KR20080092373A

KR20080092373A - 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20080092373A
Application number: KR1020087017264A
Authority: KR
Inventors: 마크 배리 브라운; 마이클 에드워드 도널드 크로더스; 타히르 나지르
Original assignee: 페플린 리서치 피티이 리미티드
Priority date: 2005-12-16
Filing date: 2006-12-18
Publication date: 2008-10-15
Also published as: US20160263068A1; HUE020998T4; EA201201452A1; IL192221A; KR20140088617A; US20160263069A1; US9603822B2; US20130225678A1; MX2008007685A; US20140357712A1; EA018545B1; IL245513A0; CY2014030I1; CA2634073A1; KR101451993B1; NO20083150L; US20180289654A1; US9861603B2; JP5709826B2; CY1115292T1

Abstract

인제놀 엔젤레이트는 강력한 항암제이며 산성 완충제의 존재하에 비양성자성 용매에 용해되어 안정화될 수 있다.

Description

치료용 조성물{THERAPEUTIC COMPOSITIONS}

본 발명은 화합물의 조성물 및 그 용도에 관련된 것으로 보다 상세하게는 치료용 조성물 및 그 용도에 관련된 것이다.

본 발명은 등대풀 종(Euphorbia species)에서 추출할 수 있는 화합물의 조성물에 관련된 것으로, 등대풀 종은 피부 암의 치료에 유용하다.

인제놀 엔젤레이트(ingenol angelate) 화합물은 다양한 등대풀 종(Euphorbia species), 특히 유포비아 페플루스 (Euphorbia peplus) 및 유포비아 드룸몬디(Euphorbia drummondii) 등에서 분리할 수 있다. 인제놀 엔젤레이트는 인제놀-3-엔젤레이트(ingenol-3-angelate; 아이소형 'b'), 인제놀-5-엔젤레이트 (ingenol-5-angelate; 아이소형 'a'), 및 인제놀-20-엔젤레이트 (ingenol-20-angelate; 아이소형 'c') 등의 3가지 형태의 아이소형(isoforms)으로 존재한다. 이들 중 첫 번째 형태는 여기에서 'Ⅰ3A'라고도 칭하고 다음의 구조를 가진다:

인제놀 엔젤레이트는 원발성 괴사(primary necrosis)를 통해 빠른 미토콘드리아의 붕괴 및 세포사(cell death)시켜 피부암 세포에 매우 치명적 것으로 발견되었는데 정상 세포에는 영향을 미치지 않는다.

미국특허 A-6432452는 유포비아 페플루스 (Euphorbia peplus), 유포비아 히르타(Euphorbia hirta) 및 유포비아 드룸몬디(Euphorbia drummondii) 등의 식물 종들에서 추출한 유효 성분의 형태의 화합물을 개시하고 있다. 이들은 여러 가지 다양한 암세포들에 대하여 각각 선택적으로 세포 독성을 나타낸다. 상기 화합물들은 암, 특히 악성흑색종(malignant melanomas) 및 편평세포암종(squalmous cell carcinomas; SCCs)의 효과적인 치료에 유용하다. 상기 화합물들은 자트로판(jatrophanes), 페플루안(pepluanes), 파랄리안(paralianes) 및 인제난(ingenanes) 중에서 선택된다. 바람직한 화합물은 유포비아 페플루스의 수액에서 추출한 엔젤로일-치환 인제난(angeloyl-substituted ingenane)이다.

마이크로그램 단위의 양의 인제놀 엔젤레이트는 일반적으로 치료용으로 유효하다. 그러나, 제형(formulation)을 특정 아이소형 또는 아이소형의 비율로 제한하는 것이 바람직한데, 아이소형 'b'가 아이소형 'a'으로, 그리고 다시 아이소형 'c'로 재배열(rearrangement) 되려는 성질은 제형에 있어서 문제가 된다. 각기 다른 아이소형은 다른 용해성을 가지므로 이런 성질은 특히 Ⅰ3A에 있어서 문제가 된다.

다른 약물을 사용하는 전신 치료는 신체에서 치료의 목표가 아닌 건강한 세포도 세포 독성이 있는 화학 약품에 필연적으로 노출이 되므로, 피부암(skin cancer)의 효과적인 국소적 치료가 필요하다. 나아가, 경구용 또는 주사로 투여하는 전신 항암 치료는 환자의 수용률이 더욱 낮다.

인제놀 엔젤레이트의 안정적이고, 바람직하게는 국소 투여를 하는 것이 가능한 제형물이 요구된다.

본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 설명될 것이다.

도 1은 프란츠 셀(Franz cell)을 개략적으로 도시한다.

도 2는 이소프로파놀 겔(isopropanol gel; pH 6.5) 내에서 아이소형 'b'의 비율을 나타낸다.

도 3은 30% IPA/구연산염 완충제(citate buffer; pH 3) 내에서 Ⅰ3A 'b'의 비율을 나타낸다.

도 4는 2~8℃, RTP 및 40℃에서, 100% 벤질 알콜 내에서의 Ⅰ3A 'b'의 비율을 나타낸다.

도 5는 2~8℃, RTP 및 40℃에서, 100% 페녹시타놀(phenoxythanol) 내에서의 Ⅰ3A 'b'의 비율을 나타낸다.

도 6은 0.1%(w/w) Ⅰ3A 제형물 16 및 각 플라시보의 제제의 순서도를 도시한다. *플라시보 제형물에는 0.25g 벤질 알콜을 기본 제형물 24.75g에 첨가했다.

도 7은 제형물 4, 14, 15, 16 및 17(n=5±SD)의 상대적 G'(Relative G') 및 G'' 수치를 나타낸다.

도 8은 제형물 4, 14, 15, 16 및 17에 대응하는 tan d 수치를 나타낸다.

도 9는 0.1%(w/w) 폴록사머 겔 및 PEG 400 제형물들에서 Ⅰ3A 'b'가 26시간 후에 방출된 평균량의 플롯 (n=3±SE)을 나타낸다.

도 10은 0.1%(w/w) 기름 및 PEG 400 제형물들에서 Ⅰ3A 'b'가 26시간 후에 방출된 평균량의 플롯을 나타낸다. (n=3±SE)

놀랍게도 인제놀 엔젤레이트는 아이소형들 사이의 재배열(rearrangement)을 거치지 않고 적절한 비양성자성 용매(aprotic solvent)와 적절한 혼합이 가능한 산성 완충제(acidic buffer)의 혼합물에서 용해될 수 있는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명의 첫 번째 측면에서 치료용 목적의 인제놀 엔젤레이트 제형물을 제공한다. 상기 인제놀 엔젤레이트는 약제로써 적절한 비양성자성 용매에 용해되고, 상기 제형물은 약제로써 적절한 산화제를 더 포함한다. 상기 산화제는 적어도 부분적으로 상기 용매에 친화적이고 4.5 이하의 겉보기 pH(apparent pH)를 갖도록 한다.

본 발명은 인제놀 엔젤레이트의 모든 형태의 아이소형(isoforms) 또는 그 혼합물의 제형물을 포함한다. 현재로써 바람직한 아이소형은 여기서 Ⅰ3A로도 칭하는 아이소형 'b'이다. '인제놀 엔젤레이트(ingenol angelate)' 및 'Ⅰ3A'에 관한 것은 특정한 언급이 없는 한, 다른 형태의 아이소형 및 그 혼합물을 포함한다.

인제놀 엔젤레이트는 다양한 용매에 용해될 수 있고, 여러 가지 용매들은 다음 실시예 1에 도시되어 있다. 그러나, 인제놀 엔젤레이트는 일반적으로 양성자성 용매(protic solvents)에서 다양한 비율로 재배열되는 성질을 갖는데, 일반적으로 식물에서 추출된 제품에서는 약 1% 이상의 재배열, 더 바람직하게는, 약 0.5%의 재배열 비율은 제약용 제형물에서는 바람직하지 않다.

일반적으로 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 등의, 용액에 양성자(proton)를 제공하지 않는 용매인 비양성자성 용매에서는, 용해는 시간이 많이 걸릴 수 있으며, 이는 요구되는 적절한 온도와 함께 적절한 수준 이상의 재배열을 발생시킬 수 있다.

아세톤 및 아세토니트릴(acetonitrile) 등의 물질은 Ⅰ3A를 용해시킬 수 있지만 일반적으로 약제로서는 적절하지 않고, 장기간 보관하는데 적절하지 않다. 더 적절한 물질은 메틸 에틸 케톤(methyl ehtyl ketone), 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 또는 디에틸 에테르(diethyl ether) 등이 있고, 가장 바람직한 물질은 벤질 알콜(benzyl alcohol)이다.

몇 가지 물질들은 Ⅰ3A를 용해하기에 적절하나, 안정성을 보장할 수 없고, 짧게는 12시간에서 길게는 6개월 또는 1년의 시간 후에 일반적으로 수용 불가능한 정도의 재배열이 일어날 수 있다.

물 또는 기타 양성자성 용매를 포함하지 않을 때는 측정 가능한 pH가 나타나지 않는다. 이런 조건에서는, 특히 높은 온도에서는 재배열이 일어날 가능성이 있다. 따라서, 일반적으로 적절한 산(acid)를 첨가함으로써 재배열을 방지할 수 있다는 것을 발견하였다.

적절한 산은 일반적으로 유기산(organic acids)인데, Ⅰ3A는 약 pH3보다 낮은 pH에서 분해되는 것으로 알려졌고, 재배열은 약 pH 4.5 이상에서 나타날 가능성이 많다. 예를 들어 1개월 또는 그 이상의 기간 동안 제형물을 보관할 경우에는 산은 완충제(buffer)의 형태가 바람직하다. 적절한 완충제는 구연산염 완충제(citrate buffer), 인산염 완충제(phosphate buffer), 아세테이트 완충제(acetate buffer), 및 구연산-인산염 완충제(citrate-phosphate buffer) 등을 포함하는데 기타 다른 완충제를 사용하는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 특히, 완충제는 2.5 이상 4.5 이하의 겉보기 pH(apparent pH)를 제형물에 제공하는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는 4 이하의 제형물의 pH, 그리고 가장 바람직한 제형물의 겉보기 pH는 3.8 또는 그 이하, 약 3.5 또는 그 이하의 pH이다. 약 3의 겉보기 pH가 유용하다. 실시예들에 나타난 양으로 사용했을 때 약 2.75의 pH의 완충제가 마지막 제형물에서 약 pH 3.5의 겉보기 pH에 비해 특히 유용한 것으로 발견되었다. 완충제의 바람직한 pH 범위는 2.6에서 2.85이고, 바람직하게는 pH 2.7 - pH 2.8이며, 구연산염 완충제가 바람직하다. 상기 산은 일반적으로 수용성 용액의 형태이며, 다른 언급이 없을 경우에 바람직하게는 탈이온수(deionised water)이다. 구연산염 완충제가 바람직하다. 아세트산 완충제를 사용할 경우, 보통 pH의 범위는 3.5에서 5.5이고, 구연산염-인산염 완충제는 보통 pH 2.75에서 7.0의 범위의 pH를 갖는다.

용매가 비양성자성 용매일 경우에 H⁺ 이온의 단위로 측정하는 pH를 가질 수 없다. 그러나, 산 또는 산성 완충제와 적어도 부분적으로 혼합되고 이들을 포함하는 용액에 있어서는 pH의 측정이 가능할 수도 있다. 본 발명의 바람직한 제형물는 국소적 투여의 형태이고, 일반적으로 대부분 완충제 또는 이온 용액을 포함하지만, 반드시 비양성자성 용매를 포함한다. 그 결과, 측정된 pH는 이온 성분에만 관여하기 때문에 절대적이기보다는 겉보기 pH(aparent pH)만을 측정할 수 있다. 겉보기 pH를 측정하는 적절한 수단은 Jenway 3320 pH 미터이다. 따라서, 측정 결과는, 특히 산 또는 완충제의 양이 적을수록 통상 이온 용액의 수치가 아닐 수 있다. 그러나 중요한 것은 어떤 이온 환경이 존재하더라도 그 환경은 산성이라는 것이다. 산의 양이 증가할수록 겉보기 pH는 pH에 더욱 동등해진다. 이론적으로 확인된 것은 아니나, 인제놀 엔젤레이트는 물에서 매우 낮은 용해성을 가지므로 비양성자성 용매에 일차적으로 용해될 가능성이 있다. 다음으로 용매에 혼합된 인제놀 엔젤레이트 용액을 산성화된 이온 용액에 추가적으로 추가하여, 적절하고, 필요에 따라서 수용성인 인제놀 엔젤레이트 이온 용액을 제제할 수 있다. 이렇게 함으로써, 가장 큰 양의 재배열이 일어나는 것으로 보이는 양성자성 용매에 인제놀 엔젤레이트를 직접 용해시키는 것을 피할 수 있다. 따라서, 양성자성 용매에의 접촉은 즉시 다른 아이소형을 형성하는 결과를 가져오지만, 이 결과는 적은 양의 산 또는 산성 완충제(이 둘은 특별한 언급이 없는 한 본 발명에서 동일하게 쓰인다)를 추가하면 최소화할 수 있다. 필요한 시간과 조건 하에서, 양성자성 용매에 용해하는 것 역시 원치 않는 높은 수치의 아이소형을 형성할 수 있다. 이것이 인제놀 엔젤레이트의 재배열되려는 성질이다.

상기 비양성자성 용매와 상기 산은 이 두 가지의 안정적인 제제를 형성할 수 있다는 점에서 적어도 부분적으로 친화적이다(compatible). 바람직하게는 상기 산 및 용매는 서로 혼합이 가능해야하고, 바람직하게는 모든 비율에서 혼합이 가능해야 한다. 특히, 겉보기 pH를 비교적 낮은 레벨에서 유지하기 위해서, 인제놀 엔젤레이트를 용해시키는 동안, 또는 용해 직후에, 적은 양의 완충제를 용매에 추가하는 것이 일반적으로 바람직하다. 다음으로, 처음 용해할 때 사용된 완충제보다 많은 양의 완충제에 용해된 인제놀 엔젤레이트를 형성할 수도 있다. 과량의 완충제에서 형성한 안정적인 제제의 예는 아래 실시예 9에 나타나 있다.

상기 산 및 용매는 단일의 상(single phase)을 형성할 정도로 충분히 혼합이 가능한 것이 바람직하다. 그러나 혼합이 불가능하거나 혼합이 덜 되는 용매와 산은 이멀젼(emulsions) 또는 마이크로 이멀젼(micro-emulsions)의 형태로 제제될 수도 있다. 상기 이멀젼은 안정적인 것일 수 있으나, 용매와 산의 혼합물을 단일 상으로 제제하는 것은 엔젤레이트의 재배열을 일반적으로 더 최소화할 수 있다.

본 발명에서 특히 유용한 용매들은 바람직하게 동소환형(homocyclic)인 고리형이며, 고리 구조로부터 분리되는 적어도 하나의 탄소에 치환된 하이드록실기를 갖는 고리 구조처럼 친수성(hydrophilic)이며 친지질성(lipophilic)이다. 특히 바람직한 용매의 예는 벤질 알콜(benzyl alcohol)이다.

완충제 이외의 산을 사용하는 것이 가능하나, pH의 변화를 최소화하기 위하여 산성 완충제를 사용하는 것이 일반적으로 바람직하다. 본 발명에서 일반적으로 '완충제(buffer)'라고 칭하지만, 이 용어는 또한 필요한 경우 산 및 산 제제를 포함한다. 특히 바람직한 완충제는 pH3 이하, 바람직하게는 pH 2.75의 구연산염 완충제이다. 벤질 알콜에서, 2.5% w/w 양의 pH 2.5 구연산염 완충제는 보통 측정이 불가능한 겉보기 pH를 나타내지만, 더 많은 양에서는, pH3 정도의 pH를 나타낸다. 완충제의 pH와 겉보기 pH의 상관 관계는 아래 실시예에 도시되어 있다. 상기 용매에 Ⅰ3A를 용해시킬 때 적은 양의 완충제에서는 환경을 산성으로 유지하는 것이 바람직하다. 상기 레벨의 완충제의 성질은, 상기 제제를 실제 사용하기 위해서 희석할 때의 완충제의 성질과 유사하다. Ⅰ3A를 추가하기 전에, 바람직하게는 1 ~ 10%의 중량에서, 더 바람직하게는 2 ~ 5%의 중량의 산성 완충제로 상기 용매를, 바람직하게는 벤질 알콜을, 산성화하는 것이 바람직하다.

사용을 위해서 제형물을 반드시 희석할 필요는 없지만, 일반적으로 Ⅰ3A는 강력한 물질이므로, Ⅰ3A의 원액은 용매, 바람직하게는 벤질 알콜 내에서 8℃ 이하에서 보관할 수 있도록 만들어질 수 있다. 상기 원액은, 최종 제형물 또는 제재(preparation)를 제조할 때 필요에 따라서 완충제 등으로 희석할 수 있다.

인제놀 엔젤레이트를 용해할 때 사용하는 완충제의 양은 약 0 ~ 100% 사이에서 변화할 수 있다. 상기 양이 0일 때는, 재배열이 발생하는 것을 최소화하기 위하여, 상기 용매에 인제놀 엔젤레이트를 추가한 직후에 많은 양의 완충제를 추가하는 것이 바람직하다. 상기 완충제에 바로 용해하는 것은 일반적으로 가능하지 않기 때문에 상기 용매의 중량의 100% 이상의 완충제의 양을 사용하는 것은 보통 바람직하기 않다. 상기 용매의 겉보기 pH를 낮은 레벨에서 유지하기 위한 수단으로써 상기 완충제를 사용하고, 인제놀 엔젤레이트의 용해 과정 동안 양성자성 용매를 추가하지 않는 것이 바람직하다. 상기 인제놀 엔젤레이트가 어느 정도 용해되면, 필요에 따라서 항생제 등과 같은 다른 양성자성 성분을 포함하는 과량의 완충제로 제형물을 제조할 수 있다. 완충제의 바람직한 레벨은 0.5~10%, 바람직하게는 1~5%, 용해 단계에서 가장 바람직하게는 2~3%이다. 상기 용해 단계는 상기 용매에 인제놀 엔젤레이트의 적어도 대부분을 용해하는 단계를 포함하는데, 바람직하게는 상기 용매에 적어도 95% w/w의 인제놀 엔젤레이트를, 더 바람직하게는 적어도 99% w/w를 용해시킨다.

본 발명에 따른 제형물는 바로 사용하거나 나중에 사용하기 위하여 보관할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 제형물는 기본적인 제형의 형태로 제조하여 사용 전에 변형할 수 있도록 제공할 수 있다. 예를 들면, 상기 설명과 같이, 제형물는 과량의 완충제 내에서 제조하거나, 겔 형태로 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 제형물는 또한 더 낮은 온도에서 일반적으로 더 안정적인 것으로 발견되었다. 벤질 알콜 및 구연산염 완충제를 포함하는 것과 같은 본 발명의 바람직한 제형물들은 40℃ 정도의 높은 온도에서 안정성을 보이고, 일반적으로 실내 온도 및 압력(RTP) 이하의 온도에서 더욱 안정적이며, 가장 안정적인 온도는 약 8℃ 이하에서 관찰된다. 냉동은 안정성을 증가시키지 않는다. 따라서, 일반적으로 본 발명의 제형물을 약 2~8℃의 온도의 일반 냉장고에 보관하여 가장 높은 안정성을 얻을 수 있다.

본 발명은 또한 제약으로 적절한 비양성자성 용매에 인제놀 엔젤레이트를 용해시키는 단계를 포함하는 인제놀 엔젤레이트 용액의 제제 방법을 제공한다. 상기 제형물는 상기 용매와 적어도 부분적으로 친화적이고, 상기 제형물에 4.5 이하의 가시적 pH를 제공하는 제약으로 적합한 산성화제를 포함한다. 상기 산은 인제놀 엔젤레이트와 동시에, 또는 추가 전에 또는 추가 후에 추가한다.

