KR20090021751A - 항－테나신 ｃ 펩타이드 앱타머 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 특정 아미노산 서열을 갖는 항-테나신 C(anti-tenascin C) 펩타이드 앱타머 및 이를 포함하는 종앙 검출용 진단 키트에 관한 것이다. 본 발명의 항-테나신 C 펩타이드 앱타머는 테나신 C에 대하여 특이적으로 결합할 뿐만 아니라, 분자량이 작기 때문에 소거율(clearance)이 우수하여 인 비보 또는 엑스 비보 종양 이미징에 매우 유리하다.
테나신, 펩타이드, 앱타머, 종양, 암

Description

항－테나신 Ｃ 펩타이드 앱타머{Peptide Aptamers against Tenascin C}
본 발명은 항－테나신 C 펩타이드 앱타머 및 그의 용도에 관한 것이다.
종양발생은 암세포 자체에서의 유전적 변이뿐만 아니라, 주변의 스트로마 및 세포외기질(ECM)에서의 변화도 동반한다. 종양 세포와 스트로마 세포 사이의 상호작용은 종양 형성 및 발전에 기여하지만, 관여하는 ECM 단백질들은 아직까지 규명되어 있지 않다. 테나신 C는 발생 단계에서 발현되는 접착(adhesion) 조절 ECM 단백질로서, 정상적인 성숙 조직에서는 발현되지 않는다(1, 2). 그러나, 테나신 C는 종양-특이 마이크로환경에서 확인되었고, 이의 고발현은 종양 형성 및 발전에 관여하는 것으로 예상되고 있다(3, 4).
테나신 단백질들(C, X, R 및 W)는 멀티머 복합체를 형성하는 큰 분자량의 당단백질로서, 조직 리모델링 과정이 관여하는 병리학적 상태에 기여한다. 예를 들어, 테나신 단백질은 세포 증식, 침윤 및 종양 형성을 야기하는 다양한 시그널링 경로를 촉진시킨다(5).
많은 고형암에서 테나신 C의 발현 양상은, 종양 위치에 타겟팅 하기 위하여 테나신 C 결합 분자를 사용하는 새로운 기회를 제공한다. 테나신 C의 큰 이소폼은 선택적 스플라이싱에 의해 생성되며, 종양 발전과 관련이 있는 것으로 보고 되었다(6-8). 따라서, 테나신 C는 많은 암들의 진단 및 예후에 대한 우수한 바이오마커가 될 수 있다(9). 항-테나신 C 항체는 종양 타겟팅에 유효하며, 방사능동위원소-표지된 단일클론 항체는 임상 시험 중에 있다(10-12). RNA 앱타머는 타겟팅 및 이미징 수단으로서 개발되고 있다(13, 14).
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 테나신 C에 특이적으로 결합하여, 인 비보 또는 엑스 비보에서 테나신 C를 타겟팅하고 또한 테나신 C의 기능을 억제할 수 있는 앱타머를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 파아지 디스플레이스 방식으로 테나신 C에 대한 우수한 특이적 결합능을 나타내는 앱타머를 발굴함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 항-테나신 C(anti-tenascin C) 펩타이드 앱타머를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상술한 항-테나신 C(anti-tenascin C) 펩타이드 앱타머를를 포함하는 종앙 검출용 진단용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 일반식 1로 표시되는 항-테나신 C(anti-tenascin C) 펩타이드 앱타머를 제공한다:
일반식 1
Xaa1-His-Lys-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10
상기 일반식에서, Xaa1는 Phe, Trp, Leu 또는 Thr이고, Xaa2는 Pro, His, Thr 또는 Ile이며, Xaa3은 아미노산 20종에서 선택되는 어느 하나의 아미노산이고, Xaa4는 Phe, Ser, Pro, Trp, Lys, Arg 또는 Gln이며, Xaa5는 Pro, Arg, Ser, Thr, Lys 또는 Ile이고, Xaa6는 아미노산 20종에서 선택되는 어느 하나의 아미노산이며, Xaa7은 아미노산 20종에서 선택되는 어느 하나의 아미노산이고, Xaa8은 아미노산 20종에서 선택 되는 어느 하나의 아미노산이며, Xaa9은 Arg, Pro, Phe, Leu, Val, Thr, Asn 또는 Ser이고, Xaa10은 아미노산 20종에서 선택되는 어느 하나의 아미노산이다.
본 발명자들은 테나신 C에 특이적으로 결합하여, 인 비보 또는 엑스 비보에서 테나신 C를 타겟팅하고 또한 테나신 C의 기능을 억제할 수 있는 앱타머를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 파아지 디스플레이스 방식으로 테나신 C에 대한 우수한 특이적 결합능을 나타내는 앱타머를 발굴함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
항체- 및 RNA 앱타머-기초 테나신 C 타겟팅에 대한 대안으로서, 본 발명자들은 테나신 C-발현 암 세포 및 고형 종양에 선택적으로 결합하는 작은 분자량의 펩타이드 앱타머를 개발하였다. 이러한 작은 분자량의 펩타이드 앱타머는 많은 이점을 가지고 있다: 저비용, 면역원성의 상당한 부재 및 세포독성제와의 용이한 커플링. 펩타이드 앱타머의 가장 중요한 이점은 다양성이다(15-18). 예를 들어, 종양 결합 펩타이드 서열은 바이러스의 코트 단백질에 결합시킬 수 있으며(19, 20), 리포좀 및 나노입자와 같은 새로운 타겟팅 물질이 펩타이드 앱타머와 같이 사용될 수 있다(21).
