KR20080075387A - 생체적합성의 주사형 하이드로 젤을 이용한 신경 재생용조직공학 이식체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생체적합성의 주사형 하이드로 젤을 이용한 신경 재생용 조직공학 이식체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 생체적합성 및 온도감응성의 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 블록 공중합체 또는 졸-젤 상전이가 가능한 생체적합성의 소장점막하 조직 파우더의 하이드로 젤을 조직공학용 지지체로 사용하여 성체 줄기세포 또는 신경계 세포와 생리활성물질을 상기 지지체에 복합화하여 손상된 척수 신경에 이식하여 시간이 경과하면서 신경축삭이 연결되어 중추신경으로의 역할을 재생 또는 복원이 가능한 조직공학용 이식체에 관한 것이다.
폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 블록 공중합체, 소장점막하 조직 파우더, 조직공학용 지지체, 조직공학용 이식체

Description

생체적합성의 주사형 하이드로 젤을 이용한 신경 재생용 조직공학 이식체{Development of tissue engineered scaffolds for nerve regeneration using biocompatible and injectable hydrogel}
도 1은 실시예 1과 2에 의해 배양된 줄기세포의 역상현미경 사진을 나타낸 것이다[(A) 근육 유래 줄기세포, (B) 지방 유래 줄기세포, (C) 골수 유래 줄기세포, (D) 신경 유래 줄기세포, (E) 후각신경 외피세포, (F) 슈반세포 (배율: 40)].
도 2는 신경 재생용 생체적합성 하이드로 젤의 상전이 거동사진으로, (A)와 (B)는 실시예 3에 의해 합성된 공중합체로 (A)는 상온 25 ℃에서 찍은 졸 상태의 사진이고, (B)는 37 ℃에서 젤로 상전이가 일어난 사진을 나타낸 것이며, (C)와 (D)는 실시예 4에서 제조된 소장점막하조직 파우더로, (C)는 상온 25 ℃에서 찍은 졸 상태의 사진이고, (D)는 37 ℃에서 젤로 상전이가 일어난 사진을 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 5에 의해 시행되어 지는 수술법을 나타낸 사진으로 (A)는 수술모습을, (B)는 수술시 절단되는 척수의 길이별로 완전 절단된 모습으로 (B1) 1 mm, (B2) 3 mm, (B3) 5 mm를 나타낸 사진이며, (C)와 (D)는 실시예 4의 소장점막하 조직 젤의 이식을, (E)와 (F)는 실시예 3의 합성 하이드로 젤의 이식을 나타내는 사진이다.
도 4는 실시예 6의 수술 모델의 운동력을 평가하기 위한 BBB 스코어의 장면을 나타낸 사진으로, 도 4a는 움직임을 관찰하기 위한 원형의 판이며, 도 4b는 길이별 손상 모델의 점수를 나타낸 그래프이며, 도 4c는 각 이식체 군의 점수를 나타내었다.
도 5는 운동력 향상을 위한 재활 훈련을 나타낸 사진으로, 도 5A는 줄기세포와 성장인자를 복합화한 실시예 3의 하이드로 젤 이식체를 이식한 1 mm 수술모델의 4주 후 회전하는 원통 위에서 운동하는 사진이며, 도 5B는 수영하는 모습을 나타낸 사진이다.
도 6은 운동력 향상을 위한 재활 훈련을 나타낸 사진으로, 도 6A는 줄기세포와 성장인자를 복합화한 실시예 4의 소장점막하 조직 젤 이식체를 이식한 1 mm 수술모델의 4주 후 회전하는 원통 위에서 운동하는 사진이며, 도 6B는 수영하는 모습을 나타낸 사진이다.
도 7은 실시예 7에 언급된 재생된 신경을 정량적으로 평가하는 운동유발 전위검사를 시행하는 모습을 나타낸 사진이다.
도 8은 실시예 8에서 실행된 재생된 신경의 정도를 조직학적으로 평가하기 위한 면역화학적 염색 사진으로, 실시예 3의 하이드로 젤 이식체의 이식 4주 후 적출된 척수신경 조직 사진(A)이며, 실시예 4의 소장점막하 조직 젤 이식체의 이식 4주 후 적출된 척수신경 조직 사진(B)이며,(C1)은 정상모델의 H&E, (C2)는 정상모델의 NF, (C3)은 정상모델의 NSE, (D1)은 실시예 3의 하이드로 젤 이식 모델의 H&E, (D2)은 실시예 3의 하이드로 젤 이식 모델의 NF, (D3)은 실시예 3의 하이드로 젤 이식 모델의 NSE, (D4)는 실시예 3의 하이드로 젤 이식 모델의 GFAP, (D5)는 실시예 3의 하이드로 젤 이식 모델의 BrdU이며 (E1)는 실시예 4의 소장점막하 조직 젤 이식모델의 H&E, (E2)는 실시예 4의 소장점막하 조직 젤 이식모델의 NF, (E3)은 실시예 4의 소장점막하 조직 젤 이식모델의 NSE, (E4)는 실시예 4의 소장점막하 조직 젤 이식모델의 GFAP, (E5)는 실시예 4의 소장점막하 조직 젤 이식모델의 BrdU 염색 사진이다.
본 발명은 생체적합성의 주사형 하이드로 젤을 이용한 신경 재생용 조직공학 이식체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 생체적합성 및 온도감응성의 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 블록 공중합체 또는 졸-젤 상전이가 가능한 생체적합성의 소장점막하 조직 파우더의 하이드로 젤을 조직공학용 지지체로 사용하여 성체 줄기세포 또는 신경계 세포와 생리활성물질을 상기 지지체에 복합화하여 손상된 척수 신경에 이식하여 시간이 경과하면서 신경축삭이 연결되어 중추신경으로의 역할을 재생 또는 복원이 가능한 조직공학용 이식체에 관한 것이다.
중추신경계에서 신경계가 손상을 입었을 경우 기능을 상실하게 될 뿐만 아니라 손상된 신경계를 회복시키거나 재생시키는 것은 거의 불가능하다고 알려져 왔 다. 하지만, 최근 수 년 전부터 분자생물학에 의한 신경 과학이 발달되면서 신경세포의 구조와 기능이 분자 수준에서 해명되고 있으며, 신경전달물질과 신경영양성장인자의 중요성이 부각되면서 약 10여 년 전부터 오랜 동안의 정설을 뒤엎고 중추신경을 재생할 수 있다는 사실이 입증되고 있다.
