KR20080043783A

KR20080043783A - 과립층 세포의 세포자멸사 조절

Info

Publication number: KR20080043783A
Application number: KR1020087003867A
Authority: KR
Inventors: 로버트 브루스 길크리스트; 제레미 톰슨; 타머 후세인
Original assignee: 애들레이드 리서치 앤드 이노베이션 피티와이 리미티드
Priority date: 2005-07-18
Filing date: 2006-07-18
Publication date: 2008-05-19
Also published as: EP2228070B1; EP1909820A4; EP1909820A1; US8530235B2; KR101502110B1; US20140073052A1; JP5841973B2; US20080274963A1; WO2007009166A1; JP2013215207A; JP2009501533A; EP2228070A2; CA2615006A1; DK2228070T3; EP2228070A3; CN101272804A

Abstract

본 발명은 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 다음 단계, 즉 (i) 과립층 세포가 노출되는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절하는 단계와, (ii) 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계와, (iii) 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계 중 한 가지 이상의 단계를 포함한다.

Description

과립층 세포의 세포자멸사 조절 {MODULATION OF GRANULOSA CELL APOPTOSIS}

본 출원은 그 내용이 참조로서 본 발명에 통합되는 2005년 7월 18일에 출원된 오스트레일리아 특허 가출원 제2005903782호에 대하여 우선권을 주장한다.

본 발명은 과립층(顆粒層; granulosa) 세포의 세포자멸사(apoptosis)의 조절을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 난모세포(oocytes) 성숙의 조절, 난포 폐쇄(卵胞閉鎖; follicle atresia), 발달(development)및 성숙의 조절, 배란율(ovulation rate)의 조절 및 여성의 수정능력(female fertility)의 조절을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

포유류의 미성숙란 (난모세포)은 난소 내의 난포에서 성장하고 발달한다. 미성숙 난모세포는 그 난모세포의 주위에 있고, 배란에 이르기까지 난모세포가 발달하도록 영양을 공급하는 체성(somatic) 과립층 세포에 대사적으로 결합된다. 난모세포는 그의 성장 및 발달을 지지를 위해서뿐만 아니라 감수분열 진행의 조절을 위해서 그의 동반 체성 과립층 세포와의 연관성에 의존한다.

난포 발달은 증식, 분화 및 폐쇄(atresia) 사이의 복합적 상호작용에 의하여 유도된다. 난소 난포의 폐쇄는 99% 이상의 난모세포의 상실의 원인이 되는 중요한 과정이다. 난포 폐쇄가 예정된 세포 사멸(programmed cell death)의 활발한 과정을 통하여 일어난다는 것이 생체 내(in vivo) 연구 및 시험관 내(in vitro) 연구 모두에서 증명된 바 있다. 세포 수준에서, 세포자멸사는 세포질 및 핵 분절, 염색질 농축, DNA 분절 및 포식작용을 특징으로 한다.

세포자멸사는 난포 발달에 있어서 (난포막 세포, 과립층 세포, 더미 세포 및 난모세포 자체에서) 적어도 4개의 상이한 세포 구획(compartments)에서 개시될 수 있다. 안트랄(antral) 난포에서의 초기 폐쇄 동안은 그 더미 세포 및 난모 세포는 벽(mural) 과립층 세포 및 말기의 난포막 세포에서의 세포자멸사로서 처음 나타나는 폐쇄적 변화에 의하여 명백하게 영향을 받지 않고 남아있다. 난모세포 및 과립층/난구 세포가 세포자멸사에서 벗어나도록 상호작용하게 하는 메커니즘은 잘 이해되어 있지 않다.

통상적으로, 난포 발달에서 난모세포의 역할은 수동적이고, 난포 발달 및 그에 따른 난자발생은 외부 호르몬에 의하여 유도된다고 생각되어왔다. 그러나, 난모세포는 난포 발달을 촉진시키는 인자를 또한 분비한다는 것이 최근 밝혀졌다. 난모세포 측분비(paracrine) 인자의 발현의 변화가 난모세포의 성숙, 난포 발달 및 수정능력에 깊은 효과를 가질 수 있다는 사실에 의하여 증명되어, 난포생성의 이러한 난모세포 조절은 매우 중요한 것으로 밝혀졌다.

그러한 것으로서, 난모세포가 난포 과립층 세포 기능의 기본적인 조절 성분을 조절하는 측분비 인자를 분비함으로써 난포 성장과, 그에 따른 난포 발달 및 수정능력을 조절하는 적극적인 역할을 수행하는 것으로 보인다는 것이 최근 그 증거에 의해 제안된다.

과립층 세포 발달의 조절에 있어서 그러한 난모세포 분비 인자의 결정적인 중요성에도 불구하고, 현재 과립층 세포 발달에 관련된 난모세포에 의하여 분비된 인자가 어떠한 것인지에 대한 정보 및 그러한 인자의 발현이 난포생성, 난모세포 성숙 및 수정능력을 조절하기 위해 어떻게 사용될 수 있는지에 대한 정보가 거의 없다.

또한, 시험관 내 및 생체 내 양쪽 모두에서의 난포생성, 난모세포 성숙 및 수정능력을 조절하는 현재의 방법은 많은 이유 때문에 불충분하다. 따라서, 과립층 세포 발달을 조절하여, 난포 발달, 난모세포 성숙 및 수정능력을 조절할 수 있는 새로운 방법이 필요하다.

본 발명은 과립층 세포의 세포자멸사가 BMP-15 (뼈 형태발생 단백질-15; GDF-9B로도 알려져 있음) 및/또는 BMP-6 (뼈 형태발생 단백질-6)에 의하여 조절된다는 것의 발견으로부터 기인한다. 따라서, 본 발명은 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는 방법 및 조성물과, 난모세포 성숙, 난포 발달 및 여성의 수정능력을 조절하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.

선행 기술로서 제시된 본 발명에서 참조하는 특허 문헌 또는 기타의 자료가 본 발명의 모든 청구항의 우선일에 있어서 그러한 문헌 또는 자료가 공지되었다거나 또는 이들에 포함된 정보가 보통의 일반적인 지식의 일부였다는 것을 자인하는 것으로서 받아들여져서는 안 된다.

발명의 요약

본 발명은 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는 방법으로서, 다음의 단계들 중 한 가지 이상을 포함하는 방법을 제공한다:

(i) 과립층 세포가 노출되는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절하는 단계;

(ii) 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계; 및

(iii) 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계.

또한, 본 발명은 여성 대상체(subject)의 난모세포 성숙 및/또는 난포 성숙에 관련된 질병 또는 상태의 예방 및/또는 치료 방법으로서, 다음의 단계들 중 한 가지 이상의 단계를 포함하는 방법을 제공한다:

(i) 과립층 세포가 노출되는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절함으로써 대상체에서 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는 단계;

(ii) 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 대상체에서 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는 단계; 및

(iii) 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 대상체에서 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는 단계.

또한, 본 발명은 난모세포의 성숙을 조절하는 방법으로서, 다음의 단계들 중 한 가지 이상의 단계를 포함하는 방법을 제공한다:

(i) 과립층 세포가 노출되는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절함으로써 난모세포와 연관된 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는 단계;

(ii) 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 난모세포와 연관된 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는 단계; 및

(iii) 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 난모세포와 연관된 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는 단계.

또한, 본 발명은 난모세포의 발달 능력(developmental competence)을 조절하는 방법으로서, 다음의 단계들 중 한 가지 이상의 단계를 포함하는 방법을 제공한다:

또한, 본 발명은 난포의 성숙을 조절하는 방법으로서, 다음의 단계들 중 한 가지 이상의 단계를 포함하는 방법을 제공한다:

(i) 과립층 세포가 노출되는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절함으로써 난포 내의 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는 단계;

(ii) 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 난포 내의 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는 단계; 및

(iii) 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 난포 내의 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는 단계.

또한, 본 발명은 난포의 폐쇄를 조절하는 방법으로서, 다음의 단계들 중 한 가지 이상의 단계를 포함하는 방법을 제공한다:

또한, 본 발명은 난포의 발달을 조절하는 방법으로서, 다음의 단계들 중 하나 이상을 포함하는 방법을 제공한다:

또한, 본 발명은 여성 대상체에서 배란율을 조정하는 방법으로서, 다음의 단계들 중 하나 이상을 포함하는 방법을 제공한다:

(i) 과립층 세포가 노출되는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절함으로써 대상체의 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는 단계;

(ii) 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 대상체의 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는 단계; 및

(iii) 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 대상체의 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는 단계.

또한, 본 발명은 여성 대상체의 수정능력을 조절하는 방법으로서, 다음의 단계들 중 하나 이상을 포함하는 방법을 제공한다:

또한, 본 발명은 동결-해동(freeze-thawing)에 기인한 과립층 세포의 세포자멸사를 감소시키는 방법으로서, 다음의 단계들 중 하나 이상을 포함하는 방법을 제공한다:

또한, 본 발명은 동결-해동에 기인한 난모세포 더미 복합체(cumulus oocyte complex), 난포, 난소 조직 또는 난소에 대한 손상을 감소시키는 방법으로서, 상기 난모세포 더미 복합체, 난포, 난소 조직 또는 난소를 다음 중 한 가지 이상에 노출시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6의 유효량;

(ii) 난모세포 더미 복합체, 난포, 난소 조직 또는 난소 내의 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 제제의 유효량; 및

(iii) 난모세포 더미 복합체, 난포, 난소 조직 또는 난소 내의 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 제제의 유효량.

또한, 본 발명은 과립층 세포의 세포자멸사 조절용 조성물로서, 다음 중 한 가지 이상을 포함하는 조성물을 제공한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6의 유효량;

(ii) 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 제제의 유효량; 및

(iii) 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 제제의 유효량.

또한, 본 발명은 난모세포 더미 복합체 및/또는 난포 배양용 배지로서, 다음 중 한 가지 이상을 포함하는 배지를 제공한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6의 유효량;

(ii) 난모세포 더미 복합체 또는 난포 내의 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제의 유효량; 및

(iii) 난모세포 더미 복합체 또는 난포 내의 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제의 유효량.

또한, 본 발명은 다음의 성분을 포함하는 조합 산물을 제공한다:

난모세포 및/또는 배아 배양 배지;

BMP-15 및/또는 BMP-6, 또는 이들의 변형체 또는 유사체; 및/또는

과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 제제; 및/또는

과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 제제;

여기서, 상기 성분들은 배양 배지에 상기 성분들을 첨가하기 위한 형태로 제공된다.

또한, 본 발명은 난모세포의 성숙을 조절하기 위한 조성물로서, 다음 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다:

(i) 난모세포와 연관된 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 유효량;

(ii) 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 난모세포와 연관된 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는 제제의 유효량; 및

(iii) 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 난모세포와 연관된 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는 제제의 유효량.

또한, 본 발명은 난모세포 시험관 내 성숙 배지를 제공하는데, 상기 배지는 다음 중 한 가지 이상을 포함한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6의 유효량;

(ii) 난모세포와 연관된 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제의 유효량; 및

(iii) 난모세포와 연관된 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제의 유효량.

또한, 본 발명은 난모세포의 발달 능력을 조절하기 위한 조성물로서, 다음 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다.

(i) 난모세포에 연관된 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는데 유효한 양의 BMP-15 및/또는 BMP-6;

(ii) 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 난모세포와 연관된 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는데 유효한 양의 제제; 및

(iii) 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 난모세포와 연관된 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는데 유효한 양의 제제.

또한, 본 발명은 난모세포의 발달 능력을 향상시키기 위한 배지를 제공하는데, 상기 배지는 다음 중 하나 이상을 포함한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6의 유효량;

또한, 본 발명은 여성 대상체에서 난모세포 성숙 및/또는 난포 성숙과 연관된 질병 또는 상태의 예방 및/또는 치료용 조성물로서, 다음 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다.

(i) 대상체의 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는데 유효한 양의 BMP-15 및/또는 BMP-6;

(ii) 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 대상체에서의 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는데 유효한 양의 제제; 및

(iii) 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 대상체에서의 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는데 유효한 양의 제제.

또한, 본 발명은 난포를 배양하기 위한 조성물로서, 다음 중 한 가지 이상을 포함하는 조성물을 제공한다:

(i) 난포 내의 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는데 유효한 양의 BMP-15 및/또는 BMP-6;

(ii) 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 난포 내의 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는데 유효한 양의 제제; 및

(iii) 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 난포 내의 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는데 유효한 양의 제제.

또한, 본 발명은 난포 배양 배지로서, 다음 중 한 가지 이상을 포함하는 조성물을 제공한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6의 유효량;

(ii) 난포 내의 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제의 유효량; 및

(iii) 난포 내의 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제의 유효량.

또한, 본 발명은 난포의 폐쇄(atresia)를 조절하기 위한 조성물로서, 다음 중 한 가지 이상을 포함하는 조성물을 제공한다:

또한, 본 발명은 난포의 발달을 조절하기 위한 조성물로서, 다음 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 여성 대상체의 배란율(ovulation rate)을 조절하기 위한 조성물로서, 다음 중 한 가지 이상을 포함하는 조성물을 제공한다:

(i) 대상체에서의 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는데 유효한 양의 BMP-15 및/또는 BMP-6;

또한, 본 발명은 여성 대상체에서의 각각의 난소 또는 월경 주기를 성숙시키는(mature) 난포의 수를 조절하기 위한 조성물로서, 다음 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다:

또한, 본 발명은 여성 대상체에서의 수정능력을 조절하기 위한 조성물로서, 다음 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다:

또한, 난모세포 시험관 내 성숙 배지를 제공하는데, 상기 배지는 다음 중 하나 이상을 포함한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6;

(ii) 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 난모세포와 연관된 과립층 세포의 세포자멸사를 억제하는 제제; 및

(iii) 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 난모세포와 연관된 과립층 세포의 세포자멸사를 억제하는 제제.

또한, 본 발명은 난모세포 더미 복합체(cumulus oocyte complex) 및/또는 난포의 배양을 위한 배지로서, 다음 중 한 가지 이상을 포함하는 배지를 제공한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6의 유효량;

(iii) 난모세포 더미 복합체 또는 난포 내의 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제의 유효량;

여기서, 상기 배지는 혈청, 알부민, 난포액, 피투인(fetuin), 난포자극호르몬(FSH) 및 항세포자멸사 성장 인자(anti-apoptotic growth factors)가 실질적으로 없는 것이다.

또한, 본 발명은 난모세포 시험관 내 성숙 배지를 제공하는데, 상기 배지는 다음 성분 중 하나 이상을 포함한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6;

(ii) 난모세포와 연관된 하나 이상의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 하나 이상의 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 억제하는 제제; 및

(iii) 난모세포와 연관된 하나 이상의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 하나 이상의 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 억제하는 제제;

여기서, 상기 배지는 혈청, 알부민, 난포액, 피투인, 난포자극호르몬(FSH) 및 항세포자멸사 성장 인자가 실질적으로 없는 것이다.

또한, 본 발명은 다음 성분 중 하나 이상을 포함하는 난포 배양 배지를 제공한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6;

(ii) 난포 내의 하나 이상의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 하나 이상의 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 억제하는 제제; 및

(iii) 난포 내의 하나 이상의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 하나 이상의 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 억제하는 제제;

여기서, 상기 조성물은 혈청, 알부민, 난포액, 피투인, 난포자극호르몬(FSH) 및 항세포자멸사 성장 인자가 실질적으로 없는 것이다.

또한, 본 발명은 다음 중 하나 이상을 포함하는 조성물 또는 배지를 제공한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6;

(ii) 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 억제하는 제제; 및

(iii) 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 억제하는 제제;

여기서, 상기 조성물은 40 mM∼400 mM NaCl, 0.1 mM∼20 mM KCl 및 0.1 mM∼40 mM 글루코스를 더 포함하는 것이다.

또한, 본 발명은 동결-해동에 기인한 과립층 세포의 세포자멸사를 감소시키기 위한 조성물로서, 다음 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다:

(i) 활성 BMP-15 및/또는 활성 BMP-6;

(ii) 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제; 및

(iii) 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제.

또한, 본 발명은 동결에 의한 난모세포 더미 복합체, 난포, 난소 조직 또는 난소에 대한 손상을 감소시키기 위한 조성물로서, 다음 중 한 가지 이상을 포함하는 조성물을 제공한다:

(i) 활성 BMP-15 및/또는 활성 BMP-6의 유효량;

(ii) 난모세포 더미 복합체, 난포, 난소 조직 또는 난소 내의 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제의 유효량; 및

(iii) 난모세포 더미 복합체, 난포, 난소 조직 또는 난소 내의 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제의 유효량.

또한, 본 발명은 난모세포를 필요로 하는 보조 생식(assisted reproduction involving an oocyte)의 방법으로서, 다음 성분 중 하나 이상을 포함하는 배지 내에서 상기 난모세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6;

(iii) 난모세포와 연관된 하나 이상의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 하나 이상의 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 억제하는 제제.

또한, 본 발명은 난모세포로부터 생성된 배아를 필요로 하는 보조 생식의 방법으로서, 다음 성분 중 한 가지 이상의 성분을 포함하는 배지 내에서 상기 난모세포 및/또는 상기 배아를 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6;

또한, 본 발명은 난모세포의 시험관 내 수정 방법으로서, 다음 성분 중 한 가지 이상의 성분을 포함하는 배지 내에서 상기 난모세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6;

또한, 본 발명은 난모세포의 발달 능력(developmental competence)의 평가 방법으로서, 다음의 단계들을 포함하는 방법을 제공한다:

(i) 난모세포와 연관된 과립층 세포에서의 세포자멸사의 정도를 측정하는 단계; 및

(ii) 난모세포와 연관된 과립층 세포에서 발견된 세포자멸사의 정도에 의하여 난모세포의 발달 능력을 평가하는 단계;

여기서, 세포자멸사 수준의 감소는 발달 능력이 증가된 난모세포를 나타내고, 세포자멸사 수준의 증가는 발달 능력이 감소된 난모세포를 나타낸다.

또한, 본 발명은 난모세포의 발달 능력의 평가 방법으로서, 다음 단계들을 포함하는 방법을 제공한다:

(i) 난모세포와 연관된 과립층 세포가 노출된 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성 중 하나 이상을 측정하는 단계; 난모세포와 연관된 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성의 수준을 측정하는 단계; 및 난모세포와 연관된 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성의 수준을 측정하는 단계; 및

(ii) 상기 측정의 결과에 의하여 난모세포의 발달 능력을 평가하는 단계;

여기서, BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성의 증가, 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6 의존 신혼전달 경로의 활성의 증가는 발달 능력이 증가된 난모세포를 나타내고, BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성의 감소, 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6 의존 신혼전달 경로의 활성의 감소는 발달 능력이 감소된 난모세포를 나타낸다.

(i) 난모세포에서 BMP-15 및/또는 BMP-6의 발현 수준을 측정하는 단계 및/또는 난모세포에 의하여 분비되는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도를 측정하는 단계; 및

(ii) 난모세포의 발달 능력을 평가하는 단계;

여기서, BMP-15 및/또는 BMP-6의 발현 및/또는 농도의 증가는 발달 능력이 증가된 난모세포를 나타내고, BMP-15 및/또는 BMP-6의 발현 및/또는 농도의 감소는 발달 능력이 감소된 난모세포를 나타낸다.

본 발명은 세포 더미 세포자멸사에 대한 난모세포 분비 인자(oocyte-secreted factors)의 효과에 대한 연구로부터 기인한 것이다. 특히, 난모세포 더미 복합체 (cumulus-oocyte complex; COC)에서의 난모세포의 존재가 세포 더미에서의 낮은 수준의 세포자멸사를 초래한다는 것과, 상기 난모세포 더미 복합체로부터 난모세포를 제거하는 경우 (난모세포절제 복합체(oocytectomized complex); OOX) 세포자멸사의 상당한 증가를 가져온다는 것을 발견한바 있다. 더욱이, 난모세포 분비 인자 BMP-15 및 BMP-6은 난모세포절제 복합체에서 세포 더미 세포자멸사를 억제할 수 있다.

이들 발견은 BMP-15 및/또는 BMP-6이 세포 더미에서 세포자멸사를 조절하는데 핵심적인 역할을 한다는 것과, 이들 인자 또는 이들 인자의 조절하에 있는 신호전달 경로가 과립층 세포에서 시험관 내 또는 생체 내 세포자멸사를 조절하기 위해 사용될 수 있고, 따라서 난모세포 성숙, 난포 발달, 배란율(ovulation rate), 각각의 난소 또는 월경 주기 동안 성숙하는 난포의 수, 및 수정능력(fertility)을 조절할 수 있다는 것을 증명한다.

본 명세서 전체에 걸쳐 사용될 다양한 용어들은 숙련된 기술자에게 잘 이해되어 있는 의미이다. 그러나, 용이한 참조를 위해서, 이들 용어의 일부를 여기에 정의할 것이다.

본 명세서에서 사용되는 "핵산"이라는 용어는 모든 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산은 게놈 기원, cDNA 기원 (즉, mRNA로부터 유래된 것), 바이러스 유래 또는 합성 기원의 핵산을 포함하는 모든 종류의 핵산일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "폴리펩티드"라는 용어는 펩티드 결합에 의하여 연결된 2개 이상의 아미노산을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 이와 유사하게, "아미노산 서열"이라는 용어는 올리고 펩티드, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열 및 이들의 단편 또는 일부를 말하며, 자연적 발생, 재조합, 돌연변이 또는 합성 폴리펩티드를 말한다.

본 명세서에서 사용되는 "조절(modulating)"이라는 용어는 과정의 임의의 억제 또는 증가, 또는 특정 실재(entity)의 활성, 기능 또는 특성의 억제 또는 증가를 의미하는 것으로 이해될 것이다.

이와 관련하여, 본 발명의 다양한 형태에서의 과립층 세포 세포자멸사의 조절은 상기 세포에서의 세포자멸사의 억제 또는 진행의 임의의 조절 또는 변화의 형태이다. 예를 들어, 세포자멸사의 조절은 (i) 세포자멸사에 들어가기 위한 세포의 능력을 감소시키거나 촉진시키는 것; (ii) 세포자멸사가 개시된 후에 세포에서 세포자멸사의 진행을 감소시키거나 촉진시키는 것; 및/또는 (iii) 특정 세포가 세포자멸사를 개시하거나 이를 진행시킬 가능성을 감소시키거나 촉진시키는 것과 관련될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "난포 발달(follicle development)"이라는 용어 및 그 변형 용어는 원시 난포 단계를 거쳐 배란전 난포를 거쳐 황체에 이르기까지의 난소 난포의 진행을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 이와 관련하여, 난포는 완전한 여성 대상체에서 존재할 수 있거나, 또 다르게는 여성 대상체로부터 분리된 난포와 같이 시험관 내에서 존재할 수 있다는 것이 이해될 것이다.

본 명세서에서 사용되는 "난모세포 성숙(oocyte maturation)"이라는 용어 및 그 변형 용어는 수정될 수 없는 감수분열적으로 미성숙한 상태로부터, 수정될 수 있고 생존가능한 배아를 생성할 수 있는 감수분열적으로 성숙한 난모세포에 이르기까지의 난모세포 진행과정에 따른 과정을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 그 용어는 또한 난모세포 세포질의 성숙을 포함하는 것으로 이해될 것이고, 그 결과 그 난모세포는 수정 후 배아 발달을 지지할 수 있다. 이와 관련하여, 난모세포는 완전한 여성 대상체에서 존재할 수 있거나, 또 다르게는 여성 대상체로부터 분리된 난모세포와 같이 시험관 내에서 존재할 수 있다는 것이 이해될 것이다.

또 다른 종류의 세포와 연관된 한 종류의 세포와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "연관된(associated with)"라는 용어 및 그 변형 용어는 어떤 세포가 직접적으로 또 다른 종류의 세포와 접촉해 있거나, 어떤 세포가 또 다른 종류의 세포가 존재하는 곳에 있어서 그 세포가 다른 종류의 세포로부터 분비되는 인자에 의하여 영향을 받을 수 있는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 과립층 세포와 연관된 난모세포의 경우, 이는 예컨대 난모세포 더미 복합체의 일부로서의 난모세포, 또는 과립층 세포, 난모세포 더미 복합체 또는 난모세포절제 복합체와 동일한 배지 중에 존재하는 나화(裸化; denuded) 난모세포를 포함하는 것으로 이해될 것이다.

폴리펩티드 또는 단백질과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "변이체"라는 용어는 1개 이상의 아미노산이 변화된 아미노산 서열을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 변이체는 치환된 아미노산이 치환전의 아미노산과 유사한 구조 또는 화학적 특성을 가지는 "보존적" 변화를 가질 수 있다 (예컨대, 루신이 이소루신으로 치환). 또한, 변이체는 "비보존적" 변화 (예컨대, 글리신이 트립토판으로 치환) 또는 1개 이상의 아미노산의 결실 및/또는 삽입을 가질 수 있다.

또한, 변이체는 전체 크기의 폴리펩티드 또는 단백질과 유사한 구조, 조절 또는 생화학적 기능을 가지는 폴리펩티드 또는 단백질일 수 있는, 전체 크기의 단백질의 생물학적으로 활성인 단편일 수 있다. 예를 들어, 생물학적으로 활성인 단편은 단백질의 아미노 또는 카르복시 말단 결실, 단백질의 내부 결실, 또는 그러한 결실의 임의의 조합일 수 있다. 또한, 생물학적으로 활설인 단편은 1개 이상의 추가적인 아미노산과 융합된 그러한 임의의 결실체를 포함할 것이다.

본 명세서에서 사용되는 "항체"라는 용어는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 및 예컨대 Fab, F(ab')₂ 및 Fv와 같은 항원 결정기에 결합할 수 있는 항체 분자의 단편을 의미하는 것으로 이해될 것이다.

특정 세포와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "분리된(isolate)"이라는 용어는 세포가 그의 천연 환경의 하나 이상의 성분으로부터 동정 및 분리(separated) 및/또는 회수된 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 분리된 난모세포는 1개 이상의 세포 더미와 연관될 수 있거나, 난모세포 더미 복합체의 일부로서 존재할 수 있거나, 또는 나화 난모세포일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "여성 대상체(female subject)"라는 용어는 인간 여성, 영장류, 가축 (예컨대, 말, 소, 양, 돼지, 염소), 반려 동물 (예컨대, 개, 고양이), 실험실용 시험 동물 (예컨대, 생쥐, 쥐, 기니피그)을 포함하는 포유류 암컷, 또는 임의의 기타의 암컷 동물로서, BMP-15 및/또는 BMP-6의 조절하에서 과립층 세포의 세포자멸사가 일어나는 암컷 동물을 의미하는 것으로 이해될 것이다.

본 명세서에서 사용되는 "보조 생식(assisted reproduction)"이라는 용어는 분리된 난모세포 및/또는 분리된 정자를 필요로 하는 인간 및 동물에서의 임의의 수정 기술로서, 시험관 내에서 배양된 난모세포 또는 배아를 사용한 기술 (예컨대, 난모세포의 시험관 내 성숙), 시험관 내 수정 (IVF; 난모세포의 흡입, 실험실에서의 수정 및 수령자에게로 배아의 전달), 생식세포 자궁관 내 전달 (GIFT; 난모세포 및 정자를 자궁관 내로 위치시킴), 접합체 자궁관 내 전달 (ZIFT; 수정된 난모세포를 자궁관 내로 위치시킴), 배아 자궁관 내 전달 (TET; 분열 배아(cleaving embryos)들을 자궁관 내로 위치시킴), 난모세포 및 정자 복강 내 전달 (POST; 난모세포 및 정자를 골반강 내로 위치시킴), 세포질 내 정자 주입 (ICSI), 고환 정자 추출 (TESE) 및 미세수술 부고환 정자 흡입 (MESA)을 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.

발명의 일반적인 설명

전술하였다시피, 한가지 형태에서 본 발명은 다음의 단계들 중 한 가지 이상 단계를 포함하는, 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는 방법을 제공한다:

본 발명의 이러한 형태에서는, 과립층 세포의 세포자멸사는 (i) 과립층 세포가 노출되는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성의 조절; 및/또는 (ii) 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성 조절; 및/또는 (iii) 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성의 조절에 의하여 억제되거나 촉진될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 이러한 형태의 방법은 과립층 세포를 농도가 증가된 BMP-15 및/또는 BMP-6에 노출시킴으로써 과립층 세포의 세포자멸사를 억제하기 위해 사용될 수 있다. 또 다르게는, 과립층 세포의 세포자멸사를 과립층 세포가 노출되는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도를 감소시킴으로써 촉진시킬 수 있다.

이와 관련하여, BMP-15 및 BMP-6는 양쪽 모두 성장 및 분화 인자의 라지패밀리(large families)를 포함하는 전환성장인자 베타 (TGF-β) 슈퍼패밀리(superfamily)의 일원이다. 이들 단백질은 프리프로펩티드(prepropeptides)로서 합성되고, 절단된 후, 이합체 단백질로 가공된다. BMP-15는 ALK-6 및 BMPR-II 수용체에 결합하는 반면, BMP-6는 ActRII 및 BMPR-II 수용체에 결합한다.

BMP-15의 경우, 이 단백질은 동종이합체 및 GDF-9와의 이종이합체 양쪽의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명은 이러한 방법에 따라 생성되는 변경된 세포자멸사 또는 세포자멸사 잠재력을 가진 과립층 세포를 제공한다. 상기 과립층 세포는, 예를 들어 분리된 과립층 세포, 생체 내에 존재하는 과립층 세포, 생체 내 또는 시험관 내의 난포 내에 존재하는 과립층 세포, 시험관 내 또는 생체 내의 난모세포 더미 복합체의 일부로서의 과립층 세포 또는 난모세포절제(oocytectomised) 복합체의 일부로서의 과립층 세포일 수 있다.

또한, 본 발명은 과립층 세포에서의 세포자멸사의 수준을 조절함으로써, 여성 대상체에서의 난모세포 성숙 및/또는 난포 성숙과 연관된 질병 또는 상태를 예방 및/또는 치료하는데 적합하다.

따라서, 본 발명의 또 다른 형태에서는 여성 대상체에서의 난모세포 성숙 및/또는 난포 성숙과 연관된 질병 또는 상태를 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음 단계들 중 하나 이상을 포함한다:

예를 들어, 본 발명은 여성 대상체에서의 과립층 세포 종양 또는 다낭난소증후군을 예방 및/또는 치료하기 위해 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 난모세포와 연관된 과립층 세포에서의 세포자멸사의 수준을 조절함으로써 난모세포의 성숙을 조절하는데 적합하다.

따라서, 본 발명의 또 다른 형태에서는 난모세포의 성숙을 조절하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음의 단계들 중 하나 이상을 포함한다:

(i) 과립층 세포가 노출되는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절함으로써 난모세포와 연관된(associated) 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는 단계;

또한, 본 발명은 이러한 방법에 따라 생성된 변경된 성숙을 가지는 난모세포를 제공한다. 상기 난모세포는, 예를 들어 분리된 난모세포, 생체 내에 존재하는 난모세포, 시험관 내 또는 생체 내의 난모세포 더미 복합체의 일부로서의 난모세포 또는 시험관 내 또는 생체 내의 난포의 일부로서의 난모세포일 수 있다. 본 발명은 또한 난모세포로부터 생성되는 배아 및 인간이 아닌 동물을 포함한다.

이러한 경우, 이러한 방법이 시험관 내의 난모세포의 성숙을 조절하는데 특히 적합하다는 것이 이해될 것이다.

또한, 본 발명은 난모세포와 연관된 과립층 세포에서의 세포자멸사의 수준을 조절함으로써 난모세포의 발달 능력을 조절하는데 적합하다.

따라서, 본 발명의 또 다른 형태에서는 난모세포의 발달 능력을 조절하는 방법을 제공할 수 있는데, 상기 방법은 다음 단계들 중 하나 이상을 포함한다:

또한, 본 발명은 이러한 방법에 따라 생성된 발달 능력이 변경된 난모세포를 제공한다. 상기 난모세포는 예를 들어 난모세포 더미 복합체의 일부로서 시험관 내 또는 생체 내의 난모세포 또는 난포에 존재하는 난모세포일 수 있다. 본 발명은 또한 상기 난모세포로부터 생성되는 배아 및 인간이 아닌 동물을 포함한다.

