톡시(methoxy)-5-하이드록시(hydroxy)-8, 3-디메틸 플라본(dimethyl flavone)과 동족배양체 수종이 분리된 바도 있다. 이들 성분 중 프레닐 플라보노이드(prenyl flavonoid)는 하복부의 혈관을 선택적으로 확장시켜주는 활성이 있는 것으로 알려지고 있다. 또한 이카린(icariin)은 음양곽의 주 약효성분으로 고혈압에 효과를 나타내는 성분으로 보고되고 있으며, 음양곽 추출물은 식균작용의 기능을 항진시키는 효과와 항산화 활성물질도 함유하고 있는 것으로 알려지고 있다.

본 발명의 목적은 LPS(Lipopolysaccharide)로 유도된 간의 독성을 해독하기 위하여, 어성초를 주성분으로 하여, 오미자, 구기자, 사상자, 음양곽을 혼합하여 추출한 물질인 어성초 함유 한방원료 혼합추출물(HCTM: Houttuynia cordata Thumb and Oriental herb mixture extract-treated group)을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 GOP, GPT의 효소를 활성화하고, 지질대사에 관여하여 LPS로 인한 간세포 지방화를 억제하는 기능을 발휘하여 LPS로 유도된 간의 독성을 해독하는데 사용될 수 있는 용도를 발견하고 이를 제공하고자 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 LPS 간독성 해독에 유용한 어성초 함유 한방원료 혼합추출물의 제조방법은 어성초 90중량부를 기준으로 여기에 오미자 1~3중량부, 구기자 1~3중량부, 사상자 3~5중량부 및 음양곽 1~3중량부을 혼합하여 혼합물을 제조하는 제 1단계; 상기 혼합물에 증류수 1900~2100중량부를 더 첨가하여 50~70℃에서 7~9시간 동안 환류 냉각한 뒤, 거름종이로 걸러 추출액을 얻는 제 2단계; 및 상기 추출액을 감압 농축하여 최종 농축물을 얻는 제 3단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 단계에 의해 제조되는 어성초 함유 한방원료 혼합추출물 및 상기 어성초 함유 한방원료 혼합추출물을 LPS로 인한 간의 독성을 해독하는데 사용하는 용도를 제공한다.

본 발명에 의한 어성초 함유 한방원료 혼합추출물(HCTM)은 LPS에 의해 유도된 간독성을 해독하는데 효과가 있으며, 이로 인하여 상기 어성초 함유 한방원료 혼합추출물(HCTM)을 이용하여 간기능 개선 및 지질대사 개선 기능을 가진 한방차의 주요 원료로 사용될 수 있다는 장점이 있다.

본 발명을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

실시예 : 어성초 함유 한방원료 혼합추출물의 제조

본 실시예에서 사용한 어성초, 오미자, 구기자, 사상자 및 음양곽은 경상남도 거창군 세명한방주식회사 식품사업부에서 구입한 것으로, 어성초 90g, 오미자 2g, 구기자 2g, 사상자 4g, 음양곽 2g을 혼합한 후, 여기에 증류수 2ℓ를 더 첨가하여 혼합물을 제조하고, 상기 혼합물을 60℃에서 8시간 동안 환류 냉각한 뒤, 거름종이로 걸러 추출액이 100㎖가 되도록 감압 농축하여 어성초 함유 한방원료 혼합추출물을 제조하였다.

이하, 실험예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 실험예에서 사용한 실험동물은 체중 170∼180g 내외의 생후 7주 암컷 흰쥐(Sprague-Dawley)로서, 대구 효창 사이언스로부터 제공받았고, 7일 동안 적응시켰다. 실험 흰쥐는 난괴법에 따라 총 21마리를 7마리씩 3군으로 나누었고, 군별로 각각 분리시키고 고형사료와 물을 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 22±1℃의 온도와 60±5% 상대습도로 유지시켰다.

