KR20080039397A - 암 치료를 위한 ｓｍｙｄ３의 조절 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 메틸전이효소 활성의 조절자, 특히 SMYD3에 의한 망막모세포종 메틸화의 조절자를 스크리닝하고, 폴리펩타이드의 메틸트랜스페라제 활성을 결정하는 방법을 특징으로 한다. 나아가 본 발명은 그렇게 해서 규명된 조절자를 이용해 대장암, 간암, 방광암 및/또는 유방암의 예방 또는 치료를 위한 방법이나 제약적 합성물을 제시한다.

Description

암 치료를 위한 ＳＭＹＤ３의 조절 방법{METHODS OF MODULATING SMYD３ FOR TREATMENT OF CANCER}

본 발명은 전사 조절에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로는 SMYD3( "ZNFN3A1" 으로도 알려져 있음)로 망막모세포종을 메틸화하는 것을 조절하는 인자과 같이 메틸전이효소 활성을 조절하는 인자의 확인에 관한 것이다. SMYD3는 많은 암에서 높은 수준으로 유지되고 있기 때문에, 그렇게 규명된 SMYD3 조절제(SMYD3 modulators)는 대장암, 간암, 유방암, 방광암 등 각종 암 치료에 유용할 것이다.

본 출원은 2005년 7월 1일 제출된 미국 특허 가출원 제 60/695,957 호를 기초로 우선권을 주장하며, 상기 가출원의 내용 전체는 본 명세서에 참조로서 포함되어 있다.

최근 분자적 연구는 세포주기 조절이 붕괴되는 것이 광범위한 인간 종양의 원인임을 밝혀내고 있다. p53, RB1 또는 p16 유전자의 유전적 변이는 세포주기 진행이 붕괴되서 통제되지 않는 세포증식을 일으키는 인간의 많은 암과 관련되어 있다 (Hanahan, D. & Weinberg, R.A., Cell, 100:57-70, 2000; Sherr, C.J.& McCormick, F. Cancer., Cell, 2:103-12, 2002). 세포 주기에서 G1/S 경계점은 세포주기가 정지하고, 유전체의 무결성(integrity)이 조사되며, 손상된 DNA를 복구하는 단계로, 정상적인 세포, 유전적 특징을 유지하는데 결정적인 역할을 한다. 주요 신호전달경로인 p53과 RB1은 하류 유전자들을 통제함으로써 G1/S 경계점의 조절에 관여한다. p21

^Cip1은 축적된 야생형 p53단백질의 전사촉진을 통해, 손상된 DNA를 가진 세포가 이 경계점에서 정지하도록 유도한다(Sherr, C.F.& Robert, J.M., Genes Dev, 13:1501-12, 1999. 가족성 망막모세포종과 관련돼 분리된 RB1은 (Friend, S.H. et al., Nature, 323:643-6, 1986; Fung,Y.K. et al., Science, 236:1657-61, 1987; Lee,W.H. et al., Science, 235:1394-9, 1987), 세포주기의 진행을 통제함으로써 종양억제유전자로 작용한다. G1기에서 S기로 넘어가면서, 사이클린 의존성 키나제(cyclin dependent kinases (CDK))는 RB1을 인산화함으로써 RB1을 불활성화시킨다. 불충분하게 인산화된 RB1은, DNA 복제와 세포주기 진행에 필요한 유전자의 발현을 조절하는 전사인자인 활성제 E2F를 억제하는데, 이는 E2F들의 활성영역 사이의 직접적인 상호작용, HDAC와 복합체를 형성한 염색질 구조의 변형 및 해당 유전자들의 촉진 부위에 위치한 E2F 결합 부위에 억제자 복합체들이 동원되면서 일어난다.(Weintraub, S.J., Nature, 358:259-61, 1992.; Sellers, W.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11544-8, 1995). CDK4/cyclinD와 같은 CDK/cyclin 복합체에 의해 인산화된 RB1은 E2F와 분리되며, cyclinE, c-Myb,CDK2 및 BCL2를 포함하는 하류 유전자들을 전사촉진시킨다.

본 발명자는 이전에 SMYD3가 히스톤 H3(H3-H4)의 라이신4에 이(디-),삼(트리-)메틸전이효소 활성을 가지며, SMYD3가 과다 발현 시 대장암과 간암,세포의 증식에 결정적인 역할을 한다는 것을 보고한 바 있다(Hamamoto, R. et al., Nat Cell Biol, 6:731-40 ,2004), 이는 과다발현된 SMYD3가 NIH3T3 세포의 성장 촉진을 일으키고, 몇몇 암세포에서 SMYD3의 발현을 녹다운(knockdown) 시키면 그 세포들의 성장저해와 세포사멸(apoptisis)이 일어나게 되기 때문이다. 그러나 SMYD3의 과다발현이 성장촉진을 일으키는 명확한 메커니즘은 알려지지 않았다. 아세틸화, 인산화 및/또는 메틸화로 일어나는 히스톤의 변형은, 염색질의 구조를 조절해 다른 분자들을 끌어들임으로써 전사를 활성화시키거나 불활성화시키게 된다. 히스톤의 라이신 메틸화에 대해 살펴보면, H3-K4, H3-K36, H3-K79의 경우 이질염색질(heterochromatin)이 진정염색질(euchromatin)로 구조변화를 일으킴으로써 전사활성에 관여하게 되는 반면 (Im,H.et al., J Biol Chem, 278:18346-52, 2003.; Bannister, A.J. et al., J Biol Chem, 280:17732-6, 2005.; Schneider,R. et al., Nat Celll Biol, 6:73-77, 2004), H3-K9, H3-K27, H4-K20의 메틸화는 이질염색질 구조로 전사를 억제시킨다.(Schotta,G.et al., Genes DEv, 18: 1251-62, 2004.; Nakayama,J. et al., Science, 292:110-3, 2001.; Kirmizis,A.et al., Genes Dev, 18:1592-605, 2004)

발명의 개요

본 발명은 적어도 부분적으로는 SMYD3의 824번 라이신 메틸화를 통한 RB1 조절의 새로운 메커니즘을 발견한 것에 기반한 것이다. ZNFN3A1이라는 유전자 이름으로도 알려져 있는 SMYD3는, 히스톤 H3 메틸전이효소로, 대부분의 대장암과 간암(예컨데, WO 2003/027413 참조), 방광암, 유방암에서 상향조절된다.

RB1의 C-말단 부위는 SMYD3의 SET 영역과 상호작용한다. 더구나, SMYD3는 체내외에서 RCDK2/cyclinE 또는 CDK6/cyclinD3 복합체에 의해 RB1의 821/826 및 807/811의 인산화를 촉진시키며, 이는 HEK293 세포에서, E2F의 전사활성화능력을 증가시킨다. 이러한 결과는, SMYD3 발현 강화가 암세포에서 RB1의 수식 및 E2F의 뒤이은 전사 활성화를 통한 세포 주기 진행을 촉진시킨다는 것을 의미한다. 이러한 최근의 발견은 RB1의 조절에 관한 새로운 메커니즘을 제안한다. 더구나, 본 발견은 발암, 특히 대장암, 간암, 방광암, 유방암의 발암을 이해하는데 도움이 되며, 이는 이들 암들의 새로운 치료전략을 세우는 것으로 연결될 것이다.

그러므로, SMYD3를 이용하여 망막모세포종의 메틸화를 조절하는 물질을 규명하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

(a) 망막모세포종 펩타이드의 메틸화에 적당한 조건 하에서, 메틸전이효소 활성을 가진 SMYD3 폴리펩타이드를 메틸화될 망막모세포종 펩타이드, 보조인자 및 시험 물질과 접촉시키는 단계;

(b) 망막모세포종의 메틸화 정도를 검출하는 단계;및

(c) 단계(b)에서 검출된 메틸화 정도를 상기 물질의 부재 하 검출된 조절 정도와 비교하는 단계.

조절 정도와 비교된 메틸화 정도의 증가 또는 감소로, SMYD3를 이용해 망막모세포종의 메틸화를 조절하는 인자를 알 수 있다.

(a) 메틸전이효소 활성을 갖는 SMYD3 폴리펩타이드, (b) SMYD3 폴리펩타이드에 의해 메틸화 될 수 있는 망막모세포종 펩타이드 및(c) 망막모세포종 펩타이드의 메틸화를 위한 보조인자를 포함하는 키트와 같이, 망막모세포종의 메틸화를 조절하는 시험 화합물의 활성을 검출하기 위한 키트를 제공하는 것이 본 발명의 더 나아간 목표이다. 구체적으로는, 상기 키트는 S-아데노실 호모시스테인 가수분해효소(S-adenosyl homocysteine hydrolase (SAHH))를 포함할 수도 있다.

본 발명은, 더 나아가 (a) 상기 방법에 따라 메틸화를 조절하는 시험 화합물을 규명하는 단계 및 (b) 상기 시험 화합물의 부존재 하 검출된 메틸화 조절 정도에 비하여, 메틸화될 기질의 메틸화 정도를 감소시키는 시험 화합물을 선택하는 단계를 포함하는 방법과 같이, 대장암, 간암, 방광암, 유방암과 같은 암을 치료하기 위한 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명은 더 나아가 상기 방법으로 확인된 화합물의 약학적으로 유효한 양 및 약학적으로 허용 가능한 담체로 구성되는, 대장암, 간암, 방광암, 유방암과 같은 암의 통증 경감을 위한 조성물을 제공한다.

상기 방법으로 확인된 화합물의 약학적으로 유효한 양을 암세포에 접촉시키는 단계를 포함하는, 대장암, 간암, 방광암, 유방암과 같은 암의 통증 경감 방법도 본 발명의 목표이다.

본 발명의 목표들, 특징 및 이점들은 이에 관한 특허청구범위, 도면, 실시예와 함께 하단에 기술할 상세한 설명 부분을 읽으면 더욱 명확해 질 것이다.

본 명세서에서 따로 정의되지 않은 모든 기술적/과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 일반적으로 이해되는 것들과 동일한 의미를 갖는다. 또한, 별도로 표시하지 않는한, 여기서 사용하는 "하나의", "그"라는 단어들은, "최소한 하나"라는 뜻이다.

비록 상기 기재된 것들과 유사하거나 동등한 방법들, 물질들이 본 발명의 실시나 시험에 사용될 수 있기는 하지만, 하단에 적합한 방법과 물질들을 기재하였다.

여기서 언급된 출판물, 특허출원, 특허나 다른 참고문헌들은 모두 참조로 본 문서에 포함되어 있다. 만약 모순될 경우, 정의를 포함한 본 명세서는 이를 수정할 것이다. 또한, 물질들, 방법들, 실시예들은 본 발명을 예시하는 것일뿐, 이것들로 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

발명의 상세한 설명

SMYD3 cDNA는 염기서열번호 1에 기재된 1284 뉴클레오타이드들로 된 개방형 해독틀(open reading frame)을 포함하는 1622 뉴클레오타이드들을 포함한다. 상기 열린 해독틀은 염기서열번호 2에서와 같이, 징크 핑거 모티브와 SET 영역을 이루는 428개 아미노산으로 이루어진 단백질을 코딩한다. 징크핑거 영역은 49번째 아미노산부터 87번째 아미노산까지이며, SET (Su 3-9, Enhancer-of-zeste, Trihorrax)영역은 117번째 아미노산부터 246번째 아미노산까지이다.

SMYD3 단백질의 세포 내 위치는 배양된 세포의 농도에 따라 세포주기 진행 동안 바뀐다. SMYD3 단백질은 세포가 S기 중기에서 말기로 가거나, 세포가 부족한 조건에서 배양될 때 핵에 축적된다. 그러나, SMYD3 단백질은 세포가 세포주기의 다른 기(phase)에 있거나, 밀집된 조건에서 배양될 때에는 핵에도 있지만, 세포질에도 위치한다.

이런 식으로 본 발명은 SMYD3 메틸전이효소 활성을 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 SMYD3 폴리펩타이드나 메틸전이효소 활성을 갖는 기능적 동등체인 폴리펩타이드를 망막모세포종 단백질과 접촉시키고, 접촉된 SMYD3나 그 기능적 동등체의 메틸전이효소 활성을 측정함으로써 수행된다. 이렇게 해서 SMYD3나 기능적 동등체의 메틸전이효소 활성을 조절하는 물질을 규명할 수 있다.

본 발명에서, "기능적 동등체"란, 피검 단백질이나 폴리펩타이드가 SMYD3와 동일하거나 거의 동일한 메틸전이효소 활성을 갖는다는 뜻이며, 특히 824번 라이신를 포함하는 망막모세포종 단백질 또는 그 조각의 메틸화를 촉매한다. 피검 단백질이 목적한 활성을 가졌는지 여부는 본 발명에 의해 정형적으로 결정된다. 즉, 메틸전이효소 활성은, (a) 기질의 메틸화가 적합한 조건 하, 폴리펩타이드를 기질(예컨데, 라이신824를 포함하는 망막모세포종 단백질이나 그 조각)과 보조인자(예컨데, 에스-아데노실-엘-메티오닌(S-adenosyl-L-methionine))와 접촉시키고, (b) 기질의 메틸화 정도를 검출함으로써 결정된다.

여기에서 사용하듯, "망막모세포종 펩타이드"란, 망막모세포종 단백질의 돌연변이체나 조각은 물론, 망막모세포종 전장 단백질을 가리킨다. 기능적인 조각의 예는 아미노산 769에서 921까지(염기서열번호 4)로 구성된 조각과 같은 C-말단 조각이지만 여기에 한정하는 것은 아니다. 이 때, 824 자리에 라이신 잔기를 갖는 조각이 바람직하다. 기능적 돌연변이의 예는 전장 망막모세포종 단백질의 메틸화 능력이 남아있는 다음 RB1 돌연변이지만, 여기에 한정하는 것은 아니다: K889A, K896A, K791A, K814A, K791A/K824A, K814A/K824A.

주어진 단백질의 기능적 동등체인 단백질을 만드는 방법은 본원발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있으며, 이는 단백질에 돌연변이를 일으키는 전통적인 방법을 포함한다. 예를 들어, 인간의 SMYD3 단백질의 아미노산 서열에 위치-지정 돌연변이를 일으켜 적절한 돌연변이체를 만드는 방법으로 인간 SMYD3 단백질과 기능적으로 당량인 단백질을 만들 수 있다(예: Hashimoto-Gotoh,T. et al., Gene, 152:271-275, 1995; Zoller,MJ, and Smith,M., Methods Enzymol, 100:468-500, 1983; Kramer,W. et al., Nucleic Acids Res, 12:9441-9456, 1984; Kramer W, and Fritz HJ., Methods, Enzymol, 154:350-367, 1987; Kunkel,TA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82:488-492, 1985). 아미노산 돌연변이는 자연상태에서도 일어날 수 있다. 본 발명에서 유용한 SMYD3 폴리펩타이드는, 한두 개의 아미노산이 돌연변이를 일으켜 인간 SMYD3 단백질과 기능적 동등체인 돌연변이 단백질를 만드는, 인간 SMYD3 단백질의 아미노산 서열을 가진 단백질들로, 특히 인간 SMYD3 단백질의 메틸전이효소 활성이 남아있는 것들이다. 이러한 돌연변이체의 돌연변이가 일어날 아미노산의 수는 일반적으로 20개 아미노산이나 그 이하이며, 바람직하게는 10개나 그 이하, 더 바람직하게는 6개 이하이며, 더욱 더 바람직하게는 3개 이하이다. 메틸전이효소 활성을 유지하기 위해, SET-영역의 "NHSCXXN"과 "GEELXXXY"는 돌연변이가 된 단백질 아미노산 서열에서도 보존되는 것이 바람직하다.("X"는 어떤 아미노산이든 가능하다.)

돌연변이가 일어나거나 변형된 단백질들, 즉 특정 아미노산 서열의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 결손, 삽입 및/또는 대체됨으로써 아미노산 서열이 변형된 단백질들은 원래 단백질의 생물학적 활성을 유지하는 것으로 알려져 있다. (Mark, D.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:5662-5666, 1984.; Zoller, M.J. & Smith, M., Nucleic Acids Research, 10:6487-6500, 1982; Wang, A. et al., Science, 224:1431-1433, Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6409-6413, 1982).

돌연변이가 일어날 아미노산 잔기는 아미노산 측쇄의 특성이 보존되도록 다른 아미노산으로 돌연변이가 일어나는 것이 바람직하다("보존적 아미노산 치환 (conservative amino acid substitution)"이라고 알려진 과정). 아미노산 측쇄의 예에는, 소수성 아미노산들(A,I,L,M,F,P,W,Y,V), 친수성 아미노산들(R,D,N,C,E,Q,G,H,K,S,T) 및 하기 기능기 도는 특성을 공동으로 갖는 측쇄를 포함한다:지방족 측쇄(G,A,V,L,I,P); 수산기를 포함하는 측쇄(S,T,Y); 황원자를 포함하는 측쇄(C,M); 카복실기와 아마이드를 포함하는 측쇄(D,N,E,Q); 염기를 포함하는 측쇄(R,K,H); 방향족을 포함하는 측쇄(H,F,Y,W). 삽입된 문자들은 아미노산의 한 문자 부호(code)이다.

인간 SMYD3 단백질(서열번호 2)의 아미노산 서열에 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 첨가된 단백질의 한 예가 인간 SMYD3 단백질을 포함한 융합 단백질이다. 융합단백질은, 인간 SMYD3 단백질과 다른 펩타이드나 단백질의 융합을 포함하며, 본 발명에 이용된다. 융합 단백질은, 이 발명의 인간 SMYD3 단백질을 코딩하는 DNA와 상기 다른 펩타이드나 단백질을 코딩하는 DNA를 연결해, 틀을 맞추고(frames match) 융합 DNA를 발현벡터에 넣어 숙주에서 발현시키는 것과 같이 당업자에게 잘 알려진 기술로 만들 수 있다. 펩타이드나 단백질이 본 발명의 단백질에 융합되는 데는 아무런 제한이 없다.

SMYD3 단백질에 융합될 수 있다고 알려진 펩타이드들은, FLAG(Hopp,T.P.et al., Biotechnology, 6:1204-1210, 1988), 6개의 His(Histidine)잔기를 포함한 6xHis, 10xHis, Influenza agglutinin(HA), 인간 c-myc 단편, VSP-GP 단편, p18HIV 단편, T-7-태그(tag), HSV-태그, E-태그, SV40T 항원 단편, lck 태그, 알파-튜불린(α-tubulin) 단편, B-태그, C 단백질 단편 및 이 외 그와 동등한 것들을 포함한다. 본 발명의 단백질에 융합될 수 있는 단백질들은, GST(glutathione-S-transferase), 인플루엔자 아글루티닌(influenza agglutinin(HA)), 면역글로불린(immunoglobulin) 불변부위(constant region), 베타-갈락토시다제(β-galactosidase), MBP(maltose-결합 단백질)과 같은 것들이다.