이 경우, 이러한 방법이 시험관 내의 난모세포의 발달 능력을 조절하는데 특히 적합하다는 것이 이해될 것이다.

또한, 본 발명은 난포 내의 과립층 세포에서의 세포자멸사의 수준을 조절함으로써 난포의 성숙을 조절하는데 적합하다.

따라서, 본 발명의 또 다른 형태에서는 난포의 성숙을 조절하는 방법을 제공할 수 있는데, 상기 방법은 다음 단계들 중 하나 이상을 포함한다:

또한, 본 발명은 이러한 방법에 따라 생성되는 변경된 성숙을 가진 난포를 제공한다. 상기 난포는 예를 들어 분리된 난포 또는 생체 내에 존재하는 난포일 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 난포로부터 분리된 난모세포와, 상기 난모세포로부터 생성된 배아 및 인간이 아닌 동물을 포함한다.

이 경우, 이러한 방법이 시험관 내의 난포의 성숙을 조절하는데 특히 적합하다는 것이 이해될 것이다.

또한, 본 발명은 과립층 세포 세포자멸사의 수준을 조절함으로써 난포의 폐쇄를 조절하는데 적합하다.

따라서, 본 발명의 또 다른 형태에서는 난포의 폐쇄를 조절하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음 단계들 중 하나 이상을 포함한다:

또한, 본 발명은 이러한 방법에 따라 생성된 변경된 폐쇄를 가진 난포를 제공한다. 상기 난포는 분리된 난포 또는 생체 내에 존재하는 난포일 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 난포로부터 분리된 난모세포와, 상기 난모세포로부터 생성된 배아 및 인간이 아닌 동물을 포함한다.

한가지 바람직한 형태에 있어서, 본 발명은 여성 대상체에서의 난포 폐쇄의 조절을 제공한다.

또한, 본 발명은 난포 내의 과립층 세포의 세포자멸사의 수준을 조절함으로써 난포의 발달을 조절하는데 적합하다.

따라서, 본 발명의 또 다른 형태에서는 난포의 발달을 조절하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음의 단계들 중 하나 이상을 포함한다:

또한, 본 발명은 이러한 방법에 따라 생성되는 발달 또는 발달 잠재력이 변경된 난포를 제공한다. 상기 난포는 분리된 난포 또는 생체 내에 존재하는 난포일 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 난포로부터 분리된 난모세포와, 상기 난모세포로부터 생성된 배아 및 인간이 아닌 동물을 포함한다.

또한, 본 발명은 여성 대상체에서의 과립층 세포의 세포자멸사 수준을 조절함으로써 여성 대상체에서의 배란율(ovulation rate)을 조절하는데 적합하다.

따라서, 본 발명의 또 다른 형태에서는 여성 대상체에서 배란율을 조절하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음의 단계들 중 하나 이상을 포함한다:

여성 대상체에서의 배란율의 측정을 위한 방법은 당해 기술 분야에 알려져 있다.

또한 본 발명은 여성 대상체에서의 과립층 세포의 세포자멸사 수준을 조절함으로써 여성 대상체의 수정능력(fertility)을 조절하는데 적합하다.

따라서, 본 발명의 또 다른 형태에서는 여성 대상체의 수정능력을 조절하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음의 단계들 중 하나 이상을 포함한다:

본 발명이 수정능력을 촉진시키기 위하여 사용되거나, 또는 피임 방법으로서 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.

본 발명의 다양한 형태에서의 과립층 세포는 시험관 내 또는 생체 내에 존재하는 임의의 과립층 세포이다. 예를 들어, 상기 과립층 세포는 세포 배양물 중의 분리된 과립층 세포, 세포 배양물 중의 1종 이상의 기타의 세포종과 연관된 과립층 세포, 난모세포 더미 복합체의 일부인 과립층 세포, 난모세포절제 복합체의 일부인 과립층 세포, 시험관 내의 난포에 존재하는 과립층 세포 또는 여성 포유동물에서의 난포의 일부를 형성하는 생체 내에 존재하는 과립층 세포일 수 있다.

시험관 내의 과립층 세포의 경우, 바람직하게는 상기 과립층 세포는 난모세포와 연관된다. 더욱 바람직하게는, 상기 과립층 세포는 세포 더미(cumulus cell)이다. 가장 바람직하게는, 상기 과립층 세포는 난모세포 더미 복합체 중에 존재하는 세포 더미이다.

또한, 본 발명의 다양한 형태에서의 과립층 세포는 전과립층 세포(pre-granulosa cell), 전동 과립층 세포(preantral granulosa cell), 벽 과립층 세포(mural granulosa cell), 과립층 세포 더미(cumulus granulosa cell), 과립층-황체 세포(granulosa-lutein cell) 또는 압축 또는 확대 과립층 세포 더미일 수 있다.

생체 내의 과립층 세포의 경우, 상기 과립층 세포는 예를 들어 여성 대상체의 난포의 일부를 형성할 수 있다.

본 발명의 다양한 형태에서 세포자멸사의 조절은 과립층 세포와 연관된 시험관 내 또는 생체 내의 난모세포의 수정 전, 수정 중 및 수정 후에 일어날 수 있다는 것이 이해될 것이다.

바람직하게는, 세포자멸사의 조절은 수정에 앞서 일어난다.

바람직하게는, 상기 과립층 세포는 인간 과립층 세포, 비인간 영장류 과립층 세포, 양 과립층 세포, 소 과립층 세포, 돼지 과립층 세포, 말 과립층 세포, 염소 과립층 세포, 고양이 과립층 세포, 설치류 과립층 세포, 개 과립층 세포 또는 마우스 과립층 세포를 포함하는 여성 포유동물로부터의 과립층 세포이거나, 여성 포유동물에 존재하는 난포의 일부를 형성하는 과립층 세포이다. 바람직하게는, 상기 과립층 세포는 인간 과립층 세포, 소 과립층 세포, 양 과립층 세포 또는 말 과립층 세포이다.

시험관 내에 존재하는 과립층 세포의 경우, 상기 과립층 세포는 난포생성(folliculogenesis)의 임의의 단계에 있는 적합한 공여자로부터 또는 과배란 상태(superovulated state)에 있는 적합한 공여자로부터 당해 기술분야에 알려진 적절한 방법에 의하여 얻어질 수 있다. 시험관 내 목적을 위해 과립층 세포를 얻는 적절한 방법은 문헌 [Gilchrist RB et al (2001) Developmental Biology 240:289-298 (마우스 세포의 경우) 및 Gilchrist RB et al (2003) Molecular, Cellular Endocrinology 201: 87-95 (반추동물 세포의 경우)]에 기재된 것과 같다. 예를 들어, 과립층 세포는 호르몬으로 자극된 또는 자극되지 않은 미성숙 또는 성숙 난소로부터 분리되고, 그 과립층 세포는 안트랄(antral) 난포를 천자(puncturing) 또는 흡입(aspirating)함으로써 또는 효소적으로 난소를 분해시킴으로써 수집되며, 이어서 파편 제거 및 원심분리에 의하여 과립층 세포를 정제/농축할 수 있다.

본 발명의 다양한 형태에서의 과립층 세포 세포자멸사의 정도는 당해 기술분야에 알려진 적합한 방법에 의하여 측정될 수 있는데, 여기에는 다음을 포함한다: (i) DNA 분절 분석법, 예컨대 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제-매개 dUTP 틈 말단 표지법 (TUNEL), 이는 세포자멸사 동안 발생하는 뉴클레오좀 상호 절단(internucleosomal cleavage) 동안 노출된 DNA의 3'-OH 말단을 검출하는 제자리 방법(in situ method)이고, 문헌 [Hensey C. and Gautier J. (1998). Dev. Biol. 203, 36-48; Veenstra, GJ, Peterson-Maduro J, Mathu MT, van der Vliet PC, Destree OHJ. (1998). Cell Death Differ 5:774-84]에 본래 기재되어 있음; (ii) 세포자멸사와 연관된 형태적 변형의 검출법, 문헌 [Compton MM (1992) Cancer Metast Rev 11:105-119, 1992; Wyllie AH (1992) Cancer Metast Rev 11: 95-103; Oltvai ZN, Korsmeyer SJ (1994) Cell 79:189-192, 1994]에 본래 기재되어 있음; 또는 (iii) 세포자멸사를 검출하기 위하여 흐름세포측정법을 사용하는 방법, 문헌 [Ormerod MG, Collins MKL, Rodriguez-Tarduchy G, Robertson D (1992) J Immunol Meth 153:57-66; Jacobs DP, Pipho C (1983) J Immunol Meth 62: 101-110]에 본래 기재되어 있음.

생체 내에 존재하는 과립층 세포의 경우, 과립층 세포의 세포자멸사의 정도는 당해 기술 분야에 알려진 적절한 방법에 의하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 전구-세포자멸사 단백질 (예컨대, Bax) 또는 항-세포자멸사 단밸질 (예컨대, Bcl-2)의 발현을 웨스턴 분석법에 의하여 측정할 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 또한 여성 대상체의 난모세포 성숙 및/또는 난포 성숙과 관련된 질병 또는 상태를 예방 및/또는 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 종양원성(tumourigenic) 세포에서의 세포자멸사 수준을 증가시킴으로써 과립층 세포 종양을 예방 및/또는 치료하기 위해 사용될 수 있다. 또 다르게는, 본 발명은 다낭난소 증후군을 예방 및/또는 치료하기 위해 사용될 수 있다.

질병 또는 상태의 발명 전, 도중 및 후 중의 어느 한 시점에서 대상체에 BMP-15 및/또는 BMP-6, 및/또는 과립층 세포에서 BMP-15 또는 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 제제를 투여하는 것이 이해될 것이다.

또한, 화학요법 등의 일부 치료법은 난포 폐쇄 수준의 증가를 가져온다. 따라서, 본 발명은 치료를 받는 대상체의 과립층세포 세포자멸사의 수준을 감소시킴으로써 그러한 상태를 개선시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 경우, 대상체의 과립층 세포의 세포자멸사 수준을 감소시키는 것은 폐쇄를 감소시키기 위한 치료의 전, 치료 동안 및/또는 치료 후 중 어느 한 시점에서 사용될 수 있다.

과립층 세포가 노축되는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성의 조절은 많은 서로 다른 방식으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 이들 단백질 중의 하나 또는 양쪽 모두의 농도를 증가시키는 경우, 상기 과립층 세포는 그 단백질에 노출되거나 또는 그 단백질과 접촉될 수 있다.

이와 관련하여, BMP-15에 관련된 것은 표적 과립층 세포(들)에서 세포자멸사를 조절하기 위해 적합한 종으로부터의 단백질 (그의 세포자멸사가 조절되기 위한 과립층 세포의 그것과 동일한 종류로부터의 단백질의 이용을 포함함), 상기 단백질의 변이체 (예컨대, 야생형으로부터 1 이상의 아미노산 치환을 가지는 단백질 형태) 또는 상기 단백질의 생물학적으로 활성인 단편을 포함한다는 것이 이해될 것이다. 상기 단백질은 분리된 단백질, 재조합 단백질, 정제 또는 반정제된 것, 또는 단백질의 복합 혼합물의 일부 (예컨대, 난모세포로부터 적응용 배지 내로 나오는 것)일 수 있다.

이와 유사하게, BMP-6에 관련된 것은 표적 과립층 세포(들)에서 세포자멸사를 조절하기 위해 적합한 종으로부터의 단백질 (그의 세포자멸사가 조절되기 위한 과립층 세포의 그것과 동일한 종류로부터의 단백질의 이용을 포함함), 상기 단백질의 변이체 (예컨대, 야생형으로부터 1 이상의 아미노산 치환을 가지는 단백질 형태) 또는 상기 단백질의 생물학적으로 활성인 단편을 포함한다는 것이 이해될 것이다. 상기 단백질은 분리된 단백질, 재조합 단백질, 정제 또는 반정제된 것, 또는 단백질의 복합 혼합물의 일부 (예컨대, 난모세포로부터 적응용 배지 내로 나오는 것)일 수 있다.

전술한 바와 같이, 상기 단백질은 정제된 또는 반정제된 단백질로서, 또는 난모세포 적응용 배지 및/또는 난모세포 방출 인자의 형태로서 전달될 수 있다. 상기 단백질의 생성을 위한 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다. 예를 들어, 난모세포로부터 분비된 BMP-15 및/또는 BMP-6를 함유하는 적응용 배지에 과립층 세포를 노출시키는 것에 의하여, 상기 단백질은 1종 이상의 다른 성분을 함유하는 추출물의 형태로 전달될 수 있다.

BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 감소시키는 경우, 활성의 감소는, 예를 들어 상기 과립층 세포를 감소된 농도의 상기 단백질을 함유하는 배지에 노출시킴으로써, 또는 이들 단백질들 중 어느 하나에 대한 중화항체를 사용하는 것에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 단백질의 농도 또는 활성을 감소시키는 기타의 방법은 ALK6 및/또는 BPMPRII 수용체의 외부도메인(ectodomain)의 사용을 포함한다. 폴리스타틴이 이 분자와 함께 불활성의 복합체를 형성함으로써 BMP-15의 농도를 감소시키기 위해 사용될 수 있다.

안티센스 핵산 및 siRNA 기술이 또한 난모세포에서의 BMP-15 및 BMP-6의 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있고, 그에 따라 난모세포에 의해 분비되는 이들 단백질의 수준을 조절할 수 있다. 따라서, 본 발명은 난모세포에 안티센스 핵산 또는 siRNA를 첨가하여, 난포 내의 BMP-15 및/또는 BMP-6의 발현을 감소시키고, 그에 따라 상기 난모세포와 연관된 과립층 세포에서의 세포자멸사의 정도를 증가시키는 한가지 형태를 포함한다. 안티센스 핵산 및 siRNA의 설계 및 투여를 위한 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다.

난모세포 더미 복합체에서 세포자멸사를 조절하는 것과 관련된 난모세포 분비 인자의 구배(gradient)를 촉진하거나 간섭하는 제제가 또한 과립층 세포의 세포자멸사 수준을 조절하기 위하여 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.

또한, 기타의 인자가 상기 과립층 세포에서의 세포자멸사 수준을 추가적으로 조절하기 위해 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, FSH에 세포의 노출은 세포자멸사의 발생을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.

바람직하게는, BMP-15 또는 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성의 조절은 ALK6 및/또는 BMPRII 수용체 신호전달 경로의 조절이다.

이와 관련하여, ALK6 및/또는 BMPRII 경로의 조절은 상기 세포내의 SMAD 1/5/8 경로의 조절을 가져온다.

GDF-9/BMP-15 이종이합체의 활성 및/또는 농도의 조절이 또한 과립층 세포 세포자멸사를 조절하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다양한 형태는 또한 과립층 세포가 노출되는 GDF-9/BMP-15 이종이합체의 농도의 조절 및/또는 과립층 세포에서의 GDF-9/BMP-15 이종이합체 의존 신호전달 경로의 활성의조절을 포함한다.

예를 들어, 본 발명의 한가지 형태에서는 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음 단계들 중 하나 이상을 포함한다:

(i) 과립층 세포가 노출되는 GDF-9/BMP-15 이종이합체의 농도를 조절하는 단계; 및

(ii) 과립층 세포에서의 GDF-9/BMP-15 이종이합체 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계.

또한, 본 발명은 동결-해동에 의한 손상에 의해 유도되는 세포자멸사를 감소시키는데 적합하다는 것이 인정되었다.

따라서, 본 발명의 또 다른 형태에서는 동결-해동에 기인한 과립층 세포의 세포자멸사를 감소시키는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음의 단계들 중 하나 이상을 포함한다:

상기 활성 BMP-16 및/또는 활성 BMP-6의 농도의 조절, 또는 BMP-15 또는 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성의 조절은 동결 전 및/또는 동결 후에 일어날 수 있다.

동결되었을 때 각각의 난모세포 더미 복합체, 전체 난포, 난소 조직 또는 전체 난소는 동결/해동의 결과로서 일반적으로 죽는다. 따라서, 본 발명은 또한 동결-해동에 기인한 이들 세포/조직에 대한 손상을 감소시키는데 적합하다.

따라서, 본 발명의 또 다른 형태에서는 동결-해동에 기인한 난모세포 더미 복합체, 난포, 난소 조직 또는 난소에 대한 손상을 감소시키는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 상기 난모세포 더미 복합체, 난포, 난소 조직 또는 난소를 다음 중 하나 이상에 노출시키는 단계를 포함한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6의 유효량;

활성 BMP-16 및/또는 활성 BMP-6의 농도의 조절, 또는 BMP-15 또는 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성 조절은 동결 전 및/또는 해동 후에 일어날 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 다양한 형태에서 BMP-15 또는 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 제제는 이들 경로의 활성을 촉진시켜, 과립층 세포의 세포자멸사의 수준을 감소시킨다.

본 발명의 다양한 형태에서 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 것은 적절한 방법에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들어, BMPRII 수용체의 활성은 과립층 세포를 BMP-7, BMP-4 및 BMP-2 중 하나 이상에 노출시킴으로써 조절될 수 있다.

또한, 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 것은 적절한 방법에 의하여 수행될 수 있다.

바람직하게는, 세포자멸사는 과립층 세포를 유효량의 BMP-15 및/또는 BMP-6을 포함하는 조성물에 노출시킴으로써, 또는 상기 세포를 상기 세포에서 BMP-15 및/또는 BMP-6 신호전달 경로를 억제 또는 촉진하는 제제를 포함하는 조성물에 노출시킴으로써 조절된다.

따라서, 본 발명의 한가지 바람직한 형태에서는 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하기 위한 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6의 유효량;

상기 과립층 세포는 시험관 내 또는 생체 내에 존재할 수 있다. 예를 들어, 상기 과립층 세포는 시험관 내의 난모세포 더미 복합체의 일부로서, 또는 여성 대상체의 난포의 일부로서의 과립층 세포로 존재할 수 있다.

특히 바람직한 형태에서는, 상기 조성물은 난모세포 더미 복합체 내 및/또는 시험관 내 난포 내의 과립층 세포의 세포자멸사를 감소시키기 위한 배양 배지이다.

따라서, 본 발명의 또 다른 형태에서는 난모세포 더미 복합체 및/또는 난포의 배양을 위한 배지를 제공하는데, 상기 배지는 다음 중 하나 이상을 포함한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6의 유효량;

(ii) 난모세포 더미 복합체 내 또는 난포 내의 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제의 유효량; 및

(iii) 난모세포 더미 복합체 내 또는 난포 내의 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제의 유효량.

상기 유효량은 상기 과립층 세포(들)에서 세포자멸사를 감소시키는 양이다.

BMP-15 및/또는 BMP-6, 및/또는 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 제제, 및/또는 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 제제는 배아 및/또는 난모세포를 위한 배양 배지 보충물(supplement)로서 역시 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.

따라서, 본 발명의 또 다른 형태에서는 다음 성분을 포함하는 조합 산물(combination product)을 제공한다:

난모세포 및/또는 배아 배양 배지;

여기서, 상기 성분들은 상기 배양 배지에 그 성분들을 첨가하기 위한 형태로 제공된다.

상기 조합 산물은 본 명세서에서 설명하고 있는 언급된 응용들 중 어떤 것을 위해서도 사용될 수 있다.

본 발명의 다양한 조합 산물에서 상기 배양 배지와 그 외의 다양한 성분들은 예컨대, 앰플, 병 또는 바이알 등의 적절한 용기 (바람직하게는 멸균된 것)에 다중 사용용(multi-use)으로 또는 유닛형(unit forms)으로 분리되어 포장될 수 있다. 상기 용기는 내용물을 채운 후 밀봉될 것이다. 상기 단백질 성분은 분리된 형태 또는 정제 또는 반정제 형태일 수 있고, 상기 단백질의 안정성 및/또는 용도를 위한 추가적인 첨가물을 함유할 수 있다. 상기 다양한 성분들의 포장 방법은 당해 기술 분야에 알려져 있다.

또한, 상기 조성물은 난모세포와 연관된 과립층 세포에서 세포자멸사 수준을 조절함으로써 난모세포의 성숙을 조절하기 위해 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 형태에서는 난모세포의 성숙을 조절하기 위한 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함한다:

(i) 난모세포와 연관된 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는데 유효한 양의 BMP-15 및/또는 BMP-6;

전술한 바와 같이, 상기 조성물은 난모세포의 시험관 내 성숙을 위한 배지의 조제용으로 특히 적합하다.

따라서, 본 발명의 또 다른 형태에서는 난모세포 시험관 내 성숙 배지를 제공하는데, 상기 배지는 다음 중 하나 이상을 포함한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6의 유효량;

상기 유효량은 과립층 세포(들)에서 세포자멸사를 감소시키는 양이다.

또한, 상기 조성물은 난모세포와 연관된 과립층 세포에서의 세포자멸사의 수준을 조절함으로써 난모세포의 발달 능력을 조절하기 위해 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 형태에서는 난모세포의 발달 능력을 조절하기 위한 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함한다.

상기 조성물은 시험관 내에서 난모세포의 발달 능력을 향상시키기 위한 배지의 조제용으로 특히 적합하다.

따라서, 본 발명의 또 다른 형태에서는 난모세포의 발달 능력을 향상시키기 위한 배지를 제공하는데, 상기 배지는 다음 중 하나 이상을 포함한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6의 유효량;

상기 유효량은 과립층 세포(들)에서 세포자멸사를 감소시키는 양을 말한다.

또한, 상기 조성물은 여성 대상체에서 난모세포 성숙 및/또는 난포 성숙과 관련된 질병 또는 상태를 예방 및/또는 치료하기 위해 여성 대상체에 투여될 수 있다. 그러한 질병 또는 상태의 예로는 과립층 세포 종양 및 다낭난소 증후군을 들 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 형태에서는 여성 대상체에서 난모세포 성숙 및/또는 난포 성숙과 연관된 질병 또는 상태의 예방 및/또는 치료를 위한 조성물을 제공하는데, 상기 조성불은 다음 중 하나 이상을 포함한다:

또한, 상기 조성물은 화학요법 등의 치료에 의해 대상체가 받는 손상을 예방 및/또는 치료하기 위해 대상체에 투여될 수 있다.

또한, 상기 조성물은 난포를 배양하기 위하여 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 형태에서는 난포를 배양하기 위한 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함한다:

상기 조성물은 난포의 시험관 내 배양용 배지의 조제에 특히 적합하다.

따라서, 본 발명의 또 다른 형태에서는 난포 배양 배지를 제공하는데, 상기 배지는 다음 중 하나 이상을 포함한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6의 유효량;

또한, 상기 조성물은 난포 내의 과립층 세포에서의 세포자멸사 수준을 조절함으로써 난포 폐쇄(follicle atresia)를 조절하기 위하여 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 형태에서는 난포의 폐쇄를 조절하기 위한 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함한다:

상기 조성물은 시험관 내 또는 생체 내의 난포에 사용될 수 있다. 시험관 내 난포의 경우, 상기 조성물은 폐쇄를 조절하기 위한 배지의 형태일 수 있다.

또한, 상기 조성물은 난포 내의 과립층 세포에서 세포자멸사 수준을 조절함으로써 난포의 발달을 조절하기 위해 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 형태에서는 난포의 발달을 조절하기 위한 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함한다:

상기 조성물은 시험관 내 또는 생체 내의 난포에 대해 사용될 수 있다. 시험관 내 난포의 경우, 상기 조성물은 폐쇄를 조절하기 위한 배지의 형태일 수 있다.

또한, 상기 조성물은 여성 대상체의 과립층 세포에서의 세포자멸사 수준을 조절함으로써 여성 대상체의 배란율(ovulation rate)을 조절하기 위하여 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 형태에서는 여성 대상체의 배란율을 조절하기 위한 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함한다:

또한, 상기 조성물은 여성 대상체의 과립층 세포에서의 세포자멸사 수준을 조절함으로써 여성 대상체에서 각각의 난소 또는 월경 주기를 성숙시키는(mature) 난포의 개수를 조절하기 위하여 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 형태에서는 여성 대상체에서 각각의 난소 또는 월경 주기를 성숙시키는 난포의 수를 조절하기 위한 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함한다:

또한, 상기 조성물은 여성 대상체의 과립층 세포의 세포자멸사 수준을 조절함으로써 여성 대상체에서의 수정능력(fertility)을 조절하기 위하여 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 형태에서는 여성 대상체에서의 수정능력을 조절하기 위한 조성물을 제공한는데, 상기 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함한다:

본 발명의 조성물은 수정능력을 촉진시키기 위해 사용될 수 있거나, 또 한편으로는 피임약으로서 사용될 수도 있다.

예를 들어, 세포자멸사를 감소시키는 제제의 경우에 있어서, 상기 조성물을 투여하여 여성 대상체의 수정능력을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 형태에서는 여성 대상체의 수정능력을 촉진시키기 위한 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 여성 대상체의 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시킴으로써 여성 대상체의 과립층 세포의 세포자멸사를 감소시키는데 유효한 양의 제제 및/또는 여성 대상체의 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시킴으로써 여성 대상체의 과립층 세포의 세포자멸사를 감소시키는데 유효한 양의 제제를 포함한다.

예를 들어, 상기 제제는 BMP-15 또는 BMP-6일 수 있다. 상기 제제가 세포자멸사를 촉진하는 경우에 있어서, 상기 조성물은 여성 대상체에 투여될 때 피임 조성물로서 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 형태에서는 피임용 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 여성 대상체의 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 감소시킴으로써 여성 대상체의 과립층 세포의 세포자멸사를 증가시키는데 유효한 양의 제제 및/또는 여성 대상체의 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 감소시킴으로써 여성 대상체의 과립층 세포의 세포자멸사를 증가시키는데 유효한 양의 제제를 포함한다.

예를 들어, 상기 조성물은 BMP-15 또는 BMP-6에 대한 적합한 길항제 항체, 또는 BMPRII 수용체의 가용성 형태일 수 있다.

본 발명의 다양한 형태에서의 제제가 BMPR-II 및/또는 ALK6 수용체의 활성을 억제하는 경우에 있어서, 상기 제제는 상기 수용체에 결합하는 하나 이상의 난모세포 분비 인자의 농도를 감소시킴으로써 상기 수용체의 활성을 방해할 수 있거나, 상기 제제는 상기 수용체에 결합함으로써 상기 수용체의 활성을 방해하여 길항제로서 작용할 수 있거나, 상기 제제는 상기 수용체의 구조에 입체적 변화를 일으킴으로써 상기 수용체의 활성을 방해할 수 있거나, BMPR-II 수용체 및 ALK6 수용체 사이의 이종이합체의 형성을 방해할 수 있거나, 상기 수용체로부터의 신호전달에 관련된 하나 이상의 세포 내 단백질의 인산화를 방해할 수 있거나, 세포 내의 하나 이상의 인자의 농도를 조절하여 (상기 수용체의 발현을 포함함) 상기 수용체의 신호전달 활성을 방해할 수 있다.

상기 제제가 상기 수용체의 활성을 억제하는 경우에 있어서, 바람직하게는 상기 제제는 상기 수용체에 결합하는 하나 이상의 난모세포 분비 인자의 농도를 감소시킴으로써, 또는 과립층 세포에서의 Smad1 및/또는 Smad 5 및/또는 Smad8의 인산화를 감소시킴으로써 그 활성을 억제한다.

상기 제제가 상기 수용체의 활성을 촉진시키는 경우에 있어서, 상기 제제는 상기 수용체에 결합하는 하나 이상의 난모세포 분비 인지의 결합을 촉진시켜 활성화시킬수 있거나, 상기 제제는 수용체 작용제(agonist)로서 작용할 수 있거나, 상기 제제는 상기 수용체의 구조에 입체적 변화를 가져와 상기 수용체의 활성을 촉진시킬 수 있거나, 상기 제제는 BMPR-II 수용체 및 ALK6 수용체 사이의 이종이합체의 형성을 촉진할 수 있거나, 상기 제제는 상기 수용체로부터의 신호전달에 관련된 하나 이상의 세포 내 단백질의 인산화를 촉진할 수 있거나, 상기 제제는 세포 내의 하나 이상의 인자의 농도를 조절하여 (상기 수용체의 발현을 포함함) 상기 수용체의 신호전달 활성을 방해할 수 있다.

BMPR-II 수용체 및/또는 ALK6 수용체의 활성을 조절할 수 있는 제제의 종류의 예로는 단백질, 항체, 앱타머(aptamers), 안티센스 핵산, 안티센스 올리코뉴클레오티드, siRNAs, 폴리펩티드, 펩티드, 소분자, 약물, 다당류, 당단백질 및 지질 들수 있다.

예를 들어, 상기 제제가 BMPR-II의 활성을 억제하는 경우에 있어서, 본 발명의 다양한 형태에서 상기 제제는 (i) 막 결합 수용체에 결합하는 하나 이상의 난모세포 분비 인자에 경쟁적으로 결합할 수 있고 따라서 상기 수용체에 결합할 수 있는 하나 이상의 난모세포 분비 인자의 농도를 감소시킬 수 있는 BMPR-II 수용체의 가용성 형태; (ii) 과립층 세포의 표면에 발현되는 BMPR-II의 농도를 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드; (iii) 과립층 세포 내의 BMPR-II/type-I 이종이합체에 의한 Smad 1 및/또는 Smad5 및/또는 Smad8의 인산화를 방해하는 제제; 또는 (v) 상기 수용체에 경쟁적으로 결합할 수 있고 그에 따라 하나 이상의 난모세포 분비 성장 인자의 결합을 감소시킬 수 있는, BMPR-II의 세포외 도메인에 대하여 상승되고 이를 표적으로 하는 항체일 수 있다.

상기 제제가 BMPR-II 및 ALK6 수용체 중 어느 하나 또는 양쪽 모두의 활성을 억제하는 경우, 바람직하게는 상기 제제는 BMP-15 의존 자극 (GDF-9/BMP-15 이종이합체에 의한 자극을 포함함)을 억제함으로써, 또는 BMP-6 의존 자극을 억제함으로써 그 활성을 억제한다.

제제가 과립층 세포에서 BMP-15 및/또는 BMP-6 신호전달을 조절하는지에 대한 측정은 당해 기술 분야에 알려진 적절한 방법에 의하여 수행될 수 있다.

바람직하게는, 상기 제제는 과립층 세포에서 Smad 1 및/또는 Smad5 및/또는 Smad8의 인산화를 조절함으로써 BMP-15 및/또는 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절한다.

Smad 1 및/또는 Smad5 및/또는 Smad8의 인산화에 대한 제제의 능력의 측정은 당해 기술분야에 알려진 적절한 방법에 의하여 수행될 수 있다.

BMPR-II에 대한 안티센스 핵산으로 BMPR-II 또는 ALK6의 활성을 억제하는 제제의 경우, 상기 제제는 상기 수용체 중의 어느 하나의 핵산 서열의 전체 또는 일부에 대해 상보적인 핵산일 수 있다.

상기 안티센스 핵산은 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 임의의 변형 또는 유도체로 이루어질 수 있다. 상기 안티센스 핵산은 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 한가지 바람직한 형태에서는, 상기 제제는 DNA 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.

안티센스 올리고뉴클레오티드인 안티센스 핵산의 경우, 상기 올리고뉴클레오티드는 염기 부분, 당 부분 또는 인산 골격에서 변형이 될 수 있고, 상기 안티센스 핵산의 기능을 촉진하기 위해 부착된 다른 기를 포함할 수 있다.

상기 올리고뉴클레오티드는 당해 기술분야에 일반적으로 알려진 구성으로 그 구조의 임의의 지점에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포잔틴(hypoxanthine), 잔틴(xanthine), 4-아세틸시토신, 5-(카르복실이드로실메틸)우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 베타-D-갈락토실쿠에오신(beta-D-galactosylqueosine), 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실쿠에오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 위부톡소신(wybutoxosine), 슈도우라실, 쿠에오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필)우라실, (acp3)w 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하는 군에서 선택되는 적어도 하나의 변형된 염기 모이어티를 포함할 수 있다.

또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 아라비노스, 2-플루오로아라비노스, 자일룰로스 및 헥소스를 포함하지만 이것에 한정되지 않는 군에서 선택되는 적어도 하나의 변형된 당(sugar) 모이어티를 포함할 수 있다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미도티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스포르디아미데이트, 메틸포스포에이트, 알킬 포스포트리에스테르 및 포름아세탈 또는 이들의 유사체 등의 적어도 하나의 변형된 인산 골격을 포함할 수 있다.