신경을 재생하기 위한 첫 번째 방법은 손상된 부위를 재생에 적합한 생물학적 환경으로 개선시키는 것이고 두 번째 방법은 신경축삭 자체의 재생능력을 강화시키는 것이다. 생물학적 환경을 개선하기 위해서는 손상부위에서 교세포로 분비되는 신경재생 저해 단백질을 차단하고, 재생을 유도하는데 필수적이라고 알려진 세포들, 즉 슈반씨 세포, 후각신경 외피세포, 신경줄기세포 등을 외부로부터 손상 부위로 투여하는 방법이 현재까지 알려진 가장 좋은 방법이다. 또한, 신경 축삭의 재생 능력을 강화시키는 방법으로는 신경성장인자나 신경영양인자를 투여하는 방법이 가장 효과적이다. 신경성장인자인 NGF(Nerve growth factor), BDNF(brain-derived neurotrophic factor), NT-3(neurotrophin-3), NT-4/5(neurotrophin-4/5)는 중추신경계 세포의 성장 및 분화, 생존, 사멸 등 다양한 기능을 조절하는 신경성장인자들이다. 즉, 신경질환의 치료를 위한 신경성장인자들이 조직과 세포의 복원을 유도하고 성장을 촉진한다는 것이 알려짐에 따라 척수손상 부위에 처리했을 때 치료의 효과를 나타낸다.
줄기세포는 체내의 어느 위치에서도 특정 조직 또는 세포로 정확히 대체할 수 있는 독특한 특징을 가지고 있으며 특정 세포형태의 전구세포로 분화될 수 있는 데, 이는 줄기세포가 재생의학의 매우 훌륭한 세포 재원이 될 수 있으며, 손상된 장기의 치료나 복원에 있어서 많은 가능성을 제시하고 있다. 줄기세포는 크게 배아 초기 또는 태아 생식세포로부터의 배아줄기세포(embryonic stem cell)와 성체의 골수나, 지방, 및 근육 등에서 분리되는 미성숙세포인 성체줄기세포(adult stem cell)로 나뉘는데, 이들은 모두 세포 치료나 유전자 치료에 있어서 크나큰 잠재력을 가지고 있다. 그러나, 배아줄기세포의 경우 윤리적인 문제를 배제할 수 없기 때문에 성체줄기세포 연구에 더욱 박차를 가하고 있으며, 골수에서 유래된 성체줄기세포를 이용하여 신경질환 치료를 위한 신경 세포화에 많은 연구가 수행되고 있다. 골수 내에 존재하는 전체 중간엽 줄기세포의 수는 1 X 106 정도 존재한다고 알려져 있으며, 소량의 골수를 채취하여 중간엽 줄기세포를 배양하는 기술은 이미 국내외적으로 축척되어 있고 실제로 임상시험에 사용되어 왔다. 근위축성 측색경화증 환자에서 중간엽 줄기세포를 이용한 치료가 보고된 바 있으며 조혈줄기세포 척수강 내 주입 및 단핵세포 척수강 내 주입의 치료예가 있다. 외상성 척수손상 환자를 대상으로 자가 유래 중간엽 줄기세포 치료의 임상연구가 국내에서 진행중이며 중간엽 줄기세포를 중증 사지 마비환자에게 환자 자신의 중간엽 줄기세포를 주입한 뒤 운동신경의 회복 여부를 관찰하여 손목과 손가락, 팔꿈치 부분의 운동신경이 일부 호전되는 긍정적인 효과를 보이고 있다.
상기 언급한 바와 같이 손상된 척수 신경을 재생하기 위한 기술로 세포치료방법이 널리 연구 개발되고 있지만 이러한 기술은 파종된 줄기세포가 장기간 생존 하지 못하므로 인해 신경 재생 능력이 현저히 저하됨이 일반적으로 알려져 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 신경 재생 세포원이 장기간 생존하며 신경 재생 능력의 향상에 관한 연구가 필요하게 되었고 이 문제는 조직공학적 방법을 이용하여 극복할 수 있음이 제시되어지고 있다.
조직공학은 지지체, 세포, 생리활성 물질, 이 세 가지 중요한 요소로 이루어져 있다. 일반적으로 골세포나 조직세포, 연골세포, 및 줄기세포와 같은 다양한 세포, 세포의 생착 능력을 향상시켜 세포를 장기간 생존시킬 수 있는 생체적합적 생분해성 지지체, 그리고 세포의 증식 및 분화에 영향을 주는 여러 가지 싸이토카인이나 성장인자와 같은 생리활성 물질을 복합화하여 조직공학적 이식체가 제조된다.
최근 발달된 의학의 도움으로 각종 신체 장기의 이식이 활발해지고 있으나 장기 기증자의 부족에 의한 이식 대기자의 증가는 날로 심화되고 있기 때문에 손상된 장기나 조직의 일부를 대체하기 위하여 생체조직 공학적으로 결손된 장기나 조직을 재생 또는 대체하고자 다양한 생체적합적 생분해성 지지체가 개발되어져 왔다. 이러한 생체조직공학의 성공적인 개발을 위해서는 체내에서 분리된 조직 세포를 체외에서 삼차원 구조를 가진 조직의 형태로 재구성하기 위한 지지체가 필수적이다. 본 발명에서는 중추신경 재생을 위한 이식용 생체적합성 지지체를 발명하였다.
본 발명자들은 친수성 고분자로 물과 유기용매에 높은 용해도를 가지며 비독성이고 면역 작용에 거부반응이 없고, 소수성인 생분해성 에스터계열의 고분자와 화학적 결합을 하여 생체에 적용되었을 경우 이 공중합체에 물의 유입을 증가시켜 분해 기간을 조절할 수 있는 폴리에틸렌글리콜을 사용하고, 또한 인체 내에서 용해, 화학적 가수분해, 그리고 효소에 의한 분해 등을 통하여 생물학적 대사산물로 분해가 되어 신체 외부로 배출되기 때문에 생체적합성이며, 분자량과 화학적 구성성분을 조절함으로써 분해기간을 조절할 수 있는 소수성의 생분해성 에스터계열인 카프로락톤(CL)을 필수구성성분으로 하고, 파라다이옥사논(PDO), 트리메틸렌카보네이트(TMC) 또는 이들이 동시에 특정 함량 비율로 중합하여 수용액상에서 온도와 농도에 따른 졸-젤 상전이 거동을 소수성부의 종류 및 화학적 구조의 변화를 통하여 연구하였고, 졸 상태의 공중합체를 쥐에 주사하여 신체 온도 부근에서의 젤 형성을 확인하였고, 폴리에틸렌글리콜로 구성된 친수성부와, 카프로락톤(CL) 세그먼트가 필수성분으로 함유되고, 파라다이옥사논(PDO) 세그먼트, 트리메틸렌카보네이트(TMC) 세그먼트, 또는 이들 세그먼트가 동시에 함유된 생분해성 폴리에스터계 소수성부로 이루어진 블록 공중합체로서, 공중합체의 분자량이 2,000 ∼ 7,000 g/mole인 생체적합성 및 온도감응성의 폴리에틸렌글리콜/생분해성 폴리에스터 블록 공중합체를 개발하여 특허 출원한 바 있다[특허 출원 제2006-0023991호].