또는, 본 발명은 인제놀 엔젤레이트를 제약으로 적합한 비양성자성 용매에 용해시키는 단계를 포함하는 인제놀 엔젤레이트 용액의 제제 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 용매와 적어도 부분적으로 친화적이고, 상기 제형물에 4.5 이하의 겉보기 pH를 제공하는 제약으로 적합한 산화제를 추가하는 단계를 포함한다. 상기 산화제는 인제놀 엔젤레이트와 동시에, 또는 추가 전에, 또는 추가 후에 추가한다. 상기 산화제는 완충제를 사용하는 것이 바람직하다.

1% 이하, 바람직하게는 약 0.5% 이하의 아이소형 'b'가 아이소형 'a'로 재배열되지 않도록 Ⅰ3A를 추가한 후에 산 또는 완충제를 추가하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 상기 산 또는 완충제는 Ⅰ3A를 추가하기 전에 용매에 추가한다. 또는 상기 3가지 성분을 동시에 혼합할 수도 있다. 후자는 가장 덜 권장하는 방법이다.

상기 과정은 또한 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 등과 같은 다른 화합물 및 용매들을 사용하여 인제놀 엔젤레이트 제형물을 제제하는데 이용할 수 있다. 직접적인 용해는 적절하지 않은 레벨의 재배열을 발생할 수 있다. Ⅰ3A는 PEG 내에서 용해될 수 있으나, 이것은 높은 온도에서 약 1시간을 필요로 하는데, 이것은 일반적으로 부적절한 레벨의 아이소형 'a'를 형성할 수 있다. 상기 Ⅰ3A를 완충된 벤질 알콜에 먼저 용해시키면, 그 후에 이것을 열에 장기간 노출할 필요없이 PEG에 바로 추가할 수 있다. Ⅰ3A를 용해시키기 위해서는 적당한 양의 벤질 알콜만을 필요로 하므로, 최종의 PEG 제형물 내의 총 벤질 알콜의 양은 약 1% w/w 또는 그 이하의 양이면 충분하다.

상기 제형물들,은 특히 8℃ 또는 그 이하의 온도에서 보관할 경우에, 장기간 보관이 가능하다. 바람직한 조성물들은 약 1% 이하, 더 바람직하게는 약 0.5% 이하정도 만의 아이소형 'b'의 아이소형 'a'로의 재배열이, 3개월 후에, 더 바람직하게는 6개월 후에 나타난다.

피부암의 치료에서 본 발명의 제형물의 용도가 더 제공된다.

본 발명은 또한 피부암의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조 방법에 있어서 인제놀 엔젤레이트(ingenol angelate)의 용도를 제공한다. 상기 인제놀 엔젤레이트는 약제로 적절한 비양성자성 용매에 용해시키고, 상기 제형물는 상기 용매와 적어도 부분적으로 친화적이며, 상기 제형물에 4.5 이하의 겉보기 pH를 제공하는 제약으로 적합한 산화제를 포함한다.

본 발명에 따른 치료로 적절한 암의 종류는 편평세포암(squamous) 및 기저세포암(basal cell cancers) 등을 포함한다.

본 발명의 '치료(treatment)'라는 용어는 요법(therapy) 및 예방을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 조성물의 치료용으로 효과적인 양을 암 질환의 부위에 국소적으로 투여하는 단계를 포함하는, 암 질환을 앓고 있는 대상에 투여하는 방법을 제공한다.

치료로 적절한 대상은 사람, 영장류, 가축동물(소, 말, 양, 돼지 및 염소 포함), 애완동물(개, 고양이, 토끼, 기니피그 포함), 포획된 야생동물, 및 토끼, 생쥐, 쥐, 기니피그 및 햄스터 등의 실험용 동물 등을 포함하는 포유동물이다. 상기 본 발명에 따른 조성물들은 특히 사람의 피부암의 치료에 적절한 것이다.

본 발명에 따른 제형물들은 모든 적절한 암의 예방 또는 치료를 위해 사용이가능하다. 투여의 형태로 국소 투여에는 크림, 겔, 연고, 로션, 스프레이, 래커 및 페인트 등의 형태, 기도 투여로는 파우더, 용액 및 현탁액, 주사용으로는 용액 및 이멀젼, 경구 투여로는 캡슐, 시럽 및 엘릭시르(elixir)의 형태, 및 페서리 및 좌약 등의 모든 적절한 형태를 포함한다. 기타 다른 적절한 투여의 형태는 당업자에게 자명할 것이며 예를 들어 경피용 패치를 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 인제놀 엔젤레이트 제형물는 국소적 투여용으로 제형될 수 있다.

모든 경우에서 최초 제형물는 본 발명의 제형에 따른다. 상기 제형은 사용 직전 또는 상기 제형물의 제제 후에 어느 때나 최종의 형태로 제조될 수 있으나, 통상 본 발명의 제형물의 형태로 유지될 것이다.

제형물들은 다음에 설명될 추가적인 성분들을 포함할 수 있다. 바람직하게는 제형물들에 향상된 안정성을 제공하는 것으로 보이는 항산화제를 포함하는 것이 바람직하다. 항산화제의 적절한 예는, 레티놀, 아스코르브산, 리코펜, 부틸레이트 히드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene), 및 토코페롤 등을 포함한다.

약제의 효능에 필요한 인제놀 엔젤레이트의 양은 당업자에게 자명할 것이며, 환자의 나이, 체중 및 성별, 환부의 크기 등의 신체적 매개변수에 따라 변경할 수 있다. 일반적으로, 제공하기 적당한 인제놀 엔젤레이트의 양은 0.01μg cm^-2~ 1 mg cm^-2이며, 바람직하게는 0.1 mg cm^-2~ 100μg cm^-2의 범위이다. 아래의 실시예들에서, 15μg cm^- ²의 제형물을 사용했으나, 1 μg cm^-2또는 그 이하의 제형물들은 효과적인 것으로 나타났다. 또 다른 예로, 본 발명의 제형물는 0.001%(w/w) ~ 0.15%(w/w), 더 바람직하게는 0.1 ~ 0.12%(w/w)의 양의 Ⅰ3A를 포함할 수 있다.

국소적 제형물는 본 발명에서 권하는 바람직한 실시예이다. 이와 관련하여, 본 발명에서 사용된 인제놀 엔젤레이트의 아직 밝혀지지 않은 성질이 특히 유용한 것으로 발견되었는데, 이것은 혈관 수축 작용을 하는 성질이다. 따라서, 이 치료 부위 주변에서 혈액 순환이 감소하므로, 유효 성분의 전신 투여는 최소로 한다.

피부 전반의 투과율은 상기 제형물의 성질에 따라 결정될 것이다. 일반적으로 상기 제형물의 투과율이 적어도 약 11 ng cm^-2h^-1이 되도록 제제하는 것이 바람직하다. 특정 상위 제한은 없으나 보통 약 1μg cm^-2h^-1을 초과하지 않도록 하는 것이 바람직하다.

국소용 제형물는 모든 적절한 형태가 가능하다. 보통, 치료 부위에서 흐르지 않는 정도의 약간의 점성이 있는 것이 바람직하다. 따라서, 인제놀 엔젤레이트를 크림, 겔, 연고 및 페인트의 형태로 제제하는 것이 일반적으로 바람직하다. 인제놀 엔젤레이트의 효능에 따라, 유효 성분의 비율에 따라서, 페인트의 형태로, 소량의 양을 바를 수 있다.

본 발명의 바람직한 제형물에 폴록사머(poloxamers)를 사용할 수 있다. 이것은 2개의 친수성 폴록시에틸렌(phloxyethylene; POE) 분자 사이에 1개의 소수성 폴록시프로필렌(poloxypropylene; POP) 분자로 연결된 코폴리머들이다. 따라서, 이들은 소수성 핵 내에서 친지질성 약물을 용해할 수 있다. 나아가, 폴록사머 계의 수성 겔 제형물는, 약물의 국소적, 지속적 전달에 효과적일 수 있는 열-유동학적(thermo-rheological) 성질을 나타낸다. 임계 미셀 온도(critical micelle temperature:cmt)라고 하는 특정 온도 이상에서는, 폴록사머 겔의 점성은 매우 크게 증가한다. 점성의 증가는 겔에 용해된 약물의 확산을 감소시키는데 이것은 겔에서 약물의 방출의 속도를 낮추고 약물이 지속적으로 전달되도록 한다. 상기 점성의 증가는 활동 부위에서 국소적으로 저장이 지속되도록 하는 역할을 한다.

상기 임계 미셀 온도는 폴록사머 및 프로필렌 글리콜 등과 같은 기타 추가 성분의 농도 등과 같은 여러가지 변수에 따라 달라진다. 이상적인 임계 미셀 온도는 상기 제형물이 액체로 환부에 주사가 가능한 형태(투여의 용이성)로 주입된 후, 신체의 온도에 접촉하면 겔 형태로 형성되어 약물이 국소적, 지속적으로 전달되도록 하는 것이다. USP에 폴록사머 188 및 폴록사머 407을 포함하여 5개의 폴록사머가 개시되어 있다. 폴록사머 188은 IV 제형물의 첨가제로 승인된 것이다 (http://www.accessdata.fda.gov).

폴록사머 겔은 인슐린의 피하 전달(Barichello et al.,1999) 및 경피용 사용을 위한 기타 약물 전달 시스템(Tobiyama et al., 1994)에서 사용되어 왔다. 코폴리머 중에 하나인 폴록사머 407은 인터루킨-2(interleukin-2) 및 인간 성장 호르몬을 포함하는 펩티드 및 치료용 단백질이 천천히 방출되도록 하기 위해 피하로 투여되어 왔다 (Morikawa et al., 1987; Katakama et al., 1997). 투여 후에는 상기 겔은 1~2일에 걸쳐서 포획된 단백질 분자들을 천천히 방출한다. 나아가, 상기 폴록사머의 상당한 비율은 배설을 통해 빠져나간다.

폴록사머(poloxamers)는 통상 무독성이며 자극이 없는 물질로 알려져 있다. 개와 토끼 등의 동물 독성 연구에 의하면, 5~10% w/v 농도로 눈, 잇몸 및 피부에 도포되었을 때 자극이 없고 민감성이 없는 것으로 나타났다. 0.5 g/kg/day 이하의 농도에서, 토끼에 정맥 투여한 14일에 걸친 실험에서, 뚜렷한 부작용은 나타나지 않았다. 개에 대한 유사한 실험에서는 0.5 g/kg/day 이하 투약시에서도 부작용은 나타나지 않았다. 또한, 18시간 동안 25℃의 온도에서, 0.001~10% w/v의 폴록사머 용액에서는 인간 혈액 세포의 용혈 현상(haemolysis)가 관찰되지 않았다 (Wade and Weller, 1994). 그러나, 쥐에서는 폴록사머 407을 복막(IP) 내에 주사했을 때(1.0 g/kg) 고지질혈증(hyperlipidemia)이 나타난 경우가 있다(Wasan et al., 2003).

본 발명에서는 또한 기름(oils)을 사용할 수 있다. 건선(psoariasis)의 치료를 위해 이멀젼을 바탕으로 한 병변 내용 제형물(intralesional formulation)을 사용한 기록이 있다(Ho et al., 1990). 투여하기 전에, 이멀젼을 형성하기 위해 폴리옥시에틸렌 피마자유(polyoxyethylated castor oil) 등의 운반제는 보통 식염수에 희석한다. 그러나, 다른 연구에 따르면 식염수에 Ⅰ3A를 희석시키는 것은 아이소형 'b'에서 'a'로의 전환을 증가시킨다. 상기 전환은 제형물의 도포 시간이 짧으면 최소화할 수 있다.

근육 내 투여(Intramuscular administration:IM)을 위한 유성 용액(oily solutions)로써 제형되는 몇 가지의 친지질성 상품이 있는데, 그 예로는 프롤릭신 에난테이트(Prolixin Enanthate; Bristol Myers Squibb)이 있다.사용되는 운반제(유성)은 아라키스 유(arachis oil;디메르카프롤 주사 B.P용으로 벤질 벤조아트와 함께 사용된다) 및 참기름 (플루페나진 에난테이트[Fluphenazine Enanthate] 주사 B.P의 저장(depot) 주사에 사용) 등과 같은 다양한 식물성유를 사용한다. 올레아긴(oleaginous) 운반제의 사용은 상기 기름에서 분리되어 수성의 체액으로 흡수되는 시간의 지체로 인해 흡수를 느리게 할 수 있다 (Ford, 1987). 유성 형태로 용해된 Ⅰ3A와 같은 비교적 친지질성인 약물을 수성 환경(근육 조직 등의)으로 주입하면, 기름과 분리되지 않고 수성 상태로 '즉시' 분리되는 경향을 보일 것이다. 이런 형태로 지속적인 방출 효과를 형성할 수 있다.

구강 제형물(buccal formulations)로도 적용될 수 있다. 점막층은 비교적 투과가 잘 되어 전신 순환계에 약물이 빨리 흡수되고 일차 통과 대사(first pass metabolism)를 피할 수 있기 때문에, 치료제의 점막 관통 전달은 일반적인 투여 형태이다. 점막 관통용 제품들은 코 또는 경구/구강을 통하여 점액흡착제(mucoadhesives)를 사용하여 투여하도록 조제할 수 있다. 상기 약물 전달 시스템을 개발할 때, 매체/제형물의 점액흡착성(mucoadhesion)은 주요한 요소이다. '점액흡착성(mucohadhesive)'이라는 용어는 생물의 막의 점액층(mucin layer)에 흡착되는 성질의 물질을 지칭하는 용어로 쓰인다. 각기 다른 점막층을 통한 약물의 전신 및 국소적 전달을 위하여 점액흡착성 폴리머들은 여러가지 투약 형태로 사용되어 왔다. 상기 투약의 형태는 알약, 패치, 테이프, 필름, 반고체 및 파우더 등을 포함한다.

점액흡착성 폴리머로 작용하기 위해, 폴리머는 여러 개의 수소와 결합하는 그룹들과 현저히 음이온의 성질을 갖는 등의 물리화학적 성질을 가져야 하고, 점막 조직의 표면을 습윤시키기 위한 적절한 표면을 가져야 하며, 점막 조직 또는 조직의 틈새를 침투하기 위한 충분한 유연성 및 길이(분자량)를 가져야 한다. 카르보머(carbomers; 폴리아크릴릭산), 히드록시프로필 메틸셀룰로오즈(hydroxypropyl methylcellulose; HPMC) 등과 자연적으로 얻을 수 있는 폴리머인 히아루로닉산(hyaluronic acid) 및 키토산 등의 여러가지 종류의 폴리머는 잠재적인 점액흡착성을 갖는 것으로 알려졌다.

당업자는 적절한 제형물의 조제를 할 수 있을 것이며, 상기 제형물에 포함되는 적절한 첨가제는, 예를 들면, 겔화제, 점성화제(viscosifier), 침투 향상제, 항생제 및 항균제 등과 같은 보존제, 및 향 및 착색제 등의 인공 성분 등을 포함한다.

적절한 겔화제(gelling agent)는, 히드록시알킬 셀룰로오즈 폴리머들(예, 히드록시메틸셀룰로오즈, 히드록시에틸셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈 및 히드록시프로필메틸셀룰로오즈 등), 카르복시메틸 셀룰로오즈, 메틸히드록시에틸 셀룰로오즈 및 메틸 셀룰로오즈, 카르보머(예, 카르보폴(carbopol)) 등과 같은 수용성 셀룰로오즈 및 카라기난(carrageenans) 등이 있다. 상기 겔화제는 1~5% (w/w) 등의 모든 적절한 양으로 추가할 수 있다. 바람직한 겔화제는 셀룰로오즈에서 파생된 것으로, 가장 바람직하게는 히드록시알킬셀룰로오즈(hydroxyalkylcellulose), 특히 히드록시에틸셀룰로오즈(hydroxyethylcellulose) 등이 있다.

적절한 보존제는 당업자에게 자명할 것이며, 파라벤(parabens; 메틸, 에틸, 프로필 및 부틸), 벤조산(benzoic acid) 및 벤질 알콜 등을 포함한다. 보존의 목적으로만 첨가된 보존제는 일반적으로 최종 국소용 제형물의 1%(w/w) 또는 그 이하로 형성될 것이다.

적절한 침투 향상제(penetration enhancers)는 이소프로필 알콜, 술폭사이드(sulphoxides; 디메틸술폭사이드, DMSO), 아존(Azones; 예, 라우로카프람(laurocapram)), 피롤리돈(예, 2-피롤리돈), 알카놀(alkanols; 예, 데카놀), 및 글리콜(예, 프로필렌 글리콜) 등을 포함한다.

본 발명에 따른 바람직한 조성물은 다음을 포함한다:

a) Ⅰ3A;

b) 침투 향상제;

c) 보존제;

d) 겔화제; 및

e) 완충제(buffer);

여기서, 상기 조성물은 3~4의 겉보기 pH를 포함한 pH를 갖는다.

특히 바람직한 조성물은 다음을 포함한다:

a) 0.1%(w/w) Ⅰ3A;

b) 30%(w/w) 이소프로필 알콜;

c) 0.9%(w/w) 벤질 알콜;

d) 1.5%(w/w) 히드록시 에틸 셀룰로오즈; 및

e) 67.5%(w/w) 구연산염 완충제 pH3, 바람직하게는 pH 2.75.

본 발명은 다음에 한정되지 않는 실시예들을 참조하여 더 설명될 것이다.

실시예 1

Ⅰ3A의 안정성은 아세톤, 아세토니트릴, 메탄올/물, 물, DMSO, 인산염 완충제(pH 범위 4.5 ~ 7) 및 암모늄 완충제(pH 4.5) 등을 포함하는 다양한 용매 시스템에서 실험되었다. 그 결과, Ⅰ3A는 아세톤, 아세토니트릴, DMSO, 인산염 완충제 (pH 4.5) 및 암모늄 완충제 (pH 4.5)에서 안정적인 것으로 도출되었다. 인제놀 엔젤레이트의 재배열은 이성질체(isomer) 'b'에서 이성질체 'a'로, 그 후, 이성질체 'c'로의 순서로 진행되는 것으로 보였다. 활성 성분을 적은 양으로 사용했기 때문에, 조성물의 안정성 측정은 피크(peak) 'a'의 영역에 대한 피크 'b'의 비율로 측정되었다.

재료

표 1. 실시예에 사용된 재료의 공급업자

재료(Materials)	공급업자(Supplier)
I3A (인제놀 엔젤레이트) 배치 번호(Batch No.) 08042 및 300502	오스트리아, 페플린 리미티드(Peplin Limited, Australia)
베타-시클로덱스트린 술포부틸 에테르, 7 나트륨염(캡티솔^®) 로트 번호 CY-03A-010244(β-Cyclodextrin sulphobutyl ether, 7 sodium salt )(Captisol^®) Lot No. CY-03A-010244)	미국, 시덱스 인코포레이티드(Cydex Incorporated, USA)
2-히드록시프로필-베타-시클로덱스트린 (카바솔^® W7HP) 배치 번호 74BO08미글리올(Miglyl) 810N 로트 번호(Lot. No.) 980404프로필렌 글리콜 배치 번호 286991	독일, 바커-케미에 게엠베하 & 컴퍼니(Wacker-Chemie GmbH & CO.)
미네랄 유 로트 번호 128H0136올레산 배치 번호 9736588428스판(Span) 80 로트 번호 120H0454트윈(Tween) 80 로트 번호 44H0121폴리에틸렌 글리콜 300 로트 번호 60H0463DMSO	영국, 시그마 화학 회사(Sigma Chemical Co., UK)
나트륨 히아루로네이트(HA)배치 번호 kx00282	일본, 교와 하코 제약(Kyowa Hakko Pharmaceuticals)
인산일칼륨(monopotassium phosphate) 배치 번호 14286	영국, 알드리치 화학 회사(Aldrich Chemical CO., UK)
아세트산 암모늄(ammonium acetate) 로트 번호 A147753001빙초산(Glacial acetic acid)	영국, 비디에이치 연구소 공급(BDH Laboratory Supplies, UK)
아세톤-HPLC 등급아세토니트릴-HPLC 등급메탄올-HPLC 등급	영국, 라스번 화학 리미티드(Rathburn Chemicals Ltd, UK)
탈이온수(엘가스탓 옵션 3A)(Deionised water(Elgastat Options 3A))	영국, 엘가 리미티드(Elga Ltd., UK)
파라피름^®	미국, 아메리카 내셔널 캠^TM (America National Cam^TM )

모든 첨가제는 약물 등급(compendial grade)의 Ⅰ3A의 최종 제형물에 사용되었다.