본 발명의 다양한 형태에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드는 당해 기술분야에 알려진 표준적인 방법에 의하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 문헌 [Stein et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16: 3209]에 기재되 있는 것과 같은 방법으로 합성될 수 있다.

또한, 본 발명의 다양한 형태에 따른 안티센스 핵산은 외인성 서열로부터 전사에 의하여 세포 내에서 생산될 수 있다. 예를 들어, 벡터가 과립층 세포 내로 도입될 수 있고, 그 후 안티센스 RNA 핵산이 전사되어 생산될 수 있다. 이해되다시피, 이러한 경우의 벡터는 상기 안티센스 핵산 및 당해 기술 분야에 알려진 과립층 세포에서의 안티센스 핵산의 발현을 이끌기 위한 적절한 구성 또는 유도 프로모터를 코딩하는 서열을 함유할 것이다.

그러한 벡터는 목적하는 안티센스 RNA를 생산하도록 전사될 수 있는 한 에피좀으로 남아있거나 또는 크로모좀으로 통합될 수 있다. 벡터는 예컨대 문헌 [Sambrook, J, Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. (1989)]에 일반적으로 기재되어 있는 바와 같이 재조합 DNA 기술에 의한 당해 기술 분야의 표준적인 방법에 의하여 제조될 수 있다. 벡터는 진핵세포에서의 복제 및 발현을 위해 사용되는 플라스미드, 바이러스형 또는 기타의 당해 기술분야에 알려진 벡터일 수 있다.

본 발명의 다양한 형태에서 상기 제제가 항체인 경우, 그 항체를 당해 기술분야에 알려진 방법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 그러한 항체에는 폴리클로날, 모노클로날, 키메라, 단쇄, Fab 단편 및 Fab 발현 라이브러리에 의하여 생산되는 단편이 포함된다.

항체의 생산을 위하여, 염소, 토끼, 쥐, 생쥐, 인간 등을 포함하는 다양한 숙주가 면역원성을 가지는 폴리펩티드 또는 그의 임의의 단편 또는 올리고펩티드를 주입하여 면역화될 수 있다. 숙주의 종에 따른 다양한 애주번트가 면역 반응을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 그러한 애주번트는 프로인트, 미네랄 겔 (예컨대, 수산화알루미늄) 및 표면 활성 물질 (예컨대, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올(pluronic polyols), 다중음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌 및 디니트로페놀)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

모노클로날 항체는 배양 중의 연속 세포주에 의한 항체 분자의 생산을 위해 제공되는 임의의 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 여기에는 하이브리도마 기술, 인간 B세포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술, 예컨대, 문헌 [Kohler, G. et al. (1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D. et al. (1985) J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote, R. J. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030; 또는 Cole, S. P. et al. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120]에 기재된 것과 같은 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

예를 들어, 뼈 형태발생 수용체 유형 II(bone morphogenic receptor type II)를 조절하는 단백질에 대한 모노클로날 항체를 생성시키기 위해서, 상기 단백질의 펩티드 서열을 합성하고, 문헌 [Groome and Lawrence M (1991) Hybridoma 10:309-316]에 기재된 바와 같은 투베르쿨린의 정제된 단백질 유도체에 결합시킬 수 있다. 그 후, 무작위교매 틸러 오리지날 (Outbred Tyler's Original; T/O) 마우스 (Southend on Sea, Essex, UK)에 4 개월에 걸쳐 면역 요법을 수행시킬 수 있다. 그 후, 문헌 [Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principle and Practice. New York: Academic Press]에 기재되어 있는 바와 같이, 상기 동물을 희생시키고, 지라를 제거하여 Sp2/0 쥐 골수종 세포에 융합시킨다.

문헌 [Groome N.P. et al. (1990) Hybridoma 9:31-42]에 기재되어 있는 바와 같이, 먼저 하이브리도마 상청액(Hybridoma supernatant)을 Nunc 면역플레이트(Nunc immunoplate)에 코팅된 펩티드에 대하여 ELISA로 스크리닝할 수 있다. 그 후, 반응성 클론을 확대시켜 제한 희석(imiting dilution)에 의하여 다시 클로닝할 수 있다. 그 후, 이들을 표적 단백질 분자에 대하여 다시 스크리닝하고, 가장 좋은 반응 클론을 선별한 후 확장 및 동형화(isotyping)를 할 수 있다. 문헌 [Harlow, E. and Lane D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Habor Press., Plainview, NY]에 기재되어 있는 바와 같이, IgG 항체는 조사 전에 고염(high salt) 프로토콜을 사용하여 단백질 A 칼럼 상에 있을 수 있다.

또한, 예컨대, 문헌 [Morrison, S. L. et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger, M. S. et al. (1984) Nature 312:604-608; 또는 Takeda, S. et al. (1985) Nature 314:452-454]에 기재되어 있는 바와 같은, "키메라 항체"의 생산을 위해 개발된 기술들, 적합한 항원 특이성 및 생물학적 활성을 가진 분자를 얻기 위한 마우스 항체 유전자의 인간 항체 유전자로의 스플라이싱이 사용될 수 있다.

특이적 결합 부분을 함유하는 항체 단편이 역시 생성될 수 있다. 예를 들어, 그러한 단편은 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생성될 수 있는 F(ab')2 단편 및 F(ab')2 단편의 이황화 결합의 환원으로 생성될 수 있는 Fab 단편을 포함한다. 또 다르게는, Fab 발현 라이브러리가 목적하는 특이성을 가진 모노클로날 Fab 단편의 빠르고 용이한 동정을 가능하도록 구성될 수 있는데, 예컨대, 문헌 [Huse, W. D. et al. (1989) Science 254:1275-1281]에 기재되어 있는 바와 같다.

다양한 면역분석법이 목적하는 특이성을 가지는 항체를 동정하기 위한 스크리닝법을 위해 사용될 수 있다. 특이성이 확립된 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 사용한 경쟁적 결합 또는 면역방사측정법을 위한 다수의 프로토콜이 당해 기술 분야에 알려져 있다.

과립층 세포에 노출시켜지는 제제의 유효량은 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는 효과를 나타내는 양 및 형태인 한 특별히 한정되지 않는다.

이와 관련하여, 상기 제제의 유효량은 조절되는 과립층 세포의 세포자멸사의 정도에 따라 적절하게 선택될 수 있고, 만약 그 제제가 생체 내로 투여될 경우라면 대상체의 연령 및 체중, 투여빈도 및 다른 활성 제제의 존재 여부가 고려될 필요가 있을 수 있다.

시험관 내의 과립층 세포에 투여되는 제제의 경우, 투여는 상기 제제에 상기 과립층 세포의 직접적인 노출에 의해 일어날 수 있다.

전술한 바와 같이, 이러한 경우 본 발명은 난모세포 시험관 내 성숙 배지의 조제를 위해 특히 적합하다.

따라서, 본 발명은 난모세포 시험관 내 성숙 배지를 제공하는데, 상기 배지는 다음 중 하나 이상을 포함한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6;

바람직하게는, 과립층 세포에서의 세포자멸사를 억제하는데 유효한 BMP-15의 농도는 1∼1500 ng/ml이다.

바람직하게는, 과립층 세포에서의 세포자멸사를 억제하는데 유효한 BMP-6의 농도는 1∼200 ng/ml이다.

이와 관련하여, BMP-15 및/또는 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 과립층 세포의 세포자멸사를 억제하는 제제의 첨가가 과립층 세포의 세포자멸사를 감소시키기 위해 일반적으로 존재하는 첨가물을 함유하지 않는 조성물 또는 배지의 조제를 가능하게 하기 위해 사용될 수 있다는 것이 추가로 확정되었다. 그러한 첨가물은 혈청, 알부민, 난포액, 피투인, 난포자극호르몬(FSH) 및 항세포자멸사 성장 인자, 예컨대 IGFs (예컨대, IGF-1) 및 EGFs (암피레귤린 및 에피레귤린을 포함함)를 포함한다.

따라서, 다양한 적절한 형태에서, 본 발명은 상기 첨가물이 실질적으로 없고, BMP-15 및/또는 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 과립층 세포의 세포자멸사를 억제하는 제제를 포함하는 조성물 및 배지를 제공한다.

예를 들어, 상기 배지는 난모세포 더미 복합체 및/또는 난포를 위한 배양 배지일 수 있다.

따라서, 또 다른 형태에서 본 발명은 난모세포 더미 복합체 및/또는 난포의 배양을 위한 배지를 제공하는데, 상기 배지는 다음 중 하나 이상을 포함한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6의 유효량;

(iii) 난모세포 더미 복합체 내 또는 난포 내의 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제의 유효량;

예를 들어, 상기 배지는 난모세포 더미 복합체 내의 난모세포의 시험관 내 성숙을 위하여 사용될 수 있다.

따라서, 또 다른 형태에서 본 발명은 난모세포 시험관 내 성숙 배지(oocyte in vitro maturation medium)를 제공하는데, 상기 배지는 다음 성분 중 하나 이상을 포함한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6;

또한 본 발명은 난포를 배양하기 위한 배지를 조제하기에 적합하고, 특히 난포 발달의 향상 또는 난포 폐쇄의 감소를 위한 것에 적합하다.

따라서, 또 다른 형태에서 본 발명은 난포 배양 배지를 제공하는데, 상기 배지는 다음 성분 중 하나 이상을 포함한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6;

또한, 다양한 형태에 있어서 본 발명은 과립층 세포의 세포자멸사를 억제하는 제제 및 난모세포 및/또는 난포의 배양을 위한 배지를 조제하기 위한 기타의 첨가물을 포함하는 조성물 또는 배지를 제공한다.

바람직하게는, 상기 조성물 또는 배지는 NaCl을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 조성물 또는 배지는 40 mM∼400 mM NaCl을 포함한다.

바람직하게는, 상기 조성물 또는 배지는 KCl을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 조성물 또는 배지는 0.1 mM∼20 mM KCl을 포함한다.

바람직하게는, 상기 조성물 또는 배지는 글루코오스를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 조성물 또는 배지는 0.1 mM∼40 mM 글루코오스를 포함한다.

따라서, 또 다른 형태에서 본 발명은 다음 중 하나 이상을 포함하는 조성물 또는 배지를 제공한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6;

(ii) 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 과립층 세포의 세포자멸사를 억제하는 제제; 및

(iii) 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 과립층 세포의 세포자멸사를 억제하는 제제;

여기서, 상기 조성물은 40 mM∼400 mM NaCl, 0.1 mM∼20 mM KCl 및 0.1 mM∼40 mM 글루코오스를 더 포함하는 것이다.

상기 조성물 또는 배지는 난모세포의 시험관 내 성숙을 위해서 또는 난포의 배양을 위해서 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위한 조성물 또는 배지의 사용을 위한 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다.

바람직하게는, 과립층 세포에서 세포자멸사를 억제하는데 유효한 BMP-15의 농도는 1∼1500 ng/ml이다.

바람직하게는, 과립층 세포에서 세포자멸사를 억제하는데 유효한 BMP-6의 농도는 1∼200 ng/ml이다.

바람직하게는, 상기 조성물 중의 NaCl 농도는 100 mM∼180 mM이다. 가장 바람직하게는, 상기 NaCl의 농도는 140 mM이다.

바람직하게는, 상기 조성물 중의 KCl 농도는 1 mM∼8 mM이다. 가장 바람직하게는, 상기 KCl의 농도는 4 mM이다.

바람직하게는, 상기 조성물 중의 글루코오스 농도는 1 mM∼25 mM이다. 가장 바람직하게는, 상기 글루코오스의 농도는 5.6 mM이다.

상기 조성물은 예컨대 쯔비테리오닌(zwitterionin) 또는 인산염 버퍼, 또는 10 mM∼60 mM 농도 범위의 중탄산나트륨 버퍼 등의 적절한 무기 버퍼를 또한 일반적으로 포함할 것이다. 바람직하게는, 중탄산나트륨의 농도는 20 mM∼40 mM이다. 가장 바람직하게는, 중탄산나트륨의 농도는 25 mM이다.

예를 들어, BMP-15를 사용한 적절한 배지는 다음과 같다:

BMP-15 0.0005

CaCl₂.2H₂0 0.265

MgSO₄.6H₂0 0.09767

KCl 0.4

NaCl 6.8

NaH₂PO₄ 0.122

L-아르기닌.HCl 0.126

L-시스테인.HCL.일수화물 0.0313

L-글루타민 0.292

L-히스티딘.HCL.일수화물 0.042

L-이소루신 0.052

L-루신 0.052

L-리신.HCl 0.0725

L-메티오닌 0.015

L-페닐알라닌 0.032

L-트레오닌 0.048

L-트립토판 0.01

L-티로신.2Na.이수화물 0.0519

L-발린 0.046

염화콜린 0.001

엽산 0.001

미오-이노시톨 0.002

나이아신아미드 0.001

D-팬토텐산.1/2Ca 0.001

피리독살.HCl 0.001

리보플라빈 0.0001

티아민.HCl 0.001

글루코오스 1

페놀 레드.Na 0.011

NaHCO₃ 2.2

BMP-6를 사용하는 적절한 배지 (g/l)는 다음과 같다:

BMP-6 0.0001

CaCl₂.2H₂0 0.265

MgSO₄.6H₂0 0.09767

KCl 0.4

NaCl 6.8

NaH₂PO₄ 0.122

L-아르기닌.HCl 0.126

L-시스테인.HCL.일수화물 0.0313

L-글루타민 0.292

L-히스티딘.HCL.일수화물 0.042

L-이소루신 0.052

L-루신 0.052

L-리신.HCl 0.0725

L-메티오닌 0.015

L-페닐알라닌 0.032

L-트레오닌 0.048

L-트립토판 0.01

L-티로신.2Na.이수화물 0.0519

L-발린 0.046

염화콜린 0.001

엽산 0.001

미오-이노시톨 0.002

나이아신아미드 0.001

D-팬토텐산.1/2Ca 0.001

피리독살.HCl 0.001

리보플라빈 0.0001

티아민.HCl 0.001

글루코오스 1

페놀 레드.Na 0.011

NaHCO₃ 2.2

전술한 바와 같이, 본 발명은 동결-해동 손상에 의해 유도되는 세포자멸사를 감소시키는데도 적합하다는 것이 인정되었다.

따라서, 또 다른 형태에서 본 발명은 동결-해동에 기인한 과립층 세포 세포자멸사를 감소시키기 위한 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함한다:

(i) 활성 BMP-15 및/또는 활성 BMP-6;

(ii) 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 조성물; 및

(iii) 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 조성물.

상기 조성물은 동결 전 및/또는 해동 후에 사용될 수 있다.

예를 들어, 각각의 난모세포 더미 복합체, 전체 난포, 난소 조직 또는 전체 난소는 동결되었을 때 동결/해동의 결과로서 일반적으로 죽고, 상기 조성물은 동결-해동에 따른 세포 및 조직의 생존력을 향상시키기 위해 사용될 수 있다.

따라서, 또 다른 형태에서 본 발명은 동결에 기인한 난모세포 더미 복합체, 난포, 난소 조직 또는 난소에 대한 손상을 감소시키기 위한 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함한다:

(i) 활성 BMP-15 및/또는 활성 BMP-6의 유효량;

한가지 바람직한 형태에서, 상기 조성물은 배양 배지이다.

본 발명의 조성물 및/또는 배지는 보조 생식 기술을 위해 사용되는 난모세포의 배양을 위해 특히 적합하다. 보조 생식을 수행하기 위한 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다.

이와 관련하여, 본 명세서에서 사용되는 "보조 생식"이라는 용어는 분리된 난모세포 및/또는 분리된 정자를 필요로 하는 인간 및 동물에서의 임의의 수정 기술로서, 시험관 내에서 배양된 난모세포 또는 배아를 사용한 기술 (예컨대, 난모세포의 시험관 내 성숙), 시험관 내 수정 (IVF; 난모세포의 흡입, 실험실에서의 수정 및 수령자에게로 배아의 전달), 생식세포 자궁관 내 전달 (GIFT; 난모세포 및 정자를 자궁관 내로 위치시킴), 접합체 자궁관 내 전달 (ZIFT; 수정된 난모세포를 자궁관 내로 위치시킴), 배아 자궁관 내 전달 (TET; 분열 배아(cleaving embryos)들을 자궁관 내로 위치시킴), 난모세포 및 정자 복강 내 전달 (POST; 난모세포 및 정자를 골반강 내로 위치시킴), 세포질 내 정자 주입 (ICSI), 고환 정자 추출 (TESE) 및 미세수술 부고환 정자 흡입 (MESA)을 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.

따라서, 또 다른 형태에서 본 발명은 난모세포를 필요로 하는 보조 생식의 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음 성분 중 하나 이상을 포함하는 배지 내에서 난모세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6;

예를 들어, 본 발명은 시험관 내 수정 기술에서 사용될 수 있다.

따라서, 또 다른 형태에서 본 발명은 난모세포의 시험관 내 수정 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음 성분 중 하나 이상을 포함하는 배지 내에서 난모세포를 배양하는 단계를 포함한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6;

또한, 본 발명은 난모세포를 필요로 하는 보조 생식에서 사용하기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명은 수정되어 배아를 형성하는 난모세포와 연관된 과립층 세포의 세포자멸사를 조절함으로써 배아의 발달 능력을 조절하는데 적합하다

따라서, 또 다른 형태에서 본 발명은 난모세포로부터 생성되는 배아의 발달 능력을 조절하기 위한 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함한다:

또 다른 형태에서, 본 발명은 난모세포로부터 생성되는 배아의 발달 능력을 조절하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음 단계들 중 하나 이상을 포함한다:

또 다른 형태에서, 본 발명은 난모세포로부터 생성되는 배아를 필요로 하는 보조 생식의 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음 성분 중 하나 이상을 포함하는 배지 내에서 난모세포 및/또는 배아를 배양하는 단계를 포함한다:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6;

또한, 본 발명은 난모세포로부터 생성되는 배아를 필요로 하는 보조 생식에서의 사용을 위한 조성물을 제공한다.

생체 내로 투여되는 본 발명의 다양한 제제의 경우, 상기 제제는 그 제제가 목적하는 작용 자리에 도달하도록 하고 과립층 세포 세포자멸사를 억제하는 효과를 가지게 하는데 적합한 형태 및 농도로 전달될 것이다.

상기 제제의 투여는 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는 목적하는 효과를 생성하는데 적합한 시간 내에 이루어질 것이다.

이와 관련하여, 본 발명의 다양한 관련된 형태에 있어서, 과립층 세포에 대한 상기 제제의 투여는 과립층 세포와 연관된 시험관 내 또는 생체 내의 난모세포의 수정 전, 그 동안 및 그 후의 시점에 일어날 수 있다.

인간 또는 동물 대상체에서, 상기 제제는 경구적으로, 비경구적으로, 국소적으로 또는 여하한 다른 적합한 수단으로 투여될 수 있고, 따라서 상기 제제의 전이 시간(transit time)이 고려되어야 한다.

또한, 본 발명의 다양한 형태에서 상기 제제의 생체 내 투여는 투여되는 제제의 특정 물리적 및 화학적 특성을 고려하여, 약학적으로 허용가능한 염, 아미노산, 폴리펩티드, 중합체, 용매, 버퍼, 부형제 및 충전제를 포함하는 한가지 이상의 약학적으로 허용가능한 첨가물의 사용을 포함할 수 있다

예를 들어, 상기 제제는 수용성 용액, 유성 제제, 지방 에멀전, 에멀전, 겔 등의 형태로의 다양한 약제로 제조될 수 있고, 이들 약제는 근육내 또는 피하 주사로서 또는 난소로 주사하여, 또는 매몰된(embeded) 약제로서 또는 비강, 직장, 자궁, 질, 폐 등을 통한 점막관통 약제로서 투여될 수 있다. 상기 약제는 구강용 약제 (예컨대, 정제, 캡슐, 과립 또는 파우더 등의 고형 약제; 시럽, 에멀전 또는 현탁액 등의 액상 약제)의 형태로 투여될 수 있다. 또한, 상기 제제를 함유하는 조성물은 보존제, 안정화제, 분산제, pH 조절제 또는 등장화제(isotonic agent)를 함유할 수 있다. 적절한 보존제의 예로는 글리세린, 프로필렌 글리콜, 페놀 또는 벤질 알콜을 들 수 있다. 적절한 안정화제의 예로는 덱스트란, 젤라틴, α-토코페롤 아세테이트 또는 알파-티오글리세린을 들 수 있다. 적절한 분산제의 예로는 폴리옥시에틸렌 (20), 소르비탄 모노-올레이트 (Tween 80), 소르비탄 세스퀴올리에이트 (Span 30), 폴리옥시에틸렌 (160) 폴리옥시프로필렌 (30) 글리콜 (Pluronic F68) 또는 폴리옥시에틸렌 수소화 캐스터 오일 60을 들 수 있다. 적절한 pH 조절제의 예로는 염산, 수산화나트륨 등을 들 수 있다. 절절한 등장화제의 예로는 글루코오스, D-소르비톨 또는 D-만니톨을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 다양한 형태에서 제제의 생체 내 투여는, 투여되는 특정 제제의 물리적 및 화학적 특성을 고려하여, 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제, 현탁제, 윤활제, 애주번트, 운반체, 운반 시스템, 유화제, 붕괴제(disintegrant), 흡착제, 보존제, 표면활성제, 착색제, 향미제 또는 감미제를 함유하는 조성물의 형태로 이루어질 수 있다.

이러한 목적을 위하여, 상기 조성물은 경구적으로, 비경구적으로, 스프레이 흡입에 의하여, 흡착, 국소적으로, 직장으로, 비강으로, 협측으로(bucally), 질로, 뇌실내로, 통상적인 비독성의 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 투여 제형으로 이식된 저장소를 통하여 또는 기타의 편리한 투여 형태로 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 비경구라는 용어는 피하, 정맥내, 근육내, 복막내, 경막내, 뇌실내, 흉골내(intrasternal) 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.

비경구적으로 투여되는 경우, 상기 조성물은 일반적으로 단위 투여량(unit dosage)으로 멸균된 주사가능한 형태 (용액, 현탁액 또는 에멀전)이고, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체를 가지는 수령자의 혈액과 등장성이다. 그러한 멸균된 주사가능한 형태의 예로는 멸균된 주사가능한 수성 또는 유성 현탁액이 있다. 이들 현탁액은 적절한 분산 또는 습윤제 또는 현탁제를 사용하는 당해 기술 분야에 알려진 기술에 따라 조제될 수 있다. 또한, 상기 멸균된 주사가능한 형태는 비독성의 비경구적으로 허용가능한 희석액 또는 용매 (예컨대, 1,3-부탄디올 중의 용액으로서) 중의 멸균된 주사가능한 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 운반체 및 용매 중에는 물, 염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 등장 염화나트륨 용액 및 행크용액이 있다. 또한, 멸균, 고정 오일(fixed oils)이 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용된다. 이러한 목적을 위하여, 합성 모노글리세리드 또는 디글리세리드, 옥수수유, 면실유, 땅콩유 및 참기름을 포함하는 임의의 순한(bland) 고정 오일이 사용될 수 있다. 에틸 올레이트, 이소프로필 미리스테이트 및 올레산 및 그의 글리세리드 유도체 등의 지방산은 (올리브유 및 피마자유를 포함함), 특히 그들의 폴리옥시에틸화 형태로, 주사제의 조제에 유용하다. 또한, 이들 유성 용액 또는 현탁액은 긴사슬 알콜 희석제 또는 분산제를 함유할 수 있다.

상기 담체는 예를 들어 가용성, 등장성 및 화학적 안정성을 강화시키는 물질 (예컨대, 항산화제, 버퍼 및 보존제)과 같은 소량의 첨가제를 함유할 수 있다.

경구적으로 투여되는 경우, 상기 조성물은 일반적으로 정제, 카세제, 파우더, 과립, 비드, 씹을 수 있는 로젠지, 캡슐, 액체, 수성 현탁액 또는 용액 또는 이와 유사한 투약형태 등의 단위 투약형태로 당해 기술분야에 알려진 통상적인 장치 및 기술을 사용하여 조제될 것이다. 이러한 제형에는 통상적으로 고체, 반고체 또는 액체 담체를 포함한다. 담체의 예로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 검 아카시아, 인산염칼슘, 광유, 코코아버터, 테오브로마 오일, 알기네이트, 트라가칸트, 젤라틴, 시럽, 메틸셀룰로오스, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 등을 들 수 있다.

정제는 활성 성분과 필요에 따라 한가지 이상의 보조성분과 함께 압착 또는 몰딩에 의하여 만들어질 수 있다. 압착 정제는 파우더 또는 과립 등의 자유롭게 흐르는(free-flowing) 형태의 활성 성분을 필요에 따라 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 표면활성제 또는 분산제와 혼합하여 적합한 기계에서 압착에 의하여 제조될 수 있다. 성형 정제는 분발 활성 성분과 불활성 액체 희석제로 적셔진 적절한 담체의 혼합물을 적합한 기계에서 몰딩시킴으로써 만들어질 수 있다.

본 발명의 다양한 형태에서 상기 제제의 투여는 또한 조절 방출 기술(controlled release technology)을 이용할 수 있다. 또한, 상기 제제는 지연 방출 약물(sustained-release pharmaceutical)로서 투여될 수 있다. 지연 방출 효과를 더욱 강화시키기 위하여, 상기 조성물은 예를 들어, 식물성유 (예컨대, 대두유, 참기름, 카멜리아유, 캐스터유, 땅콩유, 평지씨유); 중간 지방산 트리글리세리드; 에틸 올레이트 등의 지방산 에스테르; 폴리실록산 유도체와, 또 다른 것으로는, 수용성(水溶性)의 높은 분자량 화합물, 예컨대 히알루론산 또는 그의 염 (평균 분자량: ca. 80,000 ∼ 2,000,000), 카르복시메틸셀루로스 소듐 (평균 분자량: ca. 20,000 ∼ 400,000), 히드록시프로필셀룰로스 (2% 수용액에서의 점도: 3 ∼ 4,000 cps), 아테로콜라겐 (평균 분자량: ca. 300,000), 폴리에틸렌 글리콜 (평균 분자량: ca. 400 ∼ 20,000), 폴리에틸렌 옥사이드 (평균 분자량: ca. 100,000 ∼ 9,000,000), 히드록시프로필메틸셀룰로스 (1% 수용액에서의 점도: 4 ∼ 100,000 cSt), 메틸셀룰로스 (2% 수용액에서의 점도: 15 ∼ 8,000 cSt), 폴리비닐 알콜 (점도: 2 ∼ 100 cSt), 폴리비닐피롤리돈 (평균 분자량: 25,000 ∼ 1,200,000)과 같은 추가적인 성분과 함께 조제될 수 있다.

또한, 상기 제제는 수일에 걸친 조절된 방출을 위하여 소수성 중합체 매트릭스 속으로 혼입될 수 있다. 그 후, 본 발명의 조성물은 빈번한 재투여의 필요 없이 장기간에 걸친 효율적인 농도의 상기 제제를 제공하기에 적합한 고체 이식물 또는 외용 패취(patch) 속으로 성형될 수 있다. 그러한 조절된 방출 필름은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 이러한 목적을 위하여 일반적으로 채용되는 중합체의 기타의 예로는 외적 또는 내적으로 사용될 수 있는 비분해성(nondegradable) 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체를 포함한다. 특정 수화겔, 예컨대 폴리(히드록시에틸메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)이 비록 전술한 바와 같은 다른 중합체 방출 시스템보다 더 짧은 방출 주기를 가지지만 또한 유용할 수 있다.

또한, 담체는 적절한 시간 방출 특성 및 방출 반응속도를 가진 고체 생분해성 중합체 또는 생분해성 중합체의 혼합물일 수 있다. 그 후, 상기 조성물은 빈번한 재투여의 필요 없이 장기간에 걸친 효율적인 농도의 상기 제제를 제공하기에 적합한 고체 이식물 속으로 성형될 수 있다. 상기 제제는 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 임의의 적합한 방식으로 생분해성 중합체 또는 중합체 혼합물 속으로 혼입될 수 있고, 생분해성 중합체와 동질 매트릭스를 형성할 수 있거나, 또는 상기 중합체 내에 몇 가지 방식으로 캡슐화되거나, 또는 고체 이식물 속으로 성형될 수 있다.

또한, 본 발명은 난모세포와 연관된 과립층 세포의 세포자멸사의 정도를 측정함으로써 난모세포의 발달 능력을 평가하는 방법을 제공한다.

따라서, 또 다른 형태에서 본 발명은 난모세포의 발달 능력을 평가하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

이와 관련하여, "발달 능력(developmentally competence)"이라는 용어는 이식 가능한 배아로 발달하기 위한 난모세포의 능력을 의미하는 것으로 이해될 것이다.

향상된 발달 능력은 과립층 세포에서의 낮은 수준의 세포자멸사와 관련될 것이고, 반면 감소된 발달 능력은 과립층 세포에서의 높은 수준의 세포자멸사와 관련될 것이라는 것이 이해될 것이다.

상기 발달 능력의 평가는 시험관 내 난모세포 또는 생체 내 난모세포에서 수행될 수 있다.

시험관 내 및 생체 내의 세포에서 세포자멸사의 정도를 평가하는 방법은 앞에서 설명한 바와 같다.

따라서, 본 발명은 예컨대 난모세포 더미 복합체의 일부로서 또는 난포의 일부로서 시험관 내 난모세포의 발달 능력을 평가하는 것, 또는 생체 내 난모세포의 발달 능력을 평가하는 것을 포함한다.

또한, 본 발명은 다음 중 하나 이상을 측정함으로써 난모세포의 발달 능력을 평가하는데 적합하다:

(i) 난모세포와 연관된 과립층 세포가 노출된 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성;

(ii) 난모세포와 연관된 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성의 수준; 및

(iii) 난모세포와 연관된 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성의 수준.

이 경우, 향상된 발달 능력은 과립층 세포가 노출된 BMP-15 및/또는 BMP-6의 높은 농도 및/또는 활성, 또는 과립층 세포에서의 BMP-15 또는 BMP-6 의존 신호전달 경로의 높은 활성과 관련이 있을 것이고, 반면 감소된 발달 능력은 과립층 세포가 노출된 BMP-15 및/또는 BMP-6의 낮은 농도 및/또는 활성, 또는 과립층 세포에서 세포자멸사의 수준이 증가된 과립층 세포에서의 BMP-15 또는 BMP-6 의존 신호전달 경로의 낮은 활성과 관련이 있을 것이다.

상기 방법에 있어서, BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성의 증가, 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6 의존 신혼전달 경로의 활성의 증가는 발달 능력이 증가된 난모세포를 나타내고, BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성의 감소, 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6 의존 신혼전달 경로의 활성의 감소는 발달 능력이 감소된 난모세포를 나타낸다.

BMP-15 및 BMP-6의 농도 또는 활성을을 측정하는 방법 및 적절한 신호전달 경로의 활성을 측정하는 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다.

또한, 본 발명은 난모세포에 의한 BMP-15 및 BMP-6의 발현, 생산 및 분비 중 하나 이상을 측정함으로써 난모세포의 발달 능력을 평가하는 방법을 제공한다.

예를 들어, 인간의 IVF 동안, 사용되는 난모세포는 일반적으로 나화되고, 그 난모세포의 발달 능력은 수정 전에 난모세포를 함유하는 배지에서의 BMP-15 및/또는 BMP-6 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다. BMP-15 및/또는 BMP-6의 수준을 측정하기 위한 적합한 방법은 ELISA에 의한 것이다.

따라서, 또 다른 형태에서 본 발명은 난모세포의 발달 능력을 평가하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음 단계를 포함하는 것이다:

(ii) 상기 난모세포의 발달 능력을 평가하는 단계;

상기 방법에 있어서, BMP-15 및/또는 BMP-6의 발현 및/또는 농도의 증가는 발달 능력이 증가된 난모세포를 나타내고, BMP-15 및/또는 BMP-6의 발현 및/또는 농도의 감소는 발달 능력이 감소된 난모세포를 나타낸다.

