KR20080035032A

KR20080035032A - 포자형성 미생물에 대한 포자살균제

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Publication number: KR20080035032A
Application number: KR1020060101089A
Authority: KR
Inventors: 황재관; 이지혜; 이선희; 심재석; 윤지훈; 김정환; 조유미
Original assignee: 황재관
Priority date: 2006-10-18
Filing date: 2006-10-18
Publication date: 2008-04-23

Abstract

본 발명은 포자형 미생물에 대한 포자 살균제에 관한 것으로 보다 상세하게는 캠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata)로부터 분리된 화학식 1의 판두라틴 에이(panduratin A)와 화학식 2의 아이소판두라틴 에이(isopanduratin A)는 포자형성 미생물의 포자에 대하여 높은 살균활성을 나타낸다.

[화학식 1]

[화학식 2]

포자형성 미생물, 식중독 균주, 바실러스 세레우스, 클로스트리듐 퍼프리젠스, 캠페리아 판두라타, 판두라틴 에이, 아이소판두라틴 에이, 포자살균, 발아

Description

포자형성 미생물에 대한 포자살균제{Sporicidal agent against sporforming microorganism}

도 1은 캠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata)로부터 판두라틴 에이(panduratin A) 및 아이소판두라틴 에이(isopanduratin A)를 분리하는 공정도이다.

도 2는 판두라틴 에이(panduratin A)의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.

도 3은 판두라틴 에이(panduratin A)의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다.

도 4는 판두라틴 에이(panduratin A)의 ¹H-¹H COSY 스펙트럼이다.

도 5는 판두라틴 에이(panduratin A)의 DEPT 스펙트럼이다.

도 6은 판두라틴 에이(panduratin A)의 HSQC 스펙트럼이다.

도 7은 판두라틴 에이(panduratin A)의 FAB-Mass 스펙트럼이다.

도 8은 아이소판두라틴 에이(isopanduratin A)의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.

도 9는 아이소판두라틴 에이(isopanduratin A)의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다.

도 10은 판두라틴 에이(isopanduratin A)의 DEPT 스펙트럼이다.

도 11은 판두라틴 에이(isopanduratin A)의 FAB-MASS 스펙트럼이다.

도 12는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 영양세포(vegetative cell)의 현미경사진이다.

도 13은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 포자(spore)의 현미경사진이다.

도 14는 캠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata)추출물의 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 포자(spore)에 대한 농도별 살균효과를 나타낸 그래프이다.

도 15는 판두라틴 에이(panduratin A)의 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 포자(spore)에 대한 농도별 살균효과를 나타낸 그래프이다.

도 16은 아이소판두라틴 에이(isopanduratin A)의 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 포자(spore)에 대한 농도별 살균효과를 나타낸 그래프이다.

도 17은 캠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata)추출물, 판두라틴 에이(panduratin A), 아이소판두라틴 에이(isopanduratin A)의 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 포자(spore)에 대한 발아(germination)억제 효과를 나타낸 현미경사진이다.

본 발명은 캠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata)로부터 포자형성균에 대해 살균활성을 나타내는 물질을 추출하는 방법과 그 방법에 의하여 추출된 포자살균 활성물질에 관한 것이다.

보다 상세하게는 포자형성 식중독균인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 포자에 대하여 우수한 살균활성을 가지는 천연 약용 식물인 캠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata)로부터 분리 및 정제된 살균활성물질인 판두라틴 에이(panduratin A)와 아이소판두라틴 에이(isopanduratin A)의 살균효과에 관한 것이다.

식품공전에 의하면 식품에 들어있어서는 안되는 식품유해균으로서 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)를 포함한 9가지 식중독균을 지정하였으며, 바실러스 세레우스와 관련한 미생물 규격으로 생식에서 10³CFU/g이하, 장류에서는 10⁴CFU/g이하로 고시하는 등'식품별 기준 및 규격'에서 식중독균에 대한 규격이 정량으로 정하여진 식품에는 정량규격을 적용한다고 고시되어 있다. 또한 식품의약품안정청(KFDA)에서는 앞으로도 합리적인 미생물 위해평가(Microbial Risk Assessment)를 통하여 식품 유형별 미생물의 정량 규격을 제시할 계획이라고 밝힌바 있다.

최근 이상기후 등과 같은 환경변화와 수입식품의 증가 및 집단 급식의 증가에 따라 식중독 발생이 증가하고 대형화하는 추세가 뚜렷하여 이에 대한 대비책이 시급한 과제로 부상하고 있으며 국민 생활수준의 향상과 사회 환경의 변화로 소비자들은 식품의 안전성 및 위생적 품질에 대한 관심이 증대되고 있다.

