KR20080077913A

KR20080077913A - 당전이 효소를 이용한 당전이 화합물의 유도체 제조방법 및이로부터 제조된 유도체

Info

Publication number: KR20080077913A
Application number: KR1020080014803A
Authority: KR
Inventors: 김도만; 문영환
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2007-02-21
Filing date: 2008-02-19
Publication date: 2008-08-26
Also published as: KR100964944B1

Abstract

본 발명은 당전이 효소를 이용한 당전이 화합물의 유도체 제조방법 및 이로부터 제조된 유도체에 관한 것으로, 0.1-1M 농도의 설탕이 함유된 용액에 당전이효소를 반응기 최종 활성 농도가 0.1-3.0 U/ml이 되도록 첨가한 다음, 이를 15-50℃의 반응기에서 2-아미노페놀(O-aminophenol), 3-아미노페놀(m-aminophenol), 4-아미노페놀(p-aminophenol), 하이드로퀴논(hydroquinone), 및 알부틴(arbutin)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 당 수용체를 최종 활성 농도가 0.01-3중량%가 되도록 첨가하여 반응시킴으로써 설탕의 글루코오스 혹은 프락토실기를 상기 수용체에 전이하여 당전이 화합물의 유도체를 생성하는 단계 및 상기 당전이 화합물의 유도체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하여 이루어진 당전이 화합물의 유도체 제조방법, 및 이로부터 제조된 유도체가 제공된다.

본 발명에 의해 생성되는 당전이 유도체는 물에 대한 용해도가 증가되거나 빛, 열에 의한 분해나 산화를 방지하는 효과를 가지고 있고 혈관과 뇌의 세포막에서 글루코오스 채널을 통하여 선택적으로 전이 될 수 있어 식품 및 화장품, 의약품 산업 등에 유용하게 사용될 수 있다.

당전이 효소, 글루칸수크라아제, 레반수크라아제, 수크로오스, 아미노페놀

Description

당전이 효소를 이용한 당전이 화합물의 유도체 제조방법 및 이로부터 제조된 유도체{Method for preparing derivatives of glyco-compounds by using glycosyltransferases and the derivatives thereof}

본 발명은 효소와 설탕을 이용하여 여러 가지 당전이 유도 물질 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 당전이효소를 이용하여 2-아미노페놀(O-aminophenol), 3-아미노페놀(m-aminophenol), 4-아미노페놀(p-aminophenol), 하이드로퀴논(hydroquinone), 알부틴 (arbutin) 등의 당전이 화합물의 유도체를 제조하는 방법 및 이로부터 제조된 유도체에 관한 것이다.

아미노페놀류는 일반적으로 진통제인 아세트아미노펜의 제조에 사용되는 잘 알려져 있는 주요 중간체이며, 또한 염료 및 사진용 화학약품의 제조 시 중간체로서 사용된다. 또한, 4-aminophenol은 대사과정에서 쉽게 산화되어 세포독성을 나타내어 신장 인접 혈관에 문제를 일으켜 여러 가지 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다 (Lock etc., Studies on the mechanism of 4-aminophenol-induced toxicity to renal proximal tubules. Hum. Exp. Toxicol. 12(5), 383-388, 1993).

종래 기술에서 유기합성방법에 의해 4-아미노 페놀 유도체를 합성하는 연구가 진행되어 오고 있다. 예컨대, 4-[2-(5-메틸)]-티아졸릴아미노]-2,3-디-tert-부틸페놀(일본국 특허공개 공보 제67023/1987호)과 3-메틸-4-히드록시-5-n-프로필-7-플루오로 벤조푸란의 2-에톡시카르보닐 또는 2-벤질옥시카르보닐 유도체(일본국 특허 공개 공보 제53980/1987호)등이 알려져 있다. 또한, 이들 화합물은 천식 등의 알레르기 질환의 치료 또는 예방에 유용한 것으로 보고되어 있다. 또한, 2,6-디클로로-4-아미노페놀 유도체로 2,6-디클로로-4-(3,4,5-트리메톡시 벤조일)아미노 페놀은 면역 조직활성 또는 PCA(수동 피부아나필탁시과민증) 억제 활성을 갖는 것으로 알려져 있다(일본국 특허 공개 공보 제271268/1986호). 나아가 4-(라우일 아미노)-2-에틸-6-tert-부틸페놀, 4-스테아로일아미노)-2,6-디-tert-부틸페놀은 산화방지제 활성을 가지며 중합체에 대한 안정화제로서 유용한 것으로 알려져 있다(일본국 특허 공고 공보 제24782/1971).

아미노페놀류는 식품 및 화장품, 의약품 산업 등에 유용하게 사용될 수 있는 화합물이나, 물에 대한 용해도가 낮거나, 빛, 열에 의한 분해나 산화가 쉽게 이루어져 독성을 나타내기 쉬운 단점이 있어, 이러한 화합물의 기능성을 개선하거나 안정성을 증가시킬 수 있는 방법에 대한 연구가 계속 요구되는 실정이다.

