JP2009501533A - 顆粒膜細胞アポトーシスの調節 - Google Patents
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Abstract
の内の一以上を含む。
【選択図】なし
Description
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6の有効量、
(ii)卵丘卵母細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣における顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤の有効量、
(iii)卵丘卵母細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣における顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤の有効量、の内の一以上に曝露することを含む方法を提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6の有効量、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤の有効量、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤の有効量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6の有効量、
(ii)卵丘卵母細胞複合体内又は卵胞内の顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
(iii)卵丘卵母細胞複合体内又は卵胞内の顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、の内の一以上を含有する培地を提供するものである。
卵母細胞及び/又は胚の培養培地、
BMP−15及び/又はBMP−6、又はこれらのバリアント若しくはアナログ、及び/又は
顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤、及び/又は
顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤を含有し、
各成分は、培養培地に添加するための形態で提供される組合せ製品を提供するものである。
(i)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するBMP−15及び/又はBMP−6の或る特定量、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6の有効量、
(ii)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
(iii)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、の内の一以上を含有する培地を提供するものである。
(i)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するBMP−15及び/又はBMP−6の或る特定量、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6の有効量、
(ii)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
(iii)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、の内の一以上を含有する培地を提供するものである。
(i)被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するBMP−15及び/又はBMP−6の或る特定量、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
(i)卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するBMP−15及び/又はBMP−6の或る特定量、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6の有効量、
(ii)卵胞内の顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
(iii)卵胞内の顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、の内の一以上を含有する培地を提供するものである。
(i)卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するBMP−15及び/又はBMP−6の或る特定量、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
(i)卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するBMP−15及び/又はBMP−6の或る特定量、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
(i)被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するBMP−15及び/又はBMP−6の或る特定量、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
(i)被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するBMP−15及び/又はBMP−6の或る特定量、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
(i)被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するBMP−15及び/又はBMP−6の或る特定量、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6、
(ii)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
(iii)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有する培地を提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6の有効量、
(ii)卵丘卵母細胞複合体内又は卵胞内の顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
(iii)卵丘卵母細胞複合体内又は卵胞内の顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、の内の一以上を含有し、
血清、アルブミン、卵胞液、フェチュイン、卵胞刺激ホルモン(FSH)及び抗アポトーシス成長因子を実質的に含有していない培地を提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6、
(ii)卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
(iii)卵母細胞に関連する前記一以上の顆粒膜細胞のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有し、
血清、アルブミン、卵胞液、フェチュイン、卵胞刺激ホルモン(FSH)及び抗アポトーシス成長因子を実質的に含有していない培地を提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6、
(ii)卵胞内の一以上の顆粒膜細胞のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
(iii)卵胞内の前記一以上の顆粒膜細胞のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有し、
該組成物は、血清、アルブミン、卵胞液、フェチュイン、卵胞刺激ホルモン(FSH)及び抗アポトーシス成長因子を実質的に含有していない培地を提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有する組成物又は培地であって、
更に、40mM〜400mM NaCl、0.1mM〜20mM KCl、及び0.1mM〜40mMグルコースを含有する組成物又は培地を提供するものである。
(i)活性BMP−15及び/又は活性BMP−6、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
(i)有効量の活性BMP−15及び/又は活性BMP−6、
(ii)卵丘卵母細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣の顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
(iii)卵丘卵母細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣の顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6、
(ii)卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
(iii)卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有する培地において卵母細胞を培養する段階を含む方法を提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6、
(ii)卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
(iii)卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有する培地において卵母細胞及び/又は胚を培養する段階を含む方法を提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6、
(ii)卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
(iii)卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有する培地において卵母細胞を培養する段階を含む方法を提供するものである。
(i)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のアポトーシスの程度を決定する段階、及び
(ii)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内で見られるアポトーシスの程度により卵母細胞の発育能力を評価する段階を含み、
アポトーシスのレベルの低下は、高い発育能力を有する卵母細胞であることを示し、アポトーシスのレベルの上昇は、低い発育能力を有する卵母細胞であることを示す方法を提供するものである。
(i)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性、卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性レベル、卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性レベルの内の一以上を決定する段階と、
(ii)上の決定の結果を用いて卵母細胞の発育能力を評価する段階とを含み、
BMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性の上昇、及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性の上昇は、高い発育能力を有する卵母細胞であることを示し、BMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性の低下、及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性の低下は、低い発育能力を有する卵母細胞であることを示す方法を提供するものである。
(i)卵母細胞内のBMP−15及び/又はBMP−6の発現レベルを決定する、及び/又は卵母細胞が分泌するBMP−15及び/又はBMP−6の濃度を決定する段階と、
(ii)卵母細胞の発育能力を評価する段階とを含み、
BMP−15及び/又はBMP−6の発現及び/又は濃度の上昇は、高い発育能力を有する卵母細胞であることを示し、BMP−15及び/又はBMP−6の発現及び/又は濃度の低下は、低い発育能力を有する卵母細胞であることを示す方法を提供するものである。
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
(i)顆粒膜細胞が曝露されるGDF−9/BMP−15ヘテロダイマーの濃度を調節する段階、及び
(ii)顆粒膜細胞内のGDF−9/BMP−15ヘテロダイマー依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6の有効量、
(ii)卵丘卵母細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣における顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤の有効量、
(iii)細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣における顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤の有効量、の内の一以上に曝露することを含む方法を提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6の有効量、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤の有効量、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤の有効量、の内の一以上を含有する組成物も提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6の有効量、