방법

용매/첨가제들 내에서 Ⅰ3A의 안정성 연구

다음의 용매/첨가제들/첨가제 혼합물 내에서 Ⅰ3A의 안정성 연구는 14일에 걸쳐(다르게 언급된 경우를 제외하고) 실내 온도에서 실시하였다:

아세톤

아세토니트릴

메탄올

메탄올/물(70/30)

물

인산염 완충제 pH 4.5, pH 5.5, pH 6.5, pH 7.0

DMSO*

미네랄 유(Mineral oil)

미글리올(Myglyol) 810

폴리에틸렌 글리콜 300

프로필렌 글리콜

올레산

2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린(2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin; Cavasol®/H₂O)

2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린(2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin; Cavasol®/PO₄ pH4.5)

Tween 80/Span 80/H₂O

Tween 80/Span 80/PO₄ pH4.5

β-시클로덱스트린 술포부틸 에테르(β-cyclodextrin sulphobutyl ether; Captisol®)/H₂O**

β-시클로덱스트린 술포부틸 에테르(β-cyclodextrin sulphobutyl ether; Captisol®)/PO₄ pH4.5**

나트륨 히아루로네이트(Sodium hyaluronate; HA)/PO₄ pH4.5***

나트륨 히아루로네이트(Sodium hyaluronate; HA)/H₂O pH4.5***

* 10일 실험

** 7일 실험

*** 2일 실험

아세토니트릴 내에 Ⅰ3A의 원액 0.5 mg/ml를 제제했다. 1.0ml의 부분표본들을 뷰렛으로 각각의 유리 샘플 바이알들에 넣었다. 각 용액들을 에어젯(air jet)으로 건조시킨 후 각각 1.0g의 용매/첨가제/첨가제 혼합물을 바이알들에 추가했다. 0일, 5일, 14일째에, 아래 "DMSO 내에서 안정성"에 설명된 크로마토그라피 조건 하의 HPLC 분석을 위해 안정성 샘플들의 부분표본들을 제거했다. 안정성은 피크 'a'에 대한 피크 'b'의 비율로 표현되었고(또는 피크 'c'), 높은 비율은 특정 첨가제 내에서의 안정성을 나타낸다.

첨가제 내에서의 Ⅰ3A의 안정성에 대한 HPLC 분석

일부 Ⅰ3A의 제제에서 나타난 피크 'b'에서의 "숄더(shoulder)"를 분리하기 위해 다른 HPLC 방법을 개발했다.

상기 첨가제 안정성 연구를 위한 크로마토그라피 조건은 다음과 같다:

컬럼(column): Hypercarb (ThermoQuest, Phenomenex)

(S/no.3-34070)

컬럼 길이: 100 x 4.60mm

컬럼 온도: 25℃

가드 컬럼(Guard column): C18 Columbus (Phenomenex)

(S/no. 202678)

가드 컬럼 길이: 50 x 4.60mm

이동상(Mobile phase): 50% v/v 인산염 완충제 pH 4.5 / 50%v/v 아세토

니트릴

유량: 1.0 ml/min

UV 파장: 230nm

주입 용량: 10μl

시간: 35 분

예비 생체 외( in vitro ) 확산 연구

첨가제 및 침투 향상제 내에서의 Ⅰ3A의 안정성이 성립되면, Ⅰ3A의 각질층(stratum corneum)의 투과율을 결정하기 위하여 간단한 제형물로 예비 생체 외 확산 실험을 실시할 수 있다. 피부의 생리적 및 해부학적 조건과 유사하게 인시츄(in situ)로 프란츠 확산 셀을 조성한다. 이것은 도너(donor) 부분, 리셉터(receptor) 부분, 및 측지 샘플링 부분(side arm sampling port)을 포함하는 기체/액체 단계 고정 셀(static cell)이다 (도 1 참조). 두 부분의 사이에 외과적으로 절제한 피부를 고정하는데, 약물을 도포할 수 있도록 각질층이 도너 부분을 향하게 한다.

미글리올(miglyol) 내에서 Ⅰ3A의 단일 제형물(simple formulation)을 사용한 첫 번째 생체외(in vitro) 확산 실험을 실시했다. 이 실험에서 각질층 전반에 걸쳐 약물이 전혀 침투되지 않았다. 이것은 Ⅰ3A가 미글리올 내에서 최대의 열역학 활동(thermodynamic activity)에서 제형되지 않았다는 것을 의미한다. 상기 제형물은 후의 다른 확산 셀 실험에서 대조군으로 사용되었고, 상기 제형물에서 약물의 확산이 전혀 없었다면 각질층이 손상되지 않고 그대로 있다는 것을 추정할 수 있으므로, 각질층의 보존을 확인하는데 사용했다.

제형물의 제조

인산염 완충제(pH 4.5) 내에 Ⅰ3A의 제형물을 제제하고, 용해성 및 안정성, 그리고 약물의 유량을 증가시킬 목적으로 β-시클로덱스트린(Captisol®)을 추가하였다. 비교를 위하여 알려진 침투 향상제인 DMSO 내에 제제한 제 2 제형물을 제제하고, 또한 대조군으로 미글리올 용액 제형물을 제제했다. 상기 제형물들의 각질층에 대한 Ⅰ3A의 확산을 검토했다.

다음 제형물들을 제제했다:

제형물 설명

1 Ⅰ3A/Captisol® (30mM) / 인산염 완충제 pH 4.5

2 Captisol® (30mM) / 인산염 완충제 pH 4.5 대조군

3 Ⅰ3A / 미글리올

4 미글리올 대조군

5 Ⅰ3A / DMSO / 인산염 완충제 pH 4.5

6 DMSO / 인산염 완충제 pH 4.5 대조군

표 2는 제형물들에 포함된 각 성분들의 % w/w를 나타낸다. 상기 성분들은 중량을 정확히 측정하여 밀봉이 가능한 유리 바이알들에 넣고 실내 온도에서 몇 시간 동안 자석 교반 막대로 잘 교반시켰다.

표 2. 생체 외( in vitro ) 확산 연구를 위한 Ⅰ3A의 제형

제형물	Ⅰ3A(300502)		Captisol® (30mM)		PO₄ 완충제		미글리올		DMSO		총계
제형물	질량(g)	% w/w	질량(g)	% w/w	질량(g)	% w/w	질량(g)	% w/w	질량(g)	% w/w%	질량(g)	% w/w
1	0.0016	0.08	0.1299	6.54	1.8956	95.38	-	-	-	-	1.9875	100.00
2	-	-	0.1301	6.05	2.0203	93.95	-	-	-	-	2.1504	100.00
3	0.0016	0.08	-	-	-	-	2.0128	99.92	-	-	2.0144	100.00
4			-	-	-	-	2.0000	100.00	-	-	2.0000	100.00
5	0.0017	0.08	-	-	0.4035	20.04	-	-	1.6080	79.87	2.0132	100.00
6			-	-	0.4112	20.13	-	-	1.6320	79.87	2.0432	100.00

리시버 용액( receiver fluid ) 선택

본 연구에서 침투 조건을 유지하기 위해 사용된 리시버 용액은 PO₄ 완충제(pH 4.5) 내의 2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린(Cavasol, 1.38mM)을 사용했다. 에탄올/물 시스템과 같은 기타 보존액(reservoir fluids)은 에탄올이 각질층을 통하여 역확산되어 상기 제형물 내에 존재하는 Ⅰ3A의 특성이 저하될(degraded) 수 있기 때문에 제한되었다.

피부 제제

복강형성술(abdominoplasty) 직후에 외과적으로 절제한 사람의 피부를 마련했다. 제공자는 56세의 여성 유럽 백인 비흡연자였다. 피하층 지방은 포셉 및 스칼펠로 피부 샘플에서 제거하고, 피부 조각은 45초 동안 60℃의 물에 담그었다. 상기 피부 조각은 코르크 보드에 진피층(dermis)을 아래쪽으로 하여 핀으로 고정하고 표피층(epidermis; 각질층 및 생육 가능한 표피층 포함)을 진피층으로부터 제거했다. 진피층은 폐기하고 표피막은 물의 표면에 부유(浮遊)하게 한 후 Whatman no. 1 필터 종이에 놓았다. 상기의 결과물인 표피막을 완전히 건조시키고 사용 시까지 -20℃의 온도에서 알루미늄 포일에 납작하게 보관했다.

상기 표피막의 일부(필터 종이 부분을 위로)를 고정시킨 후 0.1% w/v 트립신 용액(trypsin solution)에 담궈 4℃에서 4시간 동안 배양했다. 상기 피부 조직을 37℃에서 1시간 동안 더 배양했다. 클램프를 천천히 수평으로 흔들어서 각질층을 물리적으로 제거했다. 효소 작용을 막기 위해 그 결과물인 각질층을 탈이온수에 2회, 그리고 0.1%w/v의 항-트립신 용액에 세척한 후, 다시 탈이온수로 2회 세척했다. 상기 각질층은 건조시켜 사용시까지 -20℃에서 알루미늄 포일에 납작하게 보관했다.

프란츠 셀 확산 연구

확산 실험을 위하여, 평균 확산 표면적을 0.56±0.05cm² 및 평균 리시버의 부피를 1.79±0.06ml로 각각 조정한 프란츠 확산 셀들을 사용했다. 위에 설명한 대로 마련한 각질층을 인산염 완충제(pH 4.5)로 세척하고, 10^μ의 송곳으로 뚫은 후, 프란츠셀들에 놓았다(도 1 참조). 사용한 리시버 용액은 2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린(Cavasol®) / 인산염 완충제(pH 4.5)이고 이것을 프란츠셀에 넣고, 지속적으로 자석 막대로 교반시키고 37℃로 유지했다. 상기 막들은 제형물들에 도포하기 전에 리시버 상(phase)에서 30분 동안 평형에 이르도록 했다. 각 제형물의 무한정의 도즈(infinite dose)를 각 막의 표면에 포지티브 여과(positive displacement) Finpipette®을 사용하여 적용하고 도너 챔버들은 파라필름(Parafilm®)으로 둘러쌌다. 5회의 시간에 샘플을 관찰했는데 (1,2,4,6 및 24시간에) 프란츠 셀의 막대에서 200㎕의 리시버 용액을 조심해서 제거하고, 제거한 각 샘플만큼 동일한 부피의 새로운 리시버 용액(37℃)으로 대체했다. 실험 전반에 걸쳐서, 프란츠셀에서 증발로 인한 리시버 용액의 양은 다시 채워넣어 일정한 부피를 유지했다. 샘플들은 HPLC(supra)로 분석했다.

생체 외( in vitro ) 확산 연구를 위한 HPLC 분석

사용된 크로마토그라피 조건은 다음과 같았다:

컬럼(column): Hypercarb (ThermoQuest, Phenomenex)

(S/no.3-34070)

컬럼 길이: 100 x 4.60mm

컬럼 온도: 25℃

가드 컬럼(Guard column): C₁₈ Columbus (Phenomenex)

(S/no. 202678)

가드 컬럼 길이: 50 x 4.60mm

이동상(Mobile phase): 50% v/v 인산염 완충제 pH 4.5 / 50%v/v 아세토 니트릴

유량: 1.0 ml/min

UV 파장: 230nm

주입 용량: 10μl

시간: 35 분

결과

용매 및 첨가제 내에서 Ⅰ3A의 안정성

아래 표 3은 여러 가지 용매 시스템 내에서 Ⅰ3A의 안정성을 나타낸다. 14일(다른 언급이 없는 한)이 지난 후에 실내 온도에서 용매 및 첨가제 내에서의 Ⅰ3A의 안정성은, 안정성과 동일시되는 'b'의 지배도(predominance)에 비례하는 아이소형 'a' 및 'c'에 대한 아이소형 'b'의 비율로 환산된다. 그 결과는 표 3에 정리되어 있다. Ⅰ3A가 안정적이지 않은 다른 첨가제는 적절하지 않은 것으로 추정된다.

표 3. 다양한 용매 및 첨가제 내에서의 Ⅰ3A의 안정성 결과

* 10일 실험

** 7일 실험

*** 2일 실험

예비 생체 외( in vitro ) 확산 연구

표 4는 단위 면적당 투과된 Ⅰ3A의 누적량에 의해 결정된 Ⅰ3A의 제형물들의 유량을 비교한 것이다. DMSO는 가장 먼저 그리고 가장 많이 연구되는 투과 향상제이며, 생체 외(in vitro)와 생체 외 실험에서 많은 약물들의 경피를 통한 투과를 향상시키는 것으로 나타났다. 따라서, DMSO는 Ⅰ3A의 각질층의 투과를 확인하는데 유용한 비교물질 첨가제(comparator excipient)이다. 그러나, 상기 용매의 높은 독성과 피부에 비가역성 손상을 주는 것 때문에 DMSO는 최종 제형물에서 사용되지 않는다. 미글리올 제형물에서는 Ⅰ3A의 투과를 보이지 않았다. 미글리올 내에서 각질층에 대해 Ⅰ3A가 확산이 되지 않는 현상은 Ⅰ3A는 상기 첨가제에 용해도가 높기 때문이다.

표 4. 단위면적당 투과된 I3A 의 누적량으로부터 결정된 I3A 의 제형제의 유량 비교(평균±s.e.m, 각각 n=3 및 4)

제형물	(μg/cm₂/h)
Ⅰ3A/Captisol®/ 인산염 완충제 pH 4.5Ⅰ3A/DMSO/인산염 완충제 pH 4.5	1.92±1.020.61±0.13

상기 결과는 Ⅰ3A가 각질층 전반에(각질층은 대부분의 약물의 투과에 대해 주로 장벽을 형성한다) 가시적인 레벨로 확산되는 것을 보여준다.

4-8℃에서 안정성 연구

4-8℃에서 여러 가지 용매들에서의 Ⅰ3A의 안정성을 실험했다. 1.26mg의 Ⅰ3A의 원액의 중량을 측정하여 2ml의 아세톤에 용해시켰다. 안정성 실험용 샘플을 제제하기 위해 다음과 같이 상기 원액을 사용했다:

100μm의 원액의 부분표본을 해밀턴 주사기를 사용하여 각 HPLC 유리 바이알들에 넣었다. 각 샘플에 주사할 때 주사기를 주의하여 세척하고 건조시켰다. 상기 샘플들은 에어젯(air jet)으로 건조시키고 0.5ml의 적절한 실험용 용매 시스템을 첨가했다. 상기 용매 시스템 3개를 제제하여 실험했고 아래와 같다:

1. 100% v/v 아세톤

2. 100% v/v 아세토니트릴

3. 100% v/v 메탄올

4. 70% v/v 메탄올: 30% w/w 물

5. 100% w/w 물

상기 원액 대신에 100μl의 아세톤을 사용하여 3개의 블랭크 샘플(blank sample)을 제제했다. 상기 블랭크 샘플들은 건조시키고 0.5ml의 아세톤을 각 바이알에 첨가했다. 상기 바이알들을 모두 파라필름®으로 압착하여 밀봉하고, 안정성 실험 전체 시간 동안 4-8℃의 온도에 두었다. HPLC 분석은 안정성 연구의 0일, 1일, 5일 및 14일째 날에 샘플들에 대해 실시했다. HPLC 분석을 위해 상기 샘플들은 다음과 같이 제제했다:

상기 안정성 실험 샘플들을 4-8℃의 온도에서 꺼내어 30분간 실내 온도에 두었다. 100㎕의 부분표본을 해밀턴 주사기를 사용해 새로운 HPLC 유리 바이알들에 옮겼다. 각 샘플에 주사할 때 주사기를 주의하여 세척하고 건조시켰다. 샘플들을 건조시키기 위해서, 0.5ml의 아세톤을 각 바이알에 추가하고 각 샘플들을 에어젯으로 건조시켰다. 상기 샘플들은 1ml의 아세토니트릴에 다시 넣어서 위에 설명된 크로마토그라피 조건 하에 HPLC로 분석했다.

따라서, 14일 동안 아세톤과 아세토니트릴에서 피크 'b'가 대부분 유지된 것으로 보아 Ⅰ3A는 4-8℃의 아세톤과 아세토니트릴에서 안정적이다. 양성자성 용매에서는 이성질체 'a'의 형성 후 이성질체 'c'의 형성이 급격히 증가했다.

다양한 pH 에서의 안정성

pH 4.5에서 Ⅰ3A의 안정성을 2개의 완충제에서 실험했다. 두 가지 완충제들은 모노포타슘 포스페이트/디소디움 포스페이트(monopotassium phosphate/disodium phosphate) 및 아세트산/암모늄 아세테이트이고 이들을 24시간 동안 실내온도에서 실험했다. HPLC 분석에 따르면 Ⅰ3A는 pH 4.5에서 상기 두 가지 완충제에서 모두 안정적이었다. 즉, 24시간 이후에도 아이소형 'b'(도 1)가 주로 나타났다.

Ⅰ3A의 안정성은 14일 동안 실내 온도에서 pH 5.5, 6,5, 및 7.0에서 실험했다. 안정성은 pH가 증가할수록 안정성이 감소하는 것으로 나타났는데 즉, 14일째에 아이소형 'a' 형성 후 아이소형 'c' 형성이 되었다.

DMSO 에서의 안정성

10일에 걸쳐 각각 실내온도와 37℃에서 DMSO 내에서의 Ⅰ3A의 안정성을 연구했다. 아세토니트릴 내에서의 Ⅰ3A의 대조군 샘플을 실험 샘플과 동일한 조건 하에 두었다. 상기 샘플들은 실험 시작 시간(0일), 48시간 후(2일) 및 10일 후에 다시 HPLC 분석을 실시하였다.

크로마토그라피 조건은 다음과 같다:

컬럼(column): Hypercarb (ThermoQuest, Phenomenex)

(S/no.3-34070)

컬럼 길이: 100 x 4.60mm

컬럼 온도: 25℃

가드 컬럼(Guard column): C₁₈ Columbus (Phenomenex)

(S/no. 202678)

가드 컬럼 길이: 50 x 4.60mm

유량: 1.0 ml/min

UV 파장: 230nm

주입 용량: 10μl

시간: 35 분

정체 시간(retention time):15분, 24분

Ⅰ3A는 10일 동안 각각 실내온도와 37℃에서, DMSO 내에서 안정적인 것으로 보인다.

실시예 2

pH 6.5 이소프로파놀 겔( Isopropanol gel )

이소프로파놀 겔 제제(pH 6.5) 내에서의 Ⅰ3A 'b'의 안정성을 연구했다. 프로토콜은 다음과 같다:

이소프로파놀 겔(pH 6.5)의 조성

첨가제	목표 질량	실제 질량	% w/w
글리세린	5.0000g	5.0000g	5.02
시클로메티콘(Cyclomethicone)	0.5000g	0.5000	0.50
이소프로필 알콜	25.0000g	25.0000g	25.10
카르보폴(Carbopol®) 934	0.3000g	0.3018g	0.30
프로필 알콜	25.0000g	25.0000g	25.10
물	43.7000g	43.7000g	43.87
에탄올아민	pH 6.5 까지	0.1000g	0.10
합계			100

상기 카르보폴®은 물과 글리세린에 분산시켜서 물의 수조에서 40℃로 가열하여 용해시켰다. 그 후 상기 프로필 알콜을 상기 용액에 추가했다. 상기 시클로메티콘을 상기 이소프로필 알콜에 용해시킨 이 제2 용액을 카르보폴® 용액에 잘 혼합한 후에 100%가 될 때까지 물을 더 추가한다. 상기 겔에 에탄올아민을 한 방울씩 추가하여 pH가 6.5가 되도록 한다. 상기 이소프로파놀 겔은 사용 시까지 2-8℃로 보관한다.

