KR20080077713A

KR20080077713A - 키토산 올리고당을 주요 활성성분으로 하는 직장암 예방용약학 조성물

Info

Publication number: KR20080077713A
Application number: KR1020070017219A
Authority: KR
Inventors: 손윤희; 남경수
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2007-02-21
Filing date: 2007-02-21
Publication date: 2008-08-26

Abstract

본 발명은 키토산 올리고당의 직장암 예방활성에 관한 것으로서, 좀더 구체적으로는 키토산 올리고당은 직장암 발생 과정에서 해독 작용을 하는 퀴논 환원효소와 글루타치온 S-전이효소 활성 유도효과가 우수하였고, 또한 발암물질 활성화에 기여하는 사이클로옥시게네이즈 2 발현을 억제하였으므로 키토산 올리고당은 직장암 발생을 저해하는 암 예방제로 이용할 수 있다.

키토산 올리고당, 직장암, 암 예방, 퀴논 환원효소

Description

키토산 올리고당을 주요 활성성분으로 하는 직장암 예방용 약학 조성물{Colon cancer chemopreventive composition containing chitosan oligosaccharide}

도 1은 사람 직장 아데노카시노마(colorectal adenocarcinoma) HT-29 세포에서 키토산 올리고당에 의한 퀴논 환원효소(Quinone Reductase) 활성 유도를 나타내는 그림이다. EA: 15μM 엘라직산(ellagic acid). 값은 평균±표준편차(n=3)로 나타내었다. 각 그룹의 값은 대조군과 비교할 때 통계학적으로 유의하였다(* p<0.05, ** p<0.01).

도 2는 사람 직장 아데노카시노마(colorectal adenocarcinoma) HT-29 세포에서 키토산 올리고당에 의한 글루타치온 S-전이효소 활성 유도를 나타내는 그림이다. EA: 15μM 엘라직산(ellagic acid). 값은 평균±표준편차(n=3)로 나타내었다. 각 그룹의 값은 대조군과 비교할 때 통계학적으로 유의하였다(* p<0.05, ** p<0.01).

도 3은 사이클로옥시게네이즈-2 단백질 활성에 대한 키토산 올리고당의 영향을 나타낸 그림이다. 자세한 사항은 실시예에 기재되어 있다.

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본 발명은 키토산 올리고당의 직장암 예방활성에 관한 것으로서, 좀더 구체적으로는 키토산 올리고당은 직장암 발생 과정에서 해독 작용을 하는 퀴논 환원효소와 글루타치온 S-전이효소 활성 유도효과가 우수하고, 또한 발암물질 활성화에 기여하는 사이클로옥시게네이즈 2 발현을 억제하였으므로 키토산 올리고당은 직장암 발생을 저해하는 암 예방제로 이용할 수 있다.

암예방(cancer chemoprevention)은 기존의 항암제를 이용한 암세포의 치료라는 개념과는 다른 것으로, 암을 연구하는 데 있어 가장 유망한 영역의 하나이다. 암 발생은 정상세포가 외부의 발암물질원에 의해 다단계로 진행되며 크게 개시(initiation), 촉진(promotion), 그리고 진행(progression)의 세 과정으로 진행된다(1). 이러한 다단계 과정으로 일어나는 암발생과정(carcinogenesis)은 여러가지 천연물 또는 화학적 화합물에 의해 억제되거나 지연될 수 있다. 특히 직장암은 산업화된 현대에서 발병률과 사망률이 높은 질병 중의 하나이며(2), 직장암 발생은 환경적요인의 영향을 많이 받으므로 암예방 제재가 직장암 발생에 미치는 영향을 살펴보는 것은 매우 중요하다.

