KR20090016883A - 감초 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환예방 및 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 감초 추출물은 산화적 스트레스에 대한 신경 세포의 산화적 손상을 억제하여 신경 세포를 보호하면서 세포 사멸을 억제하는 효과가 매우 우수하고 인체에는 거의 무해한 효과를 제공함으로써, 새로운 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물을 개발할 수 있게 된 것이다.
감초 추출물, 산화적 스트레스, 세포 사멸 억제, 퇴행성 신경질환
Description
본 발명은 감초 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
인간을 비롯한 모든 호기성 생물체들은 공기 중의 산소를 이용하여 생명유지를 위한 작용을 하고 있으나, 일부는 각종 물리적, 화학적, 환경적 요인에 의하여 활성산소라 불리는 수퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical;O2 -), 히드록실 라디칼 (Hydroxyl radical;-OH), 과산화수소(hydrogen peroxide;H2O2), 일중항산소(singlet oxygen;1O2) 등이 발생되고 있다(An, B. J., Park, J. M., Bae, H. J., Pyun, J. R. and Song, M. A.,2006, Antioxidant and antibacterial effects of Korean Isodon japonicus H.. J. Korean Soc . Appl . Biol . Chem . 49, 129-134.; Kim, S. J. and Kim, D. W.,2007, Antioxidative activity of hot water and ethanol extracts of Lespedeza cuneata seeds. Korean J. Food Preserv. 14, 332-335.; Lee, Y. S.,2007, Antioxidative and physiological activity of extracts of Angelica dahurica leaves. Korean J. Food Preserv. 14, 78-86.; Kim, H. J., Jin, C. and Lee, Y. S.,2007, Antioxidative activities of phenolic compounds isolated from Inonotus obliquus . Kor . J. Pharmacogn . 38, 164-169.; Kim, J. W., Jeon, Y. J., Lee, J. H. and Lee, S. C.,2006, Effect of far-infrared irradiation and heat treatment on the antioxidant activity of extracts from Citrus pomaces. J. Korean Soc . Appl . Biol . Chem . 49, 60-64.).
이러한 활성산소는 항산화효소들의 작용에 의해 제거되며 생리적으로 정상적인 상태에서는 활성산소 생성과 항산화효소에 의한 제거작용이 조화를 이루어 세포 항상성을 유지한다(Yang, J. H., Kim, D. K., Yun, M. Y and Ahn, J. K., 2006, Antioxidative activity and therapeutic effect of hydrogel preparations of scutellariae radix and zingiberis rhizoma on dermatitis. J. Kor . Pharm . Sci . 36, 253-262.; Kang, K. A., Jo, S. H., Koh, Y. S., Kim, J. S. and Hyun, J. W., 2005, Screening of anti-oxidants isolated from natural products on V79-4 hamster lung fibroblast cells induced by oxidative stress. Kor . J. Pharmacogn. 36, 34-37.; Kang, K. A., Chae, S., Kang, D. G., Kim, J. S. and Hyun, J. W.,2005, Screening of antioxidative effect of herbal extracts on oxidative stress. Kor . J. Pharmacogn . 36, 159-163.).
하지만, 이런 세포 내에서 활성산소 생성과 항산화효소에 의한 활성산소 제 거작용의 조화가 불균형을 이루게 되어 활성산소가 과량 생성되거나 항산화시스템의 기능이 저하되면, 세포는 소위 산화적 스트레스 상태에 빠지게 되면서 세포막 분해, 단백질 분해, 지질 산화, DNA 변성 등이 유도되어 암을 비롯한 심장질환 및 노화 등의 각종 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다(Kim, A. K. and Kim, J. H., 2001, Alterations of antioxidant enzymes in response to oxidative stress and antioxidants. J. Appl . Pharmacol . 9, 249-257.; Bulkley, G. B.,1983, The role of oxygen radicals in human disease process. Surgery. 94, 407-411.; Halliwell, B. and Gutteridga, J. M., 1984, Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals and disease. Biochem. J. 219, 1-14.; Sawyer, D. T. and Valentine, J. S.,1981; How super is superoxide?. ACC . Chem . Res. 14, 393.; Fridorich, I.,1986, Biological effects of the superoxide radical. Arch. Biophys . 247, 1-11.).
