KR20080093016A - 인터페론을 사용하여 폐질환을 치료하는 방법 - Google Patents

Abstract

인터페론 α, 인터페론 β 또는 인터페론 γ와 같은 에어로졸화된 인터페론을 치료학적 유효량으로 투여함을 포함하여, 폐질환, 예를 들면, 특발성 폐 섬유증(IPF) 및 천식을 치료하는 방법이 본원에서 제공된다. 또한, 하나 이상의 에어로졸화된 인터페론(들)의 약제학적 조성물이 제공된다.

인터페론, 폐쇄성 폐질환, 특발성 폐 섬유증, 천식

Description

인터페론을 사용하여 폐질환을 치료하는 방법{Method of treating pulmonary disease with interferons}

정부 지원

본 발명의 기초가 된 여러 연구는 부분적으로 NIH 연구기금 R0l HL55791, K07 HL03030 및 M0l RR00096에 의한 지원을 받았다. 미국 정부는 본 발명에서 일정한 권리를 소유할 수 있다.

본 발명은 에어로졸 인터페론을 사용하여 폐질환을 치료하는 방법, 에어로졸 전달을 위한 하나 이상의 인터페론의 제형, 및 에어로졸 침착(deposition)을 측정하는 방법에 관한 것이다.

현행 NAEPP/NIH 지침에 따른 천식 치료의 중심은 여전히 항염증제로서, 그 중에서는 코르티코스테로이드가 가장 효능이 높다. 하지만, 코르티코스테로이드의 장기간 투여는 전신 부작용을 수반한다. 또한, 일부 천식환자는 코르티코스테로이드에 대해 내성이다. 그러므로, 알레르기성 기도 질환에서 염증 반응을 표적화하 는 신약에 대한 필요성이 있다.

천식의 면역 기전에는 제2형(Th2) 사이토카인 (인터루킨(IL)-4, IL-5)을 분비하는 세포의 불균형과 함께 기억 CD4⁺ T-헬퍼 세포의 분극화된 관여가 포함된다. 사이토카인 인터페론-γ(IFN-γ)는 미감작(naive) CD4⁺ 림프구가 Th1 표현형으로 분화하는데 필요하다.

천식에서 기도 염증은 증가된 수의 호산구 및 활성화된 CD4⁺ T 세포의 존재를 특징으로 한다. 천식은 Th1형 사이토카인을 분비하는 세포 보다 Th2형 사이토카인을 분비하는 세포가 더 많은 불균형과 함께 기억 CD4⁺ T 헬퍼 세포의 분극화된 관여와 관련된다. 제2형 사이토카인 IL-4 및 IL-5, 종양 괴사 인자(TNF)-α 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 포함하는 많은 사이토카인의 생산이 증가될 뿐만 아니라 조직 호산구 증가증 및 IgE 생산 증가가 나타난다. 기도 염증에서 사이토카인 프로파일의 대부분의 연구는 천식의 쥐 모델로부터 얻는다. 동물을 감작화(sensitization)시키고, 항원 (통상적으로 오브알브민(ovalbumin))으로 시험감염(challenge)시켜, 에어로졸 항원 시험감염에 대한 항원 특이적 IgE 생산, 기도 호산구 증가증 및 기도 과민반응을 보이는 것을 밝혀낸다. 이들 변화는 증가된 Th2 사이토카인 및 감소된 IFN-γ 생산과 관련된다[참조: Brusselle et al ., Am J Respir Cell Mol Biol, 1995 Mar; 12(3):254-259].

Th2 사이토카인 IL-4는, IgE 합성으로의 B 세포의 동종형(isotype) 전환을 촉진시키고 Th2 림프구로의 미감작 T 세포의 분화를 유도하여, 기도 염증에서 중요한 역할을 한다. 에어로졸화된 항원으로 시험감염된 IL-4 넉아웃(knockout) 마우스는 기도에서 특이적인 IgE, 기도 과민반응, 기도 호산구 증가증 또는 Th2 사이토카인을 생산하지 못하였다[참조: Brusselle et al ., Am J Respir Cell Mol Biol , 1995 Mar; 12(3):254-259]. 항원에 대한 초기 노출 동안에는 항-IL-4로 처리하고 시험감염 동안에는 처리하지 않은 야생형 마우스는 IL-5 생산 및 기도 호산구 증가증이 억제된 반면에, 항원 시험감염 동안 주어진 항-IL-4로는 기도 호산구 증가증이 억제되지 않아, IL-4가 국소적 Th2 반응의 유도에 필수적이라는 것을 보여준다[참조: Coyle et al ., Am J Respir Cell Mol Biol 1995 Jul; 13(1):54-59].

IL-10은 Th1 및 Th2 림프구, 단핵구 및 대식세포, 비만 세포, 각질형성세포 및 호산구에 의해 생산되는 사이토카인이다. IL-10은 상이한 세포, 특히 단핵 세포에 의한 염증촉진성 사이토카인의 합성을 하향조절하여 항염증 사이토카인으로서 작용한다. IL-10은 항원 제시 세포(APC)를 기능적으로 억제하여 IL-5의 생산을 하향조절한다[참조: Pretolani et al ., Res Immunol 1997 Jan.]. IL-10이 호산구 기능에 미치는 직접적인 효과도 증명되었다. 저농도의 IL-10은 호산구의 CD4 발현을 감소시키고 세포 사멸을 가속화하는데 있어서 거의 코르티코스테로이드처럼 활성이 있었다. GM-CSF는 염증이 생긴 조직에서 호산구 및 호중구의 귀소(homing) 및 활성화에 직접적으로 관련된 사이토카인이다. 정상 대조군과 비교하여, PBMC 및 폐포 대식세포에 의한 IL-10 생산 수준의 감소가 천식 환자에서 기록되었다[참조: Borish, L et al ., J Allergy Clin Immunol 1996 Jun.; 97(6):1288-1296; Koning et al ., Cytokine 1997 Jun; 9(6):427-436]. 마우스에서 알레르기성 염증의 2개의 모델에서, IL-10의 점적주입(instillation)은, 아마도 IL-5 및 TNF-α를 억제하여, 기도 호산구 증가증 및 호중구 증가증으로부터 감작화된 마우스를 보호하였다[참조: Zuany-Amorim et al ., J Clin Invest 1996:2644-2651; Zuany-Amorim et al., J Immunol 1996 Jul 1; 157(1):377-84].

사이토카인 생산의 Th2/Th1 2분법과 일관되게, 천식의 쥐 모델에서 IL-4 및 IL-5 우세 및 저 수준의 Th1 사이토카인 IFN-γ 및 IL-12로 사이토카인 프로파일이 관찰된다[참조: Ohkawara et al ., Am J Respir Cell Mol Biol 1997 May; 16(5):510-20]. 최근의 동물 연구는 Th2 우세를 역전시키기 위한 시도에서 재조합 쥐 IL-12를 사용한 치료를 조사하고 있다. 시험관내 데이터는 T 림프구의 1차 항원 자극 동안 IL-12의 존재는 Th1 세포의 발생을 촉진시킨다는 것을 보여준다[참조: Kips et al ., Am J Respir Crit Care Med 1996 Feb; 153(2):535-9]. 킵스(Kips)는 면역접종시에 IL-12를 투여하여 특이적인 IgE의 생산, 기도 호산구 증가증 및 기도 과민반응을 예방하는 방법으로 생체내에서 이를 확인하였다. 이미 감작화된 마우스의 에어로졸 시험감염 동안의 IL-12 투여로는 기도 호산구 증가증 및 기도 과민반응이 예방되었지만, 특이적인 IgE 생산은 감소되지 않아, IL-12가 미감작 Th 세포의 Th1 세포로의 분화를 자극하고 Th2 세포의 발생을 억제시킬 수 있다는 것을 시사하였다. IL-12에 의한 항원 유도된 기도 호산구 증가증의 억제는 초기 감작화 동안에는 IFN-γ 의존적이지만, 2차 시험감염 동안에는 IFN-γ 독립적이 된다[참조: Brusselle et al ., Am J Respir Cell Mol Biol 1997 Dec; 17(6):767-71]. 또한, 공기알레르겐(aeroallergen) 시험감염 전 감작화된 마우스로의 백시니아 바이러스 벡터를 통한 폐에서의 IL-12 유전자의 점막 유전자 전달은, IFN-γ 의존적 방식으로 IL-4, IL-5, 기도 과민반응 및 기도 호산구 증가증의 억제를 유도하는 것으로 증명되었다[참조: Hogan et al ., - Eur J Immunol 1998 Feb.; 28(2):413-23].

IFN-γ 수준이 증가되면 면역 반응이 Th1 표현형으로 유도될 수 있으며, 천식에서 이로울 수 있다. 사람에서 임상적 상관관계는 혈청 중의 사이토카인 수준 또는 자극된 PBMC에 집중되었다. 자극된 PBMC를 사용한 대부분의 사이토카인 측정은 소아에서 수행되었다. 이러한 연구는 IL-4 및 IL-5 생산 증가 경향 및 IFN-γ의 생산 감소는 천식 소아라는 것을 증명하였다. 또한, 다른 연구에서는 아토피 및/또는 천식 중증도와 IFN-γ의 방출 간의 역 연관성이 증명되었다[참조: Imada et al ., (1995) Immunology 85(3): 373-80; Corrigan et al ., (1990) Am Rev Respir Dis 141(4) Pt 1: 970-7; Leonard et al ., (1997) Am J Respir Cell Mol Biol 17( 3): 368-75; Kang et al ., (1997) J Interferon Cytokine Res 17(8): 481-7]. 천식 환자로부터의 BAL 액 중의 사이토카인 수준은 저 수준의 IFN-γ를 보인다[참조: Kang et al ., (1997) J Interferon Cytokine Res 17(8): 481-7].

사람에서의 rIFN-γ의 임상 시험은 거의 없다. 1999년 현재, IFN-γ는 만성 육아종 질환의 치료에 대하여 지시되고, 장기간 치료 (평균 2.5년의 지속기간)는 최소한의 역효과 (발열, 설사 및 독감-유사 질병)를 보이면서 피부 병변의 개선을 가져왔다[참조: N Engl J Med 324 (8):509-16; Bemiller et al . (1995) Blood Cells Mol Dis 21(3): 239-47; Weening et al ., (1995) Eur J Pediatr 154(4): 295-8]. Boguniewicz(보구니에비치)는 용량을 증가시키면서 에어로졸화된 rIFN-γ(500mcg의 최대 용량, 2400mcg의 총 연구 용량)를 20일에 걸쳐 전달하여 경증 아토피성 천식이 있는 5명의 환자를 치료하였다[참조: Boguniewicz et al ., (1995) J Allergy Clin Immunol 95(1) Pt 1: 133-5]. 모든 환자에서 분무형 rIFN-γ가 용인되었지만, 최대 호흡량(peak flow)을 포함하여 평가된 종점에서 유의적인 변화는 없었다.

본 발명자들은 지속성 항산성 간균(AFB; Acid Fast Bacilli) 도말표본- 및 배양-양성 다중 약물 내성 결핵(TB)이 있는 5명의 환자에게 분무형 rIFN-γ를 투여하였다[참조: Condos et al ., (1997) Lancet 349(9064): 1513-5]. 환자에게 4주 동안 매주 3회 에어로졸 rIFN-γ(500mcg)를 투여하였다 (총 연구 용량: 6000mcg). 치료는 용인되어 최소한의 부작용을 보였다. 4주 종료시, 5명의 환자 중 4명이 객담 AFB 도말표본 음성이었고, 양성 배양을 위한 시간이 증가되어, 치료 후 감소된 유기체 부하(load)를 보였다. 흥미롭게도, 상기 보고된 환자 및 추가적인 환자에서, 치료 1시간 후에 수행한 PEFR이 6% 향상되었다 (n = 10).

특발성 간질성 폐렴은 조직학을 근거로 7개의 범주로 분류되었다. 여기에는 통상의 간질성 폐렴(UIP), 비-특이적 간질성 폐렴(NSIP), 미만성 폐포 손상(DAD), 기질화 폐렴(OP), 박리성 간질성 폐렴(DIP), 호흡 세기관지염(RB) 및 림프구성 간질성 폐렴(LIP)이 포함된다[참조: Nicholson, Histopathology, 2002, 41, 381-391; White, J Pathol 2003, 201, 343-354].

"특발성 폐 섬유증(IPF)"이라는 용어는 "잠재성 섬유성 폐포염(CFA)"과 동일한 의미로서, 특발성 간질성 폐렴의 주요 하위그룹에 대한 임상 용어이고, 이는 평균 생존기간이 호흡곤란의 발생으로부터 3 내지 6년인 특발성 진행성 간질성 질환을 특징으로 하는 질환을 말한다. 특발성 폐 섬유증의 진단은 폐 생검에서 통상의 간질성 폐렴(UIP)을 확인하여 실시한다. 조직학적 패턴은 반점형(patchy) 만성 염증 (폐포염), 진행성 손상 (증식성 근섬유모세포 및 섬유모세포의 작은 응집체; 섬유모세포 병소라고 함) 및 섬유증 (치밀한 콜라겐 및 벌집 모양 변화)을 포함하는 이질성(heterogeneity)을 특징으로 한다[참조: King et al ., 2000, Am J of Resp . and Critical Care Med., 164, 1025-1032]. 간질성 폐렴의 다른 하위그룹의 치료는 특발성 간질성 섬유증의 성공적인 치료를 예상하지 못한다.

코르티코스테로이드 및 세포독성제는 치료법의 중심이었고, 오직 10 내지 30%의 환자만이 초기 일시적인 반응을 보여, 장기간 치료에 대한 필요성을 시사하였다[참조: Mapel et al . (1996) Chest 110:1058-1067; Raghu et al . (1991) Am . Rev. Respir . Dis . 144:291-296]. 특발성 폐 섬유증이 있는 환자의 불충분한 진단으로 인하여, 새로운 치료학적 접근법이 필요하다.

인터페론은 면역계의 세포에 의해 생산되는 천연 단백질의 계열이다. 이러한 계열의 인터페론은 알파, 베타 및 감마로 확인되었다. 각각의 계열은 상이한 효과를 갖지만, 이들의 활성은 서로 중첩된다. 여러 인터페론은 함께, 신체에 침입할 수 있는 바이러스, 세균, 종양 및 다른 외래 물질에 대한 면역계의 공격을 지시한다. 일단 인터페론이 외래 물질을 검출하여 공격하면, 성장 또는 기능을 늦추 거나, 차단하거나, 변화시켜 이를 변형시킨다.

인터페론-γ는 특이적인 면역 조절 효과 (예: 대식세포의 활성화, 산소 라디칼의 향상된 방출, 미생물 사멸, MHC 클래스 II 분자의 향상된 발현, 항바이러스 효과, 유도성 일산화질소 신타제 유전자의 유도 및 NO의 방출, 면역 효과인자 세포를 동원하여 활성화시키는 주화성 인자, 세포내 병원체의 생존에 필요한 철에 대한 미생물 접근을 제한하는 트랜스페린 수용체의 하향조절 등)를 갖는 다면발현성(pleiotropic) 사이토카인이다. 인터페론-γ 또는 이의 수용체가 없는 유전자 조작된 마우스는 마이코박테리아에 감염되기가 매우 쉽다.

재조합 IFN-γ는 근육내 및 피하 경로를 통해 1980년대에 정상 지원자 및 암 환자에게 투여되었다. 단핵구 활성화의 증거 (예: 산화제의 방출)가 있었다. 제이프(Jaffe) 등은 20명의 정상 지원자에 대한 rIFN-γ 투여를 보고하였다[참조: Jaffe et al ., J Clin Invest . 88, 297-302 (1991)]. 첫번째로, 상기 문헌의 저자들은 rIFN-γ 250㎍을 피하로 투여하여, 4시간차에 최고 혈청 수준을 기록하였고 24시간차에 최저치를 기록하였다.

다수의 임상 시험이 지원되어 감염성 질환에 대해 IFN-γ를 평가하였다. "적절한 3개월 치료가 실패한 폐 다중 약물 내성 결핵(MDR-TB)이 있는 환자에서 흡입된 에어로졸화된 재조합 인터페론-γ1b의 안전성 및 효능의 2기/3기 연구 (A Phase II/III Study of the Safety and Efficacy of Inhaled Aerosolized Recombinant Interferon-g 1b in Patients with Pulmonary Multiple Drug Resistant Tuberculosis (MDR-TB) Who have Failed an Appropriate Three Month Treatment)"라는 제목의 MDR-TB 임상 시험은 여러 지역 (케이프 타운(Cape Town), 포트 엘리자베스(Port Elizabeth), 더반(Durban), 멕시코)에 있는 80명의 MDR-TB 환자를 등록시켜, 이들에게 무작위로, 2차적 치료법 이외에 6개월 이상 동안 에어로졸 rIFN-γ (500㎍ MWF) 또는 위약을 투여하였다. 상기 임상 시험은 객담 도말표본, M tb 배양 또는 흉부 방사선 사진 변화 상의 효능의 부족으로 인하여 조기에 중단되었다.

