KR20080031436A - 포유류 대상에서 그람 양성 박테리아 감염 치료를 위한조성물 및 방법 - Google Patents

포유류 대상에서 그람 양성 박테리아 감염 치료를 위한조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

포유류 대상에서 그람 양성 박테리아 감염을 치료하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 조성물 및 방법은 포유류 대상에서 그람 양성 박테리아 피부 감염을 치료하기 위해 추가로 제공된다. 조성물 및 방법은 포유류 대상에게 Scd1 유전자 발현을 활성화시키거나 Scd1 유전자 산물을 활성화시키는 유효량의 화합물을 투여하는 것을 포함하여 제공된다.

Description

포유류 대상에서 그람 양성 박테리아 감염 치료를 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING GRAM POSITIVE BACTERIAL INFECTION IN A MAMMALIAN SUBJECT}
정부 지원 진술
본 발명은 국립보건원 (National Institutes of Health) 으로부터 승인 번호 U54-AI54523 에 의해 정부 지원을 받아 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정의 권리를 갖는다.
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 본원에 그 전체 명세가 참조로서 인용된, 2005 년 7 월 20 일에 출원된 미국 가출원 60/701,216 호, 및 특급 우편 번호 EV 670672061 US 에 의해 2006 년 7 월 19 일에 출원된 미국 출원 표제 "COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING GRAM POSITIVE BACTERIAL INFECTION IN A MAMMALIAN SUBJECT" 의 이점을 주장한다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 포유류 대상에서 그람 양성 박테리아 감염 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 포유류 대상에서 그람 양성 박테리아 피부 감염 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 조성물 및 방법은 또한 포유류 대상에 Scd1 유전자 발현을 활성화하거나 Scd1 유전자 산물을 활 성화하는 유효량의 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
표면 상피는 병원체에 대항하는 첫번째 방어선을 구성한다. 상기 방어는 장벽 기능 및 특정 살균 효과기 분자 모두에 좌우된다. 예를 들어, 포유류의 피부는 고도로 가교 결합된 케라틴 층에 의해 덮여진 단단하게 연합된 세포로 구성되고, 보통 박테리아에 불투과성이기 때문에 부분적으로 물리적 보호를 제공한다. 인간에서, 상이한 수준으로 피부 상피 구조에 영향을 주는 여러 유전 질환, 예컨대 점막 상피 이형성 또는 수포성 상피박리증은, 감염되기 쉬운 것이 크게 증가된 것과 관련된다. Vidal et al, Nat Genet 10:229-34, 2995; Witkop et al, Am J Hum Genet 31:414-27, 1979. 그러나 피부는 심지어 그의 물리적 완전성이 깨지는 경우에도 살균 활성을 나타낸다. 이것은 생-활성 분자의 축적물 (arsenal) 을 함유하며, 항미생물 펩티드 (AMP) 중에서, 예컨대, 디펜신 및 카텔리시딘이 미생물 침입에 대항한 숙주 방어에 매우 중요하다 (Zasloff, Nature 415:389-95, 2002; Zasloff, N Engl J Med 347: 1199-200, 2002 에서 검토됨).
AMP 가 가장 잘 연구된 피부 방어 분자이지만, 다른 보호 시스템도 또한 존재할 수 있다. 피지선에 의해 생성된 단일불포화 지방산 (MUFA) 이 이와 관련해 언급될 수 있고, 일부 MUFA 는 살균성으로 공지되어 있다. Miller et al, Arch Dermatol 124:209-15, 1988; Wille and Kydonieus, Skin Pharmacol Appl Skin Physiol 16: 176-87, 2003. 그러나, 이들의 항미생물 방어에 대한 기여는 생체 내에서는 전혀 성립되지 않았고, 그들의 생합성이 미생물 자극에 의해 조절되기 쉬 운 것으로 알려지지 않았다. 포유류 대상에서 미생물 감염에 대하여 선천적 면역 반응을 자극하는 개선된 조성물 및 방법을 개발하기 위한 필요성이 당업계에 존재한다. 포유류 대상에서 그람 양성 박테리아 감염 및 그람 양성 박테리아 피부 감염을 치료하기 위한 개선된 조성물 및 방법을 개발하기 위한 추가적인 필요성이 존재한다.
요약
본 발명은 일반적으로 포유류 대상에서 그람 양성 박테리아 감염을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 조성물 및 방법은 포유류 대상에서 그람 양성 박테리아 피부 감염을 치료하기 위해 추가로 제공된다. 조성물 및 방법은 포유류 대상에게 스테아로일 CoA 탈포화효소 1 (stearoyl CoA desaturase: Scd1) 유전자 발현을 활성화시키거나 Scd1 유전자 산물, 스테아로일 CoA 탈포화효소를 활성화시키는 유효량의 화합물을 투여하는 것을 포함하여 제공된다.
마우스에서 선천적 면역결핍 표현형은 단일불포화 지방산 (MUFA) 합성에 필수적인 효소의 구조에 영향을 주는 돌연변이에 대해 추적되었다. C57BL/6 마우스의 ENU-유도 생식선 돌연변이유발은 C57BL/6 마우스의 열성 생식선 돌연변이인 플레이크 (Flake) (flk) 를 단리 및 확인하기 위해 사용되었다. flk 돌연변이체 마우스는 톨-유사 (Toll-like) 수용체 2 의 활성화에 의해 선천적 면역 반응을 도출하는 화농성 연쇄구균 (Streptococcus pyogenes) 및 황색 포도상구균 (Staphylococcus aureus), 그람 양성 병원체에 의한 피부 감염의 제거가 악화된다. 위치 클로닝 및 서열분석으로 flk 가 스테아로일 CoA 탈포화효소 1 유전자 (Scd1) 의 신규 대립유전자라는 것을 밝혔다.
대상에게 Scd1 유전자 발현을 활성화시키는 유효량의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 포유류 대상에서의 그람 양성 박테리아 감염의 치료 방법이 제공된다. 하나의 양상에서, 화합물은 톨-유사 수용체 2 의 작용제이다. 또다른 양상에서, 화합물은 소형 화학 분자, 항체, 안티센스 핵산, 짧은 헤어핀 RNA, 또는 짧은 간섭 RNA 이다. 그람 양성 박테리아 감염은, 예를 들어, 화농성 연쇄구균 감염 또는 황색 포도상구균 감염일 수 있다. 추가 양상에서, 방법은 Scd1 유전자 중의 기능의-손실 또는 감소된 기능 돌연변이를 갖는 대상을 치료하는 것을 포함한다.
대상에게 Scd1 유전자 산물을 활성화시키는 유효량의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 포유류 대상에서의 그람 양성 박테리아 감염의 치료 방법이 제공된다. 하나의 양상에서, 화합물은 톨-유사 수용체 2 의 작용제이다. 또다른 양상에서, 화합물은 소형 화학 분자, 항체, 안티센스 핵산, 짧은 헤어핀 RNA, 또는 짧은 간섭 RNA 이다. 그람 양성 박테리아 감염은, 예를 들어, 화농성 연쇄구균 감염 또는 황색 포도상구균 감염일 수 있다. 추가 양상에서, 방법은 Scd1 유전자에서 기능의-손실 또는 감소된 기능 돌연변이를 갖는 대상을 치료하는 것을 포함한다.
대상에게 유효량의 단일불포화 지방산을 투여하는 것을 포함하는, 포유류 대상에서의 그람 양성 박테리아 감염의 치료 방법이 제공된다. 단일불포화 지방산은, 예를 들어, 팔미트올레에이트 또는 올레에이트일 수 있다. 그람 양성 박 테리아 감염은, 예를 들어, 화농성 연쇄구균 감염 또는 황색 포도상구균 감염일 수 있다. 하나의 양상에서, 유효량의 단일불포화 지방산의 투여는 국소 또는 진피내이다. 또다른 양상에서, 유효량의 단일불포화 지방산의 투여는 근육내, 피하, 복강내, 또는 정맥내이다.
대상에게 Scd1 생합성 경로의 산물인 유효량의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 포유류 대상에서의 그람 양성 박테리아 감염의 치료 방법이 제공된다. 하나의 양상에서, 화합물은 단일불포화 지방산이다. 단일불포화 지방산은, 예를 들어, 팔미트올레에이트 또는 올레에이트일 수 있다. 그람 양성 박테리아 감염은, 예를 들어, 화농성 연쇄구균 감염 또는 황색 포도상구균 감염일 수 있다. 하나의 양상에서, 유효량의 단일불포화 지방산의 투여는 국소 또는 진피내이다. 또다른 양상에서, 유효량의 단일불포화 지방산의 투여는 근육내, 피하, 복강내, 또는 정맥내이다.
톨-유사 수용체 2 를 발현하는 세포를 포함하는 세포-기재 검정법 시스템과 시험 화합물을 접촉시키는 것, 톨-유사 수용체 2 신호는 리간드에 대한 응답성 (responsiveness) 에 신호를 주고 Scd1 유전자 발현 조정을 할 수 있는, 톨-유사 수용체 2 신호를 활성화시키기에 유효한 것으로 선택된 양으로 리간드를 검정법 시스템에 제공하는 것, 및 검정법에서 시험 화합물의 유효성은 그람 양성 살균 활성의 지표인, 톨-유사 수용체 2 신호 및 Scd1 유전자 발현 조정에 대한 시험 화합물의 효과를 검출하는 것을 포함하는, 세포에서의 그람 양성 살균 활성을 조정하는 화합물의 확인 방법이 제공된다. 하나의 양상에서, 리간드는 내인성 리간드 또 는 외인성 리간드이다. 상세한 양상에서, 외인성 리간드는 지질다당류, 지질 A, 디-아실화 리포펩티드, 트리-아실화 리포펩티드, S-MALP-2, R-MALP-2, 박테리아 리포펩티드, Pam2CSK4, 리포테이코산, 또는 지모산 A 이다. 추가 상세한 양상에서, 외인성 리간드는 MALP-2 이다. 추가 상세한 양상에서, 외인성 리간드는 거친 지질다당류, 매끈한 지질다당류, 또는 살모넬라 미네소타 (Salmonella Minnesota) 로부터의 지질 A 이다. 상세한 양상에서, 외인성 리간드는 그람 양성 박테리아의 구성성분이나, 그람 음성 박테리아의 구성성분은 아니다. 추가 상세한 양상에서, 내인성 리간드는 지질이다. 화합물은 예를 들어, 톨-유사 수용체 2 경로 신호의 작용제일 수 있다.
하나의 구현예에서, 방법은 Scd1 유전자 발현 또는 Scd1 유전자 산물은 세포와 외인성 리간드와의 접촉에 대한 반응으로 활성화되는, 세포에서 Scd1 유전자 발현 또는 Scd1 유전자 산물의 활성을 측정하는 것을 추가로 포함하는 검출 단계를 포함된다.
추가 구현예에서, 검출 단계가 화합물에 의해 톨-유사 수용체 2 에 대한 리간드의 향상된 결합을 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법이 제공된다. 검출 단계가 세포 검정법에서 증가된 Scd1 유전자 산물을 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법이 제공된다. 검출 단계가 세포 검정법에서 증가된 Scd1 유전자 산물 활성을 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법이 제공된다. 검출 단계가 세포 검정법에서 증가된 단일불포화 지방산 합성을 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법이 제공된다. 추가 양상에서, 검출 단계가 톨-유사 수용체 2 에 대한 표지된 리간 드 결합을 측정하는 것을 추가로 포함한다. 표지된 리간드는, 예를 들어, 방사능표지 또는 형광표지될 수 있다.
추가 양상에서, 세포 검정법은 예를 들어, 대식세포, 또는 피지선으로부터의 세포를 포함할 수 있다. 피지선으로부터의 세포는 피지 세포일 수 있다.
하나의 구현예에서, 방법은 톨-유사 수용체 2 를 검정법 시스템에 제공하는 것, 및 검정법에서 시험 화합물의 유효성은 조정의 지표인, 검정법 시스템에서 톨-유사 수용체 2 신호에 대한 시험 화합물의 효과를 검출하는 것을 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 검출 단계는 화합물에 의해 톨-유사 수용체 2 에 대한 리간드의 감소된 결합에 영향을 주는 것을 추가로 포함한다. 추가 구현예에서, 검출 단계는 화합물에 의해 톨-유사 수용체 2 에 대한 리간드의 증가된 결합에 영향을 주는 것을 추가로 포함한다. 추가 구현예에서, 검출 단계는 세포 검정법에서 스테아로일 CoA 탈포화효소 1 활성의 증가를 측정하는 것을 추가로 포함한다. 추가 구현예에서, 검출 단계는 세포 검정법에서 증가된 단일불포화 지방산 합성의 증가를 측정하는 것을 추가로 포함한다. 추가 구현예에서, 검출 단계는 세포 검정법에서 그람 양성 살균 활성의 증가를 측정하는 것을 추가로 포함한다.
대상으로부터 세포 또는 조직을 제거하는 것, 세포 또는 조직을 톨-유사 수용체 2 에 대한 내인성 리간드 또는 외인성 리간드와 접촉시키는 것, 리간드에 의해 접촉된 세포 또는 조직 중의 Scd1 유전자 산물의 생성을 측정하는 것, 및 포유류 대상에서 Scd1 유전자 산물의 감소된 기능 또는 기능 상실을 검출하는 것을 포함하는, 포유류 대상에서의 그람 양성 박테리아 감염에 대한 위험 인자의 진단 방 법이 제공된다. 세포 또는 조직은, 예를 들어, 대식세포, 피지, 또는 피지선으로부터의 것일 수 있다.
하나의 양상에서, 방법은 Scd1 유전자 산물의 감소된 기능 또는 부재가 그람 양성 박테리아 감염에 대한 위험을 증가시키는 것으로 제공된다. 또다른 양상에서, Scd1 유전자 산물의 감소된 기능 또는 부재가 세포에서 단일불포화 지방산의 합성을 감소시킨다. 추가 양상에서, Scd1 유전자 산물의 감소된 기능 또는 부재가 그람 양성 박테리아 감염에 대한 염증 반응을 감소시킨다. 상세한 양상에서, Scd1 유전자 산물의 감소된 기능 또는 부재가 환자에서 손상 부위에서 염증 반응을 감소시킨다. 추가 양상에서, Scd1 유전자 산물의 부재는 염증이 바람직한 방어 메카니즘인 상태에 대한 위험을 증가시킨다. 리간드는, 예를 들어, 외인성 리간드, 리포테이코산 (LTA), 디-아실화 리포펩티드, 트리-아실화 리포펩티드, S-MALP-2, 박테리아 리포펩티드, 펩티도글리칸, 만난, 비메틸화 CpG DNA, 플라겔린, 또는 단일-가닥 RNA 일 수 있다. 리간드는, 예를 들어, 내인성 리간드, 지질, 지방, 스테롤, 지단백질, 지방산, 산화 LDL, 트롬보스폰딘, 또는 β-아밀로이드일 것이다.
단백질 또는 핵산의 존재는 Scd1 유전자 기능의-손실-유도 장애 또는 그에 대한 유전적 소인의 표지인, 포유류 대상으로부터 수득된 세포 샘플, 단백질 샘플 또는 핵산 샘플 중의 돌연변이된 Scd1 단백질 또는 돌연변이된 Scd1 단백질을 코딩하는 핵산의 존재를 측정하는 것을 포함하는, 포유류 대상에서의 Scd1 유전자 기능의-손실-유도 장애 또는 그에 대한 유전적 소인의 진단 방법이 제공된다. 하나 의 양상에서, Scd1 유전자 기능의-손실-유도 장애는 그람 양성 박테리아 감염에 감염되기 쉬움이 증가된다.