특히, 다른 장기에 비해서 뇌는 활성산소에 의한 손상이 신체의 다른 어느 기관보다 크게 나타나는 것으로 알려져 있다. 이는 뇌는 체내를 순환하는 산소의 20%가 집중되어 산소 이용율이 높고, 세포막에 불포화 지방산 측쇄가 풍부하여 과산화지질의 함량이 높으며, 반응성 산소 유리기 반응에 촉매작용을 하는 철이 풍부한 반면 활성산소에 대한 산화방지 효소계나 저분자의 산화방지제가 타 조직에 비해 상대적으로 적은 관계로 유해활성산소나 라디칼(radicals)에 의한 산화적 손상에 매우 취약하기 때문이다. 그리고, 최근에는 여러 연구를 통해서 뇌에서 산화적 스트레스 요인은 신경세포의 세포사멸(Apoptosis)을 유도하여 퇴행성 신경질환의 발병과 관련이 매우 큰 것으로 보고되고 있다(Bae, M. K., Choi, S., Ko, M. J., Ha, H. J. and Kim, H. J.,2005, Effect of OQ21 and melatonin on lipopolysaccharide-induced oxidative stress in rat brain. Yakhak Hoeji. 49, 347-354.; Omodeo-Sale, F., Gramigna, D. and Campaniello, R.,1997, Lipid peroxidation and antioxidant systems in rat brain: effect of chronic alcohol consumption. Neurochem. Res. 22, 557-582.; Good, P. F., Werner, P., Hsu, A., Olanow, C. W. and Perl, D. P.,1996, Evidence for neuronal oxidative damage in Alzheimer's disease. Am. J. Pathol. 149, 21-28.; Choi, W. H., Oh, Y. S., Ahn, J. Y., Kim, S. R. and Ha, T. Y.,2005, Antioxidative and protective effects of Ulmus davidiana var. japonica extracts on glutamate-induced cytotoxicity in PC12 cells. Korean J. Food Sci . Technol. 37, 479-483.).
현재, 이러한 퇴행성 신경질환은 항산화물 처리, 세포 이식, 외과적 수술 등 다양한 치료법이 제시되고 있지만, 대부분이 위험요소와 부작용을 나타내고 있으며 손상 기전의 복잡성 등으로 신경세포의 손상을 보호하는 치료제는 개발되지 못하고 있는 실정이다.
따라서 각종 천연자원 등에서 보다 안전하고 위험요소와 부작용을 낮출 수 있으면서 신경세포 보호효과가 뛰어난 신규한 예방 및 치료제의 개발이 필요한 실정이다.
이에, 본 발명은 국내·외에서 자생하고 있는 435가지의 약용식물 추출물을 대상으로 PC12 신경 세포주를 이용하여 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호효과를 갖는 천연추출물의 탐색을 시도하고, 이로부터 인체에는 거의 무해한 천연 추출물을 이용하여 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물을 개발하고자 하였다.
본 발명자는 여러 약용식물 추출물 중 감초(Glycyrrhiza uralensis Fisch) 추출물이 과산화수소의 노출로부터 신경 세포를 유의적으로 보호할 수 있는 효능을 입증하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 감초 추출물로부터 신경 세포 보호 효과가 우수한 퇴행성 신경 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 감초 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
이때, 여기서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.
또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.
본 발명은 감초 추출물을 사용하여 퇴행성 신경질환을 예방하거나 치료할 수 있는 조성물로 개발할 수 있도록 한 것이다.
이때, 퇴행성 신경질환은 여러 가지 요인에 의해 신경 세포가 손실되면서 뉴런의 퇴화로 인해 발생되는 질환을 말한다.
본 발명은 산화적 스트레스로부터 신경 세포의 세포 사멸(Apoptosis)에 의해 발생되는 뇌졸중, 근위축성측삭경화증(ALS), 노인성 치매, 파킨슨병 또는 알츠하이머병의 퇴행성 신경질환을 치료하거나 예방하는 용도로 사용 가능하다.
본 발명에서 감초(Glycyrrhiza uralensis Fisch)는 콩과에 속하는 다년생 초본식물을 말하는데, 감초의 주성분으로는 글리시리진(glycyrrhizin), 글리시레틴산(glycyrrhetinic acid), 글리시리진산(glycyrrhizic acid) 외에 이소플라본(isoflavone)으로 리퀼리틴(liquilitin), 이소리퀼리틴(isoliquilitin), 리퀼리티제닌(liquilitigenin) 등이 함유되어 있고(Kim, S. J., Kweon, D. H. and Lee, J. H.,2006, Investigation of antioxidative activity and stability of ethanol extracts of licorice root (Glycyrriza glabra). Korean J. Food Sci . Technol . 38, 584-588.), 알레르기(Kumagai, A., Nanaboshi, M., Asanuma, Y., Yaur, T. and Nishino, K.,1967, Effect of glycyrrhizin on thymolytic and immuno-suppressive action of cortisone. Endocrinol . Jpn . 14, 39-42.), 만성간염(Kiso, Y., Tohin, M., Ino, H., Hattori, M., Samoto, J. and Namba, T., 1984, Mechanism of antihepatoxin activity of glycyrrhizin I. Effect on free radical generation and lipid peroxidation. Planta Med . 50, 298-302.) 및 바이러스질환(Pompei, R., Flore, O., Marcialis, M. A., Pani, A. and Loddo, B., 1979, Glycyrrhizic acid inhibits virus growth and activates virus particles. Nature. 281, 689-690.) 및 항균효과(Ahn, E. U., Shin, D. H., Baek, D. I. and Oh, J. A.,1998, Isolation and identification of antimicrobial active substance from Glycyrrhiza uralensis FISCH.. Korean J. Food Sci . Technol . 30, 680-687.) 등의 약리 작용이 알려져 있다. 하지만, 산화적 스트레스에 대한 손상된 신경세포 보호와 DNA 손상억제 효과 및 이로인한 퇴행성 신경질환의 치료 및 예방 효과에 대해서는 전혀 알려진 바가 없다.