또한, 미백효과제로서 이미 알려진 하이드로퀴논(hydroquinone)과 알부틴은 세포 내에 존재하는 타이로시네이즈의 멜라닌 생성을 억제함으로써 기미, 주근깨 및 피부 노화를 방지하는 기능을 가지고 있다. 그러나 이들은 활성이 약하거나 세 포 본래의 기능을 손상시키는 등의 부작용을 나타내기도 한다. 따라서 타이로시네이즈 저해 활성이 하이드로퀴논과 알부틴보다 더 강하면서 세포내에 안정한 화합물을 합성하고자, 이들의 유도체를 화학적인 방법 (Wang etc. A new synthesis of α-arbutin via Lewis acid catalyzed selective glycosylation of tetra-O-benzyl-α-D-glucopyranosyl trichloroacetimidate with hydroquinone, 341, 1945-1947, 2006)과 효소적인 방법 (Sugimoto etc. Enzymatic Synthesis of α-arbutin by α-anomer-selective glucosylation of hydroquinone using lyophilized cells of xanthomonas campestris WU-9701, 93, 328-330, 2002; Sugimoto etc. Synthesis of α-arbutin-α-glycosides and their inhibitory effects on human tyrosinase, 99, 272-276, 2005) 등으로 합성하고자 하는 연구가 최근 활발히 이루어지고 있다. 하지만 이 화합물은 아밀라아제라는 당 분해 효소와 아밀로펜타오스라는 알파 1-4 구조의 고가의 물질을 기질로 이용하며 본 발명은 설탕을 이용하고 덱스트란수크라아제라는 합성 효소를 이용한다.

본 발명의 목적은 글리칸수크라아제 또는 레반수크라아제를 이용하여 2-아미노페놀(O-aminophenol), 3-아미노페놀(m-aminophenol), 4-아미노페놀(p-aminophenol), 하이드로퀴논(hydroquinone), 알부틴 (arbutin) 등의 당전이 화합물의 유도체를 효소적으로 합성하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로부터 제조된 당전이 화합물의 유도체를 제공하는 것이다.

본 발명의 제1 견지에 의하면, 0.1-1M 농도의 설탕이 함유된 용액에 당전이효소를 반응기 최종 활성 농도가 0.1-3.0 U/ml가 되도록 첨가한 다음, 이를 15-50℃의 반응기에서 2-아미노페놀(O-aminophenol), 3-아미노페놀(m-aminophenol), 4-아미노페놀(p-aminophenol), 하이드로퀴논(hydroquinone), 알부틴 (arbutin)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 당 수용체를 최종 활성 농도가 0.01-2%가 되도록 첨가하여 반응시킴으로써 설탕의 글루코오스 혹은 프락토실기를 상기 수용체에 전이하여 당전이 화합물의 유도체를 생성하는 단계; 및 상기 당전이 화합물의 유도체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하여 이루어진 당전이 화합물의 유도체 제조방법이 제공된다.

본 발명의 제2 견지에 의하면, 상기 방법으로 제조된 상기 기질 화합물들의 당전이 유도체들이 제공된다.

본 발명에 의해 글루칸수크라아제 및 레반수크라아제를 이용하여 2-아미노페놀(O-aminophenol), 3-아미노페놀(m-aminophenol), 4-아미노페놀(p-aminophenol), 하이드로퀴논(hydroquinone), 알부틴 (arbutin) 등의 당전이화합물을 효소적으로 합성할 수 있으며, 당전이를 통한 이들 당전이 유도 물질들은 물에 대한 용해도가 증가되거나 빛, 열에 의한 분해나 산화를 방지하는 효과를 가지고 있고 생체에서 대사 기능이 개선될 수 있어 식품 및 화장품, 의약품 및 치매치료 산업 등에 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명자들은 2-아미노페놀(O-aminophenol), 3-아미노페놀(m-aminophenol), 4-아미노페놀(p-aminophenol), 하이드로퀴논(hydroquinone), 알부틴 (arbutin)을 수용체로 하고 글루칸수크라아제와 레반수크라아제를 이용하여 설탕의 글루코오스와 프락토오스를 상기 수용체에 전이함으로써 기질로 사용한 화합물들의 당전이 유도 물질을 합성하는 방법을 발견하였으며, 이러한 당전이 산물들의 일반적인 기능 적 특징으로는 그 물질 본래의 기능적 특징을 유지하면서 물에 대한 용해도가 증가되고, 또한, 열이나 빛에 비교적 안정되며 생체에서의 대사 기작이 개선되어 식품첨가물, 화장품 및 의약품 및 치매치료소재로의 이용가능성이 높아질 것으로 기대된다.