정상군(NOR: normal group)은 20일 동안 1.5㎖/㎏ of 0.9% 염수(saline)를 투여하고, 대조군(CON: LPS-treated group)은 20일 동안 1.5㎖/㎏ of 0.9% 염수(saline)를 매일 투여한 후, 21일째 되는 날 LPS를 5㎎/㎏의 농도로 만들어 1.5㎖/㎏의 용량으로 복강 내로 투여하였다. 어성초 함유 한방원료 혼합 추출물군(HCTM :Houttuynia cordata Thunb and Oriental herb mixture extract-treated group)인 HCTM군에는 100㎎/㎏ 농도의 각각의 분획을 1.5㎖/㎏씩 복강 내에 20일간 매일 투여하고 21일째 되는 날에 LPS를 1.5㎖/㎏의 용량을 복강 내로 투여하였다. LPS를 투여하고 절식시킨 뒤 5시간 후에 에테르(ether)로 마취하고 해부하여 혈액을 채취하고 간을 적출하여 실험하였다.

실험예 I: 어성초 함유 한방원료 혼합추출물( HTCM )의 GOT , GPT 및 지질대사에 미치는 영향

실험예 1: 혈청 중 GOT 와 GPT 의 측정

본 실험예 1에서는 후지 드라이-켐 크리니컬 케미스트리 애널라이저(FUJI DRI-CHEM CLINICAL CHEMSTRY ANALYZER: FUJI DRI-CHEM 3500, FUJIFILM)를 이용하여 실험동물의 혈청 중 GOT(glutamate oxaloactate transaminase) 및 GPT(glutamate pyruvate transaminas)의 함량을 측정하였다.

GOT, GPT 효소들은 일반적으로 NH₄ ⁺로 전환하기 위해 여러 가지 아미노산에서 알파-케토글루타레이트(α-ketoglutarate)까지 알파-아미노 그룹(α-amino group)들을 보낸다. GPT는 알파-케토글루타레이트(α-ketoglutarate)에 알라닌(alanine)의 아미노기를 전달하는 촉매 작용을 한다. GOT는 이 효소들 중에서 알파-케토글루타레이트(α-ketoglutarate)에 아스파르테이트(aspartate)의 아미노 그룹(amino group)을 전달하는 촉매작용을 한다.

혈청 중 GOT와 GPT 효소 레벨의 상승은 간 손상으로 인한 간세포의 괴사와 간조직의 파괴가 진행됨에 따라, 아미노기전이효소(transaminase)가 혈중으로 유리되어 높은 레벨을 나타내는 것이므로 간세포의 변성 및 괴사의 지표가 될 수 있다.

본 실험예 1의 결과가 아래 표 1(혈청 중 GOT 레벨에 어성초 함유 한방원료 혼합추출물이 미치는 효과) 및 표 2(혈청 중 GPT 레벨에 어성초 함유 한방원료 혼합추출물이 미치는 효과), 그리고 도 1 및 도 2에 나타나 있다.

구분	GOT(U/L)
NOR	79.66±0.57
CON	204.00±5.65
HCTM	108.50±4.94
p-value	0.016

상기 표 1 및 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, GOT 레벨에 있어서 LPS를 투여한 대조군이 정상군에 비해 약 2.5배 정도 증가하였으며 HCTM군이 대조군에 비해 76.8%로 감소하는 것으로 나타났다.

구분	GPT(U/L)
NOR	15.50±1.00
CON	81.00±1.15
HCTM	44.66±1.15
p-value	0.001

또한, 상기 표 2 및 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 정상군에 비해 대조군에서 GPT 레벨이 약 5.2배 증가하고, HCTM군에 비해 55.48% 감소하였다.

LPS로 대조군의 혈청 중 GOT, GPT 레벨이 증가한 것으로 보아 LPS도 CCl₄와 비슷한 기전으로 간에 염증을 유발하여 간세포의 변성과 괴성을 유발한 것이라고 사료된다. 대조군에 비하여 HCTM군이 효소 레벨이 감소한 것으로 보아 어성초 함유 한방원료 혼합추출물(HCTM)이 LPS로 손상된 간 기능을 회복시킬 수 있는 작용이 있는 것으로 사료된다.