치쉐(Ziesche) 등은 특발성 폐 섬유증(IPF)이 있는 18명의 환자 중 9명에게 경구 프레드니손 이외에 1주일에 3회 200mg의 용량으로 rIFN-γ를 피하로 투여하였다[참조: Ziesche et al ., (1999) N. Eng . J. Med ., 341, 1264-1269]. IPF에 대한 인터페론 γ-1b의 후속적인 3기 임상 시험의 결과가 최근에 공개되었다. 상기 시험은 샘플 크기가 적당하고 무작위화된, 전향적, 이중 맹검, 위약 대조 연구였던 IPF의 최초의 임상 시험이었지만, 강제 폐활량(forced vital capacity)과 같은 생리학적 기능의 마커에 대한 유의적인 효과는 관찰되지 않았다. 하지만, 사망자가 위약 그룹에서 더 많이 발생하였고, 인터페론 γ-1b 치료를 받은 환자 집단의 경우 생존율이 유의적으로 높았으며, 강제 폐활량은 정상 예측치의 55% 이상이었고 일산화탄소에 대한 폐의 확산능은 정상 예측치의 35% 이상이었다. 상기 연구에서 질병 진행과 생존율 간의 불일치는 설명되지 않은 채 남아 있다. 한가지 가능성은 인터페론 γ-1b 치료법이, IPF가 있는 환자의 임상 경과를 악화시키는 경우, 감염에 대한 숙주 방어를 향상시키고 하기도 감염의 중증도를 감소시키는 것이다. 이러한 가능성은, 항미생물 특성을 갖는 인터페론 유도성 CXC 케모카인(chemokine)인 I- TAC/CXCL11이, 위약을 투여받은 사람과 비교하여, 인터페론 γ-1b를 투여받은 사람에서 혈장 및 기관지폐포 세척(BAL) 액 중에서 상당히 상향조절되었지만, 섬유화촉진성(profibrogenic) 사이토카인은 일반적으로 6개월 치료 기간에 걸쳐 인터페론 γ-1b 치료법에 의해 유의적으로 변화하지 않았다는 스트리이터(Strieter) 등에 의한 관찰에 의해 뒷받침된다[참조: Strieter et al ., Am J Respir Crit Care Med. (2004)]. 뚜렷하지 않은 상기 결과를 설명하는 한가지 가능성은 현재의 투여 방법을 사용하여 폐 간질로 전달되는 약물의 수준이 부적당한 것이다.

발명의 요약

한가지 양상에서, 본 발명은 에어로졸화된 인터페론을 치료학적 유효량으로 투여함을 포함하여 폐질환을 겪고 있는 피험체에서 폐질환을 치료하는 방법을 특징으로 한다. 많은 양태에서, 폐질환은 폐쇄성 폐질환이다. 일부 양태에서, 폐질환은 천식 또는 특발성 폐 섬유증이다. 한가지 양태에서, 폐질환의 개선된 증상은 강제 폐활량(FVC) 예측치의 치료 전의 수치와 비교하여 약 10% 이상의 증가, 바람직하게는 약 20% 이상 또는 약 25% 이상 또는 33%의 증가로 측정될 수 있다. 인터페론은 인터페론 α, 인터페론 β 또는 인터페론 γ일 수 있다.

다른 양태에서, 예를 들면 IPF 또는 천식과 같은 폐질환을 겪고 있는 피험체는 하나 이상의 코르티코스테로이드, 사이클로포스파미드 및 아자티오프린을 사용한 치료에 대해 무반응성이다. 또한, 면역억제제 치료법에 대해 최소한으로 반응하여 폐 기능 검사에서 적당하지만 유의적이지 않은 향상이 있는 환자에서, 본 발 명의 추가적인 양상은, 하나 이상의 면역억제제 또는 항염증제를 사용한 치료를 포함하는, 비제한적인 하나 이상의 다른 치료 방법을 사용한 치료를 유지하면서, 상기 환자의 치료를 에어로졸화된 인터페론과 병용하는 것이다.

보다 구체적인 양태에서, 에어로졸화된 인터페론은 1주일에 3회 분무기로 주어지는 약 250㎍ 내지 750㎍ 범위의 용량으로 투여된다. 다른 양태에서, 1주일에 3회 분무기로 주어지는 500㎍의 용량이 바람직하다. 분무기의 효율에 따라 저용량이 주어질 수 있다. 인터페론-γ 치료법 및 다른 치료 방법을 병용하여 IPF 환자를 치료하는 것이 바람직한 경우, 에어로졸화된 인터페론-γ를 적정하여, 상기 환자가 바람직하지 않은 효과를 겪지 않게 할 것이다. 또한, 병용 요법을 고려하는 경우, 다른 약제는 가장 효과적인 것으로 생각되는 수단으로 전달될 수 있다. 여기에는 정맥내, 근육내, 피하 전달이 포함될 수 있고, 또는 IFN-γ와 배합되어 에어로졸로서 전달될 수 있다.

다른 양상에서, 본 발명은 에어로졸 전달에 의해 투여되는 약제의 상부 호흡기도 침착을 정확하게 측정하는 방법을 특징으로 한다. 본 발명의 당해 양상의 한가지 양태에서, 에어로졸 전달을 통해 투여되는 약제는 인터페론 α, 인터페론 β 또는 인터페론-γ와 같은 인터페론이다. 상기 기술은 특별한 기술이며, 모든 종류의 폐질환이 있는 환자에 대한 인터페론 α, 인터페론 β 또는 IFN-γ와 같은 인터페론의 전달에 적용된다.

다른 목적 및 장점은 다음의 예시적인 도면과 함께 기술된 다음의 상세한 설명의 검토로부터 명백해질 것이다.

도 1은 통상의 평상 호흡(tidal breathing) 패턴을 보여준다.

도 2는 평상 호흡과 비교하여 느리고 깊은 흡기 방법의 특징인 흡기 속도의 감소 및 매우 연장된 흡기 시간을 보여준다.

도 3은 느리고 깊은 호흡 패턴을 사용하여 4.5㎛의 에어로졸을 흡입하는 사람 피험체에서 침착 패턴을 보여준다. 이 이미지는 위장에서 소량의 활성에 의해 보여지는 상기도에서의 에어로졸의 최소한의(10% 미만의) 침착을 증명한다. 침착 이미지는 대략 8초의 흡기 시간으로 느리고 깊은 패턴을 사용하여 3회 호흡한 후 사람 피험체의 폐 주변부에 침착된 방사성표지된 에어로졸을 보여준다.

도 4는 현재의 표준 흡입 방식인 1.5㎛ 입자의 20회의 평상 호흡 후 동일한 피험체에서의 예시적인 스캔이다. 이미지의 분석은 큰 입자의 사용, 느린 흡기 및 연장된 흡기 시간과 결합된 느리고 깊은 호흡 방법은 폐에서 에어로졸 입자가 침착되는데 있어서 호흡 당 51배 효율적이라는 것을 보여준다.

도 5는 분무기를 통해 전달되는 500㎍의 IFN-γ로 12주 동안 1주일에 3회 치료받은 IPF를 겪고 있는 환자의 침착 스캔을 보여준다. 이미지화는 치료 후에 수행되었다. 관심대상의 영역을 윤곽선으로 표시하였다. sU/L은 폐의 상부 대 폐의 하부에 침착된 방사능의 분포로서 크세논에 대해 정규화된 것이다. 도면에서 수평선은 상부와 하부 폐 4분면 사이의 경계를 표시한다. sC/P는 아래에 기술된 특정한 중심부 대 주변부 비를 의미한다. a/Xe는 에어로졸 대 크세논 비를 의미한다.

도 6은 에어로졸 치료 전후에 BAL을 통해 특정된 TGF-β 수준을 보여준다.

도 7은 IPF가 있는 5명의 환자에 대한 에어로졸 rIFN-γ의 연구에서 치료받은 5명의 환자에서 치료 후 증가된 % 총 폐용량 예측치를 증명한다. 모든 환자에서 숨참의 개인적인 개선이 보고되었다. 3개월의 치료 종료시까지, 연구에 포함된 환자는 총 폐용량이 통계적으로 유의하게 증가하였다. 또한 5명의 연구 환자 중 2명에서는 강제 폐활량이 200cc 이상 (각각 200 및 500cc) 향상되었다.

도 8은 IPF가 있는 5명의 환자에 대한 에어로졸 rIFN-γ의 연구에서 치료받은 5명의 환자 중 3명에서 치료 후 증가된 % 강제 폐활량 예측치를 증명한다. 이러한 생리학적 변화는 상기 환자의 기관지폐포 세척(BAL) 액 (폐의 내층으로부터 세척된 액)으로부터 회수된 활성화된 TGF-β의 수준의 감소를 동반하였다.

도 9A 및 9B는 IPF에 대해 에어로졸 rIFN-γ를 사용하여 치료받은 5명의 환자에서 총 단백질 중 TGF-β의 감소된 비율을 증명한다. TGF-β는 폐에서 섬유증의 주요 매개인자 중의 하나이다. TGF-β의 활성화는 콜라겐 생산을 유도한다. TGF-β의 수준의 감소는 폐에서 콜라겐 침착의 감소 및 섬유증 감소를 유도할 것이다.

도 10은 인터페론-γ를 사용한 에어로졸 치료 전후에 결핵 환자 및 특발성 폐 섬유증이 있는 환자의 폐에서 측정된 인터페론-γ의 양을 증명한다.

도 11은 에어로졸 IFN-γ를 사용한 치료 후 천식 환자에서 최대 호흡량의 % 변화를 보여준다. 에어로졸 인터페론-γ를 투여받은 모든 환자를 폐활량측정법으로 연구하여 가역성 기도 질환을 평가하였다. 각각의 에어로졸 치료에서, 환자의 최대 호흡량을 치료 전후에 모니터하였다.

도 12는 도 2에서 언급된 최대 호흡량 측정치의 % 변화의 요약을 제공한다. 평균 최대 호흡량이 에어로졸 인터페론 γ 치료 후 증가하였고, 일부 환자에서는 유의적인 증가를 보였다. 중요하게는, 최대 호흡량 측정치가 인터페론 γ 치료 후 감소한 모든 환자에서, 기침 또는 다른 징후가 전혀 발생하지 않았다. 이러한 데이터는 에어로졸 인터페론 γ가 기도 질환이 있는 환자에서 안전하며 충분히 용인된다는 것을 보여준다.

본 방법 및 치료 방법론이 기술되기 전에, 본 발명은 기술된 특정 방법 및 실험 조건에 제한되지 않으며, 이러한 방법 및 조건은 변할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 또한, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의해서만 제한될 것이므로, 본원에서 사용되는 용어는 특정 양태를 기술하기 위한 목적으로만 사용되고 한정하는 것이 아니라는 것을 이해하여야 한다.

본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 단수형 "하나" 및 "상기"는, 문맥에서 분명하게 명시되어 있지 않으면, 복수의 의미를 포함한다. 따라서 예를 들면, "상기 방법"의 언급에는 본원에서 기술되고/되거나 본 명세서를 읽을 시에 당업자에게 명백할 하나 이상의 방법 및/또는 단계의 종류 등이 포함된다.

달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술적이고 과학적인 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 검사에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료는 지금 기술된다. 본원에서 언급된 모든 문헌은 본원에 참조로서 인용되어, 문헌의 인용과 관련하여 방법 및/또는 재료를 공개하고 기술한다.

정의

특정 양태에서 "개선된 증상"이라는 용어는 치료 전의 수치와 비교하여 10% 이상의 FVC 예측치의 향상으로서 평가된다.

"하나 이상의 코르티코스테로이드, 사이클로포스파미드 및 아자티오프린을 사용한 치료에 대해 무반응성"이라는 어구는 통상적인 선행 기술 치료에 대해 무반응성인 환자 집단을 의미한다.

폐활량(VC; Vital Capacity)은 폐 안으로 들어가고 나올 수 있는 총 공기를 의미한다.

Fev1은 1초 동안의 강제 호기량을 의미한다.

Fev1/FVC 비는 1초 동안의 강제 호기량 대 강제 폐활량의 비를 의미한다.

"폐질환"이라는 용어는 적어도 부분적으로 폐 또는 호흡계에 영향을 주는 임의의 질환을 말한다. 상기 용어는, 예를 들면 천식, 폐기종, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐렴, 결핵, 및 특발성 폐 섬유증을 포함하는 비제한적인 모든 형태의 섬유증과 같은 폐쇄성 및 비-폐쇄성 상태를 포함하는 의미이다.

"폐쇄성 폐질환"이라는 용어는 호흡계로 들어가거나 나오는 공기흐름을 감소시키는 임의의 폐질환을 말한다. 정상에 비해 감소된 공기흐름은, 예를 들면, FVC 또는 FEV1에 의해 총 시간 동안 또는 한정된 시간에 걸쳐 측정할 수 있다.

"특발성 폐 섬유증(IPF)"이라는 용어는 "잠재성 섬유성 폐포염(CFA)"과 동일한 의미로서, 특발성 간질성 폐렴의 주요 하위그룹에 대한 임상적 용어이고, 이는 평균 생존기간이 호흡곤란의 발생으로부터 3 내지 6년인 특발성 진행성 간질성 질환을 특징으로 하는 질환을 말한다. 특발성 폐 섬유증의 진단은 폐 생검에서 통상성 간질성 폐렴(UIP)을 확인하여 실시한다. 조직학적 패턴은 반점형 만성 염증 (폐포염), 진행성 손상 (증식성 근섬유모세포 및 섬유모세포의 작은 응집체; 섬유모세포 병소라고 함) 및 섬유증 (치밀한 콜라겐 및 벌집 모양 변화)을 포함하는 이질성을 특징으로 한다.

"천식"이라는 용어는 염증 (세포 손상) 및 폐로 이어지는 기도의 좁아짐을 포함하는 통상적인 질환을 말한다. 천식은 소아 및 성인에서 발병한다. 소아 천식은 청소년기 및 성인기까지 계속될 수 있지만, 천식이 발병한 일부 성인은 젊었을 때는 천식이 없었다. 전세계적으로 수백만 명의 사람이 천식에 걸리며, 최근 수년간 더 빈번해졌다.

"느리고 깊은 호흡"은 흡기 시간이 호기 시간보다 긴 임의의 호흡 패턴을 의미한다. 이러한 패턴은 0.5 초과의 듀티 사이클(duty cycle) (흡기 시간 / 총 호흡 시간)을 특징으로 한다. 정상적인 평상 호흡 동안에는 듀티 사이클이 항상 0.5 미만이거나 약 0.5이다. 즉, 흡기 시간이 항상 호기 시간보다 짧다. 질환 상태에서, 듀티 사이클은 폐쇄성 질환에서는 감소되고, 제한성 장애의 경우에는 여전히 0.5 미만인 것 같다. "느리고 깊은" 호흡은 I/E 비 (흡기 시간 대 호기 시간)가 1을 초과하는 것을 특징으로 할 수 있고, 일부 경우에 I/E 비는 8 또는 9에 근접하여 듀티 사이클이 0.8 또는 0.9가 될 수 있다.

인터페론-γ의 작용 기전

IFN-γ에 대한 반응의 시간적 조절 경로를 기술하는 시그날 전달 경로는 배양된 세포에서 최근에 연구되었다[참조: Vilcek et al ., (1994) Int Arch Allergy Immunol 104(4): 311-6; Young et al ., (1995) J Leukoc Biol 58(4): 373-81]. 첫번째 사건은 첨가된 IFN-γ가 이의 수용체의 세포외 도메인에 결합했을 때 발생하여, 수용체의 세포내 도메인에서 선재하는 시그날 전달인자 및 전사 활성인자 1 (STAT-1; Signal Transducer and Activator of Transcription 1)의 티로신 인산화를 유도한다. 오직 티로신-인산화된 STAT-1만이 활성화되어, 동종이량체 (또는 이종이량체)를 형성하여 특정 DNA 서열에 결합하게 된다.

핵으로 이동하여 많은 유전자의 프로모터 내의 동족(cognate) 조절 요소에 결합하면, STAT-1은 전사를 활성화시킨다. STAT-1은 구성적으로 활성인 다른 선재하는 전사 인자와 함께 작용하여, 일부 유전자의 전사가 새로운 단백질 합성에 대한 필요성 없이 최대로 유도될 수 있다. 다른 유전자는 IFN-γ에 반응하여 새로 합성된 전사 인자와 함께 STAT-1에 의해 조절된다. 마찬가지로 전사 인자를 암호화하는 IRF-1 유전자도 IFN-γ에 반응하여 STAT-1에 의해 조절된다[참조: Pine, R. (1992) J Virol 66(7): 4470-8; Pine et al ., (1994) Embo J 13(1): 158-67; Pine et al ., (1990) Mol Cell Biol 10(6): 2448-57]. IRF-1 유전자의 프로모터는 또한 핵 인자 카파 B (NF-κB)에 대한 결합 부위를 함유하고, 이는 IRF-1 유전자의 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α)-활성화된 전사를 매개한다는 점을 유의하여야 한다[참조: Harada et al ., (1994) Mol Cell Biol 14(2):1500-9; R. Pine, 미발표됨].

일단 IRF-1 단백질이 합성되면, 이는 시간적으로 하류의 여러 유전자의 전사를 활성화시킨다. IRF-1은 TAP-1, LMP-2, 및 HLA-A 및 HLA-B 클래스 I 주요 조직적합성 항원을 포함하는 항원 프로세싱 및 제시에 관련된 주요 유전자의 IFN-γ-유도된 발현을 조절하는 것으로 밝혀졌다[참조: Johnson et al ., (1994) Mol Cell Biol 14(2): 1322-32; White et al ., (1996) Immunity 5(4): 365-76].