융합 단백질들은 상기 융합 펩타이드나 단백질을 코딩하는, 상업적으로 이용가능한 DNA와 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA를 융합하고 융합된 DNA를 발현시킴으로써 만들 수 있다.

기능적으로 동등한 단백질들을 분리하는 것으로 알려진 대체 방법은, 상동서열들(homologous sequences)을 확인하기 위해 잡종화 기술을 사용하는 것이다(Sambrook,J.et al., Molecular Cloning 2nd ed, 9:47-9,58, Cold Spring Harbor Lab.Press, 1989). 당업자는 쉽게 인간 SMYD3 단백질을 코딩하는 SMYD3 DNA 서열(예를 들어, 서열번호 1)의 전체 또는 일부와 높은 상동성을 갖는 DNA를 분리하고, 분리된 DNA를 이용해 인간 SMYD3 단백질과 기능적으로 동등한 단백질들을 분리해 낼 수 있다. 본 발명에서 사용되는 단백질들은, 인간 SMYD3 단백질들을 코딩하는 DNA 서열의 전체 또는 일부와 잡종화된 DNA가 코딩하는 단백질들이나 인간 SMYD3 단백질과 기능적으로 동등한 단백질들이다. 이러한 단백질들은 인간이나 마우스(mouse)로부터 유래한 단백질에 대응하는 포유동물 상동체들(homologues)(예를 들면, 원숭이, 래트(rat), 소 유전자가 코딩하는 단백질)을 포함한다. 인간 SMYD3 단백질을 코딩하는 DNA에 상당히 상동적인 cDNA를 동물로부터 분리하는데 있어서, 특히 골격근, 고환, 간암이나 대장암의 조직을 이용하는 것이 선호된다.

당업자는 인간 SMYD3 단백질의 기능적 동등체를 코딩하는 DNA를 분리하기 위한 잡종화 조건을 정형적으로 선택할 수 있다. 예를 들어, 30분이나 그 이상, Rapid-hyb buffer"(Amersham LIFE SCIENCE)를 이용하여 68℃에서 예비잡종화(prehybridization)를 수행하고, 표지된 탐침을 붙인 후, 68℃에서 1시간이나 그 이상 덥혀서 잡종화를 시킬 수 있다. 예컨데, 다음 세척 단계는 낮은 엄격 조건(low stringent condition)에서 수행될 수 있다. 낮은 엄격 조건이란 예를 들어, 42℃, 2X SSC, 0.1% SDS나 바람직하게는 50℃,2X SSC, 0.1% SDS이다. 더욱 더 바람직하게는 높은 엄격 조건이 사용된다. 본 발명의 경우, 높은 엄격 조건은 예컨데 실온에서 20분간 2X SSC, 0.01% SDS에서 3회 세척한 후, 37℃에서 20분간 1x SSC, 0.1% SDS에서 3회 세척하고, 20분간 50℃에서 1x SSC, 0.1% SDS에서 2회 세척하는 것을 포함한다. 그러나 온도나 염농도와 같은 몇몇 요인들이 잡종화의 엄격성에 영향을 미치고, 당업자는 원하는 엄격성을 얻기 위해 각 요인들을 적당히 선택할 수 있다.

잡종화를 시킬 때, 예를 들면 중합효소연쇄반응(PCR)과 같은 유전자 증폭방법의 경우, 인간 SMYD3 단백질(서열번호 2)을 코딩하는 DNA(서열번호 1)의 서열정보에 기초해 합성된 프라이머(primer)를 이용하여, 인간 SMYD3 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코딩하는 DNA를 분리하는데 사용된다.

상기 잡종화 기술이나 유전자 증폭 기술에 의해 분리된 DNA가 코딩하는, 인간 SMYD3 단백질의 기능적 동등체들인 단백질들은 일반적으로 인간 SMYD3 단백질의 아미노산 서열과 높은 상동성을 갖는다. "높은 상동성("높은 동일성"이라고도 함)"이란, 보통 최선으로 정렬된 두 서열들(폴리펩타이드나 폴리뉴클레오타이드 서열들) 사이의 동일성 정도를 말한다. 높은 상동성 또는 동일성이란, 일반적으로 40%나 그 이상의 상동성, 바람직하게는 60%나 그 이상의 상동성, 더 바람직하게는 80%나 그 이상의 상동성, 더욱 더 바람직하게는 85%, 90%, 95%, 98%, 99%나 이보다 더 높은 것을 말한다. 두 폴리펩타이드나 폴리뉴클레오타이드 서열들 사이의 상동성이나 동일성 정도는 "Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:726-730, 1983" 의 알고리즘으로 결정된다.

본 발명에서 유용한 단백질은 이를 만드는 세포나 숙주, 정제방법에 따라 아미노산 서열, 분자 질량, 등전점, 당 사슬(sugar chains)의 존재 여부나 형태가 다양할 수 있다. 그래도 역시 인간 SMYD3 단백질(서열번호 2)의 기능적 동등체인 한, 본 발명에서 사용할 수 있다.

본 발명에서 유용한 단백질은 당업자에게 잘 알려진 방법들을 통해 재조합 단백질이나 천연 단백질로부터 만들 수 있다. 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA(예를 들면 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 DNA)를 적당한 발현 벡터에 끼워 넣고, 그 벡터를 적당한 숙주 세포에 도입하고, 추출물을 얻어, 그 추출물을 크로마토그래피-예를 들면, 이온교환 크로마토그래피, 역상(reverse phase)크로마토그래피, 겔 여과 또는 본 발명의 단백질에 대한 항체가 고정된 원통(column)을 이용한 친화크로마토그래피나 상기 원통들을 하나 이상 결합한 것에 넣어 단백질을 분리정제하여, 재조합 단백질을 만들 수 있다.

또한, 본 발명에서 유용한 단백질이 숙주세포(예를 들면 동물세포나 E.coli)에서 글루타티온-에스-트랜스페라제(glutathione-S-transferase) 단백질과 함께 융합 단백질로 발현되거나, 다수의 히스티딘이 부가되어 재조합 단백질로 발현될 경우, 발현된 재조합 단백질은 글루타티온(glutathione) 칼럼이나 니켈 칼럼을 사용하여 정제될 수 있다. 필요한 경우 융합 단백질을 정제한 후, 트롬빈(thrombin)이나 인자-Xa(factor-Xa)로 잘라내 목적 단백질 외 부위를 배제하는 것 또한 가능하다.

천연 단백질은, 예를 들면, 하기 기재된 SMYD3 단백질에 결합하는 항체가 부착된 친화성 원통(affinity column)과 본 발명의 단백질을 발현시키는 조직이나 세포들의 추출물을 접촉시키는 것과 같이 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 분리될 수 있다. 상기 항체들은 다중클론(polyclonal) 항체일 수도 있고 단일클론(monoclonal) 항체일 수도 있다.

본 발명에서, SMYD3 폴리펩타이드의 메틸전이효소 활성은 당해 기술분야에서 알려진 방법들로 확인될 수 있다. 예를 들어, 적절한 분석 조건 하, SMYD3 폴리펩타이드와 망막모세포종 펩타이드 기질을 표지된 메틸 공여자와 함께 배양할 수 있다. 바람직한 메틸 공여자들은 에스-아데노실-[메틸-¹⁴C]-엘-메티오닌(S-adenosyl-[methyl-¹⁴C]-L-methionine)과 에스-아데노실-[메틸-³H]-엘-메티오닌(S-adenosyl-[methyl-³H]-L-methionine)이지만, 여기에 한정되는 것은 아니다. 방사성표지가 망막모세포종 펩타이드로 이동한 것은, 예를 들면 SDS-PAGE 전기영동이나 형광도법(fluorography)로 검출할 수 있다. 또한, 상기 반응 후, 망막모세포종 펩타이드는 여과에 의해 메틸 공여자와 분리될 수 있고, 여과지에 남아 있는 방사성표지는 섬광계수기로 정량될 수 있다. 당 업계에는 발색 표지나 형광표지와 같이 메틸 공여자에 부착될 수 있는 다른 표지들이나 그러한 표지들이 망막모세포종 펩타이드로 이동하는 것을 검출할 수 있는 방법들이 알려져 있다.

또한 SMYD3의 메틸전이효소 활성은 에스-아데노실-엘-메티오닌과 같이 표지되지 않은 메틸 공여자나 메틸화된 펩타이드를 선택적으로 인식하는 시약을 이용해 검출할 수 있다. 예를 들면 기질의 메틸화에 적합한 조건에서, SMYD3, 메틸화시킬 기질, 메틸 공여자를 배양한 다음, 메틸화된 기질을 기존의 면역학적 방법으로 검출할 수 있다. 메틸화된 기질을 인식하는데 항체를 사용하는 것이기만 하면, 어떤 면역학적 기술이든 검출하는데 사용할 수 있다.

게다가 Lys 824에서의 RB1의 메틸화는 Ser 807과 Ser 811에서의 RB1의 인산화를 촉진시킨다는 것이 확인되었다. 따라서 달리 말하면, RB1의 인산화를 통해 RB1의 메틸화 정도를 추정할 수 있다. RB1의 인산화는 CDK2나 CDK6와 같은 활성효소(kinase)를 필요로 할 수 있다. 방사성표지된 인 공여자를 이용해 RB1의 인산화를 검출할 수도 있다. 또한 RB1의 인산화 자리를 인식하는 항체를 이용해서도 RB1의 인산화 정도를 추정할 수 있다.

다양한 저속화(low-throughput) 및 고속화(high-throughput) 효소 분석 포맷(format)들이 알려져 있으며 SMYD3의 메틸전이효소 활성을 검출하고 측정하는데 쉽게 이용할 수 있다. 고속화 분석을 위해서, 망막모세포종 펩타이드 기질을 편리하게 멀티웰 플레이트(multiwell plate)나 슬라이드(slide), 칩(chip)과 같은 고체 지지대 위에 고정한 후, 상기 방법들을 사용해 고체 지지대 상에서 메틸화된 생성물을 검출할 수 있다. 또한 메틸전이효소 반응은 용액에서 일어날 수 있으며, 그 후 망막모세포종 펩타이드를 고체 지지대 상에 고정하고, 메틸화된 생성물을 검출한다. 이러한 분석을 쉽게 하기 위해, 고체 지지대를 비오틴(biotin)으로 표지된 망막모세포종 및 스트렙타비딘(streptavidin)으로 코팅(coating)할 수 있으며, 항-망막모세포종 항체(항-retinoblastoma antibodies)로도 코팅할 수 있다. 숙련된 사람은 스크리닝(screening)을 할 적당한 처리량을 고려해 적절한 분석 포맷을 선택할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 단백질의 펩타이드 조각의 용도도 제시한다. 펩타이드 조각은 SMYD3 단백질의 특이적인 아미노산 서열을 갖으며, 약 400개 아미노산 이하, 바람직하게는 약 200개 아미노산 이하, 더 바람직하게는 약 100개 아미노산 이하로 이루어져 있고, 최소한 약 7개 아미노산, 바람직하게는 약 8개 아미노산이나 그 이상, 더욱더 바람직하게는 약 9개 아미노산이나 그 이상으로 이루어져 있다. 펩타이드 조각은 예를 들면 SMYD3에 결합하는 물질이나 화합물을 찾기 위해 스크리닝을 하거나 SAM 등 보조인자와 SMYD3 사이의 결합을 저해하는 것을 찾기 위해 스크리닝을 할 때 사용한다. 이런 스크리닝을 하는데는 SET-영역을 포함하는 펩타이드 조각을 많이 사용한다.

본 발명에서 유용한 펩타이드 조각은, 유전 공학이나 펩타이드 합성 또는 적절한 펩타이드 분해효소(peptidase)로 본 발명의 단백질을 분해해서 만들 수 있다. 예를 들면, 고체 상 합성이나 액체 상 합성을 통해 펩타이드를 합성할 수 있다.

SET-영역에 돌연변이를 일으킨 SMYD3 돌연변이체는 세포 증식에 억제효과를 보인다. 그러므로, SMYD3의 펩타이드 조각은 "NHSCXXN" 및/또는 "GEELXXXY"인 SET-영역을 포함하는 것이 바람직하다.

시험 물질에는 제한이 없다. 예를 들면, 세포 추출물, 세포배양 상청액, 미생물 배양 산물, 해양 미생물로부터 추출한 추출물, 식물 추출물, 정제되거나 천연 상태의 단백질들, 펩타이드들, 비펩타이드성(non-peptide) 화합물들, 미세분자(micromolecular) 합성화합물 및 천연화합물 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에 기재된 분석에 유용한 시험 물질이나 화합물은 메틸전이효소 활성이 부족한 SMYD3 펩타이드 조각이나 SMYD3에 특이적으로 결합하는 항체의 형태도 취할 수 있다. 예컨데, SMYD3와 그것의 망막모세포종 기질 간 결합을 막는 능력을 검사하는데 단일클론 항체와 같은 항체들을 사용할 수 있다.

본 발명에서 스크리닝 방법으로 분리해낸 물질이나 화합물은 SMYD3의 메틸전이효소 활성을 저해하는 약의 후보물질이며, 따라서 간암, 대장암, 유방암 및/또는 방광암의 치료나 예방에 적용될 수도 있다.

게다가, 상기 스크리닝 방법으로 얻을 수 있는 물질이나 화합물에는, SMYD3의 메틸전이효소 활성을 저해하는 물질이나 화합물의 일부가 첨가, 결실 및/또는 대체로 전환된 것들도 포함된다.

상기와 같이, SMYD3의 메틸전이효소 활성이 부족한 펩타이드 조각이나 SMYD3의 항체들도, SMYD3의 메틸전이효소 활성을 저해하는 물질이나 화합물이 될 수 있다. 여기에 사용되었듯이 "항체"란 용어는 특정 구조를 가진 면역글로블빈(immunoglobulin) 분자로, 항체형성에 사용되는 항원이나 그와 밀접한 항원과만 반응(예를 들면, 결합)하는 것을 말한다. 게다가, SMYD3에 의해 코딩된 단백질과 결합하는 한, 항체는 항체조각이거나 변형된 항체여도 괜찮다. 예를 들면, 항체 조각은 적절한 링커(linker)로 중쇄(H chains)과 경쇄(L chains)의 Fv 조각들이 적절히 연결된 단일쇄 Fv (single chain Fv, scFv)나 F(ab')₂ 또는 Fab가 될 수 있다(Huston J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:5879-5883, 1988). 더욱 특이적으로, 파파인(papain)이나 펩신(pepsin)과 같은 효소로 항체를 처리해 처리해 항체 조각을 만들 수도 있다. 또는 항체 조각을 코딩하는 유전자를 제조하여 발현 벡터에 삽입한 후, 적절한 숙주 세포에서 발현시킬 수도 있다(예컨데, Co M.S.et al., J.Immunol, 152:2968-2976, 1994); Better M. & Horwitz A.H., Methods Enzymol, 178:476-496, 1989; Pluckthun A. & Skerra A., Methods Enzymol, 178:497-515, 1989; Lamoyi E., Methods Enzymol, 121:652-663, 1986; Rousseaux J. et al., Methods Enzymol, 121:663-669, 1986; Bird R.E. & Walker B.W.Trends Biotechnol, 9:132-137, 1991).

폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol(PEG))과 같은 다양한 분자들과 접합시켜 항체를 수식(modify)할 수도 있다. 본 발명은 그러한 수식화된 항체들을 제시한다. 수식화된 항체는 항체를 화학적으로 수식해서 얻을 수 있다. 그러한 수식화 방법은 당 업계에 이미 알려져 있다. 또한, 항체는 인간 이외 항체에서 유래한 가변 부위와 인간 항체로부터 유래한 불변 부위로 이루어진 키메릭(chimeric) 항체 또는 인간 이외 항체로부터 유래한 상보성결정부위(complementarity determining region (CDR)), 인간 항체로부터 유래한 기본틀부위(framework region (FR)), 불변부위로 이루어진 인간화 항체(humanized antibody)로 구성될 수 있다. 이러한 항체들은 기존의 기술들을 이용해 만들 수 있다. 설치류(rodent)의 CDR들이나 CDR 서열들로 인간 항체의 상보적인 서열을 치환함으로써 인간화(humanization)을 할 수 있다. 따라서, 이러한 인간화 항체는, 실질적으로는 본래의 인간 가변 영역이 인간 외 종들의 상보적인 서열로 치환된 것이 전혀 아닌 키메릭 항체이다.

인간 기본틀 부위 및 불변 부위, 인간 가변 부위로 이루어진 완전한 인간 항체 또한 이용할 수 있다. 이러한 항체들은 당 업계에 알려진 다양한 기술을 사용하여 만들 수 있다. 예컨데 박테리오파지에 구현된 인간 항체 조각들의 재조합체 도서관 이용과 관련된 시험관 내 방법도 사용될 수 있다(예를 들면, Hoogenboom & Winter, J.Mol.Biol.227:381(1991)). 유사하게, 예를 들어, 내생적으로 이뮤노글로빈 유전자가 부분적 또는 완전히 불활성화된 마우스와 같은, 형질전환(transgenic) 동물에 인간 면역글로불린 부위를 삽입해 인간 항체를 만들 수 있다. 이러한 접근법은 예를 들면, U.S. Patent Nos.6,150,584,5,545,807; 5,545,806;5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016에 기재되어 있다.

인간이나 마우스, 랫, 기니피그, 토끼, 고양이, 쥐, 개, 양, 돼지, 소, 원숭이, 비비, 침팬지 등 동물들의 의약으로 사용하기 위해 본 발명의 방법을 이용해 분리한 물질이나 화합물을 투여할 때에는, 이 분리된 물질이나 화합물을 직접적으로 투여되거나, 기존의 조제 방법을 이용해 1회 분량으로 제작해 투여할 수 있다. 예를 들면, 필요한 경우, 이러한 의약들은 설탕으로 코팅된 알약이나 캡슐, 엘릭시르(elixir), 마이크로캡슐과 같이 경구투여가 가능한 것들일 수도 있고, 물이나 다른 약학적으로 가능한 액체로 된 현탁액(suspension)이나 무균용액(sterile solution)들이 든 주사제의 형태로 된 것, 즉 경구투여하지 않는 것들일 수도 있다. 예를 들어, 이러한 물질이나 화합물들은, 일반적인 의약사용을 위해 1회투약분이 개별단위로 포장된 형태(a unit dose form)로, 약학적으로 사용 가능한 담체 또는 매질, 특히 멸균된 물, 생리식염수, 식물성 기름, 유화제, 현탁제, 계면 활성제, 안정제, 향미제(flavoring agent), 부형제(excipient), 매개제(vehicle), 보존제, 결합제 등과 혼합될 수 있다. 이러한 의약 제조에서 지시된 가능한 범위 내에서 적절한 투여량으로 주성분의 양을 정하게 된다.