하나의 구현예에서, 방법은 단백질 샘플 또는 세포 샘플을 항-Scd1 항체와 접촉시키는 것, 및 야생형 또는 돌연변이된 Scd1 단백질의 존재를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 방법의 또다른 양상에서, 검출 단계는 포유류 대상으로부터 단핵 식세포 또는 대식세포의 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석을 추가로 포함한다. 또다른 양상에서, 방법은 표지된 DNA 또는 RNA 의 검출은 샘플에서 돌연변이된 Scd1 유전자를 코딩하는 핵산 분자의 존재의 지표인, 핵산 샘플을 혼성화 조건 하에서 돌연변이된 Scd1 유전자를 코딩하는 표지된 DNA 또는 RNA 분자와 접촉시키는 것, 및 혼성화 후 표지된 DNA 또는 RNA 분자를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 추가 양상에서, 방법은 제한 효소와 접촉된 후 단편의 부재 또는 핵산의 변경된 단편의 존재는 샘플 중의 돌연변이된 Scd1 유전자를 코딩하는 핵산 분자의 존재의 표지인, 핵산 샘플을 인식 서열이 돌연변이된 Scd1 유전자 중의 돌연변이에 의해 영향을 받는 제한 효소와 접촉시키는 것, 및 제한 효소와 접촉된 후 단편의 존재 또는 부재 또는 핵산의 변경된 단편의 존재를 검출하는 것을 포함한다.
유전자도입 비-인간 동물은 이종 핵산을 포함하여 제공되고, 여기서 핵산은 Scd1 유전자의 기능의-손실 대립유전자를 포함하고, 동물은 야생형 표현형에 비해 그람 양성 박테리아 감염에 감염되기 쉬운 것을 포함하는 표현형을 나타낸다. 유전자도입 비-인간 동물 Scd1 돌연변이체 동물의 표현형은 예를 들어, 단일불포화 지방산을 합성하지 못하는 능력 또는 위축성 (hypotrophic) 피지선을 특징으로 할 수 있다. 유전자도입 비-인간 동물은 Scd1 유전자 중의 기능의-상실 대립유전자, 예를 들어, T227K 에서의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 유전자도입 비-인간 동물은 예를 들어, 마우스 또는 래트일 수 있다. 하나의 양상에서, 세포 또는 세포주는 유전자도입 비-인간 동물로부터 유래될 수 있다.
유전자도입 비-인간 동물로부터 유래될 수 있는 세포 또는 세포주를 시험 화합물과 접촉시키는 것 및, 세포에서 단일불포화 지방산 합성의 양의 증가 또는 감소, 그람 양성 박테리아 감염에 감염되기 쉬움, 또는 톨-유사 수용체 2-유도 대식세포 활성화 활성을 검출하여, 톨-유사 수용체 2-유도 대식세포 활성화 활성의 조정제로서 시험 화합물을 확인하는 것을 포함하는, 톨-유사 수용체 2-신호 활성의 조정제에 대한 시험관 내 스크리닝 방법이 제공된다. 유전자도입 비-인간 동물로부터 유래될 수 있는 세포 또는 세포주를 시험 화합물과 접촉시키는 것 및, 세포에서 단일불포화 지방산 합성의 양의 증가 또는 감소, 그람 양성 박테리아 감염에 감염되기 쉬움, 또는 톨-유사 수용체 2-유도 대식세포 활성화 활성을 검출하여, 톨-유사 수용체 2-유도 대식세포 활성화 활성의 조정제로서 시험 화합물을 확인하는 것을 포함하는, 톨-유사 수용체 2-신호 활성의 조정제에 대한 생체 내 스크리닝 방법이 제공된다.
도 1A, 1B, 1C, 및 1D 는 플레이크 돌연변이체 마우스에서 관찰된 가시적 표현형을 보여준다.
도 2A, 2B, 및 2C 는 그람 양성 박테리아에 노출된 경우, 지속적 피부 감염 이 발달하는 플레이크 돌연변이체 마우스를 보여준다.
도 3A, 3B, 및 3C 는 플레이크 돌연변이의 지도작성 (mapping) 을 보여준다.
도 4A 및 4B 는 플레이크 돌연변이의 분자 특성을 보여준다.
도 5A 및 5B 는 야생형 및 플레이크 돌연변이체 마우스 중의 지질 함량의 박층 크로마토그래피 분석을 보여준다.
도 6A, 6B, 6C, 6D, 6E, 및 6F 는 팔미트올레산이 생체 내 항박테리아 활성을 갖는다는 것을 보여준다.
도 7A, 7B, 7C 및 7D 는 마우스 중의 Scd1 유전자 발현의 감염- 및 TLR2-의존성 유도를 보여준다.
도 8A, 8B, 8C 및 8D 는 MALP-2 로 자극받은 인간 피지세포가 염증 반응 및 SCD1 및 FADS2 유전자의 상향 조절을 나타낸다는 것을 보여준다.
도 9 는 SCD1 생합성 경로에 의한 불포화 지방산의 생합성을 보여준다.
본 발명은 일반적으로 포유류 대상에서 그람 양성 박테리아 감염을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 조성물 및 방법은 포유류 대상에서 그람 양성 박테리아 피부 감염을 치료하기 위해 추가로 제공된다. 조성물 및 방법은 포유류 대상에게 스테아로일 CoA 탈포화효소 1 (Scd1) 유전자 발현을 활성화시키는 또는 Scd1 유전자 산물, 스테아로일 CoA 탈포화효소를 활성화시키는 유효량의 화합물을 투여하는 것을 포함하여 제공된다. 포유류 대상에서 그람 양성 박테리아 감염의 치료 방법은 대상에게 단일불포화 지방산인 유효량의 화합물을 투여하는 것을 포함하여 제공된다.
C57BL/6 마우스의 ENU-유도 열성 생식선 돌연변이인 플레이크 (Flake) (flk) 는 톨-유사 수용체 2 (TLR2) 의 활성화에 의해 선천적 면역 반응을 도출하는 화농성 연쇄구균 및 황색 포도상구균, 그람 양성 병원체에 의한 피부 감염의 제거가 악화된다. 위치 클로닝 및 서열분석으로 flk 가 스테아로일 CoA 탈포화효소 1 유전자 (Scd1) 의 신규 대립유전자라는 것을 밝혔다. 플레이크 동질접합체는 단일불포화 지방산 (MUFA) 팔미트올레에이트 (C16:1) 및 올레에이트 (C18:1) (상기 모두는 그람-양성 (그러나 그람-음성은 아님) 유기체에 대항하여 살균성이다) 를 합성하는 것이 불가능하다. S. aureus-감염된 마우스에의 진피내 MUFA 투여는 박테리아 제거를 향상시킨다. 정상 마우스에서, Scd1 - 그의 프로모터에 다수의 NF-κB 요소를 가진 유전자 - 의 전사는 TLR2 신호에 의해 강하고 특이적으로 유도된다. 유사하게는, Scd1 유전자는 인간 피지세포에서 TLR2 신호에 의해 유도된다. 상기 관찰들은 포유동물 중에 조절된, 지질-기재 항미생물 효과기 경로의 존재를 밝히고, 그람-양성 박테리아 감염의 치료 또는 예방에 대한 신규한 접근법을 제시한다.
"환자", "대상", "척추동물" 또는 "포유동물" 은 상호교환적으로 사용되며, 포유동물, 예컨대 인간 환자 및 비-인간 영장류뿐 아니라, 실험 동물, 예컨대 토끼, 래트, 및 마우스, 및 기타 동물을 말한다. 동물에는 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예컨대 양, 개, 소, 닭, 양서류, 및 파충류가 포함된다.
"치료하기" 또는 "치료" 에는 증상, 합병증, 또는 질환의 생화학적 징후 (indicia) 의 발병을 예방 또는 지연시키기 위한 본 발명의 항체 조성물, 화합물 또는 작용제의 투여, 증상을 경감시키거나, 질환, 상태, 또는 장애 (예, 암, 또는 전이 암) 의 추가 발달을 저지 또는 억제시키는 것이 포함된다. 치료는 예방적 (질환의 발병을 예방 또는 지연시키기 위해, 또는 그의 임상적 또는 준임상적 증상의 소견을 예방하기 위해) 또는 질환의 소견 후 증상의 치료적 억제 또는 경감일 수 있다.
세포 내의 톨-유사 수용체의 "억제제", "활성제" 및 "조정제" 는 톨-유사 수용체 결합 또는 신호에 대한 시험관 내 및 생체 내 검정법을 사용하여 확인된 억제, 활성화 또는 조정 분자, 각각, 예를 들어, 리간드, 작용제, 길항제, 및 그의 동종체 및 유사체를 말하기 위해 사용된다.
"조정제" 에는 억제제 및 활성제가 포함된다. 억제제는, 예를 들어, 결합하여, 톨-유사 수용체의 활성을, 자극을 부분적으로 또는 완전히 차단시키고, 감소시키고, 방지하고, 활성화를 지연시키고, 비활성화시키고, 탈감작시키거나 하향 조절하는 작용제, 예를 들어, 길항제이다. 활성제는, 예를 들어, 결합하여, 톨-유사 수용체의 활성을 자극하고, 증가시키고, 열고, 활성화시키고, 이용하고 활성화를 향상시키고 감작시키거나 상향조절하는 작용제, 예를 들어, 작동제이다. 조정제에는 예를 들어, 톨-유사 수용체의, 단백질, 펩티드, 지질, 탄수화물, 다당류, 또는 상기의 조합, 예를 들어, 지단백질, 당단백질, 등을 포함하는 활성제 또는 억제제, 수용체에 결합하는 단백질과의 상호작용을 변경시키는 작용제가 포함된다. 조정제에는 예를 들어, 변경된 활성을 가진 자연 발생적 톨-유사 수용체 리간드의 유전적으로 변형된 변이체 뿐 아니라, 자연 발생적 및 합성 리간드, 길항제, 작용제, 소형 화학 분자 등이 포함된다. 억제제 및 활성제에 대한 "세포-기재 검정법" 에는 예를 들어, 본원에서 기재된 바와 같이 추정 조정제 화합물을 톨-유사 수용체를 발현하는 세포에 적용한 다음, 톨-유사 수용체 신호에 대한 기능적 효과를 측정하는 것이 포함된다. "세포-기재 검정법" 에는 억제 범위를 시험하기 위해, 잠재적 활성제, 억제제, 또는 조정제로 처리된 포유류 대상으로부터의 생체 내 조직 또는 세포 샘플 또는 톨-유사 수용체를 포함하는 시험관 내 세포-기재 검정법을, 억제제, 활성제, 또는 조정제가 없는 대조 샘플과 비교하는 것이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 대조 샘플 (억제제로 처리되지 않음) 에는 100% 의 상대적 톨-유사 수용체 활성 값을 할당할 수 있다. 톨-유사 수용체의 억제는 톨-유사 수용체 활성 값이 대조군에 비해 약 80%, 임의로 50% 또는 25-0% 인 경우 달성된다. 톨-유사 수용체의 활성화는 톨-유사 수용체 활성 값이 대조군에 비해 110%, 임의로 150%, 임의로 200-500%, 또는 1000-3000% 초과인 경우 달성된다.
톨-유사 수용체에 결합하기 위한 분자의 능력은, 예를 들어, 검정법 플레이트 상에 코팅된 톨-유사 수용체 면역부착소에 결합하기 위한 추정 리간드의 능력에 의해 측정될 수 있다. 결합 특이성은 비-톨-유사 수용체에 대한 결합을 비교하여 측정할 수 있다.
"시험 화합물" 은 Scd1 또는 톨-유사 수용체 2 의 조정제로서 시험된 임의의 화합물을 말한다. 시험 화합물은 임의의 소형 유기 분자, 또는 생물학적 실재물 (entity), 예컨대 단백질, 예를 들어, 항체 또는 펩티드, 당, 핵산, 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드, RNAi, 또는 리보자임, 또는 지질일 수 있다. 대안적으로는, 시험 화합물은 Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질의 유전적으로 변형된 변이체인 조정제일 수 있다. 전형적으로는, 시험 화합물은 소형 유기 분자, 펩티드, 지질, 또는 지질 유사체일 것이다.
하나의 구현예에서, 톨-유사 수용체에 대한 항체 결합은 리간드 또는 수용체를 고정하여 검정할 수 있다. 예를 들어, 검정에는 Ni-활성화 NTA 수지 비이드 (bead) 상에 His 태그에 융합된 톨-유사 수용체의 고정화가 포함될 수 있다. 항체는 적합한 완충액에 첨가될 수 있고, 비드는 제시된 온도에서 시간 동안 인큐베이션된다. 미결합 물질을 제거하기 위한 세척 후, 결합된 단백질은 예를 들어, SDS, 고 pH 의 완충액, 등으로 방출시키고 분석할 수 있다.
"신호 응답성" 은 톨-유사 수용체, 예를 들어, 톨-유사 수용체 2 를 통한 신호를 말한다. 신호 응답성은 예를 들어, 신호가 전달되는 것을 통해, 톨-유사 수용체 2 (TLR2) 및 Scd1 에 의해 형성된 막-걸침 복합체에 의존하는 LPS 반응을 말할 수 있다. TLR2 는 MALP2 유도 및 증가된 Scd1 발현을 통해 직접 또는 간접적으로 신호를 보낸다. TLR2 신호는, 예를 들어, 대식세포 또는 피지선 세포에서 발생할 수 있다. 세포-기재 검정법에서 측정을 위한 신호 발생 화합물은, 예를 들어, 효소 또는 형광발색단과의 공액에 의해 발생할 수 있다. 표지로서 관심의 효소는 첫째로 히드로라제, 특히 포스파타제, 에스테라제 및 글리코시다제, 또는 옥시다제, 특히 페록시다제일 것이다. 형광 화합물에는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론 등이 포함된다. 화학발광 화합물에는 루시페린, 및 2,3-디히드로프탈라진디온, 예를 들어, 루미놀이 포함된다.
"톨-유사 수용체 2 신호에 대한 시험 화합물의 효과 검출" 은 포유류 대상에서의 치료적 또는 예방적 효과, 예컨대 대상에서의 질환, 질환의 증상, 또는 질환의 부작용의 감소, 제거 또는 예방을 말할 수 있다. "톨-유사 수용체 2 신호에 대한 시험 화합물의 효과 검출" 은 세포-기재 검정법, 예를 들어, TLR2 신호의 MALP2 자극 및 Scd1 유전자 발현의 상향조절에 의해 측정된 바와 같은 진단 검정법에 효과가 있는 화합물을 말할 수 있다. Scd1 유전자에서 기능의-손실 돌연변이, 예를 들어, 플레이크 돌연변이는, 화농성 연쇄구균 및 황색 포도상구균, 톨-유사 수용체 2 의 활성화에 의한 선천적 면역 반응을 도출하는 그람-양성 병원체에 의한 피부 감염의 제거를 악화시킨다. 플레이크 동질접합체는 단일불포화 지방산 (MUFA) 팔미트올레에이트 (C16:1) 및 올레에이트 (C18:1) (상기 모두는 그람-양성 (그러나 그람-음성은 아님) 유기체에 대항하여 살균성이다) 를 합성하는 것이 불가능하다. S. aureus-감염된 마우스에의 진피내 MUFA 투여는 박테리아 제거를 향상시킨다.
본 발명이 물론 다양할 수 있는 특정 방법, 시약, 화합물, 조성물 또는 생물학적 시스템에 제한되지 않는다는 것으로 이해된다. 또한 본원에 사용된 용어는 특정 구현예만을 기재할 목적의 것이고, 제한하려는 의도가 아닌 것으로 이해된다. 본 명세서 및 청구의 범위에서 사용된 바와 같은, 단수형 "a", "an" 및 "the" 에는 내용이 명백하게 다르게 지시되지 않는다면 복수형 언급이 포함된다. 그러므로, 예를 들어, "세포" 에 대한 언급에는 2 이상의 세포의 조합 등이 포함된다.