(ii)卵丘卵母細胞複合体内又は卵胞内の顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
(iii)卵丘卵母細胞複合体内又は卵胞内の顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、の内の一以上を含有する培地を提供するものである。
卵母細胞及び/又は胚の培養培地、
BMP−15及び/又はBMP−6、又はこれらのバリアント若しくはアナログ、及び/又は
顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤、及び/又は
顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤を含有し、
各成分は、培養培地に添加するための形態で提供される組合せ製品を提供するものである。
(i)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するBMP−15及び/又はBMP−6の或る特定量、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6の有効量、
(ii)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
(iii)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、の内の一以上を含有する培地を提供するものである。
(i)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するBMP−15及び/又はBMP−6の或る特定量、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6の有効量、
(ii)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
(iii)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、の内の一以上を含有する培地を提供するものである。
(i)被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するBMP−15及び/又はBMP−6の或る特定量、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
(i)卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するBMP−15及び/又はBMP−6の或る特定量、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6の有効量、
(ii)卵胞内の顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
(iii)卵胞内の顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、の内の一以上を含有する培地を提供するものである。
(i)卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するBMP−15及び/又はBMP−6の或る特定量、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
(i)卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するBMP−15及び/又はBMP−6の或る特定量、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
(i)被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するBMP−15及び/又はBMP−6の或る特定量、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
(i)被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するBMP−15及び/又はBMP−6の或る特定量、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物も提供するものである。
(i)被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するBMP−15及び/又はBMP−6の或る特定量、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6、
(ii)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
(iii)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有する培地を提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6の有効量、
(ii)卵丘卵母細胞複合体内又は卵胞内の顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
(iii)卵丘卵母細胞複合体内又は卵胞内の顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、の内の一以上を含有し、
血清、アルブミン、卵胞液、フェチュイン、卵胞刺激ホルモン(FSH)及び抗アポトーシス成長因子を実質的に含有していない培地を提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6、
(ii)卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
(iii)卵母細胞に関連する前記一以上の顆粒膜細胞のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有し、
血清、アルブミン、卵胞液、フェチュイン、卵胞刺激ホルモン(FSH)及び抗アポトーシス成長因子を実質的に含有していない培地を提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6、
(ii)卵胞内の一以上の顆粒膜細胞のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
(iii)卵胞内の前記一以上の顆粒膜細胞のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有し、
該組成物は、血清、アルブミン、卵胞液、フェチュイン、卵胞刺激ホルモン(FSH)及び抗アポトーシス成長因子を実質的に含有していない培地を提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有する組成物又は培地であって、
更に、40mM〜400mM NaCl、0.1mM〜20mM KCl、及び0.1mM〜40mMグルコースを含有する組成物又は培地を提供するものである。
BMP−15 0.0005
CaCl2.2H20 0.265
MgSO4.6H20 0.09767
KCl 0.4
NaCl 6.8
NaH2PO4 0.122
L−アルギニン.HCl 0.126
L−システイン.HCl.一水和物 0.0313
L−グルタミン 0.292
L−ヒスチジン.HCl.一水和物 0.042
L−イソロイシン 0.052
L−ロイシン 0.052
L−リジン.HCl 0.0725
L−メチオニン 0.015
L−フェニルアラニン 0.032
L−スレオニン 0.048
L−トリプトファン 0.01
L−チロシン.2Na.二水和物 0.0519
L−バリン 0.046
塩化コリン 0.001
葉酸 0.001
myo−イノシトール 0.002
ナイアシナミド 0.001
D−パントテン酸.l/2Ca 0.001
ピリドキサール.HCl 0.001
リボフラビン 0.0001
チアミン.HCl 0.001
グルコース 1
フェノールレッド.Na 0.011
NaHCO3 2.2
BMP−6 0.0001
CaCl2.2H20 0.265
MgSO4.6H20 0.09767
KCl 0.4
NaCl 6.8
NaH2PO4 0.122
L−アルギニン.HCl 0.126
L−システイン.HCl.一水和物 0.0313
L−グルタミン 0.292
L−ヒスチジン.HCl.一水和物 0.042
L−イソロイシン 0.052
L−ロイシン 0.052
L−リジン.HCl 0.0725
L−メチオニン 0.015
L−フェニルアラニン 0.032
L−スレオニン 0.048
L−トリプトファン 0.01
L−チロシン.2Na.二水和物 0.0519
L−バリン 0.046
塩化コリン 0.001
葉酸 0.001
myo−イノシトール 0.002
ナイアシナミド 0.001
D−パントテン酸.l/2Ca 0.001
ピリドキサール.HCl 0.001
リボフラビン 0.0001
チアミン.HCl 0.001
グルコース 1
フェノールレッド.Na 0.011
NaHCO3 2.2
(i)活性BMP−15及び/又は活性BMP−6、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
(i)有効量の活性BMP−15及び/又は活性BMP−6、
(ii)卵丘卵母細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣の顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる有効量の剤、
(iii)卵丘卵母細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣の顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる有効量の剤、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6、
(ii)卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
(iii)卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有する培地において卵母細胞を培養する段階を含む方法を提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6、
(ii)卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
(iii)卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有する培地において卵母細胞を培養する段階を含む方法を提供するものである。
(i)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスの調節におけるBMP−15及び/又はBMP−6の有効量、
(ii)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することによる顆粒膜細胞のアポトーシスの調節における有効量の剤、
(iii)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することによる顆粒膜細胞のアポトーシスの調節における有効量の剤、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
(i)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節することにより顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(ii)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(iii)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
(i)BMP−15及び/又はBMP−6、
(ii)卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
(iii)卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有する培地において卵母細胞及び/又は胚を培養する段階を含む方法を提供するものである。
(i)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスの程度を決定する段階、
(ii)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞において見られるアポトーシスの程度により卵母細胞の発育能力を評価する段階、
を含み、アポトーシスのレベルの低下は、高い発育能力を有する卵母細胞であることを示し、アポトーシスのレベルの上昇は、低い発育能力を有する卵母細胞であることを示す方法を提供するものである。
(i)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性、
(ii)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性のレベル、
(iii)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性のレベル、の内の一以上を決定することにより卵母細胞の発育能力を評価するのにも適している。
(i)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性、卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性レベル、卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性レベル、の内の一以上を決定する段階、及び
(ii)前記決定の結果を用いて卵母細胞の発育能力を評価する段階、
を含み、BMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性の上昇、及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性の上昇は、高い発育能力を有する卵母細胞であることを示し、BMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性の低下、及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性の低下は、低い発育能力を有する卵母細胞であることを示す方法を提供するものである。