알약이나 캡슐과 혼합될 수 있는 첨가물들은 예를 들면, 젤라틴(gelatin), 옥수수 전분, 트라가칸스 고무(tragacanth gum), 아라비아 고무 등 결합제들이나 셀룰로스 결정(crystalline cellulose)와 같은 첨가제들, 옥수수 전분, 젤라틴, 알긴산(alginic acid)등 팽윤제들(swelling agents), 스테아린산 마그네슘(magnesium stearate)와 같은 윤활제들, 수크로스(sucrose), 락토스(lactose), 사카린(saccharin) 등 감미료, 박하, 가울테리아 아데노트릭스(Gaultheria adenothrix) 기름, 체리와 같은 향미제 등이다. 만약 개별단위로 포장된 형태가 캡슐이라면, 기름과 같은 액체 운반체도 이러한 성분에 포함될 것이다. 주사액에 사용되는 증류수와 같은 매개제를 이용해 하기 일반적으로 의약을 사용하는 식으로 주사액에 사용되는 멸균된 합성물을 만들 수 있다.

D-솔비톨(sorbitol), D-만노스(mannose), D-마니톨(mannitol), 염화나트륨과 같은 보조제을 포함하는 등장성 용액, 글루코스, 생리식염수는 주사약 수용액으로 이용할 수 있다. 이러한 것들은 알콜, 특히 에탄올과 같은 적절한 용해화제(solubilizer)나 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)과 같은 폴리알콜(polyalcohol), 또는 HCO-50, 폴리솔베이트 80 (Polysorbate 80 (TM))과 같은 비이온성(non-ionic) 계면활성제들과 함께 사용할 수 있다.

참기름이나 콩기름은 유성 액체(oleaginous liquid)로 이용가능한데, 벤질벤조에이트(benzyl benzoate)나 벤질 알콜(benzyl alcohol)과 같은 용해화제, 인 완충용액(buffer) 또는 아세트산나트륨(sodium acetate) 완충용액과 같은 완충용액, 염산프로카인(procaine hydrochloride)과 같은 마취제나 진통제, 벤질알콜이나 페놀과 같은 안정화제, 항산화제와 함께 사용할 수 있다. 이렇게 만들어진 주사약을 적절한 앰플(ampule)에 넣는다.

본 발명의 약학적 합성물을 환자에게 투약하는 데는, 동맥주사, 정맥주사, 경피주사(percutaneous injection), 비강내 투여, 근육내 투여, 경구 투여와 같이 널리 알려진 방법들이 사용된다. 투약 시 1회 용량(dosage)이나 방법은 환자의 몸무게, 나이, 투약방법에 따라 다양하며, 이때 당업자는 적절한 투약방법을 용이하게 선택할 수 있다. 게다가 그 물질이나 화합물을 DNA로 코딩할 수 있다면, 그 DNA를 유전자 치료를 위해 벡터에 삽입시키고, 그 벡터를 환자에게 투약해 치료를 할 수 있다. 그 투약 시 1회 용량 및 방법은 환자의 몸무게, 나이, 증세에 따라 달라지지만, 당업자는 이들을 용이하게 선택할 수 있다.

예를 들면, SMYD3에 결합하여 그 활성을 조절하는 물질 및 화합물의 1회 용량은 증세에 따라 다르기는 하지만, 정상적인 성인(몸무게 60kg)에게 경구 투여시, 보통 하루에 대략 0.1mg에서 약 100mg까지의 범위이며, 바람직하게는 하루에 약 1.0mg에서 약 50mg까지이고, 더욱 바람직하게는 하루에 약 1.0mg에서 약 20mg까지이다.

비경구 투약시, 환자나 의약이 목적하는 기관(organ), 증세, 투약방법에 따라 어느 정도 차이가 있기는 하지만, 정상적인 성인(몸무게 60kg)에게 주사 형태로 하루에 대략 0.01mg에서 약 30mg까지, 바람직하게는 하루에 약 0.1에서 약 20mg까지, 더 바람직하게는 하루에 약 0.1에서 약 10mg까지 투여하는 것이 적합하다. 또한 다른 동물들의 경우에도 마찬가지로, 60kg의 몸무게로 환산한 용량을 투여하면 된다.

본 발명은 간암, 대장암, 방광암이나 유방암과 같은 암들을 치료하는 방법도 제공한다. SMYD3의 비정상적인 메틸전이효소 활성과 관련된 질환을 갖거나 그 질환의 위험성이 있는 경우(또는 그러한 질환에 민감한 경우) 치료나 예방 목적으로 투약할 수 있다. 이 방법은 적합한 암세포에서 SMYD3의 작용을 감소시키는 것을 포함한다. 본 발명의 스크리닝 방법으로 얻은 물질이나 화합물을 투약해 작용을 저해한다.

그 외, 본 발명은 본 명세서에 기재된 치료 물질이나 화합물을 하나 또는 그 이상 포함하는 약학적 또는 치료용 조성물을 포함한다. 선택적으로, 본 발명은 암, 특히 간암, 대장암, 방광암이나 유방암의 예방 및/또는 치료를 위한 약학적 또는 치료용 조성물의 제조를 위한, 본 문서에 기재된 하나 또는 그 이상의 치료제나 화합물의 용도도 제공한다. 의약의 제조는, 구강, 직장, 비강(nasal), 국소(볼이나 혀 밑을 포함한다), 질이나 비경구(근육내, 피하 또는 정맥을 포함한다)투약 또는 흡입(inhalation)이나 통기법(insufflation)을 통한 투약에 적합한 것들을 포함한다. 이 제법은 적당히, 무엇이든 간에 제약 업계에 잘 알려진 방법으로 만들 수도 있고, 분량 단위로 따로따로 편리하게 만들 수도 있다. 이러한 의약의 제법들은 모두 유효 화합물(active compound)들을 액체 담체나 세밀하게 분리된 고체 담체, 또는 필요하다면 양자 모두와 결합시키는 단계 및, 필요에 따라, 원하는 제제로 생산품을 만드는 단계를 포함한다.

구강 투여에 적합한 의약의 제조는, 각각 유효 성분을 미리 계산한 만큼 포함한 알약이나 교갑제(cachet), 캡슐과 같이 분리된 단위 또는 분말이나 과립(granules) 또는 용액, 현탁액(suspension)이나 유상액(emulsion)으로 적당하게 만들 수 있다. 유효 성분은 예를 들면 담체 없이 순수한 형태 또는 페이스트(paste), 덩어리 연질약(bolus electuary)으로 될 수 있다. 구강 투여를 위한 알약이나 캡슐은 결합제(binding agent), 충전제, 윤활제, 붕해제나 습윤제(wetting agent)들과 같은 적당한 부형제들을 포함할 수 있다. 알약은 하나나 그 이상의 제조 성분들을 선택적으로 압축(compression) 또는 성형(molding)해서 만들 수 있다. 분말이나 과립과 같이 자유유동형태(free-flowing form)의 유효성분들이 결합제나 윤활제, 불활성 희석제(inert diluent), 윤활시키는, 계면활성 또는 분산제와 선택적으로 섞이는 적절한 기계 내에서 압축되어, 압출된 알약들이 만들어진다. 성형된 알약들은, 불활성 액체 희석제로 촉촉해진 가루 화합물의 혼합물을 적절한 기계 내에서 성형하여 만든다. 이 알약들은 당업계에 잘 알려진 방법들로 코팅할 수 있다. 예를 들면, 수성 또는 유성 현탁액, 용액, 유상액, 시럽(syrups)이나 엘릭세르의 형태로 구강액을 제작할 수 있고, 사용 전 물이나 다른 적합한 매개제와 조성(contitution)하기 위해 건조한 상품으로 제조할 수도 있다. 이러한 경구용 액체의 제조는 현탁제, 유상제, 비수성(non-aqueous) 매개제(식용유를 포함한다)나 방부제 등 종래의 첨가제를 포함할 수 있다. 이 알약들은 유효 성분들이 유리되는 것을 통제하거나 천천히 제공되도록 제조될 수 있다.

비경구 투약을 위한 조제는, 비후제(thickening agents) 및 현탁 물질이 포함된 수성 및 비수성 무균 현탁액;과 항산화제, 완충용액, 정균제(bacteriostats), 수혈자의 피와 등장의 제제인 용질을 포함하는 수성 및 비수성 무균 주사액을 포함한다. 이 제제는 바이알(vials)이나 밀봉된 앰플과 같이 다회용량(multi-dose)나 일회용량(unit dose)용 용기로 제작될 수도 있고, 사용 직전 식염수, 주사용 증류수(water for injection)와 같은 무균 액체 담체만 있으면 되는 냉동건조(동결건조)조건에서 보관할 수도 있다. 또한 계속주입(continuous infusion)을 위한 제제를 만들 수도 있다. 현탁액이나 임시주사용액(extemporaneous injection solution)으로 앞서 기재한 종류의 무균 분말이나 과립, 알약을 만들 수 있다.

직장(rectal)투여 용 제제는 코코아 버터나 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)과 같은 일반적인 담체를 이용해 좌약으로 만들 수 있다. 입이나 혀 밑과 같이 입에 국소 투약을 위한 제제는 수크로스(sucrose), 아카시아나 트라가칸스 고무(tragacanth)와 같은 향이 나는 베이스를 주성분으로 하는 사탕정제(lozenge)와 수크로스와 아카시아 또는 젤라틴(gelatin)과 글리세린(glycerin)등을 유효성분으로 하는 패스틸(pastille)을 포함한다. 본 발명으로 얻은 화합물은 비강투여를 위해서 드랍(drop) 형태의 분산용(dispersible) 분말이나 액체 스프레이(spray)로 사용될 수 있다. 드랍은 하나나 그 이상의 현탁제나 용해제(solubilizing agent), 분산제(dispersing agent)로 구성된 수성 또는 비수성 베이스(base)로 만들 수 있다. 액체 스프레이는 기존의 방식대로 압축팩(pressurized packs)으로 운반된다.

흡입으로 투여하기 위해서, 화합물은 주입기(insufflator), 분무기(nebulizer), 압축팩이나 에어로졸 스프레이(aerosol spray)를 운반하는 다른 적당한 수단으로 적절히 운반될 수 있다. 압축팩은 디클로로디플루로메탄(dichlorodifluoromethane), 트리클로로플루오로메탄(trichlorofluoromethane), 디클로로테트라플루오로에탄(dichlorotetrafluoroethane), 이산화탄소나 기타 적절한 가스와 같은 적절한 추진제를 포함할 수 있다. 압축된 에어로졸의 경우, 용량이 제공된 밸브로 정해져, 측정량만큼 운반된다.

또한, 흡입이나 통기법으로 투여하기 위해 이 화합물은 락토오즈(lactose)나 전분과 같이 적절한 분말 베이스나 화합물의 분말 조성물과 같이 건조한 분말 조성물의 형태가 될 수도 있다. 이 분말 조성물은, 분말이 흡입기나 주입기로 투여될 수 있도록 캡슐, 카트리지(catridges), 젤라틴이나 블리스터팩(blister packs)과 같은 단위 용량 형태로 제조될 수 있다.

원하는 경우, 상기 기재된 제제들은 유효 성분들을 지속적으로 방출시키기 위해 변형될 수도 있다. 약학적 조성물은 또한 항균물질, 면역억제제나 보존제와 같은 다를 유효 성분을 포함할 수도 있다.

본 발명의 제제는, 앞서 따로 언급한 성분들 외에도, 적절히 경구투여하기 위해 향미제를 포함하는 것과 같이, 필요한 제제 타입에 따라 당업계에 알려진 기존의 물질들을 포함할 수도 있다.

바람직한 단위 용량은, 아래 기술하겠지만, 유효 성분이 효과적인 용량이나 적절한 조각만큼 포함된 것이다.

앞서 기술한 각각의 조건들을 위해, 조성물은 하루에 대략 0.1에서 약 250mg/kg까지의 용량으로 주사투여되거나 경구투여될 수 있다. 성인용 용량범위는 일반적으로 하루에 약 5mg에서 약 17.5g, 바람직하게는 하루에 약 5mg에서 약 10g까지, 더 바람직하게는 하루에 약 100mg에서 약 3g까지이다. 분리된 포장단위로 제공하기 위해 제조된 알약이나 다른 단위용량 형태는, 그러한 용량에서 유효한 양만큼 또는, 예를 들면, 약 5mg에서 약 500mg까지, 보통 약 100mg에서 약 500mg까지를 포함하는 단위들이 복수포장(multiple)된 것일 때 유효한 양만큼을 포함할 수 있다.

약학적 조성물은 바람직하게는 (정맥이나 피하)주사로 투여되거나 경구투여되며, 피실험자에게 투여되는 정확한 양은 담당 의사의 재량이 될 것이다. 그러나 채택된 용량은, 피실험자의 나이나 성별, 치료받아야할 정확한 질환 및 그 심각한 정도 등 여러 요인에 따라 결정되어야 할 것이다. 또한 투여 과정은 상태와 위중한 정도에 따라 다양할 수 있다.

다음 실시예들은 단순히 예시적인 것이며 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 본 발명의 특징들은 상기 실시예에 잘 나타나 있으며, 당업자는 본 발명의 실시나 시험에, 여기 기재된 물질이나 방법들과 유사하거나 등가인 다른 물질 또는 방법을 사용할 수 있다.

도1은 재조합 RB1 단백질들에 대한 SMYD3의 MTase 활성을 보여준다. a부분은 재조합 히스톤 H3, p53이나 RB1의 C-말단 부위를 기질로 사용하여 시험관 내(시험관 내)에서 MTase 분석을 한 결과이다. 동일한 양의 기질이 면역침강된 FLAG-표지된 SMYD3 및 메틸 공여자인 ³H-표지된 SAM과 함께 배양되었다. SDS-PAGE로 단백질들을 분리하고, 플루오로그램(fluorogram)으로 메틸화된 기질을 검출하였다. 기질의 총량은 특정 항체를 이용해 이뮤노블롯으로 검출했다. b부분은 히스톤 H3와 C-말단 RB1 단백질들에 대한 재조합 SMYD3의 용량-의존적 MTase 활성을 보여준다. c부분은 RB1의 C 말단과 전장에 대한 SMYD3의 MTase 활성을 보여준다(각각 lane 2, 4). 보존된 아미노산 서열(SMYD3EEL)에 결실이 일어난 돌연변이체 SMYD3는 MTase 활성이 현저히 감소하였다(lane 3).

도 2는 생체 내(생체 내)에서 SMYD3와 RB1 사이의 관련성을 보여준다. a부분은 면역분석 결과를 보여준다. 특히 항-SMYD3 항체를 이용해 얻은, HepG2나 HCT116 세포의 용해질의 면역침전체(immunoprecipitants)를 항(anti)-RB1 항체로 이뮤노블롯하였다. b부분은 HEK293 세포에서 SMYD3(아래쪽)의 RB1(RB11과 RB12)의 야생형 또는 결실된 형태 사이의 상호작용을 보여준다. RB1의 보존 부위와 발현 구조체는 윗쪽 패널(panel)에 있다. c부분은 RB1과의 상호작용에 관련된 SMYD3 부위를 보여준다. SMYD3의 보존 부위와 발현 구조체는 위쪽 패널에 나와 있다. d부분은 시험관 내에서 재조합 RB1이 있거나/없을 때, 히스톤 H3에 대한 SMYD3의 메틸전이효소 활성을 보여준다. RB1은 히스톤 H3의 메틸화에 영향을 미치지 않았다 (위쪽 패널). 동량의 재조합 인간 히스톤 H3 단백질을 기질로 사용하였다(아래쪽 패널). e부분은 시험관 내에서 히스톤 H4-K20 메틸화 분석을 보여준다. 면역침강되거나 재조합된 SMYD3 단백질을 재조합된 인간 히스톤 H4를 기질로 해서 배양하었다. 면역침강된 Suv4-20h2 단백질을 양성 대조군(positive control)으로 사용하었다. 메틸화된 H4-K20은 항-트리(tri)-메틸 H4-K20 항체로 검출하였다. 도 3은, RB1 C-말단 부위의 K824의 메틸화를 보여준다. a부분은 RB1 단백질 (K824A, K889A, 및 K896A) C-말단의 야생형 및 돌연변이된 형태와 RB1의 보존 부위의 개략적인 표시이다. b부분은 SDS-PAGE로 분리된 RB1의 메틸화된 C-말단을 자기방사선술로 검출한 것이다. c부분은 액체 섬광계수기로 측정한 MTase 활성을 보여준다. d부분은 시험관 내에서 K791A, K814A, K824A, K791/K824A, 및 K814/K824A을 포함하는 RB1 단백질들의 재조합된 야생형과 돌연변이형들의 메틸화를 보여준다. RB1은 ³H-표지된 SAM의 존재 하에서 재조합된 SMYD3 단백질과 함께 배양하였다. 메틸화된 RB1은 SDS-PAGE로 분리되며 플루오그램으로 검출된다. e부분은 섬광계수기로 측정한 메틸화된 RB1을 보여준다. f부분은 SMYD3에 의한 RB1 824번 라이신의 디(di)- 및 트리(tri)-메틸화를 보여준다. SMYD3의 존재 또는 부존재 하, 메틸화된 야생형 RB1 단백질을 3H-BAS 이미징 시스템(3H-BAS imaging system)으로 검출하였다(위쪽 패널). 항-디-메틸화된 824번 라이신 (두번째 패널)나 항-트리-메틸화된 824번 라이신 (세번째 패널) 항체를 이용한 RB1 단백질의 웨스턴 블롯 분석. RB1의 총량은 항-RB1 항체로 정량하였다 (네번 째 패널).

도 4는 생체 내에서 SMYD3에 의한 RB1의 메틸화를 보여준다. a부분은 HEK-SMYD3 (HEK-SMYD3-1 and -2)세포들과 HEK-Mock (HEK-Mock-1 and -2)세포들에서의 SMYD3의 발현을 보여준다 (위쪽 패널). b부분은 생체 내에서 항-RB1 항체를 이용해 얻은 HEK-SMYD3과 HEK-Mock 세포들의 면역침전체들을 이용해, 메틸화된 RB1을 방사선상으로 검출한 것을 보여준다 (위쪽 패널). 면역침강된 RB1의 양은 변하지 않았다. 세포는 단백질 합성 저해제의 존재하에서 ³H-표지된 SAM로 처리하였다. 면역침강된 RB1의 양은 변하지 않았다(아래쪽 패널). c부분은 항-팬(pan)-메틸 라이신, 항-디-메틸 824번 라이신 및 항-트리-메틸 824번 라이신 항체들을 이용해 면역침강된 RB1의 메틸화를 웨스턴 블롯으로 분석한 결과를 보여준다. d부분에서 k까지는 항-디-메틸 824번 라이신 (d)나 항-트리-메틸 824번 라이신 (h) 항체들로 한 HEK293-SMYD3 세포들의 면역화학적 염색 결과를 보여준다. e 및 i부분은 항-SMYD3 항체를 이용해 조사한 SMYD3의 발현을 보여준다. f 및 j부분은 DAPI로 한 핵염색 결과를 보여준다. g및 k 부분은 d-f(g) 또는 h-j (k)의 합성된 이미지들로 구성된다. SMYD3를 많이 발현시키는 세포들은 생체 내에서 RB1 Lys 824에서 디- 및 트리-메틸화가 촉진된 것이 관찰되었다.