바실러스 세레우스는 토양, 물, 공기, 식품 표면 및 곡류 등 자연계에 널리 분포하는 그람 양성, 중온성 간균이며 포자를 형성하는 내열성 세균으로서, 조리 후 수 시간 방치된 고기와 야채, 스프 등에서 포자의 발아로 증식하여 설사를 일으키는 사례가 보고되고 있으며, 밥, 죽, 면류 등에서는 주로 구토를 일으키는 식중독 사례가 보고되고 있다. 또한 바실러스 세레우스는 흔하게 분포하며 10⁵CFU/g 이상으로 증식할 경우 식중독을 일으킬 수 있는 포자형성 독소형 식중독균이다. 바실러스 세레우스에 의한 식중독은 크게 두 가지 유형으로 나누어져 있으며 보다 자세하게는 독소가 열에 약하며 잠복기가 8시간에서 16시간으로 긴 설사형식중독과 잠복기가 1시간에서 6시간으로 비교적 짧지만 강한 독소를 지니며 한국인의 주식인 쌀밥 및 볶음밥 등에서 많이 발생하는 구토형식중독이 있다.

전형적인 내생포자 형성균인 바실러스속(Bacillus spp.)의 세포는 영양생장이 중지되고 탄소원 또는 질소원과 같은 주영양분이 고갈될 때 포자화가 시작된다. 포자가 생성되는 동안 영양세포는 생장을 멈추고 내열성 구조물인 내생포자로 전환된다. 내생포자와 영양세포 사이에는 구조적인 큰 차이가 있다. 포자화(sporulation)는 세포수가 지수적으로 분열될 때는 일어나지 않고, 영양성분의 고갈에 의해 세포의 생장이 정지되었을 때에만 일어난다. 포자형성은 염색체가 길어져서 축상 크로마틴(chromatin)이 형성되고 메소좀(mesosome)의 유도에 의해서 세포막이 세포 양측으로부터 세포질내로 접어져 들어가 세포 끝에 위치한 핵을 격리하면서부터 시작된다. 크기가 다른 모세포와 전포자(prespore)가 생기고 모세포막은 인지질 합성을 활발히 계속하여 전포자(prespore)를 싸서 두개의 막을 가진 포자로 된다. 이 두 막 사이에 피층(cortex)이 생기며 바실러스 세레우스와 같이 포자 외막(exosporium)이 있는 균종은 이 시기에 포자가 생성된다. 이 외막이 형성과정에서 바깥쪽 막 밖에서 단편적인 단백질이 침착되고 융합하여 포자각(spore coat)으로 성장한다. 포자는 성숙되고 융해되어 포자가 유리된다. 또한 포자는 발아하고 생육하여 영양세포로 된다(참조: Gould, G.W. Academic Press. New York.USA, 2, 173-184, 1982). 중심세포(core)는 탈수되어 건조상태를 유지하고, 펩티도클루칸(peptidoglycan)으로 이루어진 피층(cortex), 단백질(protein)로 구성된 코트층(coats layer)을 가지는 구조와 생화학적 특성(structure and biochemical properties)으로 열, 항균제 또는 항생제 등의 화학약품, 라이소자임(lysozyme), 고압(high pressure), 물리적 충격, 고전압 펄스장(high voltage pulse electric filed), 자외선(UV) 방사 등에 대하여 큰 저항성을 가지고 있으며, 극도로 불리한 생육 환경에서 살아남기 위하여 장기 휴면기능도 가지고 있다. 그러므로 가공식품의 미생물 안전성 설계 시 포자의 살균조건을 우선적으로 검토하여야 한다.

그러나 바실러스 세레우스는 그 내열성 및 포자형성능 때문에 레토르트 동등이상의 열처리를 하지 않고서는 제어하기 어려운 실정이며 이러한 법규의 적용은 식품 제조 공정의 산업화 단계에서 손실 비용 및 품질 관리 비용에 막대한 영향을 미치고 있다. 따라서 포자형성 미생물의 발아 억제( germination inhibition) 및 살균 방법을 연구, 개발하는 것이 가공식품의 위생확보와 유통기한확보 측면에서 매우 중요하다.

비포자형성균의 경우, 내열성이 약하고 화학적 처리에 대한 내성도 떨어지므로 100℃ 미만의 열처리나 유기산(organic acid), 박테리오신(bacteriocine), 알코올(alcohol)등 상업화된 항균제로 충분히 균의 생육을 억제시키거나 사멸시킬 수 있다. 반면에, 바실러스 속(Bacillus spp.)과 클로스트리듐 속(Clostridium spp.)과 같은 포자형성능을 가진 미생물은 화학적, 구조적, 생태학적 여러 특성으로 쉽게 사멸되지 않으므로 통상적으로 내열살균방법을 적용하여 내열성 포자를 사멸시키나, 이때 고온에 의한 조직감, 외관, 맛의 변화 등의 관능 및 품질상의 손상이 심하며 또한 영양 성분의 파괴도 많이 발생하여 고품질 가공식품의 개발에 장애요인으로 작용한다.

따라서 약용식물 등의 천연물로부터 부작용이 없으며 포자사멸효과를 갖는 천연 항균물질의 개발이 시급하다. 포자형성 식중독균인 바실러스 세레우스포자의 증식 및 활성을 효과적으로 억제하며, 포자를 사멸시켜 식중독방지 및 식품안전을 유지할 수 있는 성분을 함유하는 살균활성이 높으며 안전성이 높은 천연물질을 분리하는 것이 필요하다.