양, 기간 등과 같은 측정가능한 값을 언급하는 경우 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "약" 은 변화량이 기재된 방법을 수행하기에 적합하다면 구체화된 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 더욱 바람직하게는 ±5%, 심지어 더욱 바람직하게는 ±1%, 더욱 더 바람직하게는 ±0.1% 의 변화량을 포함하는 것을 의미한다.
다르게 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 가진다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명을 시험하기 위한 실시에 사용될 수 있긴 하지만, 바람직한 물질 및 방법이 본원에 기재된다. 본 발명을 기재하고 청구하는데, 하기 용어가 사용될 것이다.
SCD1 유전자 발현 또는 Scd1 유전자 산물 또는 톨-유사 수용체 2 의 조정제로서의 항체
본원에 기재된 항체 및 그의 항원-결합 단편은 특이적으로 톨-유사 수용체 2 (TLR2) 에 결합하고/하거나 이를 활성화시키거나, 특이적으로 Scd1 유전자 발현 또는 Scd1 유전자 산물에 결합하고/하거나 이를 활성화시키고, 포유류 대상에서 그람 양성 박테리아 감염에 대한 선천적 면역 반응을 조정하거나 활성화시킬 수 있다.
TLR2 에 결합하는 항체 또는 Scd1 유전자 산물에 결합하는 항체는 톨-유사 수용체 2 경로를 통해 세포에서 신호를 조절하는 화합물로서 유용하다. 예를 들어, Takeda and Akira, Cell Microbiol 5: 143-153, 2003 를 참조한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 항체에 의해 선택적으로 결합된 항원에 선택적으로 결합한다 (예, 경쟁적으로 결합하거나, 동일한 에피토프, 예를 들어, 형태 또는 선형 에피토프에 결합함). 그러므로, 에피토프는 항체에 의해 결합된 공지된 에피토프에 공간적으로 또는 기능적으로 관련된, 가까운 접근성에 있을 수 있다 (예를 들어, 선형 서열 또는 형태 공간 중의 겹쳐진 또는 인접 에피토프). 잠재 에피토프는 펩티드 쓰레딩 (threading) 프로그램을 사용하여 계산하여 확인하고, 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어, 톨-유사 수용체 2 또는 Scd1 유전자 산물의 돌연변이체 또는 단편, 예를 들어, 톨-유사 수용체 2 또는 Scd1 유전자 산물의 도메인의 돌연변이체 또는 단편에 대한 항체의 결합을 검정하여 입증할 수 있다.
본원에 기재된 항체의 서열 측정 방법은 당업계에 공지되어 있다; 예를 들어, 항체의 서열은 하이브리도마 세포주로부터 항체를 코딩하는 cDNA 를 단리 및 확인하기 위해 공지된 기술을 사용하여 측정할 수 있다. cDNA 의 서열 측정 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본원에 기재된 항체는 전형적으로는 적어도 1 개 또는 2 개의 중쇄 가변 영역 (VH), 및 적어도 1 개 또는 2 개의 경쇄 가변 영역 (VL) 을 갖는다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역 (CDR) 으로 불리는 과가변성의 영역으로 추가로 더 나뉘어질 수 있으며, 이것은 더욱 고도로 보존된 골격 영역 (FR) 으로 산재된다. 상기 영역은 정확하게 정의되어 있다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991 and Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987 참조). 하나 이상의 골격 영역을 함유하는 항체 또는 항체 단편은 또한 본 발명에 유용하다. 이러한 단편은 톨-유사 수용체 2 의 도메인에 특이적으로 결합하고 지질다당류에 의해 유도된 세포 내의 Scd1 유전자 산물 활성을 조정 또는 활성화하거나, 그람 양성 박테리아에 대한 선천적 면역 반응을 조정 또는 활성화시키기 위한 능력을 가진다.
본원에 기재된 항체에는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역 (불변 영역은 전형적으로는 면역계의 효과기 세포 및 고전적 보체계의 첫번째 성분 (C1q) 을 포함하는, 항체 및 숙주 조직 또는 인자 사이의 결합을 매개한다) 이 포함될 수 있고, 그러므로 각각 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 형성할 수 있다. 예를 들어, 항체는 4량체 (예를 들어, 디술피드 결합에 의해 연결될 수 있는 면역글로불린 2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄) 일 수 있다. 항체는 중쇄 불변 영역의 부분 (예, CH1, CH2, 및 CH3 이라고 부르는 중쇄 도메인 3 개 도메인 중 하나), 또는 경쇄 불변 영역의 부분 (예, CL 이라고 부르는 영역의 부분) 만을 함유할 수 있다.
항원-결합 단편이 또한 본 발명에 포함된다. 이러한 단편은 하기일 수 있다: (i) Fab 단편 (즉, VL, VH, CL, 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편); (ii) F(ab')2 단편 (즉, 경첩 영역에서 디술피드 결합에 의해 연결된 2 개의 Fab 단편을 함유하는 2가 단편); (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 분지의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진, dAb 단편 (Ward et al, Nature 341: 544-546, 1989); 및/또는 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR).
항체의 단편 (상기 기재된 바와 같은 항원-결합 단편을 포함함) 은 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 예컨대 자동화 펩티드 합성기에서, 또는 전장 유전자 또는 유전자 단편의 발현에 의해 합성할 수 있고, 예를 들어, Scd1 유전자 산물 F(ab')2 단편은 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생성될 수 있고, Fab 단편은 F(ab')2 단편의 디술피드 연결을 감소시켜 발생될 수 있다. 대안적으로는, Fab 발현 라이브러리는 바람직한 특이성을 가진 단일클론 Fab 단편의 비교적 빠른 확인을 가능하게 하기 위해 건설될 수 있다 (Huse et al, Science 246: 1275-81, 1989).
기타 항체 및 항체 단편 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Fv 단편, VL 및 VH 의 2 개의 도메인이 별도의 유전자에 의해 코딩되더라도, 이들은 VL 및 VH 영역이 1가 분자를 형성하기 위해 짝을 이루는 단일 단백질 사슬로서 만들 수 있게 하는 재조합 방법 또는 합성 연결자를 사용하여 연결될 수 있다 (단일 쇄 Fv (scFv) 로서 공지됨; 예를 들어, Bird et al., Science 242: 423-426, 1988; Huston et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883, 1988; Colcher et al, Ann. NY Acad. Sci. 880: 263-80, 1999; and Reiter, Clin. Cancer Res. 2: 245-52, 1996 참조).
단일 쇄 항체의 제조를 위한 기술은 또한 미국 특허 번호 제 4,946,778 호 및 제 4,704,692 호에 기재된다. 이러한 단일 쇄 항체는 항체의 "항원-결합 단편" 용어 내에 포함된다. 상기 항체 단편은 당업자들에게 공지된 통상의 기술을 사용하여 수득되고, 단편은 손상되지 않은 항체가 스크리닝되는 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. 게다가, 단일 쇄 항체는 복합체 또는 다합체를 형성할 수 있으므로, 동일한 표적 단백질의 상이한 에피토프에 대한 특이성을 갖는 다가 (multivalent) 항체가 될 수 있다.
본원에 기재된 항체 및 그의 부분은 단일클론 항체로부터 발생된 단일클론 항체일 수 있거나, 당업계에 공지된 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 항체는 재조합으로 제조될 수 있다 (예, 예를 들어 하기에 기재된 바와 같은, 파지 디스플레이에 의해 또는 조합 방법에 의해 제조됨: 미국 특허 제 5,223,409 호; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02809; Fuchs et al, Bio/Technology 9: 1370-1372, 1991; Hay et al, Human Antibody Hybridomas 3: 81-85, 1992; Huse et al, Science 246: 1275-1281, 1989; Griffiths et al, EMBO J. 12: 725-734, 1993; Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226: 889-896, 1992; Clackson et al, Nature 352: 624-628, 1991; Gram et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580, 1992; Garrad et al, Bio/Technology 9: 1373-1377, 1991; Hoogenboom et al, Nucl Acids Res. 19: 4133-4137, 1991; and Barbas et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982, 1991).
한 예로서, 톨-유사 수용체 2 에 대한 항체 또는 Scd1 유전자 산물에 대한 항체를 동물을 TLR2 폴리펩티드 또는 Scd1 폴리펩티드, 또는 단편 (예, 그의 TLR24 또는 Scd1 유전자 산물 (즉, 그의 부분의 서열을 갖는) 로부터 유래된 항원성 펩티드 단편), 또는 TLR2 항원 또는 Scd1 항원 또는 그의 항원성 단편을 발현하는 세포로 면역화하여 제조할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 정제된 TLR2 또는 Scd1 유전자 산물에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 조직 섹션, 전체 세포 (살아있는, 용리된 또는 분획화된), 또는 막 분획 중의 TLR2 또는 Scd1 유전자 산물에 결합할 수 있다. 항체는 예를 들어, 시험관 내 시스템에서, 예컨대 대식세포의 MALP-2 활성화에 의한 Scd1 유전자 발현 또는 Scd1 단백질 활성의 조정, 활성화 또는 억제를 측정하여 시험할 수 있다.
TLR2 또는 Scd1 유전자 산물로부터 유래된 항원성 펩티드가 사용되는 경우에서, 이에는 전형적으로는 TLR2 또는 Scd1 유전자 산물의 도메인의 8 개 이상의 (예, 10, 15, 20, 30, 50, 100 이상) 연속적 아미노산 잔기가 포함될 것이다. 일부 구현예에서, 항원성 펩티드는 TLR2 또는 Scd1 유전자 산물의 모든 도메인을 포함할 것이다. 발생된 항체는 이들의 본래 형태 (그러므로, 선형 또는 형태 에피토프를 갖는 항체는 본 발명 내에 있다), 변성된 또는 그렇지 않으면 비-본래 형태 또는 둘 다의 단백질 중 하나에 특이적으로 결합할 수 있다. 항원성일 것 같은 펩티드는 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 컴퓨터-기재 항원성-예측 알고리즘에 의해 확인될 수 있다. 형태 에피토프는 종종 그의 변성된 형태가 아닌, 본래 형태의 단백질에 결합하는 항체를 확인하여 확인할 수 있다.
숙주 동물 (예, 토끼, 마우스, 기니아 피그 또는 래트) 은 항원, 임의로 담체 (즉, 관련 분자의 면역원성을 안정화 또는 그렇지 않으면 개선시키는 물질) 에 연결되고, 임의로 항원보강제와 함께 투여된 (예를 들어, Ausubel et al, supra 참조) 항원으로 면역화될 수 있다. 예시적 담체는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 및 예시적 항원보강제이고, 이것은 전형적으로는 숙주 동물의 종의 관점에서 선택될 것이고, 프로인트 (Freund's) 항원보강제 (완전 또는 불완전), 항원보강제 무기물 젤 (예, 알루미늄 히드록시드), 계면 활성 성분, 예컨대 리소레시틴, 플루로닉 (pluronic) 폴리올, 다가음이온, 펩티드, 오일 에멀션, 디니트로페놀, BCG (bacille Calmette-Guerin), 및 코리네박테리움 파르붐 (Corynebacterium parvum) 이 포함된다. KLH 는 또한 종종 항원보강제로서 언급된다. 숙주에서 발생된 항체는 예를 들어, 폴리펩티드 항원 또는 그의 단편이 수지 상에 고정되어 있는 친화 크로마토그래피 방법에 의해 정제될 수 있다.
항원성 펩티드에 의해 포위되는 에피토프는 전형적으로는 단백질의 표면 (예, 친수성 영역 중) 상에, 또는 고도로 항원성인 영역 (이러한 영역은 많은 전하 잔기를 함유하는 덕분에, 처음으로 선택될 수 있다) 에 위치할 것이다. 인간 단백질 서열의 에미니 (Emini) 표면 확률 분석은 단백질의 표면에 위치되는 특히 높은 확률을 가진 영역을 표시하기 위해 사용될 수 있다.
항체는 완전한 인간 항체 (예, 인간 면역글로불린 서열, 예컨대 인간 면역글로불린 유전자 (카파, 람다, 알파 (IgA1 및 IgA2), 감마 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자 또는 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자) 의 것으로부터 항체를 제조하기 위해 유전적으로 조작된 마우스 또는 기타 포유동물에서 만들어진 항체) 일 수 있다. 대안적으로는, 항체는 비-인간 항체 (예, 설치류 (예, 마우스 또는 래트), 염소, 토끼 또는 비-인간 영장류 (예, 원숭이) 항체) 일 수 있다.
인간 단일클론 항체는 마우스의 것 대신 인간 면역글로불린 유전자를 갖는 유전자도입 마우스에서 발생될 수 있다. 상기 마우스로부터 수득된 비장세포 (관심의 항원으로 면역화된 후) 를 사용하여 인간 단백질로부터의 에피토프에 특이적인 친화성을 갖는 인간 mAb 를 분비하는 하이브리도마를 제조하기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, WO 91/00906, WO 91/10741; WO 92/03918; WO 92/03917; Lonberg et al, Nature 368: 856-859, 1994; Green et al, Nature Genet. 7: 13-21, 1994; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855, 1994; Bruggeman et al, Immunol. 7: 33-40, 1993; Tuaillon et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3720-3724, 1993; and Bruggeman et al, Eur. J. Immunol. 21: 1323-1326, 1991 참조).
항-TLR2 항체 또는 항-Scd1 항체는 또한 가변 영역, 또는 그의 부분 (예, CDR) 이 비-인간 유기체 (예, 래트 또는 마우스) 에서 발생되는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명에는 키메라성, CDR-이식된, 인간화 항체 및 인간에서 항원성을 감소시키기 위해 비-인간 유기체에서 발생된 다음 변형되는 (예를 들어, 가변 골격 또는 불변 영역에서) 항체가 포함된다. 키메라 항체 (즉, 상이한 부분이 상이한 동물 종 (예, 쥣과 mAb 의 가변 영역 및 인간 면역글로불린의 불변 영역) 으로부터 유도되는 항체) 가 당업계에 공지된 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 쥣과 (또는 기타 종) 단일클론 항체 분자의 Fc 불변 영역을 코딩하는 유전자는 쥣과 Fc 를 코딩하는 영역을 제거하기 위해 제한 효소로 소화될 수 있고, 인간 Fc 불변 영역을 코딩하는 유전자의 동등한 부분은 그러므로 치환될 수 있다 (예를 들어, 유럽 특허 출원 번호 125,023 호; 제 184,187 호; 제 171,496 호; 및 제 173,494 호; 또한 WO 86/01533; 미국 특허 제 4,816,567 호; Better et al, Science 240: 1041-1043, 1988; Liu et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443, 1987; Liu et al, J. Immunol. 139: 3521-3526, 1987; Sun et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218, 1987; Nishimura et al., Cancer Res. 47: 999-1005, 1987; Wood et al., Nature 314: 446-449, 1985; Shaw et al., J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559, 1988; Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851, 1984; Neuberger et al., Nature 312: 604, 1984; and Takeda et al., Nature 314: 452, 1984 참조).