암예방 제재는 암발생과정(carcinogenesis)의 모든 단계에 관여하며 여러 기전에 의해 작용을 나타낸다. 그 중 중요한 기전의 하나가 퀴논 환원효소(quinone reductase; QR)나 글루타치온 S-전이효소(glutathione S-transferase; GST)와 같은 단계 II 해독효소의 유도이다(3). 단계 Ⅱ 효소의 유도는 화학적인 스트레스와 암 발생과정 중의 개시(initiation) 단계에서 돌연변이 물질, 발암물질로부터 세포를 보호하는 주요 대사이다(4). 즉 퀴논 환원효소는 퀴논(quinone)을 환원시켜 무독하게 만들고 세포 내에 유도되어 발암물질에 의해 일어나는 돌연변이와 종양화 현상을 막아주고 발암물질을 무독하게 하는 역할을 하며(5),글루타치온 S-전이효소는 유리기(free radical)를 파괴하여 반응성이 높은 산소들로부터 세포를 보호한다고 보고되고 있다(6).

사이클로옥시게네이즈(Cyclooxygenase; "COX")는 아라키돈산(arachidonic acid)으로부터 프로스타글란딘(prostaglandin; PG) 합성 과정을 조절하는 효소로서 세포증식과 발암물질의 활성화에 관여하며 두 개의 아이소폼(isoform)이 존재한다. 그 중의 하나인 COX-1은 대부분의 조직에 존재하며 인체의 항상성 유지에 관여하는 반면 COX-2는 세포질 내에 위치하며 성장인자, 발암유전자, 발암물질과 사이토카인(cytokine)과 같은 여러 종류의 자극에 의해 발현되며 종양세포와 염증세포 등에 서 생성되는 프로스타글란딘의 양을 조절하는 역할을 한다(7). 최근에는 COX-2가 직장암 발생과 밀접한 관계가 있음이 보고되고 있다(8).

직장암을 포함하는 전체 대장암은 1995년도 국내 암 등록 환자 조사 결과 남자의 경우, 위암, 간암, 폐암에 이어 4번째이며, 여자의 경우도 자궁경부암, 위암, 유방암에 이어서 4번째로 발병률이 높은 암이다. 직장암은 40세 이후 발병률이 증가하여 60세 전후로 최고에 달한다.

직장암은 유전적 요인에 의한 발병률이 높다. 결장 및 직장암은 대략 환경적 요인과 유전적 요인으로 설명한다. 친척 중 대장암 환자가 있는 경우 일반인에 비해 대장암에 걸릴 확률이 높으며, 40세 이전에 대장암에 걸리는 경우에는 가족력이 있는 경우가 많다. 유전성 비용종증 대장암은 전체 대장암 환자의 5~20%나 차지하는 것으로 알려져 있어서 가족력에 대한 중요성이 강조되고 있다.

직장암은 항문연에서 약 15~16cm 부근의 S결장직장 이행부와 항문 사이에서 발생하는 암을 말한다. 직장암의 가장 흔한 증상은 점액성 혈변이다. 때로는 항문 출혈이 유일한 증상이기 때문에 전문의를 찾지 않아 암의 진행을 방치하는 경우가 많다. 직장암은 조기 발견하는 경우 완치도 가능하다.

따라서, 유전적 소인이 큰 비중을 차지하는 직장암은 발암 이후의 항암 치료보다 발암을 억제하는 암예방이 매우 중요하다.

외부의 발암물질은 단계(phase) Ⅰ 효소의 한 종류인 사이토크롬 p-450-의존 성(dependent) 모노옥시게네이즈 체계(monooxygenase system)에 의해 대사되어 전자 친화적 물질(electrophilic product), 에폭사이드(epoxides) 또는 매우 독성이 강한 물질이 된다. 그러므로 사이토크롬 P450("CYP") 효소의 활성을 억제하면 암예방의 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

퀴논 환원효소(Quinone reductase; "QR")와 같은 단계 Ⅱ 효소의 유도는 화학적인 스트레스와 암 발생과정 중의 개시(initiation) 단계에서 돌연변이 물질, 발암물질로부터 세포를 보호하는 주요대사이다.

폴리아민과 폴리아민 생합성을 위한 효소도 암 발생과정의 촉진단계와 세포의 과다증식(hyperplasia)에 중요한 역할을 한다. 특히 폴리아민{퓨트레신(putrescine), 스퍼미딘(spermidine)과 스퍼민(spermine)}은 종양 형성시 비정상적으로 생합성되며 폴리아민 생합성과정에서 중요한 효소인 오르니틴 디카복실레이즈(ornithine decarboxylase; "ODC")는 정상세포와 종양세포의 증식에 필수적이다. 생쥐의 여러 조직을 이용한 암 촉진 실험에서 ODC 활성 유도와 발암물질의 암 촉진능력 간의 밀접한 관계가 보고되었다. 특히 ODC 활성유도가 직장암 발생과정에서도 관찰되었다.