도 5는 SMYD3에 의해 RM1의 인산화가 촉진된 것을 보여준다. a부분은 시험관 내에서 SMYD3의 존재 또는 부존재 하, CDK2/cyclin E에 의한 RB1 C 말단의 인산화를 보여준다. SMYD3는 단독으로는 인산화를 증가시키지 못했다. b부분은 시험관 내에서 SMYD3의 존재 또는 부존재 하, CDK6/cyclinD3에 의해 RB1 C-말단이 인산화된 것을 보여준다. SMYD3에 의한 RB1 인산화의 촉진은, K824A가 치환된 RB1으로 억제되었다. c부분은 시험관 내에서 CDK2/cyclin E에 의한 RB1 C-말단의 인산화를, 기질로 야생형(wt) 및 K824A 돌연변이체(K824A)를 비교해 보여준다. d부분은 시험관 내에서 CDK6/cyclin D3에 의한 RB1 C-말단의 인산화를, 기질로 Wt와 K824A를 비교해 보여준다. e부분은 SMYD3의 존재하에서 CDK2/cyclin E 또는 CDK6/cyclinD3 복합체에 의한 Ser807/811과 Thr821/826의 인산화가 증가한 것을 보여준다. f부분은 HEK-Mock 세포에 비교해 HEK-SMYD3 세포에서 Ser807/811과 Thr821/826의 인산화가 증가한 것을 보여준다. 외생적으로 SMYD3를 발현시키는 HEK293 세포의 면역화학적 염색. g부분은 항-인산화된(anti-phospho) RB1 (Thr 821/826) 항체로, 세포에서 인산화된 RB1을 염색한 결과를 보여준다. h부분은 세포에서 SMYD3의 발현을 보여준다. i부분은 DAPI로 핵염색한 결과를 보여준다. j부분은 g에서 i까지의 합성된 이미지들로 구성되어 있다. SMYD3를 발현시키는 세포들은 생체 내에서 Thr821/826의 인산화가 강화된 것을 관찰할 수 있다.

도 6은 SMYD3에 의한 RB1의 인산화가 촉진된 것과 메틸화를 보여준다. a부분에서 RB1 단백질은, 야생형(p3xFlag-SMYD3)이나 돌연변이체 SMYD3 플라스미드(p3xFlag-SMYD3EEL 및 p3xFlag-SMYD3NHSC)로 형질전환된 SNU475로부터 면역침강되었다. 침전체를 이용해 항-디-메틸화된 824번 라이신(맨 위 패널), 항-트리-메틸화된 824번 라이신(두번째 패널), 항-인산화-807번/811번 세린(세번째 패널) 또는 항-인산화-트레오닌 821/824(네번째 패널) 항체들로 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 항-RB1 항체로 한 이뮤노블롯 분석은 양적인 대조군(quantity control)으로 사용했다(제일 밑에 있는 패널). b부분은 두 개의 유방암 조직에서, 824번 라이신의 디- 및 트리-메틸화와 Ser807/811 및 Thr821/826의 인산화를 보여준다. 웨스턴 블롯 분석은 항-디-메틸화된 824번 라이신, 항-트리-메틸화된 824번 라이신, 항-인산화된 RB(Ser807/811), 또는 항-인산화된 RB(Thr821/824) 항체들로 수행하였다.

도 7은 HEK-SMYD3 세포에서 E2F-전사 활성도가 증가한 것을 보여준다. 루시페라제 활성도는 HEK-SMYD3와 HEK-Mock 세포에서 E2F-루시페라제 벡터로 형질전환한 지 24시간 후에 측정하였다. 외생적으로 SMYD3를 발션시키는 HEK293 세포의 면역화학적 염색. 세포에서 인산화된 RB1은, 항-인산화된 RB1(Thr 821/826) 항체로 염색하였다. h부분은 세포에서 SMYD3의 발현을 보여준다. i부분은 DAPI로 핵 염색한 결과를 보여준다. j부분은 a-c의 합성된 이미지로 이루어져 있다. SMYD3를 발현시키는 세포는 생체 내에서 Thr821/826의 인산화가 강화된 것이 관찰되었다.

도 8은 SMYD3 단백질의 발현 패턴(pattern)이다. a부분은 인간의 암 세포주 및 조직에서 SMYD3의 발현을 보여준다. 웨스턴 블롯 분석은 항-SMYD3 항체를 이용해 수행하였다. 베타-액틴(β-actin)의 발현이 양적인 대조군으로 사용되었다. b부분은 HA-표지된 SMYD3(왼쪽 패널)과 FLAG-표지된 SMYD3(오른쪽)의 이뮤노블롯 분석을 보여준다. 웨스턴 블롯 분석은, N-말단 부위에 HA-표지된 SMYD3 또는 C-말단 부위에 FLAG-표지된 SMYD3를 발현시키는 세포들의 추출물을 이용해, 각각 항-HA 항체 또는 항-FLAG 항체로 수행하였다. c부분은 결실된 형태의 SMYD3의 도식적인 표시이다. N-말단 부위에 FLAG-표지된 SMYD3를 시리즈(series)로 발현시키는 플라스미드가, 내생적으로 SMYD3를 발현시키지 못하는 HEK293 세포에 형질전환되었다. d부분은 항-SMYD3 항체(위쪽 패널)나 항-FLAG 항체(아래쪽 패널)를 이용해 세포들의 추출물을 웨스턴 블롯으로 분석한 것을 보여준다.화살표는 SMYD3 전장 단백질을 의미하고, 별표는 SMYD3의 절단된 형태를 가리킨다.

도 9는 단백질을 포함하는 SET의 SET-N 부위의 보존된 아미노산 서열과 SMYD3 절단 자리의 결정이다. a부분은 N-말단 부위에 34-아미노산이-결실된 SMYD3 단백질의 에드만(Edman) 아미노산 서열을 보여준다. b부분은 히스톤 메틸전이효소에서 SET-N의 아미노산 서열이 정렬된 것을 보여준다. 높은 수준으로 보존된 아미노산들은 검은 상자로 표시하였으며, 적당히 보존된 아미노산들은 회색 상자로 표시하였다.

도 10은 절단된 SMYD3가 야생형 단백질에 비해 HMTase 활성이 증가한 것을 보여준다. a부분은 항-FLAG 항체(위쪽 패널)과 항-SMYD3 항체(중간 패널)로, SMYD3단백질들의 야생형이나 결실된 형태(ΔN34 및 ΔN44)의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 단백질들은 FLAG-표지된 SMYD3 단백질들을 발현시키는 세포들로부터 추출되었다. HMTase 분석에 면역침강된 SMYD3 단백질을 사용하였다. b부분은 전장 및 절단된 SMYD3 단백질들의 HMTase 활성이 양에 비례해(dose-response) 증가하는 것을 보여준다. SAHH (S-adenosyl homocysteine hydrolase)의 첨가는 이 활성을 증가시켰다. 액체 섬광 계수기로 ³H-방사능을 측정하였다.

도 11은 SET-N 부위에서 HMTase 활성을 억제하는 부위를 결정하는 것을 보여준다. a부분은 SET-N 부위의 보존된 아미노산들에 치환이 일어난 돌연변이체 SMYD3 구조 체를 개략적으로 보여준다. b부분은 항-SMYD3(위쪽 패널) 또는 항-FLAG(중간 패널) 항체를 이용해 돌연변이체(ΔN34, SETNm1, SETNm2, and SETNm3) SMYD3 단백질이나 FLAG-표지된 야생형의 이뮤노 블롯 분석을 보여준다. FLAG-표지된 SMYD3를발현시키는 HEK293F 세포들로부터 항-FLAG 항체들로 면역침강시킨 단백질을, HMTase 분석에서 효소 소스(source)로 사용하였다. c부분은 SMYD3의 야생형, 결실된 형태의 HMTase 활성을 보여준다. ³H-방사능은 액체 섬광 계수기로 측정하였다.

도 12는 SMYD3의 N-말단 영역의 결실에 의해 HMTase 활성이 증가된 것을 보여준다. a부분은 N-말단 부위가 결실된 형태의 SMYD3를 개략적으로 보여준다. GST-융합된 SMYD3 단백질들을 시리즈로 발현시키는 플라스미드들을 준비한다. b부분은 재조합된 SMYD3 단백질들을 항-GST 항체로 이뮤노블롯 분석한 것을 보여준다. GST와 융합한, 야생형과 돌연변이체 재조합된 SMYD3 단백질들은 박테리아 세포에서 발현되고, 세포로부터 정제된다. c부분은 시험관 내에서 단백질들의 HMTase 활성을 보여준다. ³H-방사능은 액체 섬광 계수기로 측정되었다.

재료 및 방법

시약:

항-RB(IF8), 항-인산화된 RB(Ser 807/811, sc-16670),및 항-인산화된 RB(Thr821/826) 항체들은 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)에서 구입하였으며, 항-Flag 항체는 시그마(SIGMA)에서, 항-팬-메틸화된 라이신 항체(ab7315)는 아브캄(Abcam Ltd.)에서 구입하였다. 디-또는 트리-메틸화된 824번 라이신를 포함하는 합성 RB1 펩타이드(잔기 820-828)나 재조합 SMYD3 단백질을 토끼(SIGMA-ALDRICH, St.Louis,MO)에 접종하였고, 이 면역이 된 토끼의 혈청에서 다중클론 항체를 정제하였다. 재조합 C-말단 GST-RB1,CDK2/cyclin E 및 CDK6/cyclinD3 단백질들은 업스테이트 바이오테크놀로지(Upstate Biotechnology)에서, 전장 재조합 RB 단백질(3108)은 큐이디 바이오사이언스(QED Bioscience)에서 습득하였다. 에스-(5'-아데노실)-엘-호모시스테인 하이드로레이즈 (S-(5'-Adenosyl)-L-homocysteine hydrolase(SAHH))는 시그마(SIGMA)에서 습득하였다.

시험관 내에서 메틸전이효소 및 활성효소의 측정:

293T 세포들은, Flag-표지된 야생형 SMYD3(p3XFLAG-CMV-SMYD3), SMYD3 돌연변이체 및 항-Flag 항체로 면역침강시켜 정제된 표지된-SMYD3 단백질을 발현하는 플라스미드로 진핵형질전환되었다. 재조합 SMYD3 단백질은 바큘로바이러스(Baculovirus(Clontech))를 이용해 Sf9 세포에서 만들었다. 시험관 내 HMTase 분석은 타 문헌(Strahl,B.D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96:14967-14972, 1999)에 기재된 약간의 변형을 가해 수행되었다. 즉, 메틸전이효소 완충용액(50mM Tris-HCL pH8.5, 100mM NaCl, 10mM DTT)에서, 메틸 공여자로 2μCi의 [methyl-³H]-표지된 S-아데노실-L-메티오닌(S-adenosyl-L-methionine(SAM, Amersham Biosciences))과 함께, 면역침강되거나 재조합된 SMUD3 단백질을 재조합 히스톤 H3또는 RB1, p53 1㎍과 함께 섞는다. 반응 혼합물은 30℃에서 1시간 동안 배양된다. 단백질들은 SDS-PAGE로 분리되고, 표지된 단백질들은 형광도법으로 검출된다. 시험관 내에서 CDK2/cyclinE나 CDK6/cyclinD3의 활성효소 분석은 제조업자의 프로토콜(protocol)(Upstate Biotechnology)에 따라 수행했다. 메틸화되지 않은 RB1과 메틸화된 RB1 모두(#12-439, Upstate Biotechnology)를 반응 기질로 사용했다.

생체 내에서 메틸화 분석

생체 내에서 메틸화 된 RB1을 측정하기 위해, Liu와 Dreyfuss가 기재한 방법(Liu, Q. & Dreyfuss, G., Mol Cell Biol, 15:2800-8, 1995)에 약간 변형을 가해, 배양 세포에서 [methyl-³H]-표지된 S-아데노실-L-메티오닌으로 생체 내에서 RB1을 표지하였다. HEK293 세포들은 37℃에서 30분간, 클로람페니콜(chloramphenicol) 40㎍/㎖ 및 사이클로헥시마이드(cycloheximide) 100㎍/㎖와 함께 배양하며, 그 후 표지하지 않은 메티오닌(methionine)이 존재하지 않는, 단백질 합성 저해제와 L-[메틸-3H] 메티오닌 10μCi/㎖를 포함한 배지로 배지를 교체하고, 추가로 3시간을 유지시켰다. 전체 세포 용해물은 항-RB 항체(IF8; Santa Cruz Biiotechnology)로 면역침강시켰다. 면역침강된 RB1 단백질은 SDS-PAGE로 분리하고, 그 다음 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이동시켜 BAS 이미징 시스템(BAS imaging system, BAS-TR2040,FUJI)나 이뮤노블롯(immunoblot)으로 분석하였다.

면역세포화학적 염색

챔버(chamber) 슬라이드(slide)에서 배양된 세포를 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)를 포함한 PBS로 15분간 고정시키고, 0.1% 트리톤 X-100 (Triton X-100)을 포함한 PBS로 실온에서 2.5분간 침투성으로 만든다. 이 세포는 4 ℃에서 24시간 동안 PBS에서 2% BSA로 덮어, 비특이적인 혼성화를 방지하고, 그 후 1차 항체로서 항-인산화된 RB(Thr 821/826)항체, 항-RB[IF8] 항체, 항-SMYD3 항체와 함께 배양시켰다. 2차 항체로서, 형광 기질-결합된 항-토끼나 항-마우스 IgG(분자적 탐침)을 사용하였으며; 핵은 4'6-디아미디노-2-페닐인돌 디하이드로클로라이드(4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride(DAPI))로 대조염색시켰다. 형광 이미지는 TCS-SP2 공초점(confocal) 현미경(Leica)으로 얻은 것이다.

루시페라제 ( luciferase ) 분석:

제조업자의 설명서(Promega)에 따라 Dual-Luciferase Reporter Assay System을 이용해 루시페라제를 분석하였다.

세포주와 조직 표본:

인간 배아 신장(Human embryonic kidney) 293 (HEK 293), HEK293T 및 HEK293F는 이와키(IWAKI)에서 구입하였다. 인간 간암 세포주 HepG2와 HCT116, SW480 인간 결 장암 주(lines)는 아메티카 타입 컬쳐 콜렉션(America Type Culture Collection (ATCC))에서 습득하였다. 인간 HCC 세포주 SNU423은 한국 세포주 은행에서 증여받았다. T47D와 MCF7 유방암 세포주는 일본 재단법인암연구회암연구소에서 친절하게도 제공받은 것이다. 모든 세포주는 적당한 배지에서 단층으로 자랐다. 원발성 유방암 조직은 환자에게 설명하고 동의를 얻어 습득한 것이다(Hamamoto, R. et al., Cancer Sci, 97:113-118, 2006).

플라스미드의 제조:

C-말단 FLAG-표지된 SMYD3의 제조는 이미 기술된 바 있다(Hamamoto, R.et al., Nat Cell Biol6, 731-740, 2004.). 우리는 SMYD3 cDNA의 야생형이나 결실된 형태를 포함하는 다양한 PCR 산물들을 pCMV-HA(Clontech) 또는 p3XFLAG-CMV10(Sigma)벡터에 넣어 클로닝(cloning)해서, N-말단 HA-표지되거나 N-말단 3xFLAG-표지된 SMYD3를 발현시키는 플라스미드를 추가적으로 만들었다. 야생형 플라스미드에 사용되는 프라이머는 5'-AAGCTTGCGGCCGCGATGGAGCCGCTGAAGGTGGAAAAG-3'(서열번호 5)나 5'-GGTACCTCTAGATTAGGATGCTCTGATGTTGGCGTC-3'(서열번호 6)이고, 돌연변이체(FLAG-SMYD3-△N44,-△N99,-△N244와 -△N34)에 사용되는 것들은 각각 5'-GGGGTACCTTAGGATGCTCTGATGTTGGCGTC-3'(서열번호 7)와 5'-CGGAATTCTGGCGCGATGGAGCCGCTGAAGGTGGAAAAG-3'(서열번호 8), 5'-CGGAATTCTGACTCCGTTCGACTTCTTGGCAG-3'(서열번호 9),5'-CGGAATTCTCGGAAGCAGCTGAGGGACCAGTACTGC-3'(서열번호 10),또는 5'- CGGAATTCACCCTTGGCGTACACGGTGTGCAAGG-3'(서열번호 11)이다. 15번,17번 또는 27번 글라이신(glycine)에 치환이 발현되는 플라스미드 돌연변이체는, 공급자의 프로토콜(Stratagene,California,USA)에 따라 QuikChange Ⅱ XL 위치지정 돌연변이 키트(Kit)으로 만들었다.

웨스턴 블롯 분석:

SMYD3에 대한 다중클론항체는, 타 문헌에 기재된 대로, 대장균(E.coli)에서 생산된 재조합 His-표지된 SMYD3 단백질로 면역시킨 토끼의 혈청에서 정제하였다. 단백질들은 10%SDS-PAGE로 분리하고 항-SMYD3, 항-HA(Sigma), 항-FLAG(Sigma), 항-GST(Pharmingen)이나 항-β-액틴(Sigma) 항체로 이뮤노블롯했다. HRP-결합된 항-토끼 IgG, 항-마우스 IgG(Amersham Biosciences)나 항-염소 IgG(Santa Cruz)항체는 ECL Detection System(Amersham)에서 2차 항체로 사용되었다.

절단부위의 결정:

C-말단-FLAG-표지된 SMYD3는 293F 세포에서 외인성으로(exogenously) 발현되었다. 세포의 항-FLAG 항체로 면역침강된 SMYD3 단백질은 듀플리케이티드 SDS-PAGE(duplicated SDS-PAGE) 겔(gel)에서 분리되고, 니트로셀룰로스 막과 시퀀스 그레이드 PVDF 막(sequence grade PVDF membrane)으로 이동한다. SMYD3 단백질의 두가지 형태를 검출하기 위해 항-FLAG 항체와 함께 니트로셀룰로스 막을 이뮤노블롯으로 분석하였다. 아세트산이 없이 CBB 용액(40% 메탄올에 0.025% CBB)으로 그 PVDF 막을 염색한 후 SMYD3의 짧은 형태에 따른 밴드(band)를 잘라내고, 아미노산서열을 분석했다. 이 단백질의 아미노산 서열은 Edman 아미노산 서열 방법(Shimadzu Biotechnologies, Tokyo,Japan)으로 결정되었다.

시험관 내에서 히스톤 메틸전이효소 ( 히스톤 methyltansferase , HNTase ) 분석:

야생형(p3XFLAG-CMV-SMYD3) 또는 돌연변이체 SMYD3(p3XFLAG-△N34, -△N44, -SETNml, -SETNm2나 SETNm3)를 발현시키는 293T 세포로부터, 항-FLAG 항체를 사용해 FLAG-표지된 SMYD3를 정제했다. 야생형(GST-SMYD3-wt)이나 돌연변이체 SMYD3 구조(construct)(GST-SMYD3-△N9, -△N19, -△N29, -△N44, -△N74)를 발현시키는 박테리아 세포로부터, GST-융합된 SMYD3 단백질을 정제한다. 시험관 내에서, HMTase 분석은 타 문헌(Hamamoto,R.et al., Nat Cell Biol, 6:731-740, 2004)에 기재된 대로 수행되었다. ³H-방사능은 액체 섬광 계수기로 측정하였다.