또한, 소장점막하 조직을 산성 용액과 펩신에 혼합하여 제조된 소장점막하 조직 용액을 염기성 용액으로 생체와 맞는 pH로 적정하고 이를 동결 건조시켜 소장점막하 조직 파우더를 제조하고, 고분자를 사용하지 않고도 상기 소장점막하 조직 파우더를 수용액 상으로 생체 내 주사시 그 자리에서 젤을 형성할 수 있는 주사용 하이드로 젤을 개발하여 특허를 출원한 바 있다[특허 출원 제 2006-100430].
따라서, 본 발명은 상기와 같은 기술을 바탕으로 하여 중추신경 재생을 목적 으로 줄기세포와 생리활성 물질을 포함하는 조직공학적 이식체의 개발에 있다.
이에, 본 발명자들은 상기와 같은 기술을 바탕으로 하여 이미 출원된 생체적합성 및 온도감응성의 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 블록 공중합체 또는 졸-젤 상전이가 가능한 생체적합성의 소장점막하 조직 파우더의 하이드로 젤을 조직공학용 지지체로 사용하여 중추신경 재생을 목적으로 성체 줄기세포 또는 신경계 세포와 생리활성물질을 복합화한 조직공학적 이식체를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 상기 선발명 특허의 개량발명으로서, 생체적합성 및 온도감응성의 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 블록 공중합체 또는 졸-겔 상전이가 가능한 생체적합성의 소장점막하 조직 파우더를 이용한 조직공학용 이식체를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 급성 또는 만성 척수 손상 부위를 부분 또는 완전 절개 후 상기 이식체를 이식하여 신경 재생을 유도하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은
성체 줄기세포 또는 신경계 세포와 생리활성물질을 생체적합성 지지체에 복합화한 조직공학용 이식체에 있어서,
상기 생체적합성 지지체는 생체적합성 및 온도감응성의 폴리에틸렌글리콜/생분해성 폴리에스터 블록 공중합체 또는 졸-젤 상전이가 가능한 생체적합성의 소장점막하조직 파우더의 주사형 하이드로 젤인 조직공학용 이식체를 그 특징으로 한다.
상기 생체적합성 및 온도감응성의 폴리에틸렌글리콜/생분해성 폴리에스터 블록 공중합체는 폴리에틸렌글리콜로 구성된 친수성부와, 카프로락톤(CL) 세그먼트가 필수성분으로 함유되고, 파라다이옥사논(PDO) 세그먼트, 트리메틸렌카보네이트(TMC) 세그먼트, 또는 이들 세그먼트가 동시에 함유된 생분해성 폴리에스터계 소수성부로 구성되고 있으며, 분자량이 2,000 ∼ 7,000 g/mole이고, 상기 졸-젤 상전이가 가능한 생체적합성의 소장점막하 조직 파우더는 소장점막하 조직을 펩신과 산성 용액에 혼합하고, 염기성 용액으로 pH 5.5 ~ 7.8로 적정한 후 동결 건조시켜 분말화하여 제조된 것으로, 상기 공중합체 또는 파우더를 인산완충용액으로 주사형의 하이드로 젤로 제조하여 이식체로 사용한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 생체적합성 및 온도감응성의 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 블록 공중합체 또는 졸-젤 상전이가 가능한 생체적합성의 소장점막하 조직 파우더의 하이드로 젤을 조직공학용 지지체로 사용하여 성체 줄기세포 또는 신경계 세포와 생리활성물질을 상기 지지체에 복합화하여 손상된 척수 신경에 이식하여 시간이 경과하면서 신경축삭이 연결되어 중추신경으로의 역할을 재생 또는 복원이 가능한 조직공학용 이식체에 관한 것이다.
먼저, 본 발명에서 사용된 성체 줄기세포 및 신경계 세포에 대해 설명하면 다음과 같다.
줄기세포는 체내의 어느 위치에서도 특정 조직 또는 세포로 정확히 대체할 수 있는 독특한 특징을 가지고 있으며 특정 세포형태의 전구세포로 분화될 수 있는데, 이는 줄기세포가 재생의학의 매우 훌륭한 세포 재원이 될 수 있으며, 손상된 장기의 치료나 복원에 있어서 많은 가능성을 제시하고 있다.
골수 유래 간엽 줄기세포는 줄기세포군의 복합적인 특징을 나타낸다. 즉, 이들은 in vitro에서 우수한 확장성을 가지며 복합적인 중배엽성 형태로 분화할 수 있고 이들의 신경세포로의 분화는 신경질환의 치료에 있어서 매우 획기적인 결과로서 이는 비교적 손쉽게 분리하여 대량으로 배양할 수 있는 세포를 이용함으로써 다양한 신경질환의 새로운 치료방법을 제시하고 있다.
또한, 골격근 유래 줄기세포와 지방 유래 줄기세포는 주변 환경에 따라 다양한 세포로 분화할 수 있는 줄기세포군의 복합적인 특성을 나타내며, 간단하게 분리할 수 있고 in vitro 상에서 대량으로 증식시킬 수 있다. 신경 줄기세포는 혈액, 뼈, 연골세포 등으로 분화되면서 배엽을 뛰어 넘는 다분화능을 나타낸다. 신경 줄기세포는 신경세포나 교세포 등으로 분화하면서 신경 조직을 증식 및 회복 시킬 수 있다.
신경계 세포원인 후각신경외피세포는 후각신경을 둘러싸고 있는 세포로 중추 신경의 일부로 신경 재생에 결정적인 역할을 한다고 널리 알려져 있으며 슈반 세포 역시 척수 신경 재생 효과와 실제 환자에게 적용 시 자가 이식이 가능한 재생 세포 원이다.
이들 줄기세포와 신경계 세포의 분리와 배양법은 이하 실시예에서 상세하게 설명하였다.
본 발명에 사용 된 생리활성 물질로 뉴로트로핀계열의 신경성장인자인 NGF(Nerve growth factor), BDNF(brain-derived neurotrophic factor), NT-3(neurotrophin-3), NT-4/5(neurotrophin-4/5)는 세포의 생물학적 활성에 영향을 주는 특정한 구조를 가지는 수용성 분자인 폴리펩타이드의 한 종류로 세포 분열은 촉진시켜 세포수를 증가시킬 뿐 아니라 형태를 변화시키기도 하며 분화를 유도하는 등 다양한 작용을 한다. 또한, 줄기세포와 성장인자를 포함한 조직공학적 이식체의 제조는 이하 실시예에서 상세하게 설명한다.