이소프로파놀 겔(pH 6.5) 내에서의 Ⅰ3A 'b'의 안정성을 조사하기 위하여, 0.02%(w/w)의 Ⅰ3A 'b'/이소프로파놀 겔 제형물을 제제하여 각각 3개의 샘플로 나누어 각각 2-8℃, 실온(RTP), 및 40℃에서 보관한다. 일정한 시간 간격으로 상기 샘플들의 안정성, 즉 Ⅰ3A 'b'에서 아이소형 'a'가 형성되는지 2회로 분석했다. 그 결과는 도 2에 나와 있다. Ⅰ3A 'b'는 아이소형 'a'으로 재배열된 후 다시 아이소형 'c'로 형성되었다. 상기 Ⅰ3A 'b'가 아이소형 'a' 및 'c'으로 전환되는 것은 더 높은 pH 및 이소프로파놀 겔에 존재하는 물 때문일 수도 있다.

30% w/w 이소프로파놀 알콜 /구연산염 완충제 pH 3.0 내에서의 Ⅰ3A ' b'

2-8℃ 및 40℃에 보관되었을 때 30% w/w IPA/구연산염 완충제(pH 3) 내에서의 Ⅰ3A 'b'의 안정성은 2회로 실험했다. 그 결과는 도 3에 나와 있다.

보존제

보존제 효능 테스트를 통과할 수 있는 농도의 다양한 보존제들이 Ⅰ3A 'b'의 제형물에서 사용하기에 적절한지 여부를 연구했다. 먼저 보존제들을 구연산 완충제(pH 3)에 제제하고 크로마토그램에서 Ⅰ3A 아이소형의 분석에 방해가 될 수 있는 피크(peaks)를 체크하기 위해 HPLC 분석을 실시했다. 그 결과는 표 5에 정리되어 있다.

표 5. 보존제들의 HPLC 분석

보존제	% w/w	코멘트
벤질 알콜	1.0	방해 피크는 없다
메틸 파라벤(M.P.)	0.2	아이소형'a' 영역 상에 큰 피크 형성
프로필 파라벤(P.P.)	0.02	아이소형'a' 영역 상에 큰 피크 형성
M.P./P.P.	0.2/0.02	아이소형'a' 영역 상에 큰 피크 형성
펜옥시에탄올(Phenoxyethanol)	1.0	아이소형'a' 영역 상에 작은 피크 형성
구연산염 완충제 대조군(Citrate buffer control)	0	방해 피크는 없다.

보존제의 크로마토그램에서의 방해 피크가 많으면 제형물 내에서의 약물의 분석하는데 어려움이 생기고, 보존제들 각각의 분리된 분석이 필요하게 될 수 있으므로, 방해 피크가 많은 것은 바람직하지 않다.

Ⅰ3A 'b'(0.05% w/w)를 각각 2-8℃, 실온, 및 40℃에서 보관된, 선택된 보존제들(벤질 알콜 및 펜옥시에탄올)에 용해시킨 후, 아이소형 'a'가 형성되는지 일정 간격으로 2회 안정성을 체크했다. 상기 안정성 연구의 결과는 도 4 및 5에 나와 있다.

상기 결과에 따르면 벤질 알콜이 가장 적절한 보존제인 것으로 나타났다.

Ⅰ3A ' b' 제형물의 제제

다음 3개의 제형물들과 각기 대응하는 플라시보들을 제제했다:

A. 1.0%(w/w)의 벤질 알콜을 보존제 사용한 0.1%(w/w) Ⅰ3A 'b'/매크로세틸 에테르 크림(macrocetyl ether cream)

B. 1.0%(w/w) Ⅰ3A 'b' / 30%(w/w)IPA / 1.5%(w/w) HEC / 1.0%(w/w) 벤질 알콜/ 구연산 pH3

C. 1.0%(w/w) Ⅰ3A 'b' / 9.5%(w/w) 시클로메티콘/ 9.5%(w/w) IPM / 1.0%(w/w) 벤질 알콜/ 엘라스토머(Elastomer) 10

Ⅰ3A 'b'의 원액을 벤질 알콜(표 6)에 제제하고 상기 원액을 제형물을 제제하는데 사용했다. 플라시보는, Ⅰ3A 'b'/벤질 알콜 원액 대신에 벤질 알콜을 단독으로 사용했다. Ⅰ3A 'b' 제형물들의 구성 성분의 정확한 질량은 표 7~9에 나와 있다. 상기 제형물들과 대응하는 플라시보들은 다음과 같이 제제했다:

제형물 A: Ⅰ3A ' b' / 매크로세틸 에테르 크림

매크로세틸 에테르 크림 유화(emulsifying) 연고를 유리 바이알에 정확한 중량을 측정하여 넣고 60℃의 물 수조에 용해시켰다. 새로운 구연산염 완충제(pH 3)를 정확히 측정하여 다른 유리 바이알에 넣고, 물 수조에서 따뜻하게 가열한 후 식을 때까지 계속 저어서 녹은 유화 연고에 천천히 넣었다. 이 과정으로 매크로세틸 에테르 크림이 생성된다. 상기 제형물을 제조하기 위하여, 벤질 알콜내의 Ⅰ3A 'b' 를 정확히 측정하여 유리 바이알에 넣고 상기 매크로세틸 에테르 크림을 정확히 측정하여 계속 저으면서 천천히 추가했다.

제형물 B: Ⅰ3A ' b' / 30% IPA 겔

상기 Ⅰ3A 'b' / 벤질 알콜을 정확히 측정하여 유리 바이알에 넣었다. 나머지 성분들은 정확히 측정하여 상기 용액에 IPA, 구연산염 완충제, 그리고 HEC의 순서로, 각각 추가하는 사이에 격렬히 저으면서 추가했다.

제형물 C: Ⅰ3A ' b' / 유기 규소 중합체( silicone )

Ⅰ3A 'b' / 벤질 알콜을 정확히 측정하여 유리 바이알에 넣었다. 나머지 성분들은 정확히 측정하여 상기 용액에 엘라스토머 10, 시클로메티콘, 그리고 IPM의 순서로, 각각 추가하는 사이에 격렬히 저으면서 추가했다.

제형물 분석

상기 제형물들 내에서 Ⅰ3A 'b'(w/w)의 농도를 확인하기 위해서 연구의 초기에 분석했고 그 농도는 약 0.1%(w/w) Ⅰ3A 'b'인 것으로 나타났다. 상기 전체 Ⅰ3A 'b' 내용물 중에서 제형물 내에 0.7% 이하의 아이소형 'a'가 존재했고 아이소형 'c'는 존재하지 않았다. 상기 제형물들은 연구의 마지막에 아이소형 'a'가 나타나는지 체크했고 2~8℃에서 보관했을 때 0.3% 이하의 아이소형 'a'가 나타났다. 아이소형 'c'는 상기 모든 제형물들에서 검출되지 않았다.

표 6. Ⅰ3A ' b' 의 원액 / 벤질 알콜

	목표 질량v	실제 질량	% w/w
Ⅰ3A 'b'(Batch No.240902)	0.0650g	0.0650g	0.15
벤질 알콜	0.6500g	0.6547g	99.85
총계:	0.7150g	0.7197g	100.00

표 7. 제형물 A

	제형물			플라시보
베이스 크림용 첨가제	목표 질량	실제 질량	% w/w	목표 질량	실제 질량	% w/w
매크로세틸 에테르 유화 연고	7.5000g	7.5015g	30.00	6.0000g	6.0589g	30.50
구연산염 완충제	17.5000g	17.5030g	70.00	13.8000g	13.8049g	69.50
총계:	25.0000g	25.0045g	100	19.8000g	19.8638g	100
매크로세틸 에테르 베이스 크림	19.8000g	19.8860g	98.96	19.8000g	19.8638g	98.99
Ⅰ3A'b'/벤질 알콜	0.2000g	0.2088g	1.04	0	0	0
벤질 알콜 단독	0	0	0	0.2000g	0.2020g	1.01
총계:	20.0000g	20.0948g	100.00	20.0000g	20.0658g	100.00

표 8. 제형물 B

	제형물			플레시보
첨가제	목표 질량	실체 질량	% w/w	목표 질량	실제 질량	% w/w
Ⅰ3A'b'/벤질 알콜	0.2000g	0.2035g	1.00	0	0	0
벤질 알콜 단독	0	0	0	0.2000g	0.2019g	1.01
IPA	6.0000g	6.0027g	29.97	0.6000g	6.0002g	29.99
구연산염 완충제 pH 3	13.5000g	13.5158g	67.49	13.5000g	13.5018g	67.49
HEC	0.3000g	0.3040g	1.52	0.3000g	0.3029g	1.51
총계:	20.0000g	20.0260g	100	20.0000g	20.0068g	100

표 9. 제형물 C

	제형물			플라시보
첨가제	목표 질량	실제 질량	% w/w	목표 질량	실제 질량	% w/w
Ⅰ3A 'b'/벤질알콜	0.2000g	0.2011g	1.00	0	0	0
벤질 알콜 단독	0	0	0	0.2000g	0.2109g	1.05
시클로메티콘	1.9000g	1.9040g	9.51	1.9000g	1.9026g	9.49
IPM	1.9000g	1.9068g	9.53	1.9000g	1.9156g	9.56
엘라스토머 10	16.0000g	16.0026g	79.96	16.0000g	16.0099g	79.89
총계:	20.0000g	20.0145g	100	20.0000g	20.0390g	100

72시간 동안 분석 용매 시스템 내에서의 Ⅰ3A 아이소형의 안정성

72시간에 걸친(장시간의 HPLC 분석 실험 동안 오토샘플러(autosampler)에 샘플들을 가능한 최대 시간 동안 둘 수 있다) 3개의 샘플 시스템 내에서의 Ⅰ3A의 아이소형 'a','b', 및 'c'의 안정성을 실험한 결과는 다음과 같다. Ⅰ3A의 3가지 아이소형의 표준들을(약 100μg/ml) 새로운 아세토니트릴, 아세토니트릴/구연산염 완충제(pH3), 및 아세토니트릴/암모늄 아세테이트 완충제(pH 4.5)에 제제하여, 즉시 HPLC내온도, 및 40℃에서 72시간 동안 둔 후, 다시 HPLC로 분석했다. 이 실험의 결과는 표 10에 나와 있다. 실내온도에서 Ⅰ3A 'b'의 아이소형 'a'의 전환은 100% v/v 아세토니트릴 내에 샘플을 넣었을 때 발생했고 아세토니트릴/구연산염(pH3) 내에서의 Ⅰ3A 'b' 표준은 40℃의 온도에서도 아이소형 'a'로의 전환은 매우 적게 나타났다. 이것은 이 용매 시스템이 샘플링 시간 동안 안정적으로 유지하는데 가장 적합한 것일 수 있다는 것을 나타낸다.

표 10. 각기 다른 용매 시스템 내에서 아이소형 ' a' ,' b' , 및 ' c' 의 안정성

아세토니트릴
	아이소형 'a'	아이소형 'b'	아이소형 'c'
시간	%'a' %'b' %'c'	%'a' %'b' %'c'	%'a' %'b' %'c'
072시간/ 2~8℃72시간/ RTP72시간/ 40℃	96.82 2.24 0.2990.63 5.71 2.5586.58 7.8 3.6516.36 47.01 35.74	0.39 99.27 03.94 95.45 05.83 93.51 015.52 83.35 0	1.28 0.41 97.301.62 0 96.691.55 0.27 97.190.6 0 97.09

아세토니트릴 /나트륨 아세테이트 완충제( pH 4.5)
	아이소형 'a'	아이소형 'b'	아이소형 'c'
시간(h)	%'a' %'b' %'c'	%'a' %'b' %'c'	%'a' %'b' %'c'
072시간/ 2~8℃72시간/ RTP72시간/ 40℃	96.65 2.16 0.2396.47 2.83 095.25 4.22 082.51 16.62 0	0.34 98.88 0.010.63 99.02 01.16 98.41 06.35 93.13 0	1.34 0.45 97.021.41 0.27 97.170.83 0 97.970 0 97.75
아세토니트릴 /구연산염 완충제 ( pH 3)
	아이소형 'a'	아이소형 'b'	아이소형 'c'
시간	%'a' %'b' %'c'	%'a' %'b' %'c'	%'a' %'b' %'c'
072시간/ 2~8℃72시간/ RTP72시간/ 40℃	97.91 1.63 098.31 1.46 098.84 1.08 098.13 1.79 0	0.13 99.64 00.18 99.49 00.13 99.76 00.34 99.63 0	1.12 0.20 98.410.87 0.16 98.840.53 0 99.24 0 0 98.7

실시예 3

IPA 겔 내의 Ⅰ3A 'b'와 pH 2.5에서 4.0 사이의 구연산염 완충제를 함께 제제하여 2~8℃와 40℃에서 pH 안정성 연구를 실시했다 (가속된(accelerated) 안정성).

재료

Materials: 재료, Supplier: 제조사, Sodium dihydrate citrate: 구연산 이수화물 나트륨, Citric acid monohydrate: 구연산 일수화물, Sodium acetate: 초산 나트륨, Benzyl alcohol: 벤질알콜, Isopropyl alcohol: 이소프로필 알콜, Natrosol: 나트로졸, Deionized water: 탈이온수

방법

Ⅰ3A 'b' 겔 및 플라시보들을 pH 2.5 ~4.0의 구연산염 완충제를 사용하여 제제했다.

pH 범위 안정성 연구를 위해 제제한 활성 및 플라시보 IPA 겔의 조성물들은 표 11 및 12에 각기 나와 있다. 시간 0(Time 0)에 플라시보 겔의 pH를 측정하기 위하여 많은 양의 플라시보를 제제했다. 연구용 약물의 양은 한정되었기 때문에 더 적은 양의 활성 겔 분량들, 즉, 각 30g가 제제되었다. 이전에 실시한 플라시보와 활성 겔의 겉보기 pH를 12개월에 걸쳐 모니터링하는 Ⅰ3A IPA 겔에 대한 안정성 연구에서 둘 사이에 별다른 차이점이 없는 것으로 나타났다. 나아가, 상기 활성 및 플라시보 겔에서 동일한 겉보기 pH가 측정되었다. 따라서, 상기 안정성 연구를 시작할 때 상기 겔들의 겉보기 pH를 결정하기 위해 플라시보 겔의 pH만을 측정했다. 상기 겔들을 하룻밤 동안 건조시킨 후, T=0 시점에 분석하고 플라시보들의 pH 수치들을 측정했다. 상기 샘플들은 다른 시점에서 샘플링할 때 물질들의 온도의 순환(cycling)을 피하기 위해 7ml 소다 유리 바이알들에 동일한 분량으로 나누고 상기 바이알들을 각각 2~8℃ 및 40℃(가속된 안정성)에서 두었다.

표 11. 활성 IPA 겔들과 pH 범위 2.5~4.0의 구연산염 완충제의 조성물

Excipient: 첨가제, Target mass: 목적 질량, Citrate buffer: 구연산염 완충제, Actual % w/w: 실제 질량 %

표 12. 플라시보 IPA 겔들과 pH 범위 2.5~4.0의 구연산염 완충제의 조성물

pH 2.5~4.0의 구연산염 완충제를 사용하여 IPA 플라시보 겔의 겉보기 pH를 측정했다.

pH 2.5~4.0의 구연산염 완충제를 사용하여 제제한 IPA 플라시보 겔들의 겉보기 pH를 Jenway 3320 pH 미터를 사용하여 측정했다.

IPA 겔들에서 추출한 Ⅰ3A

다음과 같이 IPA 겔들에서 약물을 추출했다. 상기 각 겔들 또는 그에 해당하는 플라시보들의 1그램을 정확히 측정하여 2 또는 3회에 걸쳐 10ml의 부피 측정 플라스크에 넣었다. 상기 샘플들은 먼저 보텍스 믹서에 최대 속도로 격렬히 그리고 반복적으로 교반하여 1ml의 구연산염 완충제(pH3)와 혼합했다. 그리고 오비탈 교반기(orbital shaker)에서 400rpm에서 30분간 교반 상태로 두었다. 상기 부피 측정 플라스크들에 HPLC-그레이드 아세토니트릴을 부피 표시까지 넣은 다음 샘플들을 다시 보텍스 믹서에 최대 속도로 격렬히 그리고 반복적으로 교반시켰다. 그 후 400rpm에서 60분간 오비탈 교반기에 교반 상태로 두었다. 부분표본들을 분석을 위해 HPLC 바이알들에 이동시켰다.

겔에서 추출한 Ⅰ3A는 각각 3개씩 각각 시간 0(Time 0) 및 3개월 시점(2~8℃ 샘플)에 2번 주사기로 추출했다. 그리고 2개씩 각각 1주 시점 및 4주 시점(40℃ 샘플)에 2번 주사기로 추출했다.

HPLC 분석

다음 시스템과 환경 하에서 분석을 실시했다:

기구들

Water Alliance 2695 분리 모듈(Water Alliance 2675 Separations Module; S/no. B98SMM4209M)

Water 2487 Dual λ 흡수 디텍터(Water 2487 Dual λ Absorbance detector; S/no. M97487050N)

Water Alliance 2695 D 분리 모듈(Water Alliance 2695 D Separations Module; S/no. G98SM8039N)

Water 2487 Dual λ 흡수 디텍터(Water 2487 Dual λAbsorbance detector; S/no. L02487106M)

Empower Pro Empower ^TM 소프트웨어

적용한 크로마토그라피 조건은 다음과 같다:

컬럼(column): Hypercarb (ThermoQuest, Phenomenex)

S/no.3-34070 및 S/no. 1034024A

컬럼 길이: 100 x 4.60mm

컬럼 온도: 실내 온도

가드 컬럼(Guard column): C₁₈ Columbus (Phenomenex)

S/no. 202678 및 S/no. 74554-7

가드 컬럼 길이: 50 x 4.60mm

이동상(Mobile phase): 50% v/v 나트륨 아세테이트 완충제 pH 4.5 / 50% 아세토니트릴 (v/v)

유량: 1.0 ml/min

UV 파장: 230nm

주입 용량: 30μl

시간: 35 분

오토샘플러 온도: 8℃± 2℃

정체 시간: 13분±2분 아이소형 'a';

22분±2분 아이소형 'b';

23분±2분 아이소형 'c';

0.93±0.02의 아이소형 'b'은 상대적 정체 시간 동안에 특정한 피크가 주어지지 않았다.

결과

시간 0(Time 0) 시점에서 플라시보 겔들의 겉보기 pH(apparent pH)의 측정

플라시보 겔들의 겉보기 pH의 측정 결과는 표 13에 나와 있다. 안정된 시점에서는 pH 측정을 하지 않았다.

표 13. 플라시보 IPA 겔들(n=1)의 가시적 pH 의 측정

활성 겔에서의 Ⅰ3A 아이소형들의 피크 순도 백분율( percentage peak purities) 결정

각각 안정성 실험 초기(T=0), 40℃에서 1주일 보관 후, 40℃에서 4주 보관 후, 및 2~8℃에서 3개월 보관 후의 활성 겔 내의 Ⅰ3A 'b'의 백분율 피크 순도는, 차례로 표 14, 15, 16, 및 17에 나타나 있다. 28℃에서 3개월 보관 후의 모든 겔들의 Ⅰ3A 'b'의 피크 순도 백분율은 98% 이상이었고 아이소형 'a'의 피크 순도 백분율은 1.2%이하였다. 40℃에서의 가속된 안정성 연구에서, 4주가 지난 후 'b'의 피크 순도 백분율이 가장 많이 감소한 것은 4.74의 가시적인 플라시보 수치의 겔이었다. Ⅰ3A 'b'가 아이소형 'a'로 전환되므로, 아이소형 'a'의 형성 또한 안정성의 표지로 관찰되었다. 40℃에서 1주 및 4주 보관 후에 0시간에 아이소형 'a'의 피크 순도 백분율의 증가, 그리고 2~8℃에서 3개월 보관 후에 피크 순도 백분율의 증가를 측정했고 그 결과는 표 18에 나와 있다.