실험예 2: 혈청 중 총 지질( total lipid ) 함량 측정

총 지질(total lipid)은 혈청 속에 들어 있는 지질의 함량을 측정하는 것으로, 지질의 함량이 높을수록 고지혈증, 동맥경화, 지방간으로 이어지는 것을 알 수 있는 척도로 사용되며, 특히 현대인의 고질병인 성인병의 중요한 척도로 사용된다.

본 실험예 2에서는 실험동물의 혈청 0.1㎖, 표준용액(500㎎/ethanol 100㎖) 0.1㎖, 증류수 0.1㎖에 진한 황산을 각각 2㎖을 첨가한 뒤, 100℃의 끓는 물에서 10분간 반응시킨 후 급속히 식히고, 세 종류의 용액에서 각각 0.1㎖씩 취하여 다른 튜브로 옮기고, 인산바닐린 시약을 400㎖ 첨가하여 37℃에서 15분간 반응시킨다. 반응이 끝난 뒤 540㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

본 실험예 2의 결과가 아래 표 3(혈청 중 총 지질 레벨에 어성초 함유 한방원료 혼합추출물이 미치는 효과) 및 도 3에 나타나 있다.

구분	총 지질(㎎/100㎖)
NOR	256.17±2.57
CON	433.08±4.71
HCTM	313.71±1.92
p=value	0.001

상기 표 3 및 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 총 지질(total lipid)의 경우 대조군이 정상군에 비해 LPS의 투여로 약 1.6배 증가하였으며, HCTM군과 대조군을 비교하였을 때 HCTM군의 총 지질(total lipid) 함량이 34.04% 감소하였다.

대조군에서 LPS투여로 간에 염증을 유발하여 간조직 내의 총 지질(total lipid) 함량이 증가한 것으로 사료되어지며, 대조군에 비하여 HCTM군이 간조직 내의 총 지질(total lipid) 함량을 감소시킨 것으로 보아 어성초 함유 한방원료 혼합추출물(HCTM)이 LPS로 증가된 총 지질(total lipid)의 함량을 감소시키는 작용이 고지혈증 등 지질대사 이상에 의한 성인병에 대한 예방 효과가 있을 것으로 사료된다.

실험예 3: 혈청 중 TG ( Triglyceride )의 함량 측정

TG는 중성지방으로 저장형태이면서 안정한 물질로 몸에 축적된다. 이것이 많을수록 몸에 많은 지질이 쌓이게 되어 성인병으로 이어지는 질병을 초래할 수도 있다. 하지만 TG는 없어서는 안 될 에너지원으로 장기간 에너지 공급이 없을 시 사용되어지는 필수 저장에너지 형태이므로 일정수준 이상일 경우 문제가 된다.

본 실험예 3에서는 후지 드라이-켐 크리니컬 케미스트리 애널라이저(FUJI DRI-CHEM CLINICAL CHEMSTRY ANALYZER: FUJI DRI-CHEM 3500, FUJIFILM)를 이용하여 실험동물의 혈청 중 TG의 함량을 측정하였다.

본 실험예 3의 결과가 아래 표 4(혈청 중 TG 레벨에 어성초 함유 한방원료 혼합추출물이 미치는 효과) 및 도 4에 나타나 있다.

구분	TG(U/L)
NOR	75.33±0.57
CON	294.00±2.12
HCTM	127.33±1.41
p=value	0.000

상기 표 4 및 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, TG의 경우 정상군에 비해 대조군에서 LPS의 간 염증 유발로 인해 TG 레벨이 약 3.9배 증가하였고, 시료군인 HCTM군과 대조군을 비교하였을 때 HCTM군에서 TG 레벨이 76.21% 감소하였다.