인간화 또는 CDR-이식된 항체에서, 수용자 CDR (면역글로불린 중쇄 및 또는 경쇄의) 중 1 개 또는 2 개 이상, 그러나 일반적으로 3 개 모두는 증여자 CDR 로 대체될 것이다 (예를 들어, 미국 특허 제 5,225,539 호; Jones et al., Nature 321: 552-525, 1986; Verhoeyan et al., Science 239: 1534, 1988; and Beidler et al., J. Immunol. 141: 4053-4060, 1988 참조). 톨-유사 수용체 2, Scd1 유전자, 또는 Scd1 유전자 산물에 대한 인간화 항체의 결합에 필요한 CDR 의 수만 변경하는 것이 필요하다. 증여자는 설치류 항체일 수 있고, 수용자는 인간 골격 또는 인간 일치 골격일 수 있다. 전형적으로는, CDR 을 제공하는 면역글로불린은 "증여자" 로 불리고, (그리고 종종 설치류의 것이다), 골격을 제공하는 면역글로불린은 "수용자" 라고 불린다. 수용자 골격은 자연 발생적 (예, 인간) 골격, 일치 골격 또는 서열, 또는 그와 85% 이상 (예, 90%, 95%, 99%) 일치하는 서열일 수 있다. "일치 서열" 은 관련 서열의 패밀리에서 가장 자주 발생하는 아미노산 (또는 뉴클레오티드) 로부터 형성된 것이다 (예를 들어, Winnaker, From Genes to Clones, Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1987 참조). 일치 서열 중의 각각의 위치는 패밀리 중의 위치에서 가장 자주 발생하는 아미노산 잔기에 의해 점유된다 (여기서 두 가지는 동일하게 자주 발생하고, 둘 다가 포함될 수 있다). "일치 골격" 은 일치 면역글로불린 서열 중의 골격 영역을 말한다. 톨-유사 수용체 2, Scd1 유전자, 또는 Scd1 유전자 산물에 대한 인간화 항체는 특이적 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 첨가되어 (예를 들어, 항원 결합을 개선하기 위해 골격 영역에서) 제조될 수 있다. 예를 들어, 인간화 항체는 증여자의 것들 또는 수용자 골격 잔기의 것들 외의 수용체 아미노산의 것과 동일한 골격 잔기를 가질 것이다. 이러한 항체를 발생시키기 위해, 선택된, 인간화 면역글로불린 사슬의 소수의 수용자 골격 잔기를 상응하는 증여자 아미노산으로 대체하였다. 치환은 CDR 과 인접하여 또는 CDR 과 상호작용하는 영역에서 발생할 수 있다 (미국 특허 제 5,585,089 호, 특히 12-16 열 참조). 다른 항체 인간화 기술은 EP 519596 A1 에 기재되어 있다.
톨-유사 수용체 2 에 대한 항체 또는 Scd1 유전자 산물에 대한 항체는 상기 기재된 바와 같이 또는 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 인간화될 수 있다. 예를 들어, 인간화 항체는 인간 Fv 가변 영역과 동등한 서열과 결합하는 항원에 직접적으로 관여되지 않은 Fv 가변 영역의 대체 서열에 의해 발생될 수 있다. 인간화 항체의 일반적인 발생 방법은 Morrison, Science 229: 1202-1207, 1985; Oi et al, BioTechniques 4: 214, 1986, 및 Queen et al. (미국 특허 제 5,585,089 호; 제 5,693,761 호, 및 제 5,693,762 호) 에 의해 제공된다. 상기 방법에 의해 필요한 핵산 서열은 바람직한 특성, 예컨대 MALP-2 활성화에 의한 대식세포 중의 Scd1 유전자 발현 또는 Scd1 단백질 활성의 조정, 활성화 또는 억제를 측정하기 위한 능력을 갖는 TLR2 또는 Scd1 또는 그의 단편에 대항하는 항체를 생성하는 하이브리도마로부터 수득될 수 있다. 그 다음 인간화 항체, 또는 그의 단편을 코딩하는 재조합 DNA 는 적합한 발현 벡터 내에 클로닝될 수 있다.
특정 구현예에서, 항체는 효과기 기능을 가지고, 보체를 고정할 수 있으나, 다른 것에서 이것은 효과기 세포를 모집하거나 보체를 고정할 수도 없다. 항체는 또한 Fc 수용체에 결합할 수 있는 능력이 거의 또는 아주 없을 수 있다. 예를 들어, 이것은 동종형 또는 아형, 또는 Fc 수용체에 결합할 수 없는 단편 또는 다른 돌연변이체 (예를 들어, 항체는 돌연변이체 (예를 들어, 결손된) Fc 수용체 결합 영역을 가질 수 있다) 일 수 있다. Fc 영역이 결여된 항체는 전형적으로는 보체를 고정할 수 없으므로, 이들이 결합하는 세포의 사멸을 일으키지 못할 것 같다.
다른 구현예에서, 항체는 이종 물질, 예컨대 치료제 (예를 들어, 항생제), 또는 검출가능한 표지에 커플링될 수 있다. 검출가능한 표지에는 효소 (예를 들어, 호스래디쉬 페록시다제, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제), 보결군 (예를 들어, 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴), 또는 형광, 발광, 생물발광, 또는 방사능 물질 (예를 들어, 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린 (이것은 형광이다), 루미놀 (이것은 발광이다), 루시페라아제, 루시페린, 및 애큐오린 (이것은 생물발광이다), 및 99mTc, 188Re, 111In, 125I, 131I, 35S 또는 3H (이것은 방사능이다)) 이 포함될 수 있다.
본원에 기재된 항체 (예, 단일클론 항체) 는 또한 톨-유사 수용체 2 또는 Scd1 단백질 또는 그의 단편, 예컨대 대식세포의 MALP-2 활성화에 의한 (예를 들어, 친화 크로마토그래피 또는 면역침강에 의한) Scd1 유전자 발현 또는 Scd1 단백질 활성의 조정, 활성화 또는 억제와 관련된 단편을 단리하기 위해, 또는 예를 들어, 세포 용해물 또는 상청액 (웨스턴 블롯팅 (Western blotting), 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA), 방사능면역 검정법, 등에 의해) 또는 조직학적 섹션에서 이들을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법은 특정 단백질의 발현 존재도 및 패턴의 측정을 허용한다. 상기 정보는 진단을 하거나 임상 시험 또는 치료의 효과를 평가하는데 유용할 수 있다.
본 발명에는 또한 상기 기재된 항체 및 이들 (예, 톨-유사 수용체 2 또는 Scd1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 핵산으로 형질전환된 세포) 을 함유하는 벡터 및 세포 (예, 포유류 세포, 예컨대 CHO 세포 또는 림프 세포) 를 코딩하는 핵산이 포함된다. 유사하게는, 본 발명에는 본 발명의 항체를 제조하는 세포주 (예, 하이브리도마) 및 상기 세포주의 제조 방법이 포함된다.
Scd1 폴리펩티드 또는 톨-유사 수용체 2 폴리펩티드 및 그의 조정제의 면역학적 검출
핵산 혼성화 기술을 사용하는 Scd1 유전자 또는 톨-유사 수용체 2 유전자 및 유전자 발현의 검출 외에, Scd1 또는 톨-유사 수용체 2 단백질을 검출하기 위해 면역검정법을 사용할 수 있다. 이러한 검정법은 Scd1 또는 톨-유사 수용체 2 의 조정제에 대한 스크리닝 뿐 아니라, 치료 및 진단 적용을 위해 유용하다. 면역검정법은 Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질을 질적 또는 양적으로 분석하기 위해 사용될 수 있다. 적용가능한 기술의 일반적인 개관을 Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 1988 에서 발견할 수 있다.
A. 항체의 제조
Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질과 특이적으로 반응하는 폴리클론 및 단일클론 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어, Coligan, Current Protocols in Immunology, 1991; Harlow & Lane, supra; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2d ed. 1986; and Kohler et al, Nature 256: 495-497, 1975 참조). 이러한 기술에는 파지 또는 유사한 벡터 내의 재조합 항체의 라이브러리로부터 항체의 선택에 의한 항체의 제조뿐 아니라, 토끼 또는 마우스의 면역화에 의한 폴리클론 및 단일클론 항체의 제조가 포함된다 (예를 들어, Huse et al, Science 246: 1275-1281, 1989; Ward et al, Nature 341: 544-546, 1989 참조).
Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질의 일부를 포함하는 다수의 면역원이 Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질과 특이적으로 반응성인 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 재조합 Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질 또는 그의 항원성 단편은 본원에 기재된 바와 같이 단리될 수 있다. 재조합 단백질은 상기 기재된 바와 같은 진핵 또는 원핵 세포에서 발현될 수 있고, 상기 일반적으로 기재된 바와 같이 정제될 수 있다. 재조합 단백질은 단일클론 또는 폴리클론 항체의 제조를 위한 바람직한 면역원이다. 대안적으로는, 본원에 기재되고 담체 단백질에 공액된 서열로부터 유래된 합성 펩티드는 면역원으로 사용될 수 있다. 자연 발생적 단백질은 또한 순수 또는 비순수 형태로 사용될 수 있다. 그 다음 생성물을 항체를 생성할 수 있는 동물 내에 주사한다. 단일클론 또는 폴리클론 항체는 단백질을 측정하기 위한 면역검정법에서 수반 사용하기 위해 발생될 수 있다.
폴리클론 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 마우스의 근교배 주 (예, BALB/C 마우스) 또는 토끼의 근교배주를 표준 항원보강제, 예컨대 프로인트 (Freund's) 항원보강제, 및 표준 면역화 프로토콜을 사용하여 단백질로 면역화시킨다. 면역원 제조에 대한 동물의 면역 반응을, 시험 혈액을 취하고 베타 서브유닛에 대한 반응성의 적정농도를 측정하여 모니터한다. 면역원에 대해 적합하게 높은 적정농도의 항체가 수득되면, 혈액을 동물로부터 수집하고, 항혈청을 제조한다. 필요한 경우 단백질에 대해 반응성인 항체가 풍부한 항혈청의 추가 분획화를 수행할 수 있다 (Harlow & Lane, supra 참조).
단일클론 항체는 당업자에게 잘 알려진 다양한 기술을 사용하여 수득할 수 있다. 간략하게는, 바람직한 항원으로 면역화된 동물로부터의 비장 세포를 통상적으로 골수종 세포와의 융합에 의해 불멸화시킨다 (Kohler et al, Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976 참조). 대안적인 불멸화 방법에는 Epstein Barr 바이러스, 종양유전자, 또는 레트로바이러스로의 형질전환, 또는 당업계에 잘 알려진 기타 방법이 포함된다. 단일 불멸화 세포로부터 발생하는 콜로니는 항원에 대한 바람직한 특이성 및 친화성의 항체의 제조에 대해 스크리닝되고, 이러한 세포에 의해 제조되는 단일클론 항체의 수율은 척추동물 숙주의 복강 내로의 주사를 포함하는, 다양한 기술에 의해 향상될 수 있다. 대안적으로는, Huse, et al, Science 246: 1275-1281, 1989 에 의해 개략화된 일반적 프로토콜에 따라 인간 B 세포로부터 DNA 라이브러리를 스크리닝하여 단일클론 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 DNA 서열을 단리할 수 있다.
단일클론 항체 및 폴리클론 혈청은 수집되고, 면역검정법, 예를 들어, 고체 지지체 상에 고정된 면역원으로의 고상 면역검정법에서 면역원 단백질에 대항해 적정된다. 전형적으로는, 104 또는 그 초과의 적정농도를 갖는 폴리클론 항혈청이 선택되고, 경쟁적 결합 면역검정법을 사용하여, 비-Scd1 또는 톨-유사 수용체 2 단백질에 대항하는 그들의 교차 반응성에 대해 시험되었다. 특정 폴리클론 항혈청 및 단일클론 항체는 통상 약 0.1 mM 이상, 더욱 통상 약 1 μM 이상, 바람직하게는 약 0.1 μM 이상, 가장 바람직하게는, 0.01 μM 이상의 Kd 로 결합할 것이다. 오직 특정 Scd1 오르토로그 (ortholog) 또는 톨-유사 수용체 2 오르토로그, 예컨대 인간 Scd1 단백질 또는 인간 톨-유사 수용체 2 에 대해 특이적인 항체는 또한, 비-인간 포유동물과 같은 종으로부터 기타 교차-반응 오르토로그를 빼서 제조할 수 있다. 상기 방식에서, Scd1 또는 톨-유사 수용체 2 에만 결합하는 항체를 수득할 수 있다.
일단 Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질에 대항하는 특이적 항체가 이용가능하다면, 단백질은 다양한 면역검정법으로 검출할 수 있다. 또한, 항체는 Scd1 유전자 산물 또는 톨-유사 수용체 2 의 조정제로서 치료적으로 사용할 수 있다. 면역학적 및 면역검정법 절차의 검토를 위해, Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr eds., 7th ed. 1991) 를 참조한다. 게다가, 본 발명의 면역검정법은 임의의 여러 형태로 수행될 수 있고, 이것은 Enzyme Immunoassay (Maggio, ed., 1980); 및 Harlow & Lane, supra 에서 광범위하게 검토된다.
B. 면역학적 결합 검정법
Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질은 다수의 잘 인지된 면역학적 결합 검정법 중 임의의 것을 사용하여 검출 및/또는 정량화될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제 4,366,241 호; 제 4,376,110 호; 제 4,517,288 호; 및 제 4,837,168 호 참조). 일반적 면역검정법의 검토를 위해, 또한 Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volume 37 (Asai, ed. 1993); Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr, eds., 7th ed. 1991) 를 참조한다. 면역학적 결합 검정법 (또는 면역검정법) 은 전형적으로는 선택의 단백질 또는 항원 (본 경우에서, Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질 또는 그의 항원성 서브서열) 에 특이적으로 결합하는 항체를 사용한다. 항체 (예, 항-Scd1 유전자 산물 또는 항-톨-유사 수용체 2) 는 당업자에게 잘 공지되고 상기 기재된 바와 같은 다수의 수단 중 임의의 것에 의해 제조될 수 있다.
면역검정법은 또한 종종 항체 및 항원에 의해 형성된 복합체에 특이적으로 결합하고 표지화하기 위한 표지화제를 사용한다. 표지화제는 항체/항원 복합체를 포함하는 부분 중 하나인 그 자체일 수 있다. 그러므로, 표지화제는 표지된 Scd1 유전자 산물 또는 표지된 톨-유사 수용체 2 일 수 있다. 대안적으로는, 표지화제는 항체/Scd1 유전자 산물 또는 항체/톨-유사 수용체 2 복합체에 특이적으로 결합하는 이러한 2차 항체, 3번째 부분일 수 있다 (2차 항체는 전형적으로는 첫번째 항체가 유도된 종의 항체에 특이적이다). 면역글로불린 불변 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 기타 단백질, 예컨대 단백질 A 또는 단백질 G 는 또한 표지화제로서 사용될 수 있다. 상기 단백질은 다양한 종으로부터의 면역글로불린 불변 영역을 갖는 강한 비-면역원성 반응성을 나타낸다 (예를 들어, Kronval et al, J. Immunol. 111: 1401-1406, 1973; Akerstrom et al, J. Immunol. 135: 2589-2542, 1985 참조). 표지화제는 또다른 분자가 특이적으로 결합할 수 있는 (예컨대 스트렙타비딘) 검출가능한 부분 (예컨대 비오틴) 으로 변형할 수 있다. 다양한 검출가능한 부분이 당업자에게 잘 공지되어 있다.
검정법 동안, 시약의 각 조합 후 인큐베이션 및/또는 세척 단계가 필요할 수 있다. 인큐베이션 단계는 약 5 초에서 몇 시간, 임의로 약 5 분에서 약 24 시간까지 다양화시킬 수 있다. 그러나, 인큐베이션 시간은 검정법 포맷, 항원, 용액 부피, 농도 등에 따라 달라질 것이다. 통상적으로, 검정법은 이들을 10℃ 내지 40℃ 와 같은 온도 범위에서 수행할 수 있긴 하지만, 주위 온도에서 수행할 것이다.