표 14. 시간 0( Time 0) 시점에서 활성 겔 내에서 Ⅰ3A의 아이소형의 피크 순도 백분율(n=3, 평균±표준 편차, UAP =정해지지 않은 피크, RRT =상대적 정체 시간)

Apparent pH of placebo gel: 플라시보 겡의 겉보기 pH, Percentage peak purity: 피크 순도 백분율

표 15. 40℃에서 1주일 보관 후 활성 겔 내에서 Ⅰ3A의 아이소형의 피크 순도 백분율(n=2, 평균±범위, UAP =정해지지 않은 피크, RRT =상대적 정체 시간)

표 16. 40℃에서 4주일 보관 후 활성 겔 내에서 Ⅰ3A의 아이소형의 피크 순도 백분율(n=2, 평균±범위, UAP =정해지지 않은 피크, RRT =상대적 정체 시간)

표 17. 40℃에서 4주일 보관 후 활성 겔 내에서 Ⅰ3A의 아이소형의 피크 순도 백분율(n=2, 평균±범위, UAP =정해지지 않은 피크, RRT =상대적 정체 시간)

표 18. 시간0 ( Time 0) 시점에서 IPA 겔 내에서 Ⅰ3A 아이소형 ' a' 의 백분율 피크 순도의 측정된 증가량

상기 데이터는 3개월간 겔을 2~8℃로 보관했을 때에도 pH가 아이소형 'a'의 형성에 영향을 준다는 것을 나타낸다. pH 3.00의 구연산염 완충제에 제제한 겔에서 아이소형 'a'의 피크 면적 백분율의 0.21%의 증가가 나타났고, pH 3.5의 구연산염 완충제에 제제된 겔에서 아이소형 'a'의 피크 면적 백분율에서 0.44%의 증가가 나타났다. 40℃에서 T=4주의 시점에서, 겔들 간의 아이소형 'a'의 백분율 피크 순도의 증가에 있어서 차이는 더 증가되었다.

실시예 4

유성 제형물( Oil Formulations )

재료

Crodamo GTC/C (Medium chain triglycerides): 크로다모 GTC/C(중결합 트리글리세라이드), Glacial acetic acid: 빙초산, Acetonitril-HPLC grade: 아세토니트릴-HPLC 등급, Trifuoroacetic acid: 삼불화초산

방법

적절한 기름/첨가제 선택

참기름, 분류된(fractionated) 코코넛유(중결합 트리글리세라이드;medium chain triglycerides), 콩기름, 옥수수 기름, 및 땅콩 기름들은 비경구적 투여의 운반체로 지목되었다. 각각은 100%의 레벨까지 사용될 수 있다.

비경구적 기름 제형물에 포함될 수 있는, 최대 농도로 사용된 기타 첨가제들은 다음에 제시되어 있다.

첨가제(사용)	사용된 최대 농도(%)
벤질 알콜(용해제/보존제)	3.0
에탄올(용해화제)	70
부틸레이트 히드록시아니솔(Butylated hydroxyanisole; 항산화제)	0.03
부틸레이트 히드록시톨루엔(Butylated hydoxytoluene; 항산화제)	0.03

예비 안정성 연구를 위한 Ⅰ3A 및 플라시보 제형물들의 제제

분류된 코코넛유(fractionated coconut oil)의 멸균

분류된 코코넛유(CRODAMOL GTC/C)의 약 50g을 100ml의 원뿔 플라스크(보로실리케이트 유리;borosilicate glass)에 측정하여 넣고, 마개(보로실리케이트 유리 마개)로 닫고, 예열된 오븐(Gallenkampf Hot box Oven, 팬 사이즈 2)에 넣고 173±5℃에 1시간 동안 두었다. 상기 절차 후, 상기 코코넛유를 사용 전에 실내온도에서 냉각되도록 두었다.

멸균된 기름에 Ⅰ3A 추가

약 10mg의 Ⅰ3A를 정확히 측정하여 28ml 유리 바이알에 넣고, 0.22μm MILLEX-GV 필터에 미리 여과된 약 200mg의 벤질 알콜(정확한 중량 측정)에 추가했다. 상기 혼합물을 Ⅰ3A가 벤질 알콜에 용해될 때까지 약 2시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물에 멸균된 기름 약 9.79g을 추가하고 균질(homogeneous) 용액이 될 때까지 약 5분간 교반시켰다. Ⅰ3A 대신에 멸균된 기름(정확한 중량 측정) 9.80g(9.79g와 비교하여)을 사용한 것을 제외하고 유사한 방법으로 플라시보를 제제했다. 활성제(Ⅰ3A) 및 플라시보 제형물들의 정확한 중량과 백분율 조성물의 비율은 표 19 및 20에 나와 있다.

표 19. Ⅰ3A 기름 제형물의 목표( Target ) 및 실제 양( Actual amounts )(및 % w/w) * 3 d.p.로 반올림

표 20. Ⅰ3A 플라시보 기름 제형물의 목표( Target ) 및 실제 양( Actual amounts)(및 % w/w)

* 3 d.p.로 반올림

Ⅰ3A 및 플라시보 제형물들의 보관 조건

각 제형물들(플라시보 또는 활성)의 부분표본들은 2ml의 스크류 뚜껑 앰버 유리 바이알(보로실리케이트 유리)에 넣고, 밀봉한 후 2~8℃ 및 25±2℃, 각각 두 가지 조건에서 보관한다. 1개월 또는 그 이하로 보관된 상기 제형물들은 아래 설명된 방법으로 테스트했다.

분류 코코넛유 내에서의 Ⅰ3A의 예비 안정성

표 21은 43일 동안 2~8℃ 및 25℃에서 보관된 분획 코코넛유 내에서 Ⅰ3A의 안정성을 정리한 것이다. 상기 안정성에 대한 데이터는, t=0 및 t=43일 시점에서 새로운 Ⅰ3A의 배치(batch)에서 아이소형 'a'의 비율과 비교할 때, 43일 후에 2~8℃ 및 25℃에서 보관되는 동안 아이소형 'a'의 비율은 증가하지 않는 것으로 보인다.

표 21. 43일 동안 두 가지 조건 하에 보관된 아이소형 ' a' 및 Ⅰ3A ' b' 의 백분율로서의 아이소형 ' a' 의 백분율

Fresh sample 13A in Acetonitrile at time zero: 시점 0에서의 아세토니트릴에서 신선한 13A 샘플

결과

아세토니트릴 또는 아세토니트릴/기름에 주입된 샘플들 간에 Ⅰ3A의 아이소형 'a' 및 'b'의 피크 면적 및 정체 시간에는 별다른 차이가 없었다(p>0.05).

이용가능한 기름들의 목록에서 2개가 Ⅰ3A의 제형물에 적절한 것으로 나타났는데, 분획 코코넛유 및 참기름이었다. 권장되는 참기름의 멸균 방법은 170℃에서 2시간이고 코코넛유의 멸균은 170℃에서 1시간이다. 이것은 제형물을 제제하는데 사용되는 시간 및 에너지와 관련하여 장점이 있다. Ⅰ3A는 열에 대해 불안정하기 때문에(실험으로 증명되었으나 데이터는 없다), 기름은 각각 멸균되어야 하고 Ⅰ3A는 벤질 알콜에 용해된 용액 상태로 무균으로(여과된) 추가해야 한다. Ⅰ3A/벤질 알콜 혼합물 여과에 적합한 여과기는 0.22μm MILLEX-GV 필터이나, Ⅰ3A가 여과기 막에 흡착되는지 여부는 더 조사해봐야 한다. 필요에 따라, 이 기름의 비교적 낮은 점성으로 인해(약 30 mPas; 참기름의 점성은 약 44 mPas) 상기 제형물는 인시츄에서 Ⅰ3A/벤질 알콜과 함께 제제될 수 있고 최종 제형물을 여과를 통해 멸균할 수 있다.

실시예 5

경구용 제형물

구강 제형물(buccal formulations)를 위한 몇 가지의 첨가제가 선택되는데, 17개의 비수성(non-aqueous) 제형물들을 제제하여 일관성 및 용매화를 육안으로 관찰했다.

여러 가지 폴리머(polymers)들이 가능한 점액흡착성(mucoadhesive) 운반제들이다. 수성 시스템 내에서의 Ⅰ3A의 불안정한 성질로 인해, 실험된 제형물들은 비수성이었고, 수용성 상(aqueous phase)에서의 글리세롤 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 대체했다.

재료

Polyethylene glycol: 폴리에틸렌 글리콜, Porcine Mucine-Type III: 돼지 점액-유형 III, Carbopol 934: 카보폴 934, Methylcellulose: 메틸셀룰로즈, Hydroxyethylcellulose: 히드록시메틸셀롤로즈, Hydroxypropylcellulose: 히드록시프로필셀롤로즈

방법

플라시보 제형물들의 예비 육안 스크리닝

먼저 17개의 플라시보 제형물들을 제제하여 일관성과 용매화를 육안으로 관찰했다(표 22). 간단하게, PEG 400 및 카르보폴 934의 필요한 양을 10분간 28ml의 유리 바이알들에 넣어 스파튤라로 젓고, 다른 성분들을 글리세롤, 벤질 알콜, 그리고 메틸셀룰로오즈(methylcellulose) 또는 HEC 또는 HPC의 순서로 추가했다. 상기 제형물들을 Silverson 14RT 교반기로 약 10,000 rpm에서 약 2~3분간 혼합시켰다. 모든 혼합된 플라시보 제형물들은 육안으로 스크리닝하기 전에 하루 동안(>24h) 용해되도록 두었다.

표 22. 육안 관찰을 위한 플라시보 제형물들의 조성

플라시보 제형물들의 유동학적 ( rheological ) 스크리닝(점액흡착성)

점액흡착성(mucoadhesion)를 실험하는 방법 중에 하나는 점액흡착성 경계면의 유동성(유동성)의 성질을 측정하는 것이다. 이것은 투과성의 정도를 폴리머 겔들 및 뮤신과 폴리머 겔의 혼합물 간의 유동성 매개변수의 차이를 측정함으로써 탐지할 수 있다는 가정을 바탕으로 한다. 점성의 상승적인(synergistic) 증가 효과는 생흡착성(bioadhesion) 접착의 강도의 지표로 권장되어 왔다. 육안 스크리닝으로, 점성 및 용매화(solvation)를 바탕으로 5개의 플라시보 제형물들을 선택하여, 포르신 뮤신(porcine mucin)을 사용하여 추가적으로 유동성을 실험했다. 선택된 제형물들은 표 23에 목록되어 있다.

표 23. 유동성 스크리닝에 선택된 제형물들

유동성 평가를 위한 샘플 제제

포르신 뮤신(porcine mucin)의 제제

간단하게, 15g의 포르신 뮤신 분말을 측정하여 비커에 넣고 탈이온수를 사용하여 150g까지 채워 10% w/w 뮤신의 최종 농도를 만든다. 이것은 약 2~3시간 동안 2~8℃에서 수화(hydrated)되도록 두었다. 수화된 뮤신을 탈이온수로 더 희석하여 탈이온수와 뮤신의 5% w/w 최종 농도를 만들었다. 이것을 다시 2~8℃에서 냉장고에 하룻밤 동안 수화되도록 두었다.

제형물 / 뮤신 혼합물의 제제

선택된 제형물들(표 23)을 다음과 같이 제제했다. 각 제형물들에 동일한 중량 10% w/w 뮤신을 추가하고 스파튤라로 천천히 저었다. 이것을 하룻밤 동안 2~8℃에서 수화되도록 두었다. 추가로, 상기 선택된 제형물들을 탈이온수로 희석하고(50:50 w/w) 하룻밤 동안 2~8℃의 냉장고에서 수화시켰다.

역학적(진동) 유동성 테스트 과정

Carrimed CSL² 유동계(rheometer)를 사용하여 유동성 스크리닝을 실시했다. 약 0.5g의 테스트 샘플을 플랫폼과 그 평행한 플레이트 장치(plate geometry) 사이에 놓았다. 샘플이 플랫폼과 플레티트 사이에서 압축되면 샘플의 잔여물은 장치의 직각 위치에서 스파튤라로 제거했다. 각 샘플은 총 5회 테스트하고 그 결과 기계적 스펙트라(mechanical spectra)가 나왔다. 결과물의 매개변수인 G', G'', 및 tan δ을 제형물의 점액흡착성의 강도를 측정하는데 사용했다. G'는 탄성 계수이고, G''는 점성 계수, 그리고 tan δ은 G''에 대한 G'의 비율이다.

선택된 활성 및 플라시보 제형물들의 최적화 및 제제

유동성 테스트 후에, 안정성을 위한 제형물 배치(batch)의 제제와 관련하여 최적화 실험(제형물 16 및 17)을 위해 2개의 제형물을 선택했다. 활성(Ⅰ3A 포함) 및 플라시보 제형물들(각 25g)의 배치를 제제하기 위하여 최적화된 제조 과정을 사용했다. 도 6은 첨가제/약물의 목표 용량을 사용한 활성 및 플라시보 제형물 16의 제제 과정을 도시했다. 간단히 말하면, 필요한 양의 카르보폴 934를 보로실리케이트 병에 담긴 PEG 400에 추가하고 혼합물이 완전히 용매화될 때까지 약 2시간 동안 50℃의 온도로 가열했다. 이 혼합물을 실내 온도로 냉각시키고, 혼합물에 필요한 양의 글리세롤을 추가한 것을 다시 균질의 페이스트(paste)가 형성될 때까지 2시간 동안 수조에서 약 60℃로 가열했다. 필요한 양의 HEC를 추가하고 Silverson L4RT 믹서를 사용하여 냉각된 혼합물에 저어넣고 약 10,000 rpm에서 2~3분간 혼합했다. 상기 혼합물은 실내 온도에서 하룻밤 동안(약 12시간) 완전히 용매화되도록 두었다. 도 6에서 보여진 바와 같이 이것은 '베이스 제형물(base formulation)'을 형성한다.

활성 제형물는 먼저 벤질 알콜 내에 13A를 용해시켜서 제제했다. 용매화된 베이스 제형물에 필요한 양의 13A/벤질 알콜을 추가하고 최종 농도 0.1% w/w 13A가 되도록 스파튤라로 천천히 저었다. 이와 유사하게, 용매화된 혼합물에 벤질 알콜을 추가하고 천천히 저어서 플라시보 제형물을 제제했다. 제형물 17 또한 유사하게 제제했다. 표 24는 활성 및 플라시보 제형물들 내의 첨가제/Ⅰ3A의 목표 %w/w를 나타낸다.

플라시보 및 활성 제형물들의 약 1g을 부분표본으로 2ml의 스크류 뚜껑 바이알들에 넣고 2~8℃, 25℃ 및 40℃에서 안정되게 유지했다 (후자의 온도는 단시간 가속된 안정성 연구에서 사용되었다).

표 24. 최적화된 활성( active ) 및 플라시보 ( placebo ) 제형물들 내에서 목표 %w/w (1 d.p.까지)

제형물 내의 Ⅰ3A 분석

활성 제형물로부터 Ⅰ3A 추출

의약 생성물질을 평가하기 위하여, Ⅰ3A 'b'가 아이소형 'a'로 변형되는 것(크로마토그라피 피크 순도)을 평가하기 위한 추출 방법이 갖추어 졌다. 활성 제형물에서 Ⅰ3A를 추출하는 방법은 다음과 같았다(플라시보 제형물에 같은 과정을 사용했다). 간단히, 제형물의 약 1g을 정확히 측정하여 10ml의 부피측정 플라스크에 넣고 다음에 ml의 구연산염 완충제(pH 3)에 넣었다. 이것은 균질 상태가 될 때까지 약 5분간 서서히 손으로 흔들고 HPLC 그레이드 메탄올로 적정 양을 만든다. 상기 플라스크를 기계 교반기로 약 2시간 동안 교반시켰다. 플라스크의 내용물을 15ml의 프로필렌 튜브에 옮기고 2200 rpm에서 5분간 원심분리시켰다. 그 상층액(supernatant)를 HPLC 바이알에 부분표본으로 넣고 분석했다.

예비 복구 데이터(자료 없음, preliminary recovery data)는 Ⅰ3A 'b'의 약 80% 또는 그 이상의 양이, 활성 제형물에서 복구되고 더 현저한 현상은, 제형물 내에서 첨가제로 인한 방해가 전혀 없었다는 것을 보여준다.

HPLC 방법

구강용 제형물 내에서 Ⅰ3A의 분석을 하기 위한 분석 방법은 다음과 같다.

컬럼(column): Symmetry C₁₈ - 5μm (Waters)

(S/no.T636515 07, P/no. WAT054205)

컬럼 길이: 150 x 3.90mm

컬럼 온도: 30℃

가드 컬럼(Guard column): Symmetry C₁₈ - 5μm (Waters)

(P/no. WAT054225)

가드 컬럼 길이: 20 x 3.90mm

이동상(Mobile phase): 0.02% v/v TFA의 수용액(A); 0.02% v/v TFA의 아세토니트릴 용액(B)

A:B; 50:50 (최초 조성물)

유량: 1.0 ml/min

UV 파장: 230nm (PDA)

주입 용량: 10

시간: 20 분

오토샘플러 온도: 8℃

샘플들 및 플라시보는 시간 0(Time 0) 시점에 실험했다. 약 1~2주 후에, 40℃에서 보관된 샘플들을 가속된 안정성 데이터를 얻기 위해 다시 실험되었다.

결과

육안 스크리닝

육안 스크리닝은 정성(qualitatively)으로 실시하고 점성과 용매화와 관련된몇 가지의 제형물들의 비교적 효과적인 예비 스크리닝 방법을 실시했다. 플라시보 제형물들은 2가지의 각각의 평가를 하고 점성이 너무 높거나 낮은 것은 폐기했다. 또한, 완전히 용매화되지 않은 제형물도 폐기했다. 상기 제제 방법에 따르면, 1.5% w/w 이상의 카르보폴 934의 농도는 점성이 너무 높고 그리고/또는 완전히 용매화되지 않는 비수성의 겔을 형성하는 것으로 나타났다. 카르보폴 934의 양을 0.5% w/w으로 감소시키고 농도 2.0% w/w의 메틸셀룰로오즈를 추가하자 낮은 점성의 겔이 생성되었다. 그러나, 카르보폴 934의 농도를 1.0% w/w로 증가시키고 동시에 메틸셀룰로오즈의 농도를 1.0% w/w으로 감소시키면 낮은 점성의 겔을 형성했다. 육안으로 관찰하면, 메틸셀룰로오즈의 추가는 카르보폴 934를 추가하는 것과 비교하여 점성에 크게 영향을 미치지 않았다. 그러나, 메틸셀룰로오즈는 점액흡착성의 성질을 가지므로 1.0 및 1.5% w/w의 메틸셀룰로오즈와 1.5% w/w의 카르보폴 934을 포함하는 제형물을 더 제제했다. 상기 제형물들의 육안 관찰에서 이들이 균질적이고 추가적인 평가에서 요구되는 일관성을 가지고 있다는 것을 알 수 있었다. 이와 유사하게, HPC는 카르보폴 934의 추가와 관련하여 점성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 그러나, HPC는 잠재적인 점액흡착성으로 연관되어 왔으므로 1.0% w/w과 1.5% w/w의 HPC를 포함하고 1.5% w/w의 카르보폴 934를 포함하는 제형물들은 육안으로 유동성 검사를 위해 적절한 것으로 나타났다. 제형물 4 또한 점성 및 용매화와 관련하여 육안으로 검사하기 적절하고 이것은 HEC(또 다른 잠재적인 점액흡착성 폴리머)를 포함한다. 따라서, 돼지의 뮤신을 사용하여 5개의 제형물들의 (제형물 4,14,15,16, 및 17) 점액흡착성 강도를 평가했다.