본 발명에서는 감초 추출물은 물 또는 유기 용매를 사용하여 추출한 추출물을 사용하는데, 구체적으로 물, 메탄올 또는 에탄올 등의 알코올 등을 사용하는 것이 바람직하다. 이는 인체에는 무해하거나 최소화할 수 있는 용매를 사용함으로써, 사람이 경구투여하거나 비경구투여할 시, 감초 추출물에서 잔존하는 용매의 제거 공정이 추가로 필요하지 않게 할 수 있기 때문이다.
하지만, 본 발명의 감초 추출물은 상술한 방법에 의해 국한되는 것은 아니며, 이 외의 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합하여 획득할 수 있다.
또한, 레밍톤 약제학 핸드북 (Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, Mack Pub, Co.,N.Y., USA)에 개시된 것과 같이, 본 발명의 감초 추출물을 유효성분으로 하여, 투여방법, 투여형태 및 치료목적에 따라 적절한 약제학적 조성물의 형태로 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 혼합하여 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입하여 사용한다.
그리고, 상기 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 염수, 완충제, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 링거액, 락토즈, 수크로즈, 칼슘 실리케이트, 메틸 셀룰로오즈 또는 에탄올을 담체를 사용하여 경구투여와 비경구투여용으로 분말, 과립, 주사액, 시럽, 용액제, 정제, 좌약 등과 같은 제형으로 제조한다. 다만, 본 발명의 담체가 상기의 담체로 한정되는 것은 아니다.
이때, 비경구 투여는 경구 이외에 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강, 흡입 등을 통해 약제의 투여를 의미한다.
그리고, 상기 제형에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함하여 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 제형화할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 약제학적 조성물에서 감초 추출물의 유효량은 질환의 종류, 투여경로, 제형, 사용하는 목적, 환자의 질환 경중(輕重)에 따라 당업자에 의해 결정할 수 있을 것이다. 다만, in vitro 실험으로부터 타 치료제의 유효량을 비교한 결과, 성인 기준으로 체중 1kg 당 5∼500㎍을 복용하는 것이 바람직하다.
이상과 같이, 본 발명의 감초 추출물은 산화적 스트레스에 대한 신경 세포의 산화적 손상을 억제하여 신경 세포를 보호하면서 세포 사멸을 억제하는 효과가 매우 우수하고 천연 물질로서 인체에는 거의 무해하여 퇴행성 신경 질환을 예방 또는 치료하기 위한 용도로 응용할 수 있게 된 것이다.
이하, 본 발명을 구체적인 실시 예에 의해 보다 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다.
1. 공시 재료
본 실시 예에서 사용된 감초는 2006년 11월 경남 마산시 (주)금강제약으로부터 제공받은 것을 사용하였다.
신경세포 보호 효과 실험에 사용된 시약으로 H2O2(Hydrogen peroxide solution)와 MTT(3-[4,5-dimethythiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)는 시그마사(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)제품을 구입하였으며, LDH 릴 릴리즈 어세이 키트(Lactate dehydrogenase release assay kit)는 와코 순약공업주식회사(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan)로부터 구입하였다.
세포주 배양을 위해 필요한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium), FBS(fetal bovine serum), HS(horse serum), 페니실린(penicillin) 및 스트렙도마이신(streptomycin) 등은 기브코-BRL(Gibco-BRL, Grand Island, NT, USA)에서 구입하였으며, 그 외 연구에 사용된 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.
백혈구 DNA 손상억제 효과 실험에 사용된 시약으로 히스토파크 1077(Histopaque 1077), 저융해 아가로스(low melting agarose), 정상 융해 아가로스(normal melting agarose), NaCl, Na2EDTA, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 등은 시그마사(St. Louis, MO, USA)에서 제품을 구입하였다.