본 발명은 항-테나신 C에 특이적으로 결합하는 펩타이드 앱타머를 제공한다.
본 명세서 테나신 C를 언급하면서 사용되는 용어 “앱타머”는 테나신 C에 결합능을 가지는 4-40, 바람직하게는 5-30, 보다 바람직하게는 5-20, 가장 바람직 하게는 8-15 아미노산 잔기의 펩타이드를 의미한다. 앱타머 펩타이드는 선형 또는 환형일 수 있다.
본 발명의 앱타머는 상기의 일반식 1로 표시된다. 상기 일반식 1에서, 펩타이드 몇몇 위치는 어떠한 아미노산, 즉 아미노산 20종에서 어떠한 것도 위치할 수 있다. 상기 아미노산 20종은, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Glu, Asp, Gln, Asn, His, Arg, Lys, Ser, Thr, Trp, Cys, Met 및 Tyr이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 일반식 1에서 Xaa1는 Phe이다. 바람직하게는, 상기 Xaa2는 Pro 또는 His이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 Xaa3는 Phe, Lys, Ser, Gln, Pro 또는 Arg이다. 바람직하게는, 상기 Xaa4는 Ser 또는 양전하를 갖는 아미노산(예컨대, Arg 또는 Lys)이고, 보다 바람직하게는 Ser이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 Xaa5는 Pro이다. 바람직하게는, 상기 Xaa6는 Lys, Ala, Ser, Pro, Tyr, Ile, His 또는 Thr이다.
바람직하게는, 일반식 1에서 Xaa7은 Gly, Leu, Pro, Arg, Thr, Met 또는 His이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, Xaa8은 Ser, Ile, Gly, Gln, Leu, Pro 또는 Arg이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, Xaa9은 Pro이다. 바람직하게는, 일반 식 1에서 Xaa10은 Arg, Val, Ile, Ser, Phe, Lys, Gln, Leu, Pro 또는 Ala이다.
본 발명의 펩타이드 앱타머의 구체적인 아미노산 서열은, 서열목록 제1서열 내지 제11서열에 기재되어 있으며, 바람직하게는, 서열목록 제1서열 또는 제2서열의 아미노산 서열로 이루어져 있다.
본 발명의 앱타머는 펩타이드 구조를 갖는다. 본 명세서에서 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형 또는 환형, 바람직하게는 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer . Chem . Soc . 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).
본 발명의 펩타이드 앱타머는 그 자체로서 매우 우수한 안정성을 나타내지만, 펩타이드의 아미노산 잔기를 변형시킴으로써 더욱 더 안정성을 향상시킬 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드 앱타머의 아미노산 서열에서 적어도 하나의 아미노산, 바람직하게는 N-말단은 Gly 잔기, 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 가장 바람직하게는 Gly 잔기가 결합되어, 펩타이드 앱타머의 안정성을 증가시킨다.
본 발명의 펩타이드 앱타머의 N-말단에 Gly 잔기가 추가적으로 결합되는 경 우, 추가적 Gly 잔기의 개수는 1-8개, 바람직하게는 2-6개, 보다 바람직하게는 2-4개, 가장 바람직하게는 3개이다.
테나신-C에 대한 본 발명의 펩타이드 앱타머는 암 진단 및 치료, 그리고 아테롬성 동맥경화증과 건선의 진단 및 치료에 이용될 수 있다. 본 발명의 펩타이드 앱타머는 항체와 비교하여, 매우 작은 분자량을 갖기 때문에, 혈액으로부터 매우 빠르게 소거(clearance)된다. 이러한 빠른 혈액 소거율은 인 비보 진단 이미징에서 매우 중요하며, 이는 혈액에서의 농도는 이미징에서 백그라운드를 유발하는 주요한 요인이기 때문이다. 또한, 빠른 혈액 소거율은 치료에 있어서도 매우 중요하며, 이는 혈액에서의 농도가 독성을 유발하는 주요한 요인이기 때문이다.
따라서, 본 발명의 항-테나신 C 펩타이드 앱타머는 종양 치료, 인 비보 또는 엑스 비보 진단 이미징에 특히 유리하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 펩타이드 앱타머를 포함하는 종앙 검출용 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에서 이용되는 항-테나신 C 펩타이드 앱타머는 테나신 C를 고발현 하는 종양세포, 특히 종양세포의 핵에 존재하는 테나신 C에 특이적으로 결합하여 종양을 효과적으로 검출한다.
본 발명의 펩타이드 앱타머의 진단제로서의 유용성을 높이기 위하여, 앱타머에 검출 가능한 시그널을 발생시키는 물질(예컨대, dye)을 직접적으로 또는 간접적으로 표지(labelling)시킬 수 있다. 앱타머에 결합시킬 수 있는 시그널-발생 물 질은, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 화학물질(예컨대, 바이오틴), 형광물질[예컨대, 플루오레신, FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민 6G(rhodamine 6G), 로다민 B(rhodamine B), TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole) 및 Coumarin], 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.
상술한 표지를 펩타이드 앱타머에 직접 결합시킬 수도 있지만, 간접적으로 결합시킬 수도 있다. 예를 들어, 펩타이드 앱타머에 바이오틴을 결합시키고, 상술한 표지가 컨쥬게이션된 스트렙타비딘(또는 아비딘)을 상기 바이오틴에 결합시키면, 펩타이드 앱타머를 간접적으로 표지로 레이블링할 수 있다.