비-경쟁적 검정법 포맷: 샘플에서 Scd1 유전자 산물 또는 톨-유사 수용체 2 의 검출을 위한 면역검정법은 경쟁적 또는 비-경쟁적일 수 있다. 비-경쟁적 면역검정법은 항원의 양이 직접적으로 측정되는 검정법이다. 하나의 바람직한 "샌드위치" 검정법에서, 예를 들어, 항-Scd1 유전자 산물 또는 항-톨-유사 수용체 2 항체는 고정화되는 고체 기질 상에 직접적으로 결합될 수 있다. 그 다음 상기 고정화 항체는 시험 샘플에 존재하는 Scd1 유전자 산물 또는 톨-유사 수용체 2 를 포획한다. 그렇게 고정된 Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질은 그 다음 표지화제, 예컨대 Scd1 유전자 산물에 대한 두번째 항체 또는 표지를 갖는 톨-유사 수용체 2 에 대한 항체에 의해 결합된다. 대안적으로는, 두번째 항체는 표지가 결핍될 수 있으나, 이것은 차례로 두번째 항체가 유래된 종의 항체에 특이적인 표지된 세번째 항체에 의해 결합될 수 있다. 두번째 또는 세번째 항체는 전형적으로는 검출가능한 부분을 제공하기 위해 또다른 분자가 특이적으로 결합할 수 있는 (예를 들어, 스트렙타비딘) 검출가능한 부분 (예컨대 비오틴) 으로 변형된다.
경쟁적 검정법 포맷: 경쟁적 검정법에서, 샘플에 존재하는 Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질의 양은 샘플에 존재하는 미공지된 Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질에 의해 항-Scd1 단백질 또는 항-톨-유사 수용체 2 항체로부터 대체된 (경쟁된) 공지된, 첨가된 (외인성) Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질의 양을 측정하여 간접적으로 측정된다. 하나의 경쟁적 검정법에서, 공지된 양의 Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질을 샘플에 첨가한 다음, 샘플을 Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체로 접촉시킨다. 항체에 결합된 외인성 Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질의 양은 샘플에 존재하는 Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질의 농도에 반비례한다. 특히 바람직한 구현예에서, 항체를 고체 기질 상에 고정화시킨다. 항체에 결합된 Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질의 양은 Scd1 단백질/항체 복합체 또는 톨-유사 수용체 2 단백질/항체 복합체에 존재하는 Scd1 유전자 산물 또는 톨-유사 수용체 2 의 양을 측정하거나, 대안적으로는 남아있는 비복합된 단백질의 양을 측정하여 측정할 수 있다. Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질의 양은 표지된 Scd1 단백질 분자 또는 톨-유사 수용체 2 분자를 제공하여 검출할 수 있다.
합텐 억제 검정법은 또다른 바람직한 경쟁적 검정법이다. 상기 검정법에서, 공지된 Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질을 고체 기질 상에 고정시킨다. 공지된 양의 항-Scd1 항체 또는 항-톨-유사 수용체 2 항체를 샘플에 첨가한 다음, 샘플을 고정화된 Scd1 유전자 산물 또는 톨-유사 수용체 2 와 접촉시킨다. 공지된 고정된 Scd1 유전자 산물 또는 톨-유사 수용체 2 에 결합하는 항-Scd1 항체 또는 항-톨-유사 수용체 2 항체의 양은 샘플에 존재하는 Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질의 양에 반비례한다. 또다시, 고정된 항체의 양은 항체의 고정된 분획 또는 용액에 남은 항체의 분획을 검출하여 검출할 수 있다. 항체를 표지한 곳에서 직접 또는 상기 기재된 바와 같은 항체에 특이적으로 결합하는 표지된 부분의 연이은 첨가에 의해 간접적으로 검출할 수 있다.
교차-반응성 측정: 경쟁적 결합 포맷에서의 면역검정법은 또한 교차반응성 측정을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질은 고체 지지체에 고정될 수 있다. 단백질 (예를 들어, Scd1 유전자 산물 또는 톨-유사 수용체 2 및 상동) 을 고정된 항원에 대한 항혈청의 결합에 대해 경쟁하는 검정법에 첨가한다. 고정된 단백질에 대한 항혈청의 결합에 대해 경쟁하기 위해 첨가된 단백질의 능력을 그 자체와 경쟁하기 위한 Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질의 능력과 비교한다. 상기 단백질에 대한 교차반응성% 는 표준 계산을 사용하여 계산된다. 상기 열거된 첨가된 단백질 각각과 10% 미만의 교차반응성을 갖는 이들 항혈청이 선택되고 모아진다 (pooled). 교차-반응하는 항체는 임의로 첨가된 고려된 단백질, 예를 들어, 먼 관련 상동으로의 면역흡착에 의해 모아진 항혈청으로부터 제거된다.
그 다음 면역흡착되고 모아진 항혈청은 면역원 단백질에 대해, 아마도 Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질의 대립유전자 또는 다형 변이체인 것으로 생각되는 두번째 단백질을 비교하기 위해 상기 기재된 바와 같은 경쟁적 결합 면역검정법에서 사용된다. 상기 비교를 하기 위해, 2 가지 단백질을 각각 넓은 범위의 농도에서 검정하고, 고정된 단백질에 대한 항혈청의 결합의 50% 를 억제하기 위해 필요한 각각의 단백질의 양을 측정한다. 결합의 50% 를 억제하기 위해 필요한 두번째 단백질의 양이 결합의 50% 를 억제하기 위해 필요한 Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질의 양의 10 배 미만인 경우, 두번째 단백질은 Scd1 유전자 산물 또는 톨-유사 수용체 2 면역원에 대해 발생된 폴리클론 항체에 특이적으로 결합한다고 말한다.
기타 검정법 포맷: 샘플에서 Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질의 존재를 검출하고 정량하기 위해 웨스턴 블롯 (Western blot) (면역블롯) 분석을 사용한다. 기술은 일반적으로 분자량에 근거하여 젤 전기이동에 의해 샘플 단백질을 분리하고, 분리된 단백질을 적합한 고체 지지체 (예컨대, 니트로셀룰로오스 필터, 나일론 필터, 또는 유도된 나일론 필터) 에 옮기고, 샘플을 Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 함께 인큐베이션하는 것을 포함한다. 항-Scd1 단백질 항체 또는 항-톨-유사 수용체 2 항체는 고체 지지체 상에서 Scd1 유전자 산물 또는 톨-유사 수용체 2 에 특이적으로 결합한다. 상기 항체는 직접적으로 표지될 수 있거나, 대안적으로는 항-Scd1 단백질 항체 또는 항-톨-유사 수용체 2 항체에 특이적으로 결합하는 표지된 항체 (예를 들어, 표지된 양 항-마우스 항체) 를 사용하여 이어서 검출할 수 있다.
기타 검정법 포맷에는 리포솜 면역검정법 (LIA) 이 포함되고, 이것은 특정 분자 (예를 들어, 항체) 에 결합하고, 캡슐화된 시약 또는 마커를 방출하기 위해 고안된 리포솜을 사용한다. 그 다음 방출된 화학물질은 표준 기술에 따라 검출한다 (Monroe et al., Amer. Clin. Prod. Rev. 5: 34-41, 1986 참조).
비-특이적 결합의 감소: 당업자는 종종 면역검정법에서 비-특이적 결합을 최소화하는 것이 바람직하다고 인정할 것이다. 특히, 검정법에 고체 기질 상에 고정된 항원 또는 항체가 포함되는 경우, 기질에 대한 비-특이적 결합의 양을 최소화하는 것이 바람직하다. 이러한 비-특이적 결합을 감소시키는 수단은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 전형적으로는, 상기 기술에는 기질을 단백질성 조성물로 코팅하는 것이 포함된다. 특히, 단백질 조성물, 예컨대 소 혈청 알부민 (BSA), 탈지 분유, 및 젤라틴이 널리 사용되고, 분유가 가장 바람직하다.
표지: 검정법에서 사용되는 특정 표지 또는 검출가능한 기는 검정법에서 사용되는 항체의 특이적 결합을 상당히 방해하지 않는다면, 본 발명의 중대한 양상이 아니다. 검출가능한 기는 검출가능한 물리적 또는 화학적 특성을 갖는 임의의 물질일 수 있다. 이러한 검출가능한 표지는 면역검정법의 분야에서 잘 개발되어 있고, 일반적으로, 이러한 방법에 사용되는 대부분의 임의의 표지를 본 발명에 적용할 수 있다. 그러므로, 표지는 분광적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물이다. 본 발명에 유용한 표지에는 자석 비이드 (예, DYNABEADS™), 형광 염료 (예, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 텍사스 레드 (Texas red), 로다민 등), 방사능표지 (예, 3H, 125I, 35S, 14C, 또는 32P), 효소 (예, 호스 래디쉬 페록시다제, 알칼리 포스파타제 및 ELISA 에서 통상적으로 사용되는 기타 효소), 화학발광 표지, 및 비색 표지, 예컨대 콜로이드성 골드 또는 색조 유리 또는 플라스틱 비이드 (예, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스, 등) 가 포함된다.
표지는 당업계에 공지된 방법에 따라 원하는 검정법의 성분에 대해 직접적으로 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 상기 지시된 바와 같이, 필요한 감수성, 화합물과의 공액의 용이성, 안정성 필요, 이용가능한 기구, 및 처리 규정에 따라 표지를 선택하여, 다양한 표지를 사용할 수 있다.
비-방사능 표지는 종종 간접적인 수단에 의해 부착된다. 일반적으로, 리간드 분자 (예, 비오틴) 는 분자에 공유 결합한다. 그 다음 리간드는 또다른 분자 (예, 스트렙타비딘), 본래 검출가능하거나 신호 시스템에 공유 결합하는 분자, 예컨대 검출가능한 효소, 형광 화합물, 또는 화학발광 화합물에 결합한다. 리간드 및 그들의 표적은 Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질을 인지하는 항체, 또는 항-Scd1 단백질 항체 또는 항-톨-유사 수용체 2 항체를 인지하는 2차 항체와의 임의의 적합한 조합으로 사용할 수 있다.
분자는 또한 신호 발생 화합물에 직접적으로 공액될 수 있다 (예를 들어, 효소 또는 형광발색단과의 공액에 의해). 표지로서 관심의 효소는 첫째로 히드로라제, 특히 포스파타제, 에스테라제 및 글리코시다제, 또는 옥시도타제, 특히 페록시다제일 것이다. 형광 화합물에는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론 등이 포함된다. 화학발광 화합물에는 루시페린, 및 2,3-디히드로프탈라진디온, 예를 들어, 루미놀이 포함된다. 사용될 수 있는 다양한 표지 또는 신호 발생 시스템의 검토를 위해 미국 특허 제 4,391,904 호를 참조한다.
표지 검출 수단은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 그러므로, 예를 들어, 표지가 방사능 표지인 경우, 검출 수단에는 섬광 계수기 또는 자가방사선술에서와 같은 사진 필름이 포함된다. 표지가 형광 표지인 경우, 플루오로크롬을 적합한 광 파장으로 흥분시키고, 결과 형광을 검출하여 검출할 수 있다. 형광은 전자 검출기, 예컨대 전하 커플링된 장치 (CCD) 또는 광전증배관 등의 사용에 의해, 시각적으로 검출할 수 있다. 유사하게는, 효소적 표지는 효소에 대한 적합한 기질을 제공하고, 결과 반응 생성물을 검출하여 검출할 수 있다. 최종적으로 표지와 관련된 색상을 단순히 관찰하여 간단한 표색계 표지를 검출할 수 있다. 그러므로, 다양한 계량봉 검정법에서, 다양한 공액된 비이드는 비이드의 색상으로 나타나는 반면, 공액된 골드는 종종 핑크로 나타난다.
일부 검정법 포맷은 표지된 성분의 사용을 필요로 하지 않는다. 예를 들어, 표적 항체의 존재를 검출하기 위해 응집 검출법이 사용될 수 있다. 상기 경우, 항원-코팅된 입자는 표적 항체를 포함하여 샘플에 의해 응집된다. 상기 포맷에서, 성분 중 어느 것도 표지될 필요가 없고, 표적 항체의 존재는 단순한 시각 조사에 의해 검출된다.
Scd1 유전자 산물 또는 톨-유사 수용체 2 의 조정제에 대한 고 처리량 검정법
Scd1 유전자 산물 또는 톨-유사 수용체 2 의 조정제로서 시험된 화합물은 임의의 소형 유기 분자, 또는 생물학적 실재물, 예컨대 단백질, 예를 들어, 항체 또는 펩티드, 당, 핵산, 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드, RNAi, 또는 리보자임, 또는 지질일 수 있다. 대안적으로는, 조정제는 Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질의 유전적으로 변형된 변이체일 수 있다. 전형적으로는, 시험 화합물은 소형 유기 분자, 펩티드, 지질, 및 지질 유사체일 것이다.
대부분 종종 화합물은 사용되는 수성 또는 유기 (특히 DMSO-기재) 용액에 용해될 수 있기는 하지만, 본질적으로 임의의 화학 화합물은 본 발명의 검정법에서 잠재적인 조정제 또는 리간드로서 사용될 수 있다. 검정법은 검정법 단계를 자동화하고 검정을 위해 임의의 편리한 공급원으로부터 화합물을 제공하여, 큰 화학 라이브러리를 스크리닝하기 위해 고안되고, 이것은 전형적으로는 평행으로 수행된다 (예를 들어, 로보트 검정법에서 마이크로역가 플레이트 상의 마이크로역가 포맷). Sigma (St. Louis, MO), Aldrich (St. Louis, MO), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs Switzerland) 등을 포함하는 많은 화학 화합물 공급처가 있다는 것을 인정할 것이다.
하나의 바람직한 구현예에서, 고 처리량 스크리닝 방법은 다수의 잠재적 치료 화합물 (잠재적 조정제 또는 리간드 화합물) 을 함유하는 조합적 소형 유기 분자 또는 펩티드 라이브러리를 제공하는 것을 포함한다. 이러한 "조합적 화학 라이브러리" 또는 "리간드 라이브러리" 는 그 다음 바람직한 특징적인 활성을 나타내는 이들 라이브러리 멤버 (특정 화학 종 또는 서브계열) 를 확인하기 위해, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 검정법에서 스크리닝한다. 그렇게 확인된 화합물은 통상적인 "선도 (lead) 화합물" 로서 역할을 할 수 있거나, 이들 자체는 잠재적인 또는 실제 치료제로서 사용될 수 있다.
조합적 화학 라이브러리는 화학적 합성 또는 생물학적 합성에 의해, 다수의 화학적 "빌딩 블록 (building block)" 예컨대 시약을 조합하여 발생되는 다양한 화학 화합물의 집합이다. 예를 들어, 선형 조합적 화학 라이브러리, 예컨대 폴리펩티드 라이브러리는 제시된 화합물 길이 (즉, 폴리펩티드 화합물 중의 아미노산의 수) 에 대해 모든 가능한 방식으로 화학적 빌딩 블록 (아미노산) 의 세트를 조합하여 형성된다. 이러한 화학적 빌딩 블록의 조합적 혼합을 통해 다수의 화학 화합물을 합성할 수 있다.