그리고, 신경세포주는 쥐 피크로모사이토마(rat pheochromocytoma) PC12로서 한국세포주은행(KCLB)에서 분양받아 사용하였다. 이때, 상기 세포주의 배양에 사용된 배지는 DMEM 배지(medium)에 10% FBS(fetal bovine serum), 5% HS(horse serum) 및 100 unit/㎖의 페니실린, 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신을 첨가하여 사용하였고, 95%의 습도가 유지되는 37℃, 5% CO2 배양기(incubator, MCO-18AIC, SANYO, Osaka, Japan)에서 배양하였다.
2. 본 발명의 감초 추출물 및
분획물
제조
감초 5 g에 메탄올 용매를 100 ㎖ 가하여 2일 동안 상온에서 정치시켜 추출한 후, 여과지(5C. 110 mm, Advantec, Tokyo Roshi Kaish, Ltd., Tokyo, Japan)로 여과하였다. 이 추출 여액을 회전감압농축기(EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)에서 농축하여 용매 추출물을 얻었다.
감초 메탄올 추출물은 5 ㎎/㎖로 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹여 적당한 농도로 희석하여 실험에 사용하였으며, 이 추출물을 GUE라 명명하였다.
3.
산화적
스트레스에 의한 신경세포 형태적 변화의 억제 효과
일반적으로 신경세포가 외부환경에 민감하게 자극을 받으면 신경 상해를 입는 것과 동시에 세포사의 발생으로 인한 세포의 형태학적인 변화가 나타나는 것으로 알려져 있다(Pompei, R., Flore, O., Marcialis, M. A., Pani, A. and Loddo, B. (1979) Glycyrrhizic acid inhibits virus growth and activates virus particles. Nature. 281, 689-690.). 이에, 본 실시 예에서는 산화적 스트레스에 대한 신경 세포의 형태적 변화를 본 발명의 감초 추출물 처리와 함께 현미경으로 확인하고자 하였다.
먼저, 감초 추출물에 대한 PC12 세포주의 형태학적인 관찰을 위해 6-well plate에 2 × 105 cells/well로 24시간 동안 배양하였다. 감초 추출물을 농도별(1, 5, 10, 50 ㎍/㎖)로 처리한 후 0.5 mM의 과산화수소(H2O2)를 2시간 노출시키고 위상차 현미경(phase-contrast microscope, TS 100-F, Nikon, Tokyo, Japan)로 각 well의 세포형태를 관찰하고 100배로 사진 촬영하였다.
이의 결과를 도 1에 도시하였다. 이때, 도 1에서 (a)는 아무 처리도 하지 않은 대조군, (b)는 0.5 mM 과산화 수소 처리군, (c)는 0.5 mM 과산화 수소 + GUE 10 ㎍/㎖ 처리군 및 (d)는 0.5 mM 과산화 수소 + GUE 50㎍/㎖ 처리군을 나타낸 것이다.
도 1에 도시한 바와 같이, 정상군에 비해 대조군은 스트레스로 인하여 신경돌기가 거의 소멸된 양상을 보임으로써 신경세포가 형태학적으로 큰 변화되었음을 확인할 수 있으나, 본 발명의 감초 추출물을 10 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖로 처리하였을 때는 농도 의존적으로 신경세포의 생존율이 높음을 확인할 수 있었다.
이와 같이, 신경세포의 형태학적인 변화를 통하여, 본 발명의 감초 추출물은 H2O2에 의한 신경세포 손상을 억제하거나 보호하는 효과가 있다는 것을 입증하였다.
4.
MTT
분석을 통해 감초 추출물이 세포 생존율에 미치는 효과
감초 추출물의 신경세포 보호 효과를 측정하기 위하여 엠티티 리덕션 에세이(MTT reduction assay)를 실시하였다. 세포주를 1 × 105 cells/㎖로 맞추고 96-well plate에 각각 100 ㎕씩 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양한 후, DMSO에 녹인 감초 추출물을 각각 1, 5, 10, 50 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 30분 동안 배양한 후 0.5 mM H2O2를 처리하여 2시간 배양하고 각 well에 PBS 완충액에 녹인 MTT (5 ㎎/㎖) 용액을 10 ㎕씩 첨가하여 2시간 동안 다시 배양하였다. 반응 후 well 바닥에 형성된 포르마잔(formazan)이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO 100 ㎕를 첨가하여 녹이고 ELISA 리더기(ELISA reader, Model 680, BioRad, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그리고, 대조구 세포수를 100%로 하였을 때 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.