IRF-1은 인산화되고, 인산화의 정도를 조작하면 이의 DNA 결합 활성이 영향을 받는다[참조: Pine et al ., (1990) Mol Cell Biol 10(6): 2448-57; Nunokawa et al ., (1994) Biochem Biophys Res Commun 200(2): 802-7]. 하지만, IRF-1의 인산화가 생체내에서 조절된다는 분명한 증거는 없다. STAT-1 활성은 티로신 인산화에 의존적이고 세린 인산화의 정도에 의해 영향을 받는다. 하지만, 잠재성 STAT-1의 양도 또한 조절된다. IFN-γ로 하룻밤 동안 처리한 세포에서 STAT-1 단백질의 수준이 증가되었지만, 티로신 인산화 및 DNA 결합 활성은 비-자극된 세포보다 단지 약간 높다[참조: Pine et al ., (1994) Embo J 13(1): 158-67].

유전자 발현 및 이의 조절에 관한 연구는 전체적인 면역학적 상태의 다른 양상에 관한 정보를 제공할 수 있다. 구체적으로, 사이토카인 변화의 기능적 효과를 특정 DNA 결합 활성의 측정에 의해 확인할 수 있다. 예를 들면, T 세포에서 IL-12는 STAT-4의 활성화를 유도하지만, IL-4는 STAT-6의 활성화를 유도하고, Th1 및 Th2 반응의 발생 또는 어느 하나에서 다른 하나로의 전환은 특정 시간에 검출된 STAT의 DNA 결합 활성의 프로파일에 반영될 수 있다[참조: Darnell (1996) Recent Prog Horm Res 51:391-403; Ivashkiv, L. B. (1995) Immunity 3(1): 1-4].

IPF 의 에어로졸화된 인터페론-γ 치료

최근에, IPF가 있는 환자의 소규모 무작위 시험에서 피하 인터페론-γ(IFN-γ)로 치료하였다[참조: Ziesche et al . (1999) N. Engl . J. Med . 341:1264-1269]. IFN-γ로 치료하기 전과 치료 6개월에 채취한 경기관지 생검(transbronchial biopsy) 표본의 분석은, 비정상적인 예비처리로 섬유화촉진성(profibrotic) 사이토카인인 전환 성장 인자-β(TGF-β)가 증가하고 결합 조직 성장 인자 (CTGF)가 IFN-γ를 사용한 치료 후 유의적으로 감소한다는 것을 증명하였다[참조: Ziesche et al. (1999) supra]. 프레드니솔론 만을 사용하여 치료한 환자는 TGF-β 및 CTGF 수준의 변화가 없었다.

인터페론의 전달

에어로졸 전달

본 발명의 광범위한 양상에서, 폐질환을 겪고 있는 피험체에서 천식 및 특발성 폐 섬유증(IPF)을 포함하는 폐질환을 치료하는 방법은, 에어로졸화된 인터페론(예: 인터페론-γ)을 치료학적 유효량으로 투여함을 포함하고, 이때 폐질환의 증상이 개선되거나 완화된다. 개선된 증상은 FVC 예측치가 치료 전의 수치와 비교하여 10% 이상 증가하는 것일 수 있다. 바람직한 양태에서, 에어로졸화된 IFN-γ를 사용하여 천식 또는 IPF를 겪고 있는 피험체를 치료할 수 있고, 이때 피험체는 하나 이상의 코르티코스테로이드, 사이클로포스파미드 및 아자티오프린을 사용한 치료에 대해 무반응성이다. 또한, 에어로졸화된 인터페론(예: IFN-γ)의 투여량을 계산하여 폐 섬유증이 있는 환자에서 최적화시킨다. 이러한 투여는 환자의 폐 기능 검사 결과를 향상시킬 것이다.

IFN-γ와 같은 인터페론은 다수의 상이한 경로를 통해, 예를 들면 정맥내, 근육내, 피하, 비강내로 그리고 에어로졸을 통해 투여될 수 있다. 하지만, 폐질환만을 치료하는 경우, 폐에 직접적으로 약제를 전달하여 다른 기관계에 노출되지 않게 한다. 2주일 동안 1주일에 3회 에어로졸을 통한 500㎍의 IFN-γ의 유효한 투여는 정상적인 환자에서 투여 후 IFN-γ의 수준을 증가시키는 것으로 기관지폐포 세척(BAL) 분석에 의해 밝혀졌다. 마찬가지로, 1주일에 3회 약 500㎍의 인터페론-β 투여 및 1주일에 3회 약 0.25mg의 인터페론-α 투여도 유효한 것으로 생각된다.

본 발명의 목적은 폐 투여 경로를 통해 인터페론-γ와 같은 인터페론을 전달하는 것이다. IFN-γ와 같은 인터페론은 흡입하는 동안 포유동물의 폐로 전달되어, 폐 상피 내층을 통과하여 혈류로 이동된다 (이에 관한 다른 보고에는 Adjei et al., PHARMACEUTICAL RESEARCH, VOL. 7, No. 6, pp. 565-569 (1990); Adjei et al ., International Journal of Pharmaceutics, 63:135-144 (1990); Braquet et al ., Journal of Cardiovascular Pharmacology, Vol. 13, suppl. 5, s. 143-146 (1989); Hubbard et al ., Annals of Internal Medicine, Vol. III, No. 3, pp. 206-212(1989); Smith et al ., J. Clin . Invest., Vol. 84, pp. 1145-1146 (1989); Oswein et al ., "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, 1990; 및 Platz et al., 미국특허 제5,284,656호가 포함된다). 본 발명의 실시에서 사용하는데 고려되는 것으로는 분무기, 계량 흡입기 및 분말 흡입기를 포함하는 비제한적인, 치료제의 폐 전달용으로 설계된 광범위한 기계 장치가 있고, 이들은 모두 당업자에게 익숙하다.

본 발명의 실시에 적당한 시판되는 장치의 몇몇 구체적인 예로는 Ultravent 분무기[판매원: Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri]; Acorn II 분무기[판매원: Marquest Medical Products, Englewood, Colorado]; Ventolin 계량 흡입기[판매원: Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina]; 및 Spinhaler 분말 흡입기[판매원: Fisons Corp., Bedford, Massachusetts], MistyNeb[판매원: Allegiance, McGraw Park, IL]; AeroEclipse[판매원: Trudell Medical International, Canada]가 있다.

모든 이러한 장치는 단백질의 분배에 적당한 제형의 사용을 필요로 한다. 통상적으로, 각각의 제형은 사용되는 장치의 종류에 대해 특정적이며, 치료에 유용한 통상적인 희석제, 애주번트 및/또는 담체 외에도, 적당한 분사제 물질의 사용을 포함할 수 있다. 또한, 리포좀, 마이크로캡슐 또는 미소구체(microsphere), 봉입 복합체(inclusion complex) 또는 다른 종류의 담체의 사용이 고려된다. 화학적으로 변형된 단백질을 화학적 변형 또는 사용되는 장치의 종류에 따라 상이한 제형으로 제조할 수도 있다.

분무기 (제트(jet) 분무기 또는 초음파 분무기)와 함께 사용하는데 적당한 제형은, 용액 1mL 당 약 0.1 내지 25mg의 생물학적 활성 단백질의 농도로 물에 용해된 단백질을 통상적으로 포함할 수 있다. 제형은, 예를 들면, 단백질 안정화 및 삼투압의 조절을 위한, 완충액 및 단당류를 포함할 수도 있다. 분무기 제형은, 에어로졸을 형성함에 있어서 용액의 분무화(atomization)에 의해 발생하는 단백질의 표면 유도된 응집을 감소시키거나 예방하는 계면활성제를 함유할 수도 있다.

계량 흡입기 장치와 함께 사용하기 위한 제형은 일반적으로, 계면활성제를 사용하여 분사제 중에 현탁된 단백질을 함유하는 미세하게 분쇄된 분말을 포함할 수 있다. 분사제는 상기 목적을 위하여 사용되는 임의의 통상적인 물질, 예를 들면 클로로플루오로카본, 하이드로클로로플루오로카본, 하이드로플루오로카본 또는 하이드로카본, 예를 들면 트리클로로플루오로메탄, 디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄올 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄 또는 이의 배합물일 수 있다. 적당한 계면활성제에는 소르비탄 트리올레에이트 및 대두 레시틴이 포함된다. 올레산도 계면활성제로서 유용할 수 있다.

분말 흡입기 장치로부터 투여하기 위한 제형에는 단백질을 함유하는 미세하게 분쇄된 건조 분말이 포함될 수 있고, 장치로부터 분말의 살포를 촉진시키는 양 (예: 제형의 50 내지 90중량%)의 증량제 (예: 락토스, 소르비톨, 수크로스 또는 만니톨)를 포함할 수도 있다. 단백질은 가장 유리하게는, 말초 폐로의 가장 효과적인 전달을 위하여, 평균 입자 크기가 10㎛ (또는 마이크론) 미만, 가장 바람직하게는 0.5 내지 5㎛인 미립자 형태로 제조하여야 한다.

에어로졸 전달의 목적은 사람에서 심부 폐로의 인터페론 (예: IFN-γ)과 같은 치료제의 전달을 상당히 증가시키는 것이다. 느리고 깊은 흡기로 호흡하는 특히 바람직한 접근법은, 표준 (평상 호흡)과 비교하는 경우, 폐 주변부에서 침착 효율을 최대 약 50배 만큼 증가시킬 수 있다.

평상 호흡 (도 1)과 비교하여 느리고 깊은 흡기의 방법을 사용한 특정 패턴의 호흡은 흡기 속도의 감소 및 매우 연장된 흡기 시간을 보인다. 이러한 패턴은 도 2에 제시되어 있다. 느린 흡기는 에어로졸 입자가 상기도를 우회하게 하여, 이들이 폐에 침착될 수 있게 한다. 연장된 흡기는 폐 주변부에서 에어로졸의 적당한 침전을 가능하게 한다. 흡기 시간의 연장 및 향상된 침전은 나머지 입자가 호기되기 전에 "흡기 침착"을 촉진시킨다. 이러한 환경 하에서, 호기가 시작되기 전에 흡기된 입자의 거의 100%가 침착되는 것이 가능하다. 이러한 과정은, 통상적으로 구강인두에 침착될 상대적으로 큰 (예: 약 4.5㎛) 입자를 사용하여 추가로 향상될 수 있다. 느리고 깊은 호흡의 연장된 흡기는, 말초 기도 질환이 있어서 통상적인 작은 에어로졸의 침착이 감소될 뿐만 아니라 구강인두에서 침착의 방지가 촉진되는 환자의 폐로의 약물의 전달에 특히 적당하다. 상기 방법으로 치료될 수 있는 폐 주변부의 질환에는, 예를 들면, 특발성 폐 섬유증 및 폐기종이 포함된다. 이러한 질환은 공간(airspace)을 확대시켜 평상 호흡 동안 최소한의 침착을 일으킨다.

상기 흡기 및 침착 기술은 폐 모세혈관을 통한 전신 순환으로의 전신적 흡수를 촉진시킬 목적으로 약물의 말초 전달을 향상시킬 수 있다. 도 3은 느리고 깊은 호흡 패턴을 사용하여 4.5㎛의 에어로졸을 흡입하는 사람 피험체에서 침착 패턴을 보여준다. 이 이미지는 위장에서 소량의 활성에 의해 보여지는 상기도에서의 에어로졸의 최소한의(10% 미만) 침착을 증명한다. 침착 이미지는 대략 8초의 흡기 시간으로 느리고 깊은 패턴을 사용하여 3회 호흡한 후 사람 피험체의 폐 주변부에 침착된 방사성표지된 에어로졸을 보여준다. 도 4는 현재의 표준 흡입 방식인 1.5㎛ 입자의 평상 호흡 20회 후 동일한 피험체에서의 예시적인 스캔이다. 이미지의 분석은 큰 입자의 사용, 느린 흡기 및 연장된 흡기 시간과 결합된 느리고 깊은 호흡 방법이 폐에서 에어로졸 입자가 침착되는데 호흡 당 51배 효율적이라는 것을 보여준다.

느리고 깊은 방법을 수행할 수 있는 장치의 제조는 복잡하지만, 이러한 기능을 수행하는 원형(prototype) 장치는 개발되고 있고 사용되었다 (영국에 본사가 있는 Profile Therapeutics의 자회사인 Profile Therapeutics, Inc. (28 State Street, Ste. 1100, Boston, MA 02109)).

폐 실질조직(parenchyma)의 질환은 폐 주변부에서 기하학적 변화를 일으켜 흡입된 입자의 침착을 최소화시킬 수 있다. 질환 부위(폐 주변부)로 직접적으로 전달된 치료제는 전신적으로 전달된 동일한 약제와 비교하여 보다 유효할 수 있다. 인터페론(예: IFN-γ)의 느리고 깊은 흡기 방법에서, 에어로졸은 폐 섬유증 환자의 폐포의 질환의 치료에 특히 적당하다.

사람 침착 연구에서는 느리고 깊은 흡기 방법이 통상적인 에어로졸 전달 시스템보다 약 50배 더 효율적이라는 것이 밝혀졌다. 이러한 호흡 패턴은, 인터페론(예: IFN-γ)과 같은 약제를 이러한 약제의 현존하는 제형을 사용하여 폐 주변부로 광범위하게 투여하여, 예를 들면, 특발성 폐 섬유증 또는 천식을 포함하는 폐쇄성 폐질환과 같은 폐질환에 대하여 에어로졸 치료법의 효능을 검사하기 위한 임상 시험의 설계를 가능하게 한다. 에어로졸이 거의 호기되지 않으므로, 폐에 침착되는 양은 호흡 패턴에 의해 조절된다.

비강 전달

단백질의 비강 전달도 고려된다. 비강 전달은, 치료제를 폐에 침착시킬 필요 없이, 치료제를 코로 투여한 직후 단백질이 혈류로 이동하게 한다. 비강 전달용 제형에는 덱스트란 또는 사이클로덱스트란을 함유하는 것이 포함된다.

투여량

추가적인 연구가 수행됨에 따라, 다양한 환자에서 다양한 상태의 치료에 적절한 투여 수준에 관한 정보가 알려질 것이고, 당업자는 수여자의 치료 환경, 연령 및 전반적인 건강을 고려하여 적당한 용량을 결정할 수 있을 것이라는 점을 이해하여야 한다. 일반적으로, 주사 또는 주입의 경우, 인터페론-γ 투여량은 1주일에 3회 주어지는 250㎍ (화학적 변형 없이 단백질만의 질량을 계산함) 내지 750㎍ (동일하게 계산함)의 생물학적 활성 단백질일 것이다. 보다 바람직하게는, 투여량은 1주일에 3회 주어지는 약 500㎍일 수 있다. 일반적으로, 주사 또는 주입의 경우, 인터페론-α 투여량은 일반적으로 1주일에 1 내지 5회 투여되는 250 내지 750㎍이고, 바람직하게는 1주일에 3회 투여되는 약 500㎍이다. 인터페론-β의 경우에, 투여량은 일반적으로 1주일에 1 내지 3회 0.10 내지 1mg이고, 바람직하게는 1주일에 3회 약 0.25mg이다. 투여 스케줄은 단백질의 순환 반감기 및 사용되는 제형에 따라 달라질 수 있다.

다른 화합물과의 투여

본 발명의 추가적인 양상은 폐질환을 치료하는데 사용되는 하나 이상의 약제학적 조성물과 함께 인터페론을 투여할 수 있는 것이다. 또한, 항염증제 또는 면역억제제, 예를 들면, 사이클로포스파미드, 아자티오프린 또는 코르티코스테로이드를 공동투여할 수 있다. 투여는 동시 투여이거나 순차 투여일 수 있다.

3일 동안 250㎍의 IFN-γ를 피하 투여한 후, IFN-γ의 BAL 수준의 증가 또는 폐포 대식세포의 변화는 없었지만, 말초 혈액 단핵구가 상향조절되었다는 것이 밝혀졌다[참조: Jaffe et al . (1991) J. Clin . Invest . 88:297-302]. 또한, 에어로졸 IFN-γ는 폐 결핵이 있는 환자에서 보조적 치료로서 사용되었다.

아래에 기술된 연구에서, IPF를 겪고 있고 통상적인 면역억제 치료에 대해 무반응성인 환자를 에어로졸화된 IFN-γ로 치료하였다.

본 발명은 다음의 실시예를 참조하여 보다 충분히 이해될 수 있지만, 실시예는 본 발명의 대표적인 양태이며 본 발명을 제한하는 의미가 아니다.

다음의 실시예는 당업자에게 본 발명의 치료 방법 및 화합물 및 약제학적 조성물의 제조 및 사용 방법의 완전한 공개 및 설명을 제공하기 위하여 제시되어 있으며, 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다. 사용된 숫자 (예: 양, 온도 등)의 정확성을 위하여 노력하였지만, 일부 실험적 오류 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 명시되지 않으면, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압이거나 대기압 근처이다.

실시예 1

환자 집단

연구 피험자들은 미국흉부학회(American Thoracic Society) 기준 A 또는 B (아래)에 의해 진단된 특발성 폐 섬유증(IPF)을 겪고 있는 환자들이었다. 환자 집단은 코르티코스테로이드, 사이클로포스파미드 및/또는 아자티오프린을 사용한 통상적인 치료에 반응하지 못하였거나 이에 대한 후보가 아니었다. 환자 집단을 에어로졸화된 IFN-γ로 12주 동안 치료하였다.