(i)卵母細胞内のBMP−15及び/又はBMP−6の発現レベルを決定する、及び/又は卵母細胞が分泌するBMP−15及び/又はBMP−6の濃度を決定する段階、及び
(ii)卵母細胞の発育能力を評価する段階、
を含み、BMP−15及び/又はBMP−6の発現及び/又は濃度の上昇は、高い発育能力を有する卵母細胞であることを示し、BMP−15及び/又はBMP−6の発現及び/又は濃度の低下は、低い発育能力を有する卵母細胞であることを示す方法を提供するものである。
(i)卵母細胞及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(ii)卵母細胞及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(iii)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(iv)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(v)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法も提供される。
(i)卵母細胞又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(ii)卵母細胞及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(iii)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(iv)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(v)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法も提供される。
(i)卵母細胞又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(ii)卵母細胞及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(iii)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(iv)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(v)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法も提供される。
(i)卵母細胞又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(ii)卵母細胞及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(iii)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(iv)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(v)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法も提供される。
(i)一以上の付加的な裸化卵母細胞、
(ii)一以上の卵母細胞分泌因子、
(iii)GDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
(iv)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(v)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(vi)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有する組成物も提供される。
(i)一以上の付加的な裸化卵母細胞、
(ii)一以上の卵母細胞分泌因子、
(iii)GDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
(iv)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(v)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(vi)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有する培地も提供される。
(i)一以上の裸化卵母細胞、
(ii)一以上の卵母細胞分泌因子、
(iii)GDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
(iv)胚内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(v)胚内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(vi)胚内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有する培地において卵母細胞を培養する段階を含む方法が提供される。
(i)一以上の付加的な裸化卵母細胞、
(ii)一以上の卵母細胞分泌因子、
(iii)GDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
(iv)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(v)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(vi)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有し、該培地は、血清、アルブミン、卵胞液、フェチュイン、卵胞刺激ホルモン(FSH)及び成長因子の内の一以上を実質的に含有しない培地を提供するものである。
(i)卵母細胞及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(ii)卵母細胞及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(iii)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(iv)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(v)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法も提供される。
(i)一以上の付加的な裸化卵母細胞、
(ii)一以上の卵母細胞分泌因子、
(iii)GDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
(iv)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(v)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(vi)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有する組成物も提供される。
(i)一以上の裸化卵母細胞、
(ii)一以上の卵母細胞分泌因子、
(iii)GDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
(iv)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(v)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(vi)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有する培地において卵母細胞を培養する段階を含む方法を提供するものである。
(i)一以上の裸化卵母細胞、
(ii)一以上の卵母細胞分泌因子、
(iii)GDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
(iv)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(v)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(vi)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有する培地において卵母細胞を培養する段階を含む方法を提供するものである。
(i)卵母細胞及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(ii)卵母細胞及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(iii)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(iv)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(vi)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法も提供される。
卵母細胞及び/又は胚培養培地、及び
GDF―9及び/又はBMP―15及び/又はBMP―6、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、及び/又は
一以上の卵母細胞分泌因子、及び/又は
卵母細胞内、卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、及び/又は
卵母細胞内、卵母細胞に関連する卵丘細胞内又は胚内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、及び/又は
卵母細胞内、卵母細胞に関連する卵丘細胞内又は胚内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、を含有し、各成分は、培養培地に各成分を添加するための形態で提供される組合せ製品を提供するものである。
(i)胚が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(ii)胚が曝露されるGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(iii)胚内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(iv)胚内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(v)胚内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法も提供される。
(i)一以上の裸化卵母細胞、
(ii)一以上の卵母細胞分泌因子、
(iii)GDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
(iv)胚内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(v)胚内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(vi)胚内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有する培地において胚を培養する段階を含む方法が提供される。
(i)一以上の付加的な裸化卵母細胞、
(ii)一以上の卵母細胞分泌因子、
(iii)GDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
(iv)胚内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(v)胚内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(vi)胚内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有する組成物も提供される。
(i)一以上の付加的な裸化卵母細胞、
(ii)一以上の卵母細胞分泌因子、
(iii)GDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
(iv)胚内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(v)胚内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(vi)胚内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有する培地が提供される。
(i)一以上の付加的な裸化卵母細胞、
(ii)一以上の卵母細胞分泌因子、
(iii)GDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
(iv)胚内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(v)胚内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(vi)胚内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有し、血清、アルブミン、卵胞液、フェチュイン、卵胞刺激ホルモン(FSH)及び成長因子、の内の一以上を実質的に含有しない培地を提供するものである。
(i)胚が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(ii)胚が曝露されるGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(iii)胚内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(iv)胚内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(v)胚内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法が提供される。
(i)一以上の付加的な裸化卵母細胞、
(ii)一以上の卵母細胞分泌因子、