이의 결과를 도 2에 도시하였다.
도 2에 도시된 바와 같이 아무것도 처리하지 않은 정상군과 H2O2를 처리한 대조군 그리고 H2O2와 감초 추출물을 농도별로 처리한 실험군을 비교한 결과, 대조군의 세포 생존율은 41.8% 수준으로 떨어졌으나, 감초 추출물 1, 5, 10 및 50 ㎍/㎖로 세포주에 처리했을 경우에는 신경세포 생존율은 44.5%, 55.0%, 58.9%, 89.4%로 나타나 농도 의존적으로 산화적 스트레스로부터 신경 세포를 보호하는 효과를 입증할 수 있었다.
5. 감초 추출물의
LDH
세포독성 억제 효과
감초 추출물의 신경세포 보호 효과를 측정하기 위한 방법으로 LDH(lactate dehydrogenase) release assay를 실시하였다. PC12 세포주를 1 × 105 cells/㎖로 맞춘 후, 100 ㎕씩 96-well plate에 분주하여 CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 뒤, 1, 5, 10, 50 ㎍/㎖의 농도로 제조한 감초 추출물을 세포주에 30분간 처리하였다.
30분 처리 후, 0.5 mM H2O2를 처리하고 2시간 배양한 다음, 배양액을 새로운 96-well plate에 50 ㎕를 분주하고, 이 배양액에 LDH 시약(reagent)를 50 ㎕씩 첨가하여 상온에서 정치시킨 후, 20분간 반응하였다. 반응이 완료되면 반응 정지액(stop solution)인 1 N HCl을 100 ㎕씩 첨가하여 반응을 중지시킨 후, ELISA 러디기(reader)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
살아남은 세포의 LDH 측정을 위해 배양액을 제거한 후, 0.5% 트리톤 X-100(Triton X-100) 용액을 50 ㎕ 첨가하고 40 rpm으로 10분 동안 교반(shaking)시켜 세포벽을 깨트린 다음, 같은 방법으로 LDH 시약 50 ㎕를 첨가하여 반응시키고, 반응이 끝나면 반응 정지액을 넣은 뒤, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, LDH에 의한 세포독성의 백분율은 배양액과 살아있는 세포에서 유리된 총 LDH에 대한 배양액으로부터 유리된 LDH의 값으로 계산하여 무처리 대조군과 비교한 값을 나타내었다.
이의 결과를 도 3에 도시하였다.
도 3에 도시한 바와 같이 아무것도 처리하지 않은 정상군에 비해 대조군은 47.2% 정도의 LDH 방출을 확인할 수 있는데 반해, 감초 추출물을 1, 5, 10 및 50 ㎍/㎖로 처리했을 때는 38.4%, 35.7%, 33.3% 및 24.2%로 감소함을 알 수 있었다. 이에, 본 발명의 감초 추출물이 H2O2에 의해 유도된 PC12 신경세포 손상을 강력하게 억제한다는 것을 판단할 수 있었다.
상술한 MTT의 실험과 LDH 실험 결과, 본 발명의 감초 추출물은 H2O2에 의해 유도된 산화적 스트레스 상태에서 PC12 세포주에 대하여 신경세포 보호 효과가 매우 우수함을 알 수 있었다.
6.
산화적
스트레스에 의한 세포 사멸 억제 효과
일반적으로, 세포가 산화적 스트레스를 지속적으로 받으면 세포 사멸(apoptosis)을 유도하는 것으로 알려져 있으며, 특히 H2O2에 의한 신경세포의 사멸은 caspase-3을 활성화시키는 세포 사멸 경로로 유도된다고 알려져 있다(Ahn, E. U., Shin, D. H., Baek, D. I. and Oh, J. A. (1998) Isolation and identification of antimicrobial active substance from Glycyrrhiza uralensis FISCH.. Korean J. Food Sci . Technol . 30, 680-687.).
이에, 본 실시 예에서는 산화적 스트레스 내에서 신경 세포의 핵의 형태적인 변화와 카스파제-3의 활성화를 측정하여, 감초 추출물의 세포 사멸 억제 효과를 확인하고자 하였다.
가.
훼히스트
33342(
Hoechst
33342) 염색
본 실시 예에서는 세포 사멸의 형태학적 특징 중의 하나인 핵의 변화를 관찰하기 위해서 핵 내 DNA에 특이적으로 결합하는 형광 염색제인 Hoechst 33342를 사용하여 핵을 염색하고 형광 현미경으로 관찰하고자 하였다.