제형물 4, 14, 15, 16, 및 17들의 유동성 평가

탄성 계수 G'는 탄성 변형(즉, 폴리머 네트워크 연결성의 표시)의 샘플 내성의 수치이고 G''는 점성 변형에 대한 샘플 내성의 수치이다.

각각 제형물들 간에 비교를 위하여 5개의 샘플들 간에 평균을 낸 5Hz에서 평균 G' 및 G''는 결과 데이터에서 추출했다. 제형물/뮤신 혼합물과 그 혼합물의 각 성분들 간의 상승적인(synergistic) 차이를 결정하는 G' 및 G''는 공식 1에 나와 있다. 상관계수 G'(Relative G')의 수치가 높을수록 제형물(Formulation)과 뮤신 간의 상호작용이 더 많은 것이다.

공식 1

G''를 계산하는데 유사한 공식을 사용할 수 있다. Tan δ을 공식 2를 사용하여 상관계수 G' 및 G''를 계산했다.

공식 2

도 7은 실험된 모든 4개의 제형물들의 상관계수 G' 및 G'' 수치를 나타내고 도 8은 대응하는 tan δ 수치를 나타낸다.

유동성 측정을 바탕으로, 점액흡착성 강도 증가율의 순서는 제형물 17 > 제형물 16 > 제형물 14 > 제형물 15 > 제형물 4의 순서이다. 그러나, 제형물 14 및 15는 큰 변화를 보였다 (큰 표준편차로 관찰한 결과). 이것은 상기 제형물들과 뮤신 간의 비균질 상호작용 때문일 수 있다. 또한, 탈이온수 내에서 제형물에 대해 생성된 G'는 큰 변화를 보였는데 이것은 상기 제형물들이 비균질성 수화(non homogeneous hydration)가 되었다는 것을 뜻한다. 제형물 4는 뮤신과 혼합했을 때 가장 높은 G' 수치를 가졌으나, 다른 실험된 제형물들과 비교하여 상관계수 G'의 수치는 현저히 낮았다(p<0.05). 이것은 물에 분산된 제형물 4의 G' 수치가 물에 분산된 모든 제형물에 비교하여 현저히 높기 때문이다. 제형물 4는 비교적 수용액에서 높은 점탄성 겔(viscoelastic gel)을 생성하는 것으로 보일 수 있으나(다른 제형물 수용액과 비교할 때), 제형물의 효과(그리고 뮤신의 효과)를 제한하는 상관계수 G'의 수치가 현저히 낮았으므로 뮤신과는 비교적 적은 상호작용을 갖는 것으로 보였다. 상관계수 G' 수치를 바탕으로, 제형물 16 및 17은 돼지 뮤신과 가장 많은 상호작용이 있었는데 이것은 상기 두 제형물들이 잠재적으로 점액흡착성 제형물로 사용될 수 있다는 것을 의미한다. 제형물 14 및 15는 뮤신과 약간의 상호작용을 보였는데 그러나 큰 표준편차를 기준으로 상기 제형물들의 수화/상호작용은 비균질일 수도 있다. 제형물 4는 가장 낮은 상관계수 G' 수치를 보였고 따라서 가장 낮은 상호작용을 했다. 대응하는 tan δ 수치는 점탄성에 대한 상대적 수치이고, 더 낮은 tan δ 수치는 비교적 높은 얽힘(entanglement)을 의미하며, 반대로 더 높은 tan δ 수치는 비교적 낮은 얽힘(비교적 높은 점성 성분 때문에)을 의미한다. 따라서 이 실험들을 뒷받침한다.

제형물들의 제제 시간을 약 24시간에서 12시간으로 줄이기 위하여 최적화 과정을 실시했다. 최적화 및 안정성 연구를 위해 제형물 16 및 17이 선택되었다.

Ⅰ3A 제형물들의 HPLC 분석

표 25는 0시간에 측정한 제형물 16 및 17에서 Ⅰ3A 'b'의 백분율 피크 순도, 아이소형 'a'의 백분율 면적, 및 다른 정해지지 않은 피크(unassigned peaks, UAP)를 나타낸다. 또한 비교측정기로서 시간 0에 측정한 0.1% w/w Ⅰ3A IPA의 겔 샘플의 피크 순도 백분율이 나와 있다. 경구용 제형물의 모든 피크는 수동으로 통합되었고 각 플라시보 제형물들과 비교했다.

표 25. 0시간에 제형물들의 백분율 피크 순도

표 26은 2~8℃ 및 40℃(가속된 안정성)에서 약 2주 간 보관한 제형물 16 및 17에서의 Ⅰ3A 'b'의 백분율 피크 순도, 아이소형 'a'의 백분율 면적, 및 기타 정해지지 않은 피크(UAP)를 보여준다. 또한 비교측정기로서 1주일 간 40℃에 보관한 0.1% w/w Ⅰ3A IPA 겔의 백분율 피크 순도가 수치화되어 있다. 구강용 제형물들의 모든 피크는 각 플라시보 제형물들과 비교할 때 수동으로 적분(integrated)되었다.

표 26. 2~8℃ 및 40℃에서 약 1주일간 보관한 제형물들의 백분율 크로마토그 라피 피크 순도( peak impurities).

* 1주일 후의 피크 순도; ND- 결정되지 않음

모든 제형물들에서,Ⅰ3A의 백분율 피크 순도에서 시간0(T=0) 과 최초 수치(99.3% Ⅰ3A 'b', 리포트 PB21001/24) 간의 현저한 차이는 없었다. 또한, 측정된 아이소형 'a'의 면적 백분율은 0.40%이고 이것은 0시간에서의 아이소형 'a'의 피크 면적 백분율과 유사했다 (표 25).

경구용 제형물들을 2~8℃에서 약 1~2주 간 보관한 후에 아이소형 'a'의 비율의 현저한 증가는 없었던 반면(표 26), 40℃에서 보관한 모든 경구형 샘플들에서는 아이소형 'a'의 비율이 증가했다. 그러나, 0.1% w/w IPA 겔을 40℃에서 1주일 간 보관한 후의 아이소형 'a'의 증가율은 더 높았다(1.60%). 백분율 피크 순도를 바탕으로, 상기 예비 데이터는 Ⅰ3A의 경구 제형물이 최소한 0.1% Ⅰ3A IPA 겔만큼 안정적이거나 더 안정적인 것을 의미하는 것일 수 있다.

실시예 6

폴록사머 ( Poloxamer ) 제형물들

4개의 폴록사머 제형물들이 조사되었다.

재료

방법

첨가제의 선택

예비 제형물들의 연구 이전에, 폴록사머 제형물에 적절한 첨가제를 선택했고 아래 권장하는 최고 농도와 함께 아래 목록되어 있다.

* 대조군 제형물에 사용

유동성 연구를 위한 제형물 제제

여러가지의 플라시보 폴록사머 407 제형물의 유동성 성질을 측정하기 위하여 위에 제시된 첨가제들을 사용하여 제제했다.

구연산염 완충제 pH 3의 제제

시트르산 모노하이드레이트(Citric acid monohydrate; Mwt 211g/mole)을 0.1M의 농도로 탈이온수에 넣고 제제했다. 트리-나트륨 구연산염 디하이드레이트(tri-sodium citrate dihydrate) 0.1M(Mwt 294.1 g/mole)을 탈이온수에 또한 제제했다. 구연산염 완충제 용액 pH 3를 40% v/v 시트르산 모노하이드레이트 용액(0.1M), 10% v/v 트리나트륨 구연산염 디하이드레이트 용액(0.1M), 및 50% 탈이온수와 혼합하고 최종 pH를 pH 미터(3320 JENWAY)를 사용하여 측정했다.

폴록사머 407 '베이스( base )' 용액의 제제

예비 연구에서, 여러 가지 임계 미셀 온도 값과 다양한 점성을 제공하기 위해서는 18~20% w/w의 농도의 폴록사머 407 용액이 적절하다는 것이 나타났다. 폴록사머 용액들은 Schmolka (1972)의 콜드 방법(cold method)로 제제되었다.

간단히, 필요한 양의 폴록사머 407(표 27)를 100ml 보로실리케이트 유리 Duran 병에 구연산염 완충제 pH 3 또는 프로필렌 글리콜/구연산염 완충제 pH 3에 추가했다. 상기 프로필렌 클리콜/구연산염 완충제 pH 3는 프로필렌 글리콜과 구연산염 완충제 pH 3(표 27)의 적정량을 측정하여 육안으로 볼 때 균질이 될 때까지 1~2분간 흔들어서 미리 제제했다. 성분들을 포함하는 상기 듀란 병(Duran bottle)은 뚜껑을 닫아서 얼음물 수조에 4시간 동안 넣고 투명한 용액이 생성될 때까지 15분 간격으로 흔든다. 상기 용액들은 필요 시까지 2~8℃로 보관한다.

멸균 과정

겔들은 병변 내 치료(intralesional)용이므로, 멸균이 중요하다. 멸균을 위하여, 제제된 겔들은 BP 방법으로 가압멸균되었다. 표 27의 각 겔들의 약 100g을 100ml의 듀란 병에 넣고 121℃에서 15분 간 가압멸균시켰다. 상기 과정 후에, 상기 겔들은 실내 온도에서 냉각되도록 두었고 필요 시까지 2~8℃로 보관한다.

표 27. 폴록사머 '베이스' 용액의 실제 및 목표 량

표 28. 유동성 측정을 위한 플라시보 제형물의 실제 및 목표 량

유동성 측정을 위한 플라시보 폴록사머 제형물의 제제

Ⅰ3A는 열 멸균에 대해 불안정하기 때문에, Ⅰ3A를 포함하는 제형물들은 Ⅰ3A를 적절한 용매에 용해하고, 가압멸균된 '베이스' 폴록사머 용액에 무균으로 추가(즉, 무균 여과)를 하여 제제해야 한다. 선택된 용매는 벤질 알콜이었다. 그러나, Ⅰ3A의 양이 한정되어 있기 때문에 유동성 측정을 위해서는 벤질 알콜을 포함하는 플라시보 폴록사머 제형물만을 제제했다.

벤질 알콜 /구연산염 완충제 pH 3 용액의 제제

벤질 알콜에 추가된 구연산염 완충제의 양은 2.5% w/w이었는데 이것은 벤질 알콜 내의 구연산염 완충제 pH 3의 용해도보다 낮았다. 요약하면, 약 0.5g의 구연산염 완충제 pH 3를 19.5g의 벤질 알콜에 추가하여 벤질 알콜 내에 2.5% w/w의 구연산염 완충제의 최종 비율을 얻는다. 무균 여과의 조건과 유사하게 하기 위해 상기 용액을 밀리포어 필터(Millipore filter; 0.22μm MILLEX-GV, MILLIPORE)를 통해 여과했다.

벤질 알콜 /구연산염 완충제 pH 3 용액을 폴록사머 '베이스' 용액에 추가

상기 제제된 멸균 폴록사머 '베이스' 용액들에 필요한 양의 여과된 벤질 알콜/구연산염 완충제 pH 3을 추가하여 플라시보 제형물들 (표 28)을 제제했다. 요약하면, 각 폴록사머 '베이스' 용액의 약 9.90g(정확한 중량은 표 28에 있다)을 20ml 소다 유리 바이알에 측정하여 넣고 액체를 형성하도록 얼음 물에 넣어 냉각시켰다(이 용액들은 실내 온도에서 겔을 형성한다). 상기 냉각된 폴록사머 베이스에 약 0.10g(정확한 중량은 표 28에 있다)의 여과된 벤질 알콜/구연산염 완충제 pH 3을 추가하고 육안으로 볼 때 투명한 균질 용액이 될 때까지 2분간 교반시켰다. 상기 제형물들은 사용 시까지 2~8℃에서 보관했다.

유동성 평가( Rheological evaluation )

유동성 평가는 Carrimed CSL² 유동계를 사용하여 실시했다. 약 0.4g의 테스트 샘플을 플랫폼과 그 평행한 플레이트 장치(plate geometry) 사이에 놓았다. 샘플이 플랫폼과 플레티트 사이에서 압축되면 샘플의 잔여물은 장치의 직각 위치에서 스파튤라로 제거했다. 각 샘플은 총 3회 테스트하고 그 결과로 나온 점성도를 온도에 따라 기록했다.

활성 제형물들과 관련 플라시보들의 안정성과 방출(release) 실험을 위한 제제

유동성 평가 후에, 안정성과 방출을 실험하기 위해 활성(Ⅰ3A) 및 플라시보 폴록사머 제형물들을 제제했다. 또한, 방출 실험에 대한 대조군 제형물로서 플라시보 및 활성(0.1% w/w Ⅰ3A) PEG 400 제형물들을 제제했다.

벤질 알콜 /구연산염 완충제 내의 Ⅰ3A 원액 제제

약 50mg (목표량)의 Ⅰ3A를 정확히 측정하여 500mg(목표량)의 벤질 알콜/구연산염 완충제 pH 3과 함께 7ml의 유리 비쥬 바이알에 넣었다. 상기 혼합물은 Ⅰ3A가 용해될 때까지 5분간 정기적으로 교반시켰다.

활성 및 플라시보 폴록사머 제형물들의 제제

플라시보 제형물들은 상기와 설명된 것과 같이 제제했다(표 28). 목표 농도 0.1% w/w Ⅰ3A 'b'를 포함하는 활성(Ⅰ3A) 폴록사머 제형물들은, Ⅰ3A 'b'의 추가로 인한 추가적인 중량이, 추가된 폴록사머 '베이스' 용액(표 29)의 양의 유사한 감소로 대체되는 것을 제외하고는 플라시보 제형물들과 유사하게 제제되었다. 간단히, 약 110mg(정확한 양 표시)의 Ⅰ3A/벤질 알콜/구연산염 완충제 pH3를 9.89g의 냉각된, 멸균 폴록사머 '베이스' 용액에 넣고 육안으로 볼 때 투명한 균질 용액이 될 때까지 약 2분간 교반시켰다. 정확한 중량과 목표량은 표 29에 나와있다.

표 29. 안정성 및 방출 실험을 위한 활성 폴록사머 제형물들의 실제 및 목표량

표 30. 방출 실험을 위한 플라시보 및 활성 PEG400 대조군 제형물들의 실제 및 목표량

* 벤질 알콜/구연산염 완충제 pH3 내의 정확한 Ⅰ3A의 양 = 0.09118 g/g

* 벤질 알콜 내의 정확한 Ⅰ3A의 양 = 0.09155 g/g

PEG400 대조군 제형물들의 제제

유사한 절차에 따라, 12.5mg의 Ⅰ3A를 12.5mg의 벤질 알콜에 추가했다. Ⅰ3A는 미리 Millipore 필터 (0.22μm MILLEX-GV, MILLIPORE)를 통해 여과했다. 상기 용액을 Ⅰ3A가 완전히 용해될 때까지 약 5분 간 교반시켰다. 활성 대조군 제형물들을 제제하기 위하여 약 110mg의 상기 혼합물을 7.912g PEG400 및 1.978g의 구연산염 완충제 pH3의 용액에 추가했다. 상기 플라시보들은 약 7.92g PEG400, 1.98g의 구연산염 완충제, 및 100mg의 멸균 벤질 알콜을 사용한 것을 제외하고 유사하게 제제했다. 플라시보 및 활성 PEG 400 제형물들의 정확한 중량과 목표 중량들은 표 6에 차례로 나와 있다.

활성 및 플라시보 폴록사머 제형물들의 보관 조건

안정성 실험을 위해, 각 폴록사머 407 제형물(플라시보 또는 활성)의 부분표본들을 2ml의 스크류 뚜껑 앰버 유리 바이알들(보로실리케이트 유리)에 넣고, 밀봉한 다음 각각 2~8℃, 25±2℃ 및 40±2℃의 세 가지 조건에서 보관했다.

폴록사머 제형물들 내의 Ⅰ3A의 안정성 실험

약물 제품의 측정을 위해, Ⅰ3A 'b'가 아이소형 'a'로 변형되는 것을 관찰하기 위하여 추출 방법을 만들었다(크로마토그라피 피크 순도). 활성 제형물에서 Ⅰ3A를 추출하는 방법은 다음과 같다(플라시보 제형물에서도 동일한 과정 사용). 요약하면, 약 0.5g의 제형물을 정확히 측정하여 5ml의 부피 측정용 플라스크에 넣고 HPLC 그레이드 아세토니트릴/구연산염 완충제 pH3(90:10 v/v)를 표시까지 채웠다. 상기 용액은 HPLC 바이알들에 부분표본으로 넣고 분석했다.

예비 복구 데이터(자료 없음, preliminary recovery data)는 Ⅰ3A 'b'의 약 80% 또는 그 이상의 양이 활성 제형물에서 복구되고 더 현저한 현상은, 제형물 내에서 첨가제로 인한 방해가 전혀 없었다는 것이다. 제형물들은 t=0에서 분석했고, 가속된 안정성 실험(40℃)은 t=5주의 시점에서 실시했다.

예비 Ⅰ3A 방출 연구

합성막들에서 제형제들로부터의 Ⅰ3A 'b'의 방출은 프란츠 확산 셀을 사용하여 폐쇄 조건(occluded condition) 하에서 조사했다.

리시버 용액( receiver fluid )의 선택

싱크 조건(sink condition)를 유지하기 위하여 적용한 리시버 용액은 20%의 v/v 에탄올/구연산염 완충제(pH 3.0)이고, 이것은 프란츠 셀에 넣고 자석 막대로 지속적으로 저었다. 20% v/v 에탄올/구연산염 완충제 (pH 3.0)내에서의 Ⅰ3A에 대한 예비 안정성 실험을 37℃에서 약 18시간 동안 실시했다. 18시간 후에 아이소형 'a'의 백분율 피크 면적의 증가율은 0.26%였다. 프란츠 셀 실험을 위해서는 상기 과정이 적절하다. 20% v/v 에탄올/구연산염 완충제(pH 3.0) 내의 Ⅰ3A의 역학적 용해도는 25℃에서 509.7±3 μg/ml였다.

생체 외( in vitro ) 방출 연구(프란츠 셀)

0.53cm²의 평균 확산 표면 면적 및 1.85±0.02ml의 평균 리셉터 용량의 각각 측정한 프란츠 확산 셀들을 사용하여 방출 연구를 실시했다. 재생된 셀룰로오즈 막들(MWCO 12000~14000)을 제제하고 잘라서 프란츠셀에 배치한다. 상기 막들은 제형물들을 도포하기 전에 리시버 상(receiver phase)에서 30분간 평형되도록 두었다. 각 제형물의 0.5g의 무한정 도즈(infinite dose)를 막 표면에 포지티브 제거 핀피펫(positive displacement Finnpipette®)으로 도포했다. 프란츠 셀의 막대에서 200μl의 리시버 용액를 조심해서 제거한 후 샘플로 측정치를 조사했다(겔 도포 후 26시간). 실험 전반에 걸쳐, 프란츠셀에서의 증발로 인한 리시버 용액의 손실은 다시 채워서 적정 부피를 유지했다. 모든 제형물들(활성 제형물 당 프란츠 셀 n=3 및 플라시보 제형물 당 프란츠 셀 n=1) 에 대한 상기 실험은 폐쇄 조건 (도너 웰(donor well)의 상부 부분은 파라필름으로 덮는다) 하에서 실시했다. 실시예 1에 설명된 바와 같이, 샘플들은 HPLC에 의해 분석되었고, 방출된 Ⅰ3A 'b'의 농도는 80% v/v 구연산염 완충제 / 20%v/v 에탄올에 제제된 몇 개의 측정 표준들(calibration standards)로 측정했다.