이는 LPS가 간염증 유발하여 혈청 속의 TG 레벨을 증가시킨 것으로 사료되어지며, 대조군에 비하여 HCTM군이 혈청 속의 TG 레벨을 감소시킨 것으로 보아 어성초 함유 한방원료 혼합추출물(HCTM)이 비만 등 지질대사 이상에 의한 성인병에 효과가 있을 것으로 사료된다.

실험예 4: 혈청 중 HDL -콜레스테롤( cholesterol )의 함량 측정

콜레스테롤 중 하나인 HDL-콜레스테롤(cholesterol)은 인체 내에서 혈관 내에 침착되는 지질을 간으로 이동시켜주어 대사되게 만들어주는 물질로 동맥경화나 각종 성인병을 예방해주는 물질로 여겨진다.

본 실험예 4에서는 후지 드라이-켐 크리니컬 케미스트리 애널라이저(FUJI DRI-CHEM CLINICAL CHEMSTRY ANALYZER: FUJI DRI-CHEM 3500, FUJIFILM)를 이용하여 실험동물의 혈청 중 HDL-콜레스테롤(cholesterol)의 함량을 측정하였다.

본 실험예 4의 결과가 아래 표 5(혈청 중 HDL-콜레스테롤(cholesterol)의 레벨에 어성초 함유 한방원료 혼합추출물이 미치는 효과) 및 도 5에 나타나 있다.

구분	HDL-cholesterol (U/L)
NOR	75.00±1.52
CON	28.66±1.91
HCTM	74.00±0.70
p-value	0.000

상기 표 5 및 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, HDL-콜레스테롤(cholesterol)에 있어서, LPS를 투여한 대조군이 정상군에 비해 HDL-콜레스테롤(cholesterol) 레벨이 약 2.6배 감소하였고, HCTM군이 대조군에 비해 97.84% 증가하였다.

이는 LPS가 간에 염증을 유발하여 혈청 속의 HDL-콜레스테롤(cholesterol) 레벨이 감소한 것으로 사료되며, 대조군에 비하여 HCTM군이 혈청 속의 HDL-콜레스테롤(cholesterol)의 레벨을 증가시킨 것으로 보아 어성초 함유 한방원료 혼합추출물(HCTM)이 동맥경화 등 혈관질환에 효과가 있을 것으로 사료된다.

실험예 II : 어성초 함유 한방원료 혼합추출물( HCTM )이 항산화에 미치는 영향

LPS는 체내의 단핵백혈구(monocyte), 거식세포(macrophge)에서 슈퍼옥사이드(superoxide)등 자유 라디칼(free radicals)의 생성을 증가시켜서 지질의 과산화화(lipid peroxidation)와 세포독성을 유발한다. 이때 체내에서는 GSH, GPx, SOD및 카탈라아제(catalase)등이 독성에 대해 보호 작용을 한다고 보고되어 있으며, CCl₄ 또한 간에 슈퍼옥사이드(superoxide)등 자유 라디칼(free radical)을 증가시켜 항산화 효소인 MDA, SOD, 카탈라아제(catalase), GPx의 활성이 감소된다고 보고되어있다. 또한, 간 조직에서의 항산화제의 활성정도는 CCl₄로 간독성이 유도될 때 급격히 감소한다고 보고되어 있다.

이에 본 실험예에서는 LPS로 자유 라디칼(free radicals)을 증가시켜 MDA, SOD, 카탈라아제(catalse), GPx의 활성 정도를 측정함으로써 어성초 함유 한방원료 혼합추출물(HTCM)이 항산화에 미치는 효과를 확인하였다.