(iii)GDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
(iv)胚内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(v)胚内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(vi)胚内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有する組成物も提供される。
(i)一以上の付加的な裸化卵母細胞、
(ii)一以上の卵母細胞分泌因子、
(iii)GDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
(iv)胚内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(v)胚内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(vi)胚内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有する胚培養培地も提供される。
(i)卵母細胞及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を決定する段階、及び/又は
(ii)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を決定する段階、及び/又は
(iii)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を決定する段階、及び/又は
(iv)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を決定する段階、及び
(v)卵母細胞及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性、及び/又は卵母細胞内又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性により卵母細胞の発育能力を評価する段階、を含み、
卵母細胞及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性の上昇、及び/又は卵母細胞内又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性の上昇は、高い発育能力を有する卵母細胞であることを示し、卵母細胞及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性の低下、及び/又は卵母細胞又は卵母細胞に関連する卵丘細胞の中のGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性の低下は、低い発育能力を有する卵母細胞であることを示す方法を提供するものである。
(i)卵母細胞内のGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の発現レベル、及び/又は卵母細胞が分泌したGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の濃度を測定する段階、及び
(ii)卵母細胞の発育能力を評価する段階、を含み、
GDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の発現及び/又は濃度の上昇は、高い発育能力を有する卵母細胞であることを示し、GDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の発現及び/又は濃度の低下は、低い発育能力を有する卵母細胞であることを示す方法を提供するものである。
(i)卵丘卵母細胞複合体が曝露されるTGF−β1、GDF−9、BMP−15及びアクチビンの内の一以上の濃度及び/又は活性を調節する段階、及び
(ii)卵丘卵母細胞複合体内のALK4、ALK5及びALK7受容体の内の一以上により仲介されるシグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法が提供される。
(i)雌性被験体の卵丘卵母細胞複合体が曝露されるTGF−β1、GDF−9、BMP−15及びアクチビンの内の一以上の濃度及び/又は活性を調節する剤、及び
(ii)雌性被験体の卵丘卵母細胞複合体内のALK4、ALK5及びALK7受容体の内の一以上により仲介されるシグナル伝達経路の活性を調節する剤、の内の一以上を雌性被験体に投与する段階を含む方法も提供される。
(i)雌性被験体の卵丘卵母細胞複合体が曝露されるTGF−β1、GDF−9、BMP−15及びアクチビンの内の一以上の濃度及び/又は活性を調節する剤、及び
(ii)雌性被験体の卵丘卵母細胞複合体内のALK4、ALK5及びALK7受容体の内の一以上により仲介されるシグナル伝達経路の活性を調節する剤、の内の一以上を雌性被験体に投与する段階を含む方法も提供される。
次に、本発明の上述の一般的原理を具体化する実験について記載する。しかしながら、次の説明によって上述の一般性が限定されるものではないことを理解されたい。
実施例1
ウシ卵母細胞の採取及び培養条件(COCの採取及び調製)
特に明記しない限り、全ての化学薬品及び試薬はシグマ社(ミズーリ州セントルイス)から購入した。
卵丘細胞の処理
(i)卵母細胞切除複合体の生成
各卵母細胞の細胞質は、ブッチオネ(Buccione)ら(ブッチオネ(Buccione)ら、(1990)Dev.Biol.138、16−25)に記載のマイクロマニピュレータを用いて顕微手術的にCOCから除去した(卵母細胞切除)。得られた卵母細胞切除複合体(OOX)は、数層の無傷CC層で囲まれた中空透明帯から成る。
裸化卵母細胞(DO)は、2mLのH−TCM−199/BSA中で約4分間回転攪拌させてCOCからCCを除去することによって生成した。残ったCCは、H−TCM−199/BSA中で卵母細胞を微細径火仕上げ(fire-polished)ガラスピペットを繰り返し通過させることによって除去した。
組換えマウスGDF−9及び組換えヒツジBMP−15は、形質移入293ヒト胎児腎臓細胞株(293H)を用い、先に記載のように(カイヴォ−オジャ(Kaivo-Oja)ら(2003)J Clin Endocrinol Metab 88、755−62;マクナッティ(McNatty)ら(2005)Reproduction 129:473−480)室内で産生した。組換え蛋白質は、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)を用いて一部精製した後、その濃度をウェスタンブロット(カイヴォ−オジャ(Kaivo-Oja)ら(2003)J Clin Endocrinol Metab 88:755−62)によって推定した。また、非形質移入293H細胞から対照ならし培地(293H)も産生し、HICによって精製した。組換えヒトBMP−6、組換えヒトBMP−7、BMP−6中和抗体、及びグレムリンはR&Dシステムズ社(ミネソタ州ミネアポリス)から入手した。
TUNELによるDNA損傷の確認(TUNELによる卵丘細胞内アポトーシスの評価)
CCアポトーシスDNAの検出は、TUNEL(ロシュ・ダイアグノスティック社、ドイツ、ペンツバーグ)を用い、同社の指示に従って行った。即ち、培養後、COC及びOOX複合体を1%BSAを含むPBS(pH7.4)で2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドのPBS(pH7.4)に4℃で一晩固定し、PBS/BSAで2回洗浄した後、Cell−Takコートカバーガラス(ベクトン・ディッキンソン・バイオサイエンス社、ニュージャージー州フランクリンレイクス)上に載置した。次に、0.1%TritonX−100の0.1%クエン酸ナトリウム中、室温で1時間、複合体を透過化(permeabilized)し、PBS/BSAで3回洗浄した。次に、暗所にて、フルオレセイン結合dUTP及び末端デオキシヌクレオチド転移酵素(TUNEL試薬、ロシュ社)中、複合体を37℃で1時間インキュベートした。陽性対照は、全てのDNAを切断するDNアーゼ1(0.005U/□L)中、室温で20分間インキュベートし、PBS/BSAで2回洗浄した後、TUNELを行った。陰性対照は、TdTの非存在下、フルオレセイン−dUTP中でインキュベートした。TUNEL終了後、複合体をPBS/BSAで2回洗浄し、暗所にて室温で1時間、ヨウ化プロピジウム0.5μg/mL(PI)及びRNアーゼA(0.1mg/mL)で対比染色し、全ての核を標識した。次に、複合体をPBS/BSAで2回洗浄し、カバーガラスで軽く挟みながらVectaShieldアンチブリーチング溶液(ベクターラボ社、カリフォルニア州バーリンゲーム)に入れ、暗所にて4℃で保存し、共焦点解析に備えた。
共焦点顕微鏡法及び解析
共焦点顕微鏡法を用いてCOC及びOOXにおけるアポトーシスを可視化し、定量した。ニコンC1共焦点スキャンヘッド及びニコンTE2000E顕微鏡(ニコン社、東京)を用いてCCからの二重蛍光発光を検出した。アポトーシスシグナル(フルオレセイン、レーザ励起:488nm、発光:510〜530nm)と核シグナル(ヨウ化プロピジウム、励起レーザ:532、発光:590〜640nm)との同時発光捕獲を行った。
ウェスタンブロット解析
培養処理後、25mLのRIPA溶解バッファー(10mM Tris[pH7.4]、150mM NaCl、1mM EDTA、1%TrintonX−100)にOOX複合体を溶解し、−80℃で保存し、高感度増強化学発光(ECL)アドバンスシステム(アマシャム・バイオサイエンス社、カナダ、オンタリオ)を用いてアポトーシス蛋白質を検出した。融解したライセートを100mMジチオスレトール(DTT)含有4×ローディングバッファーと混合し、SDS−PAGE(12%ポリアクリルアミドゲル)に付した。次に、20%メタノール含有25mMTris−192mMグリシン中で蛋白質をニトロセルロース膜(Hybond−ECL、アマシャム・ライフサイエンス社、カナダ、オンタリオ)に電気移動させた(electrotransferred)。13.7mMのNaCl、1%Tween−20及び2%ブロッキング剤(ECLアドバンスキットにて提供)を含有する20mMTris(pH7.6)中、ブロットを室温で1時間ブロックした後、Bcl−2又はBaxウサギポリクローナル抗体(0.35μg/mL;サンタクルーズ・バイオテクノロジー社、米国カリフォルニア州)と共に4℃で一晩インキュベートし、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギ抗体(1:200000;Silemus laboratories社、オーストラリア、メルボルン)と共にインキュベートした。次に、フラットベッドスキャナを用いて画像をスキャンし、各サンプルにおけるBcl−2及びBaxのバンド強度をImageJ Imagingシステムソフトウェア バージョン1.3(米国国立衛生研究所)によって定量した。
卵母細胞切除の卵丘細胞アポトーシスへの影響
無傷COCのアポトーシスレベルがOOXと異なるかどうか確認するため、5個のCOC又はOOXから成る群を50μLの培養培地ドロップ中で24時間培養した後、アポトーシスを評価した。実験は6回反復して行った。
卵母細胞分泌因子の卵丘細胞アポトーシスへの影響
無傷COCにおけるCCアポトーシスの低発生率に対してOSFが関与するかどうか確認するため、OOXの培養をDO数を増加させながら行い、COCと比較した。5個のOOXを含有する50μLの培地ドロップに5個、25個又は50個のDOを添加した。実験は3回反復して行った。
OSF源の近接(proximity)に関するアポトーシスのパターン
CC複合体の卵母細胞への近接に関して該複合体内でのアポトーシスの分布を確認するため、COC(即ち、OSFの源がCC複合体の中心にある)におけるアポトーシス発生率を定量する一方、DOと共培養したOOX(即ち、OSFの源がCC複合体の外側にある)におけるアポトーシス発生率を定量した。共焦点顕微鏡を用い、スキャナリティクスIPLabソフトウェア バージョン3.6によって卵母細胞領域の直径を差し引いた後、複合体の直径を測定した。次に、これを均等な3層、即ち、内部CC層、中央CC層及び外部CC層に分割し、卵母細胞の周囲に3個の環状ゾーンを形成した。各層は全半径の33%に相当した。次に、アポトーシス発生率を各層で独立して解析した。
卵丘細胞アポトーシスに対するGDF−9、BMP−6及びBMP−15の用量応答
COCで見られたアポトーシスの低発生率に対してどの推定OSFが寄与し得るか検討するため、FSHの非存在下又は存在下、OOXの培養を濃度上昇のGDF−9(0〜175ng/mL)、BMP−6(0〜100ng/mL)又はBMP−15(0〜20%v/v)と共に行った。また、OOXに対しては10%(v/v)293Hを用いた処理も行ったが、293Hは親細胞株ならし培地陰性対照としてGDF−9に対して(132ng/mLに相当)及びBMP−15に対して(10%(v/v)に相当)用いた。これらの実験は3回反復して行ったが、その際、1回の反復実験に付き1処理群に対して10個のOOXを用いた。
Bcl−2及びBax蛋白質のOOX発現に対するDO、GDF−9及びBMP−15の作用
本実験を行い、TUNELによって評価されるCCアポトーシスに対する処理の影響が、細胞死や細胞生存を制御する主要蛋白質の発現の変化に付随することを確認した。OOXに対しては、未処理下での培養、132ng/mLのGDF−9又は10%v/vのBMP−15による処理下での培養、或いはDO35個/ウェル又は10%293H(対照ならし培地)との共培養を24時間行った後、ウェスタンブロットに付し、Bc1−2及びBaxの発現について解析した。
スタウロスポリンによって誘導される卵丘細胞アポトーシスに対するDO、BMP−6及びBMP−15の作用
予備実験を行い、ウシCCに対するスタウロスポリンのアポトーシス作用を確認した(スタウロスポリンは用量依存的に(範囲:0.1〜100μM)アポトーシスを誘導した(データは示さず))。本実験の目的は、OSFによってCCがスタウロスポリン誘導アポトーシスを受けないようにすることができるかどうか確認することであった。OOXは単独で培養、或いは35個のDO、10ng/mLのBMP−6又は10%(v/v)のBMP−15と共培養した後、24時間インキュベーションの最後の6時間、0.1μM又は1.0μMのスタウロスポリンに曝露した。本実験は3回反復して行ったが、その際、1回の反復実験に付き1処理群に対して10個のOOXを用いた。
卵丘細胞アポトーシスに対するBMPアンタゴニストの作用