본 발명의 펩타이드 앱타머를 이용하여, 인 비트로 또는 엑스 비보 식으로 종양을 검출하는 경우, 생체에서 분리된 생시료(biosample)을 이용하여 종양을 검출하게 된다. 이 경우, 본 발명의 진단용 키트는 통상적인 면역분석 프로토콜에 이용될 수 있다. 이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처- ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme -linked immunosorbent assay ( ELISA ), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 펩타이드 앱타머를 이용하여, 인 비보 식으로 종양을 검출하는 경우에는 펩타이드 앱타머를 생체 내에 직접 주입하여 종양을 검출한다.
본 발명에 의해 진단될 수 있는 암 또는 종양은 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암이며, 가장 바람직하게는, 신경교종, 결장 선양암종 또는 폐 종양이다.
본 발명에서 이용되는 항-테나신 C 펩타이드 앱타머는 상술한 본 발명의 펩타이드 앱타머이며, 바람직하게는, 서열목록 제1서열 또는 제2서열의 아미노산 서열로 이루어져 있다.
본 명세서에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 항-테나신 C(anti-tenascin C) 펩타이드 앱타머 및 이를 포함하는 종앙 검출용 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 항-테나신 C 펩타이드 앱타머는 테나신 C에 대하여 특이적으로 결합할 뿐만 아니라, 분자량이 작기 때문에 소거율(clearance)이 우수하여 인 비보 또는 엑스 비보 종양 이미징에 매우 유리하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험 재료 및 실험 방법
세포 배양
인간 U118MG 및 U251 신경교종 세포, HCT116, HT-29, DLD-1, SW480 및 SW620 결장암 세포, 그리고 293T 인간 배아 신장세포(American Type Culture Collection, Rockville, MD)를 10% 우태아 혈청(FBS)이 있는 DMEM에서 배양하였다.
역전사 - PCR
총 세포 RNAmf TRIzol(Invitrogen)로 분리하였고, M-MuLV 역전사 효소(Stratagene)로 역전사하였으며, 이를 PCR 반응에 이용하였다. 다음의 PCR 프라이머가 이용되었다: 테나신 테나신 C 피브리노겐 글로브 (TNC fbg), 5'-GGTACAGTGGGACAGCAGGTG-3' (전방향) 및 5'-AACTGGATTGAGTGTTCGTGG-3'(역방향); TNC 택일적 스플라이싱(AS), 5'-CCCTGCTCTGGAAGACACC-3' (전방향) 및 5'-ATAAGGCGTAGCAGCCTTGA-3' (역방향); GAPDH 5'-TGACATCAAGAAGGTGGTGA-3' (전방향) 및 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'(역방향). cDNA를 일반적인 PCR 반응으로 증폭하였고, 산물을 2% 아가로스 젤에서 전기영동하고 에티듐 브로마이드로 염색하여 분석하였다. PCR 반응 조건은 대체적으로 다음과 같다: cDNA (10 μM), 1 x Mg2 + 결여 완충액, 2.5 mM MgCl2 , 250 nM 전방향 프라이머, 250 nM 역방향 프라이머, Taq 중합효소 l U (GENE Craft, German)을 첨가하고 총 부피가 50 ㎕ 되도록 제작한 뒤 94℃에서 5분 동안 변성시키고, 94℃에서 30초, 56℃에서 30초 및 72℃에서 30초간 30회 반응시키고, 72℃에서 7분간 연장 (extension)시켜 반응을 종결하였다.
웨스턴 블롯 분석
총 세포 추출물(40 ㎍)를 준비하고, 8% SDS-PAGE로 분리한 다음, 니트로셀룰로오스에 블롯팅 한 다음, 항-테나신 C 항체(BC24; Sigma-aldrich, Saint Louis, Missouri)와 반응시켰다. 항-α-튜블린을 대조군으로 이용하였다.
재조합 단백질 및 파아지 디스플레이 라이브러리
테나신 C 택일적 스플라이스 도메인(TNCfnA-D)을 발현하는 pET 벡터를 Dr. Harold P. Erickson (Duke University Medical Center)로부터 제공받았다. 재조합 (His)6-태깅 단백질을 제조하기 위하여, 테나신 C 택일적 스플라이스 도메인의 DNA 서열을 TNCfnA-D 플라스미드를 주형으로 하고, TNCfnA-D 센스(5'-ATAGGATCCGAACAAGCCCCT-3') 및 TNCfnA-D 안티센스 (5'-GCCGGATCCCTATGTTGTTGC -3') 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 증폭된 단편을 pET28a+ 벡터(Novagen)의 BamHI 위치에 삽입하여 (His)6-태깅-TNCfnA-D 벡터를 제조하였다. 라이게이션된 DNA를 이용하여 E. coli BL21 (DE3) 세포를 형질전환 시키고, 재조합 DNA를 DNA 서열 분석으로 확인하였다. (His)6-태깅-TNCfnA-D 융합 단백질을 제조하기 위하여, 형질전환된 세포를 카나마이신이 있는 LB 배지에서 600 nm OD 값이 0.6이 될 때까지 배양하였다. 이어, 0.4 mM 이소프로필-1-티오-D-갈락토피라노사이드를 배지에 첨가하여, 추가적으로 30℃에서 4시간 동안 배양하였다. 세포를 원심분리로 수집한 다음, 1 mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드 및 1 mg/ml 라이소자임이 있는 라이스스 완충액(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, pH 8.0) 15 ml에 재현탁 하고, 30% 펄스로 7분 동안 초음파 파쇄 하였다. 파쇄물을 4℃에서 30분 동안 13,000 rpm으로 원심분리하고, (His)6-태깅-TNCfnA-D 융합 단백질을 제조사(Qiagen, Valencia, CA)의 프로토콜에 따라 Ni-NTA 아가로스로 정제하였다. 전장 테나신 C 단백질은 Chemicon (Temecula, CA)으로부터 구입하였고, 파아지-디스플레이 펩타이드 라이브러리(Ph.D.-12)는 New England Biolabs (Beverly, MA)으로부터 구입하였다.