신경 손상 후 재생을 위하여 손상된 척수 부위를 외부로부터 격리하고 이식된 세포나 투여된 신경재생 유도물질이 머물러 있도록 하는 지지체의 역할은 매우 중요하다. 조직공학용 지지체는 생분해성을 가지는 합성고분자와 천연재료가 많이 이용되고 있고 최근 소장점막하 조직은 천연생체고분자 막으로서 단독 또는 합성 고분자와 복합화되어 사용되어지고 있다. 본 발명에서는 이러한 생체적합성 지지체로 온도감응성 폴리에틸렌글리콜/생분해성 폴리에스터 블록 공중합체, 소장점막하조직을 사용으로 조직공학적 지지체를 개발하였다.
본 발명에서 지지체로 사용되는 생체적합성 및 온도감응성의 폴리에틸렌글리콜/생분해성 폴리에스터 블록 공중합체에 대해 설명하면 다음과 같다.
폴리에틸렌글리콜/생분해성 폴리에스터 블록 공중합체의 중합 개시제로 사용 한 폴리에틸렌글리콜(PEG)은 약물 전달 분야에서 많은 장점을 가지고 있어 약물 전달체로서 약물을 쉽게 포접, 방출할 수 있으며 물과 유기 용매에 높은 용해도를 가지며 비독성이고 면역 작용에 거부반응이 없어 뛰어난 생체적합성을 나타내며 인체 내 사용에 있어서 미국 식품 의약 안전청에서 사용이 승인된 재료로서 제약 제제 산업에서 사용되고 있다. 또한, PEG는 친수성 고분자들 중에서 단백질 흡착 억제 효과가 가장 크고 혈액 접촉 물질의 생체적합성을 향상시키기 때문에 생체 재료로서 많은 응용이 이루어지고 있다. 그러나, PEG를 함유한 생체 재료들을 사용하는 동안 생분해가 일어나지 않는 문제점이 야기되었다. PEG는 비분해성이고 신체에서 축적되기 때문에 복강 내에 주사 후 혈장 콜레스테롤과 중성지방의 독성 증가를 유도하는 것으로 보고되고 있다. 따라서, 이러한 문제점을 해결하기 위하여 신장의 여과작용에 의해 신체로부터 제거가 용이한 분자량 5,000 g/mole 이하의 저분자량 PEG와 인체의 신진대사에 의해 생체적합성 산물로 분해될 수 있는 생분해성 에스터계열의 단량체들과 공중합하여 폴리에틸렌글리콜/생분해성 폴리에스터 블록 공중합체를 제조하게 되었다.
에스터계열의 생분해성 고분자는 분자량과 화학적 구성성분을 조절함으로써 분해기간을 조절할 수 있는 장점을 가지고 있다. 기본 모델이 된 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 폴리카프로락톤(PCL)의 블록 공중합체는 이미 졸-젤 상전이 특성을 보이는 온도감응성 공중합체로서 생체 재료로 응용되고 있다. 그러나, 카프로락톤은 생분해성이면서 여러 고분자와 상용성을 가지며 쉽게 결정화하는 특징을 가지고 있으나 높은 결정성은 생체 적용 시 조직과의 적합성을 감소시키고 장기간의 분 해 거동을 나타내는 단점이 있다.
이에, 카프로락톤에, 생분해성 에스터계열의 파라다이옥사논(PDO), 트리메틸렌카보네이트(TMC) 또는 이들이 동시에 일정한 함량비로 첨가하여 결정성을 낮추고 생분해 기간을 조절하였다. 즉, 다음 화학식 1로 표시되며, 각 세그먼트가 랜덤하게 불규칙적으로 소수성부를 이루고 있다.
Figure 112007012878850-PAT00001
상기 화학식 1에서, x, y 및 z는 각각 소수성 폴리에스터부를 구성하는 각 세그먼트로서, x는 50 ∼ 95 몰%, y+z는 5~50 몰%이다(y 또는 z가 0인 경우 포함).
본 발명에서 저분자량(Mn=350 ~ 2000 g/mole)의 폴리에틸렌글리콜을 친수성부로 하여 에스터계열의 카프로락톤(CL)에, 파라다이옥사논(PDO)과 트리메틸렌카보네이트(TMC), 또는 이들이 동시에 개환 공중합을 통하여 합성한다. 합성 방법은 폴리에틸렌글리콜을 공비 증류를 실시하여 건조시킨 후 에스터계의 단량체를 첨가하고 반응 용매로 메틸렌클로라이드(MC) 또는 톨루엔을 넣고 단량체의 활성화제로서 산 촉매를 사용하여 반응 온도를 -40 ∼ 130 ℃의 범위에서 중합을 실시한다. 상기 산 촉매로는 HCl, HBr, CF3COOH, CCl3COOH, BrCH2COOH, CH3COOH, BCl3, BBr3 및 캄포설폰산(Camphorsulfonic acid) 중에서 선택된 1종 이상이 바람직하다.
합성된 폴리에틸렌글리콜/생분해성 폴리에스터 블록 공중합체의 수용액상이 실온에서는 흐름 특성을 갖는 졸 상태를 유지하고 일정 온도 범위(30 ~ 46 ℃)에 걸쳐 젤을 형성하며, 임계 온도(44 ∼ 47 ℃) 이상에서는 다시 흐름 특성을 보이는 새로운 졸-젤 상전이 거동이 나타나는 온도감응성 재료를 제조하여 시차주사열량계와 X-선 회절기를 이용하여 열적 특성 및 결정성을 분석하였고, 신체 온도 부근에서의 젤 형성을 확인하기 위해 쥐에 주입하여 젤의 형성 및 보전 특성을 확인하였다.
또한, 이러한 온도감응성 블록 공중합체를 주사제형의 약물 전달체나 조직재생용 기능성 지지체로 응용하기 위해서는 낮은 점도와 빠른 젤 형성, 그리고 신체 외부로 쉽게 배출되기 위한 낮은 분자량을 가지고 있어야 하므로 카프로락톤에 에스터계열의 파라다이옥사논(PDO), 트리메틸렌카보네이트(TMC) 또는 이들이 동시에 일정한 함량 비율로 도입함으로써 결정성을 감소시켜 점도를 낮출 수 있었으며, 예상 값에 근접하는 분자량을 얻을 수 있어서 생체적합성 및 온도감응성의 하이드로 젤의 요건 중 하나인 낮은 점도와 낮은 분자량을 유지할 수 있었다.