글루칸수크라아제는 효소 반응액 중에 설탕외의 다른 화합물이 첨가될 경우 설탕의 글루코오스 단위를 첨가한 화합물의 자유 수산기에 전달하여 글리코실화된 화합물을 합성하는 효소이다. 이때 첨가된 설탕외의 화합물을 수용체라 하며 이 반응을 수용체 반응이라고 한다. 효소의 종류에 따라서 전이되는 글루코오스의 수용체와의 결합 구조와 수용체인 화합물과의 반응 효능이 다르며, 효소와 수용체와의 농도 비에 따라서도 생합성 되는 수용체 산물의 종류가 다르다.

본 발명에서는 특정 미생물 균주로부터 생성된 글루칸수크라아제를 이용하여 효소적인 방법으로 2-아미노페놀(O-aminophenol), 3-아미노페놀(m-aminophenol), 4-아미노페놀(p-aminophenol), 하이드로퀴논(hydroquinone), 알부틴 (arbutin) 등의 당전이 화합물을 생합성하였다.

본 발명에 사용되는 글루칸수크라아제는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 종 균주로부터 얻어질 수 있다. 상기 미생물로부터 글루칸수크라아제의 분리는 예를들어, 류코노스톡 메센테로이드 종 균주를 효모추 출물, 펩톤, K₂HPO₄ 및 수크로오스를 함유하는 배지에 접종하여 배양한 후, 배양액에서 균체만을 분리하고 이로부터 글루칸수크라아제를 정제하여 이루어진다. 상기 글루칸수크라아제의 분리 및 정제는 이 기술분야에 알려진 일반적인 방법에 의해 행해질 수 있다.

글루칸수크라아제를 얻기에 바람직한 류코노스톡 메센테로이드 종 균주로는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) NRRL B-1299, NRRL B-742, NRRL B-1355, NRRL B-512, NRRL B-1149, NRRL B-1142 또는 이들의 돌연변이주를 포함한다. 특히 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) NRRL B-1299가 가장 바람직하다.

본 발명에 사용되는 레반수크라아제는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides)종 균주로부터 얻어질 수 있다. 상기 미생물로부터 레반수크라아제의 분리는 예를 들어, 류코노스톡 메센테로이드 종 균주를 효모추출물, 펩톤, K₂HPO₄ 및 수크로오스를 함유하는 배지에 접종하여 배양한 후, 배양액에서 균체만을 분리하고 이로부터 레반수크라아제를 이온교환크로마토그라피 방법으로 정제하여 이루어진다.

레반수크라아제를 얻기에 바람직한 류코노스톡 메센테로이드 종 균주로는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) NRRL B-512(ATCC 10830), NRRL B-1299, NRRL B-742, NRRL B-1355, NRRL B-1149, NRRL B-1142 또는 이들의 돌연변 이주를 포함한다. 특히 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) NRRL B-512(ATCC 10830)이 가장 바람직하다. 상기 글루칸수크라아제와 레반수크라아제의 분리 및 정제는 이 기술분야에 알려진 일반적인 방법에 의해 행해질 수 있다.

상기 글루칸수크라아제를 0.1-1M 농도의 설탕이 함유된 용액에 첨가하고, 이를 2-아미노페놀(O-aminophenol), 3-아미노페놀(m-aminophenol), 4-아미노페놀(p-aminophenol), 하이드로퀴논(hydroquinone), 알부틴 (arbutin) 등의 당 수용체와 반응시키면 설탕이 분해되어 설탕의 글루코오스가 각각 상기 당 수용체에 전이되어 각종 당전이 화합물의 유도체가 합성된다. 이때 상기 글루칸수크라아제는 반응기 최종 활성 농도가 0.1-3.0 U/ml이 되도록하며, 특히 0.5-1.0 U/ml이 되도록 첨가하는 것이 가장 바람직하며, 상기 당 수용체는 각각 반응기 최종 활성 농도가 0.03-3중량%가 되도록 첨가하는 것이 바람직하다. 또한 이때 상기 반응은 일반적으로 설탕이 모두 분해 될 때까지, 바람직하게는 15-50℃에서, 보다 바람직하게는 28-37℃에서 1-18시간동안 행한다.

생성된 당전이 화합물의 유도체는 통상적인 방법에 의해 분리 및 정제될 수 있다. 예를들어, 겔투과컬럼크로마토그라피(Gel Permeation Chromatography)인 바이오겔 P-2 컬럼 크로마토그라피나 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그라피로 1차 정제한 다음, HPLC (High performance Liquid Chromatography)를 이용하여 각 유도체 들을 단리하였다. 사용된 컬럼은 μ-Bondapak C₁₈ 컬럼이나 Hypersil APS-2 NH₂ 컬럼 등을 이용하였다. 각 정제 화합물은 NMR, MALDI-TOP등의 구조 분석 방법을 이용하였다.