조합적 화학 라이브러리의 제조 및 스크리닝은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 이러한 조합적 화학 라이브러리에는 펩티드 라이브러리 (예를 들어, 미국 특허 제 5,010,175 호, Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37: 487-493, 1991 및 Houghton et al., Nature 354: 84-88, 1991 참조) 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 화학적 다양성 라이브러리를 발생시키기 위한 기타 화학이 또한 사용될 수 있다. 이러한 화학에는 펩토이드 (예, PCT 공개 번호 WO 91/19735), 코딩된 펩티드 (예, PCT 공개 번호 WO 93/20242), 랜덤 바이오-올리고머 (예, PCT 공개 번호 WO 92/00091), 벤조디아제핀 (예, 미국 특허 제 5,288,514 호), 다이버소머 (diversomer), 예컨대 하이단토인, 벤조디아제핀 및 디펩티드 (Hobbs et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913, 1993), 비닐위치 폴리펩티드 (Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568, 1992), 글루코오스 스캐폴딩 (scaffolding) 을 갖는 비펩티드성 펩티드모방성 (Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-9218, 1992), 소형 화합물 라이브러리의 유사 유기 합성 (Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661, 1994), 올리고카르바메이트 (Cho et al, Science 261: 1303, 1993), 및/또는 펩티딜 포스포네이트 (Campbell et al, J. Org. Chem. 59: 658, 1994), 핵산 라이브러리 (Ausubel, Berger 및 Sambrook, all supra 참조), 펩티드 핵산 라이브러리 (예를 들어, 미국 특허 제 5,539,083 호 참조), 항체 라이브러리 (예를 들어, Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14: 309-314, 1996 및 PCT/US96/10287 참조), 탄수화물 라이브러리 (예를 들어, Liang et al., Science 274: 1520-1522, 1996 및 미국 특허 제 5,593,853 호 참조), 소형 유기 분자 라이브러리 (예를 들어, 벤조디아제핀, Baum C&EN, Jan 18, page 33 (1993); 이소프레노이드, 미국 특허 제 5,569,588 호; 티아졸리디논 및 메타티아자논, 미국 특허 제 5,549,974 호; 피롤리딘, 미국 특허 제 5,525,735 호 및 제 5,519,134 호; 모르폴리노 화합물, 미국 특허 제 5,506,337 호; 벤조디아제핀, 제 5,288,514 호 등 참조) 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
조합적 라이브러리의 제조용 장치는 시판된다 (예를 들어, 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA 참조). 또한, 수많은 조합적 라이브러리 그 자체는 시판된다 (예를 들어, ComGenex, Princeton, N.J., Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, MO, ChemStar, Ltd, Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD, 등 참조).
후보 화합물은 톨-유사 수용체 2/Scd1 상호작용을 포함하는 경로를 통한 대식세포의 MALP-2 유도를 포함하는 장애 치료용 약물을 확인하기 위한 전략의 일부로서 유용하다. TLR2 또는 Scd1 에 결합하는 시험 화합물은 후보 화합물로 고려된다.
TLR2 또는 Scd1 에 결합하거나, TLR2 또는 Scd1 단백질 또는 폴리펩티드의 활성 또는 그의 생물학적으로 활성인 부분을 조정하는 후보 또는 시험 화합물을 확인하기 위한 스크리닝 검정법이 또한 본 발명에 포함된다. 시험 화합물은, 생물학적 라이브러리; 공간적으로 지정가능한 평행 고상 또는 용액 상 라이브러리; 디콘 볼루션 (decon volution) 을 필요로 하는 합성 라이브러리 방법; "1-비이드 1-화합물" 라이브러리 방법; 및 친화 크로마토그래피 선별을 사용하는 합성 라이브러리 방법을 포함하나 이에 제한되는 것이 아닌, 당업계에 공지된 조합적 라이브러리 방법 중 다수의 접근법 중 임의의 것을 사용하여 수득할 수 있다. 생물학적 라이브러리 접근법은 예를 들어, 펩티드 라이브러리에 대해 사용할 수 있으며, 기타 4 가지 접근법이 펩티드, 비-펩티드 올리고머 또는 화합물의 소형 화학 분자 라이브러리에 적용가능하다 (Lam, Anticancer Drug Des. 12: 145, 1997). 분자 라이브러리의 합성 방법의 예는 당업계에서 발견할 수 있다 (예를 들어: DeWitt et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909, 1993; Erb et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37: 2678, 1994; Cho et al, Science 261: 1303, 1993; Carrell et al, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061, 1994; 및 Gallop et al., J. Med. Chem. 37: 1233, 1994). 일부 구현예에서, 시험 화합물은 TLR2 또는 Scd1 의 활성화 변이체이다.
화합물의 라이브러리는 용액 내에 (예, Houghten, Bio/Techniques 13: 412-421, 1992), 또는 비이드 상에 (Lam, Nature 354: 82-84, 1991), 칩 (Fodor, Nature 364: 555-556, 1993), 박테리아 (미국 특허 제 5,223,409 호), 포자 (미국 특허 제 5,571,698 호, 제 5,403,484 호, 및 제 5,223,409 호), 플라스미드 (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869, 1992) 또는 파지 상에 (Scott et al, Science 249: 386-390, 1990; Devlin, Science 249: 404-406, 1990; Cwirla et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA.S7: 6378-6382, 1990; 및 Felici, J. Mol Biol. 222: 301-310, 1991) 제시될 수 있다.
TLR2 또는 Scd1 의 활성 또는 그의 생물학적으로 활성인 부분을 조정하기 위한 시험 화합물의 능력은 예를 들어, 시험 화합물의 존재하에서 TLR2/Scd1 복합체를 형성하는 능력을 모니터링하여 측정할 수 있다. TLR2 또는 Scd1 의 활성 또는 그의 생물학적으로 활성인 부분을 조정하는 것은 톨-유사 수용체 2/Scd1 상호작용이 포함되는 경로를 통한 대식세포의 MALP-2 유도를 측정하여 측정할 수 있다. 톨-유사 수용체 2 또는 Scd1 의 활성, 또는 그의 생물학적으로 활성인 부분을 조정하기 위한 시험 화합물의 능력은 또한 Scd1 에 결합하기 위한 톨-유사 수용체 2 단백질의 능력을 모니터링하여 측정할 수 있다. 결합 검정법은 세포-기재 또는 무-세포일 수 있다.
Scd1 에 결합하거나 이와 상호작용하기 위한 톨-유사 수용체 2 단백질의 능력은 직접 결합을 측정하기 위해 본원에 기재된 방법 또는 당업계에 공지된 방법 중 하나에 의해 측정할 수 있다. 하나의 구현예에서, Scd1 에 결합하거나 이와 상호작용하기 위한 톨-유사 수용체 2 단백질의 능력은 대식세포의 MALP-2 유도를 모니터링하여 측정할 수 있다. 대식세포의 MALP-2 유도의 검출에는 또한 검출가능한 마커, 예컨대 FLAG 서열 또는 루시페라아제를 코딩하는 재조합 Scd1 의 발현의 검출이 포함될 수 있다. 상기 검정법은 직접 결합의 검정법 외의 것일 수 있다. 일반적으로, 이러한 검정법은 Scd1 에 대한 톨-유사 수용체 2 단백질의 결합 또는 톨-유사 수용체 2 에 의한 Scd1 단백질 또는 유전자 발현의 활성화에 영향을 주기 위한 시험 화합물의 능력을 측정하기 위해 사용된다.
일반적으로, Scd1 에 결합하고, 톨-유사 수용체 2 을 통한 신호를 방해하거나, 그렇지 않으면, 대식세포의 MALP-2 유도에 영향을 주는 시험 화합물의 능력은 결합 또는 대식세포의 MALP-2 유도를 시험 화합물의 부재하에서 측정하는 대조군과 비교한다. 일부 경우에서, 미리 측정된 참조 값이 사용된다. 이러한 참조 값은 대조군에 비해 측정될 수 있고, 이 경우, 참조와 상이한 시험 샘플은 화합물이 관심의 분자 (예를 들어, 톨-유사 수용체 2) 에 결합하거나 발현을 조정한다는 (예를 들어, MALP-2 에 의해 유도된 세포 중에서 대식세포를 조정, 활성화 또는 억제하거나, 그람 양성 박테리아 감염에 대한 대식세포 반응을 조정, 활성화 또는 억제함) 것을 나타낼 것이다. 참조 값은 또한 표준으로 관찰된 결합 또는 대식세포의 MALP-2 유도의 양을 반영할 수 있다 (예를 들어, 톨-유사 수용체 2 에 대한 항체의 친화성, 또는 MALP-2 유도에 의한 Scd1 발현의 조정). 이 경우, 참조와 유사한 (예를 들어, 이와 동일 또는 미만) 시험 화합물은 화합물이 후보 화합물 (예를 들어, 톨-유사 수용체 2 에 참조 항체와 동일한 또는 그보다 더 큰 정도로 결합함) 인 것을 나타낼 것이다.
본 발명은 추가로 상기 기재된 스크리닝 검정법에 의해 확인된 신규 작용제 및 본원에 기재된 바와 같은 치료를 위한 그의 용도에 관한 것이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 자연 발생적 또는 재조합인, Scd1 유전자 산물 또는 톨-유사 수용체 2 단백질 또는 Scd1 유전자 산물 또는 톨-유사 수용체 2 단백질을 발현하는 세포 또는 조직을 사용하는 가용성 검정법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 Scd1 유전자 산물 또는 톨-유사 수용체 2 단백질 또는 그의 리간드는 공유 또는 비공유 상호작용을 통해 고상 기질에 부착되는, 고 처리량 포맷의 고상 기재 시험관 내 검정법을 제공한다. 본원에 기재된 검정법 중 임의의 하나는 고 처리량 스크리닝에 대해 적용될 수 있다.
가용성 또는 고체 상태의, 본 발명의 고 처리량 검정법으로, 하루에 수천 개의 상이한 조정제 또는 리간드를 스크리닝하는 것이 가능하다. 상기 방법론은 시험관 내에서 Scd1 유전자 산물 또는 톨-유사 수용체 2 단백질에 대해, 또는 Scd1 유전자 산물 또는 톨-유사 수용체 2 단백질을 포함하는 세포-기재 또는 막-기재 검정법에 대해 사용할 수 있다. 특히, 마이크로역가 플레이트의 각각의 웰을 선택된 잠재적인 조정제에 대항하는 별도 검정법을 수행하기 위해 사용할 수 있거나, 농도 또는 인큐베이션 시간 효과가 관찰되어야 하는 경우, 매 5 내지 10 개의 웰을 단일 조정제로 시험할 수 있다. 그러므로, 단일 표준 마이크로역가 플레이트는 약 100 개 (예, 96 개) 조정제를 검정할 수 있다. 1536 개의 웰 플레이트를 사용하는 경우, 단일 플레이트는 약 100 내지 약 1500 개의 상이한 화합물을 쉽게 검정할 수 있다. 하루에 많은 플레이트를 검정하는 것이 가능하다; 약 6,000, 20,000, 50,000 개까지, 또는 100,000 개 초과의 상이한 화합물에 대해 스크리닝하는 검정법이 본 발명의 통합 시스템을 사용하여 가능하다.
고체 상태 반응을 위해, 관심의 단백질 또는 그의 단편, 예를 들어, 세포외부 도메인, 또는 관심의 단백질 또는 융합 단백질의 일부로서 그의 단편을 포함하는 세포 또는 막을 고체 상태 성분에 공유 또는 비공유 연결을 통해 예를 들어, 태그를 통해, 직접적으로 또는 간접적으로 결합시킬 수 있다. 태그는 다양한 성분 중 임의의 것일 수 있다. 일반적으로, 태그에 결합하는 분자 (태그 결합자) 는 고체 지지체에 고정되고, 관심의 태그된 분자는 태그 및 태그 결합자의 상호작용에 의해 고체 지지체에 부착된다.
다수의 태그 및 태그 결합자를, 문헌에 잘 기재된 공지된 분자 상호작용에 근거해 사용할 수 있다. 예를 들어, 태그가 천연 결합자, 예를 들어, 비오틴, 단백질 A, 또는 단백질 G 를 갖는 경우, 이것은 적합한 태그 결합자 (아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘, 면역글로불린의 Fc 영역 등) 와 함께 사용할 수 있다. 천연 결합자, 예컨대 비오틴을 갖는 분자에 대한 항체는 또한 널리 이용가능하고 적합한 태그 결합자이다; SIGMA Immunochemicals 1998 catalogue SIGMA, St. Louis MO 참조).
유사하게는, 임의의 합텐성 또는 항원성 화합물은 태그/태그 결합제 쌍을 형성하기 위해 적합한 항체와 조합으로 사용할 수 있다. 수천 개의 특이적 항체가 시판되고, 많은 부가적인 항체는 문헌에 기재된다. 예를 들어, 하나의 통상 배열에서, 태그는 첫 번째 항체이고, 태그 결합자는 첫 번째 항체를 인지하는 두 번째 항체이다. 항체-항원 상호작용 외에도, 수용체-리간드 상호작용는 또한 태그 및 태그-결합제 쌍으로서 적합하다. 예를 들어, 세포막 수용체의 작용제 및 길항제 (예, 세포 수용체-리간드 상호작용, 예컨대 톨-유사 수용체, 트랜스페린, c-키트, 바이러스 수용체 리간드, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체, 인터루킨 수용체, 면역글로불린 수용체 및 항체, 캐드헤린 족, 인테그린 족, 셀렉틴 족, 등; 예를 들어, Pigott & Power, The Adhesion Molecule Facts Book I, 1993 참조). 유사하게는, 독소 및 독액, 바이러스 에피토프, 호르몬 (예, 아편, 스테로이드 등), 세포간 수용체 (예, 이것은 스테로이드, 갑상선 호르몬, 레티노이드 및 비타민 D; 펩티드를 포함하는 다양한 소형 리간드의 효과를 조절한다), 약물, 렉틴, 당, 핵산 (둘 다 선형 및 시클릭 중합체 배형), 올리고당, 단백질, 인지질 및 항체는 모두 다양한 세포 수용체와 상호작용할 수 있다.
합성 중합체, 예컨대 폴리우레탄, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 폴리우레아, 폴리아미드, 폴리에틸렌이민, 폴리아릴렌 술피드, 폴리실록산, 폴리이미드 및 폴리아세테이트는 또한 적합한 태그 또는 태그 결합제를 형성할 수 있다. 많은 기타 태그/태그 결합제 쌍은, 본 기재의 검토에 근거해 당업자에게 명백하므로 또한 본원에 기재된 검정법 시스템에서 유용하다.
통상적 연결자, 예컨대 펩티드, 폴리에테르 등은 또한 태그로서 역할을 할 수 있고, 이것에는 폴리펩티드 서열, 예컨대 약 5 내지 200 개의 아미노산의 폴리 gly 서열이 포함된다. 이러한 가변성 연결자는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 연결자는 Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Alabama 에서 구입가능하다. 상기 연결자는 임의로 아미드 연결, 술프히드릴 연결 또는 헤테로작용성 연결을 가진다.
태그 결합자는 다양한 통상 이용가능한 방법 중 임의의 것을 사용하여 고체 기질 상에 고정된다. 고체 기질은 기질의 모두 또는 일부를 태그 결합자의 일부와 반응성인 표면에 화학기를 고정시키는 화학 시약에 노출시켜 통상 유도 또는 작용화한다. 예를 들어, 더 긴 사슬 부분에 부착하기에 적합한 기에는 아민, 히드록실, 티올 및 카르복실기가 포함될 것이다. 아미노알킬실란 및 히드록시알킬실란은 다양한 표면, 예컨대 유리 표면을 작용화하는 데 사용될 수 있다. 이러한 고상 생중합체 어레이의 구축은 문헌에 잘 기재되어 있다. 예를 들어, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154, 1963 (예를 들어, 펩티드의 고상 합성을 기재함); Geysen et al, J. Immun. Meth. 102: 259-274, 1987 (핀 상의 고상 성분의 합성을 기재함); Frank & Doring, Tetrahedron 44: 6031-6040, 1988 (셀룰로오스 디스크 상의 다양한 펩티드 서열의 합성을 기재함); Fodor et al, Science 251: 767-777, 1991; Sheldon et al, Clinical Chemistry 39: 718-719, 1993; 및 Kozal et al., Nature Medicine 2: 753-759, 1996 (모두 고체 기질에 고정된 생중합체의 어레이를 기재함) 을 참조한다. 기질에 태그 결합제를 고정하기 위한 비-화학적 접근법에는 기타 통상적인 방법, 예컨대 열, UV 방사선에 의한 교차-연결 등이 포함된다.