전체 분자량 2,000 ∼ 7,000 g/mole의 범위의 폴리에틸렌글리콜/생분해성 폴리에스터 블록 공중합체를 합성하는 것이 바람직한데, 전체 분자량이 2,000 g/mole 미만일 경우에는 본 발명의 사용 목적인 인체 온도 범위에서 졸-젤 상전이 거동이 일어나지 않고 계속 졸 상태로 유지가 되는 문제가 있고, 7,000 g/mole을 초과하면 분자량이 커서 생분해가 일어나는데 있어 장기간이 소요되는 문제가 있기 때문이다.
본 발명에서 사용되는 폴리에틸렌글리콜/생분해성 폴리에스터 블록 공중합체 중 대표적인 예로서 다음 반응식 1로 나타낼 수 있다.
Figure 112007012878850-PAT00002
상기 반응식 1에서, n은 친수성부를 구성하는 폴리에틸렌글리콜의 반복 단위를 나타내는 정수이고, x, y 및 z는 각각 소수성 폴리에스터부를 구성하는 각 세그먼트로서 x는 50 ∼ 95 몰%, y+z는 5~50 몰%이다(y 또는 z가 0인 경우 포함).
이렇게 제조된 폴리에틸렌글리콜/생분해성 폴리에스터 블록 공중합체는 기본 모델로 한 폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤 블록 공중합체 보다 낮은 결정성을 가지기 때문에 다루기 쉬운 낮은 점도를 가지고 빠른 젤 형성을 할 수 있으며, 그리고 신체 외부로 쉽게 배출되기 위한 낮은 분자량을 가지고 있어 주사제형의 약물 전달체나 조직공학용 다공성 지지체로 응용할 수 있다. 또한, 장기간의 생분해성을 보이는 카프로락톤에 생분해성 에스터계열의 파라다이옥사논(PDO), 트리메틸렌카보네이트(TMC) 또는 이들을 동시에 일정한 함량 비율로 첨가함으로써 생분해 기간을 조절할 수 있다. 그리고, 폴리에틸렌글리콜/생분해성 폴리에스터 블록 공중합체 수용액은 파라다이옥사논(PDO) 및/또는 트리메틸렌카보네이트(TMC) 등 다양한 종류의 생분해성 고분자에 따라 다양한 온도 범위에서 졸-젤 상전이 거동을 보이기 때문에 본 발명의 목적인 생체 재료로서 인체에 적용 시 생체 온도에서의 젤화되는 특성뿐만 아니라 생체 온도보다 다소 높거나 낮은 온도에서 젤화를 목적으로 하는 용도에도 적용될 수 있다.
또한, 본 발명에서 또 다른 지지체로 적용가능한 생체적합성의 소장점막하 조직 파우더에 대해 설명하면 다음과 같다.
상기 파우더 제조 시 인간을 제외한 포유류의 소장점막하조직을 사용한다. 바람직하기로 상기 포유류로는 소, 돼지, 토끼 및 쥐 중에서 선택된 것이 좋다. 이러한 소장점막하 조직은 비세포조직으로, 대부분이 콜라겐으로 구성되며, 이 외에 다양한 성장인자, 글루코사미노글리칸 및 피브로넥틴 등이 포함되어 있다. 상기 성장인자로는 전환성장인자(transforming growth factor, TGF), 인슐린성 성장인자(insulin-like growth factor, IGF), 섬유아세포성장인자(acidic and basic fibroblast growth factor, aFGF, bFGF), 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 및 신경성장인자(nerve growth factor, NGF) 등이 있으며, 글루코사미노글리칸으로는 히아루논산(hyaluronic acid), 콘드로이틴(chondroitin), 콘드로이틴-4-설페이트(chondroitin-4-sulfate), 헤파란 설페이트(heparan sulfate), 헤파린(heparin), 알긴산(alginic acid), 덱스트란(dextran), 전분(starch), 키틴(chitin) 및 키토산(chitosan) 등이 있다.
이러한 소장점막하조직 내의 세포외 기질 및 사이토카인의 존재는 세포의 부착, 이동, 증식 및 성장과 같은 세포의 기능적인 면에 관여하며 조직재생이나 상처 치유에 매우 유용하게 작용하고, 약물전달체로서도 응용이 가능하다.
먼저, 포유류의 소장점막하 조직을 분리하는데, 포유류의 소장을 분리하여 공장을 제거한 후 식염수에 침지 및 인산완충용액에 침지하였다가 장간막을 제거한 다음 일정한 길이로 자른다. 이렇게 자른 소장을 뒤집어 점막층을 마찰로서 제거한 후 다시 뒤집어 장막과 근육층을 제거하여 소장점막하 조직을 분리한다.
상기 분리된 소장점막하 조직을 동결 건조 후에 분쇄하고 분쇄된 소장점막하 조직을 산성 용액 및 펩신으로 혼합시킨다. 상기 혼합 용액에 염기성 용액을 이용하여 pH 5.5 ~ 7.8, 바람직하게는 pH 6.5 ~ pH 7.5로 적정시켜 젤 형성이 가능한 생체적합성의 소장점막하 조직 파우더를 제조한다.
상기 산성 용액은 pH 2.5 ~ 4.5로 조절할 수 있는 용액이면 가능하고, 바람직하게는 아세트산, 파라톨루엔설포닌산 및 말레인산 중에서 선택된 산(acid)을 1 ∼ 5 중량% 농도로 포함된 수용액을 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 소장점막하 조직, 산성 용액과 펩신의 혼합비는 1 : 1 ~ 5 : 0.1 ~ 2의 중량비가 펩신이 소장점막하조직의 콜라겐 사슬을 풀어주는데 적절한 농도와 조건을 형성해주므로 바람직하다.
상기 염기성 용액은 산성을 적정시켜주고, 피하주사 또는 조직공학용 지지체로써 사용되어 질 때 주변의 세포들의 염증반응을 줄이기 위하여 사용되며, 예를 들어 수산화나트륨(NaOH), 탄산나트륨(Na2CO3), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 인산수소이나트륨(Na2HPO4), 탄산수소칼슘(Ca(HCO3)2), 수산화칼슘(Ca(OH)2), 수산화질산칼슘(Ca(OH)NO3), 수산화염화칼슘(Ca(OH)Cl), 수산화시안칼슘(Ca(OH)CN), 수산화칼륨(KOH), 수산화암모늄(NH4OH) 및 아세트산나트륨(CH3COONa) 중에서 선택된 1종 또 는 2종 이상을 사용할 수 있다. 이러한 염기성 용액을 적정시켜 pH 5.5 ~ 7.8의 생체내 pH와 유사하게 조절한다.
이렇게 고분자를 사용하지 않고 제조된 소장점막하 조직 파우더를 수용액 상으로 생체 내 주사하면 그 자리에서 바로 젤이 형성되어 약물을 서서히 방출할 수 있는 주사용 하이드로 젤을 얻을 수 있었다.
