KR20080091053A - 녹차씨앗의 신생혈관형성 억제작용을 이용한 항암제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 녹차씨앗 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 녹차씨앗 추출물(GSE: Greentea Seed Extract)은 녹차씨앗에 에탄올를 넣고 가열하면서 환류시켜 추출한 다음 증발농축기로 농축한 후 동결건조한 것을 용도에 따라 용해시켜 사용함으로 혈관형성 촉진인자들을 억제하고 신생혈관 형성을 억제하게 함으로써 위암, 간암, 유방암 또는 자궁암 세포의 증식을 억제하는 암세포 증식 억제 효과를 나타낼 수 있도록 한 녹차씨앗의 신생혈관형성 억제작용을 이용한 항암제에 관한 것이다.

항암제, 신생혈관 억제효과, 녹차씨앗, 천연산물

Description

녹차씨앗의 신생혈관형성 억제작용을 이용한 항암제{Anticancer agents with antiangiogenesis effects from greentea seeds}

본 발명은 녹차씨앗 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 녹차씨앗 추출물은 혈관형성 촉진인자들을 억제하여 신생혈관 형성을 억제하게 함으로써 암세포 증식 억제 효과를 나타내므로 항암제로 유용하게 사용될 수 있다.

혈관신생(angiogenesis)은 기존의 혈관에서 새로운 혈관이 생성되는 일련의 과정을 일컫는 용어로서, 태아의 발생, 여성의 월경, 상처 치유과정 등의 정상적인 상황 뿐 아니라 암세포의 성장과 전이, 류머티즘 관절염, 당뇨성 실명증 등의 여러 질병에서도 필수적으로 요구되는 것으로 알려져 있다. 그러나, 이는 정상적인 조건하에서는 거의 일어나지 않는 매우 엄격히 조절되는 현상이다. 즉, 정상적인 상태에서 생체는 혈관신생을 유도하는 인자들과 억제하는 인자들이 평형을 이루고 있으나, 질환이 유발되는 상황에서는 혈관성장을 촉진하는 인자들이 증가하거나, 억제하는 인자가 제대로 작용하지 못하여 혈관신생이 자율적으로 조절되지 못하고 계속 성장함으로써 질환으로 발전된다.

혈관신생의 형성은 현재까지 20가지 이상의 혈관형성 촉진인자에 의해 촉진되는 것으로 알려졌으며, 그 중 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)는 많은 종류의 종양세포 및 비만세포에서 분비되며, 동시에 가장 강력한 혈관형성 촉진인자로 알려져 있다. 또한, VEGF는 혈관투과인자(vascular permeability factor)로도 알려져 있으며, 그의 수용체인 VEGFR-1(Flt-1), VEGFR-2(Flk-1/KDR)와 결합하여 내피세포의 증식을 유발하고 혈관 투과성을 증가시켜 종양 및 비만세포의 성장과 전이에 관여하는 것으로 알려져 있다(Leung, D. W., G. Cachianes, W. J. Kuang, D. V. Goeddel and N. Ferrara (1989) Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen. Science 246:1306-1309; Ferrara, N, T. Davis-Smyth (1997) The biology of vascular endothelial growth factor. Endocr . Rev . 18:4-25; Liping Liu, Mohsen Meydani(2003)Angiogenesis Inhibitors May Regulate Adiposity, Nutrition Review, 61(11),384-387; Jaap G.Neels, Terri Thinnes, and David J.Loskutoff(2004) Angiogenesis in an in vivo model of adipose tissue development, The FASEB Journal express article 10.1096/fj.03-1101fje.Published online April 14, 2004; G.J. Hausman and R.L. Tichardson(2004)Adipose tissue angiogenesis,J.anim.Sci, 82,925-934).

특히, 암 형성에 중요한 역할을 하는 혈관신생은 암 조직에 산소와 영양분을 빠른 시간내에 공급함으로써 암조직의 성장을 직접적으로 도와준다. 따라서, 신생혈관의 형성을 억제함으로써 어떠한 조직에 새로운 혈관의 형성을 억제함으로써 조 직이 비대해지는 것을 막을 수 있다는 추론이 가능하다.