당 수용체로서 2-아미노페놀이 반응에 이용되는 경우, 하기 화학식 1의 2-아미노페놀 유도체가 생성된다.

[화학식 1]

2-아미노페놀-알파-디-이소말토올리고당

(2-aminophenol-O-α-D-isomaltooligosaccharide)

(상기 식에서, n은 0-5)

당 수용체로서 3-아미노페놀이 반응에 이용되는 경우, 하기 화학식 2의 3-아미노페놀 유도체가 생성된다.

[화학식 2]

3-아미노페놀-알파-디-이소말토올리고당

(3-aminophenol-O-α-D-isomaltooligosaccharide)

(상기 식에서, n은 0-5)

당 수용체로서 4-아미노페놀이 반응에 이용되는 경우, 하기 화학식 3의 4-아미노페놀 유도체가 생성된다.

[화학식 3]

4-아미노페놀-알파-디-이소말토올리고당

(4-aminophenol-O-α-D-isomaltooligosaccharide)

(상기 식에서, n은 0-5)

당전이효소가 글루칸수크라아제이며 당 수용체로서 하이드로퀴논이 반응에 이용되는 경우, 하기 화학식 4의 하이드로퀴논 유도체가 생성된다.

[화학식 4]

하이드로퀴논-알파-디-이소말토올리고당

(Hydroquinone-O-α-D-isomaltooligosaccharide)

(상기 식에서, n은 0-5)

당전이효소가 레반수크라아제이며 당 수용체로서 하이드로퀴논이 반응에 이용되는 경우, 하기 화학식 5의 하이드로퀴논 유도체가 생성된다.

[화학식 5]

하이드로퀴논-알파-디-프락토올리고당

(Hydroquinone-O-α-D-fructooligosaccharide)

(상기 식에서, n은 0-5)

당전이효소가 글루칸수크라아제이며 당 수용체로서 알부틴이 반응에 이용되는 경우, 하기 화학식 6의 알부틴 유도체가 생성된다.

[화학식 6]

알부틴-알파-디-이소말토올리고당

(Arbutin-O-α-D-isomaltooligosaccharide)

(상기 식에서, n은 0-5)

즉, 2-아미노페놀이 반응에 이용되는 경우에, 당전이 화합물로서 2-아미노페놀에 여러개의 글루코오스가 결합한 형태인 2-아미노페놀-O-α-D-이소말토올리고당(화학식 1)이 생성되고, 3-아미노페놀이 반응에 이용되는 경우에는 3-아미노페놀-O-α-D-이소말토올리고당(화학식 2)이 생성되고, 4-아미노페놀의 경우에는 4-아미노페놀-O-α-D-이소말토올리고당(화학식 3)이 생성된다. 이때 당전이 효소는 글루칸수크라아제를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 하이드로퀴논이 글루칸수크라아제와 반응한 경우에는 하이드로퀴논-O-α-D-이소말토올리고당(화학식 4)이 생성되고, 하이드로퀴논이 레반수크라아제와 반응한 경우에는 하이드로퀴논-O-α-D-프락토올리고당(화학식 5)이 생성되고, 그리고 알부틴의 경우에는 화학식 알부틴-O-α-D-이소말토올리고당(화학식 6)이 생성된다.

특히, 이와 같이 제조된 당전이 화합물의 유도체중 화학식 1 및 2의 유도체, 화학식 3, 4, 5 및 6에서 각각 n이 2-5인 경우에 그 유도체들은 신규물질인 것으로 여겨진다.

이러한 당전이 화합물의 유도체는 물에 대한 용해도가 증가되거나 빛, 열에 의한 분해나 산화를 방지하는 효과를 가지고 있어 식품, 화장품 및 의약품 및 치매치료 등에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 여겨진다. 예를 들어, 아미노페놀류의 경우 종래의 아미노페놀류는 물에 잘 녹지 않고, 빛이나 열에 의해 쉽게 분해 및 산화되어 갈변현상을 일으키는데 비해 본 발명의 아미노페놀류 유도체는 보다 높은 용해도를 가지며, 빛이나 열에 대해 보다 높은 안정성을 가져 식품첨가물이나 화장품 및 의약품 및 치매치료의 용도로 사용하기 적합하다. 또한 생체에서 기능성을 나타낼때에 대사 경로가 개선될 수 있어서 본 발명의 당전이 화합물의 유도체는 식품, 화장품 및 의약품 및 치매치료 등에 사용 시 그 함량을 한정하는 것은 아니나 총 중량을 기준으로 0.001-10중량%가 바람직하다.