실시예 :1: SMYD3 의 기질로서의 RB1

히스톤 H3-K4 메틸전이효소 SET7/9가 TAF10과 p53를 기질로 촉매작용한다는 것이 최근 두 보고서에서 밝혀 졌는바(Chuikov,S.et al., Nature, 432:353-60, 2004), 본 발명자들은 히스톤 H3보다는 SMYD3(GenBank Accession NO.AB057595;SEQ ID NO;1,2)의 추가적 기질을 찾았다. 모두 잘 알려진 세포주기 진행의 조절자들이기 때문에, 후보 기질로 p53과 RB1이 제일 먼저 시험되었다(GenBank Accession NO.NM_000321;SEQ ID NO;3,4). 조사 과정에서, 재조합 히스톤 H3, 야생형p53 및 RB1의 C-말단 부위(codons 769-921)가 ³H-표지된 SAM, 메틸 공여자의 존재 하에서, 293T세포에서 면역침강된 SMYD3 단백질과 함께 배양되었다. 그 후 PAGE와 자가방사선술로 메틸화된 히스톤 H3에 대응하는 밴드가 나타났는데, 이는 SMYD3가 히스톤 H3를 메틸화한다는 발견과 일치하는 것이다. 흥미롭게도, 메틸화된 RB1에 대응하는 밴드도 검출되었는데; 그에 반해 메틸화된 p53에 대응하는 밴드는 검출되지 않았다(도.1a). 히스톤 H3와 C-말단 RB1에 대한 메틸전이효소(MTase) 활성은 재조합 SMYD3 단백질을 이용해 더 측정되었다. 그 결과는 양 기질 모두에 MTase 활성이 용량-의존적으로 증가하는 것으로 나타났다(도.1b). 특히, MTase 활성은 히스톤 H3에 비해 C-말단 RB1에 대해서 더 높게 나타났다. SET7/9 또한 RB1에 대해 메틸전이효소 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다(데이터는 기재되어 있지 않음). 게다가 SMYD3는 RB1의 전장(full length)를 메틸화하였으며, 이는 RB1이 시험관 내에서 SET7/9와 마찬가지로 SMYD3, 즉 두 히스톤 H3-K4 메틸전이효소들에 의해 메틸화된다는 것을 의미한다.

실시예 2: RB1 단백질에서 SMYD3 의 메틸전이효소 활성

SMYD3와 RB1 단백질 사이의 가능한 결합(association)을 조사하기 위하여, HepG2나 HCT116세포로부터 추출한 단백질들을 항-SMYD3 항체로 면역침강시켰다. 예상대로, 항-RB1 항체를 사용한 이뮤노블롯 분석에서 RB1 단백질에 대응되는 밴드가 관 찰되었다(도 2a). 결합에 관여하는 RB1 부위를 결정하기 위해, Flag-표지된 야생성이나 돌연변이체 RB1 단백질이 HEK293 세포에서 HA-표지된 SMUD3와 함께 발현되었고, 항-Flag 항체로 면역침강을 하였다. C-말단 RB1 단백질의 메틸화와 마찬가지로 C-말단 기질영역(codons 772-928)은 SMYD3와 상호작용하였다(도2b). RB1과의 결합에 관련되는 SMYD3의 부위를 결정하기 위해, SMYD3의 야생형과 다양한 돌연변이체를 발현시키는 플라스미드를 사용하였다. 야생형과 돌연변이체 SMYD3의 △1-(codons 45-428), △2-형태(codons 1-250)는 Flag-표지된 RB1과 상호작용했지만, SET 영역이 부족한 △3-형태(codons1-100)는 RB1과 상호작용하지 않는다는 것은 SET 영역이 결합에 꼭 필요하다는 것을 시사한다(도. 2c). 히스톤 H3-K9 메틸전이효소 SUV39H1이 RB 및 HP1과 결합하고, 그 복합체는 cyclin E의 전사억제(Nielsen,S.J.et al., Nature, 412:561-565, 2001.)에서 관여한다는 것이 알려져 있다. 또한, 최근 히스톤 H4-K20 메틸전이효소, Suv4-2-h1 및 Suv4-20h2의 활성이 RB1과의 상호작용을 통해 상당히 강화된다는 것이 밝혀졌다(Gonzalo,S.et al., Nat CEll Biol, 7:420-428, 2005.). 따라서, 본 발명자들은 RB1이 SMYD3의 메틸전이효소 활성을 증가시키는지 아닌지 시험하였다. 그 결과, 히스톤 H3의 SMYD3-매개의 메틸화는 RB1에 영향을 받지 않았다(도. 2d). 특히, SMYD3는 H3-K910이나 H4-K20(도.2e)에 메틸전이효소 활성을 보이지 않았다. 이러한 데이터는 SMYD3의 H3-K4-특이적 HMT(히스톤메틸전이효소)활성에 무게를 더하며, RB1이 HMT-의존적 양식에서 히스톤 수식화(modification)에 관여한다는 것을 시사한다.

실시예 3: RB1 의 메틸화 기질의 확인

RB1의 기질영역의 메틸화에 관여하는 잔기(들)을 확인하기 위해, SET7/9 메틸전이효소들의 기질에서 보존된 아미노산 서열들을 비교하었다. 세린(serine)이나 트레오닌(threonine)이 메틸화된 라이신 앞에 있었기 때문에, 본 발명자들은 후보들로 824번째 라이신, 889번째 라이신, 896번째 라이신에 초점을 맞추었다. RB1의 기질 영역의 야생형과 세 가지 돌연변이체들의 재조합 단백질들이 준비되었다(도. 3a). 야생형 단백질에 비해, K889A 및 K896A 돌연변이체들은 SMYD3에 의해 비슷한 수준으로 메틸화 되었다(도.3b,c); 그러나 K824A의 메틸화는 심각하게 감소되었다(도.3b,c). 게다가, K824A의 교체가 RB1 단백질의 메틸화를 완전히 감소시키지 않았기 때문에, 791번 라이신과 814번 라이신의 메틸화(양자 모두 앞에 티로신이 있다)를 조사하였다. 두 돌연변이체 RB1 단백질들, 즉 K791A 및 K814A은 야생형-RB1에 비해 비슷한 수준의 메틸화를 보였다(도.3d,e). 더구나 RB1의 이중-돌연변이체(double-mutant)의 두 형태, 즉 K791A/K824A 과 K814A/K824A는 K824A 단백질과 동등한 수준의 메틸화를 보였다. 따라서 본 발명자들은 824번 라이신이 메틸화를 위한 주요 타겟(target) 잔기라고 결론지었다. 824번 라이신의 메틸화를 확실히 하기 위해, 디-또는 트리-메틸화된 824번 라이신을 인식하는, 메틸화된 RB1-특이적 항체들을 준비했다. SMYD3가 히스톤 H3 라이신 4의 디-나 트리-메틸화를 하는 것과 유사하게(Hamamoto, R. et al., Nat Cell Biol, 6:731-740, 2004.), 항체는 야생형 RB1 단백질의 메틸화에 따라 이뮤노블롯 분석에서 디-또는 트리-메틸화된 RB1 단백질을 검출하였다(도.3f). H3-K4, TAF10 및 p53를 포함하는 SET7/9 기질에서 메틸화 된 라이신의 앞에 두 개의 보존된 펩타이드, 즉 라이신의 -2위치의 R/K 및 -1위치의 S/T가 있는데도, 824번 라이신의 앞에는 -2위치의 P와 -1위치의 T가 있다. RB1이 SET7/9과 마찬가지로 SMYD3에 의해 메틸화되므로, SET7/9나SMYD3이 메틸화하는 데 있어, -2위치의 R/K는 필수가 아닐 수 있지만, -1위치의 S/T는 꼭 필요하다.

실시예 4: 생 체 내 에서 메틸화 분석

생체 내에서 SMYD3에 의한 RB1의 메틸화를 좀더 조사하기 위해, SMYD3를 발현시키지 않는 HEK293 세포를 이용해 생체 내에서 메틸화 분석을 수행하였다(Liu, Q. & Dreyfuss, G., Mol Cell Biol, 15:800-8, 1995). SMYD3를 발현시키는 HEK293 세포주(HEK-SMYD3-1 및 -2)(도.4a)를 확립하고 단백질 합성 저해제 존재 하에서 L-[메틸화된-³H] 메티오닌과 함께 세포를 배양시켰다. 그 후 세포에서 추출한 추출물들을 항-RB1 단일클론 항체로 면역정제(immunopurify)시키고 면역침강된 단백질들을 SDS-PAGE 및 자기방사술로 분석하였다. 가상으로-진핵형질전환된(mock-transfected) HEK293 세포들 (HEK-Mock-1 및 -2)에 비해, HEK-SMYD3 (HEK-SMYD3-1 및 -2) 세포들의 추출물들은 메틸화된 RB1에 대응하는, 충분히 강한 밴드를 나타낸다. 면역침강된 RB1의 양은 세포주 내에서 변하지 않았다(도. 4b). 항-팬-메틸화된-라이신, 항-디-메틸화된 RB1-824번 라이신 또는 항-트리-메틸화된 RB1-824번 라이신 항체들(도 4c)을 이용한 웨스턴 블롯 분석으로, HEK-Mock 세포들에 비해 메틸화된 RB1의 증가가 일관되게 나타났다. HEK-SMYD3의 면역화학적 염색은, SMYD3를 많 이 발현시키는 세포들이 적은 양의 SMYD3를 발현시키는 세포들보다 항-디-메틸화되거나 항-트리-메틸화된 824번 라이신 항체들로, 더 강하게 염색된다는 것을 보여주었다(각각 도. 4d-g, 4h-k). 이러한 데이터는 생체 내에서 SMYD3에 의한 RB1-824번 라이신의 메틸화를 더욱 확실히 뒷받침하는 것이다.

실시예 5: 생 체 내 에서 인산화 분석

RB1의 824번 라이신은 821^st 트레오닌과 826^th 트레오닌 사이에 위치한다. 또한 CDK/cyclin 복합체에 의해 인산화된 잔기들은, 센트랄 포켓 영역(central pocket domain)의 구조적 변화를 통해, RB1과 E2F 사이의 상호작용을 조절한다. 이러한 RB1 메틸화가 주위 트레오닌들의 인산화에 미치는 영향을 조사하기 위해, 메틸화되거나 메틸화되지 않은 RB1 단백질을 이용해 생체 내에서 인산화 분석을 수행하였다. 재조합 C-말단 RB1을 SMYD3가 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 ³H-표지된 SAM과 함께 배양하고 그 후, 재조합 recombinant CDK2/CyclinE나 CDK6/CyclinD와 조합해, ³²P-γATP와 함께 섞었다. 재조합 RB1의 메틸화와 인산화는 액체 섬광계수기로 동시에 측정하였다. C-말단 RB1 단백질은 SMYD3 존재하에서, SMYD3가 존재하지 않은 경우의 4~6배 되는 양의 ³H-표지된 메틸 공여자를 끼워 넣었다(데이터는 기재되지 않음). 특히, SMYD3는 CDK2/CyclinE 복합체로 그 용량에 비례해 RB1의 인산화를 촉진시킨 반면, SMYD3 단독으로는 인산화를 증가시키지 않았다(도. 5a). 더구 나, SMYD3가 존재하지 않은 경우보다 SMYD3가 존재하는 경우 CDK6/CyclinD3에 의한 RB1의 인산화가 촉진되었다(도.5b). 그러나, CDK2/Cyclin E 나 CDK6/Cyclin D3에 의한 K824A 돌연변이체 RB1의 인산화는, 야생형 RB1에 비해 상당히 억제되었다(각각, 도.5c,d). 이러한 데이터는 SMYD3에 의한 824번 라이신의 메틸화를 통해 RB1의 인산화가 촉진된다는 것을 의미한다. 항-인산화된 RB1 항체를 이용한 추가적인 이뮤노블롯 분석에서도, 821번/826번 트레오닌의 인산화가 SMYD3에 의해 촉진된다는 것이 밝혀졌다. 흥미롭게도, 807번/811번 세린(serine)의 인산화 또한 SMYD3에 의해 촉진된다(도. 5e). 따라서, 824번 라이신의 메틸화가 807번/811번 세린의 인산화를 증가시키거나, 추가적으로 메틸화된 잔기(들)이 인산화를 촉진시킬 수 있다. 생체 내에서 RB1의 인산화 강화를 조사하기 위해, HEK-SMYD3 및 HEK-Mock 세포의 추출물들을 이용한 항-인산화된 RB1 항체로 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 시험관 내에서 RB1 단백질의 인산화 촉진과 마찬가지로, 대조군인 세포에 비해 HEK-SMYD 세포에서 807번/811번 세린과 821번/826번 트레오닌의 인산화가 둘 다 촉진된 것이 검출되었다(도. 5f). 항-인산화된 821번/826번 트레오닌 항체와 항-SMYD3 항체를 이용한 면역화학적 염색에서, SMYD3를 발현시키는 세포들이 SMYD3를 발현시키지 않는 세포들보다, 항-인산화된 821번/826번 트레오닌 항체로, 더 강하게 염색된다는 것이 밝혀졌다(도. 5g-j). 게다가, 야생형 SMYD3의 외인성 발현은, 메틸전이효소 활성이 부족한 돌연변이체 SMYD3(SMYD3-△EEL 또는 SMYD3-△NHSC)에 비해 SMU475 세포에서 RB1 824번 라이신의 디- 및 트리- 메틸화를 촉진시켰다(Hamamoto, R. et al., Nat Cell Biol, 6:731-40, 2004.). RB1 824번 라이신의 메틸화와 관련 해서, 우리는 특히 세포에서, 821번/826번 트레오닌과 807번/811번 세린의 인산화가 어느 정도 증가하는 것을 관찰하였다(도. 6a). 특히, SMYD3를 많이 발현시키는 유방암 조직에서, 대응하는 비암성(non-cancerous) 유선 조직에 비해, 807번/811번 세린과 821번/826번 트레오닌의 인산화 증가와 함께 RB1 824번 라이신의 메틸화가 강화된 것이 웨스턴 블롯 분석으로 관찰되었다(도. 6b). 이러한 데이터는 생체 내에서 SMYD3에 의해 807번/811번 세린와 821번/826번 트레오닌의 인산화가 촉진된다는 것을 다시 한번 보여 주는 것이다. RB1의 인산화가 RB1으로부터 E2F가 분리되도록 하는 포켓 도메인을 조절하기 때문에, MercuryTM 세포주기 프로파일링 시스템(MercuryTM cell cycle profiling system)을 이용해 E2F-매개하는 전사의 리포터(reporter) 활성을 비교하였다. HEK-Mock 세포에 비해, HEK-SMYD3 세포는 E2F의 전사활성도가 증가한 것이 관찰되었다(도. 7). 이러한 데이터는 SMYD3가 824번 라이신의 메틸화를 통해 RB1의 인산화를 촉진시키고, 이것은 E2F의 전사활성도가 증가하는 것으로 이어진다는 것을 보여준다.

실시예 6: 인간 암세포에서의 SMYD3 단백질의 절단된 형태.

우리는 인간 간암세포(human hepatocellular carcinoma (HCC)), 대장암(colorectal carcinoma (CRC)), 유방암에서 SMYD3 단백질의 발현이 증가한다는 것을 이미 보고한 바 있다(Hamamoto, R. et al., Nat Cell Biol, 6:731-740, 2004; Hamamoto, R. et al., Cancer Sci, 97:113-118, 2006.). 흥미롭게도, 항-SMYD3 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석에서, 시험한 유방암 조직 모두에서 45-kDa 및 42- kDa 밴드 두 개가 관찰되었는데, 이는 정상 유선조직에서는 어느 것도 관찰되지 않는 것이다. HCC, CRC, 유방암 세포주(도. 8a)와 정상적인 정소(데이터는 없음)에서 45-kDa 및 42-kDa 밴드가 둘 다 관찰되었다. SMYD3의 분자량은 45 kDa로 예상되었으며, 우리의 RT-PCR 분석에서 SMYD3 전사체의 변형된 형태는 발견하지 못했다. 따라서 42-kDa 밴드는, 전장 SMYD3 단백질이 절단되어 생긴 것이라 가정하였다. 이러한 SMYD3의 절단을 조사하기 위해, N-말단 HA-표지된 SMYD3나 C-말단 FLAG-표지된 SMYD3를 발현시키는 플라스미드를 준비했다. HA-표지되거나 FLAG-표지된 SMYD3 단백질을 발현시키는 HEK293 세포의 추출물을 사용하여, 각각 항-HA나 항-FLAG 항체들로 이뮤노블롯 분석을 하였다. 그 결과, 항-HA 항체로 N-말단 HA-표지된 단백질에 대응하는 46-kDa 밴드가 얻어졌다. 반면, 항-FLAG 항체로는 46-kDa 와 43-kDa 단백질들의 두 밴드가 관찰되었다(도. 8b). 이러한 결과는 전장 단백질이 N-말단 부위에서 절단된다는 것을 의미한다. 절단 자리를 조사하기 위해, 내생적으로 SMYD3를 발현시키지 않는 HEK 293 세포에서, N-말단 3XFLAG-표지를 가진 SMYD3의 결실돌연변이체와 야생형을 외생적으로 발현시켰다(도. 8c). 도. 8b와 마찬가지로, 항-FLAG 항체로 웨스턴 블롯 분석을 하자, 야생형 SMYD3를 발현시키는 세포에서 48-kDa FLAG-표지된 전장 단백질만에 대응하는 밴드가 관찰되었다. 그러나, 동일한 추출물을 갖고, 항-SMYD3 항체로 한 분석에서는 48-kDa FLAG-표지된 SMYD3와 42-kDa 단백질에 대응하는 두 밴드가 검출되었다. N-말단이 결실된 형태의 SMYD3(FLAG-SMYD3-△N44, -△N99 및 -△N244)를 발현시키는 세포들에서 추출한 추출물들을 이용해 항-SMYD3 항체로 웨스턴 블롯 분석을 하자 하나의 밴드들만 나타 났다. 이러한 데이터는 SMYD3의 절단 자리가 코돈 1과 45 사이에 위치한다는 것을 의미한다.

실시예 7: SMYD3 단백질의 절단 자리의 결정.