테나신 C-결합 파아지의 바이오패닝
0.1 M NaHCO3 (pH 8.6) 내의 0.15 ㎖ (His)6-태깅-TNCfnA-D (10 ㎍/㎖) 또는 전장 테나신 C 단백질(20 ㎍/㎖)로 코팅된 96-웰 플레이트에서 파아지 라이브러리를 4℃에서 O/N 동안 패닝 하였다. 상기 웰을 블록킹 완충액 (0.1 M NaHCO3 [pH 8.6], 0.5% BSA 및 0.02% NaN3)으로 4℃에서 1시간 동안 블록킹 한 다음, 2 x 1011 pfu/㎖를 타겟 단백질-코팅된 플레이트에 첨가하였다. 25℃에서 30분 동안 반응시킨 다음, 비결합 또는 약하게 결합된 파아지를 TBST로 10번 세척하여 제거하였고, 결합된 파아지는 0.1 ml 용출 완충액(0.2 M 글라이신-HCl [pH 2.2] 및 0.1% BSA)에서 8분 동안 항온처리하여 용출시켰다. 회수된 파아지를 이용하여, E. coli ER2738 (NEB)를 감염시키고, 이어 증폭한 다음, 1/6 vol PEG/NaCl (20%(w/w) 폴리에틸렌 글라이콜 8000 및 2.5 M NaCl)로 침전시켜 정제하고, 다음 라운드의 패닝에 이용하였다. 3회 패닝 라운드 이후, 독립적인 클론들을 LB/IPTG/X-gal 플레이트 상에서 분리하고, 형성된 플라크의 수에 기초하여 파아지 타이터를 계산 하였다.
DNA 서열 분석
3개의 독립적인 선택으로부터 얻은 42개의 클론에 대하여 시퀀싱을 실시하였다. 개별적 파아지 클론들을 PEG/NaCl로 침전시켜 정제하였다. 파아지 펠릿을 요도다이드 완충액(10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1 mM EDTA 및 4 M NaI)에 현탁한 다음, 단일-가닥 파아지 DNA를 에탄올로 침전시켰다. 분리된 DNAs의 뉴클레오타이드 서열은, 자동 시퀀서(ABI prism) 및 프라이머 5'-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3'를 이용하여 결정하였따.
펩타이드의 합성
선택된 펩타이드 및 스크램블 펩타이드는, Peptron Inc. (Republic of Korea)에서 합성하였다. 합성된 펩타이드 서열은 FHKPFFPKGSARGGG (#1), FHKHKSPALSPVGGG (#2) 및 VSPKSHLKAHPFGGG (#2 스크램블)이다. 음성 대조군으로서, sialyl 루이스 X 탄수화물에 결합하는 SHWDQPRPGLKP를 이용하였다(22). 모든 펩타이드는 C-말단에 Gly 3개를 추가한 후 아미드화하고, N-말단에 바이오틴을 결합한 형태로 합성하였다.
면역화학
세포를 커버슬립에서 성장시키고, 실온에서 3.7% 파라포름알데하이드로 15분 동안 고정화 하고, 0.5% Triton X-100(in PBS)로 투과화 하였다. 세포를 세척하고, 10% 정상 소 혈청, 0.5% 젤라틴(in PBS)에서 30분 동안 실온에서 블록킹 하였다. 실온에서 1시간 동안 바이오틴-표지된 펩타이드로 염색을 실시하였다. 이차 TEXAS RED-결합 스트렙타비딘 (Calbiochem, La Jolla, CA, 1:200 희석)을 암 환경에서 50분 동안 실온에서 반응시켰다. 이어, 세포를 Hoechst33258로 카운터염색을 하였다.
동결 조직 섹션에 대한 면역형광 분석
누드 마우스의 옆구리에 2 x 106 HT29 또는 U118MG 세포를 피하주입하여 종양 제노그라프트를 구축하였다. 종양이 9-10 mm에 도달하였을 때, 마우스를 희생시키고, 종양 조직을 얻은 다음 -80℃에서 동결 보관 하였다. 8-10 μm의 두께의 동결 섹션을 절단하고 3.7% 파라포름알데하이드로 실온에서 15분 동안 고정한 다음, 0.5% Triton X-100(in PBS)으로 투과화 하였다. 세포를 세척하고 10% 우태아혈청, 10% 비지방 건조 밀크, 3% BSA(in PBS)로 2시간 동안 실온에서 블록킹 하였다. 세포를 항-테나신 C 항체(BC24; Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, 1:1000 희석), 항-β-카테닌 항체 (clone 14; BD Transduction Laboratories, Germany, 1:100 희석) 또는 바이오틴-표지 펩타이드로 하룻밤동안 4℃에서 염색시켰다. 이차 FITC-결합 항-마우스 IgG 항체(Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, 1:1000 희석) 또는 TEXAS RED-결합 스트렙타비딘(Calbiochem, La Jolla, CA, 1:1000 희석)으로 암 환경에서 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 세포를 Hoechst33258로 카운터 염색 하였다.