따라서 본 발명은 포자형성 마생물의 포자(spore)에 대하여 강력한 살균활성을 나타내는 물질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 판두라틴 에이 및 아이소판두라틴 에이는 종래의 물질을 추출하고 분리하는 방법을 이용하여 캠페리아 판두라타로부터 분리 및 정제될 수 있다. 상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명은 건조하여 분쇄한 캠페리아 판두라타에 물, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 혹은 이들의 혼합 용매를 이용하여 추출하는 단계; 추출물의 용매를 제거하는 단계; 추출물을 극성차이에 따라 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)법으로 항균활성물질인 판두라틴 에이 및 아이소판두라틴 에이를 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 캠페리아 판두라타로부터 분리된 항균활성물질인 판두라틴 에이와 아이소판두라틴 에이를 함유하는 포자형성 식중독균인 마실러스 세레우스에 대한 살균제에 그 특징이 있다.

본 발명의 캠페리아 판두라타는 생강과(Zingiberaceae family) 식물로서, 뿌리부위는 감기, 장염, 피부질환 및 요도통증에 널리 사용되고 있다. 캠페리아 판두라타에는 피노셈브린 켈콘(pinocembrin chalcone), 카르다모닌(cardamonin), 피노셈(pinocembrin), 피노스트로빈(pinostrobin), 4-하이드로판두라틴 에이(4-hydropanduratin A), 판두라틴 에이(panduratin A) 등이 함유되어 있는데, 이러한 성분들은 항암효과를 나타내는 것으로 보고된 바 있고(참조: Trakoontivakorn, G., 등, J. Agric. Food Chem., 49, 3046-3050, 2001), 플라보노이드 계통의 디하이드로 켈콘(dihydrochalcone) 화합물들은 살충효과를 나타내는 것으로 보고되어 있다(참조: Pandji, C., 등, Phytochemistry, 34, 415-419, 1993).

이하, 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.

먼저 캠페리아 판두라타로부터 살균활성을 가지는 조추출물과 항균성 정제물질인 판두라틴 에이 및 아이소판두라틴 에이를 제조하는 방법에 대하여 설명한다.

판두라틴 에이 및 아이소판두라틴 에이는 통상의 추출 및 분리방법에 의하여 수득할 수 있는데, 먼저, 건조시킨 캠페리아 판두라타 뿌리(rhizome)를 4배 내지 5배의 추출 용매와 함께 추출장치에 넣고 이틀 동안 방치하여 추출하고 이를 농축기로 농축 및 건조하여 추출물을 얻는다. 본 발명에 있어 분리를 위한 추출 용매로는 물 또는 C₁-C₆의 유기용매를 사용할 수 있으며 바람직하게는 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 석유에테르(petroleum ether) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 메탄올 또는 헥산을 사용할 수 있다. 또한 분쇄한 캠페리아 판두라타에 상기 추출용매를 혼합할 때 시료 100 g당 추출용매 300~1,000 ml의 비로 혼합하는 것이 바람직하고, 본 발명의 항균활성을 가진 성분은 고온에서도 안정하므로 추출 시 온도조건은 상온에서 130℃까지 임의로 선택할 수 있다.

다음은 캠페리아 판두라타 조추출물로부터 항균활성을 갖는 단일물질인 판두라틴 에이 및 아이소판두라틴 에이를 분리하는 방법을 설명한다. 상기와 같이 얻어진 추출물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피법을 이용하여 극성에 따른 분획물을 얻고 분리된 특정 분획물을 다시 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)법을 통하여 판두라틴 에이 및 아이소판두라틴 에이를 분리할 수 있다. 그러나 유효성분의 추출 및 분리정제 방법은 반드시 상기한 방법에 한정되는 것은 아니다.

이와 같이 본 발명의 판두라틴 에이 및 아이소판두라틴 에이는 순수하게 분리 및 정제된 화합물의 형태로 사용될 수 있으며, 또한 이를 함유하는 추출물의 형태로도 사용될 수 있다. 예컨대, 상기 기재한 바와 같은 캠페리아 판두라타의 뿌리를 압착하여 얻은 오일의 형태로 사용될 수도 있다. 상기 추출물은 상기한 바와 같이 캠페리아 판두라타를 물 또는 C₁-C₆의 유기용매로 추출하여 얻을 수 있다.

상기의 과정에 의하여 분리 및 정제된 항균활성을 가진 단일물질을 기기분석에 의해서 구조를 확인한 결과, 캠페리아 판두라타로부터 정제된 항균활성성분은 하기 화학식 1의 구조를 가지는 판두라틴 에이와 화학식 2의 구조를 가지는 아이소판두라틴 에이이다.