SMYD3의 정확한 절단 자리를 결정하려는 시도로, 면역침강된 FLAG-표지된 SMYD3단백질과 함께 전이된 PVDF막으로부터 42-kDa 단백질을 정제해(도. 8b), 그것의 아미노산 서열을 결정하였다. 그 결과, N-말단 34-아미노산들이 부족한 SMYD3 단백질의 결실된 형태를 확인했으며, 이는 34번째 코돈(aspartic acid)과 35번째 코돈(proline) 사이에 절단 자리가 존재한다는 것을 시사한다(도. 9a). SMYD3는 5번째 코돈과 27번째 코돈 사이의 SET-N 부위라고 명명된 아미노산 서열을 포함하고 있으며, 이는 SET 영역 단백질들에서 보존된다(Marmorstein, R., Trends in Biochem. Sci., Vol.8 no.2, (2003); Kouzarides, T. Curr. Opin. Genet. Dev. 12, 198-209, 2002; Lachner, M and Jenuwein, T., Curr. Opin. Cell biol, 14:286-298, 2002). SET-N 부위의 아미노산 정렬은 SMYD3 및 다른 메틸전달 효소들의 그 부위와 높은 유사성을 보이며(도. 9b), 이는 이 부위가 중요하다는 것을 의미하다.

실시예 8: 야생형 단백질에 비해, 절단된 SMYD3 의 HMTase 활성 증가.

절단된 SMYD3 단백질의 메틸전이효소 활성을 조사하기 위해, HEK293 세포에서 외생적으로 34번- 또는 44번- 아미노산이-결실된 형태의 SMYD3나 3xFLAG-표지된 야생형을 발현시키고, 이들 단백질들을 면역침강시켰다(도. 10a). 이 단백질들을 효 소 소스(source)로 히스톤 메틸전이효소(HMTase) 분석을 수행하였으며, 야생형 SMYD3의 HMTase 활성이 양에 비례해 증가(dose-dependent manner)한다는 것을 밝혔다(도. 10b). 메틸 공여자인 S-아데노실 메티오닌(SAM)이 존재하는 경우, 메틸화 반응은 에스-아데노실 호모시스테인(S-adenosyl homocysteine (SAH))의 생산이 수반되었으며, 이는 경합하는 기작으로 메틸전이효소 반응을 저해할 수 있다. 따라서 SAH를 호모시스테인(homocysteine) 및 아데노신(adenosine)으로 가수분해하는 에스-아데노실 호모시스테인 하이드로레이즈(S-adenosyl homocysteine hydrolase (SAHH))를 반응 혼합물에 첨가하였다. 예상과 같이, SAHH가 존재한 경우, 존재하지 않은 경우보다, HMT 활성이 눈에 띄게 증가한 것을 관찰할 수 있었다(도 10b). 이러한 발견은, SMYD3의 메틸전이효소 저해제의 스크리닝에 유용하다. 놀랍게도, 절단된 SMYD3 단백질들은 전장 단백질에 비해 훨씬 높은 HMTase 활성을 갖고 있었다(도 10b). 이러한 결과는 번역 후 절단이 인간 세포에서 SMYD3 HMTase 활성조절과 관련 있으며, N-말단 SET-N 부위가 HMTase 활성에 대해 억제하는 역할을 할 수 있다는 것을 의미한다.

실시예 9: SET -N 부위의 15번 및 17번 글라이신( glysine )은 HMT 활성에 중요하다.

억제된 효소 활성을 위한 SET-N 부위에서의 보존된 아미노산 서열의 중요성을 결정하기 위해, Gly15Al과 Gly17Ala이나 Gly15Ala 또는 Gly27Ala에 치환이 일어난 돌연변이체인 N-말단 FLAG-표지된 SMYD3 단백질, 각각 SMYD3-SETNm1, -SETNm2 또는 -SETNm3 또는 야생형을 발현시키는 플라스미드를 준비하였다(도. 11a). 이러한 돌 연변이체들을 발현시키는 HEK 세포들의 용해질의 웨스턴 블롯은, 치환들이 SMYD3 단백질의 절단에 영향을 미치지 않았다는 것을 보여주었다(도. 11b, 위쪽 패널). 면역침강된 SMYD3 단백질을 이용해 HMTase 분석을 하였다. 그 결과 Gly15Ala 이나 Gly27Ala (SMYD3-SETNm2 또는 -SETNm3)를 포함하는 돌연변이체 단백질들은 야생형 단백질과 유사한 HMTase 활성을 가졌다(도 11c). 반면에, Gly15Ala 및 Gly17Ala (SMYD3-SETNm1)에 두 치환들이 된 돌연변이체 단백질은 야생형 단백질에 비해 훨씬 더 활성이 촉진되었다(도. 11c). 이러한 데이터는 글라이신 15와 17이, SMYD3의 HMTase 활성 조절에 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 의미한다.

실시예 10: N-말단 10개 아미노산의 결실은 HMTase 활성 강화에 결정적이다.

N-말단 부위가 그것의 효소 활성을 촉진했기 때문에, 두 가지 가능한 메커니즘을 가설로 만들었는데, 그것은 N-말단 부위가 효소 활성을 위해 알려지지 않은 음성적 조절 인자(negative regulatory factor(s))와 연합할지도 모른다는 것과 결실이 효소 활성 증가를 일으키는 단백질의 구조적 변화를 일으킬지도 모른다는 것이다. 추가적인 음성적 조절 인자(들)이 효소 활성에 역할을 할 것인지 결정하기 위해, N-말단이 결실된 SMYD와 야생형 재조합 단백질들을 준비하고, 시험관 내에서 그것들의 HMTase 활성을 조사하였다. 도. 12과 같이, 결실 돌연변이체들(SMYD3-△N9, -△N19, -△N29, -△N44, -△N74)은 야생형 단백질에 비해 4~5배 강화된 메틸전이효소 활성을 보였다(도. 12). 이러한 결과는 추가적인 인자가 절단된 SMYD3의 활성 촉진에 관여하지 않을 것 같다는 것과 N-말단-10 아미노산들이 메틸전이효소 활성 억제 에 결정적인 역할을 할 것이란 것을 시사한다.

토의

본 명세서에는 시험관 내 및 생체 내에서 SMYD3가 RB1의 824번 라이신에 메틸전이효소 활성을 갖는다는 것과 메틸화된 RB1은, 메틸화가 되지 않은 RB1보다, CDK/cyclin 복합체에 의한 인산화에 민감하다는 것이 밝혀져 있다. 따라서, SMYD3를 발현시키는 HEK 293-SMYD3 세포들은 HEK293-Mock 세포들에 비해 증가된 E2F-전사 활성을 보이며, E2F-1의 과도한 발현이 세포증식에 필수적인 산물들을 만들어내는 일련의 유전자들을 조절함으로써 세포주기의 G1기에서 S기로 넘어가는 것을 촉진하기 때문에, 이는 SMYD3의 성장 촉진 효과와 잘 일치하는 것이다. Harbour et al.는 G1-S 진행 동안 RB1 인산화의 모델을 제시했는데, 거기서 RB1의 인산화는 C-말단 부위와 포켓 도메인 사이의 순차적인 분자 내 상호작용을 개시한다(Harbour, J. W. et al., D. C. Cell, 98:859-69, 1999). G1기에서, CDK4/6-cyclin D에 의한 RB1의 C-말단 부위의 인산화는 센트럴 포켓 영역과의 분자 내 상호작용을 촉발시키고, 이는 HDAC 결합을 저해해, 활발한 전사 억제를 막는다. 이 상호작용은 RB1의 567번째 세린에 CDK2/cyclin E가 접근하는 것을 용이하게 하며, 이는 A/B 경계면의 붕괴를 일으키고 E2F와 RB1의 상호작용을 방해한다. 이 모델에서 E2F의 분리에는, CDK4/6-cyclinD 과 CDK2/cyclin E 복합체들 모두에 의한 RB1의 성공적인 인산화가 필요하다.(Lundberg, A. S. & Weinberg, R. A., Mol Cell Biol, 18:753-61, 1998). Ser807(807번 세린)과 Ser811(811번 세린)의 인산화가 C-말단 영역을 불활성화시키는 반면, RB1의 Thr821(821번 트레오닌)과 Thr826(826번 트레오닌)의 인산화는 E2Fs나 HDACs와 같이 LXCXE 모티브(motif)-포함하는 단백질들과 A/B 포켓 도메인 사이의 상호작용을 불활성시킨다고 한다. 이러한 데이터는 SMYD3에 의한 RB1의 메틸화가 CDK2/cyclin E or CDK6/cyclin D 복합체를 통한 인산화를 촉진시켰고, Thr821/826의 인산화가 강화되므로, SMYD3를 발현시키는 세포들이 높은 E2F 전사 활성을 보인다는 것과 일치한다. 또한, 히스톤과 p53 모두의 라이신 메틸화가 그것들의 구조변화를 일으키므로, 824번 라이신의 메틸화는 C-말단 부위의 구조를 직접적으로 바꿀 수 있으며, 그에 따라 포켓 영역과 E2F의 결합을 저해할 수 있다(Tsuge, M. et al., Nat Genet, 37:1104-7, 2005). SMYD3는 E2F의 전사 활성을 증가시키기 때문에, 증가된 SMYD3는 양성 피드백 메커니즘(positive feedback mechanism)으로 E2F1의 활성을 촉진시킬 수 있다. 그러므로 SMYD3-매개한 RB1 상호작용은 인간의 발암에 결정적인 역할을 하는 것으로 보인다. RB1이 몇몇 메커니즘을 통해 전사 억제에 영향을 미친다는 것이 중요하다;RB1은 전사인자들과 상호작용하고, 그것들의 활성을 직접 저해한다. RB1을 프로모터로 끌어들이는 것은 개시전 복합체(pre-initiation complexes)의 조립을 막고; 이것은 또한 I 그룹 HDACs (HDAC-1, -2 및 -3)과 결합하고, 히스톤들의 탈아세틸화를 유도해, 이질 염색질 상태로 구조변화시킨다; 이것은 DNMT1과 복합체를 형성해 목적한 유전자의 프로모터 부위의 DNA를 메틸화시킨다(Harbour, J. W. & Dean, D. C. Genes Dev 14, 2393-409, 2000; Robertson, K. D. et al., Nat Genet, 25:338-42, 2000). 이 메커 니즘들과 함께, 히스톤 메틸화에 대한 최근의 연구로, RB1이 H3-K9 및 H4-K20 메틸화에 각각 관련된 SUV39H 및 Suv4-20h1 또는 Suv4-20h1를 포함하는 히스톤 메틸전이효소들과도 결합한다는 것이 밝혀졌다(Gonzalo, S. et al., Nat Cell Biol, 7:420-8, 2005; Nielsen, S. J. et al., Nature, 412:561-5, 2001). 이러한 메틸전이효소들에 결합하여, RB1은 복합체에 HP1이나 CBX를 끌어들임으로써 이질 염색질 형성을 안정화시킨다. 최근의 발견들은, 히스톤 H3-K4 메틸전이효소의 전사 활성 조절에 관한 새로운 시각을 제공한다. 824번 라이신이 메틸화된 RB1은 RB1의 인산화를 촉진시키고, 아마도 센트럴 포켓 영역에서 E2F1을 방출시킴으로써, 연이어 E2F1의 전사촉진이 일어나게 한다. 게다가, 메틸화된 RB1은 자신의 구조를 변화시킬 수 있으며, 이에 따라 SUV39H 및/또는 Suv4-20h1 메틸전이효소 복합체로부터 HDACs, 이질단백질1(heterochromatin 단백질 1 (HP1)), 및/또는 크로모박스 단백질(chromobox 단백질s (CBXs))과 해리되고,이는 H3-K9 및 H4-K20의 메틸화 감소로 연결된다. 더 많은 조사들이 이를 뒷받침하기는 하나, 본 명세서의 데이터는 E2F가 작용하는 유전자들의 조절에 있어, RB1의 메틸화의 중요성을 강조한다. RB1이 서로 다른 메틸전이효소들과 결합하기 때문에, RB1에서의 메틸화 위치나 그 정도는 메틸전이효소들에 따라 다를 수 있다. RB1이 서로 다른 잔기들에서 인산화된다는 것과 함께, 본 명세서의 데이터는 p53과 히스톤의 수식을 연상시키는 RB1의 복합적인 변형들의 조합이 RB1의 생물학적 특징을 명백히 보여줄 수 있다는 것을 시사한다.

RB1의 돌연변이는 망막모세포종의 산발적이고 가족성(familial)인 사례들 뿐 아니라(Weinberg, R. A., Science, 254:1138-46, 1991) 다른 인간의 암들에도 관련되어 있다(Classon, M. & Harlow, E., Nat Rev Cancer, 2:910-7, 2002). 아데노바이러스(adenovirus) E1A, HPV-E7 또는 시미안 바이러스 40(simian virus 40 (SV40)) 큰 T 항원( large T antigen)과 같은 종양유발 바이러스의 단백질들은 특정 암들에서 RB1과 결합하고, 이는 RB1과 E2F의 상호작용을 저해해, E2F의 해리가 일어나게 된다(Chellappan, S. P., et al., Cell, 65:1053-61, 1991; Bagchi, S. et al., Cell 65:1063-72, 1991). 사이클린-의존적 활성효소 4(cyclin-dependent kinase 4)의 저해제인 p16은, 종종 프로모터가 메틸화되어 불활성화되며, 이는 암세포에서 CDK/cyclin 복합체에 의한 RB1의 인산화 촉진으로 이어진다(Nuovo, G. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:12754-9, 1999). 이러한 약점은 일부 대장 및 간암과 관련있는 것으로 보고되었으며(Chaubert, P. et al., Hepatology, 25:1376-81, 1997; Toyota, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:8681-8686, 1999), 이러한 종류의 암들 모두를 설명할 수 있는 것은 아닐 것이다. 여기서는, RB1의 불활성화에 대한 새로운 메커니즘, 즉 메틸화에 의해 유발되며 RB1의 인산화 촉진이 뒤따르는 메커니즘이 밝혀졌다. 대부분의 대장 및 간암에서 SMYD3의 발현이 촉진되므로, SMYD3는 RB1의 종양억제 작용을 멈추게 하여, E2F의 전사촉진을 일으킴으로써 암세포 증식에 결정적인 역할을 할 것이다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 최근 E2F-1이 SMYD3의 프로모터 영역에서 E2F-1 결합 물질에 대한 E2F-1의 상호작용을 통해 SMYD3의 발현을 조절한다는 것과 그 물질이 2-또는 3- 단위반복(tandem repeats)된 E2F-1 결합 모티브로 구성되었다는 것을 발견하였다. 일본의 대장(n=350), 간(n=360), 유방(n=334) 암 환자들의 3-반복 대립유전자 빈도는 일반적인 일본인들로 이루어진 대조군의 것(n=730)보다 훨씬 높았다. 이러한 데이터는 일단 SMYD3가 활성화되면, RB1의 수식을 통해 E2F 전사활성을 증가시키고, 이어서 양성 피드백으로 SMYD3를 높게 유지하게 한다는 것을 시사한다. 따라서, E2F-1 결합물질의 3-반복들을 갖는 사람들은, 2-반복들을 갖는 사람들보다, SMYD3에 의한 RB1의 불활성화에 더 민감하다. 또한, SMYD3의 억제는 양성 피드백 루프(positive feedback loop)를 막고, 그것은 RB1의 인산화로 인한 E2F-1-매개의 분열촉진(mitogenic) 활성을 효과적으로 저해하기 때문에, SMYD3의 억제는 방광 및 유방 암과 간암, 대장암의 유망한 치료 전략으로 보인다.

본 명세서에서는 SMYD3에 의한 RB1의 메틸화가, CDK/cyclin 복합체에 의한 RB1 인산화 촉진을 통해, G1기에서 S기로의 세포주기 진행을 가속화시킨다는 것을 보였다. 이러한 데이터는 라이신의 메틸화가 히스톤 뿐 아니라 p53이나 RB1과 같이 히스톤이 아닌 다른 단백질에도 중요하다는 것을 의미한다. 게다가, 우리의 발견은 인간의 발암과 연관된 RB1 조절의 새로운 메커니즘을 뒷받침한다.

후생적 조절의 교란은 인간의 발암과 관련된 것으로 생각되었다. 인간의 발암에서, 세포 주기나 DNA 리페어(repair),세포 부착을 조절하는 유전자의 프로모터 부위 비정상적인 DNA의 메틸화뿐 아니라, 히스톤의 메틸화가 일어나지 않는다(abrogated)는 것이 최근 조사에서 밝혀졌다. 히스톤 메틸화는 염색질 구조 변화를 통해 유전자 발현 조절에 결정적인 역할을 한다. 우리는 SMYD3, 즉 히스톤 H3-라이신 4-특이적 메틸전이효소가 HCC, CRC나 유방암을 포함하는 몇몇 인간의 암 에서 과도하게 발현된다는 것을 보고하였다(Hamamoto, R. et al ., Nat Cell Biol,6:731-740, 2004; Hamamoto, R. et al., Cancer Sci, 97:113-118, 2006.). 우리는 종전 출원에서, 다양한 인간의 암에서 종종 강화되는 전사인자인 E2F1의 전사활성에 의해 SMYD3의 발현이 촉진된다는 것을 보인바 있다.

단백질의 기능은, 전사 후 수준에서만이 아니라, 단백질 절단, 아세틸화, 인산화, 메틸화, 당화, 유비퀴논화(ubiquitination)를 포함하는 번역후 수식화에 의해서도 조절된다. 이러한 수식화들은 단백질 불활성화나 활성화를 일으키는, 단백질과 단백질 사이의 상호작용들 및/또는 단백질의 입체형태, 단백질의 안정성과 관련이 있다. 우리는 SMYD3의 절단이 그것의 HMTase 활성도를 증가시키는 것을 발견했고, 그것은 펩신, 인슐린, 카스파제(caspases), PARP, MMP들과 같이 매우 중요한 효소들의 조절을 연상시키는데, 그 이유는 이 단백질들의 절단이 그것들의 효소 활성을 증가시키기 때문이다. 이러한 발견은 또한 SMYD3 절단에 대한, 확인되지 않은 메커니즘이 HMTase 활성 조절에 영향을 미칠 것이란 것도 시사한다. 따라서, 절단에 관여하는 단백질분해효소(protease)의 규명과 조절 메커니즘의 명확화는 SMYD3 활성을 억제하는 새로운 치료적 접근의 발전에 도움이 될 것이다. 게다가 SMYD3의 절단 형태는 전장 단백질과 비교하여, SMYD3 저해제의 스크리닝에 유용할 것이다.

우리는 본 연구에서 SMYD3 N-말단 부위의 결실이 시험관 내에서 그것의 효소 활성을 강화시킨다는 것을 발견했는데, 이는 이러한 결실이 SMYD3의 구조변화를 일으켜, 효소 활성 강화로 이어진다는 것을 의미한다. 흥미롭게도, HSP90이 SMYD3의 N-말단 부위에 결합해 그것의 HMTase 활성을 증가시킨다. HSP90은 정상적인 단백질 구조의 안정화에 기여하는, 샤페론(chaperone)과 유사한 기능을 하므로, 이러한 데이터는 구조 변화가 HMTase 활성에 영향을 미칠 것이라는 견해와 잘 일치한다. 우리의 발견은 또한, HMTase 활성에 있어서 보존된 SET-N 부위의 중요성을 강조한다. 이 보존된 부위는 단백질들을 포함하는 다른 SET 영역에서 HMTase의 음성 조절자(negative regulator)로도 기능할 것이다. 앞으로 단백질들을 포함하는 SET 영역에서의 HMTase 활성 조절 메커니즘이 밝혀질 것이다.