이에, 본 발명자들은 암조직에 산소와 영양분을 빠른 시간내에 공급하여 암 조직의 성장을 돕는데 혈관신생(angiogenesis)이 직접적으로 관여함을 확인하고, 이러한 혈관신생 형성을 억제하는 천연산물 유래의 물질을 찾고자 예의 연구한 결과, 녹차 씨앗이 혈관신생의 형성을 억제함으로써 부작용 없이 항암 효과를 제공함을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 다른 목적은 녹차씨앗의 신생혈관형성 억제작용을 이용한 항암제를 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 녹차씨앗의 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하여 신생혈관 억제작용을 가지는 항암제를 제공한다.

본 발명의 녹차씨앗 추출물은 저독성의 천연산물 유래 물질로서 신생혈관 억제작용을 가지므로 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 녹차씨앗 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암제를 제공한다.

상기 녹차씨앗 추출물은 신생혈관형성 억제작용을 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 사용하는 녹차씨앗은 녹차의 꽃이 핀 후에 열매로써 형성되며, 녹차잎과는 역할 및 특성이 다르거나 보다 우수하며 구체적으로는 하기와 같은 특성들을 나타낸다.

[참조예 1] 항산화력

항산화력은 2,4,6-트리[2-피리딜]-s-트리아진(TPTZ)(Fluka, Swisszland), 300mM 아세테이트 버퍼(pH 3.6), 40 mM HCl, 20 mM 염화철을 사용하여 FRAP(ferric reducing ability assay of plasma)법으로 측정하였으며, 1unit은 mM Fe(II)/L 으로 나타낸 값이다. 다른 식물들과 더불어 항산화력을 측정한 결과, 녹차씨앗은 다른 식물들이 비해 항산화력이 뛰어났으며 녹차보다도 역시 우수한 것으로 나타났다(도 2).

[참조예 2] 미백효과

미백효과는 1.66mM의 L-티로신 용액 1ml, 조성물 용액 1ml 및 30mM의 소듐포스페이트 1ml을 넣은 후, 37℃ 항온수조에서 10분간 가열하고, 37℃가 된 혼합액에 0.01ml의 티로시나제를 넣어 혼합한 후 다시 37℃ 항온수조에서 정확히 10분간 반응시킨 후 꺼내어 즉시 얼음에 넣어 반응을 멈추고 475nm에서 흡광도를 측정하여 실시하였다. 미백효과 역시 녹차보다는 녹차씨앗이 훨씬 강한 것으로 나타났다(도 3).

[참조예 3] 보습효과

보습효과는 플레이트에 1.5% 아가가 든 한천배지를 만들어 동일량을 넣은 후 무게를 재고, 그 위에 젤라틴을 이용해 3번 이상 코팅한 후, 특정 제조 화장품 1ml씩을 첨가하고 도말하여 37℃, 18시간 경과 후 무게를 달아 그 줄어든 비율로써 보습효과를 측정하였다. 그 결과, 녹차(GT) 보다는 녹차 씨앗(GSE)가 높은 것으로 나타났다(도 4).

[참조예 4] 항아토피 효과

항아토피 효과를 측정하기 위해 가려움을 유도하는 물질인 컴파운드 48/80을 목 뒤의 가슴에서 등 부위에 제모를 하고 0.5%의 컴파운드 48/80을 피부에 도포하고 시간당 뒷다리가 등을 긁는 횟수를 측정하는 실험을 행하였다. 24시간 후에 컴파운드 48/80과 시료를 1:1로 혼합한 것을 같은 자리에 도포하여 1시간동안 긁는 횟수를 비교하였다. 컴파운드 48/80을 바른 후의 긁은 회수를 100으로 보았을 때 시료와 컴파운드를 혼합하였을때 긁는 횟수를 환산하여 나타내었다. 항아토피 효과에서도 녹차보다는 녹차 씨앗이 훨씬 우수한 것으로 나타났다(도 5).

상기 항산화력, 미백효과, 보습효과 및 항아토피 효과에서 볼 수 있듯이 녹차와 녹차 씨앗은 그 성질이 매우 다른 것으로 녹차 씨앗은 녹차 보다도 월등한 효과를 나타내었다. 따라서 녹차 씨앗은 녹차와는 다른 역할을 하는 것을 알 수 있으며, 본 발명에서는 녹차 씨앗의 신생혈관 억제효과를 이용함을 특징으로 한다.

이하, 본 시험예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 녹차씨앗 추출물의 신생혈관 형성 억제효과, 혈관신생 억제기전, 암세포 증식 억제효과를 알아보기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 녹차씨앗 추출물(GSE: Greentea Seed Extract)은 녹차씨앗 300g에 에탄올 1500mL를 넣고 가열하면서 환류시켜 추출한 다음 증발농축기로 농축한 후 동결건조한 것을 용도에 따라 용해시켜 사용하였다.