UIP를 보이는 외과적 생검의 평가에서, 다음의 3개의 조건이 만족되어야 한다:

1. 간질성 폐질환의 다른 공지된 원인 (예: 특정 약물 독성, 환경적 노출 및 결합 조직 질환)의 배제.

2. 제한 (증가된 Fev1/FVC 비와 종종 함께 나타나는 감소된 폐활량(VC)) 및/ 또는 손상된 가스 교환 (O₂에 대한 증가된 폐포-동맥 구배 또는 CO에 대한 감소된 확산능)의 증거를 포함하는 비정상 폐 기능 연구.

3. HRCT 스캔 상의 최소의 간유리 혼탁(ground glass opacity)과 함께 양측기저 망상 이상(bibasilar reticular abnormality).

외과적 폐 생검의 부재 하에서, 면역적격(immunocompetent) 성인에서는, 다음의 경우 IPF가 추정 진단될 수 있다:

I. 상기 모든 3개의 기준이 충족된다.

II. 경기관지 폐 생검(TBBx) 또는 기관지폐포 세척(BAL)에서 다른 진단을 내리게 하는 어떤 특징도 보이지 않는다.

III. 다음의 4개의 보조 기준 중 3개:

1. 연령: 50세 초과

2. 운동시 원인불명의 호흡곤란의 잠행성 발생

3. 질환의 지속기간: 3개월 초과

4. 양측기저 흡기 악설음(crackle).

개선은 (1) 스테로이드 치료 전에 측정된 FVC와 비교하여 기저치로부터 FVC 예측치의 10%의 증가, (2) 환자의 FVC가 기저치로부터 10% 이상 증가되고 나서 치료에도 불구하고 기저치로 되돌아오는 경우로 정의된다.

연구에 포함되는데 적합한 환자는 다음과 같이 정의된다:

(1) 인정된 기준 (상기 참조)에 따라 검진 3년 이내에 IPF로 진단된 환자;

(2) 연령: 20 내지 70세;

(3) 사이클로포스파미드/아자티오프린의 존재 또는 부재하에서 프레드니손 시험이 실패했거나, 스테로이드 또는 세포독성제를 사용하는 치료가 금기되는 환자;

(4) 연구 등록 전 28일 동안 0 내지 15mg의 프레드니손 또는 등가물을 투여받고 동일한 용량의 코르티코스테로이드를 유지하려는 환자;

(5) FVC: 검진시 예측 기저치의 50% 이상 90% 이하;

(6) 실내에서 휴식시 PaO₂: 60mmHg 초과;

(7) 서면 사전 동의서를 이해할 수 있고 이에 서명하기 원하며 연구 프로토콜의 모든 요건에 응하기 원하는 환자;

(8) 연구 기관지경 검사(bronchoscopy)에 대한 기준을 충족하고 검사를 받기 원하는 환자;

(9) 벨뷰(Bellevue) 병원의 GCRC 치료실에서 1주일에 3회 약제를 투여받을 수 있는 환자.

연구에 포함되는데 부적합한 환자는 다음과 같이 정의된다: (1) 연구 기관지경 검사를 받기 원하지 않거나 받을 수 없는 환자; (2) 공지된 천식 또는 중증 COPD가 있는 환자; (3) 적절한 동맥혈 산소화의 유지를 위하여 산소 요법이 필요한 환자; (4) 약제 또는 다른 성분 약제를 연구하는데 과민증이 있는 환자; (5) 연구 약물 투여에 의해 악화될 수 있는 (의약품 설명서에 따른 약물 투여에 대한 금기) 공지된 중증 심장 질환, 중증 말초 혈관 질환 또는 발작 장애가 있는 환자; (6) 임신 또는 수유중인 여성. 가임기 여성은 임신 음성 검사를 받고 인정된 형태의 산아 조절을 사용할 필요가 있을 것이다 (연구 지속기간 동안 금욕이 바람직한 방법이다); (7) 치료 전 1주일 이내에 활동성 감염의 증거; (8) 연구 등록으로부터 1년 이내에 환자가 사망할 것 같은 IPF 이외의 임의의 상태; (9) 다음을 포함하는 이상 혈청 검사 수치: (a) 지정된 한계를 초과하는 간 기능: 검진시 총 빌리루빈 > 1.5 x 정상치의 상한; 알라닌 아미노 트랜스퍼라제 > 3 x 정상치의 상한; 알칼리성 포스파타제 > 3 x 정상치의 상한; 알부민 < 3.0; (b) 지정된 한계를 초과하는 CBC; 검진시 WBC < 2,500/mm³; 적혈구용적률(hematocrit) < 30 또는 > 59; 혈소판 < 100,000/mm³; (c) 크레아티닌 > 1.5 x 정상치의 상한; (10) 앞서 6주 이내에, 코르티코스테로이드, 사이클로포스파미드 및/또는 아자티오프린을 제외한 폐 섬유증 치료용 약물 복용; (11) 임의의 계열의 인터페론 약제를 사용한 이전의 치료; (12) 마지막 28일 이내에 임의의 징후에 대한 연구적 치료.

실시예 2

처음에는, 10명의 환자를 IPF 등록소로부터 동원하여, 에어로졸화된 인터페론-γ의 개방 표지 예비 연구(open label pilot study)에 등록시킨다. 10명의 환자는 포함 및 배제 기준을 충족시킬 것이다. 수집되는 데이터에는 과거 병력, 예를 들면 신장, 체중 및 바이탈 싸인(vital sign); 개인의 모든 약물력 및 완전한 직업력 및 흡연력, 신체 검사, EKG, CBC, 전해질 검사, 간 효소 및 응고 프로파일, CXR, 흉부 CT, PFT, ABG, 가임기 여성의 임신 검사가 포함된다.

각각의 환자는, 환자의 일생에 걸친 담배 노출, 환경적 노출 및 약물 사용을 광범위하게 질문할 폐 섬유증 질문지를 연구 시작시에 완료한다. 각각의 환자는 또한 IFN-γ의 내약성(tolerability) 및 가능한 부작용을 확인하는 증상 질문지를 완료할 것이다.

상기 환자는 기관지폐포 세척(BAL)과 함께 기저선 기관지경 검사를 받아, 특정 섬유화촉진성 및 염증성 사이토카인의 수준을 평가할 것이다. 검사는 다음과 같이 수행한다:

각각의 환자를 벨뷰(Bellevue) 병원 프로토콜에 따라 기관지경 검사에 대해 평가한다. 각각의 평가에는 Hgb, 혈소판, BUN/CR, 응고 검사, ABG (75 mmHg 이상의 PO2), EKG, CXR이 포함된다. 기관지경 검사에 대한 금기에는 환자 협조의 부족, 최근의 심근경색, 악성 부정맥, 불치성 저산소혈증, 불안정성 기관지 천식, 폐 고혈압, 부분적 기관 폐쇄 또는 성대 마비, 출혈성 체질 및 요독증이 포함된다. 환자는 기관지경 검사 전 8시간 이상 NPO 해야 한다. 정맥내 주입로를 위치시키고, 보충 산소를 투여하고, 연속 맥박 산소측정 및 혈압 모니터를 수행할 것이다.

상기 환자에 60mg의 IM 코데인(codeine)으로 예비투약하고, 점성 리도케인(lidocaine)을 비강으로 투여한 후, 리도케인 가글(gargle) 및 분무기 (국소 마취 기관지경)가 사용될 것이다. 검사 동안, 미다졸람 및/또는 모르핀을 투여하여 진정시키고 기침 반사를 감소시킬 수 있다. 이러한 약제는 기관지경 검사에서 통 상적으로 사용된다. 기관지경을 코 및 성대로 통과시키고, 기관지내 검사를 수행한다. 이어서, 총 300ml에 대해 50ml의 멸균 생리 식염수 분취액을 투여하고, 최대한의 유체를 회수하기 위하여 서서히 흡인하여 BAL을 수행한다.

BAL 액을 환자로부터 채취한 후, 모든 BAL을 처리하는데 사용되는 표준화된 프로토콜 하에서 이를 GCRC 중심 실험실에서 처리한다. BAL 액을 멸균 거즈를 통해 여과시킨다. 감별을 포함한 총 세포 수 계산을 혈구계(hemocytometer)에서 수행한다. 세포 생존성을 트리판 블루(Trypan Blue) 방법으로 측정한다. 20개의 세포원심분리 슬라이드를 BAL 액의 각각의 로브(lobe)로부터 제조하여 -70℃에서 냉동시킨다. 24시간 상청액을 사이토카인 ELISA 검정을 위하여 10⁶ 세포/ml의 농도로 수거한다. 상피 내층액의 용적을 단백질 방법에 따라 측정한다. 원심분리 후, BAL 액 상청액을 AMICON 필터 방법을 사용하여 10배 내지 50배 농축시킨다. 사이토카인 검정을 시판되는 키트[판매원: R&D Systems, Minneapolis, MN]를 사용하여 수행한다. 모든 샘플을 3중으로 검정하여, 검정 종료시 미세역가 플레이트 판독기로 사이토카인의 양을 정량한다. 경기관지 생검 표본을 이미 기술된 바와 같이 처리하여 섬유모세포를 분리하고 [참조: Raghu et al . (1989) Am . Rev . Resp . Dis . 140:95-100], 콜라겐성 단백질 속으로의 ³H 프롤린 혼입을 사용하여 콜라겐 생성에 대해 분석한다. 각각의 환자를 검사 후 4시간 동안 임상 간호사에 의해 GCRC에서 발열, 숨참, 객혈 및 기흉을 포함하는, 비제한적인 기관지경 검사의 가능한 부작용에 대해 모니터한다. 병용 투약을 환자의 의무 기록에 기록할 것이다.

각각의 환자는 안정한 용량의 코르티코스테로이드 또는 면역억제제를 유지할 것이다. 연구적 치료는 환자를 연구중인 동안에는 허용되지 않는다. 전임상 래트 연구에서 비경구 IFN-γ는 간 마이크로솜(microsome) 시토크롬 P-450의 농도를 감소시킨다는 것이 밝혀졌다. 이는 상기 분해 경로를 사용하는 것으로 공지된 약물의 대사를 감소시킬 수 있다. 환자가 상기 경로에 의해 대사되는 것으로 공지된 임의의 약물을 투약중인 경우, 적당한 모니터 방법이 수행될 것이다.

IFN-γ는 12주 동안 1주일에 3회 소형 분무기를 통해 투여될 것이다. 각각의 용량을 투여하기 전, 투여하는 의사에 의해 검사가 수행될 것이다. 최대 호흡량 측정을 수행하여, 3회 측정 중 최고 수치를 치료전 수치로서 기록할 것이다. Aeroeclipse 또는 Aerotech II 분무기를 통상적인 방식으로 제조하여 500㎍의 약물을 분무기 안에 넣을 것이다. 치료제는 환자가 코마개를 하고 앉아 있고 정상적으로 호흡하는 동안 압축 공기를 통해(부착형 또는 휴대용) 투여될 것이다. 치료 종료시, 연구 의사는 환자를 다시 검사하고 1시간 동안 치료실에서 관찰한다. 약물 전달 1시간 후, 최대 호흡량 측정치를 얻어 기록한다. 1차 에어로졸 치료 후, 각각의 환자는 추가적인 폐 검사 및 최대 호흡량 측정을 받는 경우, 추가로 4시간 동안 치료실에 남아 있을 필요가 있다. 각각의 환자에게 IFN-γ를 투여하는 동안, 발열, 피로, GI 이상, 두통, 기침, 숨참, 천명(wheezing) 및 검사 이상을 포함하는, 비제한적인 부작용에 대해 모니터한다.

독성을 "일반적 독성 기준(Common Toxicity Criteria)"에 따라 등급을 결정한다. 이에 따라서, 용량을 변화시킨다. 1급 독성의 경우, 환자는 의사의 재량으 로 치료를 계속할 수 있다. 2급 독성의 경우 (경우에 따라 즉시 비정상적인 검사 변수가 반복되어 확인됨), 1급 독성 이하로 회복될 때까지 환자 용량을 유지시켜, 회복되면 환자의 치료를 재개할 수 있다. 2급 이상의 독성이 다시 나타나는 경우, 환자를 연구로부터 제외시킨다. 임의의 3급 또는 4급 독성의 경우, 환자를 연구로부터 제외시킨다. 비정상 검사 변수를 확인해야 한다.

실시예 3

임상 효능

만성 알레르기 병력이 있는 38세의 어떤 아이티(Haitian) 여성은 운동시 숨참 및 호흡곤란이 점차적으로 증가하는 병력을 1년 6개월 동안 나타내었다. 상기 환자의 PET는 저 확산능과 함께 현저하게 제한적인 패턴을 보여, 간질성 폐질환이 의심되었다. 상기 여성은 PET 결과를 보강하는 흉부 CT 스캔을 실시한 결과, 폐 기저부에서 현저하게 늑막하 섬유증 및 벌집 모양 변화를 보였다. 개흉 폐생검은 UIP/IPF와 일치하는 패턴을 보였다.

상기 환자는 에어로졸화된 IFN-γ를 시작하였다. 호흡곤란의 감소가 보고되었고, 일상생활로 복귀할 수 있었다. 3년 동안 임상적으로 안정하였다 (표 1 참조). 객관적인 소견은 표 2에 열거되어 있다. 최대 산소 소비량의 증가, 감소된 분당 환기량 및 산소 불포화도의 감소로 보여지는 바와 같이 운동 능력이 향상되었다. 호흡곤란 점수가 감소되었다 (UCSD SOBQ). 폐 기능 검사 결과는 에어로졸 치료 동안 계속 안정하게 유지되었다. 도 5에 제시된 침착 이미지는 폐 실질조직에 침착된 54㎍의 IFN-γ를 보여준다. 도 6에는 에어로졸 치료 전후 BAL을 통해 측정된 TGF-β 수준이 제시되어 있다. IFN-γ 에어로졸의 효과와 일관되게 TGF-β 활성이 유의적으로 감소하였다.

실시예 4

BAL 액을 사용하여 단백질 측정을 하고 바이러스 억제 검정을 사용한 IFN-γ 검정을 하여, 전달된 약물의 양을 측정한다. 농축된 BAL 액 및 24시간 세포 배양 상청액을 ELISA[판매원: R&D, Minneapolis]로 사이토카인 IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8 및 TNF-α에 대해 검정한다. 무세포 BAL 상청액을 사용하여 ELISA 및 루시퍼라제 리포터 검정으로 TGF-β 활성을 측정한다. 경기관지 생검(TBBX) 표본을 사용하여 반정량적 RT-PCR로 TGF-β 유전자 전사를 측정한다. 섬유모세포를 TBBX 표본으로부터 얻어, 콜라겐 I, III 및 피브로넥틴 RNA의 양을 RT-PCR로 측정한다. RNA(10㎍)를 TBBX 또는 TBBX의 세포 배양물로부터 얻어, 노던 블롯 분석을 수행한다. 하이드록시프롤린 단백질 함량을 BAL 액, BAL 상청액 및 TBBX 표본을 사용하여 분광광도법으로 측정한다. BAL 액 세포 수를 각각의 환자에 대해 치료전 및 치료후 샘플에서 계산한다. 각각의 환자로부터의 혈액 샘플을 채취하여 보관한다.

실시예 5

소형 분무기를 통해 투여되는 IFN-γ의 침착 연구에 참여하도록 각각의 환자에게 (개별적인 동의 하에) 부탁하였다. 본 침착 연구는 다음과 같이 에어로졸화된 IFN-γ를 연구하기 위하여 계획되었다. 약물을 99mTc로 표지하여 에어로졸 분무기를 통해 투여하였다. "감쇠(attenuation) 기술"을 사용하여, 폐의 다양한 영역으로 전달된 IFN-γ의 용량을 계산하였다. 500㎍의 IFN-γ의 초기 용량을 사용하였는데, 이 용량은 이전에 안전한 것으로 밝혀졌기 때문이다. 용량은 각 개개의 환자에서 침착 연구에 따라 조절된다. 추적 기관지경 검사를 치료 종료시 상기한 프로토콜을 사용하여 수행하였다. BAL을 폐 침착 이미지에 따라 수행하여, 가장 높은 약물 침착 영역을 가장 낮은 약물 전달 영역 및 에어로졸 IFN-γ전 샘플에 대해 분석하고 비교하였다. 이러한 방식으로, 폐의 각각의 영역에 대한 총 용량을 계산하고 측정할 수 있다. 임상 반응 및 BAL 데이터에 따라, 용량을 조절하여 최적 임상 및 침착 변수를 반영할 수 있다. 가능한 경우, 치료 전후 유사한 부분의 샘플을 추출하기를 시도할 것이다. 각각의 환자를 치료 후 1개월에 추적 평가하였다. 모든 방법, 실험 평가, 방사선학적 연구 및 폐 생리학 평가의 결과를 환자의 의무 기록에 기록한다. 모든 연구 평가는 NYU 메디컬 센터의 GCRC에서 수행한다. 시판되는 한가지 호흡 작동형(breath-actuated) 분무기인 AeroEclipse를 본 연구에서 사용하였으며, 이의 입자 생성은 분무기를 통한 환자 호흡에 의존적이다. 이는 흡기 동안에만 에어로졸을 생성한다.