우리는 본 명세서에서, 암세포에서 SMYD3 단백질의 N-말단이 절단된 형태가 발현된다는 것과 절단된 단백질은 전장 단백질에 비해 확연히 높은 HMTase 활성을 보인다는 것을 보였다. 이러한 데이터는 번역-후 조절 시스템이, 단백질의 가능한 구조변화를 통해, HMTase 활성을 조절한다는 것을 암시한다. 게다가, 우리는 SAHH의 추가가 SMYD3의 메틸전이효소 활성을 증가시킨다는 것도 밝혔다. 우리의 발견은 SMYD3 활성 조절 메커니즘을 이해하는데 도움이 될 것이며, HMTase 활성을 저해하는 새로운 치료 전략의 확립에 공헌할 것이다.

본 명세서에 기재된 방법은, 대장암, 간암, 유방암, 방광암을 포함한 다양한 암들의 예방, 진단 또는 치료를 위한 추가적인 분자적 타겟(target)의 확인에 유용할 것이다. 게다가, 본 명세서에서 보고된 데이터는 암의 포괄적 이해를 돕고, 새로운 진단 전략의 발전을 촉진시키며, 치료제와 예방 물질들을 만들기 위한 분자적 타겟들을 규명하는데 단서를 제공한다. 이러한 정보는 종양발생을 더 깊이 이해하는데 도움이 되며, 암의 진단, 치료, 궁극적으로는 예방을 위한 새로운 전략을 발전시키는데 지표가 될 것이다. 본 발명이, 상세히 그리고 특정 실시예를 언급해가며 기재되었지만, 상기 기재는 사실 본보기나 설명적인 것이며, 발명과 그것의 적절한 예들을 설명하려는 것이다. 정형적인 설명을 통해, 당업자는 본 발명의 범위와 사상을 벗어나지 않고도 다양한 변화와 변형이 가능하다는 것을 쉽게 깨달을 것이다. 따라서, 본 상기 기재로 본 발명을 한정하려는 것이 아니고, 하기 청구의 범위 및 이와 균등한 범위로 본 발명의 범위를 정하려 한다.

<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. THE UNIVERSITY OF TOKYO <120> METHODS OF MODULATING SMYD3 FOR TREATMENT OF CANCERS <130> 7FPI-12-06 <150> US 60/695,957 <151> 2005-07-01 <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1622 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (96)..(1379) <400> 1 gtgcgcgcag ggcgcaggcg cgcgggtccc ggcagcccgt gagacgcccg ctgctggacg 60 cgggtagccg tctgaggtgc cggagctgcg ggagg atg gag ccg ctg aag 110 Met Glu Pro Leu Lys 1 5 gtg gaa aag ttc gca acc gcc aac agg gga aac ggg ctg cgc gcc gtg 158 Val Glu Lys Phe Ala Thr Ala Asn Arg Gly Asn Gly Leu Arg Ala Val 10 15 20 acc ccg ctg cgc ccc gga gag cta ctc ttc cgc tcg gat ccc ttg gcg 206 Thr Pro Leu Arg Pro Gly Glu Leu Leu Phe Arg Ser Asp Pro Leu Ala 25 30 35 tac acg gtg tgc aag ggg agt cgt ggc gtc gtc tgc gac cgc tgc ctt 254 Tyr Thr Val Cys Lys Gly Ser Arg Gly Val Val Cys Asp Arg Cys Leu 40 45 50 ctc ggg aag gaa aag ctg atg cga tgc tct cag tgc cgc gtc gcc aaa 302 Leu Gly Lys Glu Lys Leu Met Arg Cys Ser Gln Cys Arg Val Ala Lys 55 60 65 tac tgt agt gct aag 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Cys Lys Pro Arg 85 90 95 Tyr Pro Pro Asp Ser Val Arg Leu Leu Gly Arg Val Val Phe Lys Leu 100 105 110 Met Asp Gly Ala Pro Ser Glu Ser Glu Lys Leu Tyr Ser Phe Tyr Asp 115 120 125 Leu Glu Ser Asn Ile Asn Lys Leu Thr Glu Asp Lys Lys Glu Gly Leu 130 135 140 Arg Gln Leu Val Met Thr Phe Gln His Phe Met Arg Glu Glu Ile Gln 145 150 155 160 Asp Ala Ser Gln Leu Pro Pro Ala Phe Asp Leu Phe Glu Ala Phe Ala 165 170 175 Lys Val Ile Cys Asn Ser Phe Thr Ile Cys Asn Ala Glu Met Gln Glu 180 185 190 Val Gly Val Gly Leu Tyr Pro Ser Ile Ser Leu Leu Asn His Ser Cys 195 200 205 Asp Pro Asn Cys Ser Ile Val Phe Asn Gly Pro His Leu Leu Leu Arg 210 215 220 Ala Val Arg Asp Ile Glu Val Gly Glu Glu Leu Thr Ile Cys Tyr Leu 225 230 235 240 Asp Met Leu Met Thr Ser Glu Glu Arg Arg Lys Gln Leu Arg Asp Gln 245 250 255 Tyr Cys Phe Glu Cys Asp Cys Phe Arg Cys Gln Thr Gln Asp Lys Asp 260 265 270 Ala Asp Met Leu Thr Gly Asp Glu Gln Val Trp Lys Glu Val Gln Glu 275 280 285 Ser Leu Lys Lys Ile Glu Glu Leu Lys Ala His Trp Lys Trp Glu Gln 290 295 300 Val Leu Ala Met Cys Gln Ala Ile Ile Ser Ser Asn Ser Glu Arg Leu 305 310 315 320 Pro Asp Ile Asn Ile Tyr Gln Leu Lys Val Leu Asp Cys Ala Met Asp 325 330 335 Ala Cys Ile Asn Leu Gly Leu Leu Glu Glu Ala Leu Phe Tyr Gly Thr 340 345 350 Arg Thr Met Glu Pro Tyr Arg Ile Phe Phe Pro Gly Ser His Pro Val 355 360 365 Arg Gly Val Gln Val Met Lys Val Gly Lys Leu Gln Leu His Gln Gly 370 375 380 Met Phe Pro Gln Ala Met Lys Asn Leu Arg Leu Ala Phe Asp Ile Met 385 390 395 400 Arg Val Thr His Gly Arg Glu His Ser Leu Ile Glu Asp Leu Ile Leu 405 410 415 Leu Leu Glu Glu Cys Asp Ala Asn Ile Arg Ala Ser 420 425 <210> 3 <211> 4740 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (139)..(2922) <400> 3 ttccggtttt tctcagggga cgttgaaatt atttttgtaa cgggagtcgg gagaggacgg 60 ggcgtgcccc gcgtgcgcgc gcgtcgtcct ccccggcgct cctccacagc tcgctggctc 120 ccgccgcgga aaggcgtc atg ccg ccc aaa acc ccc cga aaa acg gcc gcc 171 Met Pro Pro Lys Thr Pro Arg Lys Thr Ala Ala 1 5 10 acc gcc gcc gct gcc gcc gcg gaa ccc ccg gca ccg ccg ccg ccg ccc 219 Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro 15 20 25 cct cct gag gag gac cca gag cag gac agc ggc ccg gag gac ctg cct 267 Pro Pro Glu Glu Asp Pro Glu Gln Asp Ser Gly Pro Glu Asp Leu Pro 30 35 40 ctc gtc agg ctt gag ttt gaa gaa aca gaa gaa cct gat ttt act gca 315 Leu Val Arg Leu Glu Phe Glu Glu Thr Glu Glu Pro Asp Phe Thr Ala 45 50 55 tta tgt cag aaa tta aag ata cca gat cat gtc aga gag aga gct tgg 363 Leu Cys Gln Lys Leu Lys Ile Pro Asp His Val Arg Glu Arg Ala Trp 60 65 70 75 tta act tgg gag aaa gtt tca tct gtg gat gga gta ttg gga ggt tat 411 Leu Thr Trp Glu Lys Val Ser Ser Val Asp Gly Val Leu Gly Gly Tyr 80 85 90 att caa aag aaa aag gaa ctg tgg gga atc tgt atc ttt att gca cga 459 Ile Gln Lys Lys Lys Glu Leu Trp Gly Ile Cys Ile Phe Ile Ala Arg 95 100 105 gtt gac cta gat gag atg tcg ttc act tta ctg agc tac aga aaa aca 507 Val Asp Leu Asp Glu Met Ser Phe Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Lys Thr 110 115 120 tac gaa atc agt gtc cat aaa ttc ttt aac tta cta aaa gaa att gat 555 Tyr Glu Ile Ser Val His Lys Phe Phe Asn Leu Leu Lys Glu Ile Asp 125 130 135 acc agt acc aaa gtt gat aat gct atg tca aga ctg ttg aag aag tat 603 Thr Ser Thr Lys Val Asp Asn Ala Met Ser Arg Leu Leu Lys Lys Tyr 140 145 150 155 gat gta ttg ttt gca ctc ttc agc aaa ttg gaa agg aca tgt gaa ctt 651 Asp Val Leu Phe Ala Leu Phe Ser Lys Leu Glu Arg Thr Cys Glu Leu 160 165 170 ata tat ttg aca caa ccc agc agt tcg ata tct act gaa ata aat tct 699 Ile Tyr Leu Thr Gln Pro Ser Ser Ser Ile Ser Thr Glu Ile Asn Ser 175 180 185 gca ttg gtg cta aaa gtt tct tgg atc aca ttt tta tta gct aaa ggg 747 Ala Leu Val Leu Lys Val Ser Trp Ile Thr Phe Leu Leu Ala Lys Gly 190 195 200 gaa gta tta caa atg gaa gat gat ctg gtg att tca ttt cag tta atg 795 Glu Val Leu Gln Met Glu Asp Asp Leu Val Ile Ser Phe Gln Leu Met 205 210 215 cta tgt gtc ctt gac tat ttt att aaa ctc tca cct ccc atg ttg ctc 843 Leu Cys Val Leu Asp Tyr Phe Ile Lys Leu Ser Pro Pro Met Leu Leu 220 225 230 235 aaa gaa cca tat aaa aca gct gtt ata ccc att aat ggt tca cct cga 891 Lys Glu Pro Tyr Lys Thr Ala Val Ile Pro Ile Asn Gly Ser Pro Arg 240 245 250 aca ccc agg cga ggt cag aac agg agt gca cgg ata gca aaa caa cta 939 Thr Pro Arg Arg Gly Gln Asn Arg Ser Ala Arg Ile Ala Lys Gln Leu 255 260 265 gaa aat gat aca aga att att gaa gtt ctc tgt aaa gaa cat gaa tgt 987 Glu Asn Asp Thr Arg Ile Ile Glu Val Leu Cys Lys Glu His Glu Cys 270 275 280 aat ata gat gag gtg aaa aat gtt tat ttc aaa aat ttt ata cct ttt 1035 Asn Ile Asp Glu Val Lys Asn Val Tyr Phe Lys Asn Phe Ile Pro Phe 285 290 295 atg aat tct ctt gga ctt gta aca tct aat gga ctt cca gag gtt gaa 1083 Met Asn Ser Leu Gly Leu Val Thr Ser Asn Gly Leu Pro Glu Val Glu 300 305 310 315 aat ctt tct aaa cga tac gaa gaa att tat ctt aaa aat aaa gat cta 1131 Asn Leu Ser Lys Arg Tyr Glu Glu Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Asp Leu 320 325 330 gat cga aga tta ttt ttg gat cat gat aaa act ctt cag act gat tct 1179 Asp Arg Arg Leu Phe Leu Asp His Asp Lys Thr Leu Gln Thr Asp Ser 335 340 345 ata gac agt ttt gaa aca cag aga aca cca cga aaa agt aac ctt gat 1227 Ile Asp Ser Phe Glu Thr Gln Arg Thr Pro Arg Lys Ser Asn Leu Asp 350 355 360 gaa gag gtg aat ata att cct cca cac act cca gtt agg act gtt atg 1275 Glu Glu Val Asn Ile Ile Pro Pro His Thr Pro Val Arg Thr Val Met 365 370 375 aac act atc caa caa tta atg atg att tta aat tct gca agt gat caa 1323 Asn Thr Ile Gln Gln Leu Met Met Ile Leu Asn Ser Ala Ser Asp Gln 380 385 390 395 cct tca gaa aat ctg att tcc tat ttt aac aac tgc aca gtg aat cca 1371 Pro Ser Glu Asn Leu Ile Ser Tyr Phe Asn Asn Cys Thr Val Asn Pro 400 405 410 aaa gaa agt ata ctg aaa aga gtg aag gat ata gga tac atc ttt aaa 1419 Lys Glu Ser Ile Leu Lys Arg Val Lys Asp Ile Gly Tyr Ile Phe Lys 415 420 425 gag aaa ttt gct aaa gct gtg gga cag ggt tgt gtc gaa att gga tca 1467 Glu Lys Phe Ala Lys Ala Val Gly Gln Gly Cys Val Glu Ile Gly Ser 430 435 440 cag cga tac aaa ctt gga gtt cgc ttg tat tac cga gta atg gaa tcc 1515 Gln Arg Tyr Lys Leu Gly Val Arg Leu Tyr Tyr Arg Val Met Glu Ser 445 450 455 atg ctt aaa tca gaa gaa gaa cga tta tcc att caa aat ttt agc aaa 1563 Met Leu Lys Ser Glu Glu Glu Arg Leu Ser Ile Gln Asn Phe Ser Lys 460 465 470 475 ctt ctg aat gac aac att ttt cat atg tct tta ttg gcg tgc gct ctt 1611 Leu Leu Asn Asp Asn Ile Phe His Met Ser Leu Leu Ala Cys Ala Leu 480 485 490 gag gtt gta atg gcc aca tat agc aga agt aca tct cag aat ctt gat 1659 Glu Val Val Met Ala Thr Tyr Ser Arg Ser Thr Ser Gln Asn Leu Asp 495 500 505 tct gga aca gat ttg tct ttc cca tgg att ctg aat gtg ctt aat tta 1707 Ser Gly Thr Asp Leu Ser Phe Pro Trp Ile Leu Asn Val Leu Asn Leu 510 515 520 aaa gcc ttt gat ttt tac aaa gtg atc gaa agt ttt atc aaa gca gaa 1755 Lys Ala Phe Asp Phe Tyr Lys Val Ile Glu Ser Phe Ile Lys Ala Glu 525 530 535 ggc aac ttg aca aga gaa atg ata aaa cat tta gaa cga tgt gaa cat 1803 Gly Asn Leu Thr Arg Glu Met Ile Lys His Leu Glu Arg Cys Glu His 540 545 550 555 cga atc atg gaa tcc ctt gca tgg ctc tca gat tca cct tta ttt gat 1851 Arg Ile Met Glu Ser Leu Ala Trp Leu Ser Asp Ser Pro Leu Phe Asp 560 565 570 ctt att aaa caa tca aag gac cga gaa gga cca act gat cac ctt gaa 1899 Leu Ile Lys Gln Ser Lys Asp Arg Glu Gly Pro Thr Asp His Leu Glu 575 580 585 tct gct tgt cct ctt aat ctt cct ctc cag aat aat cac act gca gca 1947 Ser Ala Cys Pro Leu Asn Leu Pro Leu Gln Asn Asn His Thr Ala Ala 590 595 600 gat atg tat ctt tct cct gta aga tct cca aag aaa aaa ggt tca act 1995 Asp Met Tyr Leu Ser Pro Val Arg Ser Pro Lys Lys Lys Gly Ser Thr 605 610 615 acg cgt gta aat tct act gca aat gca gag aca caa gca acc tca gcc 2043 Thr Arg Val Asn Ser Thr Ala Asn Ala Glu Thr Gln Ala Thr Ser Ala 620 625 630 635 ttc cag acc cag aag cca ttg aaa tct acc tct ctt tca ctg ttt tat 2091 Phe Gln Thr Gln Lys Pro Leu Lys Ser Thr Ser Leu Ser Leu Phe Tyr 640 645 650 aaa aaa gtg tat cgg cta gcc tat ctc cgg cta aat aca ctt tgt gaa 2139 Lys Lys Val Tyr Arg Leu Ala Tyr Leu Arg Leu Asn Thr Leu Cys Glu 655 660 665 cgc ctt ctg tct gag cac cca gaa tta gaa cat atc atc tgg acc ctt 2187 Arg Leu Leu Ser Glu His Pro Glu Leu Glu His Ile Ile Trp Thr Leu 670 675 680 ttc cag cac acc ctg cag aat gag tat gaa ctc atg aga gac agg cat 2235 Phe Gln His Thr Leu Gln Asn Glu Tyr Glu Leu Met Arg Asp Arg His 685 690 695 ttg gac caa att atg atg tgt tcc atg tat ggc ata tgc aaa gtg aag 2283 Leu Asp Gln Ile Met Met Cys Ser Met Tyr Gly Ile Cys Lys Val Lys 700 705 710 715 aat ata gac ctt aaa ttc aaa atc att gta aca gca tac aag gat ctt 2331 Asn Ile Asp Leu Lys Phe Lys Ile Ile Val Thr Ala Tyr Lys Asp Leu 720 725 730 cct cat gct gtt cag gag aca ttc aaa cgt gtt ttg atc aaa gaa gag 2379 Pro His Ala Val Gln Glu Thr Phe Lys Arg Val Leu Ile Lys Glu Glu 735 740 745 gag tat gat tct att ata gta ttc tat aac tcg gtc ttc atg cag aga 2427 Glu Tyr Asp Ser Ile Ile Val Phe Tyr Asn Ser Val Phe Met Gln Arg 750 755 760 ctg aaa aca aat att ttg cag tat gct tcc acc agg ccc cct acc ttg 2475 Leu Lys Thr Asn Ile Leu Gln Tyr Ala Ser Thr Arg Pro Pro Thr Leu 765 770 775 tca cca ata cct cac att cct cga agc cct tac aag ttt cct agt tca 2523 Ser Pro Ile Pro His Ile Pro Arg Ser Pro Tyr Lys Phe Pro Ser Ser 780 785 790 795 ccc tta cgg att cct gga ggg aac atc tat att tca ccc ctg aag agt 2571 Pro Leu Arg Ile Pro Gly Gly Asn Ile Tyr Ile Ser Pro Leu Lys Ser 800 805 810 cca tat aaa att tca gaa ggt ctg cca aca cca aca aaa atg act cca 2619 Pro Tyr Lys Ile Ser Glu Gly Leu Pro Thr Pro Thr Lys Met Thr Pro 815 820 825 aga tca aga atc tta gta tca att ggt gaa tca ttc ggg act tct gag 2667 Arg Ser Arg Ile Leu Val Ser Ile Gly Glu Ser Phe Gly Thr Ser Glu 830 835 840 aag ttc cag aaa ata aat cag atg gta tgt aac agc gac cgt gtg ctc 2715 Lys Phe Gln Lys Ile Asn Gln Met Val Cys Asn Ser Asp Arg Val Leu 845 850 855 aaa aga agt gct gaa gga agc aac cct cct aaa cca ctg aaa aaa cta 2763 Lys Arg Ser Ala Glu Gly Ser Asn Pro Pro Lys Pro Leu Lys Lys Leu 860 865 870 875 cgc ttt gat att gaa gga tca gat gaa gca gat gga agt aaa cat ctc 2811 Arg Phe Asp Ile Glu Gly Ser Asp Glu Ala Asp Gly Ser Lys His Leu 880 885 890 cca gga gag tcc aaa ttt cag cag aaa ctg gca gaa atg act tct act 2859 Pro Gly Glu Ser Lys Phe Gln Gln Lys Leu Ala Glu Met Thr Ser Thr 895 900 905 cga aca cga atg caa aag cag aaa atg aat gat agc atg gat acc tca 2907 Arg Thr Arg Met Gln Lys Gln Lys Met Asn Asp Ser Met Asp Thr Ser 910 915 920 aac aag gaa gag aaa tgaggatc tcaggacctt ggtggacact gtgtacacct 2960 Asn Lys Glu Glu Lys 925 ctggattcat tgtctctcac agatgtgact gtataacttt cccaggttct gtttatggcc 3020 acatttaata tcttcagctc tttttgtgga tataaaatgt gcagatgcaa ttgtttgggt 3080 gagtcctaag ccacttgaaa tgttagtcat tgttatttat acaagattga aaatcttgtg 3140 taaatcctgc catttaaaaa gttgtagcag attgtttcct cttccaaagt aaaattgctg 3200 tgctttatgg atagtaagaa tggccctaga gtgggagtcc tgataaccca ggcctgtctg 3260 actactttgc cttcttttgt agcatatagg tgatgtttgc tcttgttttt attaatttat 3320 atgtatattt ttttaattta acatgaacac ccttagaaaa tgtgtcctat ctatcttcca 3380 aatgcaattt gattgactgc ccattcacca aaattatcct gaactcttct gcaaaaatgg 3440 atattattag aaattagaaa aaaattacta attttacaca ttagatttta ttttactatt 3500 ggaatctgat atactgtgtg cttgttttat aaaattttgc ttttaattaa ataaaagctg 3560 gaagcaaagt ataaccatat gatactatca tactactgaa acagatttca tacctcagaa 3620 tgtaaaagaa cttactgatt attttcttca tccaacttat gtttttaaat gaggattatt 3680 gatagtactc ttggttttta taccattcag atcactgaat ttataaagta cccatctagt 3740 acttgaaaaa gtaaagtgtt ctgccagatc ttaggtatag aggaccctaa cacagtatat 3800 cccaagtgca ctttctaatg tttctgggtc ctgaagaatt aagatacaaa ttaattttac 3860 tccataaaca gactgttaat tataggagcc ttaatttttt tttcatagag atttgtctaa 3920 ttgcatctca aaattattct gccctcctta atttgggaag gtttgtgttt tctctggaat 3980 ggtacatgtc ttccatgtat cttttgaact ggcaattgtc tatttatctt ttattttttt 4040 aagtcagtat ggtctaacac tggcatgttc aaagccacat tatttctagt ccaaaattac 4100 aagtaatcaa gggtcattat gggttaggca ttaatgtttc tatctgattt tgtgcaaaag 4160 cttcaaatta aaacagctgc attagaaaaa gaggcgcttc tcccctcccc tacacctaaa 4220 ggtgtattta aactatcttg tgtgattaac ttatttagag atgctgtaac ttaaaatagg 4280 ggatatttaa ggtagcttca gctagctttt aggaaaatca ctttgtctaa ctcagaatta 4340 tttttaaaaa gaaatctggt cttgttagaa aacaaaattt tattttgtgc tcatttaagt 4400 ttcaaactta ctattttgac agttattttg ataacaatga cactagaaaa cttgactcca 4460 tttcatcatt gtttctgcat gaatatcata caaatcagtt agtttttagg tcaagggctt 4520 actatttctg ggtcttttgc tactaagttc acattagaat tagtgccaga attttaggaa 4580 cttcagagat cgtgtattga gatttcttaa ataatgcttc agatattatt gctttattgc 4640 ttttttgtat tggttaaaac tgtacattta aaattgctat gttactattt tctacaatta 4700 atagtttgtc tattttaaaa taaattagtt gttaagagtc 4740 <210> 4 <211> 928 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Pro Pro Lys Thr Pro Arg Lys Thr Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Glu Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Glu Glu Asp 20 25 30 Pro Glu Gln Asp Ser Gly Pro Glu Asp Leu Pro Leu Val Arg Leu Glu 35 40 45 Phe Glu Glu Thr Glu Glu Pro Asp Phe Thr Ala Leu Cys Gln Lys Leu 50 55 60 Lys Ile Pro Asp His Val Arg Glu Arg Ala Trp Leu Thr Trp Glu Lys 65 70 75 80 Val Ser Ser Val Asp Gly Val Leu Gly Gly Tyr Ile Gln Lys Lys Lys 85 90 95 Glu Leu Trp Gly Ile Cys Ile Phe Ile Ala Arg Val Asp Leu Asp Glu 100 105 110 Met Ser Phe Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Lys Thr Tyr Glu Ile Ser Val 115 120 125 His Lys Phe Phe Asn Leu Leu Lys Glu Ile Asp Thr Ser Thr Lys Val 130 135 140 Asp Asn Ala Met Ser Arg Leu Leu Lys Lys Tyr Asp Val Leu Phe Ala 145 150 155 160 Leu Phe Ser Lys Leu Glu Arg Thr Cys Glu Leu Ile Tyr Leu Thr Gln 165 170 175 Pro Ser Ser Ser Ile Ser Thr Glu Ile Asn Ser Ala Leu Val Leu Lys 180 185 190 Val Ser Trp Ile Thr Phe Leu Leu Ala Lys Gly Glu Val Leu Gln Met 195 200 205 Glu Asp Asp Leu Val Ile Ser Phe Gln Leu Met Leu Cys Val Leu Asp 210 215 220 Tyr Phe Ile Lys Leu Ser Pro Pro Met Leu Leu Lys Glu Pro Tyr Lys 225 230 235 240 Thr Ala Val Ile Pro Ile Asn Gly Ser Pro Arg Thr Pro Arg Arg Gly 245 250 255 Gln Asn Arg Ser Ala Arg Ile Ala Lys Gln Leu Glu Asn Asp Thr Arg 260 265 270 Ile Ile Glu Val Leu Cys Lys Glu His Glu Cys Asn Ile Asp Glu Val 275 280 285 Lys Asn Val Tyr Phe Lys Asn Phe Ile Pro Phe Met Asn Ser Leu Gly 290 295 300 Leu Val Thr Ser Asn Gly Leu Pro Glu Val Glu Asn Leu Ser Lys Arg 305 310 315 320 Tyr Glu Glu Ile Tyr Leu Lys Asn Lys Asp Leu Asp Arg Arg Leu Phe 325 330 335 Leu Asp His Asp Lys Thr Leu Gln Thr Asp Ser Ile Asp Ser Phe Glu 340 345 350 Thr Gln Arg Thr Pro Arg Lys Ser Asn Leu Asp Glu Glu Val Asn Ile 355 360 365 Ile Pro Pro His Thr Pro Val Arg Thr Val Met Asn Thr Ile Gln Gln 370 375 380 Leu Met Met Ile Leu Asn Ser Ala Ser Asp Gln Pro Ser Glu Asn Leu 385 390 395 400 Ile Ser Tyr Phe Asn Asn Cys Thr Val Asn Pro Lys Glu Ser Ile Leu 405 410 415 Lys Arg Val Lys Asp Ile Gly Tyr Ile Phe Lys Glu Lys Phe Ala Lys 420 425 430 Ala Val Gly Gln Gly Cys Val Glu Ile Gly Ser Gln Arg Tyr Lys Leu 435 440 445 Gly Val Arg Leu Tyr Tyr Arg Val Met Glu Ser Met Leu Lys Ser Glu 450 455 460 Glu Glu Arg Leu Ser Ile Gln Asn Phe Ser Lys Leu Leu Asn Asp Asn 465 470 475 480 Ile Phe His Met Ser Leu Leu Ala Cys Ala Leu Glu Val Val Met Ala 485 490 495 Thr Tyr Ser Arg Ser Thr Ser Gln Asn Leu Asp Ser Gly Thr Asp Leu 500 505 510 Ser Phe Pro Trp Ile Leu Asn Val Leu Asn Leu Lys Ala Phe Asp Phe 515 520 525 Tyr Lys Val Ile Glu Ser Phe Ile Lys Ala Glu Gly Asn Leu Thr Arg 530 535 540 Glu Met Ile Lys His Leu Glu Arg Cys Glu His Arg Ile Met Glu Ser 545 550 555 560 Leu Ala Trp Leu Ser Asp Ser Pro Leu Phe Asp Leu Ile Lys Gln Ser 565 570 575 Lys Asp Arg Glu Gly Pro Thr Asp His Leu Glu Ser Ala Cys Pro Leu 580 585 590 Asn Leu Pro Leu Gln Asn Asn His Thr Ala Ala Asp Met Tyr Leu Ser 595 600 605 Pro Val Arg Ser Pro Lys Lys Lys Gly Ser Thr Thr Arg Val Asn Ser 610 615 620 Thr Ala Asn Ala Glu Thr Gln Ala Thr Ser Ala Phe Gln Thr Gln Lys 625 630 635 640 Pro Leu Lys Ser Thr Ser Leu Ser Leu Phe Tyr Lys Lys Val Tyr Arg 645 650 655 Leu Ala Tyr Leu Arg Leu Asn Thr Leu Cys Glu Arg Leu Leu Ser Glu 660 665 670 His Pro Glu Leu Glu His Ile Ile Trp Thr Leu Phe Gln His Thr Leu 675 680 685 Gln Asn Glu Tyr Glu Leu Met Arg Asp Arg His Leu Asp Gln Ile Met 690 695 700 Met Cys Ser Met Tyr Gly Ile Cys Lys Val Lys Asn Ile Asp Leu Lys 705 710 715 720 Phe Lys Ile Ile Val Thr Ala Tyr Lys Asp Leu Pro His Ala Val Gln 725 730 735 Glu Thr Phe Lys Arg Val Leu Ile Lys Glu Glu Glu Tyr Asp Ser Ile 740 745 750 Ile Val Phe Tyr Asn Ser Val Phe Met Gln Arg Leu Lys Thr Asn Ile 755 760 765 Leu Gln Tyr Ala Ser Thr Arg Pro Pro Thr Leu Ser Pro Ile Pro His 770 775 780 Ile Pro Arg Ser Pro Tyr Lys Phe Pro Ser Ser Pro Leu Arg Ile Pro 785 790 795 800 Gly Gly Asn Ile Tyr Ile Ser Pro Leu Lys Ser Pro Tyr Lys Ile Ser 805 810 815 Glu Gly Leu Pro Thr Pro Thr Lys Met Thr Pro Arg Ser Arg Ile Leu 820 825 830 Val Ser Ile Gly Glu Ser Phe Gly Thr Ser Glu Lys Phe Gln Lys Ile 835 840 845 Asn Gln Met Val Cys Asn Ser Asp Arg Val Leu Lys Arg Ser Ala Glu 850 855 860 Gly Ser Asn Pro Pro Lys Pro Leu Lys Lys Leu Arg Phe Asp Ile Glu 865 870 875 880 Gly Ser Asp Glu Ala Asp Gly Ser Lys His Leu Pro Gly Glu Ser Lys 885 890 895 Phe Gln Gln Lys Leu Ala Glu Met Thr Ser Thr Arg Thr Arg Met Gln 900 905 910 Lys Gln Lys Met Asn Asp Ser Met Asp Thr Ser Asn Lys Glu Glu Lys 915 920 925 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer for PCR <400> 5 aagcttgcgg ccgcgatgga gccgctgaag gtggaaaag 39 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer for PCR <400> 6 ggtacctcta gattaggatg ctctgatgtt ggcgtc 36 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer for PCR <400> 7 ggggtacctt aggatgctct gatgttggcg tc 32 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer for PCR <400> 8 cggaattctg gcgcgatgga gccgctgaag gtggaaaag 39 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer for PCR <400> 9 cggaattctg actccgttcg acttcttggc ag 32 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer for PCR <400> 10 cggaattctc ggaagcagct gagggaccag tactgc 36 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized primer for PCR <400> 11 cggaattcac ccttggcgta cacggtgtgc aagg 34