조직 마이크로어레이에 의한 면역형광 분석
폐 조직 마이크로어레이는 서울대학교 의과대학 분당병원에서 파라핀 블록을 완성하였다. 폐종양 조직 마이크로 어레이는 서울 대학교 분당 병원에서 파라핀 블록을 완성하였다. 이것의 구성은 36 선양암종, 15 편평세포 암종, 1 세기관지 폐포암 및 1 정상 폐조직으로 이루어져 있다. 조직 단면의 왁스를 자일렌으로 제거하고 농도별 에탄올을 첨가하여 수화시켜 주었다. 항원 회복을 위하여 타깃 회수 용액, Tris/EDTA (pH 9; Dako)에서 20분간 가열해 주었다. 염색은 TNC 특이 단일클론 항체(BC24, Sigma aldrich) 또는 펩타이드와 반응시키고, 세척을 하였다. 항체를 이용한 경우에는 형광물질(FITC)로 표지한 이차항체를 이용하였고, 펩타이드를 이용한 경우에는 펩타이드의 바이오틴에 강하게 결합하는 스트렙타비딘에 형광표지(TEXAS RED)를 이용하였으며, 최종적인 결과를 형광현미경(Zeiss Autoplan2, Carl Zeiss)을 이용하여 관찰하였다.
실험 결과
테나신 C 결합 펩타이드 서열의 규명
암-특이적 테나신 C 단백질 이소폼에 결합하는 펩타이드 앱타머를 스크리닝 하기 위하여, 피브로넥틴 타입 Ⅲ (FN Ⅲ) (A1-D)의 택일적 스플라이싱 도메인을 His-태깅 테나신 C 단백질(도 1a에서 His-TNCfnA-D으로 표시됨) 형태로 발현시켰다. 또한, 상기 택일적 스플라이싱 도메인, EGF 도메인, 피브리노겐 글로브(fbg) 및 다른 발현 FNⅢ 도메인을 포함하는 전장 테나신 C(도 1a에서, 전장 TNC로 표시됨)을 이용하였다. 타겟으로서 테나신 C 단백질의 두가지 다른 폼을 이용하여 펩타이드 앱타머의 3번의 독립적인 선택을 실시하였다. 전장 테나신 C 단백질을 이용한 3번의 바이오패닝 후, 상대적 파아지 수율이 상당히 증가하였다(도 1b).
Figure 112007062575916-PAT00001
Ph.D.-12 라이브러리로부터 얻은 23개의 클론 중에서, 9 클론은 동일한 서열을 나타내었고(#1 펩타이드), 다른 3 클론도 동일한 서열을 나타내었으나(#2 펩타이드) 나머지 클론들은 유사한 서열을 나타내었다. His-TNCfnA-D를 선택을 위한 타겟으로 이용한 경우, 19개의 유사한 서열을 얻었다. 컨센서스 서열 (FHK(P/H)-(S/+)P---P--)은 대부분의 선택된 펩타이드에서 관찰되었고, 42개의 클론에서 볼 수 있었다. 대부분의 서열은 아미노 말단 FHKH 및 SP 또는 PX2 -4P 모티프를 포함하였다. BLAST 및 CDD (Conserved Domain Database, 23)를 이용하여 상동성 아미노산 서열을 검색한 결과, #1 펩타이드가 글라이코실 하이드라로즈(glycosyl hydraloses)의 진화적 보존성 도메인과 상당한 상동성을 나타내었다. 또한, #2 펩타이드는 글라이코실 하이드라로즈 뿐만 아니라 당화 효소들과 어느 정도 상동성을 나타내었다. 이들 두 펩타이드 서열은 선택된 서열의 대표적인 예이기 때문에, 펩타이드 앱타머 #1 (FHKPFFPKGSAR) 및 #2 (FHKHKSPALSPV)를 합성하였다. 이 경우, M13 코트 단백질로부터 플랭킹 서열(-GGG)을 갖도록 하였다. 대조군으로서, 펩타이드 #2의 스크램블 폼(VSPKSHLKAHPFGGG)을 합성하였다.
인간 암 세포주에서 테나신 C mRNA 및 단백질의 발현
다양한 인간 암 세포주(U118MG 및 U251 신경교종 세포, HCT116, HT-29, DLD-1, SW480 및 SW620 결장 암세포) 및 정상 인간세포(293T)에서 테나신 C 발현 여부를 조사하였다(도 2a-2b). 도 2a에서 볼 수 있듯이, U118MG, U251 및 SW620 세포에서 테나신 C mRNA가 높은 레벨로 발현되는 것이 관찰되었고, 다른 세포에서는 관찰되지 않았다. 흥미롭게도, 상기 3종의 세포주는 택일적 스플라이싱 테나신 C mRNA 및 고분자량 테나신 C 단백질을 발현 하였다(도 2b). 이러한 정보에 기초하여, 본 발명의 펩타이드 앱타머가 암세포에서 테나신 C를 검출하는 데 이용될 수 있는 지 여부를 조사하였다.