6-well plate에 2 × 105 cells/well로 24시간 동안 배양하고, 감초 추출물을 10 및 50 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후, 0.5 mM H2O2를 처리하여 2시간 반응하였다. PBS 완충액으로 2회 세척하고 10% 포르말린(formalin)을 처리하여 4시간 고정한 후 다시 PBS로 세척하고 Hoechst 33342(Sigma, MO, U.S.A)로 30분 동안 염색하였다. 염색 후 PBS로 세척하고 형광 현미경 하에서 400배로 관찰하였다.
이의 결과를 도 4에 도시하였다. 이때, 도 4에서 (a)는 아무것도 처리하지 않은 대조군, (b)는 0.5 mM 과산화 수소 처리군, (c)는 0.5 mM 과산화 수소 + GUE 10 ㎍/㎖ 처리군 및 (d)는 0.5 mM 과산화 수소 + GUE 50 ㎍/㎖ 처리군을 나타낸 것이다.
도 4에 도시한 바와 같이, 정상 세포의 핵(a)은 타원형의 온전한 핵 모양을 나타낸 반면, 산화적 손상을 입은 세포의 핵(b)은 응축(condensation)과 분단(fragmentation)으로 인한 세포고사체(apoptotic body)가 핵 주변에 나타나는 전형적인 세포 사멸의 특징을 나타내었다. 하지만, 본 발명의 감초 추출물을 처리한 군(c,d)은 산화적 손상을 입은 세포의 핵(b)과 비교하여 핵의 응축 현상과 분단이 현저히 감소함을 형광 현미경을 통하여 육안으로 확인할 수 있었다.
상술한 결과로부터, 과산화수소에 의한 세포의 독성은 세포사멸을 유도하는 것으로 판단되며, 본 발명의 감초 추출물은 이러한 조건에서 신경세포를 보호하는 효과를 나타낸다고 할 수 있다.
따라서, 본 발명의 감초 추출물은 산화적 스트레스에 의한 세포사멸의 유도를 억제하여 신경 세포를 보호할 수 있음을 알 수 있었다.
나.
카스파제
-3
색도계
분석(
Caspases
-3
colorimetric
assay)
일반적으로 세포 사멸을 유도하는 카스파제-3는 시스테인 단백질 분해 효소 군(cystein protease family)으로서 활성화되어 기질 결합체인 DEVD-pNA를 분해하여 p-nitoranilin(pNA)를 생성하는데, 본 실시 예에서는 이러한 성질을 이용하여 pNA의 푸른빛으로 활성 정도를 측정하여 산화적 스트레스에 의한 감초 추출물의 세포 사멸 억제 효과를 분석하고자 하였다.
12-well plate에 1 × 106 cells/㎖로 24시간 배양 후, 농도별로 감초 추출 물과 H2O2를 처리하여 2시간 배양한 다음 250 g로 원심 분리하여 상등액을 버리고 세포만을 얻었다. 세포에 차가운 분해 완충액(lysis buffer) 25 ㎕를 첨가하여 10분간 얼음 위에서 반응 후 4℃ 10,000 g로 1분간 원심 분리하였다. 이것의 상등액 50 ㎕를 96-well plate에 옮기고 2 × 반응 완충액(reaction buffer)/DTT 용액(1M dithiothreitol, 10 ㎕)과 카스파제-3 색채계 기질(caspase-3 colorimetric substrate, DEVD-pNA)를 첨가하여 2시간 동안 37℃에서 배양한 후에 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 실험군(감초 추출물 처리군)의 활성은 대조군에 대한 상대적인 활성 정도로 나타내었다.
이의 결과를 도 5에 도시하였다.
도 5에 도시한 바와 같이, PC12 세포에 0.5 mM H2O2를 처리하면 산화적 손상이 가해져서 약 3.5배 정도 높은 카스파제-3 활성을 확인할 수 있었다. 하지만, 본 발명의 감초 추출물을 1, 5, 10 및 50 ㎍/㎖로 처리한 경우에는 농도 의존적으로 카스파제-3의 활성이 감소하였으며, 특히 가장 높은 농도 50 ㎍/㎖ 처리 시에는 그 활성도가 과산화수소를 처리하지 않은 대조군과 거의 유사한 수준(1.0배)으로 측정되었다.
따라서, 본 발명의 감초 추출물은 H2O2에 의한 신경세포의 세포 사멸 과정 중 카스파제-3의 전 단계 신호전달 과정에 작용하여 신경세포의 산화적 손상을 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.
7.
코멧
어세이
(Comet assay)
감초 추출물의 백혈구 DNA 손상 억제 효과를 측정하기 위하여, 코멧 에세이(Comet assay)를 실시하였다.
먼저, 본 실시예에서는 건강한 성인남성 2명으로부터 채혈한 신선한 전혈 5 ㎖을 Histopaque 1077를 이용해서 분리한 백혈구를 사용하였다.