실험예 5: MDA ( malondialdehyde )의 측정

생체 내 지질과산화물은 분자 내에 퍼록사이드(peroxide) 결합을 갖는 지질의 총칭이다. 하이드로퍼록사이드(Hydroperoxide)가 일반적이며, 그 외에 에포퍼록사이드(epoperoxide), 폴퍼록사이드(polperoxide), 사이클릭 퍼록사이드(cyclic peroxide)등 지질과산화에 의한 최종산물을 말론다이알데하이드(MDA: malondialdehyde)라고 한다. TBA(Thiobarbituric acid)법은 MDA와 TBA사이의 발색반응을 이용한 간접적인 정량법으로 많이 이용되고 있다. 혈장의 과산화 지질(lipid peroxide)은 조직으로부터 방출되어 조직의 지질과산화 상태를 반영하고, 인접조직이나 혈류에 의해 다른 조직에 운반되었을 때 2차적인 퇴행성 변화를 유도한다고 알려져 있다. 이러한 기전은 세포 내의 산화적 스트레스의 증가, 활성산소 생성의 증가와 항산화적 방어력의 감소로 인해 야기되어진다.

본 실험예 5에서는 간 무게의 5배 양의 PBS(Phosphate Buffer Solution 0.05M pH 7.4)를 넣고 간을 균질화하여 실험재료로 사용하였다. 그리고, 간균질액을 3개의 시험관에 각각 0.5㎖씩 취한 뒤 TBA(Thiobarbituruce acid)변법으로 7% SDS(sodium dodesyl sulfate)로 용혈시켜, 여기에 0.67%(동량의 아세트산(acetic acid) 혼합시약) 2㎖를 가하여 95℃ 항온수조(water bath)에서 50분간 가온 후 즉시 급냉시킨 뒤, 부탄올(butanol) 5㎖투여 한 후 800×g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취해 535㎚에서 흡광도를 측정하였다. 1,1,4,4-테트라(tetra)-에톡시프로판(ethoxypropane)을 표준 폼으로 사용하였다.

본 실험예 5의 결과가 아래 표 6(간균질액 중 MDA 레벨에 어성초 함유 한방원료 혼합추출물이 미치는 효과) 및 도 6에 나타나 있다.

구분	MDA(nmol/mg protein)
구분	간균질액(Liver Homogenate)
NOR	1.50±0.24
CON	5.42±0.28
HCTM	2.84±0.02
p-value	0.001

상기 표 6 및 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 간 조직에서의 MDA는 LPS를 투여한 대조군이 정상군에 비해서 약 3.6배 정도로 높게 나타났고, HCTM군은 대조군에 비해 65.81%의 감소효과를 보였다.

이는 대조군에서 LPS가 간 염증을 유발하여 과산화지질함량이 증가한 것으로 사료되며, 대조군에 비해 HCTM군이 과산화지질함량이 감소된 것으로 보아 어성초 함유 한방원료 혼합추출물(HCTM)이 활성산소의 생성을 억제하여 높아진 간 조직 과산화지질함량을 감소시킴으로써 간기능 개선효과가 있을 것으로 사료된다.

실험예 6: SOD ( superoxide dismutase ) 측정

슈퍼옥사이드 음이온(Superoxide anion)은 호기적 대사과정에서 여러 가지 생화학적 반응으로 생성되며, 이것으로부터 생성되는 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical)은 조직 및 거대분자를 파괴하거나 기능을 상실케 한다. 미토콘드리아에서의 MnSOD를 포함하여 세포질의 CuㆍZnSOD는 O₂ ^- 불균화반응을 촉매하여 과산화수소로 빠르게 전환시켜 산소 독성을 방어하는 중요한 기능을 가진다. SOD는 활성산소(ㆍO₂ ^-)를 보다 반응성이 약한 H₂O₂로 전환시키는 효소로 생체 내 해독체계 중 하나이다.

본 실험예 6에서는 프리도비츠(Fridovich)법을 변형하여 SOD 활성도를 측정하였다. 먼저, 간 무게의 5배 양의 PBS(Phosphate Buffer Solution 0.2M pH 7.4)를 넣고 간을 균질화 하여 실험재료로 사용하였다. 또한, 미토콘드리아 분획방법으로는 간 무게의 10배의 A용액(Tris(10mM) 1.21g, Saccharose(0.07M) 23.96g, EDTA(0.1mM) 0.0292g, Mannitol(0.21M) 36.44g를 혼합하여 HCl(0.1N) 83.36㎖와 D.D.W를 넣어서 1ℓ로 정용)을 넣고 균질화 한 뒤, 600×g, 4℃에서 10분간 원심 분리하였다.(한일원심분리기, 한국) 그리고, 상층액을 떠서 다시 8,000×g에서 10분 원심분리하여 가라앉은 덩어리를 0,1M PBS 5㎖로 녹여서 실험재료로 사용하였다.