선택된 펩타이드 앱타머에 의한 인간 암세포주의 염색
U251, SW620 및 HCT116 세포를, 각각 테나신 C 단백질의 높은, 중간 및 미발현 여부를 조사하기 위한 모델 세포주로 이용하였다(도 3). 바이오틴-표지 펩타이드 앱타머를 이용하여, 이들이 배양된 세포주의 내재적 발현된 테나신 C를 인식하는 지 여부를 조사하였다. 흥미롭게도, 앱타머 #1 및 #2는 SW620 세포의 세포막의 극성 부위에서 스팟 또는 긴 스트리크의 특징적인 염색 패턴을 나타내었다(도 3a의 화살표). 네가티브 펩타이드를 이용하거나 또는 앱타머를 처리하지 않은 경우에는 시그널이 관찰되지 않았다. 펩타이드 앱타머 #2의 경우가 보다 높은 수준으로 염색이 되었기 때문에, 이 펩타이드를 가지고 후속의 실험을 진행하였다. U251 세포에 대한 염색 레벨이 SW620 세포보다 높았고, 이는 U251 세포에서 테나신 C 발현이 높은 것을 반영하는 것이다(도 3b). 흥미롭게도, 앱타머 #2는 U251 세포의 두 부위를 염색하였다: 하나는 세포막을 따라서 긴 스트리크로 나타남(화살표) 및 다른 하나는 세포질의 확산 염색으로 나타남. 어떤 시그널이 테나신 C에 대하여 특이적인 것인가를 분석하기 위하여, 앱타머 #2의 결합을 항-테나신 C 항체와 경쟁시켰으며, 그 결과 세포막-관련 시그널만이 항체에 의해 억제됨을 관찰하였다. 테나신 C 단백질을 발현하지 않는 HCT116 세포를 앱타머 #2로 염색한 경우, 시그널이 관찰되지 않았다(도 3c). 이러한 결과는, 테나신 C의 발현이 높은 암세포의 세포막에 있는 테나신 C 단백질에 앱타머 #2가 결합하는 것을 입증하는 것이다.
제노그라프트 마우스 모델에서 펩타이드 앱타머 #2에 의한 테나신 C의 인식
앞선 실험들은 앱타머 #2가 배양된 세포의 세포막-연관 테나신 C를 인식한다는 것을 보여주고 있지만, 이 앱타머가 종양 조직의 ECM-위치 테나신 C에 결합하는 지 여부는 명확하게 입증하고 있지 않다. U118MG 신경교종 세포를 이용하여 제노그라프트 마우스 모델을 구축하고, 종양 조직 섹션을 만든 다음, 항-테나신 C 항체로 염색하였다(도 4a). 테나신 C 단백질 시그널은 핵의 바깥쪽, ECM에서 강한 스팟 또는 큰 블로브로 나타났다(화살표). 섹션에서 종양 세포를 가시화 하기 위하여, 항-β-카테닌 항체를 이용하였다. 흥미롭게도, 앱타머 #2는 스팟 및 블로브의 형태로 동일한 염색 패턴을 나타내었다(도 4b). 펩타이드를 처리하지 않거나 또는 스크램블 펩타이드 앱타머 #2를 이용한 경우에는 염색이 거의 되지 않았다. HT-29 결장 암세포(테나신 C를 발현하지 않음)를 이용하여 제노그라프트 마우스 모델을 개발한 경우, 앱타머 시그널이 관찰되지 않았다.
조직 마이크로어레이에서 펩타이드 앱타머 #2에 의한 테나신 C의 검출
앱타머 #2가 암 환자의 조직의 테나신 C를 검출할 수 있는 지 여부를 조사하기 위하여, 52명의 폐암 환자(36 선양암종, 15 편평세포 암종 및 1 세기관지 폐포암) 및 정상인 1명으로부터 조직을 분리하여 조직 마이크로어레이를 제작하였다. 항-테나신 C 항체를 이용한 경우, 세포의 바깥쪽, ECM에서 단백질의 확연한 발현을 관찰하였다(도 5). 발현의 스트리크는 모든 종양 조직 시료에서 관찰되었고, 특히 선양암종 및 편평세포 암종에서 강한 시그널이 관찰되었으며, 세기관지 폐포암에서도 몇몇의 스팟이 관찰되었다. 이러한 스트로마 밴드는 침윤 종양 세포의 윤곽 패킷을 나타내는 것이다. 항체에서 얻은 염색 패턴 및 펩타이드 앱타머 #2에서 얻은 염색 패턴의 유사성은 본 발명의 펩타이드 앱타머가 높은 특이성을 갖는다는 것을 보여준다. 정상 조직에서는, 펩타이드 앱타머 #2 염색이 검출되지 않았다.
Figure 112007062575916-PAT00002
*ADC, 선양암종; SCC, 편평세포 암종; BAC 세기관지 폐포암
표 2에서 볼 수 있듯이, 항체는 52 명의 종양 조직 시료 모두에서 테나신 C를 검출하였으며, 본 발명의 펩타이드 앱타머 #2는 시료의 77%에서 테나신 C를 검출하였다. 그러나, 포지티브 시료에서 두 방법에 의한 시그널의 세기는 거의 유사하였다. 편평세포 암종의 경우에는 펩타이드 앱타머 #2가 항체보다 강한 시그널을 나타내었다.