준비된 백혈구 세포에 감초 추출물을 1, 5, 10, 50 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 백혈구를 PBS로 세척한 후 인위적으로 산화적 스트레스를 유발하기 위하여 200 μM의 H2O2를 백혈구에 처리하여 4℃에 5분간 반응시킨 다음 다시 PBS로 세척하였다. 이때, 양성 대조군(Positive control)은 감초 추출물의 용매인 DMSO만을 처리한 후 200 μM의 H2O2를 처리하였고, 음성 대조군(negative control)은 용매만(DMSO)을 처리한 세포에 H2O2를 처리하지 않았다.
그런 다음, 코멧 에세이(Singh, P. N. McCoy, M. T., Tice R. R. and Schneider, E. L.,1988, A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp . Cell Res. 175, 184-191.)를 위해, 상기 반응을 끝낸 백혈구를 75 ㎕의 0.7% 저융해 아가로즈(LMA)와 섞은 후, 1.0% 정상 융해 아가로즈(NMA)가 미리 코팅(precoating)된 일반 슬라이드(normal slide) 위로 상기 백혈구와 LMA의 현탁액이 골고루 분산되게 한 후 커버 글라스(cover glass)로 덮어 4℃ 냉장고에 보관하였다. 겔(Gel) 이 굳으면 커버 글라스를 벗기고 그 위에 다시 0.7%의 LMA 용액 75 ㎕으로 한겹 더 코팅되도록 하였다. 그리고, 상기 슬라이드를 미리 준비해 둔 차가운 alkali lysis buffer(2.5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM tris)에 사용 직전에 1% Triton X-100을 섞은 혼합물에 담가 저온, 암실에서 1시간 동안 침지시켜 DNA의 이중나선 구조(double strand)가 분해되도록 하였다.
DNA 분해(Lysis)가 끝난 후, 슬라이드를 전기영동 탱크(electrophoresis tank)에 배열하고 4℃의 차가운 전기영동 buffer(300 mM NaOH, 10 mM Na2EDTA, pH>13)를 채워서 40분 동안 DNA가 풀어지게 하여(unwinding) DNA의 알칼리 분해 위치(alkali labile sites)가 드러나게 한 후, 25 V/300±3 mA의 전압을 걸어 20분간 전기영동을 실시하였다. 빛에 의해 DNA가 부가적으로 손상되는 것을 방지하기 위해 위의 과정은 전기영동 탱크를 어두운 천으로 덮은 채 실시하였다.
전기영동이 끝난 후, 상기 슬라이드를 0.4 M Tris buffer(pH 7.4)에 10분씩 담가 세척하는 과정을 3회 반복하고 이를 건조시켰다. 그리고, 상기 건조된 슬라이드의 백혈구 부위를 20 ㎍/㎖ 농도의 에티디움 브로마이드로 염색하여 백혈구의 핵이 염색되게 한 다음, 상기 슬라이드 위에 커버 글라스를 덮고 형광현미경(Leica, Germany) 상에서 관찰하였다. 이때, CCD camera (Nikon, Japan)를 통해 보내진 각각의 세포핵 이미지(image)는 Komet 5.0 comet image analyzing system(Kinetic Imaging, UK)이 설치된 컴퓨터 상에서 분석하였다. 그리고, 과산화수소(H2O2)에 의한 백혈구의 DNA 손상 및 감초 추출물에 의한 손상억제 정도는 핵으로부터 이동해서 형성된 DNA 절편의 꼬리 부분에서 떨어져 나간 꼬리 부분 내 DNA %함량(% Tail DNA)을 측정하여 나타내었다. 각각의 처리구에서 2개의 슬라이드를 만들어 각각 100개 세포의 DNA 손상 정도를 측정하고 각 처리구는 최소 3회 반복 실험하였다.
그리고, 자료의 처리는 SPSS-PC+ 통계 package를 사용하여 처리하였다. 각 항목에 따라 백분율과 평균치±표준편차(SD)를 구하고 각 물질의 DNA 손상 억제 정도를 비교하기 위해 one-way 분산분석(ANOVA)을 시행하여 F 값을 구하고 Duncan's multiple range test를 이용하여 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다. 통계적 유의성은 5% 수준에서 평가하였다.
이의 결과, 도 6에 도시된 바와 같이, 양성 대조군의 DNA 손상은 36% 이었던 반면, 감초 추출물(본 발명의 실험군)을 1, 5, 10 및 50 ㎍/㎖로 백혈구에 처리했을 경우 DNA 손상은 각각 20, 18, 14, 10%로 감소하여 농도 의존적으로 과산화수소에 의한 백혈구의 DNA 손상을 억제하는 것을 입증하였다. 특히, 10 및 50 ㎍/㎖ 농도에서는 DMSO만 처리한 음성 대조군과 비슷한 수준으로 DNA 손상 정도가 측정되었다.