본 발명에 있어서 척수 손상 동물모델의 수술과 재생 과정은 다음과 같다.
본 발명의 실시예에서는 동물모델로 쥐를 선택하여 사용하였으나, 인간을 제외한 포유동물이면 모두 가능하다.
척수 손상 모델의 쥐의 선택에 있어서 재생에 이용되는 세포의 면역반응을 줄이기 위해 일례로 Fischer 쥐를 사용하였다. 이 쥐의 중추 신경 손상은 먼저 척추의 중간 부위의 피부를 제거하고 근막과 근육을 제거하여 척추 뼈의 T8-T9 부위를 노출시킨 후 노출된 척추 뼈를 제거한다. 이때, 척수가 손상되지 않도록 세심한 주위가 필요하다. 척수가 노출되면 마이크로 수술 도구를 이용하여 경막을 조심스럽게 제거하고 척수를 단순 컷팅, 1 mm, 3 mm, 5 mm의 길이로 완전히 절개하여 신경 손상 모델을 확립하였다. 여기에 분화되지 않은 성체 줄기세포 단독 또는 후각신경 외피세포 및 슈반세포를 혼합하고 생리활성 물질인 성장인자를 함유하는 조직공학적 이식체를 이식하였다.
수술 후 척수 손상을 입은 쥐는 하반신이 마비되어 각별한 주의와 관리가 필요하게 된다. 우선, 수술 후 체온 유지를 위하여 히팅베드에 눕힌 후 산소를 공급해주어 수술 후 스트레스로 인한 불규칙한 호흡을 원활하게 도와주었으며 깨끗 한 케이지와 새 베딩으로 옮기고 바닥을 따뜻하게 해준다. 수술 후 일주일간 원활한 뇨의 배설을 위해 하루 두 번 배뇨를 도와주었으며 하루 한번 일정량의 항생제를 주입하였다. 운동력의 향상을 위해 매일 규칙적으로 마사지와 걷기 운동 및 수영을 실시하였다.
본 발명에서 신경 축삭의 재생을 평가하는 지표로 사용된 운동력 평가, 운동유발전위검사 및 조직학적 평가는 다음과 같다.
운동력 평가는 BBB(Basso, Beattie 및 Bresnahan) 스코어를 통해 평가하였고 각 모델별로 채점된 점수는 그래프로 시각화하였다. 운동유발 전위검사를 측정하여 정상모델 또는 척수신경 손상 모델과 척수신경 재생모델의 신경축삭 정도를 정량적으로 평가하였고 조직학적 염색법을 통하여 절단부위에서의 염증반응, 새로운 조직의 형성 여부 및 신경 축삭의 생성을 확인함으로써 중추 신경으로서의 역할이 복원 또는 재생되어짐을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 상기와 같은 실험을 토대로 확보된 재생 세포원과 생리활성 물질 및 신경 재생용 조직공학적 이식체에 의해 보다 효과적인 신경 재생의 방법을 제시하였다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위를 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 특히, 선 출원된 제2006-23991호와 제2006-100430호에 생체적합성 및 온도감응성의 폴리에틸렌글리콜/생분해성 폴리에스터 블록 공중합체 또는 졸-젤 상전이가 가능한 생체적합성의 소장점막하조직 파 우더의 주사형 하이드로 젤에 대한 상세한 설명을 모두 포함한다.
실시예 1 : 척수신경 손상 치료를 위한 세포원으로 이용된 성체 줄기세포의 분리 및 배양
본 발명은 척수손상 부위에 이식을 위한 세포원으로 4가지 종류의 성체줄기세포의 분리 및 배양에 관한 실시예이다.
첫 번째 세포원으로 골격근 유래 줄기세포의 분리 및 신경세포로의 분화이다. 골격근 유래 줄기세포를 분리하기 위해 60 ∼ 80 g Fischer 쥐의 대퇴부에서 근육을 분리하여 콜라겐 분해 효소를 이용하여 세포를 분리하였다. 분리한 세포는 5% 우태혈청, 5% 말혈청 및 2% 항생제를 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)에 부유시킨 후 콜라겐을 코팅한 세포배양 플라스크에 분주하였다. 1 시간이 지난 후 세포배양 플라스크로부터 상층액을 모아 원심 분리하여 배양액으로 세척을 한 후 새로운 세포배양 플라스크에 분주하였다. 이 1 시간 이내에 대부분의 섬유아세포가 플라스크 바닥에 부착하게 되며 세포배양 플라스크에 섬유아세포가 30 ∼ 40% 정도 차게 되면 다시 상층액을 모아 원심분리를 하고 배양액으로 세척하여 새로운 플라스크에 분주하였다. 그 후 2 시간이 지난 후와 1, 2, 및 3 일이 되는 날 같은 과정을 반복하여 골격근유래 줄기세포를 분리하였고, 분리한 세포는 103 ~ 104 세포/cm2의 농도로 세포배양 플라스크에 파종한 후 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배양한 세포는 3 일에 한 번씩 배양액을 교체 해 주었으며 15 일에 한 번씩 계대배양 하였다.
두 번째 세포원으로 지방유래 줄기세포의 분리 및 신경분화이다. 지방 유래 줄기세포를 분리하기 위하여 60 ∼ 80 g의 Fischer 쥐의 복부 지방을 분리하여 콜라겐 분해 효소 처리를 거친 후 세포를 분리하였다. 10% 우태혈청과 1% 항생제가 들어있는 DMEM 배양액를 이용하여 세포를 배양하며 골격근 유래 줄기세포와 같은 방식으로 계대 배양하였다.
세 번째 세포원으로 골수유래 줄기세포의 분리 및 신경분화이다. 골수유래 줄기세포를 분리하기 위하여 60 ∼ 80 g Fischer 쥐의 대퇴골과 하퇴골을 분리하여 1 ㎖ 주사기를 이용하여 인산완충용액(phosphate buffered saline)을 관류하여 골내강의 세포를 획득하여 원심분리를 통하여 분리하였다. 10% 우태혈청과 1% 항생제가 들어있는 DMEM 배양액를 이용하여 세포를 배양하며 골격근 유래 줄기세포와 같은 방식으로 계대 배양하였다.
네 번째 세포원으로 신경유래 줄기세포의 분리 및 신경분화이다. 신경유래 줄기세포를 분리하기 위하여 60 ∼ 80 g Fischer 쥐의 두개골을 절개하고 뇌 부분만 순수하게 분리하였다. 수술용 가위로 조직을 잘라 2회의 세척을 거친 후 신경세포 배양액를 이용하여 배양하며 골격근 유래 줄기세포와 같은 방식으로 계대배양하였다.