Scd1 및 톨-유사 수용체 2 의 조정제로서 2 특이적 화합물
하나의 양상에서, 후보 또는 시험 2 특이적 화합물의 확인 방법은 혈청 및/또는 비-인간 동물의 순환 중의 작용제의 농도를 감소시켜 제공된다. 즉석 방법을 사용하여 선택되거나 적정화된 화합물을 이러한 화합물의 투여로부터 이득이 있을 대상, 예를 들어, 인간 대상을 치료하기 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 방법의 구현예에서 시험될 수 있는 후보 화합물은 2 특이적 화합물이다. 본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "2 특이적 화합물" 에는 2 개의 상이한 결합 특이성을 갖는 화합물이 포함된다. 예시적 2 특이적 화합물에는 예를 들어, 2 특이적 항체, 헤테로중합체, 및 항원-기재 헤테로중합체가 포함된다.
본 발명의 구현예에서 시험될 수 있는 2 특이적 분자에는 바람직하게는 표적 작용제 (예를 들어, 별개의 항체 또는 항원) 에 특이적인 두번째 결합 부분에 교차연결된 Scd1, 바람직하게는 인간 Scd1 에 특이적인 결합 부분이 포함된다. 톨-유사 수용체 2 에 대해 특이적인 결합 부분의 예에는 톨-유사 수용체 2 리간드, 예를 들어, MALP-2 또는 바람직한 구현예에서, 톨-유사 수용체 2 에 대한 항체가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
또다른 구현예에서, 신규 톨-유사 수용체 2 결합 분자는 톨-유사 수용체 2 에 대한 결합 능력에 근거해 확인될 수 있다. 예를 들어, 화합물 또는 소형 화학 분자의 라이브러리는 세포가 없는 결합 검정법으로 시험될 수 있다. 다수의 시험 화합물, 예를 들어, 펩티드모방성, 소형 화학 분자 또는 기타 약물을 시험을 위해 사용할 수 있고, 하기를 포함하는 당업계에 공지된 조합적 라이브러리 방법 중 수많은 접근법 중 임의의 하나를 사용하여 수득할 수 있다: 생물학적 라이브러리; 공간적으로 지정가능한 평행 고상 또는 용액 상 라이브러리; 디콘 볼루션을 필요로 하는 합성 라이브러리 방법; "1-비이드 1-화합물" 라이브러리 방법; 및 친화 크로마토그래피 선별을 사용하는 합성 라이브러리 방법. 생물학적 라이브러리 접근법은 펩티드 라이브러리에 제한되는 반면, 기타 4 가지 접근법이 펩티드, 비-펩티드 올리고머 또는 화합물의 소형 화학 분자 라이브러리에 적용가능하다 (Lam, Anticancer Drug Des. 12: 145, 1997).
조정제 및 천연 추출물의 라이브러리를 시험하는 많은 약물 스크리닝 프로그램에서, 고 처리량 검정법이 제시된 시간에 조사된 조정제의 수를 최대화하기 위해 바람직하다. 예컨대 정제된 또는 반-정제된 단백질로 유도될 수 있는 세포가 없는 시스템에서 수행되는 검정법은, 시험 조정제에 의해 매개되는 분자 표적에서의 변경의 비교적 용이한 검출 및 빠른 개발을 가능하게 하기 위해 발생될 수 있는 "1차" 스크리닝으로서 종종 바람직하다. 게다가, 시험 조정제의 세포 독성 및/또는 생물학적 이용가능성의 효과는 일반적으로 시험관 내 시스템에서 무시될 수 있으며, 대신 검정법은 업스트림 (upstream) 또는 다운스트림 (downstream) 요소로의 결합 친화성의 변경이 명백할 수 있다면 분자 표적에 대한 약물의 효과에 일차로 초점을 맞춘다.
또다른 구현예에서, 당업계에 공지된 파지 디스플레이 기술은 신규 TLR2 또는 Scd1 결합 분자를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 TLR2 또는 Scd1 또는 그의 생물학적으로 활성인 부분에 결합하는 후보 또는 시험 화합물을 스크리닝하기 위한 검정법을 제공한다.
TLR2 또는 Scd1 에 결합하는 분자를 확인하기 위한 세포-기재 검정법은 본 발명의 2 특이적 화합물에서의 사용을 위한 추가적 작용제를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, TLR2 또는 Scd1 발현 세포는 스크리닝 검정법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, TLR2 또는 Scd1 에 대한 결합에서 통계적으로 유의한 변화를 야기하는 화합물이 확인될 수 있다.
하나의 구현예에서, 검정법은 톨-유사 수용체 2 결합 분자가 시험관 내 TLR2 또는 Scd1 단백질에 결합하는 그의 능력에 근거해 확인되는 무-세포 검정법이다. TLR2 또는 Scd1 단백질 결합 분자가 제공될 수 있고, TLR2 또는 Scd1 단백질에 결합하는 단백질의 능력은 업계에 인지된 직접 결합의 측정 방법을 사용하여 시험될 수 있다. 표적 분자에 대한 단백질의 결합 능력의 측정을, 예를 들어, 실시간 생분자 상호작용 분석 (Biomolecular Interaction Analysis: BIA) 과 같은 기술을 사용하여 수행할 수 있다. Sjolander et al, Anal. Chem. 63: 2338-2345, 1991, 및 Szabo et al, Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699-705, 1995. 본원에 사용되는 바와 같은, "BIA" 는 상호작용물 중 임의의 것을 표지하지 않고 (예, BIAcore) 실시간으로 생특이적 상호작용을 연구하기 위한 기술이다. 표면 플라스몬 공명 (SPR) 의 광학 현상의 변화는 생물학적 분자 사이의 실시간 반응의 지표로서 사용될 수 있다.
본 발명의 무-세포 검정법은 단백질의 가용성 및/또는 막-결합 형태 둘 다를 사용할 여지가 있다. 막-결합 형태 단백질이 사용되는 무-세포 검정법의 경우, 단백질의 막-결합 형태가 용액 내에 유지되도록 가용화제를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 가용화제의 예에는 비-이온성 세제, 예컨대 n-옥틸글루코시드, n-도데실글루코시드, n-도데실말토시드, 옥타노일-N-메틸글루사미드, 데카노일-N-메틸글루사미드, Triton® X-100, Triton® X-114, Thesit®, 이소트리데시폴리(에틸렌 글리콜 에테르)n, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암미니오]-1-프로판 술포네이트 (CHAPS), 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암미니오]-2-히드록시-1-프로판 술포네이트 (CHAPSO), 또는 N-도데실=N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판 술포네이트가 포함된다.
단백질-단백질 상호작용의 검출을 가능하게 하는 적합한 검정법이 당업계에 공지된다 (예, 면역침강, 2-하이브리드 검정법 등). 시험 화합물의 존재 및 부재에서 이러한 검정법을 수행하여, 상기 검정법은 표적 분자(들) 과 본 발명의 단백질의 상호작용을 조정 (예, 억제 또는 향상) 하는 화합물을 확인하기 위해 사용할 수 있다.
표적 분자에 결합하는 또는 그와 상호작용하는 단백질의 능력을 측정하는 것은, 예를 들어, 직접 결합에 의해 달성될 수 있다. 직접 결합 검정법에서, 단백질은 표적 분자에 대한 단백질의 결합은 복합체 중의 표지된 단백질을 검출하여 측정할 수 있도록 방사능동위원소 또는 효소적 표지로 커플링할 수 있을 것이다. 예를 들어, 단백질은 125I, 35S, 14C, 또는 3H, 및 방사능방사의 직접 계수 또는 섬광 계수에 의해 검출된 방사능동위원소로 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 대안적으로는, 분자는 예를 들어, 호스래디쉬 페록시다제, 알칼리 포스파타제, 또는 루시페라아제, 및 적합한 기질의 생성물로의 전환의 측정에 의해 검출되는 효소적 표지로 효소적으로 표지될 수 있다.
전형적으로는, 단백질 중 하나 또는 모두의 비복합된 형태로부터 복합체의 분리를 용이하게 하기 위한 것 뿐 아니라, 검정법의 자동화를 적용하기 위해 본 발명의 단백질 또는 그의 결합 단백질을 고정화시키는 것이 바람직할 것이다. 후보 작용제의 존재 및 부재에서 업스트림 또는 다운스트림 결합 요소에 대한 결합은, 반응물을 함유하기에 적합한 임의의 용기에서 달성될 수 있다. 예에는 마이크로역가 플레이트, 시험 튜브, 및 마이크로-원심분리 튜브가 포함된다. 하나의 구현예에서, 융합 단백질은 단백질을 매트릭스에 결합하도록 하는 도메인을 첨가하여 제공할 수 있다. 예를 들어, 글루타티온-S-트랜스페라제/ TLR2 (GST/ TLR2) 융합 단백질은 글루타티온 세파로오즈 비이드 (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.) 또는 글루타티온 유래된 마이크로역가 플레이트 상에 흡수될 수 있고, 그러면 이것은 세포 용해물, 예를 들어, 35S-표지된, 및 시험 조정제와 조합시키고, 혼합물을 복합체 형성을 조장하는 상태, 예를 들어, 약간 더욱 엄격한 상태가 사용될 수 있음에도, 염 및 pH 에 대한 생리학적 상태에서 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 미결합된 표지를 제거하기 위해 비이드를 세척하고, 매트릭스를 고정하고 방사능표지를 직접적으로 (예를 들어, 섬광기 내에 위치된 비이드), 또는 이어서 복합체가 분리된 후 상청액 중에서 측정한다. 대안적으로는, 복합체는 매트릭스로부터 용리되고, SDS-PAGE 에 의해 분리되고, TLR2-결합 단백질의 수준은 표준 전기이동 기술을 사용하여 젤로부터 정량화된 비이드 분획에서 발견될 수 있다.
매트릭스 상에 단백질을 고정하기 위한 기타 기술은 또한 대상 검정법에서 사용하기에 이용가능하다. 예를 들어, 비오티닐화 분자는 당업계에 잘 공지된 기술 (예, 비오티닐화 키트, Pierce Chemicals, Rockford, III.) 을 사용하여 비오틴-NHS (N-히드록시-숙신이미드) 로부터 제조할 수 있고, 스트렙타비딘-코팅된 96 웰 플레이트 (Pierce Chemical) 의 웰에 고정한다.
또한 상호작용물 중 임의의 것을 표지하지 않고 TLR2 과 Scd1 사이의 상호작용을 조정하기 위한 화합물의 능력을 측정하는 것이 본 발명의 범주 내에 있다. 예를 들어, 마이크로생체측정기 (microphysiometer) 를 단백질 또는 표적 분자의 표지 없이 그의 표적 분자로 본 발명의 단백질의 상호작용을 검출하기 위해 사용할 수 있다. McConnell et al, Science 257: 1906-1912, 1992. 본원에 기재된 바와 같은, "마이크로생체측정기" (예, Cytosensor) 는 광-지정형 전위차계 센서 (LAPS) 를 사용하여 세포가 그의 환경을 산성화하는 비율을 측정하는 분석 기구이다. 상기 산성화 비율의 변화는 화합물과 수용체 사이의 상호작용의 표지로서 사용될 수 있다.
본 발명에서 시험될 수 있는 항원-기재 헤테로중합체에는 우선적으로 자가항체에 의해 인지되는 항원에 가교결합된, TLR2 또는 Scd1, 바람직하게는 인간 TLR2 또는 Scd1 에 특이적인 결합 부분이 포함된다. 자가항체에 의해 인지되는 항원의 예에는 하기 중 임의의 하나가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다: 인자 VIII (대체 재조합 인자 VIII 에 의한 혈우병의 치료와 관련된 항체); 근육 아세틸콜린 수용체 (항체는 질환 중증근육무력증과 관련된다); 카디올리핀 (질환 루푸스와 관련됨); 혈소판 관련 단백질 (질환 특발성 혈소판감소성 자반증과 관련됨); 쇼그렌증후군 (Sjogren's Syndrome) 과 관련된 다중 항원; 조직 이식 자가면역 반응의 경우에 관련된 항원; 심장 근육에서 발견된 항원 (질환 자가면역 심근염과 관련됨); 면역 복합체 매개 신장 질환과 관련된 항원; dsDNA 및 ssDNA 항원 (루프스 신장염과 관련됨); 데스모글레인 및 데스모플라킨 (천포창 및 유사천포창과 관련됨); 또는 잘 특성화되고 질환 병인론과 관련된 임의의 기타 항원.
본 방법에서 시험하기 위한 예시적 헤테로중합체 및 항원-기재 헤테로중합체 및 이의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 예시적 헤테로중합체는 WO 03007971A1; U.S. 20020103343A1; 미국 특허 제 5,879,679 호; 미국 특허 제 5,487,890 호; 미국 특허 제 5,470,570 호; WO 9522977A1; WO/02075275A3, WO/0246208A2 또는 A3, WO/0180883A1, WO/0145669A1, WO 9205801A1, Lindorfer et al, J. Immunol. Methods. 248: 125, 2001; Hahn et al, J. Immnol. 166: 1057, 2001; Nardin et al, J. Immunol. Methods. 211: 21, 1998; Kuhn et al, J. Immunol. 160: 5088, 1998; Taylor et al, Cancer Immunol Immunother. 45: 152, 1997; Taylor et al, J. Immunol. 159: 4035, 1997; 및 Taylor et al, J. Immunol. 148: 2462, 1992 에 교시되어 있다. 또한, 상기 헤테로중합체의 변이 형태가 제조될 수 있다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, 상이한 결합 화학을 사용하여 제조된 2 특이적 분자의 형태를 사용할 수 있다. 2 특이적 분자의 성분을 가교 결합하기 위해 사용될 수 있는 예시적 시약에는 폴리에틸렌 글리콜, SATA, SMCC 뿐 아니라, 당업계에 공지된 기타 시약들이 포함되고, 예를 들어, Pierce Biotechnology 로부터 이용가능하다. 시험될 수 있는 2 특이적 분자의 예시적 형태는 그 내용이 본원에 참조로서 인용된, 2002년 9월 12월에 출원된 미국 일련 번호 60/411,731 호에 기재되어 있다.
또다른 구현예에서, 2 특이적 분자의 상이한 다합체 형태가 제조될 수 있다 (예를 들어, 2량체, 3량체, 4량체, 5량체 또는 고차 다합체 형태). 또다른 구현예에서, 2 특이적 분자의 정제된 형태를, 예를 들어, 그 내용이 본원에 참조로서 인용된, 2002년 5월 13일에 출원된 미국 일련 번호 60/380,211 호에 기재된 바와 같이 시험할 수 있다.
또다른 구현예에서, 헤테로중합체의 결합 부분 중 하나가 항체인 경우, 상이한 동종형 (예, IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2 (예, IgG2a), IgG3, IgG4, 또는 IgM) 의 항체를 사용할 수 있다. 또다른 구현예에서, 항체 분자의 부분 (예, Fab 단편) 은 결합 부분 중 하나에 대해 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 결합 부분 중 하나 이상이 Fc 도메인을 포함하는 항체이다. 하나의 구현예에서, 항체는 마우스 항체이다.
또다른 구현예에서, 항체에 대한 변형의 효과를 시험할 수 있고, 예를 들어, 항체의 면역제거 (deimmunization) 의 효과를, 예를 들어, 2003 년 3월 28일에 출원된 미국 일련 번호 60/458,869 호에 기재된 바와 같이 시험할 수 있다.