본 연구 (실시예의 연구 II를 참조)에서, 시험관 내 성숙 동안의 난모세포 더미 복합체의 다른 나화 난모세포와의 공동 배양은 상기 난모세포 더미 복합체의 수정에 따른 포배 형성의 속도(rates)에 극적인 향상을 가져온다는 것이 또한 발견되었다. 이러한 결과는 난모세포 분비 인자가 난모세포 발달 능력에 깊은 효과를 가진다는 것을 증명한다.

또한, 난모세포 발달 능력의 향상에 기여하는 난모세포 분비 인자의 적어도 일부는 GDF-9 및/또는 BMP-15라는 것이 더 발견되었다. 따라서, GDF-9 동종이합체, BMP-15 동종이합체 및 GDF-9/BMP-15 이종이합체가 포함될 것이다.

BMP-6이 난모세포 발달 능력의 향상을 이끌 난모세포 분비 인자 중의 하나일 것이라는 점이 또한 예상된다.

따라서, 본 발명은 다음 단계 중 하나 이상을 포함하는 난모세포의 발달 능력을 조절하는 방법을 제공한다:

(i) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 더미세포가 노출되는 난모세포 분비 인자의 농도 및/또는 활성을 조절하는 단계;

(ii) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절하는 단계;

(iii) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 GDF-9 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계;

(iv) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계; 및

(v) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계.

이와 관련하여, 난모세포 및 배아의 발달 및 발달 능력을 조절하고 진단하기 위한 새로운 기술의 개발이 필요하다는 것이 점점더 명백해지고 있다.

또한 인간 및 동물 양쪽 모두에서 보조 생식 기술과 관련하여 잘 입증되어 있는 곤란성이 있다. 특히, 모든 연령의 여성으로부터의 난모세포의 시험관 내 성숙을 향상시킬 필요 및 수정된 난모세포의 발달 능력을 향상시킬 필요가 있는데, 특히 35세 미만의 여성과 비교할 때 IVF에 의한 임신 성공이 약 1/4인 40세 이상의 여성에 관한 IVF 프로그램에 있어서 필요하다.

이와 관련하여, "보조 생식"이라는 용어는 분리된 난모세포 및/또는 분리된 정자를 필요로 하는 인간 및 동물에서의 임의의 수정 기술로서, 시험관 내에서 배양된 난모세포 또는 배아를 사용한 기술 (예컨대, 난모세포의 시험관 내 성숙), 시험관 내 수정 (IVF; 난모세포의 흡입, 실험실에서의 수정 및 수령자에게로 배아의 전달), 생식세포 자궁관 내 전달 (GIFT; 난모세포 및 정자를 자궁관 내로 위치시킴), 접합체 자궁관 내 전달 (ZIFT; 수정된 난모세포를 자궁관 내로 위치시킴), 배아 자궁관 내 전달 (TET; 분열 배아들을 자궁관 내로 위치시킴), 난모세포 및 정자 복강 내 전달 (POST; 난모세포 및 정자를 골반강 내로 위치시킴), 세포질 내 정자 주입 (ICSI), 고환 정자 추출 (TESE) 및 미세수술 부고환 정자 흡입 (MESA); 또는 인간 및/또는 동물에서 배아를 생산하기 위한 모든 다른 시험관 내 기술 (예컨대 핵 전달, 처녀생식적 활성화(parthenogenic activation) 및 분화전능세포의 사용)을 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.

난모세포 및 배아와 관련하여 사용된 "분리된"이라는 용어는 난모세포 또는 배아가 그의 천연 환경으로부터 제거 또는 정제 (적어도 부분적으로)된 때를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 분리된 배아의 예로는 보조 생식 기술을 사용하여 시험관 내에서 생성된 배아 또는 대상체로부터 분리된 배아를 들 수 있다. 분리된 난모세포의 예로는 난포의 일부, 난모세포 더미 복합체 또는 나화 난모세포로서 대상체로부터 분리된 난모세포를 들 수 있다.

"발달적으로 능력이 있는(developmentally competence)"이라는 용어는 이식 가능한 배아를 형성할 수 있는 배아 또는 난모세포를 의미하는 것으로 이해될 것이다. "발달 능력(developmental competence)"이라는 용어는 이식 가능한 배아로 발달하기 위한 난모세포 또는 배아의 능력을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 발달 능력이 향상된 난모세포 또는 배아는 성공적인 이식 후에 살아있는 동물 또는 인간으로 발달할 가능성이 증가될 것이다.

또한, 이러한 방법은 수정 후의 발달을 통해 진행하는 난모세포의 능력을 변화시키기 위해 사용될 수 있다.

예시적으로, (i) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미가 노출되는 난모세포 분비 인자의 농도 및/또는 능력; (ii) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 능력; (iii) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성 중 하나 이상을 증가시킴으로써 세포 더미 복합체 내에서 수정된 난모세포는 포배기 또는 상실기까지 더 잘 발달할 것이다.

한가지 이상의 난모세포 분비 인자의 적합한 출처는 난모세포를 하나 이상의 추가적인 나화 난모세포에 노출시키는 것을 포함한다. 또한, 난모세포는 하나 이상의 난모세포로부터의 적응용 배지에 노출될 수 있다.

바람직하게는, 난모세포의 발달 능력의 조절은 난모세포 또는 난모세포와 연관된 더미 세포가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도를 조절하는 방법에 의하는 것이다.

이와 관련하여, 난모세포의 발달 능력은 난모세포 또는 난모세포와 연관된 더미 세포가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도를 증가시킴으로써 향상될 수 있다.

따라서, 바람직한 형태에서 본 발명은 난모세포의 발달 능력을 조절하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 더미 세포가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도를 조절하는 단계를 포함한다.

전술한 하나 이상의 단계의 조절은 난모세포의 수정 전, 난모세포의 수정과 동시에 도는 난모세포의 수정 후에 일어날 수 있다는 것이 이해될 것이다.

바람직하게는, 상기 하나 이상의 단계의 조절은 난모세포의 수정 전에 일어난다. 예를 들어, 상기 방법은 난모세포의 수정이 일어나기 전에 난모세포의 발달 능력을 향상시키기 위해 사용될 수 있다.

상기 방법은 시험관 내 또는 생체 내의 난모세포의 발달 능력을 조절하기 위해 사용될 수 있다는 것이 또한 이해될 것이다.

예를 들어, 상기 방법은 시험관 내의 난모세포의 발달 능력을 조절하기 위하여 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 상기 난모세포는 예컨대 난포 내에 존재하는 난모세포, 난모세포 더미 복합체 내에 존재하는 난모세포, 그의 세포 더미가 나화 난모세포 또는 난모세포 더미 복합체에 존재하거나 또는 나화된 수정된 난모세포일 수 있다. 바람직하게는, 상기 난모세포는 난모세포 더미 복합체의 일부이다.

적합한 여성 수용자로부터 난모세포 및 난모세포 더미 복합체를 수집하기 위한 방법 및 시험관 내에서 그 난모세포를 수정시키는 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다.

이와 관련하여, 본 발명은 상기 방법에 의하여 생성되는 발달 능력의 변화를 가진 분리된 난모세포 (예컨대, 시험관 내의 나화 난모세포 또는 시험관 내의 난모세포 더미 복합체의 일부인 난모세포) 및 그 난모세포로부터 생성되는 배아 또는 비인간 동물을 제공한다.

시험관 내에서 생성된 발달 능력이 변경된 난모세포는 적합한 수용 여성 대상체에 전달시키는 것을 포함하는 보조 생식 기술에서 사용될 수 있거나, 또는 배아 전달, IVF 및/또는 유전적 조작에 사용하기 위하여 생존을 유지면서 시험관 내에서 배양될 수 있거나, 또는 배아 전달 또는 기타의 조작에 앞서 보존 또는 동결될 수 있다. 또한, 수정된 난모세포로부터 생성된 배아는 핵 전달 또는 배아 줄기 세포 생산을 위한 배아 세포의 공급원으로서 사용될 수 있다.

따라서, 또 다른 형태에서 본 발명은 난모세포와 관련된 보조 생식의 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음 단계 중 하나 이상을 포함한다:

(i) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미가 노출되는 난모세포 분비 인자의 농도 및/또는 활성을 조절하는 단계;

예를 들어, 상기 보조 생식 방법은 난모세포의 시험관 내 수정일 수 있다.

따라서, 또 다른 형태에서 본 발명은 난모세포의 시험관 내 수정 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음 단계 중 하나 이상을 포함한다:

본 발명은 또한 난모세포에 관련된 보조 생식에서의 사용을 위한 조성물을 제공한다.

또 다른 형태에서, 본 발명은 또한 난모세포로부터 새성되는 배아에 관련된 보조 생식의 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음 단계 중 하나 이상을 포함한다:

또한, 본 발명은 난모세포로부터 생성된 배아와 관련된 보조 생식에서의 사용을 위한 조성물을 제공한다.

또 다른 형태에서, 본 발명은 난모세포의 발달 능력을 향상시키기 위한 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함한다:

(i) 하나 이상의 추가적인 나화(denuded) 난모세포;

(ii) 하나 이상의 난모세포 분비 인자;

(iii) GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6 또는 이들의 변이체 또는 유사체;

(iv) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 GDF-9 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제;

(v) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제; 및

(vi) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제.

바람직한 형태에서, 상기 조성물은 난모세포를 위한 배양 배지이다.

따라서, 본 발명은 다음 중 하나 이상을 포함하는 난모세포 배양 배지를 또한 제공한다:

(i) 하나 이상의 추가적인 나화 난모세포;

(ii) 하나 이상의 난모세포 분비 인자;

바람직하게는, 상기 조성물 또는 배지는 난모세포의 발달 능력을 향상시키기 위하여 사용된다.

또 다른 형태에서, 본 발명은 난모세포와 관련된 보조 생식의 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음 중 하나 이상을 포함하는 배지에서 상기 난모세포를 배양하는 단계를 포함하는 것이다:

(i) 하나 이상의 추가적인 나화 난모세포;

(ii) 하나 이상의 난모세포 분비 인자;

(iv) 배아에서의 GDF-9 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제;

(v) 배아에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제; 및

(vi) 배아에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제.

상기 배지는 혈청, 알부민, 난포액, 피투인, 난포자극호르몬(FSH) 및 성장 인자, 예컨대 IGFs (예컨대, IGF-1) 및 EGFs (암피레귤린 및 에피레귤린을 포함함) 중의 하나 이상이 실질적으로 없을 수 있다.

따라서, 또 다른 형태에서 본 발명은 난모세포의 발달 능력을 향상시키기 위한 배지를 제공하는데, 상기 배지는 다음 성분 중 하나 이상을 포함한다:

(i) 하나 이상의 추가적인 나화 난모세포;

(ii) 하나 이상의 난모세포 분비 인자;

(vi) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제;

여기서, 상기 조성물은 혈청, 알부민, 난포액, 피투인, 난포자극호르몬(FSH) 및 성장 인자 중의 하나 이상이 실질적으로 없는 것이다.

상기 배지는 그 배지의 조제를 위한 적합한 기타의 첨가물을 포함한다.

바람직하게는, 상기 배지는 NaCl을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 배지는 40 mM∼400 mM NaCl을 포함한다.

바람직하게는, 상기 배지는 KCl을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 조성물 또는 배지는 0.1 mM∼20 mM KCl을 포함한다.

바람직하게는, 상기 배지는 글루코오스를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 조성물 또는 배지는 0.1 mM∼40 mM 글루코오스를 포함한다.

또한, 본 발명은 난모세포에 관한 보조 생식에서의 사용을 위한 조성물을 제공한다.

하나 이상의 나화 난모세포의 유효량, 또는 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 더미 세포가 노출되는 난모세포 분비 인자의 농도는 요구되는 발달의 향상 정도에 따라 선택될 수 있다. 이와 유사하게 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 유효량이 선택될 수 있고, 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제의 유효량도 마찬가지일 것이다.

제제(agent)의 예로는 약물, 소분자, 핵산, 올리고뉴클레오티드, 폴리펩티드, 펩티드, 단백질, 효소, 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 수용체에 대한 리간드, 보조인자, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 작은 간섭 RNAs, 지질, 항체 또는 그의 일부분, 앱타머 또는 바이러스를 포함한다.

바람직한 형태에서, 본 발명은 난모세포의 발달 능력을 향상시키기 위한 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6 또는 이들의 변이체 또는 유사체를 포함한다.

특히 바람직한 형태에서, 상기 조성물은 배지이다.

이와 관련하여, "변이체"라는 용어는 1개 이상의 아미노산이 변화된 아미노산 서열을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 변이체는 치환된 아미노산이 치환전의 아미노산과 유사한 구조 또는 화학적 특성을 가지는 "보존적" 변화를 가질 수 있다 (예컨대, 루신이 이소루신으로 치환). 또한, 변이체는 "비보존적" 변화 (예컨대, 글리신이 트립토판으로 치환) 또는 1개 이상의 아미노산의 결실 및/또는 삽입을 가질 수 있다.

바람직하게는, 상기 변이체는 고유 단백질과 아미노산 수준에 있어서 75%를 넘는 상동성을 가진다. 더욱 바람직하게는, 상기 변이체는 고유 단백질과 90%를 넘는 상동성을 가진다. 가장 바람직하게는, 상기 변이체는 고유 단백질과 95%를 넘는 상동성을 가진다.

"유사체"라는 용어는 기준 분자와 유사한 구조, 조절 또는 생화학적 기능을 가지는 분자를 의미하는 것으로 이해될 것이며, 상기 기준 분자의 생물학적으로 활성인 단편을 포함한다.

바람직하게는, 난모세포가 노출되는 GDF-9의 농도는 1∼1000 ng/ml이다.

바람직하게는, 난모세포가 노출되는 BMP-15의 농도는 1∼1500 ng/ml이다.

바람직하게는, 난모세포가 노출되는 BMP-6의 농도는 1∼200 ng/ml이다.

또한, 상기 방법 및 조성물은 난모세포의 시험관 내 성숙을 위해서 및 난모세포의 질의 향상을 위해서 적합하다.

따라서, 본 발명은 또한 난모세포의 성숙의 조절 방법 및/또는 난모세포의 질의 조절 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음 단계 중 하나 이상을 포함한다:

이와 관련하여, 본 발명은 상기 방법에 의하여 생성되는 성숙 및/또는 질이 변경된 분리된 난모세포 및 상기 난모세포로부터 생성되는 배아 및 비인간 동물을 제공한다.

또 다른 형태에서, 본 발명은 또한 난모세포의 시험관 내 성숙 및/또는 난모세포의 질의 향상을 위한 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함한다:

(i) 하나 이상의 추가적인 나화 난모세포;

(ii) 하나 이상의 난모세포 분비 인자;

바람직하게는, 상기 조성물은 난모세포의 배양을 위한 배지이다.

상기 배지는 혈청, 알부민, 난포액, 피투인, 난포자극호르몬(FSH) 및 성장 인자, 예컨대 IGFs (예컨대, IGF-1) 및 EGFs (암피레귤린 및 에피레귤린을 포함함) 중의 하나 이상이 실질적으로 없을 수 있다. 바람직하게는, 상기 배지는 혈청이 없는 배지이다.

바람직한 형태에서, 상기 배지는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6을 포함한다. 따라서, 본 발명은 난모세포 배양 배지를 제공하는데, 상기 배지는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6을 포함한다.

바람직한 형태에서, 본 발명은 난모세포를 위한 시험관 내 성숙 배지를 또한 제공하는데, 상기 배지는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6를 포함하는 것이다.

이러한 배지는 난모세포의 질의 향상 및 난모세포 발달 능력 향상에 또한 적합하다. 따라서, 본 발명은 난모세포 질의 향상 및/또는 난모세포 발달 능력의 향상을 위한 배지를 제공하는데, 상기 배지는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6를 포함하는 것이다.

적절한 배지의 예로는 10% v/v BMP-15 및/또는 175 ng/ml GDF-9 및/또는 10 ng/ml BMP-6로 보충된 쿡 오스트레일리아(Cook Australia)사의 보빈 비트로 퍼트 배지(Bovine Vitro Fert Medium) 또는 보빈 비트로 블라스트 배지(Bovine Vitro Blast Medium)를 들 수 있다.

또한, 상기 조성물 및/또는 배지는 보조 생식 기술을 위해 사용되는 난모세포의 배양에 특히 적합하다.

따라서, 또 다른 형태에서 본 발명은 난모세포를 포함하는 보조 생식 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음 중 하나 이상을 포함하는 배지에서 상기 난모세포를 배양하는 단계를 포함하는 것이다:

(i) 하나 이상의 나화 난모세포;

(ii) 하나 이상의 난모세포 분비 인자;

따라서, 또 다른 형태에서 본 발명은 난모세포의 시험관 내 수정 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음 중 하나 이상을 포함하는 배지에서 상기 난모세포를 배양하는 단계를 포함하는 것이다:

(i) 하나 이상의 나화 난모세포;

(ii) 하나 이상의 난모세포 분비 인자;

본 발명은 또한 난모세포와 관련된 보조 생식에서의 사용을 위한 조성물을 제공한다.

상기 방법 및 조성물은 또한 난모세포의 수정에 의하여 생성되는 배아의 발달 또는 발달 능력을 조절하는데 적합하다. 이와 관련하여, 상기 난모세포는 수정 전, 수정 중 및 수정 후의 한 시점에서 처리될 수 있다.

따라서, 본 발명은 난모세포로부터 생성되는 배아의 발달 및 발달 능력을 향상시키는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음 단계 중 하나 이상을 포함하는 것이다:

(vi) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계.

이렇게 생성된 배아는 포배기 또는 상실배기까지 더 잘 발달 할 것이고, 배아 전달 후 자궁 속으로 더 잘 이식될 것이다.

GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6; 및/또는 난모세포, 난모세포와 연관된 세포 더미 또는 배아에서의 GDF-9 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제; 및/또는 난모세포, 난모세포와 연관된 세포 더미 또는 배아에서의 GDF-15 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제; 및/또는 난모세포, 난모세포와 연관된 세포 더미 또는 배아에서의 GDF-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제는 또한 배아 및/또는 난모세포를 위한 배양 배지 보충물(supplement)로서 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.

따라서, 또 다른 형태에서 본 발명은 다음의 성분을 포함하는 조합 산물을 제공한다:

- GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6, 또는 이들의 변이체 또는 유사체; 및/또는

- 하나 이상의 난모세포 분비 인자; 및/또는

- 난모세포, 난모세포와 연관된 세포 더미 또는 배아에서의 GDF-9 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제; 및/또는

- 난모세포, 난모세포와 연관된 세포 더미 또는 배아에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제; 및

- 난모세포, 난모세포와 연관된 세포 더미 또는 배아에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제;

여기서, 상기 성분들은 배지에 첨가되기 위한 형태로 제공되는 것이다.

상기 조합 산물은 본 명세서에서 언급된 응용들 중 하나를 위해 사용될 수 있다.

상기 배양 배지와 그 외의 다양한 성분은, 예컨대 앰플, 병 또는 바이알 등의 적절한 용기 (바람직하게는 멸균된 것)에 다중 사용용(multi-use)으로 또는 유닛형(unit forms)으로 분리되어 포장될 수 있다. 상기 용기는 내용물을 채운 후 밀봉될 수 있다. 상기 단백질 성분은 분리된 형태 또는 정제 또는 반정제 형태일 수 있고, 상기 단백질의 안정성 및/또는 용도를 위한 추가적인 첨가물을 함유할 수 있다. 상기 다양한 성분들의 포장 방법은 당해 기술 분야에 알려져 있다.

배아의 발달 및/또는 발달 능력이 조절될 수 있다는 것이 또한 고려된다.

따라서, 본 발명은 또한 배아의 발달 또는 발달 능력을 향상시키는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음 단계 중 하나 이상을 포함하는 것이다:

(i) 배아가 노출되는 난모세포 분비 인자의 농도 및/또는 활성을 조절하는 단계;

(ii) 배아가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절하는 단계;

(iii) 배아에서의 GDF-9 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계;

(iv) 배아에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계; 및

(v) 배아에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계.

상기 방법은 또한 배아의 발달 능력(ability) 및/또는 발달 능력(competence)을 변경시키기 위해 사용될 수 있다.

특히, 이러한 방법은 다음 중 하나 이상을 증가시킴으로써 수정 시점에서부터 포배기 난모세포에 이르기까지의 배아의 발달을 향상시키기 위해 사용될 수 있다: (i) 배아가 노출되는 난모세포 분비 인자의 농도 및/또는 활성; (ii) 배아가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성; 및 (iii) 배아에서의 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성.

따라서, 배아는 포배기 또는 상실기까지 더 잘 발달할 것이고, 배아 전달 후 자궁 속으로 더 잘 이식될 것이다.

하나 이상의 난모세포 분비 인자의 적합한 출처는 하나 이상의 추가적인 나화 난모세포에 상기 배아를 노출시키는 것을 포함한다. 또한, 상기 배아를 하나 이상의 난모세포로부터의 적응용 배지에 노출시킬 수 있다.

바람직하게는, 배아의 발달 및/또는 발달 능력의 조절은 상기 배아가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도를 조절하는 방법에 의한다.

이와 관련하여, 배아의 발달 및/또는 발달 능력은 상기 배아가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도를 증가시킴으로써 향상될 수 있다.

따라서, 바람직한 형태에서 본 발명은 배아의 발달 및/또는 발달 능력을 조절하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 배아가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도를 조절하는 단계를 포함하는 것이다.

상기 하나 이상의 단계의 조절은 난모세포의 수정 후의 시점에 일어날 수 있다는 것이 이해될 것이다.

또한 상기 방법은 시험관 내 또는 생체 내의 배아의 발달 및/또는 발달 능력을 조절하기 위해 사용될 수 있다는 것이 또한 이해될 것이다. 바람직하게는, 상기 배아는 시험관 내 배아이다.

시험관 내의 배아를 생성시키기 위한 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다.

이와 관련하여, 본 발명은 또한 상기 방법에 의하여 생성되는 변경된 발달 도는 발달 능력을 가지는 분리된 배아 및 상기 배아로부터 생성되는 비인간 동물을 제공한다.

시험관 내에서 생성된 발달 또는 발달 능력이 변화된 배아는 적합한 여성 수용 대상체에 전달시키는 것을 포함하는 보조 생식 기술에서 사용될 수 있거나, 배아 전달, 유전적 조작에 사용하기 위하여 생존을 유지면서 시험관 내에서 배양될 수 있거나, 또는 배아 전달 또는 기타의 조작에 앞서 보존 또는 동결될 수 있다. 또한, 수정된 난모세포로부터 생성된 배아는 핵 전달 또는 배아 줄기 세포 생산을 위한 배아 세포의 공급원으로서 사용될 수 있다. 상기 배아로부터 생성된 배아들은 핵 전달 또는 배아 줄기세포 생산을 위한 배아 세포의 공급원으로서 사용될 수 있다.

따라서, 또 다른 형태에서 본 발명은 배아와 관련된 보조 생식의 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음 중 하나 이상을 포함하는 배지에서 상기 배아를 배양하는 단계를 포함하는 것이다:

(i) 하나 이상의 나화 난모세포;

(ii) 하나 이상의 난모세포 분비 인자;

본 발명은 또한 배아와 관련된 보조 생식에서의 사용을 위한 조성물을 제공한다.

한가지 바람직한 형태에서, 본 발명은 배아의 발달 및/또는 발달 능력을 향상시키기 위한 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함하는 것이다:

(i) 하나 이상의 추가적인 나화 난모세포;

(ii) 하나 이상의 난모세포 분비 인자;

바람직한 형태에서, 상기 조성물은 배아를 위한 배양 배지이다.

따라서, 본 발명은 또한 다음 중 하나 이상을 포함하는 배아 배양 배지를 제공한다:

(i) 하나 이상의 추가적인 나화 난모세포;

(ii) 하나 이상의 난모세포 분비 인자;

따라서, 또 다른 형태에서 본 발명은 배아의 발달 능력을 향상시키기 위한 배지를 제공하는데, 상기 배지는 다음 성분 중 하나 이상을 포함하는 것이다:

(i) 하나 이상의 추가적인 나화 난모세포;

(ii) 하나 이상의 난모세포 분비 인자;

(vi) 배아에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제;

상기 배지는 그 배지의 조제를 위한 기타의 적절한 첨가물을 포함한다.

하나 이상의 나화 난모세포의 유효량, 또는 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 더미 세포가 노출되는 난모세포 분비 인자의 농도는 요구되는 발달의 향상 정도에 따라 선택될 수 있다. 이와 유사하게 배아가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 유효량이 선택될 수 있고, 배아에서의 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제의 유효량도 마찬가지일 것이다.

제제의 예로는 약물, 소분자, 핵산, 올리고뉴클레오티드, 폴리펩티드, 펩티드, 단백질, 효소, 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 수용체에 대한 리간드, 보조인자, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 작은 간섭 RNAs, 지질, 항체 또는 그의 일부분, 앱타머 또는 바이러스를 포함한다.

바람직한 형태에서, 본 발명은 배아의 발달 또는 발달 능력을 향상시키기 위한 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6 또는 이들의 변이체 또는 유사체를 포함한다.

특히 바람직한 형태에서, 상기 조성물은 배지이다.

바람직하게는, 배아가 노출되는 GDF-9의 농도는 1∼1000 ng/ml이다.

바람직하게는, 배아가 노출되는 BMP-15의 농도는 1∼1500 ng/ml이다.

바람직하게는, 배아가 노출되는 BMP-6의 농도는 1∼200 ng/ml이다.

상기 방법 및 조성물은 또한 배아가 포배기로 진행할 가능성을 증가시키는데 적합하다.

따라서, 본 발명은 또한 배아가 포배기로 진행할 가능성을 증가시키는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음 단계 중 하나 이상을 포함하는 것이다:

이와 관련하여, 본 발명은 또한 상기 방법에 의하여 생성되는 분리된 배아 및 그 배아로부터 생성되는 비인간 동물을 제공한다.

또 다른 형태에서, 본 발명은 또한 배아가 포배기로 진행할 가능성을 증가시키기 위한 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함한다:

(i) 하나 이상의 추가적인 나화 난모세포;

(ii) 하나 이상의 난모세포 분비 인자;

바람직하게는, 상기 조성물은 상기 배아의 배양을 위한 배지이다.

(i) 하나 이상의 추가적인 나화 난모세포;

(ii) 하나 이상의 난모세포 분비 인자;

한가지 바람직한 형태에서, 상기 배지는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6을 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6을 포함하는 배아 배양 배지를 제공한다.

이러한 배지는 또한 배아의 발달 및/또는 발달 능력을 향상시키는데 적합하다. 따라서, 본 발명은 또한 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6을 포함하는 배아의 발달 및/또는 발달 능력을 향상시키기 위한 배지를 제공한다.

바람직하게는, 상기 배지는 혈청이 없는 배지이다.

적절한 배지의 예로는 10% BMP-15 및/또는 175 ng/ml GDF-9 및/또는 10 ng/ml BMP-6으로 보충된 쿡 오스트레일리아(Cook Australia)사의 보빈 비트로 퍼트 배지(Bovine Vitro Fert Medium) 또는 보빈 비트로 블라스트 배지(Bovine Vitro Blast Medium)를 들 수 있다.

GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 활성, 및/또는 배아에서의 그들의 신호전달 경로의 활성의 조절은 당해 기술 분야에 알려진 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 세포에서 이들 경로의 활성을 측정하기 위한 다양한 방법이 당해 기술분야에 알려져 있다.

배아가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성의 조절은 많은 서로 다른 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 이들 단백질의 하나 또는 모두의 농도를 증가시키는 경우, 상기 배아를 상기 단백질에 노출시키거나 또는 접촉시킬 수 있다.

이와 관련하여, BMP-15에 관련된 것은 적합한 종(species)으로부터의 단백질 (난모세포 또는 배아의 종과 동일한 종으로부터의 단백질을 포함함), 상기 단백질의 변이체 (예컨대, 야생형으로부터 1 이상의 아미노산 치환을 가지는 단백질 형태) 또는 상기 단백질의 생물학적으로 활성인 단편을 포함한다는 것이 이해될 것이다. 상기 단백질은 분리된 단백질, 재조합 단백질, 정제 또는 반정제된 것, 또는 단백질의 복합 혼합물의 일부 (예컨대, 난모세포로부터 적응용 배지로 나오는 것)일 수 있다.

이와 유사하게, GDF-9에 관련된 것은 적합한 종(species)으로부터의 단백질 (난모세포 또는 배아의 종과 동일한 종으로부터의 단백질을 포함함), 상기 단백질의 변이체 (예컨대, 야생형으로부터 1 이상의 아미노산 치환을 가지는 단백질 형태) 또는 상기 단백질의 생물학적으로 활성인 단편을 포함한다는 것이 이해될 것이다. 상기 단백질은 분리된 단백질, 재조합 단백질, 정제 또는 반정제된 것, 또는 단백질의 복합 혼합물의 일부 (예컨대, 난모세포로부터 적응용 배지로 나오는 것)일 수 있다.

이와 유사하게, BMP-6에 관련된 것은 적합한 종(species)으로부터의 단백질 (난모세포 또는 배아의 종과 동일한 종으로부터의 단백질을 포함함), 상기 단백질의 변이체 (예컨대, 야생형으로부터 1 이상의 아미노산 치환을 가지는 단백질 형태) 또는 상기 단백질의 생물학적으로 활성인 단편을 포함한다는 것이 이해될 것이다. 상기 단백질은 분리된 단백질, 재조합 단백질, 정제 또는 반정제된 것, 또는 단백질의 복합 혼합물의 일부 (예컨대, 난모세포로부터 적응용 배지로 나오는 것)일 수 있다.

전술한 바와 같이, 상기 단백질은 정제 또는 반정제 단백질로서 전달될 수 있다. 상기 단백질을 생산하는 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다. 또한, 상기 단백질은 하나 이상의 기타 성분을 함유하는 추출물의 형태로 전달될 수 있다.

난모세포 또는 배아가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 난모세포 및/또는 배아에서의 이들에 의존하는 신호전달 경로의 활성을 측정함으로써 난모세포 또는 배아의 발달 능력을 평가하는 것이 또한 가능하다.

(i) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 측정하는 단계; 및/또는

(ii) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 GDF-9 의존 신호전달 경로의 활성을 측정하는 단계; 및/또는

(iii) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 측정하는 단계; 및/또는

(iv) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 측정하는 단계; 및

(v) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성, 및/또는 상기 난모세포 또는 세포 더미에서의 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성에 의하여 난모세포의 발달 능력을 평가하는 단계;

여기서, 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성의 증가, 및/또는 상기 난모세포 및/또는 세포 더미에서의 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6 의존 신혼전달 경로의 활성의 증가는 발달 능력이 증가된 난모세포를 나타내고, 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성의 감소, 및/또는 상기 난모세포 및/또는 세포 더미에서의 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6 의존 신혼전달 경로의 활성의 감소는 발달 능력이 감소된 난모세포를 나타낸다.

이러한 경우, 향상된 발달 능력은 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 더 높은 농도 및/또는 활성, 및/또는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6 신혼전달의 더 높은 활성과 관련될 것이다.

GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 또는 활성을 측정하는 방법과, 적절한 신호전달 경로의 활성을 측정하는 방법은 당해 기술 분야에 알려져 있다.

예를 들어, 인간의 IVF 동안, 사용되는 난모세포는 일반적으로 나화되고, 그 난모세포의 발달 능력은 수정 전에 난모세포를 함유하는 배지에서의 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다. GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 수준을 측정하기 위한 적합한 방법은 ELISA에 의한 것이다.

(i) 난모세포에서 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 발현 수준을 측정하는 단계 및/또는 난모세포에 의하여 분비되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도를 측정하는 단계; 및

(ii) 상기 난모세포의 발달 능력을 평가하는 단계;

상기 방법에 있어서, GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 발현 및/또는 농도의 증가는 발달 능력이 증가된 난모세포를 나타내고, GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 발현 및/또는 농도의 감소는 발달 능력이 감소된 난모세포를 나타낸다.

본 발명은 또한 난모세포 더미 복합체의 확장(expansion)을 조절하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음 단계 중 하나 이상을 포함하는 것이다:

(i) 난모세포 더미 복합체가 노출되는 TGF-β1, GDF-9, BMP-15 및 액티빈 중 하나 이상의 농도 및/또는 활성을 조절하는 단계; 및

(ii) 난모세포 더미 복합체에서의 ALK4, ALK5 및 ALK7 수용체 중 하나 이상에 의하여 매개되는 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계.