フォリスタチンはBMP−15及びアクチビンの両方に高親和性で結合し、これらの生物活性に拮抗する(リン(Lin)ら、2003;オオツカ(Otsuka)ら、2001)。グレムリンは壁側GC及びCCの両方で発現し、BMP−4やBMP−7を選択的にブロックし(メリノ(Merino)ら、1999)、BMP−15に拮抗し得る。本実験の目的は、BMP−6やBMP−15によって防止されるCCアポトーシスに対するこれらのアンタゴニストの有効性について検討することであった。用量増加のフォリスタチン(0〜100μg/mL)の存在下又は用量増加のグレムリン(0〜40μg/mL)の存在下でOOXを10%(v/v)のBMP−15と共に培養した。別の実験においては、高用量(20μg/mL)のBMP−6モノクローナル中和抗体(NAb)の非存在下又は存在下でOOXを10ng/mLのBMP−6で処理した。これらの実験の各々は3回反復して行ったが、その際、1回の反復実験に付き1処理群に対して10個のOOXを用いた。
卵丘細胞に対する卵母細胞の抗アポトーシス作用におけるBMP−15及びBMP−6の役割
CCに対する卵母細胞の抗アポトーシス生物活性を中和するため、50μg/mLのフォリスタチン又は20μg/mLのBMP−6NAbの存在下又は非存在下、或いはこれら両方のアンタゴニストの存在下でOOXを25個のDOと共培養した。別の実験を行い、OOX+DOと比較してBMP−15やBMP−6の相加作用について検討した。OOXはDOで処理するか、或いは10ng/mLのBMP−6及び/又は10%v/vのBMP−15で処理した。これらの実験は3回反復して行ったが、その際、1回の反復実験に付き1処理群に対して10個のOOXを用いた。
卵丘細胞アポトーシスに対するBMP−7及びそのアンタゴニストであるグレムリンの作用
CCアポトーシスに対するBMP−7やそのアンタゴニストであるグレムリンの影響について検討するため、2μg/mLのグレムリンの存在下又は非存在下でOOXを100ng/mLのBMP−7及び/又は10%のBMP−15で処理した。本実験は3回反復して行ったが、その際、1回の反復実験に付き1処理群に対して10個のOOXを用いた。
統計解析
卵丘細胞アポトーシスの頻度はSigmaStatソフトウェア(SPSS社、イリノイ州シカゴ)を用いたANOVAによって解析し、平均値間の有意差はチューキー−クレーマーpost−hoc検定によって求め、複数の平均値を比較した。全ての細胞比率データは解析前にアークサイン変換した。p<0.05の場合に差は統計的に有意であるとした。
本研究から、卵母細胞切除によってCOCから卵母細胞を除去するとCCアポトーシスが実質的に増加することが分かる。しかし、OOXを卵母細胞と共培養することによってアポトーシスを低レベルに回復させることができ、卵母細胞は用量依存的にアポトーシスの発生率を低下させ、最大濃度(50個(DO)/ウェル)で完全にCOCのレベルまで回復する。これらの知見から、低レベルのCCアポトーシスは卵母細胞の存在に大きく依存することが分かる。また、このような作用が卵母細胞とCCとの直接的な接触のない共培養環境中で見られたことから、CCアポトーシスの特徴的な低発生率は、卵母細胞のCCへのギャップ結合性シグナル伝達ではなく、卵母細胞からの可溶性パラクリンシグナルに特異的に起因し得るものである。
実施例16
ウシ卵母細胞の採取及び培養条件
特に明記しない限り、全ての化学薬品及び試薬はシグマ社(ミズーリ州セントルイス)から購入した。
卵丘卵母細胞複合体の処理
(i)裸化卵母細胞の生成
裸化卵母細胞(DO)は、2mLのH−TCM−199/BSA中で約4分間回転攪拌させてCOCからCCを除去することによって生成した。残った卵丘細胞は、H−TCM−199/BSA中で卵母細胞を微細径火仕上げガラスピペットを繰り返し通過させることによって除去した。
組換えマウスGDF−9及び組換えヒツジBMP−15は、形質移入293ヒト胎児腎臓細胞株(293H)を用い、先に記載のように(カイヴォ−オジャ(Kaivo-Oja)ら(2003)J.Clin.Endocrinol Metab 88:755−762;マクナッティ(McNatty)ら(2005)Reproduction 129:473−480)室内で産生した。組換え蛋白質は、最近記載のように(ヒッキー(Hickey)ら、(2005)Biol Reprodオンライン)疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)を用いて一部精製した後、その濃度をウェスタンブロット(カイヴォ−オジャ(Kaivo-Oja)ら、2003 3)J.Clin.Endocrinol Metab 88:755−762)によって推定した。また、非形質移入293H細胞から対照ならし培地(293H)も産生し、HICによって精製した。
全ての実験は、受胎能が示された同一の雄ウシ由来の凍結精液を用いて行った。即ち、液体窒素内で保存したストロー1本分の精液を水浴中で1分間急速に融解した。精液サンプルを不連続(45%:90%)パーコール勾配(アマシャム・バイオサイエンス社)の上に重層し、室温にて700gで20〜25分間遠沈した。上清を除去し、精子ペレットを500mLのBovine Vitro Wash(クック・オーストラリア社、オーストラリア、クイーンズランド州エイトマイルプレインズ)で洗浄し、200gで更に5分間遠沈した。精子をIVF培地(Bovine Vitro Fert、クック・オーストラリア社)で再懸濁させた後、受精培地ドロップ(Bovine Vitro Fert(クック・オーストラリア社)に0.01mMのヘパリン、0.2mMのペニシラミン及び0.1mMのヒポタウリンを添加)に添加し、精子の最終濃度を1×106個/mLとした。COCの授精はCOC当りIVF培地10mLの培地密度で6%CO2の加湿空気中、39℃で24時間行った。
統計解析
統計解析はSigmaStatソフトウェア(SPSS社、イリノイ州シカゴ)を用いたANOVAによって行い、平均値間の有意差はチューキー−クレーマーpost−hoc検定によって求め、複数の平均値を比較した。全ての比率データは解析前にアークサイン変換した。p<0.05の場合に差は統計的に有意であるとした。
IVM時の無傷COCとDOとの共培養が後の胚の発育能力に及ぼす影響
卵母細胞発育能力に対する卵母細胞分泌因子の作用について確認するため、インビトロ成熟(IVM)時に卵丘卵母細胞複合体を4処理群に無作為に割り当てた。IVM後、全ての複合体及び卵母細胞を受精させ、8日目に形成胚盤胞の質について評価した。
卵母細胞発育能力に対するGDF−9やBMP−15(単独使用及び併用)の作用
COCで見られる発育能力に対してどの卵母細胞分泌因子が寄与し得るか検討するため、10%の293H(対照ならし培地)、10%のBMP−15、175ng/mLのGDF−9又はBMP−15+GDF−9の存在下又は非存在下で上述のものと同一のIVM系を併用して複合体を24時間培養した。これらの実験は3回反復して行ったが、その際、1回の反復実験に付き1処理群に対して25個のCOCを用いた。
TGF−βスーパーファミリー分子による卵丘細胞への卵母細胞パラクリンシグナル伝達は卵丘膨張に不可欠である。
TGF−βスーパーファミリーのメンバーは、マウス卵丘膨張を可能にする因子(CEEF)の有力候補である。本研究を行い、卵丘膨張を制御するTGF−βスーパーファミリープロセスについて検討した。eGG刺激マウスからCOCを採取し、卵母細胞を顕微手術的に除去して卵母細胞切除(OOX)複合体を生成した。確立したスコアリングシステムを用い、0(膨張なし)〜+4(最大膨張)でFSH誘導卵丘膨張について評価した。FSH単独で処理したOOX複合体は膨張しなかった(スコア:0)が、有意な(p<0.05)膨張誘導がGDF9(スコア;平均±SEM:3.7±0.1)、アクチビンA(2.6±0.1)又は卵母細胞との共培養(スコア3.2±0.2)によって生じた。GDF9及びアクチビンのタイプI受容体はそれぞれALK5及びALK4である。ALK4/5/7キナーゼ阻害剤が卵丘膨張を中和する能力について検証した。データを図13〜15に示す。
研究III−マーモセットサル顆粒膜細胞増殖を制御する成長分化因子9シグナル伝達系
導入&目的:
卵母細胞は、隣接する顆粒膜細胞(GC)に作用するパラクリン成長因子を分泌することによって卵胞の成長や発育を制御する。ヒトや非ヒト霊長類においては、このような卵母細胞因子やそれらが用いるGC受容体/シグナル伝達系の性質について殆ど知られていないが、その主な理由としては卵母細胞や非黄体化GCが少ないことが挙げられる。本研究の目的は、卵母細胞分泌成長分化因子9(GDF9)によって用いられる受容体/シグナル伝達系を同定し、コモンマーモセットサル(Callithrix jacchus)においてGCの成長を促進することであった。
(i)動物
本研究には7匹の成体雌性マーモセットを用い、クイーンエリザベス病院の動物棟(Animal House)にて飼育した。本研究は地元の動物倫理委員会によって承認され、研究動物のケアと使用についての指導原理に従って行った。
卵胞を手作業で切除し、3種類のサイズの卵胞、即ち、洞周囲(periantral)卵胞(PA;0.42〜0.66mm)、小型胞状卵胞(SA;0.66〜1.5mm)及び大型胞状卵胞(LA;>1.5mm)に分類した。各サイズの卵胞からGCを採取しプールした後、0.3mg/mLのポリビニルアルコール(PVA、シグマ社)を添加した重炭酸緩衝組織培養培地−199(B−TCM)で2回洗浄した。個々の実験に応じて、壁側GC(1×105個(細胞)/mL)、ホルモン、阻害剤及び培地を96ウェルプレート(ファルコン社)の各ウェルに添加し、最終体積を125μLとした。各実験においては全ての処理を少なくとも2個のウェルにて行い、各実験は少なくとも3回繰り返した。細胞を37℃の空気雰囲気(湿度96%、5%CO2)中で18時間培養した後、同一条件下で更に6時間、15.4kBqのトリチウム標識チミジン(3H−チミジン、ICN)のパルス標識を行った。培養後、壁側GCを回収し、取り込まれた3H−チミジンをシンチレーションカウンタによって定量してS期の細胞比率の指標とすることにより、壁側GCのDNA合成及び増殖のレベルが示された(30)。
リボソーム蛋白質−L19(L19)、骨形成蛋白質受容体タイプ2(BMPRII)、アクチビン受容体様キナーゼ5(ALK5)及びSmad3mRNAの発現に対し、顆粒膜細胞についてRT−PCRによって検討した。MGCを上述のように採取した。各サイズの卵胞から100,000個の細胞を氷上でエッペンドルフチューブに移し、RLTバッファー(キアゲン社、オーストラリア、クリフトンヒル)に溶解し、液体窒素で急速凍結(snap frozen)した後、−80℃で保存した。
特定のリン酸化Smadに応答するルシフェラーゼレポーター構築物を用い、組換えGDF9による壁側GCSmad蛋白質の活性化を検出した。DMEM(MPバイオメディカルズ社、オーストラリア、セブンヒルズ)+2%FCS(トレース・バイオサイエンス社、オーストラリア、キャッスルヒル)で細胞を最終洗浄した以外は、上述同様に壁側GCを採取し処理した。最終洗浄後、細胞を96ウェルプレート(ファルコン社)の個々のウェルに移し、1.6×105個(細胞)/mLで培養した。4時間培養後、Fugene6(ロシュ・ダイアグノスティックス社、オーストラリア、キャッスルヒル)を用いて50ngのルシフェラーゼレポーター構築物DNAを細胞に一過的に形質移入した。形質移入18時間後、培地を細胞から吸引し、0.1%FCS添加DMEMで置換した。この時点で細胞に様々なリガンドを添加し(以下参照)、培養期間を更に48時間延長した。ウェルから培地を除去し、プレートを−20℃で凍結させることによって実験を終了させた。細胞を回収するため、100μLの溶解バッファーを各ウェルに添加し、プレートをロッキングプラットフォーム上で室温にて20分間インキュベートした。20μLの細胞ライセートを用い、Galaxystarルミノメーター(GMBラブテクノロジーズ社、ドイツ、オッフェンブルク)によってルシフェラーゼ活性を測定した。
7匹の成体雌性マーモセットをhFSHで6日間刺激し、7日目に全卵巣を除去し、卵胞を手作業で切除した後、3種類のサイズの卵胞、即ち、洞周囲(periantral)卵胞(PA;0.42〜0.66mm)、小型胞状卵胞(SA;0.66〜1.5mm)及び大型胞状卵胞(LA;>1.5mm)からGCを採取した。4種類のアプローチを用い、GCにおけるGDF9の機能について検討した。卵母細胞、卵丘細胞(CC)及びGCからRNAを抽出し、ヒトプライマーを用いたRT−PCRに付し、他種においてGDF9シグナル伝達に関与することが示唆されている受容体/細胞内シグナル伝達分子の発現を確認した。GDF9シグナル伝達経路について検討するため、LA卵胞由来の培養GCにCAGA−ルシフェラーゼレポーター構築物又はBRE−ルシフェラーゼレポーター構築物を形質移入し、様々なTGF−βスーパーファミリー成長因子による処理、或いはマウス卵母細胞との共培養を行った。マーモセットGC増殖に対するGDF9の作用について確認するため、GCバイオアッセイを用い、24時間後の3H−チミジンの取り込みをDNA合成及び細胞増殖の指標として評価した。様々な濃度のGDF9で細胞を処理したが、この処理はGDF9単独で、或いはFSH及び/又はIGF1と共に行った。他の実験においては、GDF9+/−IGF1の存在下、GCをSB431542(アクチビン様キナーゼ(ALK)4/5/7阻害剤)で用量を増加させながら処理した。
実験1:卵母細胞によるGDF9mRNAの発現
洞周囲卵胞、小型胞状卵胞又は大型胞状卵胞から回収した裸化卵母細胞由来のcDNAについてRT−PCRを行った。予想通り、どのサイズの卵胞由来の卵母細胞もGDF9mRNAを発現した(図16)。配列決定によってPCR産物を同定した。
本実験を行い、小型胞状卵胞及び大型胞状卵胞由来のGCが主要なGDF9シグナル伝達経路分子(即ち、骨形成蛋白質受容体II、ALK5及びSmad3)のmRNAを発現するかどうか確認した。小型胞状卵胞及び大型胞状卵胞の両方に由来するGCにおいて、これら3種類の転写物全てのmRNA発現が検出された(図17)。全てのPCR産物の配列決定を行った結果、対応するヒト配列と相同性を示した。
本実験を行い、大型胞状卵胞由来のGCがTGF−β及び/又はBMPシグナルに応答することができるかどうか確認した。CAGA又はBREルシフェラーゼプラスミド構築物を細胞に形質移入した後、TGF−β1、GDF9、BMP7又は卵母細胞で処理した。CAGA−ルシフェラーゼ活性は、TGF−β1、卵母細胞及びGDF9によって対照レベルよりそれぞれ19倍、6倍及び5倍刺激されたが、BMP7によっては刺激されなかった(図18A)。逆に、BRE−ルシフェラーゼ活性は、BMP7によって対照レベルと比べて31倍刺激されたが、TGF−β1、GDF9又は卵母細胞によっては活性化されなかった(図19B)。