결과

폴록사머 '베이스' 용액의 멸균

폴록사머 베이스 용액을 멸균한 즉시, 프로필렌을 포함하지 않는 폴록스-01(Polox-01) 및 폴록스-02에서는 상 분리(phase separation) 현상이 나타났다. 상기 용액들이 얼음물에 냉각되면 용액들은 투명한 균질 상태가 되었다. 그러나, 프로필렌 글리콜을 포함하는 베이스 용액, 폴록스-pg-01 및 폴록스-pg-02는 멸균 직후 상 분리를 보이지 않았다. 이것은 프로필렌 글리콜을 추가하는 것이 상기 현상을 억제한다는 것을 의미한다.

유동성 평가

폴록사머 플라시보 제형물들에 대한 유동성 평가를 실시했고 점성(Pa.s)은 4~40℃ 범위의 온도(℃)에 따라 결정되었다. 임계 미셀 온도값은 변화의 중간 지점을 택하여 결정되었다. 모든 플라시보 제형물들에서 적정 시점인 임계 미셀 온도까지 온도가 증가할수록 점성이 약간씩 증가했다. 임계 미셀 온도에서는 온도가 조금 증가해도 현저한 점성의 증가를 보였다. 임계 미셀 온도값은 농도에 의존적이었는데, 즉, 폴록사머 407의 농도가 낮아질수록 임계 미셀 온도값은 증가했다. 나아가, 폴록사머 플라시보 제형물들에 프로필렌 글리콜을 추가하면 임계 미셀 온도를 더욱 감소시켰다. 그러나, 임계 미셀 온도값 이상에서는 해당 프로필렌 글리콜을 함유하지 않는 제형물과 비교할 때 동일한 샘플들의 점성은 약 1.5~2배로 증가했다. 예를 들어, 37℃에서의 폴록스-01-플라시보의 점성은 약 1.2Pa.s였고 해당 프로필렌 글리콜 플라시보 제형물(폴록스-pg-01-플라시보)는 2.4Pa.s였다. 따라서, 프로필렌 글리콜을 추가하면 점성을 임계 미셀 온도값 이상으로 높이는 것으로 보이나 실제 임계 미셀 온도값은 감소한다. 표 31은 모든 제형물들에서 임계 미셀 온도값과 37℃에서의 점성을 정리한 것이다.

표 31. 모든 폴록사머 플라시보 제형물들에서의 Cmt 수치 및 점성(37℃)(n=3±SEM)

폴록사머 제형물들 내의 Ⅰ3A의 안정성 연구

표 32는 0시간에 측정한 모든 활성 폴록사머 제형물들에서 Ⅰ3A 'b'의 피크 순도 백분율, 아이소형 'a'의 백분율 면적, 및 다른 정해지지 않은 피크(unassigned peaks, UAP)를 나타낸다. 또한 비교측정기로서 시간 0에 측정한 0.1% w/w Ⅰ3A IPA의 겔 샘플의 피크 순도 백분율이 나와 있다. 경구용 제형물의 모든 피크는 수동으로 적분되었고 각 플라시보 제형물들과 비교했다.

표 32. 시간 0에서 제형물들의 백분율 피크 순도

표 33은 40℃(가속된 안정성)에서 5주 간 보관한 후 측정한 모든 활성 제형물에서의 Ⅰ3A 'b'의 백분율 피크 순도, 아이소형 'a'의 면적 백분율, 및 기타 정해지지 않은 피크(UAP)를 보여준다. 또한 비교측정기로서 4주일 간 40℃에 보관한 0.1% w/w Ⅰ3A IPA 겔의 피크 순도 백분율이 수치화되어 있다. 구강용 제형물들의 모든 피크는 각 플라시보 제형물들과 비교했을 때 수동으로 적분되었다.

표 33. 40℃로 보관한 5주 시점에서 제형제들의 백분율 크로마토그라피 피크 순도

* HPLC 방법 1을 사용하여 40℃에서 4주간 보관한 후 실험한 것.

모든 폴록사머 제형물들에서 Ⅰ3A의 백분율 피크 순도의 별다른 차이는 없었다. 그러나 0시간에서, Ⅰ3A IPA 겔에 비교할 때 상기 제형물들의 아이소형 'a'의 비율은 더 낮았다. 이것은 제형물들의 제조 시, 벤질 알콜에 추가하는 소량의 구연산염 완충제 pH 3 때문일 수 있다.

모든 활성 폴록사머 제형물들을 40℃에서 5주 간 보관한 후에 아이소형 'a'의 비율이 증가하는 결과가 나타났다. 그러나 4주 동안 40℃에서 보관한 후에 0.1% w/w IPA 겔의 아이소형 'a'의 증가율은 더 높았다(4.7%). 백분율 피크 순도를 바탕으로, 상기 데이터는 Ⅰ3A의 폴록사머 제형물들의 안정성이 0.1% Ⅰ3A IPA 겔과 유사하다는 의미할 수 있다.

예비 방출 연구

도 9는 0.1% w/w 폴록사머 겔 및 PEG 400 제형물들에서 26시간 후에 방출되는 Ⅰ3A의 양(μm/cm²)을 나타낸다. 폴록사머 제형제들 간에 현저한 차이(p>0.05)는 없었으나, 모든 폴록사머 제형물들에서의 방출은 PEG 400 대조군 제형물에서의 방출보다 속도가 현저히 느렸다 (p<0.05). 모든 폴록사머 제형물들에서의 Ⅰ3A 'b'의 평균 방출량은 약 16μm/cm²이었고, 대조군 PEG 400 제형물의 방출량은 약 53μm/cm²이었다. 이것은 모든 폴록사머 제형물들에서의 Ⅰ3A 'b'의 방출량은 대조군과 비교하여 26시간 후에 약 70%가 감소했다는 것을 의미한다.

결과

4개의 폴록사머 제형물들을 실험했다. 상기 폴록사머 겔들은 점성의 증가(37℃에서)를 보였는데 그 순서는 폴록스-01-플라시보 < 폴록스-pg-01-플라시보 < 폴록스-02-플라시보 < 폴록스-pg-02-플라시보 순이었다. 또한, 프로필렌 글리콜을 추가하면 점성이 임계 미셀 온도값보다 증가할 것으로 보이지만, 실제 임계 미셀 온도값은 감소했다.

폴록사머 겔들의 안정성은 가속된 조건 하에서 0.1% Ⅰ3A IPA 겔과 유사한 것으로 나타났다.

방출 실험들은 폴록사머 제형제들 간에 방출에 있어서 현저한 차이(p>0.05)는 없었으나, 모든 폴록사머 제형물들에서의 방출은 PEG 400 대조군 제형물에서의 방출보다 속도가 현저히 느렸다 (p<0.05). 또한, 모든 폴록사머 제형물들에서의 Ⅰ3A 'b'의 방출량은 대조군과 비교하여 26시간 후에 약 70%가 감소했다는 것을 의미한다.

실시예 7

PEG 400 대조군 제형물과 비교하여 유성기반(oily-based) 병변내 용 제형물에서의 Ⅰ3A 'b'의 생체 외(in vitro) 방출을 실험했다.

재료

방법

방출 연구를 위한 Ⅰ3A(활성) 및 플라시보 제형물들의 제제

3개의 유성 제형물과 그 해당 플라시보를 제제했다. 벤질 알콜의 양은 1% w/w로 유지했다. 2개의 제형물들의 제제는 기름을 열로 멸균하기 앞서 항산화제를 추가하는 것 또는 기름의 멸균 후에 항산화제 추가하는 것 중에 하나로 했다.

유성 제형물의 제제( PB23001 /2에 따라) ' 크로다 - BA ( Croda - BA )'

분류 코코넛유의 멸균

약 100g의 분획 코코넛유(CRODAMOL GTC/C)를 100ml 원뿔형 플라스크(보로실리케이트 유리)에 넣고, 뚜껑(보로실리케이트 유리 뚜껑)을 닫은 후, 170±2℃에서 1시간 동안 예열한 오븐(Gallenkampf Hot box 오븐, 사이즈 2)에 넣었다. 상기 과정 후에, 기름은 사용 시까지 실내온도에서 냉각되도록 두었다.

멸균된 기름에 Ⅰ3A 추가

Ⅰ3A의 약 15mg을 정확히 측정하여 20ml 유리 바이알에 넣고, 미리 0.22μm MILLEX-GV 필터에 여과해 놓은 약 15mg의 벤질 알콜(정확한 중량 표시)에 추가했다. 상기 혼합물은 벤질 알콜 내에 Ⅰ3A가 용해될 때까지 약 2시간 동안 주기적으로 교반시켰다. 상기 혼합물에 약 14.835g의 멸균된 기름을 추가하고 균질 용액이 될 때까지 약 5분 간 교반시켰다. 플라시보는, Ⅰ3A 대신에 멸균된 기름(정확한 중량 표시) 약 14.85g을 사용하는 것을 제외하고는 유사한 방법으로 제제했다. 활성(Ⅰ3A) 및 플라시보 제형물들의 정확한 중량 및 비율 조성은 표 34 및 35에 나와 있다.

표 34. Ⅰ3A 크로다 / BA 기름 제형물의 목표 및 실제량(및 % w/w)

* 3 d.p.로 반올림

표 35. 플라시보 크로다 / BA 기름 제형물의 목표 및 실제량(및 % w/w)

* 3 d.p.로 반올림

' 크로다 - BA / Antiox' 의 유성 제형물의 제제

기름들은 오래 보관하면 부패할 수 있고 이것은 의약 생성물질의 품질을 떨어뜨린다. 따라서, 이것을 감소시키려면 제형물 내에 항산화제를 포함시킬 수 있다(열 멸균 후). 기름을 열 멸균 처리한 후에 항산화제를 추가시킨 플라시보 및 활성 제형물들은 다음 방법에 따라 제제했다.

항산화제/ 벤질알콜 혼합물의 제제

약 60mg의 항산화제(BHT)를 2g의 벤질 알콜에 용해시킨 후 0.22μm MILLEX-GV 필터로 여과했다.

멸균된 기름에 Ⅰ3A 추가

Ⅰ3A의 약 15mg(배치 번호 0319)을 정확히 측정하여 20ml 유리 바이알에 넣고, 상기와 같이 제제한 약 154.5mg의 BHT/벤질 알콜에 추가했다. 상기 혼합물은 벤질 알콜 내에 Ⅰ3A가 용해될 때까지 약 2시간 동안 주기적으로 교반시켰다. 상기 혼합물에 약 14.8305g의 냉각된 멸균된 기름을 추가하고 균질 용액이 될 때까지 약 5분 간 교반시켰다. 플라시보는, Ⅰ3A 대신에 멸균된 기름(정확한 중량 표시) 약 14.8455g을 사용하는 것을 제외하고는 유사한 방법으로 제제했다. 활성(Ⅰ3A) 및 플라시보 제형물들의 정확한 중량 및 비율 조성은 표 36에 나와 있다.

표 36. Ⅰ3A 크로다 - BA / Antiox 유성 제형물의 목표 및 실제량(및 % w/w)

* 3 d.p.로 반올림

표 37. Ⅰ3A 플라시보 크로다 - BA / Antiox 유성 제형물의 목표 및 실제량(및 % w/w)

* 3 d.p.로 반올림

' 크로다 / Antiox - BA' 의 유성 제형물 제제

기름들을 건조한 열 멸균법으로 처리하는 것 역시 부패의 원인이 될 수 있고 이것은 의약 생성물질의 품질을 떨어뜨린다. 따라서, 이것을 감소시키려면 열 멸균을 하기 전에 제형물 내에 항산화제를 포함시킬 수 있다. 기름을 열 멸균 처리하기 전에 항산화제를 추가시킨 플라시보 및 활성 제형물들은 다음 방법에 따라 제제했다.

항산화제/기름 혼합물의 멸균

50g의 기름에 약 15mg의 항산화제(BHT)를 100ml의 원뿔 플라스크(보로실리케이트 유리;borosilicate glass)에 넣어 용해시키고, 마개(보로실리케이트 유리 마개)로 닫고, 예열된 오븐(Gallenkampf Hot box Oven, 팬 사이즈 2)에 넣고 170±2℃에 1시간 동안 두었다. 상기 과정 후, 상기 항산화제/기름을 사용 전에 실내온도에서 냉각되도록 두었다.

멸균된 기름에 Ⅰ3A 추가

Ⅰ3A의 약 15mg(batch No. 0319)을 정확히 측정하여 20ml 유리 바이알에 넣고, 미리 0.22μm MILLEX-GV 필터에 여과해 놓은 약 150mg의 벤질 알콜에 추가했다. 상기 혼합물은 벤질 알콜 내에 Ⅰ3A가 용해될 때까지 약 2시간 동안 주기적으로 교반시켰다. 상기 혼합물에 약 14.835g의 멸균된 항산화제/기름을 추가하고 균질 용액이 될 때까지 약 5분 간 교반시켰다. 플라시보는, Ⅰ3A 대신에 멸균된 기름(정확한 중량 표시) 약 14.8455g을 사용하는 것을 제외하고는 유사한 방법으로 제제했다. 활성(Ⅰ3A) 및 플라시보 제형물들의 정확한 중량 및 비율 조성은 표 38 및 39에 나와 있다.

표 38. ' 크로다 / Antiox - BA' 의 유성 제형물의 목표 및 실제량(및 % w/w)

* 3 d.p.로 반올림

표 39. ' 크로다 / Antiox - BA' 의 유성 제형물의 목표 및 실제량(및 % w/w)

* 3 d.p.로 반올림

모든 제형물들의 부분표본들은 예비 방출 실험을 위해 보관하고 나머지는 2ml 앰버 보로실리케이트 유리 바이알들에 부분표본으로 넣고, 뚜껑을 닫고 안정성 실험을 위해 2~8℃ 및 25℃에서 보관했다.

예비 Ⅰ3A 방출 연구

리시버 용액( receiver fluid )의 선택

싱크 조건(sink condition)를 유지하기 위하여 적용한 리시버 용액은 20%의 v/v 에탄올/구연산염 완충제(pH 3.0)이고, 이것은 프란츠 셀에 넣고 자석 막대로 지속적으로 저었다. 20% v/v 에탄올/구연산염 완충제 (pH 3.0)내에서의 Ⅰ3A에 대한 예비 안정성 실험을 37℃에서 약 18시간 동안 실시했다. 18시간 후에 아이소형 'a'의 백분율 피크 면적의 증가율은 0.26%였다. 프란츠 셀 실험을 위해서는 상기 과정이 적절하다. 20% v/v 에탄올/구연산염 완충제(pH 3.0) 내의 Ⅰ3A의 동역학적 용해도는 25℃에서 509.7±3 μg/ml였다.

생체 외( in vitro ) 방출 연구(프란츠 셀)

0.53cm²의 평균 확산 표면 면적 및 1.85±0.02ml의 평균 리셉터 용량의 각각 측정한 프란츠 확산 셀들을 사용하여 방출 연구를 실시했다. 재생된 셀룰로오즈 막들(MWCO 12000~14000)을 제제하고 잘라서 프란츠셀에 배치한다. 상기 막들은 제형물들을 도포하기 전에 리시버 단계에서 30분간 평형이 되도록 두었다. 각 제형물의 0.5g의 무한 도즈(infinite dose)를 막 표면에 포지티브 제거 핀피펫(positive displacement Finnpipette®)으로 도포했다. 프란츠 셀의 막대에서 200μl의 리시버 용액를 조심해서 제거한 후 샘플로 측정치를 조사했다(겔 도포 후 26시간). 실험 전반에 걸쳐, 프란츠셀에서의 증발로 인한 리시버 용액의 손실은 다시 채워서 적정 부피를 유지했다. 모든 제형물들(활성 제형물 당 프란츠 셀 n=3 및 플라시보 제형물 당 프란츠 셀 n=1) 에 대한 상기 실험은 폐쇄 조건 (도너 웰(donor well)의 상부 부분은 파라필름으로 덮는다) 하에서 실시했다. 샘플들은 HPLC에 의해 분석되었고, 방출된 Ⅰ3A 'b'의 농도는 80% v/v 구연산염 완충제 / 20%v/v 에탄올에 제제된 몇 개의 측정 표준들(calibration standards)로 측정했다.

HPLC 방법

HPLC 방법은 실시예1에 설명되어 있고 Ⅰ3A를 결정하는데 사용되었다.

결과

예비 방출 연구

도 10은 0.1% w/w 기름 및 PEG 400 제형물들에서 26시간 후에 방출되는 Ⅰ3A의 양(μm/cm²)을 나타낸다. 기름 제형물들 간에 현저한 차이(p>0.05)는 없었으나, 모든 기름 제형물들에서의 방출은 PEG 400 대조군 제형물에서의 방출보다 속도가 현저히 느렸다 (p<0.05). 모든 기름 제형물들에서의 Ⅰ3A 'b'의 방출량은 약 3.4μm/cm²이었으나, 대조군 PEG 400 제형물의 방출량은 약 16배나 많았다(53μm/cm²). 또한, BHT(항산화제)를 추가하는 것은 기름 제형물들에서 Ⅰ3A 'b'의 방출에 별다른 영향을 주지 않는 것으로 보일 것이다.

실시예 8

IPA 겔 제형물들의 안정성

다른 pH 구연산염 완충제들을 사용하여 제제된 IPA 겔 제형물에서의 Ⅰ3A 'b'의 안정성(T=12개월)을 연구했다. pH 범위는 2.5에서 4.0이었다.

재료

방법

HPLC 기구 사용 및 방법

HPLC을 통하여 샘플 용액들의 피크 순도 백분율을 분석했다. HPLC 방법 2의 크로마토그라피 조건은 다음과 같다:

기구:

Water Alliance 2695 분리 모듈 및 오토샘플러(Autosampler)(SN:L96SM4656N)

Waters 996 PDA 디텍터(SN:MX7AM7987M)

밀레니움³² 소프트웨어(Millennium³² Software), 버전 4.00

크로마토그라피 조건:

컬럼(column): Symmetry C₁₈ - 5μm (Waters)

(SN: T70641T 12)

컬럼 길이: 150 x 3.90mm

컬럼 온도: 30℃±2℃

가드 컬럼(Guard column): Symmetry C₁₈ - 5μm (Waters)

(PN:WAT054225)

가드 컬럼 길이: 20 x 3.90mm

A:B; 50:50 (최초 조성물)

유량: 1.0 ml/min

오토샘플러 온도: 8℃±2℃

UV 파장: 230nm

주입 용량: 10μl

시간: 20 분

증감도(Gradients)

IPA 겔 제형물들에서 Ⅰ3A b의 추출

다음과 같이 각 IPA 겔 제형물들에서 Ⅰ3Ab를 추출했다. 상기 각 활성 또는 플라시보의 겔 제형물의 약 0.5그램을 정확히 측정하여 A급 5ml 부피 플라스크에 넣었다. 상기 과정을 각 제형물 당 3개씩 실시했다. 상기 각 겔 샘플들에 구연산염 완충제(pH=3.0, 0.5ml)를 추가하여 보텍스 믹서에 최대 속도로 1분간 교반시킨 후, 오비탈 교반기(orbital shaker)에서 400rpm에서 30분간 교반 상태로 두었다. 상기 각 부피 측정 플라스크들에 HPLC-그레이드 아세토니트릴을 부피 표시까지 넣은 다시 보텍스 믹서에 최대 속도로 1분간 교반시켰다. 마지막으로 400rpm에서 60분간 오비탈 교반기에 교반 상태로 두었다. 분석을 위해 부분표본들을 HPLC 바이알들에 옮겼다.

플라시보 겔들의 겉보기 pH 의 측정

플라시보 겔들의 겉보기 pH를 Jenway 3320 pH 미터와 컴비네이션 pH 전극을 사용하여 측정했다. 요약하면, 각 겔의 약 0.5g을 25ml 유리 바이알들에 옮기고 적어도 1시간 동안 실내온도에 두었다. 컴비네이션 pH 전극은 IPA 겔에 넣고 상기 전극의 모든 막들이 겔로 덮히도록 확인했다. pH 미터의 수치는 최소한 1분간 안정되도록 둔 후에 겔의 가시 pH를 기록했다.