IFN-γ를 시험관내 및 생체내 연구를 위하여 ^99m테크네튬 디에틸렌 트리아민펜타-아세트산(^{99 m}Tc-DTPA)을 사용하여 방사선표지하였다. AeroEclipse의 경우, 2개의 바이알 (250mg의 IFN-γ)을 사용하여 2mL의 최종 용적을 제조하였다. AeroEclipse를 Pari Master 공기 압축기[판매원: PARI Respiratory Equipment, Inc. Monterey, CA]를 사용하여 작동시켰다.

분무기를 임상 용도 방식으로 회로에 연결시켰다. 10단계 저유량 (1.0L/m) 케스케이드 임팩터(cascade impactor)[판매원: California measurements, Sierra Madre, CA]를 T 커넥터 (T 커넥터_{케스케이드})[판매원: Hudson Respiratory Care, Temecula, CA]를 사용하여 연결시켰다. 호기 동안에 입자가 케스케이드 임팩터에 들어가는 것을 방지하는 흡기 필터를 피스톤 펌프와 케스케이드 임팩터 사이에 위치시켰다. 제2 필터 (누출(leak) 필터)를 시스템 안에 위치시켜 흡기 필터 또는 임팩터 중 어느 쪽으로도 이동하지 않은 과량의 입자를 포획하였다. 환자 환기의 가능한 효과를 평가하기 위하여, 피스톤 펌프[판매원: Harvard Apparatus, Millis, MA]를 사용하여 환자의 호흡 노력을 시뮬레이션하였다.

흡입 전에 에어로졸을 2개의 조건 하에 벤치(bench)에서 연구하였다:

스탠딩 클라우드 ( Standing Cloud ): 케스케이드 임팩터는 피스톤 펌프에 의해 생성되는 임의의 환기 없이(펌프를 회로로부터 분리시킴) 1 Lpm으로 튜빙(tubing)으로부터 직접 입자의 샘플을 추출하였다. AeroEclipse로부터 입자를 생성시키기 위하여, 호흡 구동(actuation) 밸브를 샘플추출 동안에 손으로 눌렀다.

환기 동안: Harvard 펌프를 사용하여 환자의 호흡과 유사한 사인파 흐름(sinusoidal flow)을 시스템에서 생성시켰다. 750mL의 일회 호흡용적(tidal volume); 20/m의 호흡속도 및 0.5의 듀티 사이클을 사용하였다.

공기역학적 입자 분포 뿐만 아니라, 케스케이드 (T 커넥터_{케스케이드})로의 연결 튜빙에의 침착을 측정하였다. 에어로졸의 탄도 특성(ballistic property)을 T 커넥터_{케스케이드}에 대한 활성으로서 정량하여, 케스케이드 임팩터에 포획된 활성의 % (%케스케이드)로서 보고하였다. 이러한 침착은 폐 침착을 예측하는데 사용되었다.

크세논 이미지화 및 감쇠 연구: 모든 피험체에 대하여 IFN-γ 침착을 AeroEclipse 분무기를 사용하여 연구하였다. 크세논 이미지화 및 감쇠 연구(하기 참조)를 수행하였다.

폐 용적 및 윤곽 연구 ( ¹³³ 크세논 ( ¹³³ Xe ) 평형 스캔): 환자를 뒤에 위치한 감마 카메라 (Picker Dina 카메라; Northford, CT)의 앞에 앉혔다. ^99m테크네튬(^{99 m}Tc)에 대한 실내 배경 이미지를 촬영한 후, 카메라를 ¹³³Xe에 대해 설정하였다. 기능적 잔기량(FRC; Functional Residual Capacity)에서 평상 호흡하면서, 환자는 15초에 걸쳐 계수비(count rate)가 ±10%로 안정해질 때까지 5 내지 10mCi의 ¹³³Xe를 흡기하였다. 1.0분 감마 카메라 이미지(¹³³Xe 평형 이미지)를 얻어 분석을 위하여 컴퓨터 (Nuclear Mac v1.2/94; Scientific Imaging Inc. Littleton, CO)에 저장하였다. 이 이미지를 사용하여 폐의 외측 윤곽을 정하였다.

에어로졸 침착 연구: ¹³³Xe 이미지화 후, 카메라를 ^{99 m}Tc로 전환시켰다. 이어서, 환자는 방사선표지된 에어로졸화된 IFN-γ를 분무기로부터 흡기하였다. 각각의 장치의 경우 호기 필터가 존재하여 호기된 입자를 포획하였다. 분무기가 건조해질 때까지 작동시켰다. 최종 흡기 후, 환자는 물 한 컵을 마셔 구강인두부터 위장에 있는 물질을 세척하였다. 위장 활성을 측정하여 상기도 침착을 평가하였다.

폐 감쇠 연구 (관류 스캔): 폐 관류 스캐닝을 수행하여 폐의 감쇠 계수를 계산하였다. 침착 이미지화 직후, 5mCi의 ^{99 m}Tc-알부민 거대응집체를 말초 정맥을 통해 주사하였다. 모든 거대응집체는 심장의 우측을 지나 국부적 관류에 비례하여 폐에 분포된다고 가정하였다. 1분 이미지를 얻었다. 관류는 {측정된 활성} - {이전의(침착) 이미지에서 측정된 활성} 으로서 계산하였다. 폐 감쇠 계수는 카메라에 의해 측정된 활성의 양을 주사된 활성의 양으로 나누어 측정하였다. 폐 감쇠 계수 = 측정된 활성 / 주사된 활성.

위장 감쇠: 공지된 양의 ^{99 m}Tc가 가해진 빵을 환자에게 제공하고, 섭취 후 위장의 감마 카메라 사진을 촬영하였다. 위장 감쇠는 섭취된 활성을 감마 카메라에 의해 측정된 활성으로 나누어 계산하였다. 위장 감쇠 계수 = 측정된 활성 / 섭취된 활성.

침착의 정량: 컴퓨터를 사용하여, 관심대상의 영역을 저장된 평형 ¹³³Xe 평형 스캔 주변에 시각적으로 그려 폐 윤곽을 명확하게 하고 폐 용적을 포함시켰다. 이어서, 2차원 폐 영역의 내부 1/3의 윤곽을 나타내는 중심 폐 영역을 그렸다. 크세논 영역을 정한 후, 동일한 영역을 침착 이미지 상에 놓고 위장 활성을 확인하였다. 이어서, 위장의 윤곽을 나타내는 "위장 영역"을 시각적으로 그렸다. 위장 영역과 좌측 폐의 크세논 평형 영역 간에 중첩되는 영역이 있는 경우, 중첩되는 영역을 "폐 위의 위장(stomach on lung)" 또는 SOL이라고 정의하였다. 전체 폐 침착을 측정하기 위하여, 위장 및 "폐 위의 위장" 영역으로부터의 방사능은 배제시켰다.

폐 영역에서 활성을 정량하고 적당한 감쇠 보정을 가하여 감마 카메라를 사용하여 폐 침착을 측정하였다. 구강인두 침착은 침착 이미지 상의 총 활성으로부터 폐 활성을 빼서 측정하였다. 위장 감쇠에 대해 적당한 보정을 하였다.

고유한 중심부 대 주변부 비 ( sC /P): 고유한 중심부 대 주변부 폐 활성은 에어로졸 이미지를 크세논 평형 이미지로 나눈 것으로 정의하였다. 상기 비는 국부적 폐 용적에 대해 정규화된 침착된 에어로졸의 분포를 나타낸다.

에어로졸 침착에 대한 sC/P = (C/P 에어로졸 / C/P 크세논)

에어로졸이 완전하게 기체로서 작용하고 ¹³³Xe 분포를 따르는 경우, sC/P 비는 1.0일 것이다. 중심 기도에 우선적으로 침착되는 입자는 sC/P 비가 2.0 이상이 된다.

침착 연구의 결과: 침착 연구의 결과는 폐 전체에 걸쳐 에어로졸이 상당히 침착됨을 보여준다. 폐 용적에 대해 정규화한 경우, 상대적으로 보다 많은 입자가 주변부보다 중심 폐 영역에 존재한다 (sC/P 비 = 1.618). 최소한의 상기도 침착이 존재한다.

실시예 6

에어로졸 IFN -γ의 효과

역효과: 본 발명자들은 에어로졸화된 IFN-γ로 15명 (정상 지원자 및 폐 결핵이 있는 환자)을 치료하였다. 에어로졸 투여는 충분히 용인되었으며, 간헐적인 기침 또는 근육통을 호소하는 환자는 거의 없었다. 가장 긴 투여 기간은 3개월이었고 역효과의 증가는 없었다. 또한, 제이프(Jaffe)는 정상 피험체에게 투여된 에어로졸화된 IFN-γ는 전신적 부작용 없이 안전하다는 것과, 비경구적으로 투여된 rIFN-γ(이의 효과는 말초 혈엑에서만 볼 수 있다)와 반대로, 폐포 대식세포는 활성화시킬 수 있지만, PBMC는 활성화시킬 수 없다는 것을 밝혀내었다[참조: Jaffe et al ., (1991) J Clin Invest 88(1): 297-302].

침착 연구: 본 발명자들은 IFN-γ의 에어로졸 침착 특징을 연구하였다. 침착 이미지가 제시되어 있고, 이는 방사능(에어로졸)이 폐의 모든 정상적인 영역에 침착된다는 것을 보여준다. 질환 및 공동(cavitary) 영역은 제외된다. 관류 스캔은 공동 영역으로의 최소한의 관류를 또한 보여준다. 침착의 예비 측정은, 질량 균형 기술 및 크세논을 사용하여, 폐에 전달된 10 내지 20% 범위의 에어로졸 용량을 보여준다 (도면). 본 발명자들은 폐로 표적화된 약물 전달은 정상적인 폐 실질조직에서 약물이 침착되게 한다고 결론을 내렸다[참조: Condos et al ., (1998) Am J Respir Crit Care Med 157(3): A187].

기관지폐포 세척 소견: 이전에 본 발명자들은 IFN-γ로 치료한 중증 다중 약물 내성 결핵이 있는 환자의 그룹에서 임상적 개선을 증명하였다. 환자는 치료 전후에 방사선촬영상 관련된 영역의 BAL과 함께 기관지경 검사를 받았다. 24시간 세포 배양 상청액 및 BAL로부터의 액을 ELISA로 검정하여, 시간에 걸쳐 TNF-α의 수준 (평균 172 pg/ml에서 117 pg/ml로), IL1-β의 수준 (평균 25 pg/ml에서 8 pg/ml로)은 감소하고 IFN-γ의 수준 (평균 3.3 pg/ml에서 2.5 pg/ml로)은 뚜렷하게 변화하지 않은 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들은 IFN-γ 투여가 질환 부위에서 국부적으로 생산되는 TNF-α의 감소와 관련된다고 결론을 내렸다. 이는 진행된 MDR-TB에서 IFN-γ의 이로운 효과를 부분적으로 설명할 수 있다[참조: Condos et al ., (1998) Am J Respir Crit Care Med 157(3): A187].

실시예 7

특발성 폐 섬유증의 성공적인 치료

IPF가 있는 5명의 환자에 대한 에어로졸 IFN-γ의 연구에서, 본 발명자들은 치료가 충분히 용인된다는 것을 밝혀내었다. 역효과에는 피로, 기침 및 저급 발열이 포함되었다 (n = 1). 연구 기간 동안의 통상적인 실험적 평가에서 어떤 이상도 나타나지 않았다. 모든 환자는 숨참에 있어서 개인적인 개선이 보고되었다. 3개월의 치료 종료시까지, 연구에 포함된 환자는 총 폐용량이 통계적으로 유의하게 증가하였다. 도 7은 치료받은 5명의 환자 중 3명에서 치료 후 증가된 % 총 폐용량 예측치를 증명한다. 또한 5명의 연구 환자 중 2명에서 강제 폐활량이 200cc 이상 (각각 200 및 500cc) 향상되었다. 도 8은 치료받은 5명의 환자 중 3명에서 치료 후 증가된 % 강제 폐활량 예측치를 증명한다. 이러한 생리학적 변화는 상기 환자의 기관지폐포 세척(BAL) 액 (폐의 내층으로부터 세척된 액)으로부터 회수된 활성화된 TGF-β의 수준의 감소를 동반하였다. 도 9는 치료받은 5명의 환자에서 총 단백질 중 TGF-β의 감소된 비율을 증명한다. TGF-β는 폐에서 섬유증의 주요 매개인자 중의 하나이다. 이의 활성화는 콜라겐 생성을 유도한다. 이의 수준의 감소는 폐에서 콜라겐 침착의 감소 및 섬유증 감소를 유도할 것이다. 또한, 본 발명자들은 에어로졸 치료 전후 환자의 BAL 액 중의 인터페론-γ의 수준을 측정하여 약물의 에어로졸 투여와 관련된 증가를 밝혀내었다. 도 10은 인터페론-γ를 사용한 에어로졸 치료 전후에 결핵 환자 및 특발성 폐 섬유증이 있는 환자의 폐에서 측정된 인터페론-γ의 양을 증명한다.

이전에 수행된 피하 연구와 대조적으로, 본 발명자들은 rIFN-γ의 에어로졸 전달로 폐 기능이 생리학적으로 향상된다는 것을 보일 수 있었다. 이러한 향상은, 인터뮨(Intermune) 피하 시험에서 환자가 받은 1년 치료와 비교하여 3개월의 치료 기간에 걸쳐 발생하였다. 이러한 생리학적 향상은 폐에서 IFN-γ의 수준의 증가와 관련되었고, 이는 에어로졸 치료 후 환자의 폐로부터 회수된 활성화된 TGF-β의 수준의 감소를 유도하였다. 이러한 데이터는 약리학적 유효량의 인터페론-γ를 폐로 전달하는 능력을 증명한다. 검출가능한 폐 수준의 인터페론-γ는 피하 투여 후 측정되지 않았다[참조: Jaffe et al ., J Clin Invest . 88, 297-302 (1991)]. 폐 용량을 추가로 정하기 위한 노력에서, 5명의 환자 중 2명에서 침착 연구를 수행하였다. 이러한 연구에서 폐 주변부로의 대략 40 mcg의 rIFN-γ의 침착을 확인하였다. rIFN-γ의 폐 용량 또는 폐 수준의 어떠한 측정치도 피하 rIFN-γ 시험에서 측정되거나 보고되지 않았다.

실시예 8

사이토카인 유전자 조절

본 연구에서는 전사 인자의 양, 인산화 및 DNA 결합 활성을 연구하여, 에어로졸 IFN-γ 치료가 세포 시그날 전달 경로에 작용하여 잠재성 STAT-1을 활성화시키고 IRF-1의 새로운 합성을 유도한다는 가설을 검사한다. 본 발명자들은 IFN-γ를 사용한 치료 전후 폐 TB가 있는 환자의 폐의 무관한 영역 및 관련된 영역으로부터 채취한 BAL 세포에서 이러한 실험을 수행하였다[참조: Condos et al ., (1999) Am J Respir Crit Care Med (출판중)]. IRF-1의 정제 및 클로닝은, 다넬 제임스 이 쥬니어(James E. Darnell, Jr.)와 함께 록펠러(Rockefeller) 대학교의 분자 세포 생물학 실험실의 파인 리차드(Richard Pine) 박사가 수행한 초기 연구의 주요 부분이었다[참조: Pine et al ., (1990) Mol Cell Biol 10(6): 2448-57]. 본 연구의 3번 목적에 대해 제안된 것과 동일하거나 유사한 면역블롯 및 전기영동 이동성 변화 검정(EMSA; Electrophoretic Mobility Shift Assay)을 본 실시예에서 언급된 연구에서 사용하였다.

결핵 환자의 무관한 폐에서의 사이토카인 유전자 조작의 결과가 가장 관련이 있다. 결과는 BAL 세포의 부착성 (주로 폐포 대식세포) 및 비-부착성 (림프구 및 다형핵 세포) 부분에서, 에어로졸 IFN-γ 치료 후 특정 IRF-DNA 및 STAT-1-DNA 복합체의 양이 증가한다는 것을 보여준다.

실시예 10

천식 치료에서의 효능

본 발명자들은 경증 내지 중등증 천식이 있는 30명의 환자를 동원하여 IFN-γ 에어로졸 대 표준 치료를 받게 할 것이다. 본 연구는, 증상 조절을 위하여 적정량의 코르티코스테로이드 흡입을 필요로 하는 경증 내지 중등증 지속성 천식이 있는 피험체에서 무작위화된, 위약 대조된, 교차, 이중 맹검 rIFN-γ 에어로졸 전달 연구로서 수행될 것이다.

환자들은 임의의 인종 또는 성별의 18세 내지 65세이어야 한다. 이들은 현재 비흡연자이어야 하고 흡연력이 10 갑년(pack year) 미만이어야 한다. 천식 진단에 대한 NAEPP 지침을 충족하는 환자를 등록시킬 것이다. 본 발명자들은, 1초 동안의 강제 호기량 (FEV1) 기저치가 예측치의 70% 이상이고 가역성의 증거 (기관지확장 치료후 FEV1이 15% 이상의 향상됨)가 있는 경증 내지 중등증 지속성 천식이 있는 환자를 동원할 것이다. 이러한 환자는 흡입형 b2-효능제 및 저용량의 흡입형 코르티코스테로이드를 간헐적으로 사용하는 것이 필요할 것이다. 저용량의 흡입형 코르티코스테로이드 사용에는 168 내지 500 mcg/일의 베클로메타손 디프로피오네이트, 200 내지 400 mcg/일의 부데소나이드 DPI, 500 내지 1000 mcg의 플루니솔라이드 또는 400 내지 1000 mcg/일의 트리암씨놀론 아세토나이드가 포함된다.