次に、ALK4/5/7キナーゼ阻害剤を用い、GDF9がTGF−β/アクチビンシグナル伝達経路を介してGC増殖を促進するという別方面の証拠を得た。阻害剤SB431542はALK6の活性に影響を及ぼすことなく、ALK4、ALK5及びALK7のキナーゼ活性に特異的に拮抗する(インマン(Inman)2002)。マウスにおいてSB431542はTGF−β1、GDF9及び卵母細胞によって刺激される壁側GC成長を用量依存的に阻害することを先に示した。本研究においては、大型胞状卵胞由来のマーモセットGCを用い、GDF9によって刺激されるDNA合成がSB431542の存在下で用量依存的に阻害されることも示した(図18)。このキナーゼ阻害剤は濃度1μMでGDF9の刺激作用を完全に排除することができる。
本実験においては、異なるサイズの卵胞に由来する壁側顆粒膜細胞がGDF9の成長促進活性に応答する能力について検討した。概して、DNA合成率は大型卵胞由来のGCにおいて最も低く(399cpm/12,500個(細胞))、洞周囲卵胞由来のGCにおいて最も高かった(5936cpm/12,500個(細胞))(図19)。
図20は、小型及び大型胞状卵胞由来の壁側GCをGDF9で用量を増加させながら(0〜350ng/mL)24時間処理したことを示す。培養期間の最後に3H−チミジン取り込みを測定した。各ポイントは7回の反復実験から得た平均cpm/12,500個(細胞)+/−SEMを示す。
図21は、壁側顆粒膜細胞DNA合成に対するGDF9のFSH及び/又はIGF−1との併用の影響を示す。小型胞状卵胞(A)又は大型胞状卵胞(B)由来の壁側GCをGDF9(175ng/mL)、rhFSH(50mIU/mL)及びIGF−1(25ng/mL)の組合せと共に24時間培養した。各バーは7回の反復実験から得た平均cpm/12,500個(細胞)+/−SEMを示す。
図22は、壁側顆粒膜細胞DNA合成に対するGDF9+/−BMP15の影響を示す。小型胞状卵胞(A)又は大型胞状卵胞(B)由来の壁側GCをGDF9(175ng/mL)又はBMP15(10%)の一方のみ、或いは両方の組合せと共に培養した。各バーは3回の反復実験の平均+/−SEを示す。
本研究によって、卵母細胞分泌因子GDF9が霊長類顆粒膜細胞増殖を刺激する分子基盤が特徴付けられる。卵胞発育の初期から後期において、マーモセットのCC及びGCはGDF9に対する応答に必要な分子成分を有する。実際、GDF9はどのサイズの卵胞においてもGCDNA合成を刺激するが、小型卵胞において最も顕著であり、特にIGF1との相乗作用が顕著である。マーモセットGCは排卵前に分化するに従いGDF9に対して不応となる。GDF9は、TGF−βシグナル伝達系の成分を用い、TGF−β様細胞内応答を誘導することによってマーモセットGC増殖を調節する。
研究IV−卵母細胞分泌因子は卵母細胞発育能力を高める
材料及び方法:
卵母細胞の採取及び培養条件
特に明記しない限り、全ての化学薬品及び試薬はシグマ社(ミズーリ州セントルイス)から購入した。地元の食肉処理場にてウシ卵巣を採取し、温生理食塩水(30〜35℃)に入れて実験室に運んだ。50μg/mLのカナマイシン、0.5mMのピルビン酸ナトリウム、50μg/mLのヘパリン及び4mg/mLの無脂肪酸ウシ血清アルブミン(FAF−BSA;ICPbio社、ニュージーランド、オークランド)を添加した約2mLの吸引培地(Hepes緩衝組織培養培地−199:TCM−199、ICNバイオケミカルズ社、米国カリフォルニア州アーヴィン)を含む10mLシリンジと18ゲージ針とを用いて、胞状卵胞(直径3〜8mm)からCOCを吸引した。約5層の細胞層を超える密集した卵丘で覆われ、細胞質が均一に着色した無傷のCOCを解剖顕微鏡下で選択し、Hepes緩衝TCM−199で2回洗浄し、10%ウシ胎仔血清(FCS)(インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド)を添加したHepes緩衝TCM−199で1回洗浄した。卵成熟用基本培地としてはBovine VitroMat(クック・オーストラリア社、オーストラリア、クイーンズランド州エイトマイルプレイン)、即ち、ウシ卵胞液のイオン組成に基づく培地を用いた。全てのIVM処理は0.1IU/mLのFSH(ピュレゴン、オルガノン社、オランダ、オッス)を添加して行った。複合体の培養は、予め平衡化し、ミネラルオイルで重層した300□Lのドロップ中で行い、5%CO2の加湿空気中、39℃で24時間インキュベートした。
裸化卵母細胞(DO)は、2mLのHepes緩衝TCM−199中で約4分間回転攪拌させてCOCからCCを除去することによって生成した。残ったCCは、Hepes緩衝TCM−199中で卵母細胞を微細径火仕上げガラスピペットを繰り返し通過させることによって除去した。
組換えマウスGDF9及び組換えヒツジBMP15は、O.リトヴォス(O.Ritvos)(ヘルシンキ大学)から当初提供された形質移入293ヒト胎児腎臓細胞株(293H)を用い、先に記載のように室内で産生し、一部精製した。非形質移入293H細胞から対照ならし培地(以下「293H」と称する)を産生し、GDF9やBMP15のならし培地と同様のクロマトグラフィー手順に付した。
胚のインビトロ産生は所定の無血清培地(Bovine Vitro培地シリーズ、クック・オーストラリア社)を用いて行った。全ての実験においては、受胎能が示された単一の雄ウシ由来の凍結精液を用いた。即ち、融解精液を不連続(45%:90%)パーコール勾配(アマシャム・バイオサイエンス社)の上に重層し、室温(RT)にて700gで20〜25分間遠沈した。上清を除去し、精子ペレットを500μLのBovine VitroWash(クック・オーストラリア社)で洗浄し、200gで更に5分間遠沈した。精子をIVF培地(Bovine VitroFert、クック・オーストラリア社)で再懸濁させた後、受精培地ドロップ(Bovine VitroFertに0.01mMのヘパリン、0.2mMのペニシラミン及び0.1mMのヒポタウリンを添加したもの)に添加し、精子の最終濃度を1×106個/mLとした。COCの授精はCOC当りIVF培地10μLの密度で6%CO2の加湿空気中、39℃で24時間行った。
細胞計数は、(フォウラディ−ナシュタ(Fouladi-Nashta)ら、2005)に記載の技法の修正版を用いて行った。即ち、膨張/孵化した胚盤胞を酸性タイロード液に入れて帯を除去した後、4mg/mLのポリビニルアルコール(PVA)リン酸バッファー生理食塩水溶液(PBS/PVA)で簡単に洗浄した。次に、帯除去(Zona-free)胚を10mMのトリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)PBS/PVA溶液中、4℃で10分間インキュベートした。この後、胚を0.1mg/mLの抗ジニトロフェノールBSA抗体(モレキュラープローブ社、米国オレゴン州ユージーン)と共に37℃で10分間インキュベートした。モルモット補体を用いた補体媒介溶解後、胚を洗浄し、10μg/mLのヨウ化プロピジウム中、37℃で20分間インキュベート(栄養外胚葉を染色)し、その後、4μg/mLのビスベンズイミド(Hoechst33342;シグマ−アルドリッチ社)100%エタノール溶液中、4℃で一晩インキュベート(内部細胞塊(ICM)及び栄養外胚葉の両方を染色)した。次に、顕微鏡スライド上で80%グリセロールPBSのドロップに胚を全載し、カバーガラスをマニキュア液でシールした。次に、UVフィルタ及びデジタルカメラを搭載した蛍光顕微鏡(オリンパス社、東京)下(400倍)で胚を観察し、全細胞数及びコンパートメント細胞数を求めた(内部細胞塊(ICM)核は青く見え、栄養外胚葉(TE)核はピンクに染色された)。
卵母細胞発育能力に対するネイティブOSFの作用について確認するため、IVM時にCOCを2処理群に無作為に割り当てた。即ち、処理(1)においては、30個のCOCを300μLのドロップ中で24時間培養し、処理(2)においては、30個のCOCを300μLのドロップ中、150個のDOと0〜24時間共培養し、その後、30個の複合体を除去し、受精させた(図24)。処理2によって、10μLのドロップ中で5個のDOに対しCOCは1個となり、濃度が0.5個(DO)/μLとなるが、これは、OSFの影響を検討するのに必要な範囲内である。IVM後、全ての複合体を受精させ、8日目に形成胚盤胞の数及び質について評価した。実験は6回反復して行った。
本実験を行い、外因性組換えOSFであるGDF9及び/又はBMP15をIVM時に添加することによって後の卵母細胞発育能力が向上するかどうか確認した。上述の基本IVM培地中でCOCを24時間培養しながら、更に以下の処理を行った。1)処理無し(対照)、2)175ng/mLのGDF9、3)10%v/vのBMP15、4)10%v/vのBMP15と175ng/mLのGDF−9、及び5)10%v/vの293H。IVM後、全ての複合体を受精させ、8日目に形成胚盤胞について評価した。これらの実験は4回反復して行ったが、その際、1回の反復実験に付き1処理群に対して50個のCOCを用いた。
本実験の目的は、(1)無傷COC内で卵母細胞によって分泌されるGDF9やBMP15を阻害することの後の発育に及ぼす影響について検討することと、(2)組換えOSFは純粋ではないため、COCに対する該OSFの作用を特異的に中和することであった。4μMのSB−431542(GDF9のアンタゴニスト)の存在下又は非存在下、COCの培養を単独で、或いは175ng/mLのGDF9又は10%v/vの293Hと共に行った。別の実験においては、IVM時に10μg/mLのフォリスタチン−288の存在下又は非存在下、COCの培養を単独で、或いは10%v/vのBMP15又は10%v/vの293Hと共に行った。IVM後、全ての複合体を受精させ、8日目に形成胚盤胞について評価した。これらの実験は3回反復して行ったが、その際、1回の反復実験に付き1処理群に対して60個のCOCを用いた。
反復実験による発育比率データは全て解析前にアークサイン変換した。統計解析はSigmaStatソフトウェア(SPSS社、イリノイ州シカゴ)を用いたANOVAによって行い、平均値間の有意差はチューキー−クレーマーpost−hoc検定によって求め、複数の平均値を比較した。p<0.05の場合に差は統計的に有意であるとした。
実験1:IVM時の無傷COCとDOとの共培養が後の発育能力に及ぼす影響
DO由来のネイティブOSFに無傷COCを曝露することによって、授精後胚盤胞ステージに達した卵母細胞の比率は、COCを単独で培養した場合(39%)に比べて有意に(p<0.001)上昇した(51%)。また、後に続く胚盤胞の細胞数は有意に(p<0.05)増加し、総細胞数及び栄養外胚葉の細胞数は対照COCと比べて増加した。しかし、卵母細胞の分裂はIVM時のOSFへの曝露には有意に影響を受けなかった(p>0.05)。
成熟COCへBMP15を添加することによって、その胚盤胞ステージへの発育が劇的に高まり(p<0.05)、対照COCと比べて16%、293H処理COCと比べて30%高まった。親293H細胞株由来のならし培地は卵母細胞発育ポテンシャルに悪影響を及ぼし、対照COCと比べて胚盤胞率が14%低下した(p<0.001)。また、GDF9によっても胚盤胞率が293H処理COCと比べて上昇した(p<0.05)が、COC単独培養と比べて上昇は見られなかった。胚盤胞率に対するGDF9の相加作用はBMP15単独の場合を超えることはなかった。卵母細胞の分裂は処理群によって有意に影響を受けることはなかったが、293H対照ならし培地に曝露した卵母細胞においては分裂率が顕著に低かった。
先の実験2で見られた、IVM時の293H添加による分裂率への悪影響は、これらの両方の実験でも見られ、対照群からの差は有意であった(2要因ANOVA、p<0.05;図25A及び26A)。GDF9のアンタゴニストであるSB−431542(ALK4/5/7阻害剤)は卵母細胞の分裂率に対して影響を及ぼさなかった(p>0.05;図25A)。これに対し、COCをフォリスタチンで処理した場合、BMP15処理に関わらず、卵母細胞の分裂率は有意に低下した(フォリスタチン、71.8±1.3;対照、76.2±1.3;p=0.007;図26A)。実験2と合致するように、COCをGDF9で処理した場合、対照と比べて分裂率が有意に変化することはなく、BMP15で処理した場合にもフォリスタチンの作用に関係無く有意な変化は見られなかった(図25A及び26A)。
研究V−卵母細胞のインビトロ成熟時の外因性GDF9は後の胚発育及び胎仔の結果(fetal outcome)を改善する
胚の増殖能力は、その発生源である卵母細胞の発育能力に依存する。最近、卵母細胞とその体細胞との間の双方向制御ループの存在及び必要性がますます明らかになっている。本研究の目的は、マウス卵母細胞インビトロ成熟(IVM)時に添加する卵母細胞パラクリン因子である成長分化因子9(GDF9)が後の胚や胎仔の発育に及ぼす作用について評価することであった。
Claims (66)
- 顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する方法であって、該方法は次の各段階、
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法。 - 顆粒膜細胞のアポトーシスは、濃度及び/又は活性が高められたBMP−15及び/又はBMP−6に顆粒膜細胞を曝露することにより阻害される、請求項1に記載の方法。
- 顆粒膜細胞のアポトーシスは、BMP−15及び/又はBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤に顆粒膜細胞を曝露することにより阻害される、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記剤は、ALK6及び/又はBMPRII受容体シグナル伝達経路の活性を上昇させる、請求項3に記載の方法。
- アポトーシスの阻害は卵成熟及び/又は発育能力を促進する、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 顆粒膜細胞はインビトロにおける卵丘卵母細胞複合体内の顆粒膜細胞である、請求項5に記載の方法。
- 顆粒膜細胞はインビボにおける顆粒膜細胞である、請求項2〜5のいずれか一項に記載の方法。
- アポトーシスの阻害は雌性被験体の受胎能を促進する、請求項7に記載の方法。
- 顆粒膜細胞のアポトーシスは、顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を低下させる剤に顆粒膜細胞を曝露することにより促進される、請求項1に記載の方法。