이하에서 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하나 본 발명이 이들 예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1(효소액의 제조)

L. mesenteroides NRRL B-1299 를 1L의 물에 효모추출물 5g, 펩톤 5g, K₂HPO₄ 20g과 수크로오스 20g 함유하는 LB 배지에 접종하여 28℃에서 배양한 후, 배양액에서 균체만을 분리하여 조효소액을 준비하고 이 효소액으로부터 글루칸수크라아제를 정제하여 사용하였다. 효소의 정제는 DEAE-Sepharose(2.5×35cm)를 20mM 소디움 포스페이트 완충용액(pH6.8)으로 미리 평형화한 후 조효소액을 적용하고 컬럼의 3배에 해당하는 완충용액으로 결합하지 않은 단백질을 제거하고, 동일한 완충용액으로 준비한 NaCl(0-1M) 용액으로 흡착된 효소를 분리하였다. 활성이 있는 단백 질 부분을 모아서 동일한 완충용액으로 투석한 후 다시 컬럼에 적용하는 과정을 세 번 반복하여 글루칸수크라아제 활성을 갖는 부분을 분리, 정제하였다.

L. mesenteroides NRRL B-512를 LWG 액체 배지(0.3% (w/v) 효모 추출물, 펩톤, 0.3% (w/v) K₂HPO₄, 및 미네랄 용액(2% MgSO₄·7H₂O, 0.1% NaCl, 0.1% FeSO₄·7H₂O, 0.1% MnSO₄·H₂O, 0.13% CaCl₂·2H₂O, 2% (w/v) 글루코오스) 에서 12 시간에서 16 시간동안 OD600 이 3.0이 될 때까지 배양한 뒤 배양액에서 균체만을 분리하여 조효소액을 준비하고 이 액을 DEAE-Sepharose 컬럼(2.5×35cm) 혹은 CM-Sepharose 컬럼(2.5×35cm)을 이용하여 정제 레반수크라아제 효소액을 얻어 사용하였다.

실시예 2

1) 당전이 효소 반응

당전이 산물을 생산하기 위하여 본 실시예에서는 0.3M의 설탕용액을 준비하고, 실시예 1에서 얻은 글루칸수크라아제 효소를 사용하였다.

아미노페놀류 반응조건은 글루칸수크라아제, 0.3M 수크로오스와 0.5% 아미노페놀류를 1:1:1 (v/v/v)로 반응기 안에 혼합한 후 28℃에서 반응시켰다. 반응은 28℃에서 반응기의 설탕이 모두 소모될 때까지(약 3시간) 수행하였다.

하이드로퀴논의 반응조건은 글루칸수크라아제/레반수크라아제, 0.3M 수크로오스와 1% 하이드로퀴논을 1:1:1 (v/v/v)로 반응기 안에 혼합한 후 28℃에서 반응시켰다. 반응기의 설탕이 모두 소모될 때까지(3시간) 수행하였다.

알부틴의 반응조건은 글루칸수크라아제, 0.3M 수크로오스와 0.5% 아큐빈을 1:1:1 (v/v/v)로 반응기안에 혼합한 후 28℃에서 반응시켰다. 반응기의 설탕이 모두 소모될 때까지(3시간) 수행하였다. 알부틴의 배당체 합성은 20mM 소디움 아세테이트 완충용액(pH 5.2 60ml)에 12.25mM 알부틴과 100mM 설탕용액 그리고 2U/ml B-1299 글루칸 수크라제를 최종농도로 포함하도록 하여 반응기를 준비하였다. 이 반응은 28℃에서 설탕이 모두 소모될 때까지 진행하였고 8분간 반응혼합액을 끓여서 효소반응을 멈추었다.

효소의 최종 활성은 아미노페놀류, 하이드로퀴논의 경우는 1 U/ml이었다. 효소 1 유니트는 1분에 효소 1ml당 설탕으로부터 유리되는 프락토오스의 μmol 수로 나타내었다. 당전이 산물의 생산과 설탕의 완전한 반응 종결의 확인은 반응액 1㎕를 취하여 Merck K6F TLC 플레이트에 점적한 후 니트로메탄:노르말프로필알코올:물=2:5:1.5 (v/v/v) 혹은 아세토니트릴:물=85:15 (v/v)로 준비된 전개용매를 이용하여 전개하였으며, 분리된 탄수화물의 성분은 HPTLC(High pressure thin layer chromatograph) 플레이트를 0.5%(w/v) α-나프톨과 5%(v/v) 황산을 함유한 발색시약을 이용하여 분석되었다 (도 5).

2) 반응 산물의 구성 확인

또한 생산된 산물의 구성을 HPLC와 NMR, MALDI-TOP 분석 방법을 이용하여 확인하였다. 반응물을 정제하기 위해 Bio Gel P-2 컬럼을 준비하여 시료를 투여하고 물로 용출하여 당의 분리 정도를 TLC를 이용하여 확인하였다. 분리된 당을 진공 농 축한 후 TLC를 이용하여 확인하였다. 합성 산물의 성분과 분포를 TLC, NMR과 MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometer)를 이용하여 확인하였으며, 수용체 반응 결과는 도 1 - 도 4에 나타내었다.

Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299로부터 얻은 글루칸수크라아제와 아미노페놀류의 반응(도 1)으로부터 2-아미노페놀-O-α-D-글루코피라노사이드(도 1의 P1), 3-아미노페놀-O-α-D-글루코피라노사이드(도 1의 P2), 4-아미노페놀-O-α-D-글루코피라노사이드(도 1의 P3) 등의 아미노페노류 글루코올리고당 수용체 반응 산물이 합성되었고, 하이드로퀴논과 글루칸수크라아제의 반응(도 2)으로부터는 하이드로퀴논-O-α-D-글루코피라노사이드(도 2의 P4)의 수용체 반응 산물이 합성되었고, 하이드로퀴논과와 레반수크라아제의 반응(도 3)으로부터는 하이드로퀴논-O-α-D-프락토피라노사이드(도 3의 P5)의 수용체 반응 산물이 합성되었다. 또한, 알부틴과 글루칸수크라아제의 반응(도 4)으로부터는 알부틴-O-α-D-글루코피라노사이드(도 4의 P6, P7)의 수용체 반응 산물이 합성되었다.

한편, 각각의 분별 시료는 증발기로 47℃에서 농축하였고 각 배당체는 HPLC를 이용하여 그 순도를 확인하였다. 이때 사용한 컬럼은 역상 컬럼으로 hypersil APS-2 NH₂(4.6x250mm, Bio-Rad)로 이동상은 아세토니트릴/메탄올을 부피비로 4:1 또는 3:1로 사용하였으며 이동속도는 0.5ml/분으로 하였고 실온에서 RI 디텍터를 이 용하여 작업하였다. 정제한 시료의 HPLC 크로마토 그램을 도 6에 나타내었다. 바이오 겔 P-2 크로마토 방법 이후에 얻어진 순수한 물질을 HPLC로 확인한 결과 알부틴-G1과 알부틴-G2의 수율은 사용한 알부틴의 양대비 23.8%와 3.3%였다. 정제 후 각 시료의 분자량은 MALDI-TOF-MS로 분석하였다. 이를 위하여 정제한 알부틴 배당체(3mg/ml)를 탈이온화 물로 희석한 후 2,5-디하이드로시 벤조익에씨드(1mg/ml)를 아테토니트릴 유기용매에 녹인 것과 1:1의 부피로 섞어주고 이 혼합액 1ul를 스테인리스 스틸에 점적한 후 실온에서 서서히 건조시켰다. 질량스펙트럼을 MALDI-TOF-MS(Voyager DE-STR; Appled Bio Systems, USA)를 이용하여 분석하였고, 이 때 조건은 포지티브 모드로 65 kV 가속 전압을 사용하였다. NMR을 이용한 구조 분석은 2~3mg의 정제된 알부틴 배당체를 D₂O 250㎕에 녹인 후, NMR(직경 3mm) 튜브에 넣은 후 Unity Inova 500 spectrometer(Varian Inc., USA)를 사용하였고, 500 MHz 장비로 ¹H NMR을, 125 MHz 장비로 ¹³C NMR을 각각 분석하였다. 알부틴과 당과의 결합 위치는 2D NMR 분석 방법 중 한가지인, 프로톤끼리 연결해주는 COSY와 프로톤과 카본을 연결하는 HSQC, 프로톤과 카본의 연결 이지만 다수의 본드로 연결된 HMBC를 이용하여 분석하였다. 그 결과는 다음 표 1과 같다.

[표 1]

알부틴-G1

알부틴-G1의 분자 이온은 m/z 457로 관찰되었다. 표 1에서 보면, 4.89ppm (J=7.0Hz)에서 보이는 더블렛 신호는 포도당의 아노메릭 부분이 알부틴의 방향족기에 베타-결합되어있음을 보여주고 있고, 이는 HMBC로도 확인되었다. 4.83ppm(J=3.5Hz)에서 보이는 더블렛 신호는 하나의 당이 알부틴에 알파로 결합되어 있음을 보여준다. 알부틴 배당체의 알부틴 탄소 신호들 모두를 알부틴(화학식 7)과 비교했을 때, C-6’의 65.55 ppm을 제외하고는 모두 δ₁-δ에서 마이너스 값의 차이를 보였는데, C-6'의 2.15 ppm 다운필드 쉬프트는 알부틴의 C-6‘ 부분에 포도당이 결합되어 있음을 제시한다. HMBC 데이터에서도 포도당기의 C-6’ 또한 65.55ppm에서 확인이 되었고, 포도당기의 프로톤 H-1''과 알부틴의 C-6’ 사이에 커플링(또는 크로스 피크)이 확인된바 알부틴-G1의 구조는 4-히드록시페닐 β-이소말토시드로 구조해석 하였다.(화학식 8)

[화학식 7]

[화학식 8]