임신중이거나, 광섬유 기관지경 검사가 금기되거나, 현재 흡연자이거나, 흡연력이 10 갑년을 초과하는 환자는 제외될 것이다. 잘 관리가 안된 천식 또는 중증 천식 병력이 있거나, 최근 전신적 코르티코스테로이드 사용력이 있거나, 최근 악화 또는 감염 병력이 있는 모든 환자도 제외될 것이다.

본 발명자들은 1개월의 "워시-인(wash-in)" 기간을 두어, 모든 동원된 환자가 흡입형 코르티코스테로이드의 동일한 기저선 용량 (베클로메타손 디프로피오네이트 4 내지 12 puff/일)에서 시작하게 할 것이다. 각각의 환자는 기저선에서,

1) 완전한 병력 및 신체 검사 및 통상적인 실험적 검사,

2) 폐 기능 측정 (FEV1, FVC 및 PEFR),

3) 정맥 주사에 의한 헤파린 처리된 50ml 채혈,

4) 총 IgE, 특정 알레르겐에 대한 특정 IgE 및 호산구 수 계산을 위한 혈액 샘플 채취,

5) BAL과 함께 광섬유 기관지경 검사, 및 24시간 배양 상청액 중의 세포 수/감별 및 ELISA에 의한 IFN-γ, IL-4, IL-5, GM-CSF, IL-10, IL-12 및 IL-13 수준의 분석을 받을 것이다.

이어서, 본 발명자들은 에어로졸 rIFN-γ(500 mcg)를 15명의 환자에게 8주 동안 1주일에 3회 투여할 것이다. 등량의 에어로졸화된 식염수를 무작위 방식으로 15명의 환자에게 투여할 것이다. 8주에 본 발명자들은 1개월의 워시-아웃(wash out) 기간을 두어 피험자가 본 시험의 제2 부문으로 넘어가게 할 것이다. 환자는 각각의 외래 방문시에,

1) 징후 및 증상에 관한 간단한 질문지,

2) 일지 카드의 검토 및 b-효능제 사용의 모니터,

3) 에어로졸 치료 전후 최대 호흡량 모니터,

4) 매주 수행되는 간략한 병력 및 신체 검사를 받고,

5) 피험자는 에어로졸화된 IFN-γ 치료 전, 치료 동안 및 치료 후 매일 일지에 증상을 특징지을 것이다. 이들은 기침, 천명 및 숨참의 증상을 등급으로 평가할 것이다. 이들은 또한 매일 최대 호흡량 측정치를 기록할 것이다.

본 시험의 각각의 부문의 완료시 (에어로졸화된 IFN-γ 치료 또는 대조군 식염수 투여 8주차에), 피험자는,

1) 완전한 병력 및 신체 검사 및 통상적인 실험적 검사,

2) 폐 기능 측정 (FEV1, FVC 및 PEFR)

3) 정맥 주사에 의한 헤파린 처리된 50ml 채혈,

4) 총 IgE, 특정 알레르겐에 대한 특정 IgE (RAST) 및 호산구 수 계산을 위한 혈액 샘플 추출을 하고,

5) 마지막 IFN-γ 치료 또는 무치료 다음날 BAL과 함께 광섬유 기관지경 검사를 수행할 것이다. 본 발명자들은 24시간 배양 상청액 중의 BAL 세포 수/감별 및 ELISA에 의한 IFN-γ, IL-4, IL-5, GM-CSF, IL-10, IL-12 및 IL-13의 수준을 분석할 것이다.

6) 모든 환자는 천식 클리닉에서 1개월마다,

a) 완전한 병력 및 신체 검사

b) 통상적인 실험적 검사

c) 폐활량측정 및 최대 호흡량 측정

을 계속 받을 것이다.

다양한 이유로 본 발명자들은 경증 내지 중등증 지속성 천식이 있는 환자를 저용량 흡입형 스테로이드에 대해 연구하기로 선택하였다. 첫번째로, 경증 간헐적 증상이 있는 환자만을 포함시키면 본 발명자들이 이러한 집단에서 생리학적, 증상적 또는 면역학적 변화를 민감하게 발견하지 못할 수 있다. 두번째로, 본 발명자들은 흡입형 스테로이드를 필요로 하는 임의의 환자를 본 시험을 위하여 치료를 중단하게 할 수 없다. 또한, 본 시험의 목적은 에어로졸화된 IFN-γ가 이미 구체화된 치료 방법에 대한 보조제로서 역할을 할 수 있는지 결정하는 것이다. 본 발명자들은 코르티코스테로이드가 사이토카인 수준에 영향을 줄 수 있으므로, 흡입형 스테로이드가 본 발명자들의 연구를 혼란시킬 수 있다는 것을 이해한다. 본 발명자들은 "워시 인" 기간을 포함시켜 모든 피험자가 동일한 기저선에서 시작하게 할 것이다.

실시예 11

천식환자의 폐 기능에 미치는 영향

에어로졸 rIFN-γ가 폐 기능 측정치에 미치는 영향을 측정하기 위하여, 본 발명자들은 에어로졸화된 치료 전에 각각의 피험자에 대하여 1초 동안의 강제 호기량 (FEV1), 강제 폐활량(FVC), 최대 호기 유속(PEFR), 총 폐용량(TLC)을 포함하는 폐 용적, 및 기능적 잔기량(FRC)의 폐활량측정치를 얻을 것이다. 이는 벨뷰(Bellevue) 병원 폐 기능 검사실에서 수행될 것이다.

본 발명자들은 천식이 없는 결핵 환자의 치료에서 기록된 바와 같이, 에어로졸화된 rIFN-γ의 투여 직후 최대 호흡량 측정치가 다소 향상될 것이라고 예상한다. 현재는, IFN-γ가 기관지확장제 효과를 갖는 이유가 불명확하다. 본 발명자들은 또한 감소된 기도 염증을 반영하여, 에어로졸 IFN-γ 치료 8주 후 FEV1 및 FVC가 향상될 것이라고 예상한다.

본 발명자들은 특히 FEV1이 개개의 환자의 경우 재현가능하므로 FEV1을 추적하기로 선택한다. 이 수치는 대기도 폐쇄에 대해 특정적이다. 본 발명자들은 본 연구의 초기 부분 동안 소기도 질환의 다른 변수가 영향을 받는다는 것을 발견하게 되면, 특정한 기도 전도도, 기도 저항 또는 강제 호기치를 25 내지 50%에서 종점으로 사용할 것이다. 보다 민감한 기도 저항 검사가 필요하게 되면, 본 발명자들은 순응도(compliance)의 빈도 의존성 연구를 수행할 수 있다. 본 발명자들은 또한 메타콜린으로 기관지 유발 연구를 수행하여 기도 과민반응을 연구할 수 있다. 이러한 추가적인 연구는 개체의 변이성 뿐만 아니라 개체간 변이성으로 인하여 신뢰성이 높지 않다. 교차 시험으로서의 연구 설계는 개체간 변이성을 없애야 한다.

실시예 12

BAL 표본에 미치는 영향

BAL 표본을 30명의 천식 환자로부터 채취할 것이다. 본 발명자들은 에어로졸 IFN-γ를 15명의 상기 환자에게 8주 동안 투여하여 IFN-γ가 사이토카인 생산을 조절하는지 평가할 것이다. 상기 환자는 치료 전후 BAL 및 혈액 채취를 받을 것이다.

방법 광섬유 기관지경 검사: 피험체를 병력 및 신체 검사, 폐활량측정, 산소측정, 기관지 과민반응성의 평가, 응고 검사 (PT, PTT, 혈소판) 및 CBC 및 스크리닝 화학으로 예비 스크리닝할 것이다. 진행되는 동안, 환자는 계속적인 심장 박동 및 O2 포화도 모니터, 피험체 증상 및 약물 용량의 기록, 제자리 정맥내 카테터, 흡입형 b-효능제 예비투약, 피하 아트로핀 (0.4mg), 진정 (미다졸람, iv) 및 보충 산소를 받을 것이다. 광섬유 기관지경을 가벼운 예비투약 및 코와 상기도의 국소 마취 후 삽입한다. 기관지경의 끝을 우폐 중엽(right middle lobe)의 구역(segmental) 또는 아구역(subsegmental) 기관지 또는 혀돌기(lingula) 속으로 고정시킨다. 100ml의 37℃ 생리 식염수를 20ml씩 분취액으로 기관지 속으로 점적주입한다. 가온된 식염수는 천식 피험체에서 열에 의해 유도되는 기관지 경련이 일어나는 것을 예방할 것이다. 서서히 간헐적 흡인을 사용하여 유출액을 회수한다. 60 내지 80%의 유체 회수율이 경증 천식환자에서 예상된다. 회수율은 중등증 내지 중증 질환이 있는 피험체에서 50%로 감소된다 [Jarjour, 1998 #62]. 맥박 산소측정 및 환자 상태의 임상적 평가가 검사 진행 후 계속될 것이다. 퇴원 설명문에는 1주 이내의 추적조사 예약 및 연락 전화번호가 포함될 것이다.

폐포 대식세포( AM ) 및 BAL 세포: 세포를 표준 기술로 수행되는 기관지폐포 세척(BAL)으로 채취하여, 배양을 위하여 다음과 같이 제조할 것이다: 유체를 멸균 거즈 한 층을 통해 여과시켜 점액 덩어리를 제거한다. 총 세포 수 계산을 혈구계에서 수행하고, 세포 감별을 변형된 라이트-김사(Wright-Giemsa) 염색으로 염색된 세포원심분리 슬라이드에서 수행하여 총 500개의 세포를 센다. 세포 생존성을 트리판 블루 배제(Trypan Blue exclusion)로 측정하고, 모든 경우에, 실험에 사용될 회수된 세포는 90% 이상 생존가능일 것이다. 20개의 세포원심분리 슬라이드를 BAL의 각각의 로브(lobe)로부터 제조하여 일단 10% 포르말린 중에 1회 고정시켜 -70℃에서 냉동시킬 것이다. BAL 세포를 세척하여, 10% 열-불활성화된 소 태아 혈청(FCS) 및 100u/mL 페니실린 및 100 mcg/ml 스트렙토마이신이 보충된 RPMI[판매원: GIBCO] 중에서 10⁶ 세포/ml의 농도로 24시간 동안 배양(37℃)할 것이다.

말초 혈액: IFN-γ 치료 완료 전후 하루 중 일정한 시간에 혈액을 정맥 주사로 채취할 것이다. 헤파린 처리된 정맥혈로부터 피콜 하이팩(Ficoll-Hypaque) 밀도 구배 원심분리로 PBMC를 분리할 것이다. 헤파린 처리된 정맥혈을 피콜 하이팩(Ficoll-Hypaque)에 적층하여 2500rpm으로 20분 동안 원심분리한다. 저밀도층의 PBMC를 흡인하여, 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하고, 10%의 열-불활성화된 FCS, 100 U/ml 페니실린 및 100 mcg/ml 스트렙토마이신이 있는 PRMI-1640[판매원: GIBCO] 중에 10⁶ 세포/ml의 농도로 재현탁시킬 것이다. 이어서, 세포 배양물을 37℃ 및 5% CO₂에서 24시간 동안 배양할 것이다. 이어서, 세포 상청액을 수거하여 사이토카인에 대해 ELISA로 검정할 것이다.

혈청 샘플을 또한 채취하여, 도시 천식(urban asthma)와 관련된 알레르겐 (디.프테로니시누스(D. pteronyssinus), 디.파리네아(D. farinea), 비.게르마니카(B. germanica) -독일 바퀴벌레 및 피.아메리카나(P. americana) -미국 바퀴벌레)에 대한 특정 IgE (RAST)를 측정할 것이다.

추가적인 연구를 아토피성 천식환자 및 정상 대조군으로부터 채취한 PBMC에 대해 수행할 것이다. 이는 분리 후 상기한 바와 같이 동일하게 보충된 RPMI 배양 배지 중에서의 PBM 세포 배양을 포함할 것이다. 이어서, 이러한 배양된 세포를 비특이적 자극 (LPS) 또는 공지된 알레르겐으로 자극시킬 것이다. 이어서, 배양 상청액을 사이토카인에 대해 ELISA로 검정할 것이다. 이 수준을 휴지 세포 사이토카인 수준과 비교할 것이다. 이러한 평가를 수행하여, 천식 피험체의 대규모 도시 집단을 스크리닝해서, 기저선의 불충분한 IFN-γ 반응을 보이는 환자를 에어로졸화된 IFN-γ 치료 시험에 동원할 수 있다.

사이토카인의 평가: 본 발명자들은 24시간에 걸쳐 10⁶ 세포/ml의 농도로 수거된 BAL 세포 상청액을 IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IL-13 및 GM-CSF에 대하여 ELISA[판매원: Endogen]로 평가할 것이다. 본 발명자들은 10⁶ 세포/ml의 5개의 관을 수거하여, 각각의 사이토카인에 대해 샘플을 3중으로 실험할 수 있게 한다. 폐 구역 당 BAL 세포 수가 평균 30 내지 40 x 10⁶ 이므로, 본 발명자들은 각각의 환자에 대해 BAL 세포 상청액을 평가할 수 있을 것으로 예상할 수 있다. BAL후 표본 중에서 IFN-γ가 회수될 수 있고 본 발명자들의 관심대상은 BAL 세포로부터의 자발적인 사이토카인의 방출이므로, 본 발명자들은 BAL 액 중의 사이토카인을 측정하지 않을 것이다.

실시예 13

IFN -γ 치료에 의해 영향을 받는 유전자 조절의 기전

상기 임상 치료 프로토콜은 IFN-γ에 반응하여 유전자 발현을 조절하는 전사 인자의 양 및 활성에 대하여 뚜렷한 효과를 미칠 것이고, 이러한 데이터와 사이토카인 프로파일과의 상관관계는 천식에서 면역 반응을 평가할 수 있는 기준을 확장시킬 것이다. 또한, 얻어진 상기 데이터는 사이토카인 생산 및 사이토카인의 발현 및 다른 유전자의 분석으로부터의 결과의 기전적 해석을 가능하게 할 것이다.

본 연구의 설계에는 다수의 대조군이 포함되어, 다른 어떤 변수와도 상이한 에어로졸 IFN-γ 치료의 효과를 증명하는 것을 돕는다. 여기에는 치료 과정 전후 BAL 및 혈액 샘플을 채취하는 것과, 무관한 로브(lobe) 및 관련된 로브로부터 BAL 샘플을 수거하는 것이 포함된다. 이러한 목적을 위한 모든 실험은 BAL 또는 PBM 세포로부터 제조된 단백질 추출물을 사용하여 수행될 것이다. 세포질 및 핵 단백질을 수득하여 개별적으로 분석할 것이다. 보다 명확한 결과를 얻기 위하여, BAL 세포를 부착성 및 비-부착성 집단으로 분리할 것이다. 전자에는 주로 폐포 대식세포가 포함될 것이다. 후자에는 주로 림프구 및 과립구가 포함될 것이다. PBMC는 추가적인 분리 없이 추출될 것이다.

본 연구를 위한 전사 인자 양 및 DNA-결합 활성의 조사는, 에어로졸 IFN-γ 치료의 임상 프로토콜이 세포 시그날 전달 경로에 작용하여 잠재성 STAT-1을 활성화시키고 IRF-1 및 CIITA의 새로운 합성을 유도할 것이라는 가설을 검사할 것이다. 얻어지는 데이터는 유전자 발현을 조절하는 분자적 기전과 초기 임상 관찰을 관련시킬 것이다. 에어로졸 IFN-γ를 사용한 치료학적 생체내 치료의 제한된 과정으로부터의 결과는, 치료에 대한 분자적 반응을 증명하는 데이터와 함께 해석되는 경우, 앞으로의 시험 설계를 예측하는 능력이 훨씬 높을 것이다.

전사 인자 STAT -1, IRF -1 및 CIITA 의 양의 측정: 치료 프로토콜 전후 상기 전사 인자들의 총량을 정량하는 것이 유용한 두가지 주요 이유가 있다. 이러한 데이터는 IFN-γ 치료에 대해 조절되는 반응의 종합적인 해석에 결정적일 것이다. 이는 이용가능한 단백질이 인산화되는 정도 및 DNA-결합 활성을 갖는 총 단백질의 비율에 관한 결론을 유도할 것이다. 또한, 단백질의 양은 인자를 암호화하는 유전자의 조절된 발현의 최종적인 측정이고, 따라서 유발된 면역 반응의 기능성 및 조절성 양상을 추가로 통합하기 위한 앞으로의 연구에 대한 기반을 제공한다.

면역블롯 검출은 사용되는 주요 기술일 것이다. 최대 5 x 10⁶ 세포로부터의 세포질 또는 핵 추출물이 각각의 분석에 사용될 것이다. 상기한 바와 같이 세포를 채취하면 각각의 환자에 대해 10개의 샘플이 수득될 것이다. 1명의 환자로부터의 모든 PBMC 및 BAL 세포 추출물은 하나의 실험에 포함될 것이고, 이는 샘플 세트 내에서의 상대적인 정량화를 용이하게 할 것이다. 배양된 세포주로부터 제조된 대조군 세포질 및 핵 추출물도 각각의 실험에 포함될 것이다. 이전의 연구를 토대로, 이러한 샘플은 표적 단백질을 함유하는 것으로 공지될 것이고, 따라서 면역블롯 검출을 위한 양성 대조군을 제공할 수 있다. 또한, 이들을 사용하여, 얻어진 데이터가 정량적이라는 것을 입증하거나 정량적 검출의 한계를 밝힐 수 있다.