Claims (21)

1. 하기 단계들을 포함하는 SMYD3로 망막모세포종의 메틸화를 조절하는 물질을 동정하는 방법:

   a. 하기 성분들로 이루어진 그룹에서 선택된, 메틸전이효소 활성을 가지는 SMYD3 폴리펩타이드를 상기 물질의 존재 하에, 망막모세포종 펩타이드의 메틸화에 적합한 조건에서, 메틸화 될 망막모세포종 펩타이드 및 보조인자와 접촉시키는 단계:

   ⅰ. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;

   ⅱ. 서열번호 2의 아미노산 서열 중 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환되거나 결실 또는 삽입된 폴리펩타이드로, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리 펩타이드와 등가(equivalent)의 메틸전이효소 활성을 갖는 폴리펩타이드;

   ⅲ. 서열번호 2와 최소한 약 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드로, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드와 등가의 메틸전이효소 활성을 갖는 폴리펩타이드;

   ⅳ. 엄격한 조건에서 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 폴리뉴클레오타이드와 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드가 코딩하는 폴리펩타이드로, 서열번호 2의 아미노산서열로 구성된 폴리펩타이드와 등가의 메틸전이효소 활성을 갖는 폴리펩타이드;및

   ⅴ. 서열번호 2의 아미노산 서열의 위치 117에서 246까지의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드로, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드와 등가의 메틸전이효소 활성을 갖는 폴리펩타이드;

   b. 망막모세포종 펩타이드의 메틸화 정도를 검출하는 단계; 및

   c. 단계(b)의 메틸화 정도를 상기 물질이 없는 조건에서 검출한 대조군의 정도와 비교하는 단계(이때, 대조군의 정도와 비교해 메틸화 정도의 증가 또는 감소는, 상기 물질이 SMYD3로 망막모세포종의 메틸화를 조절하는 것을 의미한다).
2. 제 1항에 있어서, 상기 망막모세포종 펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩타이드, 또는 그것의 기능적 돌연변이, 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 보조인자는 에스-아데노실 호모시스테인 하이드로레이즈(S-adenosyl homocysteine hydrolase(SAHH))인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 하기와 같은 구성성분들로 구성되는, 망막모세포종의 메틸화를 조절하는 시험 화합물의 활성을 검출하기 위한 키트:

   a. 하기 성분들로 구성된 그룹에서 선택된, 메틸전이효소 활성을 갖는 SMYD3 폴리펩타이드:

   ⅰ. 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드;

   ⅱ.서열번호 2의 아미노산 서열 중 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환되거나 결실 또는 삽입된 폴리펩타이드로, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드와 등가(equivalent)의 메틸전이효소 활성을 갖는 폴리펩타이드;

   ⅲ. 서열번호 2와 최소한 약 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드로, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드와 등가의 메틸전이효소 활성을 갖는 폴리펩타이드;

   ⅳ. 엄격한 조건에서 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 폴리뉴클레오타이드와 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드가 코딩하는 폴리펩타이드로, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드와 등가의 메틸전이효소 활성을 갖는 폴 리펩타이드;및

   ⅴ. 서열번호 2의 아미노산 서열의 위치 117에서 246까지의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드로, 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드와 등가의 메틸전이효소 활성을 갖는 폴리펩타이드;

   b. (a)의 폴리펩타이드로 메틸화될 수 있는 망막모세포종 펩타이드;및

   c. 망막모세포종 펩타이드의 메틸화를 위한 보조인자.
5. 제 4항에 있어서, 상기 망막모세포종 펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드, 또는 그것의 기능적 돌연변이 단편인 것을 특징으로 하는 키트.
6. 제 4항에 있어서, 상기 키트는 하기 요소들로 구성된 키트:

   a. S-adenosyl homocysteine hydrolase(SAHH).
7. 하기 단계들을 포함하는, 대장암, 간암, 방광암 및 유방암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암을 치료하기 위한 화합물을 스크리닝하는 방법:

   a. 제 1항의 방법을 이용하여 메틸화를 조절하는 시험 화합물을 동정하는 단계; 및

   b. 상기 시험 화합물의 부존재 하 검출된 대조군의 메틸화 정도에 비교해, 메틸화될 기질의 메틸화 정도를 감소시키는 시험 화합물을 선택하는 단계.
8. 적절한 담체 및 제 7항의 방법으로 동정된 약학적으로 유효한 양의 화합물을 포함하는 조성물로, 대장암, 간암, 방광암 및 유방암으로 구성된 군으로부터 선택되는 암의 증세 완화를 위한 조성물.
9. 암세포를 제 7항의 방법으로 동정한, 약학적으로 유효한 양의 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 대장암, 간암, 방광암 및 유방암으로 구성된 군으로부터 선택된 암의 증세를 완화시키는 방법.
10. 제 1항에서, (ⅲ)의 상기 폴리펩타이드는 서열번호 2와 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1항에서, (ⅱ)의 상기 폴리펩타이드는, 20개 아미노산까지 보존성 치환이 일어난 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 1항에서, (ⅱ)의 상기 폴리펩타이드는, 서열번호 2의 아미노산 서열의 위치 1에서 250까지의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 1항에서, (ⅱ)의 상기 폴리펩타이드는, 서열번호 2의 아미노산 서열의 위치 45에서 428가지의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 1항에서, (ⅱ)의 상기 폴리펩타이드는, 위치 1에서 30까지의 아미노산들이 결실된 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 1항에서, (ⅱ)의 상기 폴리펩타이드는, 위치 1에서 44까지의 아미노산들이 결실된 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 1항에서, (ⅱ)의 상기 폴리펩타이드는, 위치 1에서 20까지의 아미노산들 이 결실된 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 1항에서, (ⅱ)의 상기 폴리펩타이드는, 위치 1에서 10까지의 아미노산들이 결실된 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 1항에서, (ⅳ)의 상기 폴리펩타이드는, 특히, 매우 엄격한 조건에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 폴리뉴클레오타이드와 혼성화하는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제 2항에서, 상기 기능적 망막모세포종 단편은 C-말단 단편으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 2항에서, 상기 기능적 망막모세포종 조각은 서열번호 4의 아미노산 서열의 위치 769-921의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제 2항에서, 상기 기능적 망막모세포종 돌연변이는, 하기 돌연변이들 중 하나 또는 그 이상을 포함하는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

    K880A, K896A, K791A, K814A, K791A/K824A 또는 K814A/K824A.

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