상술한 코멧 에세이 결과로부터, 본 발명의 감초 추출물은 산화적 스트레스에 의해 유도된 인체 백혈구 DNA 손상에 대한 보호 효과가 매우 우수함을 알 수 있었다.
그리고, 전술한 개시에 대해서 일정 범위의 수정, 변화 및 치환이 가능하며, 어떤 경우에는 본 발명의 특징 중 일부만이 사용될 수도 있다. 따라서, 첨부된 청구항들이 넓게 또한 본 발명의 사상과 범위에 부합되게 해석되어야 한다.
도 1은 본 발명의 감초 추출물이 위상차 현미경을 통해 산화적 스트레스 조건에서 신경 세포의 형태적 변화에 미치는 영향을 나타낸 사진이다.
도 2는 본 발명의 감초 추출물이 MTT 분석을 통해 산화적 스트레스 조건에서 세포 생존율에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 감초 추출물이 LDH 분석을 통해 산화적 스트레스 조건에서 세포 생존율에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 감초 추출물이 훼히스트 33342 핵 염색을 통해 산화적 스트레스 조건에서 신경 세포 핵의 형태적 변화에 미치는 영향을 나타낸 사진이다.
도 5는 본 발명의 감초 추출물이 카스파제-3의 색도계 분석을 통해 산화적 스트레스 조건에서 신경 세포 핵의 형태적 변화에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 감초 추출물이 코멧 분석을 통해 산화적 스트레스 조건에서 DNA 손상 억제에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
Claims (3)
- 감초 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물.
- 제 1 항에 있어서,상기 감초 추출물은 물, 메탄올 또는 에탄올로 추출된 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서,상기 퇴행성 신경 질환은 뇌졸중, 근위축성측삭경화증(ALS), 노인성 치매, 파킨슨병 또는 알츠하이머병인 것을 특징으로 하는 조성물.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020070081195A KR20090016883A (ko) | 2007-08-13 | 2007-08-13 | 감초 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환예방 및 치료용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020070081195A KR20090016883A (ko) | 2007-08-13 | 2007-08-13 | 감초 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환예방 및 치료용 조성물 |
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| KR20090016883A true KR20090016883A (ko) | 2009-02-18 |
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ID=40685787
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| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20090016883A (ko) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101034596B1 (ko) * | 2009-05-07 | 2011-05-12 | 원광대학교산학협력단 | 근력약화, 근위축, 구음장애, 연하장애의 증상을 개선·지연시키기 위한 조성물 |
| WO2011099812A3 (ko) * | 2010-02-12 | 2011-12-29 | 한국생명공학연구원 | 감초 추출물을 포함하는 로타바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물 |
| WO2012128576A2 (ko) * | 2011-03-22 | 2012-09-27 | 서울대학교 산학협력단 | 감초에 주로 함유되어 있는 데하이드로글리아스페린 ｃ를 유효성분으로 함유하는 인지 기능의 저하 또는 손상을 치료하기 위한 조성물 |
| US8445038B2 (en) | 2010-02-16 | 2013-05-21 | Chungbuk National University Industry—Academic Cooperation Foundation | Compositions for prophylaxis or treatment of cerebrovascular diseases, for improving memory impairment, or for protecting neuronal cells, containing ethanol extract from Aralia elata, Chaenomelis fructus and Glycyrrhizae radix |
-
2007
- 2007-08-13 KR KR1020070081195A patent/KR20090016883A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (6)
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| WO2012128576A2 (ko) * | 2011-03-22 | 2012-09-27 | 서울대학교 산학협력단 | 감초에 주로 함유되어 있는 데하이드로글리아스페린 ｃ를 유효성분으로 함유하는 인지 기능의 저하 또는 손상을 치료하기 위한 조성물 |
| KR20120107789A (ko) * | 2011-03-22 | 2012-10-04 | 서울대학교산학협력단 | 감초에 주로 함유되어 있는 데하이드로글리아스페린 ｃ를 유효성분으로 함유하는 인지 기능의 저하 또는 손상을 치료하기 위한 조성물 |
| WO2012128576A3 (ko) * | 2011-03-22 | 2013-01-03 | 서울대학교 산학협력단 | 감초에 주로 함유되어 있는 데하이드로글리아스페린 ｃ를 유효성분으로 함유하는 인지 기능의 저하 또는 손상을 치료하기 위한 조성물 |
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