알부틴-G2

알부틴-G2의 분자 이온은 m/z 619로 관찰되었다. 표 1에서 보면, 4.94ppm (J=7.0Hz)에서 보이는 더블렛 신호는 포도당의 아노메릭 부분이 알부틴의 방향족기에 베타-결합되어있음을 보여주고 있고, 이는 HMBC로도 확인되었다. 4.86ppm(J=3.5Hz)와 4.81ppm(J=3.5Hz)에서의 두 더블렛 신호는, 두 개의 포도당 기들이 알부틴에 알파로 결합되어 있음을 보여준다. 표 1에서 C-6'의 66.83 ppm, 그리고 C-6''의 65.29ppm은 각각 2.43과 4.97ppm의 다운필드 쉬프트를 보여주는 데이터이다. 이 결과는 알부틴의 포도당기의 C-6'에 하나의 포도당기가 결합이 되어 있고, C-6''에 다른 포도당이 결합되어 있음을 제시한다. HMBC 데이터에서도 포도당기의 C-6’또한 65.83ppm에서 확인되었고, 포도당기의 프로톤 H-1''과 알부틴의 C-6’ 사이에 커플링이 확인되었고, 더군다나 포도당기의 C-6''가 65.29ppm에서 확인되었고 알부틴의 C-6''와 포도당기의 H-1''' 프로톤 간에 커플링이 확인되어 알부틴-G2은 4-히드록시페닐 β-이소말토트리오시드로 구조해석 되었다.(화학식 9)

[화학식 9]

도 1은 본 발명에 따라 수크로오스 용액에 각 아미노페놀류의 용액과 글루칸수크라아제를 첨가하여 반응시킨 경우에 반응 산물의 분포를 분석한 TLC 결과이다.

S, 수크로오스; F, 프락토오스;

래인 1, 0.3M 수크로오스 + 2-aminophenol + L. mesenteroides NRRL 1299 글루칸수크라아제;

래인 2, 0.3M 수크로오스 + 3-aminophenol + L. mesenteroides NRRL 1299 글루칸수크라아제;

래인 3, 0.3M 수크로오스 + 4-aminophenol + L. mesenteroides NRRL 1299 글루칸수크라아제;

도 2는 하이드로퀴논을 이용하여 설탕과 글루칸수크라아제를 반응시킨 후 합성된 수용체 산물을 확인한 TLC 결과이다.

S, 수크로오스; F, 프락토오스;

래인 1, 하이드로퀴논;

래인 2, 0.3M 수크로오스 + 완충용액 + L. mesenteroides NRRL 1299 글루칸수크라아제;

래인 3, 0.3M 수크로오스 + 하이드로퀴논 + L. mesenteroides NRRL 1299 글루칸수크라아제;

도 3은 하이드로퀴논을 이용하여 설탕과 레반수크라아제를 반응시킨 후 합성된 수용체 산물을 확인한 TLC 결과이다.

S, 수크로오스; F, 프락토오스;

래인 1, 하이드로퀴논;

래인 2, 0.3M 수크로오스 + 완충용액 + L. mesenteroides NRRL 512 레반수크라아제

래인 3, 0.3M 수크로오스 + 하이드로퀴논 + L. mesenteroides NRRL 512 레반수크라아제;

도 4는 본 발명에 따라 수크로오스 용액에 알부틴과 글루칸수크라아제를 첨가하여 반응시킨 경우에 반응 산물의 분포를 분석한 TLC 결과이다.

S, 수크로오스; F, 프락토오스;

래인 1, 0.3M 수크로오스 + 완충용액 + L. mesenteroides NRRL 1299 글루칸수크라아제;

래인 2, 0.3M 수크로오스 + 알부틴 + L. mesenteroides NRRL 1299 글루칸수크라아제

도 5는 본 발명에 따라 당수용체로서 알부틴을 이용하여 당전이 화합물 유도체를 생성한 결과이다.

레인 1, 과당;

레인 2, 효소반응기(알부틴 없음);

레인 3, 효소반응기(알부틴 포함);

레인 4, 표준 알부틴;

화살표는 알부틴 산물을 표시함

도 6은 본 발명의 실시예에 따라 정제된 시료의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.