본 발명은 직장암 예방효능을 갖는 천연물질 유래 암 예방제를 제공함으로써 화학합성 항암제의 부작용을 극복하려는 것을 그 목적으로 한다.

위와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 여러 천연물질들을 탐색하 던 중 키토산 올리고당이 직장암 예방효과를 나타냄을 알게 되어 본 발명에 이르게 되었다.

키토산은 천연(게나 새우껍질, 갑각류 등)에 존재하는 키틴을 탈아세틸화시킨 물질로서 키토산은 여러 가지 생리활성을 나타냄에도 불구하고 그 분자량이 매우 크고 우리 몸에 이를 분해하는 효소가 존재하지 않아서 그 응용 폭이 제한되고 그대로 섭취시에는 대부분 흡수되지 않고 체외로 배출된다. 천연에 존재하는 키틴은 부분적으로 탈아세틸화되어 있는 것이 보통인데 이러한 키틴의 단량체에서 아세틸기가 떨어져 나간 형태가 바로 키토산이다. 통상 D-글루코사민이 5,000개 이상이 반복적으로 결합하고 분자량이 100만 이상인 탄수화물을 키토산이라 한다. 키토산은 약산에 용해되며 분자내 (+)이온을 가지고 있으며 특히 항균성이 높은 것으로 알려져 있어 천연 보존제로서 일반식품에 많이 사용된다.

키토산의 부분 분해물인 키토산 올리고당은 우리 몸에 흡수가 잘 되며 물에 잘 녹기 때문에 식품 첨가물 등으로 사용이 용이하다. 또한 높은 수용성으로 체내 흡수율이 뛰어나 면역증강, 항균작용, 콜레스테롤조절, 칼슘흡수촉진 등의 광범위한 고기능성 생리활성물질로 밝혀져 관심이 집중되고 있다.

본 발명은 키토산 올리고당을 유효성분으로 함유하는 직장암 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 퀴논 환원효소, 글루타치온 S-전이효소 활성 유도효과를 나타냄으로써 직장암 예방 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 키토산 올리고당을 유효성분으로 함유하는 직장암 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 발암물질 활성화에 기여하는 사이클로옥시게네이즈 2 발현을 억제함으로써 직장암 예방 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 키토산 올리고당을 유효성분으로 함유하는 직장암 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 키토산 올리고당은 갑각류 등으로부터 추출하여 얻을 수 있고, 키토산 올리고당 제품으로 판매되는 것도 많다. 본 발명의 실시예에서는 판매되는 키토산 올리고당을 입수하여 실험하였다.

본 발명의 약학 조성물은 유효성분인 키토산 올리고당만으로 구성될 수 있으나, 기타 약제학적으로 사용 가능한 담체, 부형제 및 첨가제를 더 포함할 수도 있다. 또한, 목적에 따라 다른 활성성분과 혼합하여 효과를 증진시킬 수도 있다.

본 발명의 약학 조성물은 임상적으로 투여시 약제학적으로 허용되는 담체와 키토산 올리고당을 배합하여 경구 또는 비경구 투여에 적합한 고체, 반고체 또는 액체 형태의 약제학적 제제로 제형화하여 투여할 수 있다. 이러한 목적으로 적합하게 사용할 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체는 고체이거나 액체일 수 있으며 희석제, 향미제, 가용화제, 윤활제, 결합제, 붕해제 중의 어느 하나 또는 그 이상일 수 있다. 본 발명의 조성물로부터 제조되는 제제의 예로는 정제, 환제, 분말, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등을 예시할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 사람의 경우 키토산 올리고당의 통상적인 1일 투여량은 0.1 내지 10g/kg 체중, 바람직하게는 30 내지 1,000mg/kg 체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.