난모세포 더미 복합체에서의 ALK4, ALK5 및 ALK7 수용체 중 하나 이상에 의하여 매개되는 신호전달 경로의 활성의 조절은, 예컨대 난모세포 더미 복합체에서의 세포내 신호전달 분자 Smad2 및 Smad3 중 어느 하나 또는 양쪽 모두의 수준 및/또는 활성을 조절함으로써 이루어질 수 있다.

난모세포 더미 복합체의 확장의 조절은 시험관 내 또는 생체 내에서 일어날 수 있다.

바람직한 형태에서, 상기 더미 확장의 조절은 상기 난모세포 더미 복합체를 (i) 난모세포 더미 복합체가 노출되는 TGF-β1, GDF-9, BMP-15 및 액티빈 중 하나 이상의 농도 및/또는 활성; 및 (ii) 상기 ALK4, ALK5 및 ALK7 수용체 중 하나 이상에 의하여 매개되는 신호전달 경로의 활성 중 어느 하나 또는 양쪽 모두를 조절하는 능력을 가지는 제제에 노출시킴으로써 달성된다.

본 발명은 또한 그러한 제제를 포함하는 난모세포 더미 복합체의 확장을 조절하기 위한 조성물을 제공한다.

생체 내의 난모세포 더미 복합체의 경우, 상기 방법은 또한 여성 대상체에서 배란을 조절하는데 적합하다. 예를 들어, 상기 여성 대상체는 인간 여성, 영장류, 가축 (예컨대, 말, 소, 양, 돼지, 염소), 반려 동물 (예컨대, 개, 고양이) 또는 실험실용 시험 동물 (예컨대, 생쥐, 쥐, 기니피그)을 포함하는 포유류 암컷일 수 있다.

따라서, 본 발명은 다음 중 하나 이상을 여성 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 여성 대상체에서의 배란을 조절하는 방법을 제공한다:

(i) 여성 대상체의 난모세포 더미 복합체가 노출되는 TGF-β1, GDF-9, BMP-15 및 액티빈 중 하나 이상의 농도 및/또는 활성을 조절하는 제제; 및

(ii) 여성 대상체의 난모세포 더미 복합체에서의 ALK4, ALK5 및 ALK7 수용체 중 하나 이상에 의하여 매개되는 신호전달 경로의 활성을 조절하는 제제.

본 발명은 또한 여성 대상체에서 배란을 조절하기 위한 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 (i) 난모세포 더미 복합체가 노출되는 TGF-β1, GDF-9, BMP-15 및 액티빈 중 하나 이상의 농도 및/또는 활성; 및 (ii) 여성 대상체의 난모세포 더미 복합체에서의 ALK4, ALK5 및 ALK7 수용체 중 하나 이상에 의하여 매개되는 신호전달 경로의 활성 중 어느 하나 또는 양쪽 모두를 조절하는 능력을 가지는 제제를 포함하는 것이다.

상기 방법은 또한 여성 대상체에서의 수정능력을 조절하는데 적합하다.

따라서, 본 발명은 또한 다음 중 하나 이상을 여성 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 여성 대상체의 수정능력을 조절하는 방법을 제공한다:

본 발명은 또한 여성 대상체에서 수정능력을 조절하기 위한 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 (i) 난모세포 더미 복합체가 노출되는 TGF-β1, GDF-9, BMP-15 및 액티빈 중 하나 이상의 농도 및/또는 활성; 및 (ii) 여성 대상체의 난모세포 더미 복합체에서의 ALK4, ALK5 및 ALK7 수용체 중 하나 이상에 의하여 매개되는 신호전달 경로의 활성 중 어느 하나 또는 양쪽 모두를 조절하는 능력을 가지는 제제를 포함하는 것이다.

예를 들어, 상기 방법은 (i) 난모세포 더미 복합체가 노출되는 TGF-β1, GDF-9, BMP-15 및 액티빈 중 하나 이상의 농도 및/또는 활성; 및 (ii) 여성 대상체의 난모세포 더미 복합체에서의 ALK4, ALK5 및 ALK7 수용체 중 하나 이상에 의하여 매개되는 신호전달 경로의 활성 중 어느 하나 또는 양쪽 모두를 억제하는 능력을 가지는 제제를 사용함으로써 여성 대상체의 수정능력을 감소시키는데 적합하다.

본 발명은 또한 그러함 제제를 포함하는 피임용 조성물을 제공한다.

도 1은 TUNEL (녹색 표지)법으로 검출된 더미 세포에서의 DNA 단편화의 동일초점 레이저 주사 현미경에 의한 대표적인 이미지이다. 모든 세포 핵은 또한 요오드화 프로피디움(propidium iodide)으로 염색된다 (적색). 양성 대조군인 DNAase 1 처리 OOX는 매우 강한 세포자멸사 염색 (99%)을 보여주고 (A), 음성 대조군은 특이적 표지화로 표시되는 어떠한 세포자멸사 신호도 나타내지 않고 (0%) (B), COC는 낮은 세포자멸사 표지화를 나타내고 (9%) (C), 그와 비교해 OOX는 더 높은 세포자멸사 표지화를 나타내었다 (35%) (D).

도 2는 FSH의 존재 (A) 또는 부존재 (B)의 경우 더미 세포 세포자멸사(cumulus cell apoptosis)에 대한 난모세포 분비 인자의 용량 반응을 보여준다. 난모세포절제 복합체 (OOX)를 증가하는 수의 나화 난모세포 (DO)와 함께 배양하였고, 그 최대 용량은 대조군 COC 수준으로 세포자멸사를 감소시키는데 효과를 가지는 것이었다. 점은 세포자멸사한 세포 더미의 평균 백분율을 나타낸다 (평균 ± SEM). 상이한 표지^{a, b, c}를 가진 점들로부터의 값은 유의적으로 상이하다 (p<0.001).

도 3은 OSF 기원에 근접성과 관련하여 더미 복합체 내에서의 세포자멸사의 패턴을 보여준다. COC 및 OOX의 직경을 동일초점 현미경을 사용하여 측정하고, 각각 반경의 33%를 나타내는 내부층, 중간층, 외부층의 3개의 층으로 나누었다 (A). 세포자멸사의 발생은 난모세포에 가장 가까울 때 가장 낮았고 ([C], COC 내부층; [D]와 대조적으로, OOX 외부층), 난모세포로부터의 거리가 증가할수록 증가하였다 (B). ^*X 레이저 처리 (2-way ANOVA; P=0.026).

도 4는 세포 더미 세포자멸사에 대한 잠정적인 난모세포 분비 인자 (GDF-9, BMP-6, BMP-15)의 용량 반응을 보여준다. OOX를 FSH가 부존재 (A, C, E)하거나 또는 존재 (B, D, F)하는 경우 증가하는 농도의 GDF-9 (0∼175 ng/ml), BMP-6 (0∼100 ng/ml) 및 BMP-15 (0∼20% v/v)와 함께 배양하였다. 세포 더미 세포자멸사는 GDF-9에 의해 영향을 받지 않았고, BMP-6에 의하여 용량 의존 방식으로 약해졌으며 BMP-15에 의한 경우 이는 더 명백하였다. 점은 세포 더미 세포자멸사의 평균 백분율을 나타낸다 (평균 ± SEM). 상이한 표지^{a, b, c}를 가진 점들로부터의 값은 유의적으로 상이하다 (A-B; p<0.001). 별표는 그 인자 (C-F)에 대한 대조군 (OOX)과 비교한 유의적 차이 (P<0.001)을 나타낸다.

도 5는 웨스턴 블롯 분석법에 의하여 조사된 Bcl-2 및 Bax 단백질의 OOX 발현에 대한 DO, GDF-9 및 BMP-15의 효과를 보여준다. 다음의 처리를 한 후 35 OOX의 그룹을 각각의 레인에 실었다: 레인 1, 10% v/v 293H (대조군 적응용 배지); 레인 2, 대조군 (OOX 단독); 레인 3, 132 ng/ml GDF-9; 레인 4, 10% v/v BMP-15; 레인 5, 0.7 DO/μl. 농도계측기(densitometry)로 밴드 강도를 정량하고, 3번의 반복 실험으로부터 293H 대조군과 관련하여 발현시켰다 (평균 ± SEM). 그룹 내의 상이하게 위에 쓴 바(bar) (^a- ^bBcl-2, ^y- ^zBax)는 유의적 차이를 나타낸다 (P<0.001).

도 6은 DO, BMP-6 및 BMP-15에 의한 스타우로스포린 유도 세포자멸사로부터의 세포 더미의 보호를 보여준다. OOX 단독 또는 35 DO, 10 ng/ml BMP-6 또는 10% v/v BMP-15와의 공동 배양물을 배양의 마지막 6시간에 0.1 μM 또는 1.0 μM 스타우로스포린 (STS) 중 하나에 노출시켰다. 난모세포, BMP-6 및 BMP-15는 모두 스타우로스포린 유도 세포 더미 세포자멸사를 방지하였다. 별표는 OOX 대조군과 비교한 OOX 평균 유의적 차이 (p<0.001)를 나타낸다.

도 7은 세포 더미 세포자멸사에 대한 BMP 길항제의 효과를 보여준다. OOX를 증가하는 용량의 폴리스타틴 (0∼100 μg/ml)의 존재하에서 10% v/v BMP-15와 함께 배양하였고 (A), OOX를 20 μg/ml의 BMP-6 중화 항체 (NAb)의 높은 중화 용량의 존재 또는 부존재하에서, 10 ng/ml BMP-6와 함께 배양하였다 (B). BMP-15에 의한 세포 더미 세포자멸사의 억제는 폴리스타틴에 의하여 상쇄되었다. NAb는 BMP-6의 항세포자멸사 효과를 효과적으로 상쇄하였다. 점 및 선은 세포 더미 세포자멸사의 평균 백분율을 나타낸다 (평균 ± SEM). 상이한 표지^{a, b, c}를 가진 점들로부터의 값은 유의적으로 상이하다 (p<0.001).

도 8은 세포 더미 상의 난모세포의 항세포자멸사 반응에 있어서 BMP-15 및 BMP-6의 역할을 보여준다. 나화 난모세포 (25 DOs)와 공동 배양된 OOX를 50 μg/ml 폴리스타틴, 20 μg/ml BMP-6 NAb 또는 이들의 조합으로 처리하였다 (A). 폴리스타틴과 BMP-6 NAb 양쪽 모두는 난모세포의 항세포자멸사 효과를 부분적으로 상쇄시키는데 효과가 있지만, 단독 또는 조합 어느 것이든 OOX 수준에까지 세포자멸사가 완 전하게 회복되지는 않았다. OOX를 DO와 공동배양 또는 BMP-15 단독 처리 또는 BMP-6 단독 처리는 세포 더미 세포자멸사를 감소시켰다 (B). OOX의 BMP-6 및 BMP-15로의 조합 처리는 BMP-15 단독의 효과를 넘도록 세포자멸사 수준을 추가적으로 감소시키지 않았고, 이들 두 가지 BMP의 추가적인 효과가 없다는 것을 나타낸다. 선은 세포 더미 세포자멸사의 평균 백분율을 나타낸다 (평균 ± SEM). 상이한 표지^{a, b, c}를 가진 점들로부터의 값은 유의적으로 상이하다 (p<0.001).

도 9는 세포 더미 세포자멸사에 대한 BMP-7 및 그의 길항제 그렘린(gremlin)의 효과를 보여준다. OOX를 그렘린 (0∼40 μg/ml)의 증가된 투여량의 존재하에서 10% BMP-15와 함께 배양시켰다 (A). 또한, OOX를 2 μg/ml 그렘린의 존재 또는 부존재하에서 100 ng/ml BMP-7 및/또는 10 % BMP-15와 공동 배양하였다 (B). 그렘린은 BMP-15의 억제 효과를 상쇄시키지 않았지만, 반면 BMP-7의 경우에는 상쇄시켰다. 선 및 점은 세포 더미 세포자멸사의 평균 백분율을 나타낸다 (평균 ± SEM). 상이한 표지^{a, b, c}를 가진 선들로부터의 값은 유의적으로 상이하다 (p<0.001).

도 10은 IVM 동안 나화 난모세포의 존재 또는 부재하에서 난모세포 더미 복합체의 공동배양 결과를 보여준다. 복합체 및 난모세포를 IVM 후에 6개의 처리 그룹으로 나누었다. 나화 난모세포 (A), 난모세포 더미 복합체 (B), 0 시간에서 나화 난모세포와 함께 난모세포 더미 복합체의 공동배양 (C), 0 시간에서 난모세포 더미 복합체와 함께 나화 난모세포의 공동배양 (D), 난모세포 더미 복합체 9시간 후 IVM의 마지막 15시간 동안 나화 난모세포와 공동배앙 (E), 난모세포 더미 복합체 9시 간 후 벗김(denuding) 그 후 IVM의 마지막 15시간 동안 난모세포 더미 복합체와 공동배앙 (F).

도 11은 IVM 동안 나화 난모세포와 함께 또는 나화 난모세포가 없는 무손상 난모세포 더미 복합체의 이후의 난모세포 발달의 분열율(cleavage rate)에 대한 효과를 보여준다. 난모세포 더미 복합체를 IVM 동안 4개의 처리 그룹에 무작위적으로 할당하였다. IVM 후, 모든 복합체 및 난모세포를 수정시키고, 2일째에 그 분열율을 평가하였다. 선은 분열율의 평균 백분율을 나타낸다 (평균 ± SEM). 상이한 표지^{a, b, c}를 가진 선들로부터의 값은 유의적으로 상이하다 (p<0.001).

도 12는 이후의 배아 발달 능력에 대한 IVM 동안 DO와 함께 무손상 COC의 공동배양의 효과를 보여준다. 난모세포 더미 복합체를 시험관 내 성숙(IVM) 동안 4개의 처리 그룹에 무작위적으로 할당하였다. IVM 후, 모든 복합체 및 난모세포를 수정시키고, 8일째에 포배(blastocyst) 형성의 질을 평가하였다. 선은 분열율의 평균 백분율을 나타낸다 (평균 ± SEM). 상이한 표지^a∼e를 가진 선들로부터의 값은 유의적으로 상이하다 (p<0.001).

도 13은 GDF-9 및 난모세포 유도 더미 확장에 대한 ALK4/5/7 억제제의 효과를 보여준다.

도 14는 GDF-9, TGF-β1 또는 난모세포 유도 DNA 합성에 대한 ALK4/5/7 억제제의 효과 (패널 A)와, GDF-9 및 난모세포 유도 DNA 합성에 대한 다양한 농도의 상기 억제제의 효과 (패널 B)를 보여준다.

도 15는 TGF-β1 자극 CAGA 루시퍼라제 활성에 대한 다양한 농도의 ALK4/5/7 억제제의 효과를 보여준다.

도 16은 상이한 크기의 난포로부터의 난모세포에 의한 GDF9 mRNA의 발현을 보여준다. 난포를 손으로 절개하여 3가지 크기의 군으로 분리하였다: 페리안트랄(periantral), 작은 안트랄(small antral) 및 큰 안트랄(large antral). 난모세포 RNA를 Qiagen Micro Rneasy 키트를 사용하여 추출하였다. RNA을 무작위 6합체를 사용하여 역전사 시킨 후, PCR로 증폭시켰다. -ve RT: 역전사효소 없음; -ve PCR: DNA 중합효소 없음; 및 +ve: 양성 조직 샘플 (난소).

도 17은 상이한 크기의 난포로부터 과립층 세포 (GC)에 의한 수용체/신호전달 mRNA의 발현을 보여준다. 각각의 난포로부터 1 x 10⁵ GCs를 수집하고, 전체 RNA를 추출하였다. GC RNA를 무작위 6합체를 사용하여 역전사 시키고 PCR로 증폭시켰다. -ve RT: 역전사효소 없음; -ve PCR: DNA 중합효소 없음; 및 +ve: 양성 조직 샘플 (난소).

도 18은 GDF9 및 난모세포에 의한 TGF-β 신호전달 경로의 활성화를 보여준다. 큰 난포로부터의 MGC를 Smad 3-반응 CAGA-루시퍼라제 리포터 구조물 (A) 또는 Smad 1-반응 BRE-루시퍼라제 리포터 구조물 (B) 중의 하나로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 이어서, 그 세포를 무처리로 두거나, 0.5 ng/ml TGFβ1,88∼265 ng/ml GDF9, 50 ng/ml BMP7로 처리하거나, 또는 60 개의 마우스 난모세포와 공동배양하였다. 세포를 48 시간 동안 배양한 후, 세포 추출물로부터 루시퍼라제 활성을 측정하 였다. 선은 3번의 반복 실험으로부터의 평균 +/- SEM을 대조군과 비교한 배수 변화(fold change)로서 나타낸다.

도 19는 ALK4/5/7 키나아제 억제제인 SB431542를 사용한 GDF9 자극 벽(mural) 과립층 세포 DNA 합성의 억제를 보여준다. 큰 안트랄 난포로부터의 벽 GC를 24시간 동안 배양하고, 175 ng/ml GDF9로 티미딘 혼입을 자극시켰다. ALK4/5/7 키나아제 억제제인 SB-431542의 투여는 GDF9에 의하여 자극된 티미딘 혼입을 의존적으로 억제하였다. 선/점은 3번의 반복 실험으로부터의 평균 +/- SEM을 대조군과 비교한 배수 변화(fold change)로서 나타낸다.

도 20은 벽 과립층 세포 DNA 합성에 대한 GDF9 및 난포 크기의 효과를 보여준다. 페리 안트랄, 작은 안트랄 및 큰 안트랄 난포로부터의 벽 GC를 175 ng/ml GDF9의 존재하에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 기간의 마지막에, 3H-티미딘 혼입을 평가하였다. 선은 8번의 반복 실험으로부터의 평균 cpm/12,500 세포 +/- SEM을 나타낸다.

도 21은 벽 과립층 세포 DNA 합성에 대한 GDF9 및 난포 크기의 효과를 보여준다. 작은 안트랄 및 큰 안트랄 난포로부터의 벽 GC를 증가하는 GDF9 (0∼350ng/ml)의 투여량으로 24시간 동안 처리하였다. 배양 기간의 마지막에, 3H-티미딘 혼입을 평가하였다. 점은 7번의 반복 실험으로부터의 평균 cpm/12,500 세포 +/- SEM을 나타낸다.

도 22는 벽 과립층 세포 DNA 합성에 대한 FSH 및/또는 IGF-1과 조합으로의 GDF9의 효과를 보여준다. 작은 (A) 또는 큰 (B) 안트랄 난포로부터의 벽 GC를 GDF9 (175 ng/ml), rhFSH (50 mIU/ml) 및 IGF-1 (25 ng/ml)의 조합물과 함께 24시간 동안 배양하였다. 선은 7번의 반복 실험으로부터의 평균 cpm/12,500 세포 +/- SEM을 나타낸다.

도 23은 벽 과립층 세포 DNA 합성에 대한 GDF9 +/- BMP15의 효과를 보여준다. 작은 (A) 또는 큰 (B) 안트랄 난포로부터의 벽 GC를 GDF9 (175 ng/ml)와 BMP15 (10%) 중의 하나를 단독으로 또는 그 둘의 조합과 함께 배양하였다. 선은 3번의 반복 실험으로부터의 평균 +/- SE를 나타낸다.

도 24는 IVM 동안 COC를 난모세포 분비 인자 (OSF)에 대해 노출시키는 것에 대한 실험적 디자인의 도식적 설명을 보여준다. IVM의 기간 동안 COC를 단독으로 또는 0.5 DO/μl의 농도의 나화 난모세포와 공동으로 (COC + DOs) 배양하였다. 이어서 난모세포를 수정시키고, 배아 발달을 배아 발달 능력을 평가하는데 사용하였다.

도 25는 이후의 분열 (A) 및 발달 능력 (B)에 대한 IVM 동안 GDF9 길항제인 SB-431542의 존재 또는 부재하에서 GDF9로 무손상 COC의 처리의 효과를 보여준다. IVM에 이어서, 모든 복합체를 수정시키고, 2일째에 그 분열율을 조사하고, 8일째에 포배 형성을 조사하였다. 293H는 트랜스펙션되지 않은 293H 세포로부터의 조절-적응용 배지이다. 선은 백분율 (평균 ± SEM)을 나타내고, 상이한 표지 a∼d를 가진 그래프 내의 선 또는 그룹화된 선은 유의적으로 상이하다 (p<0.05). 분열율은 SB-431542에 의하여 영향을 받지 않았으나, 293H에 의하여 영향을 받았다.

도 26은 이후의 분열 (A) 및 발달 능력 (B)에 대한 IVM 동안 폴리스타틴의 존재 또는 부재하에서 BMP15로 무손상 COC의 처리의 효과를 보여준다. IVM 후, 모든 복합체를 수정시키고, 2일째에 그 분열율을 조사하고, 8일째에 포배 형성을 조사하였다. 293H는 트랜스펙션되지 않은 293H 세포로부터의 조절-적응용 배지이다. 선은 백분율 (평균 ± SEM)을 나타내고, 상이한 표지 a∼d를 가진 그래프 내의 선 또는 그룹화된 선은 유의적으로 상이하다 (p<0.05). 분열율은 폴리스타틴에 의하여 및 293H에 의하여 역으로 영향을 받았다.

도 27은 이러한 연구로부터 유래된 가설적인 모델의 도식적인 설명을 보여준다. 난모세포 성숙기간 동안 난모세포 분비 인자(OSFs)에 대한 COC의 노출은, 그 분비 인자들의 고유 형태가 난모세포에 의해 분비되는 성장 인자의 특정되지 않는 혼합물로서 분비되거나 또는 외인성 재조합 BMP15 또는 GDF9이건 간에, 이후의 난모세포 발달 능력을 실질적으로 향상시킨다 (~40% 내지 ~60%). OSF는 많은 세포 더미 기능을 조절하는 것으로 알려져 있고, 이러한 모델은 이들이 이후의 발달을 향상시키는 난모세포로 돌아 들어가는(pass back) (굵은 화살표) 양성 조절 인자를 포함할 수 있다는 것을 제안한다.

바람직한 실시상태의 설명

이하에서는 전술한 본 발명의 일반적인 원리를 구체화하는 실험에 대한 내용을 설명할 것이다. 그러나, 이하의 설명이 전술한 일반성을 한정하는 것은 아니라는 것이 이해될 것이다.

연구 I 난모세포 분비 인자는 더미 세포 세포자멸사를 예방한다

실시예 1

소 난모세포의 수집과 배양 조건 ( COC 의 수집과 제조)

특별히 명시하지 않은 경우, 모든 화학물질과 시약은 시그마사(sigma; St Lois, MO)에서 구입하였다.

소 난소는 지역 도축장에서 수집하였고 따뜻한 생리식염수 (30∼35℃)에 담아 실험실로 이송하였다. 난모세포 더미 복합체 (COC)는 안트랄 난포 (직경 2∼8 mm)로부터 흡입하였고, 이는 18 게이지 바늘과 카나마이신 (Sigma-Aldrish, St.Louis, MO) 50 μg/ml와 지방산이 없는 소 혈청 알부민 (FAF-BSA) (ICPbio Ltd, Auckland, NZ) 4 mg/ml 가 첨가된 흡입 배지 (Hepes-buffered Tissue Cultured Medium-199: TCM-199,ICN Biochemicals, Irvine, CA, USA) ∼2ml가 포함된 10-ml 주사기를 사용하였다. 5개의 세포층과 균일하게 색소 침착된 세포질보다 큰 치밀한 더미 덮개를 가진 완전한 COC를 해부현미경 하에서 수집하고, 헤페스 완충 TCM-199 (Hepes-buffered TCM-199)에서 두 번, 상응하는 배양 배지에서 한번 세척하였다. 복합체를 50 μg 드롭(drops)으로 전처리된 광유가 도포된 배양 배지 (0.23 mmol 소듐 피루베이티드 1^-1, 0.3 mg/ml 폴리비닐 알콜 (PVA;sigma, St Louis, MO)로 보충된 바이카보네이티드-완충 TCM-199에서 0.1 IU/ml FSH (Organon, Netherlands)의 존재 또는 부존재하에 5% 이산화탄소가 포함된 습윤화 공기에서 24시간 동안 39℃ 로 배양하였다.

실시예 2

더미 세포의 처리

(i) 난모세포절제 복합체의 생성

각 난모세포의 세포질은 문헌 [Buccione et al. (1990) Dev Biol 138, 16-25]에 기술된 바와 같이 현미조작장치(micromanipulator)를 사용하여 COC로부터 현미외과적으로 절제하였다(oocytectomy). 형성된 난모세포절제 복합체 (OOX)는 완전한 CC의 각 층에 의해서 둘러싸인 텅 빈 투명대(hollow zona pellucida)로 구성된다.

(ii) 나화(denuded) 난모세포의 생성

나화 난모세포(DO)를 2 ml H-TCM-199/BSA에서 약 4분 동안 볼텍싱(vortexing) 처리하여 COC로부터 CC를 제거함으로써 생성하였다. 잔여 CC를 H-TCM-199/BSA 내에서 난모세포를 불로 미세한 구멍이 뚫리게 제작한(fine-bore fire-polished) 유리 피펫을 여러 번 통과시킴으로써 제거하였다.

(iii) 성장 인자와 결합 단백질

재조합 마우스 GDF-9과 재조합 양 BMP-15는 트랜스펙션된 293 인간 배아 신장 세포주(293H)를 사용하여 이전에 보고된 방법대로 (Kaivo-Oja et al (2003) J Clin Endocrinol Metab 88, 755-62; McNatty et al (2005) Reproduction 129:473-480) 인하우스(in-house)에서 생성되었다. 재조합 단백질을 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)을 사용하여 부분적으로 정제하였고, 그 농도를 웨스턴 블롯법 (Kaivo-Oja et al (2003) J Clin Endocrinol Metab 88: 755-62)에 의하여 평가하였다. 대조 적응용 배지(293H)는 트랜스펙션되지 않은 293H 세포로부터 또한 생성되고 HIC에 의해 정제되었다. 재조합 인간 BMP-6, 재조합 인간 BMP-7, BMP-6 중성화 항체, 그리고 그렘린(gremlin)은 R&D 시스템(Minnaepolis, MN)에서 획득하였다.

실시예 3

TUNEL 에 의한 DNA 손상의 측정 ( TUNEL 에 의한 더미 세포에서 세포자멸사의 평가)

CC 세포자멸 DNA는 제조사의 사용설명서에 따라서 TUNEL (Roche Diagnostic, Penzberg, Germany)을 사용하여 측정하였다. 요약하면, COC 와 OOX 복합체 배양후에는 1% BSA를 포함한 PBS (pH 7.4)에 두번 세척하였고, 4℃에서 밤새 4% 파라포름알데하이드에 고정하였고, Cell-Tak-코팅된 (Cell-Tak-coated) 커버슬립 (Beckton Dickinson Biosciences, Franklin Lakes, NJ)에 놓기 전에 PBS/BSA에 두번 세척하였다. 그런 다음 복합체는 1시간 동안 실온에서 0.1% 시트르산나트륨이 함유된 0.1% Triton X-100에서 투과되었고(permeabilized) PBS/BSA에서 3번 세척하였다. 복합체는 형광물질(fluorescein)-복합의 dUTP와 말단 데옥시뉴클레오티드 전이효소 (deoxynucleotide transferase) (TUNEL reagents, Roche)에서 1시간 동안 37℃의 암실 내 배양되었다. 양성 대조군은 DNAse 1 (0.005 U/l)에 실온에서 20분 동안 배양되었고, 이는 모든 DNA를 분열시키고, TUNEL 이전에 PBS/BSA에서 2번 세척되었다. 음성 대조군은 TdT 없이 형광-dUTP에서 배양되었다. TUNEL 이후, 복합체는 PBS/BSA에 2번 세척하였고, 모든 핵을 표지화하기 위하여 요오드화 프로피디움 0.5 mg/ml (PI)에 RNase A (0.1 mg/ml)를 더하여 실온의 암실에서 1시간 동안 대비염색하였다. 복합체는 PBS/BSA에 두 번 세척하였고, 벡타쉴드(VectaShield) 표백 방지 용액 (Vector Labs, Burlingame, CA)이 있는 가벼운 커버슬립 압착에 고정하여 공초점 분석을 위하여 4℃의 암실에 보관하였다.

실시예 4

공초점 현미경과 그 분석

COC와 OOX에서 세포자멸사는 공초점 현미경을 사용하여 시각화하고 정량화하였다. CC로부터의 이중 형광 방출은 니콘 C1 공초첨 스캐닝 해드(Nikon C1 Confocal Scanning Head) 와 니콘 TE2000E 현미경 (Nikon, Tokyo, Japan)을 사용하여 측정하였다. 세포자멸 신호 (형광물질, 레이저 여기 488nm, 방출 510∼530nm)와 핵 신호 (요드화 프로피디움, 여기 레이져 532, 방출 590∼640nm)의 동시 방출을 포착하였다.

모든 복합체를 위한 모든 세포자멸사 발생의 정확한 표지를 생성하기 위하여, 각 복합체의 깊이는 25%, 50%, 75%의 3개의 백분위수 내로 구성체를 나누기 위한 Z 시리즈 (광학 Z 평면 섹션)를 통과하여 측정하였다. 이러한 광학 구역 영상은 색 채널 (녹색의 더미 세포자멸 형광과; 적색의 핵 더미 형광)과 독립적으로 획득하고 저장되었다. 그 후 기록된 영상은 Scanalytics IPLab software Version 3.6. (Scanalytics, Fairfax, VA)으로 처리되었다. CC 개수의 정량화 (각각의 색 채널을 위한)는 각 광학 섹션 백분위수(각 복합체는 3개의 광학 "z"-평면 섹션)를 자동 분획 필터를 이용한 거시 스크립트(macro script)를 이용하여 독립적으로 측정되었 다. 각 슬라이스는 세포자멸 핵의 비율을 생성하였고 3 백분위수 수치는 전체 복합체에 대한 총 세포자멸 핵의 비율을 표지화하기 위하여 평균화되었다. 이러한 과정은 각 개개의 복합체에 대해 독립적으로 되풀이되었다.

실시예 5

웨스턴 블롯 분석법

배양물의 처리에 이어서, OOX 복합체를 25 ml RIPA 용해 완충액(10 mM Tris [pH 7.4], 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Trinton X-100) 과 -80℃에서 보관, 고감도의 Enhanced Chemiluminescence (ECL) Advance system (Amersham Biosciences, Ontario, Canada)을 사용하여 세포자멸 단백질의 측정을 위하여 용해한다. 녹은 용해물들은 100 mM 디티오트레톨(DTT) 포함한 4X 로딩 버퍼에 혼합하고, SDS-PAGE (12% polyacrylamide gel)를 수행하였다. 단백질들은 그 다음 20% 메탄올을 포함한 25 mM Tris-192 mM 글리신에 있는 니트로셀룰로오스 막 (Hybond-ECL, Amersham Life Science, Ontario, Canada.)으로 전기이동된다. 블롯은 RT에서 1시간 동안 13.7 mM NaCl, 1% Tween-20과 2% 블로킹 제제 (ECL Advance Kit에서 제공됨)를 포함한 20 mM Tris (pH 7.6)에 블록화(blocked) 된다. 그 후 4℃에서 Bcl-2 또는 Bax 토끼 폴리클로날 항체 (0.35 mg/ml; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)와 함께 밤새 배양하고, 홍당무 퍼옥시다제-접합 항토끼 항체 (1: 200 000; Silemus laboratories, Melbourne, Australia)와 함께 배양한다. 그 후 영상들을 플랫 베드 스캐너를 사용하여 구체화시키고 각 표본에서 Bcl-2과 Bax 밴드의 강도는 ImageJ Imaging System Software version 1.3 (National Institutes of Health, USA)에 의 하여 정량화한다.

실시예 6

더미 세포 세포자멸사에서 난모세포 절제의 효과

완전한 COC가 OOX로 세포자멸사의 다른 단계를 가졌는지를 결정하기 위해, 5개의 COC군 또는 OOX는 세포자멸사가 평가되기 전에 배양 배지 50 ml 드롭에서 24시간 동안 배양되었다. 6개의 반복 실험이 수행되었다.