단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 나서, 막으로 이동시킬 것이다. 막을 시약으로 현상하여 STAT-1, IRF-1 및 CIITA을 차례대로 검출할 것이다. 막에 최종적으로 프로브를 결합시켜 b-튜불린을 검출할 것이고, 이는 세포질 및 핵 단백질 추출물 중에 모두 존재할 것이므로, 시험내 및 시험간 세포질 또는 핵 추출물의 정량적 비교를 위한 내부 표준으로서 역할을 할 수 있다. 필요한 모든 항체는 실험실에서 입수가능하거나 구입할 수 있으며, 면역블롯 프로토콜에 대해 작용을 하는 것으로 공지되어 있다. 상이한 단백질을 순차적으로 검출하기 위하여, 막을 처리하여 표적 단백질을 방출시키지 않으면서 항체 결합을 파괴시킬 것이다. 이러한 접근법은, 각각의 표적 단백질의 검출을 순차적으로 반복하고 1회 및 2회에 얻어진 시그날을 비교하여, 작용하는 것으로 입증될 수 있다. 각각의 단백질에 대한 검출의 특이성을 위한 음성 대조군은 나머지 2개에 대한 항체에 의해 제공된다. 또한, 막을 최종 시점에는 1차 항체를 포함시키지 않고 현상할 것이다.

사용가능한 세포의 수가 불충분하거나, 특정 전사인자의 양이 매우 적은 경우, 시그날이 검출되지 않을 수 있다. 상기 단백질에 대한 ELISA 검정을 사용하여 높은 민감성을 얻는 것이 가능할 수 있지만, 면역블롯 방법의 높은 신뢰성 및 특이성은 잃게 될 것이다. 하지만, 이러한 가능한 문제 중 어떤 것도 중요한 것 같지는 않다. 바람직한 세포의 수는 통상적으로 각각의 BAL 샘플의 단지 일부분만을 구성할 것이다. 적은 양의 임의의 표적 단백질은, 의미있는 결론을 유도하는 생리학적으로 적절한 결과일 것이다. 하지만, 세포 당 100 내지 1000 카피의 표적 단백질 (분석된 분취액 중의 8 펨토몰 이하 (0.5 내지 1.5ng)에 상응할 것이다)이 존재하는 경우, 사용가능한 시약 및 검출 시스템이 시그날을 제공할 것이라는 것을 주의하여야 한다.

STAT -1, IRF -1 및 CIITA 의 티로신 및 세린 인산화의 특성규명: 전사 인자 인산화의 변화는 종종 인자의 존재를 이의 기능으로 연결시킨다. 이는 DNA-결합 활성이 인산화의 변화에 의해 직접적으로 변화되지 않는 경우에도 사실이다[참조: David et al ., (1995) Science 269(5231):1721-3; Wen, Z. et al ., (1995) Cell 82(2): 241-50; Pine et al ., (1994) Embo J 13(1): 158-67; Cho et al ., (1996) J Immunol 157(11): 4781-9; David et al ., (1996) J Biol Chem 271(27):15862-5; Gupta et al ., (1995) Science 267(5196):389-93; Hibi et al ., (1993) Genes Dev 7(11): 2135-48; Parker et al ., (1996) Mol Cell Biol 16(2): 694-703; Schindler et al ., (1992) Science 257(5071): 809-13; Shuai et al ., (1992) Science 258(5089): 1808-12]. 상기한 바와 같이, STAT-1의 티로신 및 세린 인산화는 조절되고, 이는 이의 활성을 조절한다. IRF-1은 인단백질이지만, 자연적으로 일어나는 인산화의 변화는 보고되지 않았고, CIITA의 인산화는 거의 연구되어있지 않다. 본원에서 기술되는 실험은, PBMC 및 BAL 세포로부터의 추출물을 이전에 주로 세포 배양 시스템에서 보고된 인산화 발생에 대해 검사하여 STAT-1의 생체내 조절에 관한 데이터를 제공할 것이다. IRF-1 및 CIITA에 관해 얻어진 데이터는 이전에 보고된 것을 능가할 것이다.

상기 실험을 위한 가장 직접적인 설계는, 면역 침전으로 세포 추출물로부터 표적 단백질을 정량적으로 회수하여, 회수된 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 나서, 분리된 단백질의 면역블롯 분석으로 인산화를 검출하는 것이다. 특정 표적 단백질에 거의 또는 전혀 의존하지 않고, 시판되는 항-포스포티로신 항체를 사용하여 면역블롯을 실시해서 티로신 인산화의 존재 및 정도를 측정할 수 있다는 것은 익히 확인되어 있다. 포스포세린에 대한 항체도 시판되고 있지만, 이 항체가 의도된 표적 단백질에서 이러한 잔기를 검출할 것이라는 것은 확실하지 않다. 따라서, 이러한 접근법의 성공적인 적용에 관하여 다소 불확실성이 있다. 상기한 양성 및 음성 대조군의 종류 외에도, 포스포티로신 또는 포스포세린의 특이적인 검출은, 용액 중에 포스포아미노산을 포함시키고 시그날이 얻어지지 않는다는 것을 관찰하는 방법으로 밝혀낼 수 있다.

SDS-PAGE에 의해 변성된 단백질이 항-포스포세린 항체와 가장 잘 반응하는 것 같지만, 세린 인산화의 면역블롯 검출이 작용하지 않는 경우, ELISA가 성공적인 대안이 될 가능성이 남아있다. 이러한 경우에는, 웰을 표적 단백질에 대한 항체로 코팅하여, 단백질이 결합되게 하고, 검출 단계에서는 표적 단백질에 대한 항체의 공급원과 상이한 종으로부터 얻어진 항-포스포세린 1차 항체를 사용할 것이다. 면역블롯에 사용되는 대조군도 본질적으로 ELISA 시스템에 적용될 것이다.

다른 대안이 STAT-1 세린 인산화의 분석에 사용가능하다. 특이적인 항-포스포STAT-1 (P-Ser) 항체를, 인산화 조절이 일어나는 공지된 세린 위치 (Ser 727번)를 토대로 하여 제조할 수 있다(방법 참조) [참조: Wen, Z. et al ., (1995) Cell 82(2): 241-50]. 이는 매우 성공적일 것 같은데, 그 이유는 인산화된 형태의 다수의 단백질에 대해 특이적인 시판되는 항체[판매원: New England BioLabs]가, 적당한 포스포펩티드로 면역화시키고 나서 단백질-a, 펩티드 및 포스포펩티드 친화도 매트릭스를 사용하여 특이적인 항체를 정제하는 방법으로 수득되었기 때문이다. 유사한 접근법이 본 연구에 사용될 것이다. ³²P-오르토포스페이트로 세포를 대사적으로 표지하고 나서 표적 단백질을 특이적으로 면역침전시키고 포스포아미노산을 분석하는 것은 본 연구에 적당하지 않은데, 그 이유는 표적 단백질이 대사적으로 표지하는데 필요한 배양 기간 동안 변형될 수 있고, 사용가능한 물질의 양이 이러한 접근법에 충분하지 않을 것 같기 때문이다. 세린 인산화의 변화를 측정하는 것은 임의의 표적 단백질의 경우 쉽게 달성되지 않을 수 있지만, 상기 조절된 해독후 변형의 가능성 있는 의미는 시도하는 것을 강력하게 뒷받침한다.

이러한 데이터를 사용하여 상기 시스템에서 상기 인자의 양과 이들의 기능 간의 관계를 확인할 것이다. STAT-1 티로신 인산화의 정도는 활성화의 수준을 결정할 것이고, 따라서 DNA-결합 활성의 최소 및 최대 수준을 결정할 것이다. 세린 인산화의 변화는 DNA-결합 활성을 조절할 수 있고, 상기한 바와 같이 STAT-1 기능에 대해 추가적인 효과가 있을 수 있다. 증가된 양의 STAT-1 및 기저 수준의 인산화가 검출되는 것이 가능하다. 이러한 결과는, 생체내 반응이 전체적으로 장기간 동안 IFN-γ에 노출된 배양된 세포의 반응과 유사하고 IFN-γ에 대한 분자 반응으로서 STAT-1의 새로운 합성과 함께 해독후 변형 (인산화 및 탈인산화)의 시간 경과를 반영한다는 것을 의미할 것이다. IRF-1 또는 CIITA 인산화의 변화에 관한 데이터는 IFN-γ에 대한 생체내 분자 반응의 추가적인 마커로서 역할을 할 것이고, 이러한 변화의 기능적 중요성을 확인하는 앞으로의 기초 연구에 대한 강력한 근거를 제공할 것이다. 양은 변화하고 인산화는 변화하지 않으면, 상기 인자들의 인산화가 상기 시스템에서 조절되지 않는 것이거나, 또는 STAT-1의 경우 가능한 바와 같이, 샘플을 채취한 시점에 지속된 순 변화(net change)가 없었던 것일 수 있다. 다른 시스템에서의 앞으로의 연구는 이러한 가능성을 구별하기 위하여 필요할 것이다.

STAT -1, STAT -4, STAT -5, STAT -6 및 IRF -1의 DNA -결합 활성의 측정: DNA-결합 활성의 측정은 치료 프로토콜에 대한 분자 반응의 조절을 평가하는데 필요한 최종 데이터를 제공할 것이다. 전기영동 이동성 변화 검정에 의한 실험 샘플 중의 STAT 계열 및 IRF-1 전사 인자의 검출 및 정량은 확립된 방법에 의해 달성될 것이다. 배양된 세포로부터 제조된 추출물은 양성 대조군으로서 본 검정에 포함될 것이다. 상기 인자의 특이성 및 확인을 위한 대조군은 경쟁인자 올리고뉴클레오티드 또는 항혈청을 포함하는 반응을 수행하여 제공될 것이다. 비-특이적 및 특이적 올리고뉴클레오티드 또는 항혈청이 사용될 것이다.

전체 집단이 동일한 시점부터 첨가된 사이토카인에 노출되고 동일한 시간 동안 지속되는 세포 배양 시스템의 동시성(synchrony)과 대조적으로, BAL에 의해 채취되거나 혈액 샘플 중에 있는 세포는, 노출된 부위 안팎으로의 이동에 의해 발생하는 각 세포의 노출의 비-동시적 시작 및 지속에 부가되어 반복된 에어로졸 IFN-γ 치료의 총 효과를 보여줄 것이다. 세포 배양 모델에서, STAT-1 DNA-결합 활성의 IFN-γ 활성화는 수 분 이내에 일어난다. 일부 세포주에서는, 활성이 매우 빠르게 감소된다. 단핵 세포주 NB4, U937 및 THP-1을 포함하는 다른 세포주에서는, 활성이 수 시간 동안 지속된다[참조: R. Pine and E. Jackson, 미발표됨]. STAT-1은 IRF-1 유전자를 조절하므로, IFN-γ에 의한 IRF-1 DNA 결합 활성의 유도는 통상적으로 1 내지 2시간 후에만 검출되지만, 그 후 16시간 이상 지속된다. 따라서, STAT-1 및 IRF-1 DNA-결합 활성이 동시에 존재할 수 있지만, 하나 또는 다른 하나의 활성만 검출되는 것도 가능하다.

실험 샘플로부터 얻어진 결과는 STAT-1 및 IRF-1 DNA 결합 활성이 둘다 존재한다는 것을 밝혀낼 수 있고, 따라서 셍체내에서 수일에 걸친 간헐적 투여의 순 결과는 세포 배양 시스템에서의 노출의 중간 시점과 동등하다는 것을 나타낼 것이다. 이는 Bcr/abl-형질전환된 세포주 또는 백혈병 환자로부터의 PBMC에서 보고된 STAT 인자의 구성적 활성화와 상이할 것이다[참조: Carlesso et al ., (1996) J Exp Med 183(3): 811-20; Gouilleux-Gruart et al ., (1996) Blood 87(5):1692-7]. 또한, 이러한 결과는 IFN-γ에 대한 반응의 완전한 장비(panoply)가 샘플을 채취한 시점에 진행 중이었다는 것을 강력하게 시사할 것이다. 대안으로, STAT-1 또는 IRF-1 DNA-결합 활성이 검출될 수 있다. STAT-1만 검출될 것 같지는 않은데, 그 이유는 IRF-1의 지속된 유도는 일반적이지만, STAT-1 활성화는 통상적으로 일시적이기 때문이다. STAT-1 DNA-결합 활성의 부재 하에서 IRF-1 DNA-결합 활성의 존재는, 상기 치료가 IFN-γ로 하룻밤 동안 처리한 후 배양된 세포에서 보이는 것과 동등한 반응을 유발했다는 것을 의미할 것이다. 생리학적으로 이것은 IFN-γ의 존재가 충분히 오래 지속되어 단핵구에서 대식세포로의 분화 또는 Th1 T 세포 반응의 발생과 같은 생물학적 종점(biological endpoint)이 유발되는 상황과 일치할 것이다.

STAT-4, -5 및 -6의 검정은 IL-2에 대한 T 세포의 반응 뿐만 아니라, 주요 Th1 또는 Th2 사이토카인의 존재 및 기능에 대한 분자 마커를 제공할 것이다. 많은 최근의 보고에서 IL-2는 STAT-5를 활성화시키고, IL-12는 STAT-4를 활성화시키고, IL-4는 STAT-6을 활성화시킨다는 것이 밝혀졌다[참조: Cho et al ., (1996) J Immunol 157(11): 4781-9; Gilmour et al ., (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92(23): 10772-6; Schindler et al ., (1992) Science 257(5071): 809-13]. 본 시험에서 얻어지는 데이터는 그 자체로는 이러한 해석을 증명할 수 없는데, STAT 계열의 거의 모든 일원이 하나 이상의 사이토카인에 의해 활성화되고, 거의 모든 사이토카인이 하나 이상의 STAT를 활성화시킬 수 있기 때문이다. 구체적으로, STAT-4는 IFN-α에 의해서도 활성화되고, STAT-5는 IL-7, IL-15, 프로락틴 및 성장 호르몬에 의해서도 활성화되며, STAT-6은 IL-13에 의해서도 활성화된다[참조: Ivashkiv, L. B. (1995) Immunity 3(1): 1-4; Darnell (1996) Recent Prog Horm Res 51:391-403; Cho et al ., (1996) J Immunol 157(11): 4781-9]. STAT-1은 IL-6 및 IL-10 뿐만 아니라, IFN-γ에 의해 활성화될 수 있다는 것을 또한 주의하여야 한다. 하지만, 이러한 데이터의 해석은 상기한 사이토카인 유전자 발현의 분석에 의해 뒷받침될 것이다. 또한, STAT-4, -5 및 -6 DNA-결합 활성의 검정은 특정 사이토카인 프로파일과 함께 발생하는 세포내 분자 효과에 관한 데이터를 제공하여 이러한 관찰을 상당히 확장시킬 것이다.

방법

본 발명자들은 GITC 및 초원심분리를 사용하여 10 x 10⁶ BAL 세포로부터 mRNA를 추출할 것이다. RT-PCR은 이러한 소량의 세포 분취액에 대해 수행할 수 있으므로, 총 RNA를 추출하고, -70℃에 보관하여, IRF-1의 유전자 발현에 대해 검정할 것이다. PCR 프라이머는 공개된 서열을 기본으로 할 것이고, 사이토카인 유전자에 대해 기술된 바와 같이 RT-PCR을 사용하여, 전사 정도를 대조군으로서의 b-액틴 또는 GAPDH와 비교할 것이다. IRF-1은 기저 발현되므로, RT-PCR에 대한 정량적 접근법이 필요할 것이다. BAL 세포로부터의 총 RNA를 표준 방법에 따라 올리고-d(T) 및 PCR을 사용하여 역전사시킬 것이다. PCR의 제1회는 다음의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 20%의 cDNA로 수행될 것이다: 정방향 프라이머 5'-GTCAGGGACTTGGACAGGAG-3', 및 역방향 프라이머 5'-AGCTCGGGGGAAATGTTAGT-3'. IRF-1 발현을 GAPDH 발현에 대해 정규화할 것이다.