결과

T=12개월의 시점에서 플라시보 겔들의 가시 pH 측정

T=0 및 T=12개월 시점에서 2~8℃에서 보관한 플라시보 IPA 겔들의 겉보기 pH는 표 40에 나와 있다.

표 40. T=0 및 T=12개월 시점에서 플라시보 IPA 겔들의 겉보기 pH

표 40의 데이터는 pH 3.00, 3.50 및 4.00 구연산염 완충제들로 제제한 플라시보 IPA 겔들을 2~8℃에서 12개월 간 보관한 후에 겉보기 pH에 현저한 변화는 없다는 것을 보여준다. 그러나, pH 2.50 및 2.75 구연산염 완충제들로 제제한 플라시보 IPA 겔들에서는 2~8℃에서 12개월 간 보관한 후의 제제 pH는 약간의 감소를 보였다. 상기 겔들의 pH 감소는 보관 시간 또는 샘플 분석 시간 동안 상기 겔에서 IPA의 증발 때문일 가능성도 있다.

T=12개월에서의 활성 IPA 겔들 내에서 Ⅰ3A 이성질체들( isomers )의 피크 순도 백분율

표 41은 2~8℃에서 12개월 간 보관한 후의 각기 다른 활성(0.1% w/w) IPA 겔 제형물들에서의 Ⅰ3A 이성질체들의 피크 순도 백분율을 제시한다. 표 42는 T=0 및 T=12개월 시점에서 Ⅰ3Aa의 피크 순도 백분율(percentage peak purity)를 비교한 것을 보여준다.

표 41. 2~8℃에서 12개월 간 보관한 후의 활성 IPA 겔들에서의 Ⅰ3A 이성질체들의 백분율 피크 순도

HPLC 방법 2를 사용하여 분석한 데이터

표 41의 데이터는 표 41은 2~8℃에서 12개월 간 보관한 후에 해당 플라시보 겔 제형물의 겉보기 pH 증가에 따라 아이소형의 피크 순도 백분율이 증가한다는 것을 제시한다. 예를 들면, pH 2.75 구연산염 완충제로 생성된 IPA 겔은, 4.92%의 아이소형의 백분율 피크 순도를 갖는 pH 4.00 구연산염 완충제로 제제한 IPA 겔 제형물과 비교할 때 1.07%의 아이소형의 피크 순도 백분율을 갖는다. 상기 데이터는 더 낮은 pH 구연산염 완충제들로 제제한 IPA 겔 제형물들 내에서의 Ⅰ3A b의 안정성의 증가를 특징으로 한다.

표 42. T=0 및 T=12개월 시점에서의 Ⅰ3A a 의 백분율 피크 순도의 비교

HPLC 방법 1로 분석한 T=0 데이터, 및 HPLC 방법 2로 분석한 T=12개월 데이터

표 42의 데이터는 2~8℃에서 12개월 간 보관한 후에 모든 활성 IPA 겔 제형물들에서의 아이소형 'a'의 피크 순도 백분율의 증가가 있었음을 보여준다. 그러나, 예를 들어, 아이소형 a의 가장 큰 피크 순도 백분율의 증가(4.48%)를 보이는 pH 4.00 구연산염 완충제로 제제한 IPA 겔 제형물과 비교할 때, pH 2.50 구연산염 완충제로 제제한 IPA 겔 제형물은 아이소형 a의 백분율 피크 순도의 약간의 증가만을 나타냈다. 여기서도 역시, 상기 결과는 더 낮은 pH의 구연산염 완충제들로 제제한 IPA 겔 제형물들 내에서의 Ⅰ3A b의 안정성의 증가를 특징으로 한다. 따라서, 가장 낮은 pH의 구연산염 완충제로 제제한 IPA 겔 제형물은 2~8℃에서 12개월 동안 규격(<1% 아이소형 a) 이내로 유지되는 것으로 보인다.

따라서, 2~8℃에서 12개월 후에, Ⅰ3Ab에서 더 나은 안정성을 제공하는 IPA 겔 제형물들은 더 낮은 pH의 구연산염 완충제들(pH=2.5~3.0)으로 제제한 것들이었다.

실시예 9

다양한 pH 및 온도에서의 겔 사전혼합( Premix ) 용액 내에서의 Ⅰ3 A'b' 의 안정성

방법

겔 사전혼합 용액들의 제제

겔 사전혼합 용액들은 다음의 절차로 제제되었다:

1. 깨끗하고 건조된 듀란(Duran) 병에 구연산염 완충제를 측정하여 바로 넣는다.

2. 단계 1의 듀란 병에 IPA를 측정하여 바로 넣는다.

3. 깨끗하고 건조된 샘플 병에 Ⅰ3A'b'의 정확한 양을 측정하여 넣는다.

4. 단계 3의 샘플 병에 정확한 양의 벤질 알콜을 측정하여 넣는다.

5. 단계 4의 샘플 병을 오비탈 교반기에 넣고 Ⅰ3A'b'가 완전히 용해될 때까지 400rpm으로 교반한다.

6. 단계 2의 듀란 병에 단계 5의 Ⅰ3A'b'/벤질 알콜 용액을 추가한다.

7. 균질 용액이 될 때까지 상기 혼합물을 둔다.

제제하고, 안정되게 유지해 둘 겔 사전혼합 용액들의 조성은 다음과 같다:

표 43. 겔 사전혼합 용액 1

표 44. 겔 사전혼합 용액 2

표 45. 겔 사전혼합 용액 3

표 46. 겔 사전혼합 용액 4

]

표 47. 겔 사전혼합 용액 5

표 48. 겔 사전혼합 용액 6

표 49. 겔 사전혼합 용액 7

표 50. 겔 사전혼합 용액 8

겔 사전혼합 제형물들의 안정성 테스트

상기 제제된 겔 사전혼합 용액들은 각각 2~8, 25, 및 40℃에서 안정되도록 둔 후, T=0 및 T=2주 시점들에서 테스트했다. 각 시점에서 다음 설명된 절차에 따라 사전혼합 용액들에서 Ⅰ3A'b'의 성분을 평가했다.

1.1.3 겔 사전혼합 제형물들의 안정성 테스트

상기 제제된 겔 사전혼합 용액들은 각각 2~8, 25, 및 40℃에서 안정되도록 둔 후, T=0 및 T=2주 시점들에서 테스트했다. 각 시점에서, 아래 설명된 바와 같이, Ⅰ3A'b' 관련 물질 아이소형 'a' 및 아이소형 'c'의 피크 면적에 대한 Ⅰ3A'b'의 HPLC 피크 면적의 비율을 계산함으로써, 프리믹스 용액들에서 Ⅰ3A'b'의 성분을 평가했다.

HPLC 기구 사용 및 방법

HPLC 방법 2을 사용하여 모든 샘플 용액들의 Ⅰ3A'b'를 분석했다. HPLC 방법 2의 기구 사용 및 크로마토그라피 조건은 다음과 같다:

기구:

Water Alliance 2695 분리 모듈 및 오토샘플러

Waters 996 PDA 디텍터

엠파워 소프트웨어(Empower Software), 버전 2.00

크로마토그라피 조건:

컬럼(column): Symmetry C₁₈ - 5μm (Waters)

컬럼 길이: 150 x 3.90mm

컬럼 온도: 30℃±2℃

가드 컬럼(Guard column): Symmetry C₁₈ - 5μm (Waters)

(PN: WAT054225)

가드 컬럼 길이: 20 x 3.90mm

A:B, 50:50 (최초 조성물)

(증감도(Gradient)는 아래 표 51 참조)

유량: 1.0 ml/min

오토샘플러 온도: 8℃±2℃

UV 파장: 230nm

주입 용량: 10/40 μl

시간: 20 분

표 51. HPLC 방법 2의 증감도(Gradient) 표

pH 범위 2.75에서 4.00, 온도 2~8, 25, 및 40의 겔 프리믹스 dyddodr 들 내의 Ⅰ3A 'b' 안정성 데이터(평균, n=3)

Gel 사전혼합# (겔 프리믹스 번호)

Storage Temperature (보관 온도)

Time ( weeks ) - (시간(주일))

% Peak Purity of Ⅰ3 A'b' Relative to Ⅰ3 A'b' , isoform ' a' and isoform ' c'

(Ⅰ3A'b'에 대한 Ⅰ3A'b'의 % 피크 순도, 아이소형 'a' 및 아이소형 'c')

% Peak Purity of isoform ' a' Relative to Ⅰ3 A'b' , isoform ' c' and isoform ' a' (Ⅰ3A'b'에 대한 아이소형 'a'의 % 피크 순도, 아이소형 'c' 및 아이소형 'a')

% Peak Purity of isoform ' c' Relative to isoform ' a' , isoform ' c' and Ⅰ3A'b' (아이소형 'a'에 대한 아이소형 'c'의 % 피크 순도, 아이소형 'c' 및 Ⅰ3A'b')]

결론:

24 및 40℃에서 겔 사전혼합 용액들을 보관했을 때와 비교하여, Ⅰ3A'b'에서 얻은 더 높은 백분율 피크 HPLC 순도를 바탕으로, 모든 겔 사전혼합 용액들을 2~8℃에서 보관했을 때 Ⅰ3A'b'에 대해 가장 높은 안정성을 보였다.

HPLC 피크 순도 백분율을 바탕으로, Ⅰ3A'b'에 가장 높은 안정성을 제공하는 2개의 겔 사전혼합 용액들은 1번과 5번이었다. 상기 사전혼합 용액들은 연구에서 사용된 가장 낮은 pH의 구연산염 완충제를 포함했다 (pH=2.75).

HPLC 피크 순도 백분율을 바탕으로, Ⅰ3A'b'에 가장 낮은 안정성을 제공하는 2개의 겔 사전혼합 용액들은 4번과 8번이었다. 상기 사전혼합 용액들은 연구에서 사용된 가장 높은 pH의 구연산염 완충제를 포함했다 (pH=4.00).

겔 사전혼합 용액들에서 온도와 구연산염 완충제 pH를 낮추는 것은 Ⅰ3A'b'에 대해 가장 높은 안정성을 제공했다. 이 연구에서 Ⅰ3A'b'의 HPLC 피크 순도 백분율을 안정성의 지표로 사용했다.

참고 문헌:

Claims

제약으로 적절한 비양성자성 용매(aprotic solvent)에 용해된 인제놀 엔젤레이트; 그리고,

상기 용매에 적어도 부분적으로 친화적이며 제형물에 4.5 또는 그 이하의 겉보기 pH를 제공하는 제약으로 적절한 산화제를 포함하는 치료 목적의 인제놀 엔젤레이트 제형물.
제 1 항에 있어서,

상기 산화제는 상기 비양성자성 용매 내의 인제놀 엔젤레이트의 용액을 제제한 후에 첨가된 인제놀 엔젤레이트 제형물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기 인제놀 엔젤레이트는 인제놀-3-엔젤레이트인 인제놀 엔젤레이트 제형물.
상기 어느 항에 있어서,

상기 제형물 내에 존재하는 인제놀 엔젤레이트는 적어도 99% 인제놀-3-엔젤레이트인 인제놀 엔젤레이트 제형물.
제 4 항에 있어서,

인제놀-3-엔젤레이트의 양은 적어도 99.5%인 인제놀 엔젤레이트의 제형물.
상기 어느 항에 있어서,

상기 비양성자성 용매는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 메틸 에틸 키톤(methyl ethyl ketone), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 디에틸 에테르(diethyl ether), 벤질 알콜(benzyl alcohol), 및 그 혼합물 중에서 선택된 인제놀 엔젤레이트 제형물.
제 6 항에 있어서,

상기 비양성자성 용매는 적어도 벤질 알콜을 포함하는 인제놀 엔젤레이트의 제형물.
상기 어느 항에 있어서,

상기 산화제는 산(acid)인 인제놀 엔젤레이트 제형물.
제 8 항에 있어서,

상기 산성화제는 유기산인 인제놀 엔젤레이트 제형물.
상기 어느 항에 있어서,

상기 산화제는 산성 완충제(acid buffer)인 인제놀 엔젤레이트 제형물.
제 10 항에 있어서,

상기 완충제는 구연산염 완충제(citrate buffer), 인산염(phosphate) 완충제, 아세테이트 완충제, 및 구연산-인산염 완충제 중에서 선택된 것인 인제놀 엔젤레이트 제형물.
제 10 항에 있어서,

상기 완충제는 구연산염 완충제인 인제놀 엔젤레이트 제형물.
제 10 항 내재 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 완충제의 pH는, 상기 제형제에 추가하기 전, pH 2.5 내지 pH 4인 인제놀 엔젤레이트 제형물.
제 13 항에 있어서,

상기 완충제의 pH는 pH 2.7 내지 pH 3.5인 인제놀 엔젤레이트 제형물.
제 14 항에 있어서,

상기 완충제의 pH는 pH 2.7 내지 pH 3.0인 인제놀 엔젤레이트의 제형물.
상기 어느 항에 있어서,

pH 3 내지 pH 4의 겉보기 pH(apparent pH)를 갖는 인제놀 엔젤레이트 제형물.
제 16 항에 있어서,

3.5의 겉보기 pH를 갖는 인제놀 엔젤레이트 제형물.
상기 어느 항에 있어서,

상기 제형물은 인제놀 엔젤레이트, 벤질 알콜, 그리고 pH 2.5의 구연산염 완충제로 이루어지고, 상기 구연산염 완충제는 상기 제형물의 1 ~ 10%w/w의 양으로 존재하는 인제놀 엔젤레이트 제형물.
상기 어느 항에 있어서,

항산화제를 더 포함하는 인제놀 엔젤레이트의 제형물.
제 19 항에 있어서,

상기 항산화제는 레티놀, 아스코르브산, 리코펜, 토코페롤, 부틸레이트 히드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene), 및 그 혼합물 중에서 선택된 것인 인제놀 엔젤레이트 제형물.
상기 어느 항에 있어서,

상기 용매와 산성화제는 단일 상(single phase)을 형성하는 것이 가능한 인제놀 엔젤레이트의 제형물.
상기 어느 항에 있어서,

파라벤, 벤조산(benzoic acid), 벤질 알콜, 및 그 혼합물 중에서 선택된 보존제를 더 포함하는 인제놀 엔젤레이트 제형물.
상기 어느 항에 있어서,

투과 향상제를 더 포함하는 인제놀 엔젤레이트의 제형물.
제 23 항에 있어서,

상기 투과 향상제는 이소프로필 알콜, 술폭사이드(sulphoxides), 아존( azone), 피롤리돈, 알카놀(alkanol), 글리콜, 지방산, 물, 계면활성제, 테르핀(terpene), 인 지질(phospholipid), 및 그 혼합물 중에서 선택된 것인 인제놀 엔젤레이트 제형물.
상기 어느 항에 있어서,

점액흡착성제(mucoadhesive)를 더 포함하는 인제놀 엔젤레이트 제형물.
상기 어느 항에 있어서,

국소용 투여에 적절한 제제의 형태인 인제놀 엔젤레이트 제형물.
제 26 항에 있어서,

중량의 대부분을 차지하는 구연산염 완충제를 포함하는 인제놀 엔젤레이트(ingenol angelate) 제제(preparation).
제 26 항 또는 제 27 항에 있어서,

겔화제(gellant)를 더 포함하는 인제놀 엔젤레이트 제제.
제 26 항에서 제 28 항에 있어서,

겔, 크림, 연고 또는 페인트의 형태인 인제놀 엔젤레이트 제제.
상기 어느 항에 있어서,

상기 인제놀 엔젤레이트는 적어도 99% 인제놀-3-엔젤레이트이고, 3개월 후에 'a' 아이소형으로 재배열되는 비율이 1% 이하인 인제놀 엔젤레이트 제제.
상기 어느 항에 있어서,

상기 인제놀 엔젤레이트는 적어도 99% 인제놀-3-엔젤레이트이고, 3개월 후에 'a' 아이소형으로 재배열되는 비율이 0.5% 이하인 인제놀 엔젤레이트 제제.
상기 어느 항에 있어서,

피부암(skin cancer)의 치료에 사용하기 위한 인제놀 엔젤레이트 제형물 또는 제제의 용도.
피부암의 치료 또는 예방에 사용되기 위한 약물의 제조를 위한 인제놀 엔젤레이트 제형물의 용도에 있어서,

상기 인제놀 엔젤레이트는 제약으로 적절한 비양성자성 용매에 용해되며,

상기 제형물은 적어도 부분적으로 상기 용매와 친화적이고,

상기 제형물은 상기 제형물에 4.5 또는 그 이하의 겉보기 pH를 제공하는 제약으로 적합한 산화제를 포함하는 인제놀 엔젤레이트 제형물의 용도.
제 32 항 또는 제 33 항에 있어서,

상기 제형물은 상기 제 1 항부터 제 30 항의 제형물인 인제놀 엔젤레이트 제형물의 용도.
제 32 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 피부암은 편평세포암(squamous) 또는 기저세포암(basal cell cancers)인 것에 있어서 인제놀 엔젤레이트 용도.
인제놀 엔젤레이트 제형물의 제제 방법에 있어서,

상기 인제놀 엔젤레이트를 제약으로 적절한 비양성자성 용매(aprotic solvent)에 용해하는 단계; 그리고,

적어도 부분적으로 상기 용매와 친화적이고 상기 제형물에 4.5 또는 그 이하의 겉보기 pH(apparent pH)를 제공하는 제약으로 적합한 산화제를 추가하는 단계를 포함하며,

상기 산화제는 상기 인제놀 엔젤레이트를 추가할 때 함께, 추가하기 전, 또는 추가 후에 추가하는 것인 인제놀 엔젤레이트(ingenol angelate) 제형물의 제제 방법.
제 36 항에 있어서,

상기 제형물은 제 2 항에서 제 29 항의 어느 항에 정의된 것에 따른 것인 인제놀 엔젤레이트 제형물의 제제 방법.
제 36 항 또는 제 37 항에 있어서,

상기 인제놀 엔젤레이트는 실질적으로 인제놀-3-엔젤레이트이고, 'a' 아이소형으로 재배열되는 비율이 인제놀-3-엔젤레이트의 1% 이하가 되도록 산화제의 추가 및 조건들을 선택하는 인제놀 엔젤레이트 제형물의 제제 방법.
제 36 항에서 제 38 항 중 어느 항에 있어서,

상기 인제놀 엔젤레이트는 실질적으로 인제놀-3-엔젤레이트이고, 'a' 아이소형으로 재배열되는 비율이 인제놀-3-엔젤레이트의 0.5% 이하가 되도록 산화제의 추가 및 조건들을 선택하는 인제놀 엔젤레이트 제형물의 제제 방법.
제 36 항에서 제 39 항 중 어느 항에 있어서,

상기 산화제는 상기 제형물에 pH 3 내지 pH 3.5의 겉보기 pH를 부여하는인제놀 엔젤레이트 제형물의 제제 방법.
제 36 항에서 제 40 항 중 어느 항에 있어서,

상기 산화제는 상기 제형물의 1 ~ 10% w/w의 양으로 추가되는 인제놀 엔젤레이트 제형물의 제제 방법.
제 36 항에서 제 41 항 중 어느 항에 있어서,

다른 바람직한 성분을 추가하기 전에 상기 제형물은 정의된 성분들만으로 제조되는 인제놀 엔젤레이트 제형물의 제제 방법.
제 42 항에 있어서,

상기 다른 바람직한 성분은 과량의 산성 완충제인 인제놀 엔젤레이트 제형물의 제제 방법.
제 42 항 또는 43 항에 있어서,

상기 다른 바람직한 성분은 폴리에틸렌 글리콜인 인제놀 엔젤레이트의 제형물의 제제 방법.
제 42 항에서 제 44 항 중 어느 항에 있어서,

다른 바람직한 성분은 겔화제인 인제놀 엔젤레이트 제형물의 제제 방법.
제 42 항에서 제 45 항 중 어느 항에 있어서,

상기 제형물은 이후 어는점 및 8℃ 사이의 온도에서 보관되는 인제놀 엔젤레이트 제형물의 제제 방법.