상기의 과정으로 분리 및 정제된 항균활성을 가진 단일물질은 포자형성 식중독균인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 최소저해농도(MIC: Minimum Inhibitory Concentration)가 16 ㎍/ml로서 살균활성이 매우 높아 강력한 살균활성을 나타내었다(표 1참조).

이하, 본 발명을 구체적으로 실시예를 통하여 자세히 설명하기로 한다. 그러나 다음의 실시예 및 실험예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한 하기 실시 예 및 실험 예 들에서 특별히 부피%임을 명시하지 않은 %는 중량%를 나타낸다.

<실시예 1> 캠페리아 판두라타 추출물 제조

캠페리아 판두라타 식물은 이물질을 제거하고 분쇄하였다. 분쇄된 시료 100 g당 100%(V/V) 에탄올 400 mL를 가하여 상온에서 48시간 동안 교반하여 추출하였다. 이 추출물은 여과지를 이용하여 여과한 다음 용매를 완전히 제거하기 위해 감압기를 사용하여 농축한 다음 동결건조하였다.

<실시예 2> 판두라틴 에이 및 아이소판두라틴 에이의 분리 · 정제 및 구조결정

<2-1> 판두라틴 에이 및 아이소판두라틴 에이의 분리 · 정제

상기 실시예 1의 에탄올 추출물을 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 분획하였다. 에틸아세테이트 분획물(10.51 g)을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 헥산과 클로로포름과 에틸아세테이트를 15:5:1.5(v/v/v)의 비율로 혼합한 용매로 용출시켜 분획물 Ⅲ(1.51 g)과 분획물 Ⅳ(1.09 g)을 얻었다. 분획물 Ⅲ을 헥산과 에틸아세테이트 메탄올 18:2:1(v/v/v)의 비율로 혼합한 용매로 컬럼 크로마토그래피하여 분획물 Ⅲ-B를 얻었다. 이후, 분획물 Ⅲ-B를 리싸이클링 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 100% 메탄올로 용출시켜 단일물질 분획인 판두라틴 에에 Ⅲ-B-2(0.9 g)을 얻었다. 또한, 분획물 Ⅳ를 RP-18 컬럼 크로마토 그래피를 이용하여 90% 메탄올 용매로 용출시켜 분획물 Ⅳ-B를 얻었다. 이 분획물을 클로로포름과 메탄올을 10:0.2(v/v)의 비율로 혼합한 용매로 용출시켜 분획물 Ⅳ-B-2를 얻었으며, 이를 헥산과 에틸아세테이트 10:3(v/v)의 혼합 용매로 용출하여 단일물질 분획인 아이소판두라틴 에이 Ⅳ-B-2-2(0.57 g)을 얻었다. 이와 같은 분리 공정도를 도 1에 나타내었다.

<2-2> 단일물질 Ⅲ-B-2의 구조분석

상기 분리된 단일물질 Ⅲ-B-2의 구조를 결정하기 위하여 ¹H-NMR(500Mhz, CDCL₃) 스펙트럼과 ¹³C-NMR(125Mhz, CDCL₃) 스펙트럼을 측정하여 그 결과를 도 2와 도 3에 각각 나타내었다. Ⅲ-B-2 화합물의 ¹H-NMR(500Mhz, CDCL₃), ¹³C-NMR(125Mhz, CDCL₃) 스펙트럼은 26개의 탄소 시그널과 한개의 케톤(δ_C207.06) 그리고 산소와 연결되어 있는 올레핀 탄소 3개를 보여주었고(δ_C165.50 (X3)), 반면 다른 시그널은 탄소와 붙어있는 4개의 올레핀 카본(δ_C147.48, 137.62, 132.24, 106.26)과 9개의 올레핀 메틴(δ_C128.75(X2), 127.47(X2), 125.95, 124.64, 121.44, 94.6(X2))이 하나 혹은 두개 치환된 벤젠 고리와 관련됨을 나타내었다. 높은 자기장 영역에서 하나의 메톡시기(δ_C55.76)와 3개의 메틴기(δ_C54.18, 42.99, 37.47), 두개의 메틸렌기(δ_C36.29, 29.27), 그리고 3개의 메틸기(δ_C26.05, 23.16, 18.33)가 탐지 되었는데 이것은 한 쌍의 벤젠과 두 쌍의 이중 결합을 나타낸다. ¹H-NMR(500Mhz)은 단일 치환된 벤젠으로부터의 시그널{δ_C7.15 (2H, m), δ_C7.15 (2H, m), δ_C7.01 (1H, m)}과 1,2,4,6 치환된 벤젠의 시그널{δ_C5.88 (1H, m)을 보여주었다. 또한 이 스펙트럼은 δ_C3.66(3H, m)에서의 메톡시기와 {δ_C1.70(3H, br.S), δ_C1.45 (6H, s)}에서의 3개의 알릴 메틸기를 나타내었다. ¹³C-NMR 스펙트럼과 ¹H-NMR 스펙트럼의 결과를 토대로 {δ_C4.63 (1H, dd, J=4.7, 11.5 Hz), δ_C3.34 (1H, br.d, J=10.9, 10.8, 6.3 Hz), δ_C2.55 (1H, br.d, J=5.5) 그리고 δ_C2.26 (1H, br.d, J=18.1 Hz), δ_C2.17 (1H, m), δ_C2.03 (1H, m), δ_C1.97 (1H, m) 신호에 의해 3개의 메틴기와 2개의 메틸렌기가 탐지 되었다. 각각의 양자는 ¹H-¹H COSY 스펙트럼에 의해 관찰되었다. ¹H-NMR(500MHz)은 {δ7.15(2H, m), δ7.13(2H, m), δ7.01(1H, m)}에서의 신호가 단일 치환된 벤젠으로부터 나온 신호임을 보여주었고, δ5.88(2H, br. S)는 1,2,4,6번이 치환된 벤젠으로부터 나온 신호임을 보여주었다. 이 스펙트럼은 또한 δ3.66(3H s)에서 하나의 메톡시기를 나타내었고 {δ1.70(3H, br. S), δ1.45(6H, s)}에서 3개의 알릴 메틸기를 나타내었다. ¹³C-NMR와 ¹H-NMR 스펙트럼에서 3개의 메틴기와 2개의 메틸렌기가 δ4.63(1H, dd, J=4.7, 11.5 Hz), δ3.34(1H, br. ddd, J=14.0, 10.9, 6.4Hz)와 δ2.55(1H, br. d, J=5.5)와 δ2.26(1H, br. d,J=18.1Hz), δ2.17(1H, m), δ2.03(1H, m), δ1.94(1h,m)에서 신호에 의해 탐지 되었다. 각각의 전자 관계는 ¹H-¹H COSY로 측정하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. DEPT 실험에서 탄소공명을 통해 나오는 파장으로 각각의 탄소신호를 구별해 내었고 그 결과를 도 5에 나타내었다. 또한, HSQC의 스펙트럼을 통해 1-bond 탄소의 위치를 확인 하였고 그 결과를 도 6에 나타내었다.