그러나, 활성성분의 실제 투여량은 치료할 질환, 투여경로, 환자의 연령, 성별, 체중과 질환의 중증 정도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하며, 따라서 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

아래에서는 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 실시예를 들어 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래 실시예의 기재에 의하여 제한되는 것은 아니다.

<시료>

냉동건조한 시료 키토산 올리고당 (1,000<Mw<3,000)은 (주)키토라이프(서울, 한국)로부터 제공받아 실험에 사용하였다.

<실시예 1. 세포배양>

계대 보존 중인 사람 직장 아데노카시노마(colorectal adenocarcinoma) HT-29 세포(KCLB 30038)를 10% 우태혈청(fetal bovine serum; "FBS")이 포함된 RPMI 1640 배양액에서 CO₂ 배양기(5% CO₂, 37℃)로 배양하였다. 배양액은 3일 또는 4일 간격으로 교환해 주었다. 이 세포는 액체 질소의 기체상태 (-150℃)에 보존해 두었 다가 같은 passage 번호를 가진 세포를 녹여서 실험에 사용하였으며, 세포의 생존은 트리판 블루 익스클루젼(trypan blue dye exclusion) 방법으로 확인하였다.

<실시예 2. 퀴논 환원효소(QR) 활성 측정>

HT-29 세포 내의 퀴논 환원효소 활성은 Prochaska와 Santamaria의 방법(9)으로 측정하였다. 퀴논 환원효소 특이 활성(specific activity) 계산은 분당 환원된 MTT(3,4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)의 흡광도와 크리스탈 바이올렛의 흡광도에 의해 산출하였고, 퀴논 환원효소의 활성유도는 대조군의 활성과 시료에 의한 활성의 비로 계산하였다.

<실시예 3. 글루타치온 S-전이효소 활성 측정>

세포내 글루타치온 S-전이효소("GST") 활성 측정은 Habig 등(10)의 방법을 참고하여 측정하였다.HT-29 세포를 96-웰 플레이트의 각 웰에 1×10⁴ 세포 접종시키고 24시간 배양 후, 농도별 키토산 올리고당이 포함된 새 배양액 200 ㎕을 각 웰에 처리하였다. 48시간 배양 후, 세포를 세척하고 용균시켰다. 배양된 세포 내에서 유도된 글루타치온 S-전이효소 활성 측정을 위해 0.1M 인산칼슘완충액(pH 6.5)에 2.5mM 글루타치온("GSH"), 1mM CDNB(chloro-2,4-dinitrobenzene)를 첨가한 혼합액을 100㎕씩 각 웰에 가하고 1분간 플레이트 교반기에서 교반한 후, 3분간 흡광도의 증가를 마이크로플레이트 판독기, 380nm에서 측정하였다.

<실시예 4. 사이클로옥시게네이즈-2 발현>

세포의 최종수를 3×10⁵cells/㎖로 조정하여 12 웰 플레이트의 각 웰에 24시간 부착시킨 후에 시료를 농도별로 50㎕씩 가하였다. 이를 37℃ CO₂ 배양기에서 다시 2시간 배양시킨 후 TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate) 150nM의 농도를 가하여 사이클로옥시게네이즈-2를 유도하였다. 이를 30시간 동안 배양한 후 세포의 용균액(lysate)을 준비하여 웨스턴 블랏 분석에 사용하였다. 즉 세포 용균액의 단백질은 전기영동으로 분리하고 20% 메탄올, 25 mM Tris, 192 mM 글라이신(glycin)이 포함된 완충액을 사용하여 니트로셀룰로스 막으로 이동시켰다. 단백질이 이동된 막은 Ponceau 용액으로 이동 유무를 확인한 후, 5% 탈지분유(non-fat dry milk) 용액으로 30분간 실온에서 반응하여 차단하였다. 그리고 차단용 완충액으로 희석한 1차 항체와 막을 4시간 이상 반응하였다. 반응이 끝난 후 TTBS(Tris-Tween buffered saline)를 사용하여 5분 간격으로 6회 세척하였다. 계속하여 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 부착된 2차 항체와 반응시키고 다시 한번 TTBS로 6회 세척하였다. 세척이 끝나면 증류수로 세척하고 ECL 용액으로 2분간 반응하고 필름에 감광하여 나타난 띠의 두께를 비교하여 단백질 발현 유무 및 그 차이를 확인하였다.