SOD의 측정은 보샹(Beauchamp)과 프리도비츠(Fridovich)의 방법에 따라 0.2M K-포스페이트 버퍼(phosphate buffer) (pH 7.4)를 672㎕, 1mM 크산틴(xanthine) 100㎕, 1% 소디움 디옥시클로레이트(sodium deoxychlorate) 30㎕, 1.5mM KCN 30㎕, 0.2mM 시토크롬(cytochrome) C 150㎕를 넣은 혼합물에 샘플 8㎕를 넣고, 크산틴 옥시데이즈(xanthine oxidase) 원액을 10㎕를 넣어 혼합한 후, 엘리사(Elisa)를 이용하여 550nm에서의 흡광도 변화를 2분 동안 측정하였다. 효소의 활성도는 표준액으로 시그마사의 항산화효소 기준(superoxide dismutase standard)을 사용하여 측정하였다.

본 실험예 6의 결과가 아래 표 7(미토콘드리알 프랙션(mitochondrial faction)에서 SOD 활성에 어성초 함유 한방원료 혼합추출물이 미치는 효과) 및 도 7에 나타나 있다.

구분	SOD (mU/mg protein)
구분	Mitochondrial fraction
NOR	121.75±0.47
CON	56.61±1.70
HCTM	113.26±3.08
p-value	0.002

상기 표 7 및 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 간 조직에서의 SOD 활성정도는 LPS를 투여한 대조군이 정상군에 비해서 약 2.1배 정도로 낮게 나타났고 HCTM군은 대조군에 비해 86.96%의 상승효과를 보였다.

대조군에서 LPS의 투여로 간염증을 유발하여 SOD 활성정도가 감소한 것으로 사료되며, 대조군 보다 HCTM군이 SOD 활성정도가 증가한 것으로 보아, 어성초 함유 한방원료 혼합추출물(HCTM)이 활성산소의 생성을 억제하여 산소독성을 감소시킴으로써 손상된 간조직의 기능을 회복시킨 것으로 사료된다.

실험예 7: 카탈라아제( Catalase ) 측정

카탈라아제(Catalase)는 과산화수소(hydrogen peroxide)를 물로 환원시키는 역할을 담당하는 효소로서 SOD와 함께 체내 항산화효소 시스템의 근간을 이루고 있다. 일반적으로 스트레스에 의해 각종 대사가 증진되어 활성산소가 생성되고 이오 인해 SOD의 활성이 증가될 경우 카탈라아제(catalase) 활성도 함께 증가하는 것으로 알려져 있다.

카탈라아제(Catalase)는 세포내에서 생성된 과산화수소를 소거하여 세포내 페록시데솜(peroxidesomes)에 주로 분포되어 있고 H₂O₂농도가 높을 때 주로 작용한다.

본 실험예 7에서는 간무게의 5배 양의 PBS(Phosphate Buffer Solution 0.05M pH 7.0)를 넣고 간을 균질화하여 실험재료로 사용하였다. 카탈라아제의 측정은 에비(Aebi)의 방법을 이용하여 포스페이트 버퍼(phosphate buffer) (0.05M pH 7.0) 1.9㎖에 샘플 호모제네이트(sample homogenate)와 미토콘드리알 프랙션(mitochondrial fraction)을 800×g에서 20분 원심 분리한 상등액 100㎕를 버퍼(buffer)로 10, 20, 40, 80배 희석, 0.1㎖와 과산화수소용액 1㎖를 혼합하여 240㎚에서 90초 동안 흡광도 감소를 측정하였다.