실시예 2 : 척수신경 손상 치료를 위한 세포원으로 이용된 신경계 세포의 분리 및 배양
본 발명은 손상된 척수신경을 재생하기 위하여 신경계 세포로서 후각신경 외피세포 슈반세포의 분리 및 배양에 관한 실시예이다.
첫 번째 세포원으로 후각신경외피세포는 60 ∼ 80 g Fischer 쥐의 두개골을 제거 후각망울을 분리하여 HBSS(Hanks 버퍼를 이용하여 2회 세척을 거친 후 0.125% 트립신을 이용하여 조직에서 세포를 분리하였다. 분리된 세포를 10% 우태혈청이 포함된 F12/DMEM 배양액에서 배양하고 3일 주기의 배양액 교환과 15일 주기로 계대하였다.
두 번째 세포원으로 슈반세포는 60 ∼ 80 g Fischer 쥐의 좌골신경을 분리하여 Leibovitiz-15 배양액에 담아 상피를 벗겨낸 후 신경을 1 mm 크기로 잘라서 10 % 우태혈청이 들어있는 DMEM 배양액에서 배양하였다. 일주일에 두 번씩 배양액을 교체하고 일주일 간격으로 새로운 용기로 신경조각을 옮겨주면서 5주 동안 배양하였다.
실시예 3 : 폴리에틸렌글리콜/생분해성 폴리에스터 블록 공중합체의 합성
분자량 3150 g/mole의 MPEG-PCL/PPDO 블록 공중합체를 합성하기 위하여 개시제인 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG) 1.67 g(2.24 mmol) 및 톨루엔 80 mL을 잘 건조된 100 mL 둥근 플라스크에 넣고 딘 스탁 트랩을 사용하여 3시간동안 130 ℃에서 공비 증류를 실시하였다. 증류 후 톨루엔을 모두 제거하고 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG)을 실온으로 냉각시킨 후 미리 정제된 카프로락톤(CL) 5.11 g(2.24 mmol)과 파라다이옥사논(PDO) 0.38 ml(2.24 mmol)를 주입한 후, 반응용매로서 미리 정제된 메틸렌클로라이드(MC) 25 mL을 넣은 다음 중합 촉매로서 HCl을 4 mL 투여하여 24시간동안 실온에서 교반시켜 주었다. 모든 과정은 고순도 질소 하에서 실시하였다. 반응 후 미반응 단량체나 개시제를 제거하기 위하여 600 mL의 헥산과 150 mL의 헵탄에 반응물을 서서히 떨어뜨리면서 침전시켜 주었다. 침전물은 메틸렌클로라이드(MC)에 녹여 거름종이로 거른 후 회전 증발기를 통하여 용매를 제거하고 감압 하에서 건조시켰다. 합성된 블록 공중합체는 EO 가스로 멸균한 후 인산완충용액에 15 ~ 20 wt%로 용해하여 균일 분산시킨 다음 주사 가능한 젤 제형을 제조하였다.
실시예 4 : 생체적합성의 소장점막하 조직 젤의 제조
사후 4 시간 이내의 돼지 공장을 흐르는 물에 깨끗이 씻은 후 일정한 크기로 잘라 핀셋을 이용한 물리적인 힘을 가해 최외각 층인 세로사, 조밀층과 근육 점막층을 제거하고 식염수로 다시 깨끗이 세척하여 튜브형의 소장점막하 조직을 제조하고 -80 ℃의 급저온 냉각기에서 보관하여 사용하였다.
상기 과정을 거쳐 저장된 소장점막하 조직을 동결건조 후, 믹서기로 분쇄하고 동결 미세 분쇄기를 이용하여 10 ~ 30 ㎛ 크기의 분말을 얻은 후, 분쇄된 소장점막하 조직 1 중량%를 3 중량%의 아세트산과 1 중량%의 펩신 및 3차 증류수를 이용하여 48 시간 동안 교반시켜 주었다. 이 후에 형성된 소장점막하 조직 용액을 1N의 탄산나트륨(Na2CO3), 탄산수소나트륨(NaHCO3) 및 수산화나트륨(NaOH)을 이 용하여 pH 7.4를 맞추었다. pH를 맞춘 용액을 동결건조 후에 동결미세분쇄기를 이용해 분쇄시켜 최종 생체적합성 소장점막하 조직 파우더를 얻었다. 이렇게 해서 얻어진 최종 파우더를 pH 7.4인 인산완충용액과 섞어 주사제형 가능한 젤이 형성됨을 확인하였다.
실시예 5 : 줄기세포와 생리활성 물질이 복합화된 이식체의 이식
본 실시예는 제조된 신경재생용 지지체를 동물모델에 이식하는 방법이다.
실시예 3과 4에서 제조된 신경 재생 지지체용 젤은 실시예 1과 2에서 분리한 줄기세포 단독 또는 신경계 세포인 후각신경 외피세포와 슈반세포를 일정량 혼합하여 전체 세포수가 2 × 106개가 되게 하고 신경성장인자인 BDNF(200 ng/scaffold)를 함유하는 이식용 이식체를 준비하였다. 70 ~ 80 g의 5주령 female Fischer 쥐의 흉추(T8 ~ T9) 부분을 도 5와 같이 각 크기 별로 완전 절단하여 손상시킨 후 조직공학적 이식체를 이식하였다. 수술 후 빠른 회복을 위해 산소를 공급해주고 마취가 깰 때까지 40 ℃의 히팅베드에서 휴식을 취하였으며 일주일간 하루 두 번 배뇨를 도와주고 하루 한번 일정량의 항생제를 투입하였다[도 3].
실시예 6 : 운동력 향상을 통한 재생 평가
수술 후 척수 손상 모델의 운동력 향상을 위하여 1주일 후부터 매일 마사지와 로터리 챔버를 통하여 근력을 향상시켜 주었다. 또한, 정기적인 수영연습을 통하여 뒷다리의 움직임을 향상시킬 수 있게 도와주었다. 이와 같이 재활훈련을 거친 모델의 운동력 평가는 수술 후 1주 마다 BBB(Basso, Beattie, Bresnahan) 스코어를 통해 평가하였다[도 4]. 평가 전에 운동력을 향상시키기 위해 회전하는 원통 위에서 훈련시킨 후 원형의 판 위에서 움직임을 관찰하였다. 운동력 측정은 BBB 스케일을 따라 점수를 정하는 방법을 선택하였다. 점수는 쥐의 뒷다리의 움직임과 발을 딛는 모양, 발의 각도, 몸통의 안정감 등을 채점하였다. 이식체를 이식하지 않은 Blank군에 비해 이식체를 이식한 수술 군에서 더 높은 운동력을 보였으며 그 손상 정도가 적을수록 운동력의 향상이 증대되었다. 또한, 1 mm 모델에서 천연 소장점막하 조직 젤을 사용한 군이 합성 하이드로 젤을 사용한 군 보다 조금 더 높은 운동력을 보였지만 두 군 모두 운동력이 향상됨으로써 중추신경의 재생을 확인하였다.