초점 스캔 현미경과 함께 TUNEL은 CC 세포자멸사의 시각화와 정량화의 매우 효과적인 수단임을 증명했다. TUNEL 양성과 음성 대조군 (Figs 1A와 1B; 99%와 0%의 세포자멸사, 각각)은 특이성을 증명하였다. COCs는 CC 세포자멸사의 낮은 발생을 나타내었고 (9%; 도 1C), 난포세포의 제거는 OOXs에서 35%의 의미있는 증가를 가져왔다 (p<0.001; 도1D). 배지에 FSH의 추가는 OOXs (10% 까지)와 COCs (6% 까지)에서 세포자멸사의 발생은 의미있게 감소하였다 (p<0.001; 도 2).

실시예 7

더미세포 세포자멸사에서 난모세포-방출 인자의 효과

OSF가 완전한 COC의 CC에서 세포자멸사의 낮은 발생에 대한 책임이 있는지를 결정하기 위해, 증가된 수의 DO와 함께OOX는 배양하고 COC와 비교하였다. 5, 25 혹은 50 DO는 5OOX를 포함한 50 ml 배양 드롭에 추가되었다. 3개의 반복 실험을 수행하였다.

만약 난포세포 측분비(paracrine) 인자가 낮은 COC 세포자멸사의 책임이 있는가를 결정하기 위하여, DOs의 농도 증가와 함께 OOXs를 함께 배양함으로써, OOX 에서 세포자멸사의 발생을 COC 수준으로 감소하기 위한 시도가 시행되었다. CC 세포자멸사는 DOs의 증가된 수와 함께 OOXs의 배양을 함으로써 용량 의존적인 형태로 유의한 수준으로 감소되었다 (p<0.001). OOXs에서 FSH의 유무와 상관없이 세포자멸 정도는 최대 DO (50 DO/well)에서 COC 수준으로 완벽하게 복구되었다 (Fig 2). 이러한 결과들은 OSF가 CC 내에서 세포자멸사를 예방하는 것을 의미한다.

실시예 8

OSF 기원의 접근과 관련하여 세포자멸사의 양식

난모세포에 복합체의 근접성과 관련하여 CC 복합체 내에서 세포자멸사의 위치를 결정하기 위해, COCs에서 세포자멸 발생을 정량화하였고, 이의 OSF의 기원은 CC 복합체의 중심이고, 반대로 Dos와 공동 배양한 OOXs에서 OSF의 기원은 CC 복합체의 바깥쪽이다. 초점 현미경을 사용하여, 복합체의 직경은 Scanalytics IPLab software Version 3.6을 사용하여 난모세포 위치의 직경을 뺀 후에 측정하였다. 이것은 그 후 난모세포 주변에 3개의 고리 구역(ring zones)을 형성하는 내층, 중간, 외층의 CC로 3개의 동등한 층으로 나누었다. 각 층은 총 반지름의 33% 비율과 동등하였다. 세포자멸사의 발생은 각 층에서 독립적으로 분석되었다.

초점 현미경의 정성 관찰은 COCs 내부에 세포자멸 세포가 대부분 복합체의 바깥 층에 존재하고, 반면에 OOXs가 Dos와 공동 배양 시 세포자멸사는 내부 더미층 내에 관찰되는 것을 의미한다. 그러므로 OSF는 CC 층을 통하여 항세포자멸(anti-apoptotic)의 형태학적인 기울기를 성립시킴을 가정하였다. 이러한 가정을 입증하기 위하여, COC와 OOX 복합체의 직경을 측정하였고 내층, 중간, 외층의 3개의 층으 로 나누었다 (도 3A). 완전한 난모세포를 가지고 있는 COCs 내부에, 세포자멸의 발생은 내층에서 외층을 향하여 (도 3A와 3C) 유의성있게 증가하였다 (P<0.026). 반대로, OOXs가 Dos와 공동 배양시, 세포자멸의 발생은 OSFs의 근원에 가까운 내층으로부터 외층으로 감소하였다 (Figs 3B와 3D). 이러한 효과를 설명하기 위하여, 난모세포와 가장 가까운 COC에서 내층은 4배였고, 세포자멸사의 유의하게 낮게 발생하였다. 이는 OOX+DO 군으로부터 그것의 반대쪽 내층과 비교하여 DOs로부터 가장 멀리있는 층인 경우 세포자멸사의 가장 높은 발생을 보였다 (도 3B).

실시예 9

더미세포 세포자멸사에서 GDF -9, BMP -6, BMP - 15 의 용량 반응

COC에서 관찰되는 세포자멸사의 낮은 발생에 기여할 수 있는 잠정적인 OSFs를 시험하기 위한 시도에 있어서, FSH의 존재 또는 부존재 하에서 GDF-9 (0∼175 ng/ml), BMP-6 (0∼100 ng/ml) 또는 BMP-15 (0∼20% v/v) 중의 하나의 농도를 증가시키면서 OOX를 배양하였다. OOX를 또한 10% (v/v) 293H으로 처리하였는데, 이는 GDF-9 (132 ng/ml에 등가량) 및 10%(v/v)에 등량인 BMP-15에 대한 모세포주 적응용 배지 음성 대조군으로서 제공되는 것이다. 반복 실험당 처리 군 마다 10개의 OOX를 사용하여 이들 실험을 세 번 반복하여 수행하였다.

이들 실험은 CC 세포자멸사의 조절에 대한 잠정적인 이들 OSF의 효과를 측정하기 위해 수행하였다. OOX 복합체를 GDF-9, BMP-6 및 BMP-15의 증가하는 투여량으로 처리하였다. GDF-9은 FSH의 존재 또는 부존재하에서, CC 세포자멸사의 발생에 대한 중요한 효과를 보이지 않았고, GDF-9의 최고 투여량 (175 ng/ml)에서도 세포 자멸사는 293H 대조군 적응용 배지 군과 유의적인 차이가 있지 않았다 (도 4C, D). CC 세포자멸사는 증가하는 투여량의 BMP-15로 OOX를 처리함으로써 용량 의존적으로 유의적으로 감소하였고, 20% BMP-15에서 최대 효과를 가졌다 (도 4E). BMP-15가 FSH와 조합되어 사용되었을 때에도 유사한 반응이 관찰되었다 (도 4F).

실시예 10

Bcl -2 및 Bax 단백질의 OOX 발현에 대한 DO , GDF -9 및 BMP -15의 효과

이 실험은 세포의 죽음과 생존을 조절하는 핵심 단백질의 발현에서의 변화를 수반하는 TUNEL에 의하여 평가되는 CC 세포자멸사에 대한 처리 효과를 확인하기 위하여 수행하였다. OOX를 24시간 동안 처리 없이 배야하거나, 또는 132 ng/ml GDF-9, 10% v/v BMP-15로 처리하고, 35 DO/웰, 또는 10% 293H와 공동배양하고 (대조군 적응용 배지), 그 후 Bcl-2 및 Bax 발현의 분석을 위하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.

OOX 복합체의 CC에서의 Bcl-2 및 Bax 발현의 패턴을 연구하기 위하여 이 실험을 수행하였다. Bcl-2 단백질의 발현은 무처리 또는 GDF-9로의 처리시와 비교하여 OOX가 DO 및 BMP-15와 공동배양될 때 CC에서 유의적으로 (P<0.001) 더 높다 (도 5). 이와 대조적으로, Bax 단백질의 발현은, Bax 수준이 거의 검출되지 않는 정도의 DO 또는 BMP-15와 공동 배양된 OOX와 비교하여, 무처리 또는 GDF-9와 공동배양된 OOX의 경우에 CC에서 유의적으로 (P<0.001) 더 높다는 것이 발견되었다 (도 5). 이들 결과는 우리의 TUNEL 결과를 뒷받침한다; 즉 DO 및 BMP-15 (그러나, GDF-9는 아님)는 CC 세포자멸사의 예방과 관련되어 있다는 것과, DO 및 BMP-15는 세포의 생 존에 유리하도록 Bcl-2 대 Bax의 비율을 변화시키지만 (Oltvai et al., 1993), GDF-9은 Bcl-2 대 Bax 비율에 대한 효과가 없다는 것을 지지한다.

실시예 11

스타우로스포린(staurosporine)에 의하여 유도되는 더미 세포 세포자멸사에 대한 DO , BMP -6 및 BMP -15의 효과

용량 의존적으로 세포자멸사를 유도하는 소의 CC에 대한 스타우로스포린의 세포자멸 효과를 측정하기 위한 예비적인 실험을 수행하였다 (범위; 0.1∼100 μM, 데이터를 나타내지 않음). 이 실험의 목표는 OSF가 CC를 스타우로스포린에 의하여 유도되는 세포자멸사의 진행으로부터 막을 수 있는지 여부를 측정하기 위한 것이었다. OOX 단독으로 또는 35 DO, 10 ng/ml BMP-6 또는 10% (v/v) BMP-15와 공동으로 배양한 후, 24시간의 배양 기간 중 마지막 6시간 동안 0.1 μM 또는 1.0 μM 스타우로스포린 중 어느 하나에 0.1 μM 또는 1.0 μM 스타우로스포린 중 어느 하나에 노출시켰다. 반복 실험당 처리 군 마다 10개의 OOX를 사용하여 이들 실험을 세 번 반복하여 수행하였다.

이 실험의 목적은 난모세포가 세모자멸사 유도 사건으로부터 CC를 보호할 수 있는지 여부 및 BMP-15 및 BMP-6에 의한 모사(mimicked)에 의하여 그러한 효과가 얻어질 수 있는지 여부를 결정하기 위해서이다. 스타우로스포린은 0.1 및 1.0 μM으로 각각 처리하였을 때, CC 세포자멸사의 발생을 41%에서 51% 및 74% 까지 증가시켰다 (P<0.001) (도 6). 스타우로스포린의 상기 두 가지 용량의 세포자멸사 유도 효과는, 스타우로스포린 처리 OOXs를 COC 수준까지 감소된 세포자멸사를 가지는 DOs와 공동배양할 때, 완전히 없어졌다. 또한, 상기와 동일한 2가지 용량의 스타우로스포린에 노출된, 10% BMP-15 또는 10 ng/ml BMP-6로 처리된 OOX는 세포자멸사의 유의적인 감소를 보여주였다; 각각 17% 및 21% (0.1 μM); 25% 및 31% (1 μM) (P< 0.001). 이들 결과는 OSF의 항세포자멸사 작용은 CC를 세포자멸사적 손상으로부터 보호할 수 있고, BMP-15 및 BMP-6은 이러한 효과를 모방할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 12

더미 세포 세포자멸사에 대한 BMP 길항제의 작용

폴리스타틴은 높은 친화도로 BMP-15 및 액티빈 양쪽 모두에 결합하고, 그들의 생활성을 중화시킨다 (Lin et al., 2003; Otsuka et al., 2001). 그렘린은 벽 GC 및 CC 양쪽 모두에서 발현되고 BMP-4 및 BMP-7을 선택적으로 차단하며 (Merino et al., 1999), BMP-15를 중화시킬 수 있다. 이 실험의 목적은 BMP-6 및 BMP-15 예방 CC 세포자멸사에 대한 이들 길항제의 유효성을 시험하기 위한 것이었다. 증가하는 용량의 폴리스타틴 (0∼100 μg/ml)의 존재하에서 또는 증가하는 용량의 그렘린 (0∼40 μg/ml)의 존재하에서 OOX를 10 % (v/v) BMP-15와 함께 배양하였다. 별개의 실험에서, 높은 용량 (20 μg/ml)의 BMP-6 모노클로날 중화항체 (NAb)의 존재 또는 부존재하에서 OOX를 처리하였다. 반복 실험당 처리 군 마다 10개의 OOX를 사용하여 이들 실험을 세 번 반복하여 수행하였다.

이들 실험을 BMP-15 및 BMP-6 길항제가 CC 세포자멸사에 대한 BMP-15 및 BMP-6의 항세포자멸사 효과를 중화할 수 있는지에 대하여 시험하기 위하여 수행하 였다. BMP-15 처리 OOXs를 증가하는 농도의 폴리스타틴과 함께 배양하였을 때, 세포자멸사에 있어서 유의적인 (P<0.001) 용량의존 증가가 있었다 (도 7A). 10 ng/ml BMP-6와 함께 배양된 OOX 복합체를 높은 용량 (20 μg/ml)의 BMP-6 중화항체로 처리하였다. 도 7B는 BMP-6 길항제가 10 ng/ml BMP-6의 항세포자멸사 효과를 유의적으로 (P<0.001) 중화하였다는 것을 도해하고 있다.

실시예 13

더미 세포 상의 난모세포의 항세포자멸사 작용에서의 BMP -15 및 BMP -6의 역할

CC 상에서의 난모세포의 항세포자멸 생활성을 중화시키기 위한 시도에서, 50 μg/ml 폴리스타틴, 20 μg/ml BMP-6 NAb의 존재 또는 부존재하에서 또는 그 양쪽의 길항제의 존재하에서, OOX를 25 DO와 공동배양하였다. OOX + DO와 비교한 BMP-15 및 BMP-6의 추가적인 효과를 조사하기 위하여 별개의 실험을 수행하였다. OOX를 DO, 또는 10 ng/ml BMP-6 및/또는 10% v/v BMP-15로 처리하였다. 반복 실험당 처리 군 마다 10개의 OOX를 사용하여 이들 실험을 세 번 반복하여 수행하였다.

CC에서 난모세포의 항세포자멸 효과가 BMP-15 및/또는 BMP-6에 기인할 수 있는지 여부를 추가적으로 측정하기 위해서, BMP-6 NAb와 함께 또는 BMP-6 NAb 없이 폴리스타틴을 사용하여 OSFs를 중화시키기 위한 시도를 하였다. 도 8A는 난모세포와 공동배양한 OOX가 OOX 단독과 비교하여 CC 세포자멸사의 발생이 감소하였고, 이는 COC 대조군과 비교할 정도였다는 것을 도해하고 있다. 폴리스타틴 단독 또는 BMP-6 NAb 단독 중의 한가지는 세포 더미 상의 난모세포의 항세포자멸 효과의 ∼ 50%를 유의적으로 중화시켰다 (P<0.001). 폴리스타틴 및 BMP-6 NAb의 효과는 그들의 결합된 존재가 세포자멸사 수준을 더 회복시키지 않기 때문에 부가적인 것이 아니다.

도 8A의 결과는 난모세포 분비 BMP-15 및 BMP-6는 CC 세포자멸사를 막는데 과다하게 작용하고, 그에 따라 추가적인 방식으로 작용하지 않을 것이라는 점을 제안하였다. 이러한 제안을 시험하기 위하여 실험을 수행하였다. OOX의 DO와의 공동배양 또는 BMP-15 단독 또는 BMP-6 단독으로의 처리는 CC 세포자멸사를 유의적으로 (P<0.001) 감소시켰다 (도 8B). OOXs와 BMP-6 및 BMP-15의 조합 처리는 BMP-15 단독 (P>0.05) 경우의 수준을 넘어 세포자멸사를 더 감소시키지 않았고, 이는 이들 2개의 BMPs의 효과는 추가적이지 않다는 것을 제안한다.

실시예 14

더미 세포 세포자멸사에 대한 BMP -7 및 그의 길항제, 그렘린의 효과

CC 세포자멸사에 대한 BMP-7 및 그의 길항제인 그렘린의 영향을 조사하기 위하여, OOX를 2 μg/ml 그렘린의 존재 또는 부재하에서 100 ng/ml BMP-7 및/또는 10 % BMP-15로 처리하였다. 반복 실험당 처리 군 마다 10개의 OOX를 사용하여 이들 실험을 세 번 반복하여 수행하였다.

CC 세포자멸사의 조절에 있어서 BMP-15의 존재하에서의 BMP-7 및 그의 길항제인 그렘린의 효과를 측정하기 위하여 이 실험을 수행하였다. BMP-7 및 BMP-15는 더미 세포 세포자멸사를 유의적으로 감소시켰다 (P<0.001; 도 9). BMP-15 처리 OOXs를 증가하는 용량의 그렘린과 함게 배양하였을 때, 세포자멸사는 유의적으로 증가하지 않았다 (도 9A). 반대로, 2 μg/ml 그렘린은 100 ng/ml BMP-7의 억제 효과를 유의적으로 (P<0.001) 역전시켰지만, BMP-15가 존재하는 경우는 그렇지 않았다 (도 9B).

실시예 15

통계적 분석

더미 세포 세포제멸사의 빈도를 SigmaStat software (SPSS Inc, Chicago, IL)를 사용하여 ANOVA로 분석하여, 다중 평균의 비교를 위해 터키-크라머 포스트-혹 테스트(Tukey-Kramer post-hoc test)를 사용하여 평균값 사이의 유의적인 차이를 측정하였다. 분석에 앞서 모든 세포 비례 데이터를 아크-사인(arc-sine) 변환하였다. 그 차이는 p< 0.05에서 통계적 유의성으로 고려되었다.

토론 - 연구 I

본 연구는 난모세포 절제에 의한 COC로부터 난모세포의 제거가 CC 세포자멸사의 실질적인 증가를 가져온다는 것을 증명한다. 그러나, 낮은 세포자멸사 수준은, 용량 의존으로 세포자멸사의 발생을 감소시키고, 최대 농도인 50 DO/웰에서 COC 수준까지 완전히 회복시키는, OOX의 난모세포와의 공동배양에 의하여 회복될 수 있다. 이러한 발견들은 낮은 수준의 CC 세포자멸사는 난모세포의 존재에 상당히 의존한다는 것을 증명한다. 더욱이, CC 세포자멸사의 특징적으로 낮은 발생은, 이들 효과가 직접적인 난모세포-CC 접촉이 없는 공동 배양 환경에서 관찰되었기 때문에, 난모세포의 CC로의 간극 결합성(gap junctional) 신호전달에 기인한다기 보다는, 난모세포로부터의 가용성 측분비 신호에 특이적으로 기인할 수 있다.

상기 연구는 난모세포는 OSF의 형태발생적 구배(morphogenic gradient)를 수립함으로써 CC 세포자멸사를 활발하게 억제한다는 것을 증명한다. 우선, CC 세포자멸사의 감소를 2가지 상이한 방법으로 평가하였다: 정량적 공초점 현미경과 함께 TUNEL. 세포자멸사를 조절하는 핵심 단백질의 발현을 또한 웨스턴 블롯으로 측정하였다. OOX의 난모세포에의 노출은 항세포자멸사성 Bcl-2의 발현을 극적으로 유도시켰다. 반대로, 전구 세포자멸사성 Bax의 발현이 OOX 단독에서는 높아졌지만, OSF에 의하여 현저하게 감소되었다. 이들 결과는 난모세포가 세포 생존에 유리하게 Bax와 Bcl-2의 비율을 변경함으로써 CC 내에서 세포자멸사를 막는다는 것을 나타낸다. 두 번째로, 난모세포의 항세포자멸 작용은 난모세포(들)의 자리로부터의 구배(gradient)에 따랐다. 무손상 COCs에서, 세포자멸사의 발생은 CC의 가장 내부 층에서 최저였고, 난모세포로부터의 거리가 증가함에 따라 증가하였다. 반대로, OOX + DO에서, 난모세포가 그 복합체의 바깥에 있고, OOX가 빈(hollow) 경우, 난모세포에 가까운 CC의 외곽 층이 가장 낮은 세포자멸사를 나타내었다. 이것은 COC 내에서 매우 국소적인(localised) OSF의 형태발생적 구배의 첫 번째 직접적인 증거이다. 세 번째로, OSF는 CC를 세포자멸사적 손상으로부터 보호할 수 있었다. 스타우로스포린은 무차별적 DNA 손상을 일으키는 것과 반대로 세포성 신호 연속단계를 통한 세포자멸사를 유도한다 (to date uncharacterized). 난모세포는 세포자멸사가 유도하는 사건으로부터 CC를 보호할 수 있다는 것을 증명하는 스타우로스포린에 의하여 유도되는 세포자멸사를 OSF는 예방할 수 있다. 이들 결과를 종합하면 난모세포는 매우 국소화된 방식으로 작용하는 잠재적인 항세포자멸사 인자(들)을 분비한다는 것을 증명한다.

FSG로 배지의 보충은 또한 COCs 및 OOXs 양쪽 모두에서 CC 세포자멸사의 발생을 저하시킨다. 이것은 기타의 연구와 일치하고, FSH가 난포 성장을 유도하는 불가결한 호르몬이라는 인식과 난포 폐쇄의 첫번째 원인은 FSH에 대한 불충분한 노출이라는 인식과도 일치한다.

GDF-9이 특별한 잠재적인 GC 미토겐 이라는 사실에도 불구하고 GDF-9는 CC 세포자멸사의 발생에 중요한 효과를 가지지 않는다. 그 대신에, CC 세포자멸사는 일반적으로 약한 미토겐인 BMP-15, BMP-6 및 BMP-7에 의하여 뚜렷하게 감소되었다. 이러한 연구는 BMP 신호전달 (GDF-9 신호전달은 아님)이 CC 세포자멸사를 막는다는 여러가지 증거를 제공한다; 1) 테스트된 3가지 모든 BMPs는 용량 의존방식으로 CC 세포자멸사의 발생을 감소시켰고, 2) BMP-6 및 BMP-15 양쪽 모두는 스타우로스포린에 의해 유도된 세포자멸사로부터 CC를 보호하였으며, 3) CC 항세포자멸 Bcl-2의 발현은 BMP-15에 의하여 촉진되었지만, GDF-9에 의해서는 아니었고, 이와 대조적으로, 4) 전구 세포자멸 Bax 발현은 BMP-15에 의하여 역제되지만, GDF-9에 의해서는 그렇지 아니하였다. 이들 발견은 Bcl-2과 Bax의 비율이 새포의 생존 또는 죽음 여부를 결정한다는 생각과, BMP-15 및 BMP-6는 그 비율을 조절할 수 있다는 생각을 뒷받침한다.

TGF-β 슈퍼페밀리에 의하여 활성화되는 2개의 상이한 신호전달 경로가 있다; BMP 경로 및 TGFβ/액티빈 경로. ALK5 수용체를 통한 GDF-9 신호는, SMAD 2/3 분자를 활성화시키고, 그에 따라 TGF-β 유사 세포내 반응을 일으킨다. 다른 한편 으로, ALK6 및 BMPRII 수용체를 통한 BMP-15, BMP-6 및 BMP-7 신호는 그에 따라 다른 SMAD 1/5/8 경로를 활성화시킨다. 따라서, 소 OSF는 CC에서 동시적으로 신호 전달 경로(; SMAD 1/5/8 경로의 활성화와 BMP-6의 난모세포의 항세포자멸 활성 전달, 난모세포의 유사분열촉진 물질 신호를 전달하는 GDF-9 에 의한 SMAD 2/3 경로 교체의 활성화)를 자극함을 보여준다.

본 연구의 추가적인 목표는 천연 OSF가 CC 세포자멸사를 예방함을 증명하는 것이었다. 이것은 OSFs의 실제 정화(purification)는 지금까지 실행될 수 없는 것으로 인정됨으로써, CC의 난모세포 효과의 실험적인 중성화를 통하여 가장 쉽게 획득되었다. 몇몇 높은 친화 결합성 단백질이 폴리스타틴과 그렘린을 포함한 BMP 활성을 중화한다. 난포를 발달시키는 GCs에 의해 잘 발현되는 폴리스타틴은 비활성 복합체를 형성함으로써 액티빈과 BMP-15의 생물학적인 활성화를 방해한다. 현재 연구에서, 폴리스타틴과 BMP-6 중화 항체는 각각 BMP-15와 BMP-6의 항세포자멸 효과를 중화시킬 수 있다. GCs와 CC에서 표현되고 BMP-2, BMP-4와 MP-7 길항작용제로 표현되는 그렘린은 BMP-15의 항세포자멸 효과를 중화시키지 않는다.

난모세포의 항세포자멸 효과를 중성화하기 위한 BMP 길항제의 능력을 확인하였다. 폴리스타틴 또는 BMP-6 중화 항체 단독은 난모세포의 항세포자멸 효과를 부분적으로 중화시킬 수 있고, 이는 소 난모세포의 이러한 활성이 BMP-15 및/또는 BMP-6에 부분적으로 기여할 수 있음을 보여준다. 이러한 사실은 이런 난모세포-분비 분자를 위한 새로운 기능을 전적으로 의미한다. BMP-15와 BMP-6는 더미 세포 세포자멸사를 예방하기 위해 풍부하게 활성화됨을 나타낸다. 재조합 단백질은 함께 추가 시 세포자멸사의 부가적인 효과를 가지지 않고, 천연 난모세포 BMP-15와 BMP-6의 동시적 중성화는 어느 한쪽 단독의 중성화 효과를 증가시키지 않는다. 이러한 자료는 BMP-15와 BMP-6 난모세포 단백질이 중요한 항세포자멸 OSFs임을 처음으로 직접적인 증거를 제공한다.

본 연구에서, CC 세포자멸사를 예방함에 있어 OSF가 아니며, 난포 포낭에 의해서만 표현될 지라도 BMP-7은 난모세포-분비 BMP-15 또는 BMP-6의 활성을 모방할 수 있음을 보여주었다. BMP-2와 BMP-4 활성을 길항하는 데에 매우 효과적인 것으로 알려진 그렘린은 BMP-7의 항세포자멸 효과를 중화하였으나 BMP-15에 대해서는 비효과적이었다. 그러함으로써, 내분비 난모세포-물질의 CC에 대한 항세포자멸 효과는 BMP-7과 그렘린이 동시에 존재함에 영향을 받지 않았다.

연구 II 나화 난모세포와의 공동 배양 시스템에서의 소 난모세포 더미 복합체의 발달 능력: 난모세포 분비 인자(들)의 역할

실시예 16

소 난모세포의 수집 및 배양 조건

소 난소는 지역 도축장에서 수집하였고 따뜻한 생리식염수 (30∼35℃)에 담아 실험실로 이송하였다. 난모세포 더미 복합체 (COC)는 안트랄 난포 (직경 2∼8 mm)로부터 흡입하였고, 이는 18 게이지 바늘과, 50 μg/ml 카나마이신, 0.5 mM 피 루베이트 나트륨, 50 μg/ml 헤파린 및 4 mg/ml 지방산 없는 소 혈청 알부민 (FAF-BSA; ICPbio Ltd, Aukland, NZ)이 첨가된 흡입 배지 (Hepes-buffered Tissue Cultured Medium-199: TCM-199,ICN Biochemicals, Irvine, CA, USA) ∼2ml를 함유하는 10-ml 주사기를 사용하였다. 5개의 세포층과 균일하게 색소 침착된 세포질보다 큰 치밀한 더미 덮개를 가진 무손상 COC를 해부현미경 하에서 수집하고, Hepes-buffered TCM-199에서 2번 세척하고, 10% 소태아혈청 (FCS) (Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 보충된 Hepes-TCM199에서 1번 세척하였다. 난모세포 성숙을 위한 기초 배지는 Bovine VitroMat (Cook Australia, Eight Mile Plain, Qld, Australia)이고, 이는 소 난포액의 이온성 조성물을 기재로 하는 배지이고, 또한 100 μm 글리실글루타민 (그루타맥스; Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 100 μm N-아세틸-1-시스테인, 100 μm 2-머캅토에틸아민, 1% v/v 비필수 아미노산 (100×; Gibco Invitrogen), 2% v/v 필수 아미노산 (50×; Gibco Invitrogen), 4 mg mL-1 지방산 없는 BSA 및 5.6 mm 글루코오스를 함유한다. 모든 IVM 처리에 0.1 IU/ml FSH (Puregon, Organon, Oss, Netherlands)를 보충하였다. 복합체를 광유와 함께 도포된 미리 평형이 유지된 50 ml 드롭(drops)으로 배양하고, 5% 이산화탄소가 포함된 습윤 공기에서 24시간 동안 39℃로 배양하였다.

실시예 17

난모세포 더미 복합체의 처리

(i) 나화 난모세포의 생성

나화 난모세포(DO)를 2 ml H-TCM-199/BSA에서 ∼4분 동안 볼텍스 처리하여 COC로부터 CC를 제거함으로써 생성한다. 잔여 CC를 H-TCM-199/BSA 내에서 난모세포를 불로 미세한 구멍이 뚫리게 제작한(fine-bore fire-polished) 유리 피펫을 여러 번 통과시킴으로써 제거한다.

(ii) 성장 인자

재조합 마우스 GDF-9과 재조합 양 BMP-15는 트랜스펙션된 293 인간 배아 신장 세포주(293H)를 사용하여 이전에 보고된 방법대로 (Kaivo-Oja et al (2003) J Clin Endocrinol Metab 88, 755-62; McNatty et al (2005) Reproduction 129:473-480) 인하우스(in-house)에서 생성되었다. 최근 보고된 바와 같이 (Hickey et al., (2005) Biol Reprod on line), 재조합 단백질을 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)을 사용하여 부분적으로 정제하고, 그 농도를 웨스턴 블롯법 (Kaivo-Oja et al (2003) J Clin Endocrinol Metab 88: 755-62)에 의하여 평가하였다. 대조 적응용 배지(293H)는 트랜스펙션되지 않은 293H 세포로부터 또한 생성되고 HIC에 의해 정제되었다.

(iii) 시험관 내 수정 및 배아 배양

모든 실험을 수정능력이 증명된 동일한 수컷 황소로부터의 동결 정액을 사용하여 수행하였다. 요약하면, 액체 질소에 저장된 1개 스트로(straw)의 정액을 수조에 1분 동안 재빨리 해동시켰다. 불연속 (45%: 90%) 페르콜 구배 (Percoll gradient; Amersham Bioscience)의 위에 상기 정액 샘플을 도포하고, 실온에서 20∼25분 동안 700 g로 원심분리시켰다. 상청액을 제거하고, 그 정액 펠릿을 500 ml Bovine Vitro Wash (Cook Australia, Eight Mile Plains, Qld, Australia)로 세척 한 후, 200 g로 5분 동안 추가로 원심분리시켰다. 정자(spermatozoa)를 IVF 배지 (Bovine Vitro Fert, Cook Australia)에 재현탁한 후, 수정 배지 드롭 (Bovine Vitro Fert, Cook Australia, 0.01 mM 헤파린, 0.2 mM 페니실아민 및 0.1 mM 히포타우린으로 보충됨)에 최종 농도 1 x 10⁶ 정자/ml으로 첨가하였다. COC를 6% CO₂ 함유 습윤 공기에서 24 시간동안 39℃에서, COC당 10 ml IVF 배지의 배지 밀도에서 수정시켰다.

수정 후 23∼24 시간에 온화한 피펫팅으로 더미 세포를 제거하고, 5개의 추정되는 접합체(zygotes)를 미리 평형화된 Cook Bovine Cleave medium (modified SOFaa, Cook Australia) 20 μl 드롭으로 전달시키고, 38.5℃의 광유에서 7% O₂, 6% CO₂, 평형 N2 하에서 5일 동안 (1일째 내지 5일째) 배양하였다.

5일째에, 배아를 광유로 도포된 38.5℃의 미리 평형화된 Bovine Vitro Blast (Cook Bovine Blast medium; Cook Australia)의 20 ml 드롭에 5∼6개의 그룹으로 전달하고, 8일째까지 배양하였다. 8일째에 국제 배아 전달 학회의 매뉴얼에 기재된 정의에 따라 배아의 질을 각각 평가하고, 숙련된 소 발생학자에 의한 블라인드 테스트를 하였다.

실시예 18

통계적 분석

SigmaStat software (SPSS Inc, Chicago, IL)를 사용하는 ANOVA에 의한 통계적 분석을 수행하고, 다중 평균의 비교를 위해 터키-크라머 포스트-혹 테스 트(Tukey-Kramer post-hoc test)를 사용하여 평균값 사이의 유의적인 차이를 측정하였다. 모든 백분율 데이터를 분석에 앞서 아크-사인(arc-sine) 변환하였다. 차이는 p< 0.05에서 통계적 유의성으로 고려되었다.

실시예 19

이후의 배아 발달 능력에 대한 IVM 중의 DO 와의 무손상 COC 의 공동 배양의 효과

난모 세포 발달 능력에 있어서 난모세포 분비 인자의 효과를 측정하기 위하여, 난모세포 더미 복합체를 시험관 내 성숙 (IVM) 동안 4개의 처리 군으로 무작위로 할당하였다. IVM 후에, 모든 복합체 및 난모세포를 수정시키고, 포배 형성의 질을 8일째에 평가하였다.