- 顆粒膜細胞のアポトーシスは、BMP−15及び/又はBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を低下させる剤に顆粒膜細胞を曝露することにより促進される、請求項1又は9に記載の方法。
- 前記剤は、ALK6及び/又はBMPR11受容体シグナル伝達経路の活性を低下させる、請求項10に記載の方法。
- 顆粒膜細胞はインビボにおける顆粒膜細胞である、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
- アポトーシスの阻害は雌性被験体の受胎能を低下させる、請求項12に記載の方法。
- 雌性被験体の卵成熟及び/又は卵胞成熟に関連する疾病又は症状を予防及び/又は治療する方法であって、該方法は次の各段階、
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法。 - 卵母細胞の成熟を調節する方法であって、該方法は次の各段階、
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法。 - 卵母細胞の発育能力を調節する方法であって、該方法は次の各段階、
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法。 - 卵母細胞から作製された胚の発育能力を調節する方法であって、該方法は、次の各段階、
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法。 - 卵胞の成熟を調節する方法であって、該方法は次の各段階、
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法。 - 卵胞の閉鎖を調節する方法であって、該方法は次の各段階、
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法。 - 卵胞の発育を調節する方法であって、該方法は次の各段階、
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法。 - 雌性被験体の排卵率を調節する方法であって、該方法は次の各段階、
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法。 - 雌性被験体の受胎能を調節する方法であって、該方法は次の各段階、
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法。 - 凍結融解に起因する顆粒膜細胞のアポトーシスを低減する方法であって、該方法は次の各段階、
(i)顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法。 - 凍結融解に起因する卵丘卵母細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣の損傷を低減する方法であって、該方法は、卵丘卵母細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣を
(i)BMP−15及び/又はBMP−6の有効量、
(ii)卵丘卵母細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣における顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤の有効量、
(iii)卵丘卵母細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣における顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤の有効量、
の内の一以上に曝露することを含む方法。 - 顆粒膜細胞のアポトーシスを低減するために使用される組成物であって、該組成物は、
(i)BMP−15及び/又はBMP−6の有効量、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤の有効量、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤の有効量、
の内の一以上を含有する組成物。 - 卵丘卵母細胞複合体培養培地であって、該培地は、
(i)BMP−15及び/又はBMP−6の有効量、
(ii)卵丘卵母細胞複合体内又は卵胞内の顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
(iii)卵丘卵母細胞複合体内又は卵胞内の顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
の内の一以上を含有する培地。 - 卵母細胞インビトロ成熟培地であって、該培地は、
(i)BMP−15及び/又はBMP−6の有効量、
(ii)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
(iii)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
の内の一以上を含有する培地。 - 卵母細胞及び/又は卵胞の培養培地であって、該培地は、
(i)BMP−15及び/又はBMP−6の有効量、
(ii)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
(iii)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
の内の一以上を含有する培地。 - 培地は卵母細胞の発育能力を改善するために使用される、請求項28に記載の培地。
- 培地は、血清、アルブミン、卵胞液、フェチュイン、卵胞刺激ホルモン(FSH)及び抗アポトーシス成長因子を実質的に含有していない、請求項26〜29のいずれか一項に記載の培地。
- 培地は、40mM〜400mM NaCl、0.1mM〜20mM KCl及び0.1mM〜40mMグルコースの内の一以上を更に含有する、請求項26〜30のいずれか一項に記載の培地。
- 雌性被験体の排卵率を調節するために使用される組成物であって、該組成物は、
(i)被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するBMP−15及び/又はBMP−6の或る特定量、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
の内の一以上を含有する組成物。 - 雌性被験体の卵巣周期又は月経周期の各周期において成熟する卵胞の数を調節するために使用される組成物であって、該組成物は、
(i)被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するBMP−15及び/又はBMP−6の或る特定量、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
の内の一以上を含有する組成物。 - 雌性被験体の受胎能を調節するために使用される組成物であって、該組成物は、
(i)被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するBMP−15及び/又はBMP−6の或る特定量、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
の内の一以上を含有する組成物。 - (i)BMP−15及び/又はBMP−6、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
の内の一以上を含有する組成物又は培地であって、
更に、40mM〜400mM NaCl、0.1mM〜20mM KCl、及び0.1mM〜40mMグルコースを含有する組成物又は培地。 - 凍結融解に起因する顆粒膜細胞アポトーシスを低減するために使用される組成物であって、該組成物は、
(i)活性BMP−15及び/又は活性BMP−6、
(ii)顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(iii)顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
の内の一以上を含有する組成物。 - 凍結に起因する卵丘卵母細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣の損傷を低減するために使用される組成物であって、該組成物は、
(i)有効量の活性BMP−15及び/又は活性BMP−6、
(ii)卵丘卵母細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣の顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
(iii)卵丘卵母細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣の顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
の内の一以上を含有する組成物。 - 卵母細胞を用いた補助生殖方法であって、該方法は、次の各成分、
(i)BMP−15及び/又はBMP−6、
(ii)卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
(iii)卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
の内の一以上を含有する培地において卵母細胞を培養する段階を含む方法。 - 卵母細胞のインビトロ受精方法であって、該方法は、次の各成分、
(i)BMP−15及び/又はBMP−6、
(ii)卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
(iii)卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
の内の一以上を含有する培地において卵母細胞を培養する段階を含む方法。 - 卵母細胞から作製された胚を用いた補助生殖方法であって、該方法は、次の各成分、
(i)BMP−15及び/又はBMP−6、
(ii)卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
(iii)卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
の内の一以上を含有する培地において卵母細胞及び/又は胚を培養する段階を含む方法。 - 卵母細胞の発育能力を評価する方法であって、該方法は、
(i)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のアポトーシスの程度を決定する段階と、
(ii)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内で見られるアポトーシスの程度により卵母細胞の発育能力を評価する段階とを含む方法。 - 卵母細胞の発育能力を評価する方法であって、該方法は、
(i)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のアポトーシスの程度を決定する段階と、
(ii)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内で見られるアポトーシスの程度により卵母細胞の発育能力を評価する段階とを含み、
アポトーシスのレベルの低下は、高い発育能力を有する卵母細胞であることを示し、アポトーシスのレベルの上昇は、低い発育能力を有する卵母細胞であることを示す方法。 - 卵母細胞の発育能力を評価する方法であって、該方法は、
(i)卵母細胞に関連する顆粒膜細胞が曝露されるBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性、卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性レベル、卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性レベル、の内の一以上を決定する段階と、
(ii)上の決定の結果を用いて卵母細胞の発育能力を評価する段階とを含み、
BMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性の上昇、及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性の上昇は、高い発育能力を有する卵母細胞であることを示し、BMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性の低下、及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性の低下は、低い発育能力を有する卵母細胞であることを示す方法。 - 卵母細胞の発育能力を評価する方法であって、該方法は、
(i)卵母細胞内のBMP−15及び/又はBMP−6の発現レベルを決定する、及び/又は卵母細胞が分泌するBMP−15及び/又はBMP−6の濃度を決定する段階と、
(ii)卵母細胞の発育能力を評価する段階とを含み、
BMP−15及び/又はBMP−6の発現及び/又は濃度の上昇は、高い発育能力を有する卵母細胞であることを示し、BMP−15及び/又はBMP−6の発現及び/又は濃度の低下は、低い発育能力を有する卵母細胞であることを示す方法。 - 卵母細胞の発育能力を調節する方法であって、該方法は、次の各段階、
(i)卵母細胞及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(ii)卵母細胞及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(iii)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(iv)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(v)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法。 - 卵母細胞を用いた補助生殖方法であって、該方法は、次の各段階、