실시예 7 : 운동유발 전위검사를 통한 재생 평가
본 연구에서는 척수 신경의 재생 정도를 알아보기 위해 운동유발 전위검사를 실행하였다[도 7]. 운동유발 전위검사(MEP; Motor Evoked Potential)란 근육이 운동하기 위해 수축작용을 일으킬 때 발생하는 미세한 전기적인 활동전위(Action potential)를 증폭시켜 기록한 기록이다. 이 운동유발 전위검사는 대뇌의 운동 피질(Motor cortex)이나 중추신경계 운동 경로(motor pathway)의 자극에 의해 근육, 말초신경 혹은 척수에서 기록되는 전위로 운동 경로의 검사를 위해 많이 사용하는 방법이다. 수술 후 매 4주와 8주마다 운동유발 전위검사를 시행하여 지연 시간(Latency, m/s)과 진폭(Amplitude, μV)의 값을 측정, 신경축삭의 재생정도를 관찰하였다. 신경 재생을 위한 이식체 삽입 동물 모델은 대조군인 이식체를 넣지 않은 군에 비해 약 30 ~ 40%의 신경 재생이 확인되었다.
Figure 112007012878850-PAT00003
Figure 112007012878850-PAT00004
실시예 8 : 조직학적 평가
재생된 신경의 조직학적 평가를 위하여 수술 4주와 8주 후 조직을 적출하였다. 조직은 재생된 신경축삭의 수를 확인하기 위하여 세로로 절단하였으며, H&E 염색을 통하여 지지체와 세포 이식부위에서의 염증반응과 새로운 조직의 형성 여부, 축삭이 자라 들어가는지에 대한 판단을 실시하였다. H&E 염색결과 지지체와 세포의 이식에 따른 염증반응을 확인할 수 없었으며 절단된 척수신경 주변으로 새로운 조직이 형성됨을 확인하였다. 신경재생을 더욱 명확히 증명하기 위하여 신경세포 특이적인 마커인 NF(neurofilament; SCYTEK, USA), NSE(neuron-specific enolase; Serotec, UK) 및 별아교세포 특이적인 마커인 GFAP(glial fibrillary acidic protein; Dako, Denmark)에 대한 항체를 이용한 조직면역학적 염색을 통해 재생을 평가하였다. 또한, 이식된 세포의 생존과 재생에 미치는 영향을 알아보기 위하여 이식 전 Brdu(bromodeoxyuridine; Dako, Denmark)로 표지하고 세포추적을 실시하였다. 염색 결과, 이식한 세포의 생존을 확인할 수 있었고 손상받은 척수신경 주변에서 신경축삭의 성장과 교세포 확인을 통해 신경 재생이 유도되었음을 확인하였다[도 8].
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 신경 재생 세포원 및 생리 활성 물질을 포함한 조직공학용 이식체는 손상된 척수 신경에 이식되어 시간이 경과하면서 신경축삭이 연결되어 중추신경으로의 역할을 재생 또는 복원됨을 확인함으로써 신경 재생 세포원 및 골세포나 조직세포, 연골세포와 같은 다양한 세포의 생착 능력을 향상시켜 세포를 장기간 생존시킬 수 있는 생체적합적 생분해성 지지체개발 그리고 세포의 증식 및 분화에 영향을 주는 여러 가지 사이토카인이나 성장인자와 같은 생리활성 물질이 복합화된 조직공학적 이식체 개발을 통해 신경 재생 능력의 향상에 기여하며, 장기 기증자의 부족에 의한 이식 대기자의 증가 환자에 대한 손상된 장기나 조직의 일부를 대체하기 위하여 생체조직 공학적으로 결손된 장기나 조직을 재생 또는 대체하고자 다양한 삼차원 구조 제조가 가능하며 또한 주사제형으로 사용상의 편리성을 갖는 생체적합적 생분해성 지지체 개발에 매우 유용하리라 기대된다.

Claims (7)

  1. 성체 줄기세포와 생리활성물질을 생체적합성 지지체에 복합화한 조직공학용 이식체에 있어서,
    상기 생체적합성 지지체는 생체적합성 및 온도감응성의 폴리에틸렌글리콜/생분해성 폴리에스터 블록 공중합체 또는 졸-젤 상전이가 가능한 생체적합성의 소장점막하조직 파우더의 주사형 하이드로 젤인 것을 특징으로 하는 조직공학용 이식체.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 생체적합성 및 온도감응성의 폴리에틸렌글리콜/생분해성 폴리에스터 블록 공중합체는 분자량이 2,000 ∼ 7,000 g/mole이며, 상기 공중합체의 친수성부는 폴리에틸렌글리콜로 구성되고, 소수성부는 카프로락톤(CL) 세그먼트가 필수성분으로 함유되고, 파라다이옥사논(PDO) 세그먼트, 트리메틸렌카보네이트(TMC) 세그먼트, 또는 이들 세그먼트가 동시에 함유된 생분해성 폴리에스터계 소수성부로 구성된 것을 특징으로 하는 이식체.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 친수성부를 구성하는 폴리에틸렌글리콜의 분자량은 350 ∼ 2000 g/mole인 것을 특징으로 하는 이식체.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 소수성부는 다음 화학식 1로 표시되며, 각 세그먼트가 랜덤하게 공중합된 것을 특징으로 하는 이식체;
    [화학식 1]
    Figure 112007012878850-PAT00005
    상기 화학식 1에서, x, y 및 z는 각각 소수성 폴리에스터부를 구성하는 각 세그먼트로서, x+y+z=100몰%, y 또는 z가 0일 수 있으며, x는 50 ∼ 95 몰%, y+z는 5~50 몰%이다.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 졸-젤 상전이가 가능한 생체적합성의 소장점막하조직 파우더는 소장점막하 조직을 펩신과 산성 용액에 혼합하고, 염기성 용액으로 pH 5.5 ~ 7.8로 적정한 후 동결 건조시켜 분말화한 것임을 특징으로 하는 이식체.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 주사형 하이드로 젤은 생체적합성 및 온도감응성의 폴리에틸렌글리콜/생분해성 폴리에스터 블록 공중합체 또는 졸-젤 상전이가 가능한 생체적합성의 소장점막하조직 파우더를 인산완충용액과 혼합하여 젤화한 것임을 특징으로 하는 이식체.
  7. 급성 또는 만성 척수 손상 부위를 부분 또는 완전 절개 후 상기 청구항 1 내지 6 중에서 선택된 어느 한 항의 이식체를 이식하여 신경 재생을 유도하는 방법.
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