Claims

0.1-1M 농도의 설탕이 함유된 용액에 당전이효소를 반응기 최종 활성 농도가 0.1-3.0 U/ml가 되도록 첨가한 다음, 이를 15-50℃의 반응기에서 2-아미노페놀(O-aminophenol), 3-아미노페놀(m-aminophenol), 4-아미노페놀(p-aminophenol), 하이드로퀴논(hydroquinone), 및 알부틴(arbutin)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 당 수용체를 최종 활성 농도가 0.01-3%(중량%)가 되도록 첨가하여 반응시킴으로써 설탕의 글루코오스 혹은 프락토실기를 상기 수용체에 전이하여 당전이 화합물의 유도체를 생성하는 단계; 및

상기 당전이 화합물의 유도체를 분리 및 정제하는 단계;

를 포함하여 이루어진 당전이 화합물의 유도체 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 당전이효소는 글루칸수크라아제 및 레반수크라아제로 이루어진 그룹으부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 글루칸수크라아제는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) NRRL B-1299 균주로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 레반수크라아제는 류코노스톡 메센테로이 드(Leuconostoc mesenteroides) NRRL B-512 균주로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 당전이효소가 글루칸수크라아제인 경우 설탕의 글루코오스가 상기 당 수용체에 전이되는 것을 특징으로 하는 당전이 화합물의 유도체 제조방법.
제 2항에 있어서, 상기 당전이효소가 레반수크라아제인 경우 설탕의 프락토실기가 상기 당 수용체에 전이되는 것을 특징으로 하는 당전이 화합물의 유도체 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 당전이효소는 반응기 최종 활성 농도가 0.5-2.0 U/ml가 되도록 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 당 수용체는 반응기 최종 활성 농도가 0.03-3중량%가 되도록 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 반응은 28-37℃에서 1-18시간동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 당 수용체가 2-아미노페놀인 경우, 하기 화학식 1의 2-아미노페놀 유도체가 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.

[화학식 1]

2-아미노페놀-알파-디-이소말토올리고당

(2-Aminophenol-O-α-D-isomaltooligosaccharide)

(상기 식에서, n은 0-5)
제 1항에 있어서, 상기 당 수용체가 3-아미노페놀인 경우, 하기 화학식 2의 3-아미노페놀 유도체가 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.

[화학식 2]

3-아미노페놀-알파-디-이소말토올리고당

(3-Aminophenol-O-α-D-isomaltooligosaccharide)

(상기 식에서, n은 0-5)
제 1항에 있어서, 상기 당 수용체가 4-아미노페놀인 경우, 하기 화학식 3의 4-아미노페놀 유도체가 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.

[화학식 3]

4-아미노페놀-알파-디-이소말토올리고당

(4-Aminophenol-O-α-D-isomaltooligosaccharide)

(상기 식에서, n은 0-5)
제 2항에 있어서, 상기 당전이효소가 글루칸수크라아제이며 상기 당 수용체가 하이드로퀴논인 경우, 하기 화학식 4의 하이드로퀴논 유도체가 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.

[화학식 4]

하이드로퀴논-알파-디-이소말토올리고당

(Hydroquinone-O-α-D-isomaltooligosaccharide)

(상기 식에서, n은 0-5)
제 1항에 있어서, 상기 당전이효소가 레반수크라아제이고 상기 당 수용체가 하이드로퀴논인 경우, 하기 화학식 5의 하이드로퀴논 유도체가 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.

[화학식 5]

하이드로퀴논-알파-디-프락토올리고당

(Hydroquinone-O-α-D-fructooligosaccharide)

(상기 식에서, n은 0-5)
제 1항에 있어서, 상기 당전이효소가 글루칸수크라아제이며당 수용체가 알부틴인 경우, 하기 화학식 6의 알부틴 유도체가 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.

[화학식 6]

알부틴-알파-디-이소말토올리고당

(Arbutin-O-α-D-isomaltooligosaccharide)

(상기 식에서, n은 0-5)
하기 화학식 1로 표시되는 2-아미노페놀 유도체.

[화학식 1]

2-아미노페놀-알파-디-이소말토올리고당

(2-Aminophenol-O-α-D-isomaltooligosaccharide)

(상기 식에서, n은 0-5)
하기 화학식 2로 표시되는 3-아미노페놀 유도체.

[화학식 2]

3-아미노페놀-알파-디-이소말토올리고당

(3-Aminophenol-O-α-D-isomaltooligosaccharide)

(상기 식에서, n은 0-5)
하기 화학식 3으로 표시되는 4-아미노페놀 유도체.

[화학식 3]

4-아미노페놀-알파-디-이소말토올리고당

(4-Aminophenol-O-α-D-isomaltooligosaccharide)

(상기 식에서, n은 2-5)
하기 화학식 4로 표시되는 하이드로퀴논 유도체.

[화학식 4]

하이드로퀴논-알파-디-이소말토올리고당

(Hydroquinone-O-α-D-isomaltooligosaccharide)

(상기 식에서, n은 2-5)
하기 화학식 5로 표시되는 하이드로퀴논 유도체.

[화학식 5]

하이드로퀴논-알파-디-프락토올리고당

(Hydroquinone-O-α-D-fructooligosaccharide)

(상기 식에서, n은 2-5)
하기 화학식 6으로 표시되는 알부틴 유도체.

[화학식 6]

알부틴-알파-디-이소말토올리고당

(Arbutin-O-α-D-isomaltooligosaccharide)

(상기 식에서, n은 2-5)