[시험예 1] 녹차씨앗의 신생혈관형성 억제효과

24웰 배양 플레이트에 150 uL 의 매트리겔(matrigel)로 코팅한 후 고체화를 위하여 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 HUVECs(Human Umbilical Vein Endothelial Cells : 사람태반세포)를 트립신-EDTA를 사용하여 웰로부터 분리한 다음 코팅된 매트리겔 플레이트당 25,000세포/웰이 되도록 재현탁시켰다. 셀에 녹차씨앗 추출물(GSE)을 용량별로 투여한 후 37℃의 5% CO2환경에서 4시간동안 배양하고, 형성된 튜브 망의 길이는 현미경하에서 플레이트의 웰을 불규칙적으로 5 분야로 나누어 디지털 카메라(Nikon, Coolpix)로 촬영하여 그 영상을 픽셀로 전환시킨 후, NIH 이미지 프로그램으로 분석하였다.

그 결과, 녹차씨앗(GSE-S)의 동결 건조물이 같은 농도 0.005%의 녹차에 비해 현저히 우수한 혈관신생 억제효과를 나타냄을 확인하였다(도 6).

[시험예 2] 녹차 씨앗의 신생혈관의 억제기전

녹차 씨앗이 어떻게 신생혈관의 형성을 억제하는가 하는 기전을 알아보기 위해 웨스턴 블랏(western blot)으로 4종류의 신호전달 분자 즉, VEGFR2(VEGF receptor2), 베타카테닌(β-catenin), PI3-키나아제(PI3-Kinase) 및 VE-캐더린(vascular epithelium-cadherin)에 어떠한 작용을 하는지 알아보았다.

녹차씨앗 추출물(GSE-S)의 농도를 5.0 x 10-5%, 12.5 x 10-5%, 25.0 x 10-5% 및 50.0 x 10-5%로 증가함에 따라 각각의 안티바디(anti-VEGFR2, anti-β-catenin, anti-PI3Kinase 및 anti-VE-cadherin)의 밴드의 진하기가 약해지는 것으로 나타나 녹차씨앗 추출물에 의하여 신호전달 분자가 억제되어 신호가 전달되지 못함을 알 수 있다(도 7). 따라서, 신호전달 분자로부터 NF-κB까지의 신호전달이 이루어지지 못함으로써 NF-κB가 활성화되지 못하여 신생혈관의 형성이 일어나지 못한다.

즉, 녹차씨앗은 상기 4종류의 신호 전달 분자를 저해함으로써 신생혈관 형성을 억제함을 알 수 있다.

[시험예 3] 항혈관신생(Anti-angiogenesis) 효과에 의한 암세포 증식 억제 효과

본 시험예에서 사용한 암세포주는 하기의 방법으로 배양하였다:

위암(SNU-719), 간암(SNU-423), 유방암(HCC-1428) 및 자궁암(SNU-1005) 암세포를 100unit/ml의 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)과 10%의 FBS가 함유된 RPMI-1640배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator)에서 배양하였다. 배양된 각각의 암세포는 일주일에 2~3회 배지를 갈아주고 6~7일만에 PBS로 세척한 후 0.05% 트립신-0.02%EDTA를 사용하여 부착된 세포를 분리하였다. 분리된 세포를 원심분리하여 직접된 암세포에 배지를 넣고, 암세포가 골고루 분산되도록하여 계대배양하여 사용하였다.

1) 트리판 블루 색소 배제법(Trypan blue dye exclusion assay)

6-7일 배양 후 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척한 후 트립신/EDTA로 세포를 플라스크에서 분리하고 0.4% 트리판 블루 용액을 동량 처리하여 즉시 헤모사이토메터(hematocytometer)를 이용하여 살아있는 세포의 수를 측정하였다.

그 결과, 위암(SNU-719), 자궁암(SNU-17), 간암(SNU-423) 및 유방암(HCC-1428)세포는 녹차씨앗의 농도가 5x10-5%, 5x10-4%, 5x10-3%, 1x10-2%로 증가함에 따라 암세포의 성장이 억제되는 것을 볼 수 있었다. 특히 위암 및 자궁암세포에 대하여 억제작용이 크게 나타났다(도 9).