처리 (1): 20개의 나화 난모세포를 200 ml 드롭에서 24 시간 동안 배양하였다 (DO; 도 1A). 처리 (2): 20개의 난모세포 더미 복합체를 200 ml 드롭에서 24 시간 동안 배양하였다 (DO; 도 1B). 처리 (3): 20개의 COC를 0 시간부터 100 개의 나화 난모세포와 함께 200 ml 드롭에서 24 시간 동안 공동 배양하였고, 그 중의 20개 복합체 (COC-0h; 도 1C) 및 20개 나화 난모세포 (DO-0h; 도 1D)를 IVM 후에 수정시켰다. 처리 (4): 20개의 COC를 처음 9시간 동안 무손상 COC로서 200 ml IVM 배지에서 성숙시켰다. 이와 동시에, 100개 COC를 9시간 동안 나화에 앞서 성숙시키고, 그 후 상기 100 개 DO를 전달시켜 상기 20개 COC와 함께 IVM의 마지막 15 시간 동안 성숙시켰다. 처리 3의 경우와 같이, 20개의 복합체 (COC-9h; 도 1E) 및 20개의 나화 난모세포 (DO-9h; 도 1F)를 전술한 바와 같이 그 후 수정시켰다. 7번의 반복 실 험을 수행하였다.

1개의 COC를 5개 DO와 함께 10 ml 드롭에서 배양하면, 0.5 DO/ml의 농도가 되고, 이는 난모세포 분비 인자의 영향을 평가하기 위해 사용되는 특유의 범위 내이다 .

그 결과를 표 1 및 도 11 및 12에 제공한다.

나타나 있는 바와 같이, 0 또는 9 시간에서의 무손상 난모세포 더미 복합체의 나화 난모세포와의 공동배양은 수정 후에 포배기에 도달하는 난모세포의 수 (각각 50% 및 61%)를 COC 단독 배양 (40%; 도 12)과 비교하여 유의적으로 증가시켰고 (P<0.001; 도 12), 이는 나화 난모세포로부터 분비된 측분비 인자가 포배기로 발달되는 COC의 능력을 향상시킨다는 것을 보여준다. 더욱이, 나화 전의 IVM의 처음 9 시간 동안의 무손상 더미 세포 교신과 함께 난모세포의 성숙에 이어 마지막 15시간의 IVM 동안 복하체와의 배양은 8일째에 유의적으로 더 많은 포배를 가져왔다.

더미 세포의 존재 (이웃하는 COCs로부터)는 DOs (DO-0h)의 발달 능력을 향상시키지 않았는데, 그에 따라 포배율은 DOs 단독 배양 (DO)에 유사하였다 (도 12). IVM 전의 더미 세포의 제거는 수정 후 포배기에 도달하는 난모세포의 수를 무손상 COCs와 비교하여 유의적으로 (P<0.001; 도 12) 감소시켰다 (각각 12%, 40%). 나화에 앞서 처음 9시간 동안의 무손상 더미와 함께 난모세포의 성숙은 DOs 단독 배양과 비교하여 포배율을 유의적으로 (P<0.001; 도 12) 향상시켰다 (각각 12%, 25%).

난모세포의 분열은 나화 난모세포 처리들 및 난모세포 더미 복합체 처리들 사이에서 유의적인 차이가 없었지만 (도 11), 나화는 일반적으로 이후의 수정율 (fertilization rates)을 유의적으로 저하시켰다. 그러나, 다정자수정의 발생은 (DNA 형광, H33349으로 염색된 난모세포의 코호트를 분리하여 평가함으로써) 나화 난모세포와 난모세포 더미 복합체 사이에 차이가 없었다 (데이터를 나타내지 않음)

실시예 20

난모세포 발달 능력에 애한 GDF -9, BMP -15 (단독 및 조합)의 효과

난모세포 분비 인자의 기여 여부를 조사하기 위하여 발달 능력을 COC에서 관찰하였다. 복합체를 전술한 것과 동일한 IVM 시스템과 함께, 10% 293H (대조군 적응용 배지), 10% BMP-15, 175 ng/ml GDF-9 또는 BMP-15 + GDF-9의 존재 또는 부재하에서 24시간 동안 배양하였다.

반복 실험당 처리 그룹마다 25개의 COC를 사용하여 이러한 실험을 3번 반복하여 수행하였다.

표 2에 나타나 있듯이, BMP15 단독 또는 GDF9과의 조합은, GDF-9 단독으로 처리된 COCs 또는 임의의 보충물의 존재하에서 성숙된 COCs와 비교하여, 수정 후에 포배기에 도달하는 난모세포의 수를 증가시키는데 더 효과적이었다.

실시예 21

TGF -β 수퍼패밀리 분자에 의한 더미 세포에 대한 난모세포 측분비 신호는 더미 확장에 있어 필수적이다

TGF-β 수퍼패밀리의 일원들은 마우스 더미 확장 가능 인자 (CEEF)을 위한 첫번째 후보이다. 더미 확장을 조절하는 TGF-β 수퍼패밀리 프로세스를 조사하기 위하여 이 실험을 수행하였다. COCs를 eGG 초회감작 마우스 (eGG-primed mice)로부터 수집하고, 그 난모세포를 미세수술로 제거하여 난모세포절제(OOX) 복합체를 만들었다. FSH 유도 더미 확장을 평가하기 위해 사용되는 채점 시스템을 수립하였다; 0 (확장 없음) 내지 +4 (최대 확장). FSH 단독으로 처리된 OOX 복합체는 확장에 실패하였지만 (점수: 0), GDF9 (점수; 평균 ± SEM: 3.7 ± 0.1), 액티빈 A (2.6 ± 0.1), 또는 난모세포와의 공동배양 (점수 3.2 ± 0.2) 중의 어느 하나에 의하여 확장이 유의적으로 (p<0.05) 유도되었다. GDF9 및 액티빈에 대한 유형 I(type-I) 수용체는 각각 ALK5 및 ALK4이다. 더미 확장을 중화시키는 ALK4/5/7 키나아제 억제제의 능력을 테스트하였다. 데이터를 도 13 내지 15에 나타내었다.

나타나는 바와 같이, 상기 억제제는 GDF-9 및 난모세포 유도 더미 확장을 완전하게 중화시키고 (도 13), 또한 상기 억제제는 GDF-9 및 난모세포 유도 과립층 세포 DNA 합성을 완전히 폐기시켰다 (도 14).

상기 억제제는 또한 CAGA-루시퍼라제 활성의 억제에의 하여 증명되어 TGF-β1, GDF9 및 Smad2/3 분자의 난모세포 자극 활성화를 완전히 폐기시켰다 (도 15A 및 15B).

폴리스타틴, 즉 액티빈의 길항제는 OOX 복합체의 액티빈에 대한 반응을 중화시키는데 또한 효과적이지만 (점수: 0), 난모세포와 공동 배양된 OOX 복합체의 확장에 대한 유의적인 효과 (p>0.05)는 없었다 (점수: 2.7 ± 0.2). 이 연구는 액티빈이 유일한 CEEF가 아니며, ALK4/5/7 경로를 통한 신호가 마우스 더미 확장에 필수적이라는 것에 대한 증거를 제공한다.

실시예 22

연구 III - 명주 원숭이( marmoset monkey ) 과립층 세포 증식을 조절하는 성장 분화 인자 9 신호전달 시스템

개요 및 목적:

난모세포는 이웃하는 과립층 세포 (GC)에 작용하는 측분비 성장 인자를 분비함으로써 난포 성장 및 발달을 조절한다. 인간 및 비인간 영장류에서, 주로 난모세포 및 비황체화 GC의 희소성 때문에 사용되는 난모세포 인자 또는 GC 수용체/신호전달 시스템(들)의 특성에 대해서는 거의 알려진 바가 없다. 이 연구의 목적은 통상의 명주 원숭이, 칼리트릭스 야쿠스 (Callithrix jacchus)에서의 GC 성장을 촉진하는 난모세포 분비 성장 분화 인자 9 (GDF9)에 의해 이용되는 수용체/신호전달 시스템을 확인하는 것이다.

방법:

(i) 동물

7마리의 성체 여성 명주 원숭이를 이 연구에 사용하였고, 퀸 엘리자베스 병원 동물 하우스(The Queen Elizabeth Hospital Animal House)에 수용시켰다. 이 연구는 지역 동물 윤리 위원회의 승인을 받았고, 동물 연구의 관리와 사용을 위한 지침 원칙(Guiding Principals for the Care and Use of Research Animals)에 따라서 행해졌다.

암컷 명주 원숭이를 6일 동안 하루 2번씩 hFSH (50IU/day)를 주사하여 초회감작 시키고, 난포기의 7일째에 전체 난소를 제거하였다.

(ii) GC 배양

난포를 손으로 절제하고 페리 안트랄 (PA; 0.42∼0.66mm), 스몰 안트랄 (PA; 0.66∼1.5mm), 라지 안트랄 (LA; >1.5mm)의 3개의 크기 군으로 분류하였다. 난포 크기로부터의 GC를 수집하고 저장한 후, 0.3mg/ml 폴리비닐 알콜 (PVA, Sigma)로 보충된 이카르보네이트 완충 조직 배양 배지-199 (B-TCM)에서 두번 세척하였다. 각각의 실험에 따른 벽 GC (1x10⁵ cells/ml), 억제제 및 배지를 96-웰 플레이트 (Falcon)의 웰에 첨가하여 125 μl의 최종 부피를 만들었다. 각 실험 내에서, 모든 처리를 적어도 두개의 웰에서 수행하였고, 각 실험을 적어도 3번 반복하였다. 공기 중의 5% CO₂, 96% 습도, 37℃시의 분위기 하에서 18시간 동안 세포를 배양하고, 이어서, 동일한 조건하에서 추가 6시간까지 15.4 kBq 삼중수소 티미딘 (³H-thymidine, ICN)의 펄스를 하였다. 배양 후에, 벽 GCs를 수확하고, S기의 세포의 비율의 표시자로서 신틸레이션 계수기를 사용하여 혼입된 ³H-티미딘을 정량하였고, 그에 따라 벽 GC DNA 합성 또는 증식 (30)의 수준의 표지를 제공하였다.

(iii) RNA 및 RT-PCR

리보좀 단백질-L19 (L19), 뼈 형태형성 단백질-수용체 유형 2 (BMPRII), 액티빈 수용체 유사 키나아제 5 (ALK5) 및 Smad 3 mRNA의 발현에 대하여 RT-PCR에 의하여 과립층 세포를 조사하였다. MGC를 전술한 바와 같이 수집하였다. 각 난포 크기로부터 100,000개의 세포를 얼음 위의 에펜도르프 튜브로 전달하고, RLT 버퍼 (Qiagen, Clifton Hill, Australia) 내에서 용해시키고, 액체 질소에 동결시키고, -80℃에서 저장시켰다.

마이크로 RNA 분리 키트 (Qiagen, Clifton Hill, Australia)를 사용하여 RNA를 분리하였다. 여기에는 균질화에 앞서 20 ng 담체 RNA를 각 샘플에 첨가하는 것을 포함하고, 모든 샘플을 게놈 DNA의 감염을 제거하기 위하여 DNase로 처리하였다.

리보그린 RNA 정량 키트 (Molecular Probes, Eugene, OR)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라서 RNA를 정량하였다.

70 ng RNA를 제조자의 설명서에 따라 무작위 프라이머 (Boehringer Mannheim, Germany) 및 슈퍼스크립트 II RT 키트 (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY)를 사용하여 역전사 하였다. RNA를 물로 치환한 음성 RT 대조군을 포함하였다.

PCR 증폭에 HotStarTaq DNA 폴리머라제 키트 (Qiagen, Clifton Hill, Australia)에서 공급되는 시약을 이용하였다. 각 반응을 2.5 μl Qiagen 10X 버퍼, 각각 0.4mM dNTP (Applied Biosystems, Australia), 0.5 U HotStarTaq DNA 폴리머라제, 0.56 μM의 각 프라이머, 1 μl의 cDNA (1:4 희석됨)로 구성시키고, 초정제수(ultra pure water) (Fisher Biotech, Perth, Australia)로 25 μl의 최종 부피로 만들었다. cDNA를 물로 치환한 음성 PCR 대조군을 각 PCR 영동(run)에 포함시켰다. 5분 동안 95℃에서 상기 중합효소의 최초 활성화에 이어서, 95℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분 및 72℃에서 7분의 최종 신장 단계의 40번의 증폭 사이클을 수행하였다. 그 후, 정확한 크기의 생성물을 확인하기 위하여 2% 아가로스 겔 상에서 영동시켰다. 마지막으로, 각 PCR 생성물의 확인을 서열분석으로 증명하였다.

명주 원숭이 서열 데이터가 부족하기 때문에, 프라이머 쌍을 인간 L19, BMPRII, ALK5 및 Smad 3에 대하여 프라이머 익스페스 소프트웨어(Primer Express software; PE Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 디자인하고, 진워크 (Geneworks; Adelaide, Australia)에 의해 합성하였다. 모든 프라이머 쌍을 인트론을 제외하도록 디자인하였다. 이 연구에서 사용된 프라이머의 올리고뉴클레오티드 서열을 표 1에 제공한다.

(iv) 루시퍼라제

포스포릴화 Smads에 대응하는 루시퍼라제 리포터 구조물을 사용하여 재조합 GDF9에 의한 벽 GC Smad 단백질의 활성화를 검출하였다. 벽 GCs를 수집하고, 세포를 DMEM(MP Biomedicals, Seven Hills, Australia) + 2% FCS (Trace Biosciences, Castle Hill, Australia)에서 최종 세척한다는 것을 제외하고는 전술한 바와 같이 가공하였다. 최종 세척 후에, 세포를 96-웰 플레이트 (Falcon)의 각 웰에 전달하고, 1.6x10⁵ 세포/ml에서 배양하였다. 4시간의 배양 후, Fugene 6 (Roche Diagnostics, Castle Hill, Australia)를 사용하여 세포를 일시적으로 50 ng의 루시퍼라제 리포터 구조물 DNA로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 18시간 후에, 배지를 세포로부터 흡입하고, 0.1% FCS로 보충된 DMEM 으로 치환하였다. 이 시점에 다양한 리간드를 세포에 첨가하고, 배양기간을 추가로 48시간 동안 연장하였다. 웰에서 배지를 제거하여 실험을 종료하고 플레이트를 -20℃에서 냉동시켰다. 세포를 회수하기 위하여, 100 μl의 용해 버퍼를 각 웰에 첨가하고, 20분 동안 흔들리는 플랫폼 상에서 실온에서 플레이트를 배양하였다. 세포 용해물 20 μl를 갤럭시스타 루미노미터(Galaxystar luminometer; GMB Labtechnologies, Offenburg, Germany)를 사용하여 루시퍼라제 활성의 측정을 위하여 사용하였다.

(v) 통계

7마리의 성체 암컷 명주 원숭이를 hFSH로 6일 동안 초회감작시키고, 전체 난소를 7일째에 제거하고, 난포를 손으로 절제한 후, GC를 3가지 크기 분류로부터 수집하였다: 페리안트랄 (PA; 0.42∼0.66mm), 스몰 안트랄 (SA; 0.66∼1.5mm) 및 라지 안트랄 (LA; >1.5mm). 4가지의 상이한 접근법을 사용하여 GC에서의 GDF9의 기능을 조사하였다. 난모세포, 더미 세포(CC) 및 GC로부터 RNA를 추출하고, RT-PCR을 인간 프라이머를 사용하여 수행하여 다른 종에서의 GDF9 신호전달에 연관되는 것으로 제안된 수용체/세포내 신호전달 물질의 발현을 확인하였다. GDF9 신호전달 경로를 조사하기 위하여, LA 난포로부터의 배양된 GC를 CAGA-루시퍼라제 또는 BRE-루시퍼라제 리포터 구조물 중의 하나로 트랜스펙션시키고, 다양한 TGF-β 수퍼패밀리 성장 인자로 처리하거나 마우스 난모세포와 공동배양 시켰다. 명주원숭이 GC 증식에 있어서 GDF9의 효과를 측정하기 위하여, GC 생체분석을 사용하여 24시간 ³H-티미딘 혼입 후에 DNA 합성 및 세포 증식의 표지자로서 평가하였다. 세포를 다양한 농도의 GDF9으로 단독으로 또는 FSH 및/또는 IGF1과 함께 처리하였다. 또 다른 실험에서, GC를 GDF9 +/- IGF1의 존재하에서 증가하는 용량의 SB431542, 액티빈 유사 키나아제 (ALK) 4/5/7 억제제로 처리하였다.

결과:

실험 1: 난모세포에 의한 GDF9 mRNA의 발현

RT-PCR을 페리, 스몰 또는 라지 안트랄 난포 각각으로부터 회수한 나화 난모세포로부터 유도된 cDNA 상에서 수행하였다. 예상한 바와 같이, 모든 크기의 분류로부터의 난모세포는 GDF9 mRNA를 발현하였다 (도 16). 그 PCR 생성물의 동일성을 서열분석에 의하여 확인하였다.

실험 2: GC에 의한 GDF9 신호전달 경로 분자의 발현

스몰 및 라지 안트랄 난포로부터의 GC가 핵심 GDF9 신호전달 경로 분자 (뼈 형태발생 단백질 수용체 II, ALK5 및 Smad 3)에 대한 mRNA를 발현하는지 여부를 결정하기 위하여 이 실험을 수행하였다. 모든 3개의 전사물에 대한 mRNA 발현을 스몰 및 라지 안트랄 난포 양쪽으로부터의 GC에서 검출하였다 (도 17). 모든 PCR 생성물을 서열분석하고, 그들에 상응하는 인간 서열에 대한 동질성을 나타내었다.

실험 3: Smad 세포내 신호전달 경로의 활성화

라지 안트랄 난포로부터의 GC가 TGF-β 및/또는 BMP 신호에 반응할 수 있는지 여부를 결정하기 위하여 이 실험을 수행하였다. 세포를 CAGA 또는 BRE 루시퍼라제 플라스미드 구조물로 트랜스펙션 시킨 후, TGF-β1, GDF9, BMP7 또는 난모세포로 처리하였다. CAGA-루시퍼라제 활성이 TGF-β1, 난모세포 및 GDF9으로 상기 대조군 수준보다 각각 19 배, 6배 및 5배 자극되었지만, BMP7에 의해서는 자극되지 않았다 (도 18A). 반대로, BRE-루시퍼라제 활성이 대조군 수준에 비해 BMP7에 의하여 31배 자극되었지만, TGF-β1, GDF9 또는 난모세포에 의해서 활성화되지 않았다 (도 19B).

실험 4: GDF9는 TGF-β신호전달 경로를 통하여 과립층 세포 증식을 자극한다:

다음으로, GDF9이 TGF-β/액티빈 신호전달 경로를 통하여 GC 증식을 촉진시키는 또 다른 증거를 제공하기 위하여, ALK 4/5/7 키나아제 억제제를 이용하였다. 억제제 SB431542는 특이적으로 ALK4, ALK5 및 ALK7의 키나아제 활성을 중화시키지만, ALK6의 활성에 영향을 미지지 않는다 (Inman 2002). SB431542는 마우스에서 TGF-β1, GDF9 및 난모세포 자극 벽 GC 성장을 용량 의존적으로 억제한다는 것을 이미 보여준바 있다. 이 연구에서, 라지 안트랄 난포로부터의 명주 원숭이 GC를 사용하여, GDF9에 의해 자극된 DNA 합성이 SB431542의 존재시에 용량 의존적으로 억제된다는 것을 또한 나타낸바 있다 (도 18). 1 μM 농도의 상기 키나아제 억제제는 GDF9의 자극 효과를 완전히 제거할 수 있다.

실험 5: 페리 안트랄 난포로부터의 벽 과립층 세포는 더 높은 분열유발(mitogenic) 인덱스를 가진다

이번 실험에서, GDF9의 성장 촉진 활성에 대한 반응을 위해 상이한 크기의 난포로부터의 벽 과립층 세포의 능력을 관찰하였다. 일반적으로, DNA 합성은 라지 난포로부터의 GC에서 가장 낮았고 (399 cpm/12,500 cells), 페리 안트랄 난포로부터의 GC에서 가장 높았다 (5936 cpm/12,500 cells) (도 19).

벽 과립층 세포 DNA 합성에 대한 GDF9 및 난포 크기의 효과:

도 20은 스몰 및 라지 안트랄 난포로부터의 벽 GC를 증가하는 용량의 GDF9 (0∼350 ng/ml)로 24시간 동안 처리한 것을 나타낸다. 그 배양 기간의 마지막에 ³H-티미딘 혼입을 측정하였다. 점은 7번의 반복 실험으로부터의 평균 cpm/12,500 세포 +/- SEM을 나타낸다.

벽 과립층 세포 DNA 합성에 대한 FSH 및/또는 IGF1과 조합시의 GDF9의 효과:

도 21은 벽 과립층 세포 DNA 합성에 대한 FSH 및/또는 IGF1과 조합시의 GDF9의 효과를 나타낸다. 스몰 (A) 또는 라지 (B) 안트랄 난포로부터의 벽 GC를 GDF9 (175 ng/ml), rhFSH (50 mIU/ml) 및 IGF-1 (25 ng/ml)과 함께 24시간 동안 배양하였다. 선은 7번의 반복 실험으로부터의 평균 cpm/12,500 세포 +/- SEM을 나타낸다.

벽 과립층 세포 DNA 합성에 대한 GDF9 +/- BMP15의 효과:

도 22는 벽 과립층 세포 DNA 합성에 대한 GDF9 +/- BMP15의 효과를 보여준다. 스몰 (A) 또는 라지 (B) 안트랄 난포로부터의 벽 GC를 GDF9 (175 ng/ml) 또는 BMP15 (10%) 단독 중 어느 하나 또는 상기 2가지의 조합과 함께 배양하였다. 선은 3번의 반복 실험으로부터의 평군 +/- SE를 나타낸다.

결론:

이 연구는 난모세포 분비 인자 GDF9이 영장류 과립층 세포 증식을 자극하는 분자적 기초의 특성을 나타낸다. 초기에서 후기 난포 발달까지, 명주 원숭이 CC 및 GC는 GDF9에 대한 반응을 위해 필요한 분자 성분을 가지고 있다. 사실, GDF9은 모든 난포 크기에서의 GC DNA 합성을 자극하지만, 작은 난포에서 가장 현저하고, 특히 IGF1와 상승효과가 있다. 명주원숭이 GC는 그들의 배란전의 분화로서 GDF9에 불응한다. GDF9은 TGF-β 신호전달 시스템의 성분을 이용하고 TGF-β 유사 세포내 반응을 유도함으로써 명주원숭이 GC 증식을 조절한다.

실시예 23

연구 IV - 난모세포 분비 인자는 난모세포 발달 능력을 향상시킨다.

재료 및 방법:

난모세포 수집 및 배양 조건

특별히 명시하지 않은 경우, 모든 화학물질과 시약은 시그마사(sigma; St Lois, MO)에서 구입하였다. 소 난소는 지역 도축장에서 수집하였고 따뜻한 생리식염수 (30∼35℃)에 담아 실험실로 이송하였다. COC는 안트랄 난포 (직경 3∼8 mm)로부터 흡입하였고, 이는 18 게이지 바늘과, 50 μg/ml 카나마이신, 0.5 mM 피루베이트 나트륨, 50 μg/ml 헤파린 및 4 mg/ml 지방산 없는 소 혈청 알부민 (FAF-BSA; ICPbio Ltd, Aukland, NZ)이 첨가된 흡입 배지 (Hepes-buffered Tissue Cultured Medium-199: TCM-199,ICN Biochemicals, Irvine, CA, USA) ∼2ml를 함유하는 10-ml 주사기를 사용하였다. ∼5개 세포층 이상과 균일하게 색소 침착된 세포질보다 큰 치밀한 더미 덮개를 가진 무손상 COCs를 해부현미경 하에서 수집하고, Hepes-buffered TCM-199에서 2번 세척하고, 10% 소태아혈청 (FCS) (Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 보충된 Hepes-TCM199에서 1번 세척하였다. 난모세포 성숙을 위한 기초 배지는 Bovine VitroMat (Cook Australia, Eight Mile Plain, Qld, Australia)으로서, 이는 소 난포액의 이온성 조성물을 기재로 하는 배지이다. 모든 IVM 처리에 0.1 IU/ml FSH (Puregon, Organon, Oss, Netherlands)를 보충하였다. 복합체를 광유와 함께 도포된 미리 평형이 유지된 300 l 드롭으로 배양하고, 5% 이산화탄소가 포함된 습윤 공기에서 24시간 동안 39℃로 배양하였다.

나화 난모세포의 생성

나화 난모세포(DO)를 2 ml Hepes-buffered TCM-199에서 ∼4분 동안 볼텍스 처리하여 COCs로부터 CCs를 제거함으로써 생성한다. 잔여 CCs를 Hepes-buffered TCM-199 내에서 난모세포를 불로 미세한 구멍이 뚫리게 제작한(fine-bore fire-polished) 유리 피펫을 여러 번 통과시킴으로써 제거한다.

성장 인자 및 길항제

재조합 마우스 GDF9과 재조합 양 BMP15는 O. Ritvos (University of Helsinki)에게 기증받은 트랜스펙션된 293 인간 배아 신장 세포주(293H)를 사용하여 이전에 보고된 방법대로 인하우스(in-house)에서 생산되고 부분적으로 정제되었다. 대조군 적응용 배지(이하에서 '293H'로 부름)를 트랜스펙션되지 않은 293H 세포로부터 제조하고, GDF9 및 BMP15 적응용 배지와 동일한 크로마토그래피 과정을 수행하였다.

그락소스미스클라인 (GlaxoSmithKline; Stevenage, UK)으로부터 기증받은 SB-431542는 경쟁적 ATP 결합 자리 키나아제 억제제로서 행동하며, 특히 액티빈 수용체 유사 키나아제 (ALKs) 4, 5 및 7의 활성을 중화시키지만, ALKs 1, 2, 3 또는 6 또는 기타의 세포 키나아제의 활성에 영향을 주지 않는다. 따라서, SB-431542는 BMP 신호전달에 영향 없이 ALK 4/5 리간드; TGF-β1, 액티빈 및 GDF9를 강력하게 중화시킨다 (Inman et al., 2002; Gilchrist et al., 2006). 우리는 과립층 세포에서 고유 OSFs 및 GDF9의 성장 촉진 작용 SB-431542가 완전히 중화시킨다는 것을 최근 증명한 바 있다. 폴리스타틴-288을 S. Shimasaki (University of California San Diego, USA)로부터 기증받았고, 우리는 이 결합 단백질이 CC에서 고유 OSFs 및 재조합 BMP15의 생활성을 중화시킨다는 것을 이미 보고한 바 있다.

시험관 내 수정 및 배아 배양

배아의 시험관 내 생산을 규정된 혈청이 없는 배지 (Bovine Vitro series of media, Cook Australia)를 사용하여 수행하였다. 수정능력이 증명된 동일한 수컷 황소로부터의 동결 정액을 사용하여 모든 실험을 수행하였다. 요약하면, 해동된 정액을 불연속 (45%: 90%) 페르콜 구배 (Percoll gradient; Amersham Bioscience) 위에 도포하고, 실온에서 20∼25분 동안 700 g로 원심분리 (RT)시켰다. 상청액을 제거하고, 그 정액 펠릿을 500 μl Bovine Vitro Wash (Cook Australia, Eight Mile Plains, Qld, Australia)로 세척한 후, 200 g로 5분 동안 추가로 원심분리시켰다. 정자를 IVF 배지 (Bovine Vitro Fert, Cook Australia)에 재현탁한 후, 수정 배지 드롭 (Bovine Vitro Fert, Cook Australia, 0.01 mM 헤파린, 0.2 mM 페니실아민 및 0.1 mM 히포타우린으로 보충됨)에 최종 농도 1 x 10⁶ 정자/ml으로 첨가하였다. COC를 6% CO₂ 함유 습윤 공기에서 24 시간동안 39℃에서, COC당 10 μl IVF 배지의 배지 밀도에서 수정시켰다.

수정 후 23∼24 시간에 온화한 피펫팅으로 CC를 제거하고, 5개의 추정되는 접합체(zygotes)를 미리 평형화된 Cook Bovine Cleave medium (modified SOFaa, Cook Australia) 20 μl 드롭으로 전달시키고, 38.5℃의 광유에서 7% O₂, 6% CO₂, 평형 N2 하에서 5일 동안 (1일째 내지 5일째) 배양하였다.

5일째에, 배아를 광유로 도포된 38.5℃의 미리 평형화된 Bovine Vitro Blast (Cook Bovine Blast medium; Cook Australia)의 20 μl 드롭에 5∼6개의 그룹으로 전달하고, 8일째까지 배양하였다. 8일째에 국제 배아 전달 학회의 매뉴얼에 기재된 정의에 따라 배아의 질을 각각 평가하고, 숙련된 소 발생학자에 의한 블라인드 테스트를 하였다.

분별 염색

세포 계수를 문헌 [Fouladi-Nashta et al., 2005]에 기재된 기술의 변형된 버전을 사용하여 수행하였다. 요약하면, 확대된/부화된(expanded/hatched) 포배를 산 티로이드 용액(acid Tyrode's solution) 속에 위치시켜 조나(zona)를 제거한 후, 인산염 완충 식염수 (PBS/PVA) 중의 4 mg mL-1 폴리-비닐 알콜 (PVA)로 간단히 세척하였다. 그 후, 조나(zona)가 없는 배아를 4℃에서 10분 동안 PBS/PVA 중의 10 mM 트리니트로벤젠 술폰산 (TNBS)에서 배양하였다. 다음으로, 배아를 이어서 0.1 mg mL-1 항디니트로페놀-BSA 항체 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)와 함께 37℃에서 10분 동안 배양하였다. 기니피그 보체를 사용한 보체 매개 용해에 이어서, 배아를 세척하고, 10 μg mL-1 요오드화 프로피디움에서 37℃에서 20분간 배양한 후, 100% 에탄올 중의 4 μg mL-1 비스펜지미드 (Hoechst 33342; Sigma-Aldrich)로 4℃에서 밤새 배양하였다 (속세포덩이 (ICM) 및 트로펙토덤(trophectoderm) 양쪽 모두 염색됨). 그 후, 배아를 현미경 슬라이드 위에 PBS 중의 80% 글리세롤 드롭 내로 올리고, 커버슬립을 매니큐어(nail polish)로 밀봉하였다. 그 후, 배아를 전체 세포 및 구획 세포 수를 측정하기 위해 부착된 자외선 필터 및 디지털 카메라가 장착된 400x의 형광 현미경 하에서 조사하였는데, 여기서, 속세포덩이 (ICM) 핵이 청색이고, 트로펙토덤 (TE) 핵이 핑크색으로 염색된다.

실험 1: 이후의 발달 능력에 대한 IVM 동안의 무손상 COC의 DO와의 공동배양의 효과

난모세포 발달 능력에 대한 고유 OSFs의 효과를 측정하기 위하여, COC를 IVM 동안 2개의 처리 군으로 무작위로 할당하였다; 처리 (1) 30개의 COC를 24 시간 동안 300 μl 드롭에서 배양함, 처리 (2) 30개의 COC를 300 μl 드롭에서 0∼24 시간에 150개 DO와 함께 공동 배양함, 그 후 그 30개의 복합체를 제거하고 수정시킴 (도 24). 처리 2는 10 μl 드롭에서 1 COC 대 5 DO의 비율을 나타내며, OSF의 영향을 조사하기 위해 요구되는 범위 내인 0.5 DO/μl의 농도이다. IVM 후에, 모든 복합체를 수정시키고, 8일째에 포배 형성의 수 및 질을 조사하였다. 6번의 반복 실험을 수행하였다.