상기 분리된 단일물질의 질량 분석을 위해 측정한 FAS/MS 스펙트럼의 결과를 도 7에 나타내었다. 본 화합물은 FAS/MS 스펙트럼(m/z, 407, M+H⁺)에서 분자량이 406로 판명되었고, 분자식은 C₂₆H₃₀O₄이었다.

이상의 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, ¹H-¹H COSY, DEPT, ¹H-¹³C HSQC 및 FAS/MS에 대한 결과와 기존에 기재된 참고문헌(Trakoontivakorn G., et al., J. Agric. Food. Chem. 49:3046-3050, 2001)을 통해, 분리된 단일 물질은 하기 화학식 1로 표시되는 판두라틴 에이(Panduratin A)인 것으로 확인되었다.

[화학식 1]

<2-3> 단일물질 IV-B-2-2의 구조분석

상기 분리된 단일물질 Ⅳ-B-2-2의 구조를 결정하기 위하여 ¹H-NMR(500Mhz, CDCL₃) 스펙트럼과 ¹³C-NMR(125Mhz, CDCL₃) 스펙트럼을 측정하여 그 결과를 도 8과 도 9에 각각 나타내었다. Ⅳ-B-2-2 화합물의 ¹H-NMR(500Mhz, CDCL₃), ¹³C-NMR(125Mhz, CDCL₃) 스펙트럼은 ¹³C-NMR (125 MHz, CD₃OD) 205.89 (s, C-7), 167.06 (s, C-6), 164.41 (s, C-4), 162.81 (s, C-2), 146.98 (s, C-1"), 136.89 (s, C-3'), 130.97 (s, C-9'), 127.68 (d, C-3", 5"), 126.74 (d, C-2", 6"), 125.00 (d, C-4"), 124.12 (d, C-8'), 120.58 (d, C-4'), 105.71 (s, C-1), 95.71 (d, C-5), 90.69 (d, C-3), 56.40 (q, OMe), 55.69 (d, C-1'), (1H, dd, J=4.5, 11.5 Hz, H-1'), 3.80 (3H, s, -OMe), 3.28 (1H, ddd, 44.23 (d, C-2'), 38.68 (d, C-6'), 37.30 (t, C-5'), 30.04 (t, C-7'), 26.06 (q, C-11'), 23.31 (q, C-12'), 18.17 (q, C-10'), ¹H-NMR (500 MHz, CD₃OD) 7.07 (2H, dd, J=7.2, 8.2 Hz, H-3", 5"), 7.05 (2H, d, J=8.2 Hz, H-2", 6"), 6.95 (1H, dd, J=7.2, 7.2 Hz, H-4"), 5.88 (1H, d, J=2.0 Hz, H-3), 5.70 (1H, d, J=2.0 Hz, H-5), 5.33 (1H, br. s, H-4'), 4.77 (1H, m, H-8'), 4.42 J=11.7, 10.5, 6.4 Hz, H-6'), 2.43 (1H, m, H-2'), 2.25 (1H, br. d, J=5.2 Hz, H-5'), 2.15 (1H, br. d, J=17.7 Hz, H-7'), 1.98 (1H, ddd, J=15.0, 7.0, 7.0 Hz, H-7'), 1.92 (1H, m, H-5'), 1.69 (3H, s, H-12'), 1.40 (6H, s, H-10', 11') ¹³C-NMR (125 MHz) 스펙트럼에서는 모두 26개의 signal 이 관측되었다. DEPT 실험에서 탄소공명을 통해 나오는 파장으로 각각의 탄소신호를 구별해 내었고 그 결과를 도 10에 나타내었다.DEPT 스펙트럼과 함께 시그널을 분석한 결과, 1개의 케톤 (δ_C 205.89)과 산소가 결합한 올레핀 4급 탄소가 3개 (δ_C 167.06, 164.41, 162.81) 확인되었다. 그 외에 탄소가 결합한 4개의 올레핀 4급탄소 (δ_C 146.98, 136.89, 130.97, 105.71)가 관측되었고, 9개의 올레핀 메틴(olefine methine) 탄소 {δ_C 127.68 (x2), 126.74 (x2), 125.00, 124.12, 120.58, 95.71, 90.69)가 관측되었는데, 그 중에 2쌍의 시그널은 중복되어 일치환 또는 파라-이치환 벤젠고리의 존재도 추정할 수 있었다. 고자장 영역에서는 1개의 메톡시 (δ_C 56.40), 3개의 메틴 (δ_C 55.69, 44.23, 38.68), 2개의 메틸렌 (δ_C 37.30, 30.04), 3개의 메틸 (δ_C 26.06, 23.31, 18.17) 탄소 시그널이 관측되었으므로, 2개의 벤젠 고리와 2쌍의 이중결합을 가진 화합물로 추정되었다.