2)생체 내(in vivo) 실험

위암(SNU-719), 간암(SNU-423), 유방암(HCC-1428) 및 자궁암(SNU-1005)의 암세포(2 × 106 cells in 0.1 ml of PBS)를 6주된 암컷 무모쥐(nude mouse)의 옆구리 한 쪽에 피하주사하여 2주간 배양시켜 암조직을 발생시키고, 그 크기를 하기 식에 따라 잰 다음, 녹차씨앗 추출물(5ug/g body weight)을 복강 주사하여 4주일간 실시하고 암조직의 크기를 측정하였다.

종양의 표면적(mm2) = (L/2 × W/2) x 3.14

L : 종양의 길이(mm)

W : 종양의 폭(mm)

그 결과, 녹차씨앗의 신생혈관형성 억제효과에 의하여, 암의 크기가 줄어드는 것을 확인하고 따라서 암세포의 억제 효과를 확인할 수 있었다(도 10).

[시험예 4] 세포주의 녹차씨앗 추출물에 대한 독성 시험

HUVECs(Human Umbilical Vein Endothelial Cells : 사람태반세포)이 충분하게 자란 후 녹차씨앗 추출물을 용량별로 첨가하고 24시간 배양한 후 세포를 트리판 블루(trypan blue)로 염색 한 후 헤모사이토메터(hematocytometer)를 사용하여 역상현미경으로 살아있는 세포 수를 세어 세포에 대한 독성을 측정하였다.

그 결과, HUVECs 세포주가 95%이상의 생존율을 보여 녹차씨앗 추출물은 독성이 거의 없는 것으로 나타났다(도 11).

도 1은 혈관신생의 억제에 의하여 암세포가 죽어가는 과정을 나타낸 것이다.

도 2는 녹차씨앗과 녹차 및 다른 천연산물들의 항산화력을 나타낸 그래프로서, 여기서 EGCG는 에피갈로킨갈레이트이다.

도 3은 녹차씨앗과 녹차 및 다른 천연산물들의 미백효과를 나타낸 그래프이다.

도 4는 녹차씨앗과 녹차 및 다른 천연산물들의 보습효과를 나타낸 그래프로서, 여기서 DAD는 민들레, CJJ는 차전자, GT는 녹차, HWG는 황기, SUK는 석이, GSE는 녹차씨앗, AGA는 아가리쿠스, NRM는 노루궁뎅이, JCW는 장춘화, DCHC는 동충하초 및 CHIL는 돌외이다.

도 5는 녹차씨앗과 녹차 및 다른 천연산물들의 항아토피효과를 나타낸 그래프이다.

도 6은 녹차씨앗과 녹차의 신생혈관형성 억제효과를 나타낸 그래프이다.

도 7은 녹차씨앗의 4종류의 신호전달 분자, 즉 VEGFR2(VEGF receptor2), 베타카테닌(β-catenin), PI3-키나아제(PI3-Kinase) 및 VE-캐더린(vascular epithelium-cadherin)의 저해 효과를 웨스턴 블랏으로 관찰한 그림이다.

도 8은 고지방식이를 16일간 투여후 녹차씨앗 추출물을 병행투여한 15일간의 체중감소를 나타낸 그래프이다.

도 9는 녹차씨앗 추출물의 농도에 따른 위암세포, 자궁암세포, 간암세포, 유방암세포의 감소를 나타낸 그래프이다.

도 10은 녹차씨앗 추출물 투여에 의한 위암, 자궁암, 간암, 유방암 암조직의 감소를 나타낸 사진이다.

도 11은 HUVECs(Human Umbilical Vein Endothelial Cells)의 녹차씨앗 추출물에 대한 독성시험 결과이다.

Claims (3)

1. 녹차씨앗의 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하여 신생혈관 억제작용을 가지는 것을 특징으로 하는 녹차씨앗의 신생혈관형성 억제작용을 이용한 항암제.
2. 제 1항에 있어서,

   상기 녹차씨앗 추출물은 위암, 간암, 유방암 또는 자궁암 세포의 증식을 억제함을 특징으로 하는 녹차씨앗의 신생혈관형성 억제작용을 이용한 항암제.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   녹차씨앗 추출물(GSE: Greentea Seed Extract)은 녹차씨앗 300g에 에탄올 1500mL를 넣고 가열하면서 환류시켜 추출한 다음 증발농축기로 농축한 후 동결건조한 것을 용도에 따라 용해시켜 사용할 수 있도록 된 것을 특징으로 하는 녹차씨앗의 신생혈관형성 억제작용을 이용한 항암제.

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