추가 논의 사항
본 발명자들은, 테나신 C에 결합하는 본 발명의 펩타이드 앱타머, 특히 펩타이드 앱타머 #2가 배양된 인간 암세포 및 제노그라프트 동물 모델에서 테나신 C 단백질을 인식할 수 있다는 것을 입증하였다. 놀랍게는, 본 발명의 앱타머는 인간 암 조직의 테나신 C를 항체와 거의 유사한 정도로 검출하였다. 본 발명자들이 알고 있는 한, 본 발명은 테나신 C에 결합하는 펩타이드 앱타머에 대한 첫 번째 보고이며, 펩타이드 앱타머를 프로브로 이용하여 다수의 암 환자로부터 얻은 폐 조직에서 테나신 C를 분석한 첫 번째 보고이다. 보존성 도메인에 기초한 상동성 검색에 의하여, ECM에서 테나신 C-상호작용 단백질에 대한 유용한 정보를 얻었다.
테나신 C는 대부분의 고형암, 일반적으로 종양 세포를 둘러싸는 ECM 또는 스트로마 세포에서 고발현된다(24). 이와 같은 사실은 폐암에서도 동일하다.
테나신 C의 큰 분자량의 이소폼이 폐암에서 과발현(24, 25) 되기 때문에, 정량적 및 정성적 변화가 관찰되었다. 인간 폐 종양 조직의 면역조직화학 분석은, 스트로마의 포컬 부위에서 테나신 염색을 보여준다(26). 흥미롭게도, 동일한 실험자는 ECM 단백질(테나신 포함)의 발현을 관찰하였고, 이는 침윤 종양 세포의 패킷을 보여주는 스트로마 밴드로 관찰하였으며, 이는 앱타머를 이용한 본 발명자들의 연구 결과와 동일하다. 피브로넥틴 및 콜라겐 타입 IV의 과도한 발현과는 반대로, 면역반응성의 단지 포컬 부위만이 항-테나신 C 항체를 이용한 실험에서 편평세포 암종 및 선양암종에서 관찰되었고, 이는 본 발명자들의 연구 결과와 동일하다.
종양발생 및 전이에서 테나신 C의 역할은 아직 명확하지 않다. 기질-세포 접착에 관여하는 대부분의 ECM 단백질들과 다르게, 테나신 C는 항-접착성 특성을 갖는다. 따라서 스트로마의 포컬 부위에서 테나신 C의 과발현은 ECM에 대한 종양세포의 접착을 변화시키며, 침윤성에 영향을 준다. 사실, 테나신 C 발현 및 매트릭스 메탈로프로테아제 활성은 재발성 폐암(28) 및 신경교종 세포(29)와 관련이 있다. 또한, 테나신 C는 암 세포 시그널링을 변화시킨다. 예를 들어, 종양의 포컬 침윤 지점에서의 과발현은 종양세포의 생존 및 전이를 촉진시킬 수 있다. 테나신 C는 다양한 세포에서, Akt 및 Wnt 경로가 관여하는 세포 생존 및 증식 시그널을 유도하는 것으로 보고되어 있다(30-34).
테나신 C는 종양 조직에서 다른 세포들을 조절함으로써, 종양의 전이를 촉진시킬 수 있을 것으로 판단된다. 따라서 테나신 C의 큰 이소폼의 과발현은 침투성 T-세포의 증식을 억제하고, 인간 폐암에서 림포사이트의 익펙터 기능을 하향조절한다(25). 또한, 테나신 C는 종양 스트로마 및 마크로파아지의 리크루트먼트를 조절하며, 테나신 C 발현은 마크로파아지의 침투와 연관성이 있다(34, 35). 테나신 C는 혈관 내피 성장인자-A으이 발현을 조절함으로써, 혈관신생을 촉진한다(36). 또한, 테나신 C는 종양 세포와 ECM의 구성요소(예컨대, 세포 표면 어넥신 II) 사이의 상호작용을 조절한다(37).
국소적인 높은 발현 양상 때문에, 테나신 C는 치료제의 종양-특이적 타겟팅에 대한 매우 중요한 타겟이 될 수 있다. 이러한 이유 때문에, 테나신 C-특이적 단일클론 항체는 임상시험 중에 있으며(10-12, 38), 단일클론 항-테나신 C 항체에 대한 개선이 계속적으로 연구되고 있다. 또한, RNA 앱타머는 종양 이미징을 위하여 이미 개발된 바 있다(13, 40). 암 치료에서의 펩타이드의 상당한 가능성을 고려하면(41), 본 발명으 펩타이드 앱타머의 개발은 펩타이드-기초 종양 타겟팅에 대한 유전자 치료 바이러스 담체를 디자인하는 데 있어서, 매우 흥미로운 출발점이 될 것으로 판단한다(15, 19, 20, 42).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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도 1a는 펩타이드를 선별하기 위하여 이용된 재조합 테나신 C 단백질의 구조에 대한 개략도이다. FNⅢ, 피브로넥틴 타입 Ⅲ, fbg; 피브리노겐 글로브, AS; 택일적 스플라이싱.
도 1b는 전장 테나신 C에 대하여 선별을 한 각각의 라운드 후의 결합된 파아지의 수를 나타낸다.
도 2a-2b는 배양된 인간 종양 세포주에서 테나신 C mRNA 및 단백질의 발현 양상을 보여준다. 도 2a. 배양된 인간 종양세포주에서 분리된 총 RNA를 RT-PCR로 분석하였다. fbg; 피브리노겐 글로브, AS; 택일적 스플라이싱. GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 대조군으로 이용하였다. 도 2b. 배양된 인간 종양세포주의 총 세포 추출물을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 튜블린을 로딩 대조군으로 이용하였다.