(i)卵母細胞又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(ii)卵母細胞及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(iii)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(iv)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(v)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法。 - 卵母細胞のインビトロ受精方法であって、該方法は、次の各段階、
(i)卵母細胞又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(ii)卵母細胞及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(iii)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(iv)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(v)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法。 - 卵母細胞から作製された胚を用いた補助生殖方法であって、該方法は、次の各段階、
(i)卵母細胞又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(ii)卵母細胞及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(iii)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(iv)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(v)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法。 - 卵母細胞の成熟を調節する及び/又は卵母細胞の質を調節する方法であって、該方法は、次の各段階、
(i)卵母細胞及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(ii)卵母細胞及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(iii)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(iv)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(v)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法。 - 卵母細胞の発育能力を改善するために使用される組成物であって、該組成物は、
(i)一以上の付加的な裸化卵母細胞、
(ii)一以上の卵母細胞分泌因子、
(iii)GDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
(iv)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(v)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(vi)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
の内の一以上を含有する組成物。 - 卵母細胞培養培地であって、該培地は、
(i)一以上の付加的な裸化卵母細胞、
(ii)一以上の卵母細胞分泌因子、
(iii)GDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
(iv)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(v)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(vi)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
の内の一以上を含有する培地。 - 培地は、インビトロにおける卵母細胞の成熟のために卵母細胞の発育能力を改善するため、及び/又は卵母細胞の質を改善するために使用される、請求項51に記載の培地。
- 卵母細胞を用いた補助生殖方法であって、該方法は、
(i)一以上の裸化卵母細胞、
(ii)一以上の卵母細胞分泌因子、
(iii)GDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
(iv)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(v)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(vi)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
の内の一以上を含有する培地において卵母細胞を培養する段階を含む方法。 - 卵母細胞のインビトロ受精方法であって、該方法は、
(i)一以上の裸化卵母細胞、
(ii)一以上の卵母細胞分泌因子、
(iii)GDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
(iv)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(v)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(vi)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
の内の一以上を含有する培地において卵母細胞を培養する段階を含む方法。 - 卵母細胞から作製された胚の発育又は発育能力を改善する方法であって、該方法は、次の各段階、
(i)卵母細胞及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(ii)卵母細胞及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(iii)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(iv)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(vi)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法。 - 胚の発育又は発育能力を改善する方法であって、該方法は、次の各段階、
(i)胚が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(ii)胚が曝露されるGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(iii)胚内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(iv)胚内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(v)胚内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法。 - 胚を用いた補助生殖方法であって、該方法は、
(i)一以上の裸化卵母細胞、
(ii)一以上の卵母細胞分泌因子、
(iii)GDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
(iv)胚内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(v)胚内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(vi)胚内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
の内の一以上を含有する培地において胚を培養する段階を含む方法。 - 胚が胚盤胞ステージに進行する可能性を高める方法であって、該方法は、次の各段階、
(i)胚が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(ii)胚が曝露されるGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(iii)胚内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(iv)胚内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
(v)胚内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法。 - 卵母細胞の発育能力を評価する方法であって、該方法は、
(i)卵母細胞及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性を決定する段階、及び/又は
(ii)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を決定する段階、及び/又は
(iii)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を決定する段階、及び/又は
(iv)卵母細胞内及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を決定する段階、及び
(v)卵母細胞及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性、及び/又は卵母細胞内又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性によって卵母細胞の発育能力を評価する段階を含み、
卵母細胞及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性の上昇、及び/又は卵母細胞内又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性の上昇は、高い発育能力を有する卵母細胞であることを示し、卵母細胞及び/又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の濃度及び/又は活性の低下、及び/又は卵母細胞内又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性の低下は、低い発育能力を有する卵母細胞であることを示す方法。 - 卵母細胞の発育能力を評価するための方法であって、該方法は、
(i)卵母細胞内のGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の発現レベルを決定する、及び/又は卵母細胞が分泌したGDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の濃度を決定する段階と、
(ii)卵母細胞の発育能力を評価する段階とを含み、
GDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の発現及び/又は濃度の上昇は、高い発育能力を有する卵母細胞であることを示し、GDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6の発現及び/又は濃度の低下は、低い発育能力を有する卵母細胞であることを示す方法。 - 胚の発育及び/又は発育能力を改善するために使用される組成物であって、該組成物は、
(i)一以上の付加的な裸化卵母細胞、
(ii)一以上の卵母細胞分泌因子、
(iii)GDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
(iv)胚内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(v)胚内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(vi)胚内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
の内の一以上を含有する組成物。 - 胚培養培地であって、該培地は、
(i)一以上の付加的な裸化卵母細胞、
(ii)一以上の卵母細胞分泌因子、
(iii)GDF−9及び/又はBMP−15及び/又はBMP−6、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
(iv)胚内のGDF−9依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(v)胚内のBMP−15依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
(vi)胚内のBMP−6依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
の内の一以上を含有する培地。 - 培地は、胚の発育能力を改善するため、又は胚が胚盤胞ステージに進行する可能性を高めるために使用される、請求項62に記載の培地。
- 卵丘卵母細胞複合体の発現を調節する方法であって、該方法は、次の各段階、
(i)卵丘卵母細胞複合体が曝露されるTGF−β1、GDF−9、BMP−15及びアクチビンの内の一以上の濃度及び/又は活性を調節する段階、
(ii)卵丘卵母細胞複合体内のALK4、ALK5及びALK7受容体の内の一以上により仲介されるシグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法。 - 雌性被験体の排卵を調節する方法であって、該方法は、
(i)雌性被験体において卵丘卵母細胞複合体が曝露されるTGF−β1、GDF−9、BMP−15及びアクチビンの内の一以上の濃度及び/又は活性を調節する剤、
(ii)雌性被験体において卵丘卵母細胞複合体内のALK4、ALK5及びALK7受容体の内の一以上により仲介されるシグナル伝達経路の活性を調節する剤、
の内の一以上を雌性被験体に投与する段階を含む方法。 - 雌性被験体の受胎能を調節する方法であって、該方法は、
(i)雌性被験体において卵丘卵母細胞複合体が曝露されるTGF−β1、GDF−9、BMP−15及びアクチビンの内の一以上の濃度及び/又は活性を調節する剤、
(ii)雌性被験体において卵丘卵母細胞複合体内のALK4、ALK5及びALK7受容体の内の一以上により仲介されるシグナル伝達経路の活性を調節する剤、
の内の一以上を雌性被験体に投与する段階を含む方法。
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