세포 추출물의 제조: BAL로부터의 세포를 상기한 바와 같이 무혈청 RPMI 배지로 처리하고 나서, 수를 계산한 후, 조직 배양 플레이트로 이동시킬 것이다. 37℃에서 2시간 후, 비-부착성 세포를 배지와 함께 제거하여 다시 수를 계산할 것이다. 부착성 세포의 수는 상기 두 번의 세포 수 계산 간의 차이로서 얻어질 것이다. PBMC는 상기한 바와 같이 무혈청 RPMI 배지로 처리하고 나서, 수를 계산할 것이다. 모든 나머지 단계는 0 내지 4℃에서 수행될 것이다. 현탁액 중의 세포를 원심분리 (200 x g, 10분)하고 나서, 상청액을 흡인하고 펠릿을 인산염 완충 식염수 (PBS) 중에 재현탁시킬 것이다. 이 단계를 반복하고 나서, 이러한 세포를 1회 더 원심분리하고, 최종 PBS 상청액을 흡인할 것이다. PBS를 첨가하고 나서 흡인하여, 부착된 세포 단층을 세척할 것이다. PBS를 다시 첨가하여, 단층을 긁어 분리시킬 것이다. 세포 및 PBS를 원심분리 관으로 이동시켜 원심분리하고 나서, PBS를 흡인하여 제거할 것이다. 세척된 세포 펠릿을, 용해 완충액 (20 mM Hepes·Na, pH 7.9, 0.1 mM EDTA·Na, 0.1 M NaCl, 0.5% NP-40, 10% 글리세롤, 1 mM DTT, 0.4 mM PMSF, 3 ㎍/ml 아프로티닌, 2 ㎍/ml 류펩틴(leupeptin), 1 ㎍/ml 펩스타틴, 100 μM Na₃VO₄, 10 mM Na₂P₂O₇, 5 mM NaF) 중에 현탁시키고(10⁵ 세포 당 3 ㎕) 5분 동안 항온처리하여 용해시킬 것이다. 핵을 원심분리 (500 x g, 10분)에 의해 회수할 것이다. 상청액을 제거하고 나서, 원심분리 (13,000 x g, 15분)로 정화시킬 것이다. 생성된 상청액을 세포질 추출물로서 회수하여, 분쇄된 드라이아이스 또는 액체 질소에서 냉동시키고 나서, -80℃에서 보관할 것이다. 핵 펠릿을 세척 완충액 (NP-40이 없는 용해 완충액) 중에 재현탁시키고 나서, 원심분리로 회수할 것이다. 상청액을 흡인하고 나서, 펠릿을 추출 완충액 (NaCl이 0.1M 대신에 0.3M인 세척 완충액) 중에 현탁시키고(10⁵ 세포 당 3㎕), 30분 동안 혼합할 것이다. 추출된 핵을 원심분리로 펠릿화시켜, 상청액이 핵 추출물로서 회수될 것이고, 이를 위와 같이 냉동시켜 보관할 것이다. 단백질 농도를 측정하여, 유사한 양의 상이한 추출물이 실험에서 사용될 수 있게 할 것이다. 이는 일반적으로 동일한 용적의 각각의 추출물을 사용함을 포함하는데, 추출 완충액 용적 대 세포 수의 고정된 비를 사용하면 통상적으로, 상이한 제조로부터의 단일 추출물 세트 내의 핵 또는 세포질 추출물에 대해 일정한 단백질 농도가 수득되기 때문이다.

면역화학 방법: 면역블롯을 다음과 같이 수행할 것이다: 추출물 및 단백질 크기 표준을 SDS-PAGE용 농축된 라엠리(Laemmli) 샘플 로딩 완충액과 함께 혼합하여, 표준 프로토콜에 따라 8%의 분리 겔 및 4%의 축적 겔(stacking gel)로 제조된 불연속 트리스-글리신 겔 시스템에 가할 것이다. 상기 겔 %는 관심대상의 모든 단백질을 분리시킬 것이다. 전기영동을 마커 염료가 겔의 바닥에 도달할 때까지 일정한 전압으로 수행할 것이다. 겔을 이동 완충액 (트리스-글리신 + 15% 메탄올) 중에 평형화시키고 나서, 단백질을 동일한 완충액과 함께 니트로셀룰로스 막으로 반건조 장치[판매원: BioRad Transblot, SD]를 사용하여 이동시킬 것이다. 막을 표준 방법으로 현상할 것이다. 간략히 설명하면, 이는 트리스 완충 식염수 + Tween 20 세제 중의 탈지분유와 함께 항온처리하여 차단시키고, 특이적인 1차 항체와 함께 항온처리하고, 차단 용액 중에서 수회 세척하고, 효소-연결된 2차 항체와 함께 항온처리하고, 차단제가 없는 완충액 중에서 세척하고, 효소 기질과 함께 항온처리함을 포함할 것이다. 화학발광 기질의 경우, 시그날을 X-레이 필름으로 검출할 것이다. 대안으로, Molecular Dynamics Storm 860 장치를 화학형광 기질로부터의 시그날을 검출하기 위하여 PHRI에서 사용할 수 있다. 실험 설계를 토대로, 이전에 본질적으로 동일한 것으로 결정된 STAT-1 및 IRF-1의 이동에 대한 최적 조건[참조: Pine et al ., (1994) Embo J 13(1): 158-67; Pine et al ., (1990) Mol Cell Biol 10(6): 2448-57; Pine 미발표됨]은, 각각의 상기 단백질에 대한 이전에 결정된 최적 현상 조건과 같이, 본 연구에서 사용될 것이다. CIITA의 경우, 차단제, 세제 농도, 각각의 단계에 대한 항온처리 시간 및 검출 방법의 선택을 포함하는 최적 검출 조건은 배양된 세포로부터 제조된 대조군 추출물을 사용하여 실험적으로 결정될 것이다. STAT-1 및 IRF-1의 면역침전은 이전에 기술된 것을 약간 변형하여 수행될 것이다. 구체적으로, 항-IRF-1 항체에 결합된 IRF-1의 회수를 위한 에스.아우레우스(S. aureus) 세포의 사용을 단백질-a 아가로스의 사용으로 대체하였다.

전사 인자의 양을 검출하거나 인산화를 검사하는데 ELISA 검정이 바람직한 경우에는, 표준 방법을 기본으로 한 상세한 방법을 배양된 세포로부터의 대조군 추출물을 사용하여 실험적으로 개발할 것이다. 민감성을 증가시키기 위하여, 바람직한 접근법은 포획 항체를 미세역가 디쉬의 웰에 결합시킨 후, 차단시키고 나서, 목적하는 추출물과 함께 항온처리함을 포함할 것이다. 추가적인 세척 후, 특이적인 2차 항체를 사용하고 나서, 2차 항체에 대한 효소-연결된 항체를 사용하고, 기질 항온처리를 수행할 것이다. 세척은 각각의 항체 항온처리 후에 포함될 것이다. STAT-1의 경우, 래빗 폴리클로날 항혈청을 사용하여 검출을 위한 포획 항체 및 마우스 모노클로날 항체를 제공하거나 또는 그 반대가 가능할 것인데, 둘다 단백질 및 포스포티로신 또는 포스포세린에 대해 사용가능하기 때문이다. IRF-1 및 CIITA의 경우, 단백질에 대한 래빗 폴리클로날 항체만이 사용가능하므로, 포스포티로신 또는 포스포세린에 대한 마우스 모노클로날 항체를 사용하는 것이 필요할 것이다. 이러한 단백질의 검출은, 추출물을 사용하여 미세역가 디쉬의 웰을 코팅하고 나서, 특이적인 1차 항체 및 효소-연결된 2차 항체와 함께 항온처리하는 것을 필요로 할 것이다. 실험 샘플의 검정에서 특이성에 대한 대조군에는, 경우에 따라, 1차 항혈청을 제외시키고/시키거나 포스포아미노산을 포함시키는 것이 포함될 것이다.

전기영동 이동성 변화 검정: 각각의 상기 STAT 계열 일원 및 IRF-1에 대한 최적 검정이 개발되었다[판매원: Pine and Gilmour, supra]. 반응에는 비특이적 및 특이적인 경쟁인자 또는 비특이적 및 특이적인 항체가 포함될 것이다. 각각의 반응을 5㎍의 추출 단백질, 통상적으로 2 내지 3㎕를 사용하여 수행할 것이다. 경쟁인자를 사용하는 반응의 경우, 이러한 올리고뉴클레오티드는 추출물과 함께 혼합되는 경우 방사성표지된 프로브와 함께 포함될 것이다. 항체를 사용하는 반응의 경우, 단백질-DNA 결합 반응을 통상적으로 수행하고 나서, 항혈청을 첨가하여 항온처리를 계속할 것이다. 항온처리가 완료되면, 반응물을 천연 폴리아크릴아미드 겔에 가하고 나서, 이를 4℃에서 전기영동할 것이다. 겔을 건조시킨 후, 생성물을 방사성촬영 또는 Molecular Dynamic PhosphoImager로 수득할 것이다.

본 발명자들은 기저선에서 얻은 데이터 및 rIFN-γ 치료 후 얻은 데이터를 스튜던트 대응표본 t 검정(Student's paired t test)으로 비교하여, 분석결과를 평균±SEM으로 표현할 것이다. 기존 연구에 따라, 본 발명자들은 FEV1에서 0.3L 차이 및 3x10⁵ 세포/ml의 차이를 검출할 필요가 있을 것이다. 30명의 피험자로, 본 발명자들은 80%의 검정력을 가질 것이다. 따라서 본 발명자들은 각 그룹에 15명의 피험자를 동원할 것이다.

피험자 집단: 의학적 평가를 천식이 있는 400명의 사람에 대해 수행할 것이다. 경증 내지 중등증 지속성 알레르기성 천식이 있는 30명의 환자를 임의로 IFN-γ 에어로졸 (n = 15) 대 표준 치료 (n = 15)를 받게 할 것이다. 환자는 폐 기능 및 기관지 유발 측정을 받아야 한다. 광섬유 기관지경 검사에 대한 금기가 없어야 한다. 대다수의 연구 집단은 벨뷰(Bellevue) 병원 1차 치료 천식 클리닉으로부터 동원될 것이다. 본 연구자들의 환자 집단의 인구통계학적 특징은 다음과 같다: 90%의 미성년자 (주로 히스패닉계 및 아프리카계 미국인), 18 내지 79세 (중앙값 = 39세), 그리고 1:2의 남성:여성 비.

잠재적인 위험성: 일반적으로, 인터페론-γ(IFN-γ)에 대한 부작용의 위험성 및 중증도는 주어지는 약물의 양과 관계가 있다. 본 연구에서 사용된 용량 (50 mcg/m²)에서, 가장 흔한 가능한 부작용에는 발열, 두통 및 권태감이 포함된다. 간헐적인 오심 및 구토가 고용량에서 보고되었다. 에어로졸화는 부작용과 관계가 없었지만, 두통, 기침 및 발열이 예상될 수 있다. 심한 증상이 발생하는 경우, 투약이 중지될 것이다. 천식과 관련이 없는 이전에 알려지지 않은 IFN-γ의 부작용의 위험성이 있다. 개체에서 IFN-γ의 단백질 부분에 대한 알레르기 반응이 발생할 수 있고, 이러한 경우 투약이 중단될 것이다.

위험성 관리 방법: 임의의 위험성을 최소화시키기 위하여, 의학적 평가 후 심장 질환 또는 협심증 병력이 있는 개체를 제외하고 기관지폐포 세척을 수행한다. 흉부 x-레이 및 출혈 변수를 포함하는 혈액 연구를 수행한다. 기관지폐포 세척은 의사의 감독 하에 폐 전임의에 의해 수행될 것이다. 검사 후, 연구 피험자는 3시간 동안 NPO를 유지하고, 바이탈 싸인(vital sign)을 3시간 동안 30분 마다 확인할 것이다. 모든 환자는 검사 동안 심장 모니터링을 받을 것이고, 임의의 저산소혈증을 예방하기 위하여 검사 동안 및 검사 후 2시간 동안 비강으로 O₂를 공급받을 것이다. 모든 환자 데이터는 폐 연구소에서 보안이 유지될 것이다. 피험자에게 부작용이 발생하는 경우를 대비하여, "크래시 카트(crash cart)"에 광섬유 기관지경을 준비하고, 기관삽관 튜브, 주사가능 리도케인 및 에피네프린 등을 포함시키며, 대기중인 당직의사 및 CPR 팀이 있는 병원에서 모든 과정을 수행한다. 모든 기관지폐포 세척 과정을 주기적으로 평가하여 부작용 발생이 증가하는지 확인하고 이의 원인을 확인할 것이다.

실시예 14

에어로졸 인터페론-γ를 투여받는 모든 환자를 폐활량측정법으로 연구하여 가역성 기도 질환을 평가하였다. 대부분의 환자는 가역성의 징후가 없는 폐쇄성 기도 질환이 있었다. 각각의 에어로졸 치료에서, 환자는 각각의 치료 전후에 최대 호흡량 모니터링을 받았다. 모든 환자에 대한 데이터는 도 11에 제시되어 있다. 최대 호흡량 측정의 % 변화의 요약 데이터는 도 12에 제시되어 있다. 평균 최대 호흡량이 에어로졸 인터페론-γ 후 증가하였고, 일부 환자에서는 유의적으로 증가하였다. 이러한 데이터는 에어로졸 인터페론-γ가 기도 질환이 있는 환자에서 안전하며 충분히 용인된다는 것을 증명한다.

Claims (39)

1. 에어로졸화된 인터페론을 치료학적 유효량으로 투여함을 포함하여, 폐질환을 겪고 있는 피험체에서 폐질환을 치료하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 폐질환이 폐쇄성 폐질환인 방법.
3. 제1항에 있어서, 폐질환이 특발성 폐 섬유증인 방법.
4. 제1항에 있어서, 폐질환이 천식인 방법.
5. 제1항에 있어서, 강제 폐활량(FVC; Forced Vital Capacity) 예측치가 치료를 수행하기 전의 수치와 비교하여 적어도 10% 이상 증가되어 질환이 개선되는 방법.
6. 제1항에 있어서, 폐질환을 겪고 있는 피험체가 하나 이상의 코르티코스테로이드, 사이클로포스파미드 및 아자티오프린을 사용한 치료에 대해 무반응성인 방법.
7. 제1항에 있어서, 에어로졸화된 인터페론을 약 250 내지 750㎍ 범위의 용량으로 1주일에 3회 투여하는 방법.
8. 제1항에 있어서, 에어로졸화된 인터페론을 약 500㎍의 용량으로 1주일에 3회 투여하는 방법.
9. 제1항에 있어서, 투여되는 에어로졸화된 인터페론의 양을 계산하여 최적화시키는 방법.
10. 제1항에 있어서, 투여의 결과로 폐질환이 있는 환자의 폐에 인터페론이 침착(deposition)되는 방법.
11. 제1항에 있어서, 투여의 결과로 폐 기능 검사 결과가 향상되는 방법.
12. 제1항에 있어서, 인터페론이 인터페론 α인 방법.
13. 제1항에 있어서, 인터페론이 인터페론 β인 방법.
14. 제1항에 있어서, 인터페론이 인터페론 γ인 방법.
15. 치료학적 유효량의 에어로졸화된 인터페론을 치료학적 유효량의 면역억제제 또는 항염증제와 함께 전달함을 포함하여, 폐질환이 있는 환자를 치료하는 방법.
16. 제15항에 있어서, 면역억제제 또는 항염증제가 코르티코스테로이드, 아자티오프린 및 사이클로포스파미드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
17. 제15항에 있어서, 폐질환이 폐쇄성 폐질환인 방법.
18. 제15항에 있어서, 폐질환이 특발성 폐 섬유증인 방법.
19. 제15항에 있어서, 폐질환이 천식인 방법.
20. 제15항에 있어서, FVC 예측치가 치료를 수행하기 전의 수치와 비교하여 적어도 10% 이상 증가되어 질환이 개선되는 방법.
21. 제15항에 있어서, 폐질환을 겪고 있는 피험체가 하나 이상의 코르티코스테로이드, 사이클로포스파미드 및 아자티오프린을 사용한 치료에 대해 무반응성인 방법.
22. 제15항에 있어서, 에어로졸화된 인터페론을 약 250 내지 750㎍ 범위의 용량으로 1주일에 3회 투여하는 방법.
23. 제15항에 있어서, 에어로졸화된 인터페론을 약 500㎍의 용량으로 1주일에 3회 투여하는 방법.
24. 제15항에 있어서, 투여되는 에어로졸화된 인터페론의 양을 계산하여 최적화시키는 방법.
25. 제15항에 있어서, 투여의 결과로 폐질환이 있는 환자의 폐에 인터페론이 침착되는 방법.
26. 제15항에 있어서, 투여의 결과로 폐 기능 검사 결과가 향상되는 방법.
27. 제15항에 있어서, 인터페론이 인터페론 α인 방법.
28. 제15항에 있어서, 인터페론이 인터페론 β인 방법.
29. 제15항에 있어서, 인터페론이 인터페론 γ인 방법.
30. 치료학적 유효량의 에어로졸화된 인터페론을 포함하는, 폐질환 환자의 치료용 약제학적 조성물.
31. 제30항에 있어서, 면역억제제 또는 항염증제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
32. 제30항에 있어서, 면역억제제 또는 항염증제가 코르티코스테로이드, 아자티오프린 및 사이클로포스파미드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
33. 제30항에 있어서, 폐질환이 폐쇄성 폐질환인 약제학적 조성물.
34. 제30항에 있어서, 폐질환이 특발성 폐 섬유증인 약제학적 조성물.
35. 제30항에 있어서, 폐질환이 천식인 약제학적 조성물.
36. 제30항에 있어서, 폐질환을 겪고 있는 피험체가 하나 이상의 코르티코스테로이드, 사이클로포스파미드 및 아자티오프린을 사용한 치료에 대해 무반응성인 약제학적 조성물.
37. 제30항에 있어서, 인터페론이 인터페론 α인 약제학적 조성물.
38. 제30항에 있어서, 인터페론이 인터페론 β인 약제학적 조성물.
39. 제30항에 있어서, 인터페론이 인터페론 γ인 약제학적 조성물.

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