본 실험예 7의 결과가 아래 표 8(간균질액 중 카탈라아제 활성(Catalase activities)에 어성초 함유 한방원료 혼합추출물이 미치는 효과) 및 도 8에 나타나 있다.

구분	카탈라아제 (mU/mg protein)
구분	간균질액(Liver Homogenate)
NOR	315.39±4.99
CON	100.69±8.22
HCTM	232.64±1.71
p-value	0.402

상기 표 8 및 도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 간 조직에서의 카탈라아제 활성 정도는 LPS를 투여한 대조군이 정상군에 비해서 약 3.1배 정도로 낮게 나타났고 HCTM군은 대조군에 비해 57.26%의 상승효과를 보였다.

LPS가 간염증을 유발시켜 카탈라아제 함량이 감소된 것으로 사료되어지며 대조군 보다 HCTM군이 카탈라아제가 증가된 것은 어성초 함유 한방원료 혼합추출물(HCTM)이 활성산소를 제거하므로써 생체내 대사과정에서 생성된 유독한 과산화물로부터 생체조직을 보호하여 손상된 간조직의 기능을 회복시킨 것으로 사료된다.

실험예 8: GPx ( glutathione peroxidase ) 활성도 측정

글루타티온(Glutathione)은 글루타메이트(glutamate), 시스테인(cysteine), 글리신(glycine)으로 구성된 트리펩타이드(tripeptide)로서 세포기능에 있어 항산화제로써 중요한 역할을 하며, 요산(uric acid), 비타민 C 등과 함께 생체내 주요 수용성 항산화제 중 하나이다. 세포내 단백질 또는 펩타이드(peptide)의 생리적, 화학적 조절뿐만 아니라 활성산소와 생체이물(xenobiotics)의 무독화에 관여한다. 특히 직접적인 활성산소의 소거제나 글루타티온 페록시다아제(glutathione peroxidase)의 코펙터(cofactor)로 작용하여 활성산소에 대한 높은 보호효과를 나타낸다. 글루타티온(Glutathione)은 체내에서 환원형(GSH)과 산화형(GSSG)으로 존재하는데, 무독화에 참여한 GSH는 GSSG로 산화된 후 글루타티온 리덕타아제(glutathione reductase)에 의해 다시 GSH로 환원된다. 그러므로 GSH와 GSSG는 체내에 얼마만큼의 산화적 손상이 있었는지의 척도가 될 수 있다.

본 실험예 8에서는 간무게의 5배 양의 PBS(Phosphate Buffer Solution 0.1M pH 7.0)를 넣고 간을 균질화하여 실험재료로 사용하였다. GPx의 측정은 로렌스(Lawrence)등의 방법에 준하여 0.1M 포스페이트 버퍼(phosphate buffer)(4 mM EDTA) 400㎕, 0.01M NaN₃ 70㎕, 0.01M GSH 70㎕, 1.5mM NADPH 70㎕, H₂O 360㎕, GSSG-환원효소(GSSG-reductase) (1.8 U/ml) 20㎕, 샘플 10㎕를 혼합하여 상온에서 1분간 방치한 후, 5mM H₂O₂ 100㎕를 가해 잘 섞은 후 340㎚에서 90초 동안 흡광도 감소 측정을 하였다.

본 실험예 8의 결과가 아래 표 9(간균질액 및 미토콘드리아 프랙션 중 GPx 활성에 어성초 함유 한방원료 혼합추출물이 미치는 효과) 및 도 9에 나타나 있다.

구분	GPx (mU/mg protein)
구분	간균질액(Liver Homogenate)
NOR	141.93±1.72
CON	49.92±8.05
HTMG	116.86±1.64
p-value	0.001

상기 표 9 및 도 9에서 알 수 있는 바와 같이, 간 조직에서의 GPx활성정도는 LPS 투여로 대조군이 정상군에 비해서 약 2.8배 정도로 낮게 나타났고 HCTM군은 대조군에 비해 72.75%의 상승효과를 보였다.