도 3a-3c는 배양된 세포에 대한 선별된 펩타이드의 결합 양상을 보여준다. SW620(도 3a), U251 (도 3b) 및 HCT116 (도 3c)의 배양된 세포를 1 mM 바이오틴-표지 펩타이드 앱타머(#1, #2), 대조군 펩타이드(NC) 또는 펩타이드 앱타머 #2(1 mM)과 항-테나신 C 항체(1:1000 희석)로 1시간 동안 실온에서 처리하였다. 핵을 Hoechst33258로 카운터염색 하였다. 화살표는 염색된 세포를 가리킨다. 배율, X 1000 (도 3a 및 도 3c), X 630 (도 3b).
도 4a-4b는 U118MG 종양 제노그라프트 조직에 대한 펩타이드 앱타머 #2의 결합을 면역형광으로 분석한 결과이다. 동결된 조직 섹션을 항-테나신 C 항 체(1:1000 희석), 항-β-카테닌 항체 (1:100 희석) (도 4a), 10 μM 바이오틴-표지 펩타이드 앱타머 (#2) 또는 스트램블 펩타이드 (#2 scr) (도 4b)와 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 조직을 Hoechst33258로 카운터염색 하였다. 화살표는 염색된 세포를 가리킨다. 배율, X 630.
도 5a-5d는 종양 환자 폐 조직에 대한 펩타이드 앱타머 #2의 결합 양상을 보여준다. 선양암종(도 5a), 편평세포 암종(도 5b), 세기관지 폐포암(도 5c) 및 정상(도 5d) 조직으로부터 얻은 파라핀-임베딩된 폐 조직 항-테나신 C 항체(1:1000 희석) 또는 바이오틴-표지 앱타머 #2(10 μM)과 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 조직을 Hoechst33258로 카운터염색 하였다. 배율, X 630.
도 6은 조직 마이크로어레이에 대한 펩타이드 앱타머 #2의 결합 양상을 보여주는 형광 세기에 대한 정량적 분석 결과이다. 항-테나신 C 항체 또는 펩타이드 앱타머 #2로 조직 마이크로어레이를 염색하였다. 종양 및 정상 조직(n = 5)에서 형광의 평균 세기를 계산 하였다(펩타이드 또는 항체 염색 면적/Hoechst33258 염색 면적). 회색 및 검정색 막대는 각각, 펩타이드 앱타머 #2 및 항-테나신 C 항체에 의한 형광 시그널을 나타낸다. 숫자는 환자의 수를 나타낸다. ADC; 선양암종, SCC; 편평세포 암종, BAC; 세기관지 폐포암, N; 정상조직.
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Claims (18)

  1. 다음 일반식 1로 표시되는 항-테나신 C(anti-tenascin C) 펩타이드 앱타머:
    일반식 1
    Xaa1-His-Lys-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10
    상기 일반식에서, Xaa1는 Phe, Trp, Leu 또는 Thr이고, Xaa2는 Pro, His, Thr 또는 Ile이며, Xaa3은 아미노산 20종에서 선택되는 어느 하나의 아미노산이고, Xaa4는 Phe, Ser, Pro, Trp, Lys, Arg 또는 Gln이며, Xaa5는 Pro, Arg, Ser, Thr, Lys 또는 Ile이고, Xaa6는 아미노산 20종에서 선택되는 어느 하나의 아미노산이며, Xaa7은 아미노산 20종에서 선택되는 어느 하나의 아미노산이고, Xaa8은 아미노산 20종에서 선택되는 어느 하나의 아미노산이며, Xaa9은 Arg, Pro, Phe, Leu, Val, Thr, Asn 또는 Ser이고, Xaa10은 아미노산 20종에서 선택되는 어느 하나의 아미노산이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 Xaa1는 Phe인 것을 특징으로 하는 펩타이드 앱타머.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 Xaa2는 Pro 또는 His인 것을 특징으로 하는 펩타이드 앱타머.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 Xaa3는 Phe, Lys, Ser, Gln, Pro 또는 Arg인 것을 특징으로 하는 펩타이드 앱타머.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 Xaa4는 Ser인 것을 특징으로 하는 펩타이드 앱타머.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 Xaa5는 Pro인 것을 특징으로 하는 펩타이드 앱타머.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 Xaa6는 Lys, Ala, Ser, Pro, Tyr, Ile, His 또는 Thr인 것을 특징으로 하는 펩타이드 앱타머.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 Xaa7은 Gly, Leu, Pro, Arg, Thr, Met 또는 His인 것을 특징으로 하는 펩타이드 앱타머.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 Xaa8은 Ser, Ile, Gly, Gln, Leu, Pro 또는 Arg인 것을 특징으로 하는 펩타이드 앱타머.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 Xaa9은 Pro인 것을 특징으로 하는 펩타이드 앱타머.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 Xaa10은 Arg, Val, Ile, Ser, Phe, Lys, Gln, Leu, Pro 또는 Ala인 것을 특징으로 하는 펩타이드 앱타머.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드 앱타머는 서열목록 제1서열 내지 제11서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 펩타이드 앱타머.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드 앱타머는 N-말단에 Gly 잔기를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드 앱타머.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 Gly 잔기의 개수는 2-4개인 것을 특징으로 하는 펩타이드 앱타머.
  15. 상기 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 펩타이드 앱타머를 포함하는 종앙 검출용 진단 키트.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 종양은 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암인 것을 특징으로 하는 키트.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 종양은 신경교종, 결장 선양암종 또는 폐 종양 인 것을 특징으로 하는 키트.
  18. 제 4 항에 있어서, 상기 펩타이드 앱타머는 서열목록 제1서열 또는 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 키트.
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