¹H-NMR (500 MHz) 스펙트럼에서는 일치환 벤젠 고리에서 유래한 시그널 {δ7.07 (2H, dd, J=7.2, 8.2 Hz), δ7.05 (2H, d, J=8.2 Hz), δ6.95 (1H, dd, J=7.2, 7.2 Hz)} 와 1,2,4,6 사치환 벤젠 고리에서 유래한 시그널 {δ5.88 (1H, d, J=2.0 Hz), δ5.70 (1H, d, J=2.0 Hz)이 확인되었다. 또한 1개의 메톡시 (δ3.80, 3H, s)와 3개의 아릴 메틸 {δ1.69 (3H, s), δ1.40 (6H, s)}의 존재도 확인되었다. 그 외에 고자장 영역에서는 각 시그널의 적분치와 ¹³C-NMR 의 데이터를 함께 고찰한 결과 3개의 메틴 {δ4.42 (1H, dd, J=4.5, 11.5 Hz), δ3.28 (1H, ddd, J=11.7, 10.5, 6.4 Hz), δ2.43 (1H, m)} 과 2개의 메틸렌 {δ2.25 (1H, br. d, J=5.2 Hz), δ2.15 (1H, br. d, J=17.7 Hz), δ1.98 (1H, ddd, J=15.0, 7.0, 7.0 Hz), δ1.92 (1H, m)}의 존재가 확인되었다. 각 프로톤 시그널은 ¹H-¹H COSY 스펙트럼에서 각각의 상호관계를 관측하였다. 즉 H-2"에서 H-6"까지의 프로톤 시그널의 연결과, H-1' → H-6' → H-5' → H-4'의 연결, H-1'→ H-2' → H-7' → H-8' 의 연결, 그리고 H-3과 H-5의 long range coupling 도 확인할 수 있었다.

이상의 결과를 종합하고, 스펙트럼 데이터와 비교하여 이 화합물은(2-methoxy-4,6-dihydroxyphenyl)-[3'-methyl-2'-(3"-methylbut-2"-enyl)-6'-phenylcyclo-hex-3'-enyl]methanone으로 구조 결정하였고, 이미 Kaempferia pandurata Roxb.에서 분리된 판두라틴 A와 이성질체였기 때문에 아이소판두라틴 A로 명명하였다. 상기 분리된 단일물질의 질량 분석을 위해 측정한 FAS/MS 스펙트럼의 결과를 도 11에 나타내었다. 본 화합물은 FAS/MS 스펙트럼(m/z, 407, M+H⁺)에서 분자량이 406로 판명되었고, 분자식은 C₂₆H₃₀O₄이었다.

이상의 결과들을 종합하여 볼 때, 분리된 단일 물질은 하기 화학식 2로 표시되는 아이소판두라틴 에이(Isopanduratin A)임이 판명되었다.