<실시예 5. 통계학적 처리>

실험결과는 평균±표준편차(standard deviation, SD)로 나타내었으며, 실험 에 대한 유의성 검정을 위해 student's t-test를 수행하여 결과치는 p 값이 0.05 미만인 경우를 통계학적으로 의미 있는 것으로 간주하였다.

<결과 1. 퀴논 환원효소 및 글루타치온 S-전이효소 활성>

키토산 올리고당은 농도 0.1～5.0 ㎎/㎖ 처리에 의해 퀴논 환원효소 활성을 최대 1.7배 유도하였으며 농도의존적으로 활성을 증가시켰다(도 1). 그리고 배양한 직장암 세포주 HT-29에서 글루타치온 S-전이효소 활성도 통계적으로 유의성 있게 증가시킴을 관찰할 수 있었다(도 2). 단계 Ⅱ 생체 해독효소의 유도는 발암과정의 개시단계를 저해하는 중요한 방어 기작이다. 즉 퀴논 환원효소는 퀴논을 환원시켜 무독하게 만들고, 발암물질에 의해 일어나는 돌연변이와 종양화 효과를 막아주는 역할을 한다. 글루타치온 S-전이효소는 외부 이물질의 대사 과정 중 생성된 친전자성 대사산물을 글루타치온과 결합하여 용해되기 쉬운 수용성 물질로 만들어 배설시키는 효소로서(11), 이 효소는 생체 내의 글루타치온을 기질로 이용하여 발암의 직접적인 원인이 되는 활성 중간 대사산물을 제거함은 물론 항산화 활성의 역할도 한다. 따라서 암예방 물질을 검색하는 데 있어서 글루타치온 S-전이효소는 단계 Ⅱ 효소 중의 하나로서 발암개시 단계의 생화학적 표식자로 이용되고 있다. 직장암 세포주 HT-29에서의 단계 II 생체 해독효소의 활성 증가는 직장에서의 직장암 발생 관련 발암물질의 활성을 억제하여, 결과적으로 직장암 발생을 억제할 수 있는 것으로 보고되었다(13,14). 그러므로 키토산 올리고당이 HT-29 세포에서 퀴논 환원효소와 글루타치온 S-전이효소 활성을 증가시켰으므로, 키토산 올리고당은 단계 II 생 체해독효소의 활성 증가작용에 의하여 직장암발생의 개시를 저해할 수 있을 것으로 보인다.

<결과 2. 사이클로옥시게네이즈 2 활성에 미치는 영향>

키토산 올리고당이 인체 대장암 세포인 HT-29 세포에서 TPA에 의해 유도된 사이클로옥시게네이즈 2("COX-2")의 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블랏 분석으로 살펴본 결과, 키토산 올리고당이 사이클로옥시게네이즈 2 단백질의 발현을 농도의존적으로 억제하였다(도 3). 사이클로옥시게네이즈 2는 염증반응, 여러 악성종양의 발생, 전이, 혈관 생성 등과 관계가 있는 것으로서 키토산 올리고당이 사이클로옥시게네이즈 2의 발현을 억제하는 것은 직장암 발생과정의 촉진을 억제하는 효과가 있을 것으로 기대된다.

위에서 살펴본 바와 같이, 키토산 올리고당은 직장암 발생 예방제로 사용할 수 있으므로, 특히 유전적 요인에 의한 직장암의 예방에 유용하다.

Claims

키토산 올리고당을 주요 활성성분으로 하는 직장암 예방용 약학 조성물.
제1항에 있어서,

단계 Ⅱ 해독효소인 퀴논 환원효소 또는 글루타치온 S-전이효소 활성 유도효과를 나타내는 것을 특징으로 하는, 키토산 올리고당을 주요 활성성분으로 하는 직장암 예방용 약학 조성물.
제1항에 있어서,

사이클로옥시게네이즈 2의 발현 억제 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는, 키토산 올리고당을 주요 활성성분으로 하는 직장암 예방용 약학 조성물.