실험 2: 난모세포 발달 능력에 대한 IVM 중의 BMP15 및/또는 GDF9의 효과

IVM 동안 외인성 재조합 OSFs, GDF9 및/또는 BMP15의 추가가 이후의 난모세포 발달 능력을 향상시키는지 여부를 측정하기 위해 이 실험을 수행하였다. COC를 다음의 첨가 처리, 즉 1) 없음 (대조군) 2) 175 ng/ml GDF9, 3) 10% v/v BMP15, 4) 10% v/v BMP15 및 175 ng/ml GDF- 9, 및 5) 10% v/v 293H를 하여 전술한 기초 IVM 배지에서 24시간 동안 배양하였다. IVM 후에, 모든 복합체를 수정시키고, 8일째에 포배 형성의 수 및 질을 조사하였다. 각 반복 실험당 처리 군 마다 50개의 COC를 사용하여 4번의 반복 실험을 수행하였다.

실험 3 & 4: 난모세포 발달 능력에 대한 GDF9 또는 BMP15 길항제의 효과.

이 실험의 목적은 (1) 이후의 발달에 대하여 무손상 COC 내의 난모세포에 의해 분비되는 GDF9 또는 BMP15를 억제하는 효과의 조사와, (2) 이들 조제물이 순수하지 않은 경우, COC에 대한 재조합 OSF의 효과를 특이적으로 중화시키기 위함의 두 가지였다. COC를 4 μM SB-431542 (GDF9 길항제)의 존재 또는 부존재하에서, 단독으로 또는 175 ng/ml GDF9 또는 10% v/v 293H와 함께 배양하였다. 다른 실험에서, COC를 IVM 동안 10 μg/ml 폴리스타틴-288의 존재 또는 부존재 하에서 단독으로 또는 10% v/v BMP15 또는 10% v/v 293H와 함께 배양하였다. IVM 후에, 모든 복합체를 수정시키고, 8일째에 포배 형성의 수 및 질을 조사하였다. 각 반복 실험당 처리 군 마다 60개의 COC를 사용하여 3번의 반복 실험을 수행하였다.

통계적 분석

모든 반복된 비례적 발달 데이터를 분석 전에 아크-사인 변환시켰다. SigmaStat software (SPSS Inc, Chicago, IL)를 사용하는 ANOVA에 의한 통계적 분석을 수행하고, 다중 평균의 비교를 위해 터키-크라머 포스트-혹 테스트(Tukey-Kramer post-hoc test)를 사용하여 평균값 사이의 유의적인 차이를 측정하였다. 차이는 p< 0.05에서 통계적 유의성으로 고려되었다.

결과:

DO로부터의 고유 OSF에 대한 무손상 COC의 노출은, COC 단독으로 배양한 경우 (39%)와 비교하여 수정 후 포배기에 도달하는 난모세포의 비율 (51%)을 유의적으로 증가시켰다 (P<0.001). 더욱이, 생겨나는 포배의 세포 개수는 대조군 COC와 비교하여 더 많은 전체 및 트로펙토덤 세포 수로 유의적으로 (P<0.05) 증가하였다. 그러나, 난모세포의 분열은 IVM 동안의 OSF에 노출에 의하여 유의적으로 영향을 받지 않았다 (P>0.05).

실험 2: 난모세포 발달 능력에 대한 IVM 동안의 BMP15 및/또는 GDF9의 효과

성숙 COC에 BMP15의 첨가는 대조군 COC와 비교하여 16% 또는 293H-처리 COC와 비교하여 30%까지 그들의 포배기로의 발달을 극적으로 향상시켰다 (P<0.05). 293H 모세포주로부터의 적응용 배지는 난모세포 발달 능력에 역으로 영향을 주어 대조군 COC에 비하여 포배율을 14% 까지 저하시켰다 (P<0.001). GDF9은 또한 293H-처리 COC에 비하여 포배 수율을 증가시켰지만 (P<0.05), COC 단독 배양과 비교하여서는 그렇지 않았다. BMP15 단독의 경우를 넘는 GDF9의 포배율에 대한 추가적인 효과는 없었다. 난모세포의 분열은, 비록 293H 대조군 적응용 배지에 노출된 경우 비율이 특히 낮아졌지만, 처리 군에 의하여 유의적으로 영향을 받지는 않았다.

실험 3 & 4: 난모세포 발달 능력에 대한 GDF9 또는 BMP15 길항제의 효과

전술한 실험 2에서 관찰된 분열율에 대한 IVM 동안 293H 첨가의 역효과가 이번 2가지 실험에서도 관찰되었다; 대조군으로부터의 차이는 유의적이었다 (2-웨이 ANOVA, p<0.05; 도 25A 및 26A). ALK 4/5/7 억제제인 GDF9 길항제, SB-431542는 난모세포의 분열율에 영향을 미치지 않았다 (p>0.05; 도 25A). 반대로, 폴리스타틴으로의 COC의 처리는, BMP15 처리와 무관하게, 난모세포 분열율을 유의적으로 감소시켰다 (폴리스타틴, 71.8 ± 1.3; 대조군, 76.2 ± 1.3; p=0.007; 도 26A). 실험 2와 마찬가지로, GDF9과 함께 COC의 처리는, 폴리스타티의 효과와 독립적으로, 대조군과 비교한 분열율을 유의적으로 변경시키지 않았고, BMP15로의 처리의 경우와도 마찬가지였다 (도 25A 및 26A).

SB-431542 또는 폴리스타틴으로 대조군 COC의 처리는 포배 발달을 비처리 COC에 비해 유의적으로 (P<0.05) 감소시켰는데, 이는 이들 길항제가 난모세포에 의하여 분비되는 내인성 GDF9 또는 BMP15의 효과를 각각 적어도 부분적으로 중화시킬수 있다는 것을 제안한다 (도 2B & 3B). 실험 2와 마찬가지로, 이번 실험에서 (도 25A 및 26A), 외인성 GDF9 및 BMP15 양쪽 모두는 포배 수율을 증가시키고 (P<0.05), 이러한 증가는 그들 각각의 길항제의 첨가에 의하여 제거되었다. SB-431542 또는 폴리스타틴의 첨가는 무처리 대조군 COC의 수준까지 포배 발달을 감소시킬 뿐만 아니라, 길항제로 처리한 대조군 COC의 수준까지 난포율을 더 억제하였다 (도 25B & 26B). 이것은 SB-431542 및 폴리스타틴이 난모세포의 발달 능력에 대한 외인성 및 내인성 GDF9 또는 BMP15 양쪽 모두의 효과를 중화시킨다는 것을 제안한다. SB-431542 또는 폴리스타틴의 첨가 여부와 무관하게, 293H로 성숙된 COC로부터의 포배 발달율은 실질적으로 감소하였다 (P<0.05) (도 25B & 26B).

실시예 24

연구 V - 난모세포의 시험관 내 성숙 동안의 외인성 GDF9는 이후의 배아 발달 및 태아 생성을 향상시킨다.

배아의 생존은 그 배아가 유도되는 난모세포의 발달 능력에 의존한다. 최근, 난모세포와 그의 체세포의 이방향성 조절 루프 (bi-directional regulatory loof)의 존재 및 필수성 점점더 명확해지고 있다. 이 실험의 목적은 이후의 배아 및 태아 발달에 대한 마우스 난모세포 시험관 내 성숙 동안에 첨가된 난모세포 측분비 인자 성장 분화 인자 9 (GDF9)의 효과를 평가하기 위한 것이었다. eCG 46시간 후에, COC를 조숙(pre-puberty) 마우스 (CBAxC57BL＼6 하이브리드)의 안트랄 난포로부터 흡입하고, 50 mIU/ml FSH / 10 ng/ml EGF, 재조합 마우스 GDF9 (200ng/ml) 또는 등가 v/v 대조군 모세포주 293H 적응용 배지와 함께 또는 이들 없이 37℃에서 6% CO₂, 5% O₂의 웨이마우스 배지(Waymouth's medium) + 5% FCS에서 17시간 동안 성숙시켰다. 그 후, 난모세포 (n=1106)를 수정시키고, 37℃, 6% CO₂, 5% O₂의 G1.2/G2.2 배지에서 포배기까지 배양하였다. 포배를 모으고, 가임신 스위스 암컷(pseudo-pregnant Swiss females)으로 전달시키거나 또는 차별적으로 염색하였다. 임신 15일째에 임신율을 평가하였다.

GDF9의 효과는 FSH/EGF의 존재에 의존하였다. FSH/EGF로 GDF9는 더미 확장을 증가시켰다 (3.1±0.1 더미 확장 지수 대 2.4±0.1; P<0.05). 하지만, 수정, 발달 또는 포배율의 백분률 (83% vs 75%)에 있어서 GDF9의 유의적인 효과는 없었다. GDF9은 트로펙토덤 세포 수 (P=0.07)에 비해 포배 속세포덩이 (P=0.003)에서의 더 큰 차이로 포배 총 세포수 (P=0.05)를 유의적으로 증가시켰다. 따라서, 이식(implantation)은 영향을 받지 않았지만 (83% 대 77%), 태아 발달은 GDF9의 첨가로 거의 2배가 되었다 (39% 대 21%; P=0.04).

이러한 연구는 FSH/EGF의 존재하에서, IVM 동안 외인성 GDF9는 포배의 질 및 이후의 태아 생존을 향상시킨다는 것을 증명한다. 이러한 발견은 적절한 난모세포-체세포 상호작용의 중요성을 강조하고, 또한 IVM 난모세포의 손상된 발달 능력이 GDF9 결핍에 부분적으로 기인할 수 있기 때문에 IVM 배양 배지의 개발을 위한 중요한 암시를 가진다.

마지막으로, 전술한 본 발명의 방법 및 조성물의 다양한 변형 및 변화가 본 발명의 범위와 사상에서 벗어남이 없이 당해 기술분야의 숙련자에게 명백하다는 것이 이해될 것이다. 비록, 본 발명을 특정의 바람직한 실시상태와 관련하여 설명하였지만, 청구되는 본 발명은 그러한 특정의 실시상태에 과도하게 한정되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 사실, 본 발명을 실시하기 위한 전술한 방식에 대한 당해 기술분야의 숙련자에게 명백한 다양한 변형이 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims

다음의 단계들 중 한 가지 이상 단계를 포함하는 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는 방법:

(i) 과립층 세포가 노출되는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절하는 단계;

(ii) 과립층 세포 내에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계; 및

(iii) 과립층 세포 내에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 과립층 세포의 세포자멸사는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 증가된 농도 및/또는 활성에 과립층 세포를 노출시킴으로써 억제되는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 과립층 세포의 세포자멸사는 BMP-15 및/또는 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제에 과립층 세포를 노출시킴으로써 억제되는 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 제제는 ALK6 및/또는 BMPRII 수용체 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 것인 방법.
제2항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 세포자멸사의 억제는 난모세포 성숙 및/또는 발달 능력을 촉진시키는 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 과립층 세포는 시험관 내 난모세포 더미 복합체(cumulus oocyte complex) 내의 과립층 세포인 것인 방법.
제2항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 과립층 세포는 생체 내의 과립층 세포인 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 세포자멸사의 억제는 여성 대상체에서의 수정능력을 촉진시키는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 과립층 세포의 세포자멸사는 과립층 세포가 노출되는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 감소시키는 제제에 과립층 세포를 노출시킴으로써 촉진되는 것인 방법.
제1항 또는 제9항에 있어서, 상기 과립층 세포의 세포자멸사는 BMP-15 및/또는 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 감소시키는 제제에 과립층 세포를 노출시킴으로써 촉진되는 것인 방법.
제10항에 있어서, 상기 제제는 ALK6 및/또는 BMPR11 수용체 신호전달 경로의 활성을 감소시키는 것인 방법.
제9항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 과립층 세포는 생체 내의 과립층 세포인 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 세포자멸사의 억제는 여성 대상체에서의 수정능력을 감소시키는 것인 방법.
다음의 단계들 중 한 가지 이상의 단계를 포함하는 여성 대상체의 난모세포 성숙 및/또는 난포 성숙과 관련된 질병 또는 상태의 예방 및/또는 치료 방법:

(i) 상기 대상체에서의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포가 노출되는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절함으로써 조절하는 단계;

(ii) 상기 대상체에서의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포 내에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 조절하는 단계; 및

(iii) 상기 대상체에서의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포 내에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 조절하는 단계.
다음의 단계들 중 한 가지 이상의 단계를 포함하는 난모세포의 성숙을 조절 하는 방법:

(i) 난모세포와 연관된 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포가 노출되는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절함으로써 조절하는 단계;

(ii) 난모세포와 연관된 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 조절하는 단계; 및

(iii) 난모세포와 연관된 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 조절하는 단계.
다음의 단계들 중 한 가지 이상의 단계를 포함하는 난모세포의 발달 능력을 조절하는 방법:

(i) 난모세포와 연관된 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포가 노출되는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절함으로써 조절하는 단계;

(ii) 난모세포와 연관된 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 조절하는 단계; 및

(iii) 난모세포와 연관된 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 조절하는 단계.
다음의 단계들 중 한 가지 이상의 단계를 포함하는 난모세포로부터 생성된 배아의 발달 능력을 조절하는 방법:

(i) 난모세포와 연관된 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포가 노 출되는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절함으로써 조절하는 단계;

(ii) 난모세포와 연관된 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 조절하는 단계; 및

(iii) 난모세포와 연관된 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 조절하는 단계.
다음의 단계들 중 한 가지 이상의 단계를 포함하는 난포의 성숙을 조절하는 방법:

(i) 난포 내의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포가 노출되는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절함으로써 조절하는 단계;

(ii) 난포 내의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 조절하는 단계; 및

(iii) 난포 내의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 조절하는 단계.
다음의 단계들 중 한 가지 이상의 단계를 포함하는 난포의 폐쇄를 조절하는 방법:

(i) 난포 내의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포가 노출되는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절함으로써 조절하는 단계;

(ii) 난포 내의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 조절하는 단계; 및

(iii) 난포 내의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 조절하는 단계.
다음의 단계들 중 한 가지 이상의 단계를 포함하는 난포의 발달을 조절하는 방법:

(i) 난포 내의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포가 노출되는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절함으로써 조절하는 단계;

(ii) 난포 내의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 조절하는 단계; 및

(iii) 난포 내의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 조절하는 단계.
다음의 단계들 중 한 가지 이상의 단계를 포함하는 여성 대상체에서 배란율(ovulation rate)을 조절하는 방법:

(i) 대상체에서의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포가 노출되는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절함으로써 조절하는 단계;

(ii) 대상체에서의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 조절하는 단계; 및

(iii) 대상체에서의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 조절하는 단계.
다음의 단계들 중 한 가지 이상의 단계를 포함하는 여성 대상체의 수정능력을 조절하는 방법:

(i) 대상체의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포가 노출되는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절함으로써 조절하는 단계;

(ii) 대상체의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 조절하는 단계; 및

(iii) 대상체의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 조절하는 단계.
다음의 단계들 중 한 가지 이상의 단계를 포함하는 동결-해동에 기인한 과립층 세포의 세포자멸사를 감소시키는 방법:

(i) 과립층 세포가 노출되는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절하는 단계;

(ii) 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계; 및

(iii) 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계.
동결-해동에 의한 난모세포 더미 복합체(cumulus oocyte complex), 난포, 난소 조직 또는 난소에 대한 손상을 감소시키는 방법으로서, 상기 난모세포 더미 복합체, 난포, 난소 조직 또는 난소를 다음 중의 한 가지 이상에 노출시키는 단계를 포함하는 방법:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6의 유효량;

(ii) 난모세포 더미 복합체, 난포, 난소 조직 또는 난소 내의 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 제제의 유효량; 및

(iii) 난모세포 더미 복합체, 난포, 난소 조직 또는 난소 내의 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 제제의 유효량.
다음 중 한 가지 이상을 포함하는 과립층 세포의 세포자멸사를 감소시키는데 사용되는 조성물:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6의 유효량;

(ii) 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 제제의 유효량; 및

(iii) 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 제제의 유효량.
다음 중 한 가지 이상을 포함하는 난모세포 더미 복합체 배양 배지:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6의 유효량;

(ii) 난모세포 더미 복합체 또는 난포 내의 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제의 유효량; 및

(iii) 난모세포 더미 복합체 또는 난포 내의 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제의 유효량.
다음 중 한 가지 이상을 포함하는 난모세포 시험관 내 성숙 배지:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6의 유효량;

(ii) 난모세포와 연관된 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제의 유효량; 및

(iii) 난모세포와 연관된 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제의 유효량.
다음 중 한 가지 이상을 포함하는 난모세포 및/또는 난포 배양 배지:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6의 유효량;

(ii) 난모세포와 연관된 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제의 유효량; 및

(iii) 난모세포와 연관된 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제의 유효량.
제28항에 있어서, 상기 배지는 난모세포의 발달 능력을 향상시키기 위해 사 용되는 것인 배지.
제26항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 배지는 혈청, 알부민, 난포액, 피투인(fetuin), 난포자극호르몬(FSH) 및 항세포자멸사 성장 인자(anti-apoptotic growth factors)가 실질적으로 없는 것인 배지.
제26항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 배지는 40 mM∼400 mM NaCl, 0.1 mM∼20 mM KCl 및 0.1 mM∼40 mM 글루코스를 더 포함하는 것인 배지.
다음 중 한 가지 이상을 포함하는 여성 대상체의 배란율을 조절하기 위해 사용되는 조성물:

(i) 상기 대상체에서의 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는데 유효한 양의 BMP-15 및/또는 BMP-6;

(ii) 상기 대상체에서의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 조절하는데 유효한 양의 제제; 및

(iii) 상기 대상체에서의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 조절하는데 유효한 양의 제제.
다음 중 한 가지 이상을 포함하는 여성 대상체에서의 각각의 난소 또는 월경 주기를 성숙시키는 난포의 수를 조절하는 데 사용되는 조성물:

(i) 대상체에서의 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는데 유효한 양의 BMP-15 및/또는 BMP-6;

(ii) 대상체에서의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 조절하는데 유효한 양의 제제; 및

(iii) 대상체에서의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 조절하는데 유효한 양의 제제.
다음 중 한 가지 이상을 포함하는 여성 대상체에서의 수정능력을 조절하기 위해 사용되는 조성물:

(i) 대상체에서의 과립층 세포의 세포자멸사를 조절하는데 유효한 양의 BMP-15 및/또는 BMP-6;

(ii) 대상체에서의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 조절하는데 유효한 양의 제제; 및

(iii) 대상체에서의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 조절하는데 유효한 양의 제제.
다음 중 한 가지 이상을 포함하는 조성물 또는 배지:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6;

(ii) 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 억제하는 제제; 및

(iii) 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 억제하는 제제;

여기서, 상기 조성물은 40 mM∼400 mM NaCl, 0.1 mM∼20 mM KCl 및 0.1 mM∼40 mM 글루코스를 더 포함한다.
다음 중 한 가지 이상을 포함하는 동결-해동에 의한 과립층 세포의 세포자멸사를 감소시키는 데 사용되는 조성물:

(i) 활성 BMP-15 및/또는 활성 BMP-6;

(ii) 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제; 및

(iii) 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제.
다음 중 한 가지 이상을 포함하는 동결에 의한 난모세포 더미 복합체, 난포, 난소 조직 또는 난소에 대한 손상을 감소시키기 위해 사용되는 조성물:

(i) 활성 BMP-15 및/또는 활성 BMP-6의 유효량;

(ii) 난모세포 더미 복합체, 난포, 난소 조직 또는 난소 내의 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제의 유효량; 및

(iii) 난모세포 더미 복합체, 난포, 난소 조직 또는 난소 내의 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제의 유효량.
난모세포를 필요로 하는 보조 생식의 방법으로서, 다음 성분들 중 한 가지 이상의 성분을 포함하는 배지 내에서 상기 난모세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6;

(ii) 난모세포와 연관된 하나 이상의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 하나 이상의 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 억제하는 제제; 및

(iii) 난모세포와 연관된 하나 이상의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 하나 이상의 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 억제하는 제제.
난모세포의 시험관 내 수정 방법으로서, 다음 성분들 중 한 가지 이상의 성분을 포함하는 배지 내에서 상기 난모세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6;

(ii) 난모세포와 연관된 하나 이상의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 하나 이상의 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 억제하는 제제; 및

(iii) 난모세포와 연관된 하나 이상의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 하나 이상의 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 억제하는 제제.
난모세포로부터 생성되는 배아를 필요로 하는 보조 생식의 방법으로서, 다음 성분들 중 한 가지 이상의 성분을 포함하는 배지 내에서 상기 난모세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법:

(i) BMP-15 및/또는 BMP-6;

(ii) 난모세포와 연관된 하나 이상의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 하나 이상의 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 억제하는 제제; 및

(iii) 난모세포와 연관된 하나 이상의 과립층 세포의 세포자멸사를 상기 하나 이상의 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절함으로써 억제하는 제제.
다음의 단계들을 포함하는 난모세포의 발달 능력(developmental competence)의 평가 방법:

(i) 난모세포와 연관된 과립층 세포에서의 세포자멸사의 정도를 측정하는 단 계; 및

(ii) 난모세포와 연관된 과립층 세포에서 발견된 세포자멸사의 정도에 의하여 난모세포의 발달 능력을 평가하는 단계.
다음의 단계들을 포함하는 난모세포의 발달 능력의 평가 방법:

(i) 난모세포와 연관된 과립층 세포에서의 세포자멸사의 정도를 측정하는 단계; 및

(ii) 난모세포와 연관된 과립층 세포에서 발견된 세포자멸사의 정도에 의하여 난모세포의 발달 능력을 평가하는 단계;

여기서, 세포자멸사 수준의 감소는 발달 능력이 증가된 난모세포를 나타내고, 세포자멸사 수준의 증가는 발달 능력이 감소된 난모세포를 나타낸다.
다음 단계들을 포함하는 난모세포의 발달 능력의 평가 방법:

(i) 난모세포와 연관된 과립층 세포가 노출된 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성 중 하나 이상을 측정하는 단계; 난모세포와 연관된 과립층 세포에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성의 수준을 측정하는 단계; 및 난모세포와 연관된 과립층 세포에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성의 수준을 측정하는 단계; 및

(ii) 상기 측정의 결과에 의하여 난모세포의 발달 능력을 평가하는 단계;

여기서, BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성의 증가, 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6 의존 신혼전달 경로의 활성의 증가는 발달 능력이 증가된 난모세포를 나타내고, BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성의 감소, 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6 의존 신혼전달 경로의 활성의 감소는 발달 능력이 감소된 난모세포를 나타낸다.
다음 단계들을 포함하는 난모세포의 발달 능력의 평가 방법:

(i) 난모세포에서 BMP-15 및/또는 BMP-6의 발현 수준을 측정하는 단계 및/또는 난모세포에 의하여 분비되는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도를 측정하는 단계; 및

(ii) 상기 난모세포의 발달 능력을 평가하는 단계;

여기서, BMP-15 및/또는 BMP-6의 발현 및/또는 농도의 증가는 발달 능력이 증가된 난모세포를 나타내고, BMP-15 및/또는 BMP-6의 발현 및/또는 농도의 감소는 발달 능력이 감소된 난모세포를 나타낸다.
다음 단계들 중 한 가지 이상의 단계를 포함하는 난모세포의 발달 능력의 조절 방법:

(i) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미가 노출되는 난모세포 분비 인자(oocyte secreted factors)의 농도 및/또는 활성을 조절하는 단계;

(ii) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절하는 단계;

(iii) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 GDF-9 의존 신 호전달 경로의 활성을 조절하는 단계;

(iv) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계; 및

(v) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계.
다음 단계들 중 한 가지 이상의 단계를 포함하는 난모세포를 필요로 하는 보조 생식 방법:

(i) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미가 노출되는 난모세포 분비 인자의 농도 및/또는 활성을 조절하는 단계;

(ii) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절하는 단계;

(iii) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 GDF-9 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계;

(iv) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계; 및

(v) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계.
다음 단계들 중 한 가지 이상의 단계를 포함하는 난모세포의 시험관 내 수정 방법:

(i) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미가 노출되는 난모세포 분비 인자의 농도 및/또는 활성을 조절하는 단계;

(ii) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절하는 단계;

(iii) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 GDF-9 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계;

(iv) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계; 및

(v) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계.
다음 단계들 중 한 가지 이상의 단계를 포함하는, 난모세포로부터 생성된 배아를 필요로 하는 보조 생식 방법:

(i) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미가 노출되는 난모세포 분비 인자의 농도 및/또는 활성을 조절하는 단계;

(ii) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절하는 단계;

(iii) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 GDF-9 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계;

(iv) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계; 및

(v) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계.
다음 단계들 중 한 가지 이상의 단계를 포함하는 난모세포 성숙의 조절 및/또는 난모세포 질(quality)의 조절 방법:

(i) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미가 노출되는 난모세포 분비 인자의 농도 및/또는 활성을 조절하는 단계;

(ii) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절하는 단계;

(iii) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 GDF-9 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계;

(iv) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계; 및

(v) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계.
다음 중 한 가지 이상을 포함하는 난모세포의 발달 능력을 향상시키는 데 사용되는 조성물:

(i) 1개 이상의 추가의 나화 난모세포;

(ii) 1개 이상의 난모세포 분비 인자;

(iii) GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6 또는 이들의 변이체 또는 유사체;

(iv) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 GDF-9 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제;

(v) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제; 및

(vi) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제.
다음 중 한 가지 이상을 포함하는 난모세포 배양 배지:

(i) 1개 이상의 추가의 나화 난모세포;

(ii) 1개 이상의 난모세포 분비 인자;

(iii) GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6 또는 이들의 변이체 또는 유사체;

(iv) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 GDF-9 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제;

(v) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제; 및

(vi) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제.
제51항에 있어서, 상기 배지는 난모세포의 시험관 내 성숙에 있어서 난모세포의 발달 능력의 향상을 위해서 및/또는 난모세포의 질의 향상을 위해서 사용되는 것인 배지.
난모세포를 필요로 하는 보조 생식 방법으로서, 다음 중 한 가지 이상을 포함하는 배지에서 난모세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법:

(i) 1개 이상의 나화 난모세포;

(ii) 1개 이상의 난모세포 분비 인자;

(iii) GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6 또는 이들의 변이체 또는 유사체;

(iv) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 GDF-9 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제;

(v) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제; 및

(vi) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제.
난모세포의 시험관 내 성숙 방법으로서, 다음 중 한 가지 이상을 포함하는 배지에서 난모세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법:

(i) 1개 이상의 나화 난모세포;

(ii) 1개 이상의 난모세포 분비 인자;

(iii) GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6 또는 이들의 변이체 또는 유사체;

(iv) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 GDF-9 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제;

(v) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제; 및

(vi) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제.
다음 단계들 중 한 가지 이상의 단계를 포함하는 난모세포로부터 생성되는 배아의 발달 또는 발달 능력의 향상 방법:

(i) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미가 노출되는 난모세포 분비 인자의 농도 및/또는 활성을 조절하는 단계;

(ii) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절하는 단계;

(iii) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 GDF-9 의존 신 호전달 경로의 활성을 조절하는 단계;

(iv) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계; 및

(v) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계.
다음 단계들 중 한 가지 이상의 단계를 포함하는 배아의 발달 또는 발달 능력의 향상 방법:

(i) 배아가 노출되는 난모세포 분비 인자의 농도 및/또는 활성을 조절하는 단계;

(ii) 배아가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절하는 단계;

(iii) 배아에서의 GDF-9 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계;

(iv) 배아에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계; 및

(v) 배아에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계.
배아를 필요로 하는 보조 생식 방법으로서, 다음 중 한 가지 이상을 포함하는 배지에서 배아를 배양하는 단계를 포함하는 방법:

(i) 1개 이상의 나화 난모세포;

(ii) 1개 이상의 난모세포 분비 인자;

(iii) GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6 또는 이들의 변이체 또는 유사체;

(iv) 배아에서의 GDF-9 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제;

(v) 배아에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제; 및

(vi) 배아에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제.
다음 단계들 중 한 가지 이상의 단계를 포함하는 배아가 포배 단계로 진행할 가능성을 증가시키는 방법.

(i) 배아가 노출되는 난모세포 분비 인자의 농도 및/또는 활성을 조절하는 단계;

(ii) 배아가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 조절하는 단계;

(iii) 배아에서의 GDF-9 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계;

(iv) 배아에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계; 및

(v) 배아에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계.
다음 단계들을 포함하는 난모세포의 발달 능력의 평가 방법:

(i) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성을 측정하는 단계; 및/또는

(ii) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 GDF-9 의존 신호 전달 경로의 활성을 측정하는 단계; 및/또는

(iii) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 측정하는 단계; 및/또는

(iv) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 측정하는 단계; 및/또는

(v) 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성, 및/또는 상기 난모세포 또는 세포 더미에서의 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성에 의하여 난모세포의 발달 능력을 평가하는 단계;

여기서, 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성의 증가, 및/또는 상기 난모세포 및/또는 세포 더미에서의 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6 의존 신혼전달 경로의 활성의 증가는 발달 능력이 증가된 난모세포를 나타내고, 난모세포 및/또는 난모세포와 연관된 세포 더미가 노출되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도 및/또는 활성의 감소, 및/또는 상기 난모세포 및/또는 세포 더미에서의 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6 의존 신혼전달 경로의 활성의 감소는 발달 능력이 감소된 난모세포를 나타낸다.
다음 단계들을 포함하는 난모세포의 발달 능력의 평가 방법:

(i) 난모세포에서의 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 발현 수준을 측 정 및/또는 난모세포에 의하여 분비되는 GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 농도를 측정하는 단계; 및

(ii) 난모세포의 발달 능력을 평가하는 단계;

여기서, GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 발현 및/또는 농도의 증가는 발달 능력이 증가된 난모세포를 나타내고, GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6의 발현 및/또는 농도의 감소는 발달 능력이 감소된 난모세포를 나타낸다.
다음 중 한 가지 이상을 포함하는 배아의 발달 및/또는 발달 능력을 향상시키기 위해 사용되는 조성물:

(i) 1개 이상의 추가적인 나화 난모세포;

(ii) 1개 이상의 난모세포 분비 인자;

(iii) GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6 또는 이들의 변이체 또는 유사체;

(iv) 배아에서의 GDF-9 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제;

(v) 배아에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제; 및

(vi) 배아에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제.
다음 중 한 가지 이상을 포함하는 배아 배양 배지:

(i) 1개 이상의 추가적인 나화 난모세포;

(ii) 1개 이상의 난모세포 분비 인자;

(iii) GDF-9 및/또는 BMP-15 및/또는 BMP-6 또는 이들의 변이체 또는 유사체;

(iv) 배아에서의 GDF-9 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제;

(v) 배아에서의 BMP-15 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제; 및

(vi) 배아에서의 BMP-6 의존 신호전달 경로의 활성을 증가시키는 제제.
제62항에 있어서, 상기 배지는 배아의 발달 능력을 향상시기키 위해 또는 배아가 포배 단계로 진행할 가능성을 증가시키기 위해 사용되는 것인 배지.
다음 단계들 중 한 가지 이상의 단계를 포함하는 난모세포 더미 복합체의 확장을 조절하는 방법:

(i) 난모세포 더미 복합체가 노출되는 TGF-β1, GDF-9, BMP-15 및 액티빈 중 하나 이상의 농도 및/또는 활성을 조절하는 단계; 및

(ii) 난모세포 더미 복합체에서의 ALK4, ALK5 및 ALK7 수용체 중 하나 이상에 의하여 매개되는 신호전달 경로의 활성을 조절하는 단계.
다음 중 한 가지 이상을 여성 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 여성 대상체에서의 배란을 조절하는 방법:

(i) 여성 대상체의 난모세포 더미 복합체가 노출되는 TGF-β1, GDF-9, BMP-15 및 액티빈 중 하나 이상의 농도 및/또는 활성을 조절하는 제제; 및

(ii) 여성 대상체의 난모세포 더미 복합체에서의 ALK4, ALK5 및 ALK7 수용체 중 하나 이상에 의하여 매개되는 신호전달 경로의 활성을 조절하는 제제.
다음 중 한 가지 이상을 여성 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 여성 대상체의 수정능력을 조절하는 방법:

(i) 여성 대상체의 난모세포 더미 복합체가 노출되는 TGF-β1, GDF-9, BMP-15 및 액티빈 중 하나 이상의 농도 및/또는 활성을 조절하는 제제; 및

(ii) 여성 대상체의 난모세포 더미 복합체에서의 ALK4, ALK5 및 ALK7 수용체 중 하나 이상에 의하여 매개되는 신호전달 경로의 활성을 조절하는 제제.