[화학식 2]

<실험예 1> 바실러스 세레우스의 포자제조, 수집 및 확인

실험에 사용할 포자형성 식중독균인 바실러스 세레우스는 Nutrient Broth(NB, Becton, Dickinson and Company Sparks, NJ, USA)배지 1 L 당 15 g의 한천배지를 함유한 NA(Becton, Dickinson and Company Sparks, NJ, USA)플레이트에 바실러스 세레우스 KCCM 40138의 영양세포(vegetative cell)를 접종 후 pH 7.0± 0.2의 조건으로 30℃에서 1주일이상 배양시켜 영양분공급의 차단의 방법으로 바실러스 세레우스의 영양세포를 포자로 형태변화시켰다. 포자가 형성되면 0.85부피%의 멸균식염수(sterilized NaCl solution)를 각각의 아가플레이트(agar plate)에 1~2 ml씩 분주하여 스프레더(spreader)로 포자를 긁어내고 50 ml 멸균튜브(sterile tube)에 모은다. 상기 포자현탁액(spore suspension solution)은 배지성분 및 잔사(debris)를 제거하기 위하여 4℃의 원심분리기(centrifuge)에서 3000 rpm의 속도로 20분간 원심분리를 실시한다. 세척(washing)을 위하여 상기의 원심분리과정을 3회 반복 실시한다. 다음으로 5분간의 온오프(on-off) 초음파 공정(ultrasonication)을 통하여 영양세포만을 파괴시켜 다시 원심분리를 실시한다.

상기의 방법으로 제조된 바실러스 세레우스의 포자현탁액의 펠렛(pellet)을 현미경(microscope, Olympus CX31, Japan)으로 관찰하여 포자형성여부를 확인하기위하여 염색을 실시한다. 슬라이드글라스(slide glass)에 포자현탁액을 떨어뜨려 건조시킨 후 말라카이트 그린(malachite green, Sigma St. Louis, MO, USA)용액으로 10분간 염색한다. 그 후, 증류수(distilled water)로 말라카이트 그린염색용액을 세척하고, 건조시킨 후 사프라닌(safranin, Sigma St. Louis, MO, USA)염색용액으로 10분간 염색한 후 증류수로 다시 세척한다. 상기의 과정을 통하여 영양세포는 사프라닌 염색용액에 의하여 붉은색(도 12 참고)으로, 포자는 말라카이트 그린 염색용액에 의하여 푸른색(도 13 참고)으로 염색되어 현미경상에서 포자형성여부를 확인할 수 있다. 최종적으로 모아진 포자는 25 ml의 0.85부피%의 멸균식염수(sterilized NaCl solution)에 현탁시켜 분주하여 -80℃에 장기 보존한다.

<실험예 2> 최소저해농도(Minimum Inhibitory Concentration) 측정

상기 실시예 1에서 제조한 캠페리아 판두라타 추출물과 실시예 2에서 분리정제한 판두라틴 에이 및 아이소판두라틴 에이의 포자형성 식중독균인 바실러스 세레우스에 대한 살균활성을 측정하기 위하여 최소저해농도(MIC: minimum inhibitory concentration)법을 실시하였다.

실험에 사용할 상기포자형성 식중독균의 포자는 상기 실험예 1-1의 방법에 의하여 제조하여 사용하였다.

최소저해농도(MIC: minimum inhibitory concentration)법은 0.85부피%의 멸균식염수를 이용하여 실시하였다. 캠페리아 판두라타의 100부피% 에탄올 추출물, 판두라틴 에이, 아이소판두라틴 에이는 바실러스 세레우스에 대하여 아무런 영향이 없는 농도인 1부피% 디메틸술폭사이드(Dimethylsulfoxode, Duksan Pure Chemical Co.,LTD, Ansan, Korea)에 용해시켜 10⁵㎍/ml의 농도로 제조하였으며, 동일 농도의 글루타르알데하이드(glutaraldehyde, Sigma St. Louis, MO, USA)를 대조군으로서 제조하였다.

96웰 플레이트(96 well plate)에 0.85부피%의 멸균식염수액을 넣은 후 캠페리아 판두라타의 100부피% 에탄올 추출물, 판두라틴 에이, 아이소판두라틴 에이와 글루타르알데하이드를 최종농도 10³ ㎍/ml가 되도록 제조한 샘플을 1:1의 비율로 섞은 후 순차적 희석법에 의하여 희석하였다. 그 후, 포자현탁액의 접종수가 최종농도 1×10⁷ CFU/ml이 되도록 접종한 후 30℃에서 24 시간 배양하였을 때 균의 성장이 저해되는 농도를 최소저해농도 값으로 정하였다.

표 1에서 알 수 있는 바와 같이 판두라틴 에이와 아이소 판두라틴 에이의 최소저해농도(MIC: Minimum Inhibitory Concentration)가 16 ㎍/ml로서 대표적인 바실러스 세레우스의 포자에 대하여 강력한 살균활성을 나타내었다.