LPS가 간염증을 유발하여 GPx함량이 감소된 것으로 사료되며, 대조군 보다 HCTM군이 GPx 활성정도가 높게 나타난 것으로 보아 어성초 함유 한방원료 혼합추출물(HCTM)이 활성산소에 대한 보호효과를 나타내어 LPS의 투여로 인한 효소 불활성을 예방하여 활성을 높이는 역할을 한 것으로 사료된다.

상기 실험예를 통하여, 전반적으로 LPS에 의해 유도된 간독성에 대하여 어성초 함유 한방원료 혼합 추출물(HCTM)이 지질대사 관련 반응에서 GOT, GPT, 총 지질(total lipid), TG를 낮추고, HDL-콜레스테롤(HDL-cholesterol)을 높여서 지질대사를 개선하는 효과가 있음을 알 수 있었다.

또한 LPS에 의해 유도된 간독성에 대하여 어성초 함유 한방원료 혼합추출물(HCTM)이 항산화효소 관련 반응에서 MDA를 낮추고 SOD, 카탈라아제(catalase), GPx를 높여 항산화 효소를 활성화시키는 효과가 있음이 밝혀졌다.

그러므로, 어성초 함유 한방원료 혼합 추출물은 간기능 개선 및 지질대사개선 기능을 가진 한방차의 주원료로 사용될 수 있을 것으로 사료된다.

도 1은 혈청 중 GOT 레벨에 어성초 함유 한방원료 혼합추출물이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.

도 2는 혈청 중 GPT 레벨에 어성초 함유 한방원료 혼합추출물이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 혈청 중 총 지질 레벨에 어성초 함유 한방원료 혼합추출물이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.

도 4는 혈청 중 TG 레벨에 어성초 함유 한방원료 혼합추출물이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 혈청 중 HDL-콜레스테롤(cholesterol)의 레벨에 어성초 함유 한방원료 혼합추출물이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.

도 6은 간균질액 중 MDA 레벨에 어성초 함유 한방원료 혼합추출물이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.

도 7은 미토콘드리알 프랙션(mitochondrial faction)에서 SOD 활성에 어성초 함유 한방원료 혼합추출물이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.

도 8은 간균질액 중 카탈라아제 활성(Catalase activities)에 어성초 함유 한방원료 혼합추출물이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.

도 9는 간균질액 및 미토콘드리아 프랙션 중 GPx 활성에 어성초 함유 한방원료 혼합추출물이 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.

Claims

어성초 90중량부를 기준으로 여기에 오미자 1~3중량부, 구기자 1~3중량부, 사상자 3~5중량부 및 음양곽 1~3중량부을 혼합하여 혼합물을 제조하는 제 1단계;

상기 혼합물에 증류수 1900~2100중량부를 더 첨가하여 환류 냉각한 뒤, 거름종이로 걸러 추출액을 얻는 제 2단계; 및

상기 추출액을 감압 농축하여 최종 농축물을 얻는 제 3단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 LPS 간독성 해독에 유용한 어성초 함유 한방원료 혼합추출물의 제조방법.
제 1항에 있어서,

상기 환류 냉각은 50~70℃에서 7~9시간 동안 행하여 지는 것을 특징으로 하는 LPS 간독성 해독에 유용한 어성초 함유 한방원료 혼합추출물의 제조방법.
제 1항에 있어서,

상기 감압 농축은 상기 최종 농축물의 양이 상기 어성초 90중량부를 기준으로 90~110중량부가 될 때까지 실행하는 것을 특징으로 하는 LPS 간독성 해독에 유용한 어성초 함유 한방원료 혼합추출물의 제조방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 의한 방법에 의해 제조되는 것을 특징 으로 하는 LPS 간독성 해독에 유용한 어성초 함유 한방원료 혼합추출물.
상기 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 의한 방법에 의해 제조된 어성초 함유 한방원료 혼합추출물을 LPS로 인한 간의 독성을 해독하는데 사용하는 용도.