	최소저해농도 (㎍/㎖)	최소저해농도(㎍/㎖)	최소저해농도(㎍/㎖)	최소저해농도 (㎍/㎖)
	캠페리아 판두라타 에탄올추출물	판두라틴 에이	아이소판두라틴 에이	글루타르 알데하이드
바실러스 세레우스 포자	64	16	16	250

<실험예 3> 포자살균효과 측정

포자 현탁액에 0.85부피%의 멸균식염수(sterilized NaCl solution)와 캠페리아 판두라타의 100부피% 에탄올 추출물, 판두라틴 에이, 아이소판두라틴 에이를 첨가하여 최종 캠페리아 판두라타 추출물의 농도가 각각 10⁴, 10³, 10², 10¹, 10⁰, 10^-1, 10^-2 ㎍/ml가 되도록 만들었다. 30℃에서 4 시간동안 혼합교반한 후 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하는 과정을 통하여 잔존하는 항균물질을 제거하는 과정을 3회 반복실시 하여 천연 항균제로 처리된 포자만을 남긴다. 이러한 세척과정을 통하여 항균소재를 완전히 제거한 다음 0.85부피%의 멸균식염수를 가한다. 다음으로 순차적 희석법(serial dilution)으로 적당한 포자수를 맞춘 후 TSA(Triptic Soy Agar, Becton, Dickinson and Company Sparks, NJ, USA)플레이트에 도말하여 30℃에서 24 시간 배양하여 생균수 측정법에 의하여 콜로니(Colony) 수를 측정하여 CFU/ml로서 표시하였다.

도 14의 그래프에서 알 수 있는바와 같이, 생균수 측정법에 의해 생균수를 측정한 결과 10⁴ ㎍/ml 농도에서 캠페리아 판두라타의 에탄올 추출물은 아무처리를 하지 않은 바실러스 세레우스의 포자에 대하여 약 3로그의 저해효과는 나타내어 우수한 살균 활성을 보였으며 도 15의 그래프에서 알 수 있는 바와 같이, 생균수 측정법에 의해 생균수를 측정한 결과 10⁴ ㎍/ml 농도에서 판두라틴 에이는 바실러스 세레우스의 포자를 컨트롤에 비하여 3로그 저해시키는 효과를 나타내어 우수한 살균 활성을 보였다.

도 16의 그래프에서 알 수 있는 바와 같이, 생균수 측정법에 의해 생균수를 측정한 결과 100 ㎍/ml 농도에서 아이소판두라틴 에이의 바실러스 세레우스의 생균수는 3로그가 감소함으로서 아이소판두라틴 에이는 100 ㎍/ml의 농도에서 강력한 살균 활성을 보였다.

<실시예 4> 포자 발아 억제효과 측정

포자상태에서 영양세포로 형태가 변화한 후에는 지수적으로 증식이 일어나나기 때문에 포자의 발아를 억제하는 것이 중요하다.

TSB(Triptic Soy Broth, Becton, Dickinson and Company Sparks, NJ, USA)에 바실러스 세레우스의 포자를 접종하여 배양한 후 매 1시간별로 샘플링(sampling)하여 내생포자를 염색하여 포자와 영양세포를 구별한다. 세균의 내생포자는 염색하기 어렵지만 한번 염색되면 잘 탈색되지 않는다. 내생포자를 염색하는 방법에는 여러 가지가 알려져 있으며 오랜 시간동안 생물학적 염료를 처리하여야 하는데 이때 포자의 염색방법으로 말라카이트 그린(malachite green)을, 영양세포를 붉게 염색하기 위하여 사프라닌(safranin)을 사용하는 Bartholomew-Mittwer방법에 의하여 포자와 발아된 영양세포를 구분한다.

도 17에서 알 수 있는바와 같이 포자발아억제 실험법에 의하여 포자발아를 관찰한 결과, 아무런 샘플을 처리하지 않은 바실러스 세레우스의 포자는 4시간 만에 영양세포로 발아하여 증식하기 시작하였음에 반하여 100 ㎍/ml 농도의 판두라틴 에이와 아이소판두라틴 에이를 처리한 그룹에서는 12시간까지 포자의 발아가 저해되어 영양세포가 지수적으로 증식하는 것을 매우 강력하게 억제하였다.

이상에서 설명한 바와 같이 본 발명의 천연 약용식물인 캠페리아 판두라타( Kaempferia pandurata)로부터 분리 및 정제된 항균활성 단일물질인 판두라틴 에이(panduratin A) 및 아이소판두라틴 에이(isopanduratin A)는 포자형성 미생물의 포자에 대해서 우수한 살균활성을 제공하며, 포자의 발아를 저해하여 영양세포로 지수적인 증식을 하는 것을 억제한다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 판두라틴 에이(panduratin A)를 유효성분으로 함유하는 포자형 미생물에 대한 포자살균제.

[화학식 1]
하기 화학식 2로 표시되는 아이소판두라틴 에이(idsopanduratin A)를 유효성분으로 함유하는 포자형 미생물에 대한 포자살균제.

[화학식 2]
제 1항, 제 2항중 어느 한 항에 있어서 판두라틴 에이와 아이소판두라틴 에이 화합물이 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata)에서 추출된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항과 제 2항에 있어서, 포자형 미생물이 바실러스(Bacillus) 또는 클로스트리듐(Clostridium) 속 박테리아인 조성물.