본 발명에서 제공되는 방법에서, 비-인간 동물의 혈청, 순환 및/또는 조직 중의 작용제, 예를 들어, 병원성 작용제의 농도는 예를 들어, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 이상 또는 약 100% 로 감소될 수 있다.
또다른 구현예에서, 대상의 혈청, 순환 및/또는 조직 중의 작용제의 농도는 간접적으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 혈청 및/또는 순환 중의 작용제의 존재로부터 야기되는 병리학은 예를 들어, 동물로부터 조직 샘플을 측정하여 측정할 수 있다. 비-인간 동물의 혈청, 순환 및/또는 조직 중의 작용제의 농도의 또다른 간접적 측정은 비-인간 동물에서 감염을 일으키는 작용제의 능력의 측정이다. 예를 들어, 임상 징후 및 감염 증상에 대한 2 특이적 화합물의 효과가 측정될 수 있다. 감염, 예를 들어, 하나의 장기 시스템에서 또다른 시스템으로 또는 한 개체에서 또다른 개체로의 감염의 만연을 억제하기 위한 2 특이적 화합물의 능력을 또한 시험할 수 있다.
또다른 구현예에서, 비-인간 동물에서 TLR2 또는 Scd1 을 갖는 세포에 결합하기 위한 2 특이적 화합물의 능력을 측정한다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, TLR2 또는 Scd1 표적 분자에 결합하기 위한 2 특이적 화합물의 능력을 측정하는 것은 또한 실시간 생분자 상호작용 분석 (BIA) 과 같은 기술을 사용하여 달성할 수 있다 (Sjolander et al, Anal. Chem. 63: 2338-2345, 1991 및 Szabo et al, Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699-705, 1995). 본원에 사용되는 바와 같은, "BIA" 는 상호작용물 중 임의의 것을 표지하지 않고 (예, BIAcore) 실시간으로 생특이적 상호작용을 연구하기 위한 기술이다. 표면 플라스몬 공명 (SPR) 의 광학 현상의 변화는 생물학적 분자 사이의 실시간 반응의 지표로서 사용될 수 있다.
또다른 구현예에서, 비-인간 동물에서 세포에 의한 작용제의 파괴 (예를 들어, 대식세포에 의한 살해) 가 측정된다.
비-인간 동물의 혈청 및/또는 순환 중의 작용제의 농도를 감소시키는 화합물 (2 특이적 화합물을 수여받지 않은 비-인간 동물에서 관찰된 농도와 비교해) 을 선택할 수 있다.
주제 검정법에서 시험하기 위한 화합물은 시험된 다수의 화합물 중에서 선택될 수 있다. 또다른 구현예에서, 본 검정법에서 시험하기 위한 2 특이적 화합물은 예를 들어, 시험관 내 검정법에서 이미 TLR2 또는 Scd1 에 결합할 수 있는 것으로 확인될 수 있고, 본 검정법을 사용하여 추가로 평가 또는 최적화될 수 있다. 이러한 경우에서, 혈청 및/또는 순환 중의 작용제의 농도를 감소시키는 2 특이적 화합물의 능력을, 혈청 및/또는 순환 중의 작용제의 농도를 감소시키는 그의 능력을 측정하기 위해, 또다른 2 특이적 화합물 또는 동일한 화합물의 비-최적화된 형태와 비교할 수 있다
바람직한 구현예에서, 본 발명의 2 특이적 화합물은 대략 1 μg 화합물/kg 체중 내지 대략 100 μg 화합물/kg 체중의 범위의 농도로 투여된다. 본원에 정의된 바와 같은, 치료적 유효량의 2 특이적 화합물 (즉, 유효 투여량) 은 약 0.01 내지 5000 μg/kg 체중, 바람직하게는 약 0.1 내지 500 μg/kg 체중, 더욱 바람직하게는 약 2 내지 80 μg/kg 체중, 더욱 더 바람직하게는 약 5 내지 70 μg/kg, 10 내지 60 μg/kg, 20 내지 50 μg/kg, 24 내지 41 μg/kg, 25 내지 40 μg/kg, 26 내지 39 μg/kg, 27 내지 38 μg/kg, 28 내지 37 μg/kg, 29 내지 36 μg/kg, 30 내지 35 μg/kg, 31 내지 34 μg/kg 또는 32 내지 33 μg/kg 체중의 범위이다. 당업자는 특정 인자가 질환 또는 장애의 중증도, 선행 치료, 대상의 일반적 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 기타 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는, 대상을 효과적으로 치료하는데 필요한 투여량에 영향을 미칠 수 있다는 것을 인식할 것이다. 게다가, 치료적 유효량의 단백질, 폴리펩티드, 또는 항체로의 대상의 치료에는 단일 치료가 포함될 수 있거나, 바람직하게는, 일련의 치료가 포함될 수 있다.
바람직한 예시에서, 동물은 작용제의 정맥내 (iv) 주사 후 약 1 내지 500 μg/kg 체중의 범위의 2 특이적 화합물로 치료된다. 또한 치료에 사용된 유효 투여량의 2 특이적 화합물은 특정 치료의 경과에 따라 증가 또는 감소될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 투여량의 변화가 야기될 수 있고, 본원에 기재된 바와 같은 진단 검정법의 결과로부터 명백해질 수 있다.
시험 화합물 및/또는 작용제의 투여 경로는 동물의 순환 내로의 정맥내 (iv) 주사일 수 있다. 기타 투여 경로에는 국소, 비경구, 피하, 또는 흡입에 의한 것이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 용어 "비경구" 에는 또한 예를 들어, 질환 또는 상해의 부위에서 국소화 투여를 포함하는 예를 들어, 피하, 정맥내, 또는 근육내 경로에 의한 주사가 포함된다. 이식물로부터의 화합물의 지속된 방출은 또한 당업계에 공지되어 있다. 당업자는 적합한 투여량이 치료되는 장애의 특성, 환자의 체중, 연령 및 일반적 상태, 및 투여 경로와 같은 인자에 따라 달라질 것임을 인지할 것이다. 예비적 투여량은 동물 시험에 따라 측정될 수 있고, 인간 투여에 대한 투여량의 조정은 업계에 허용되는 실시에 따라 수행된다.
후보 화합물 및 작용제는 동물에 대한 투여량 범위에 걸쳐 투여될 수 있다. 작용제가 또한 동물에 투여되는 경우, 후보 화합물은 작용제의 투여 전, 동시에 또는 그 후에 투여될 수 있다.
본 발명의 TLR2- 또는 Scd1-발현 유전자도입 동물, 예를 들어, 마우스를 대상의 혈청 및/또는 순환 중의 원하지 않는 작용제, 예컨대 자가항체, 감염성 작용제 또는 독소의 존재와 관련된 인간에서의 장애 또는 질환을 치료하는데 유용한 후보 화합물을 스크리닝 또는 평가하기 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 2 특이적 화합물에 의해 결합될 수 있는 예시적 표적된 작용제에는 바이러스, 바이러스성 입자, 독소, 박테리아, 폴리뉴클레오티드, 항체, 예를 들어, 자가면역 장애와 관련된 자가항체 중 임의의 하나가 포함되나 이에 제한되는 것이 아닌 혈액-유래 작용제가 포함된다. 하나의 구현예에서, 예시적 표적된 바이러스성 작용제에는 사이토메갈로바이러스, 인플루엔자, 뉴캐슬 (Newcastle) 질환 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 간염, 아데노바이러스-2, 소 바이러스성 설사 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 뎅기열 바이러스, 마르버그 (Marburg) 바이러스, 엡스타인-바 (Epstein-Barr) 바이러스 중 임의의 하나가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
예시적 그람-양성 박테리아는 화농성 연쇄구균, 황색 포도상구균, 결핵균 (Mycobacterium 결핵), 폐렴 연쇄구균 (Streptococcus pneumoniae), 또는 고초균 (Bacillus subtilis) 에 표적한다. 상기 기재된 방법 및 조성물 중 임의의 것은 피부 감염, 집단-습득 폐렴, 상부 및 하부 기도 감염, 피부 및 연조직 감염, 원내 폐 감염, 뼈 및 관절 감염, 기도 감염, 급성 박테리아 중이염, 박테리아 폐렴, 요로 감염, 합병 감염, 비합병 감염, 신우신염, 복강내 감염, 심부 종기, 박테리아 패혈증, 중추신경계 감염, 균혈증, 상처 감염, 복막염, 수막염, 화상 후 감염, 비뇨생식관 감염, 위장관 감염, 골반내 감염 질환, 심내막염, 및 기타 혈관내 감염의 치료에 유용하다. 치료되는 감염은 그람-양성 박테리아에 의해 야기될 수 있다. 이것에는 제한 없이, 황색 포도상구균, 표피포도상구균 (Staphylococcus epidermidis), 엔테로코쿠스 파이칼리스 (Enterococcus faecalis), 엔테로코쿠스 파에시움 (Enterococcus faecium), 클로스트리듐 페트프린겐스 (Clostridium petfringens), 클로스트리듐 디피실 (Clostridium difficile), 화농성 연쇄구균, 폐렴 연쇄구균, 기타 스트렙토코쿠스 spp., 및 기타 클로스트리듐 spp 에 의한 감염이 포함된다. 더욱 구체적으로는, 감염은 그람-양성 구균에 의해, 또는 약물 내성 그람-양성 구균에 의해 야기될 수 있다. 예시적 그람-양성 구균은 제한 없이, S. aureus, S. epidermidis, S. pneumoniae, S. pyogenes, M. catarrhalis, C. difficile, H. pylori, Chlamydia spp., 및 Enterococcus spp 이다.
균혈증은 그람-양성 또는 그람-양성 박테리아에 의해 야기될 수 있다. 그람-음성 박테리아는 단일 층의 펩티도글리칸으로 이루어진 얇은 벽 세포 막 및 지질다당류, 지단백질, 및 인지질의 외부 막을 갖는다. 예시적 그람-음성 유기체에는 에스케리시아 (Escherichia), 시겔라 (Shigella), 에드워드시엘라 (Edwardsiella), 살모넬라 (Salmonella), 시트로박테르 (Citrobacter), 클렙시엘라 (Klebsiella), 엔테로박테르 (Enterobacter), 하프니아 (Hafnia), 세라티아 (Serratia), 프로테우스 (Proteus), 모르가넬라 (Morganella), 프로비덴시아 (Providencia), 예르시니아 (Yersinia), 에르비니아 (Erwinia), 부틀라우셀라 (Buttlauxella), 세데세아 (Cedecea), 에빈겔라 (Ewingella), 클루이베라 (Kluyvera), 타투멜라 (Tatumella) 및 라넬라 (Rahnella) 로 이루어진 엔테로박테리아세아가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 엔테로박테리아세아 과 (family) 가 아닌 기타 예시적 그람-음성 유기체에는 하기가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다: 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스테노트로포모나스 말토필리아 (Stenotrophomonas maltophilia), 부르콜데리아 (Burkholderia), 세파시아 (Cepacia), 카르데네렐라 (Gardenerella), 바지날리스 (Vaginalis) 및 아시네토박테르 (Acinetobacter) 종. 그람-양성 박테리아는 다수 층의 펩티도글리칸으로 이루어진 두꺼운 세포 막 및 테이코산의 외부 층을 갖는다. 예시적 그람-양성 유기체에는 황색 포도상구균, 코아귤라제-음성 스타필로코시, 스트렙토코스, 엔테로코시, 코리네박테리아, 및 바실러스 (Bacillus) 종이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
하나의 구현예에서, 표적된 작용제는 통상적 요법에 내성이고, 예를 들어, 항생제에 내성이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 검정법의 수행에 있어서, 작용제는 예를 들어, 2 특이적 화합물의 투여 전, 그와 동시에 또는 그 후 유전자도입 동물에 투여된다.
본 발명의 2 특이적 화합물, 또는 그의 임의의 부분은 그의 반감기를 향상시키기 위해 변형될 수 있다. 펩티드 유사체는 주형 펩티드의 것과 유사한 특성을 갖는 비-펩티드 약물로서 제약 산업에서 통상적으로 사용된다. 상기 유형의 비-펩티드 화합물은 "펩티드 모방" 또는 "펩티드모방성" 으로 불리며 (Fauchere, Adv. Drug Res. 15: 29, 1986; Veber et al, TINS p.392, 1985; 및 Evans et al, J. Med. Chem 30: 1229, 1987, 이들은 본원에 참조로서 인용됨), 컴퓨터 계산된 분자 모델링의 도움으로 통상적으로 개발된다. 치료적으로 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모방은 동등한 치료적 또는 예방적 효과를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 펩티드모방성은 패러다임 폴리펩티드 (즉, 생물학적 또는 약물학적 활성을 갖는 폴리펩티드), 예컨대 항원 폴리펩티드와 구조적으로 유사하나, 당업계에 공지되고 하기 참조에 추가 기재된 방법에 의해 -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis 및 trans), -COCH2-, - CH(OH)CH2-, 및 -CH2SO- 로 이루어진 군으로부터 선택된 연결에 의해 임의로 대체된 하나 이상의 펩티드 연결을 갖는다: Spatola, A. F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins Weinstein, B., ed., Marcel Dekker, New York, p. 267, 1983; Spatola, A. F., Vega Data, Vol. 1, Issue 3, "Peptide Backbone Modifications," 1983; Morley, Trends. Pharm. Sci. pp.463-468, 1980; Hudson et al., Int. J. Pept. Prot. Res. 14: 177-185, 1979 (-CH2NH-, CH2CH2-); Spatola et al, Life. Sci. 38: 1243-1249, 1986 (-CH2-S); Hann, J. Chem. Soc. Perkin. Trans. 1: 307-314, 1982 (--CH-CH-, cis 및 trans); Almquist et al., J. Med. Chem. 23: 1392-1398, 1980 (-COCH2-); Jennings-White et al., Tetrahedron Lett. 23: 2533, 1982 (-COCH2-); Szelke et al., European Patent Application No. EP 45665 CA: 97: 39405, 1982 (-CH(OH)CH2-); Holladay et al., Tetrahedron. Lett. 24: 4401-4404, 1983 (-C(OH)CH2-); 및 Hruby, Life Sci. 31: 189-199, 1982 (-CH2-S-); 이들 각각은 본원에 참조로서 인용된다. 특히 바람직한 비-펩티드 연결은 -CH2NH- 이다. 이러한 펩티드 모방은 예를 들어, 더욱 경제적인 제조, 더욱 큰 화학적 안정성, 향상된 약물학적 특성 (반감기, 흡수, 잠재성, 효능 등), 변경된 특이성 (예, 생물학적 활성의 넓은 스펙트럼), 감소된 항원성, 및 기타를 포함하는 폴리펩티드 구현예에 대해 유의한 장점을 가질 수 있다. 펩티드모방성의 표지화는 통상적으로 정량적 구조-활성 데이터 및/또는 분자 모델링에 의해 예측되는 펩티드모방성 상의 비-간섭 위치(들) 에 대해 직접적으로 또는 스페이서 (예, 아미드 기) 를 통한 하나 이상의 표지의 공유 결합을 포함한다. 이러한 비-간섭 위치는 일반적으로 펩티드모방성이 치료 효과를 생성하기 위해 결합되는 거대분자(들) 과 직접 접촉을 형성하지 않는 위치이다. 펩티드모방성의 유도체화 (예, 표지화) 는 펩티드모방성의 바람직한 생물학적 또는 약물학적 활성을 실질적으로 방해하지 않아야만 한다.
아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산의 동일한 유형의 D-아미노산으로의 체계적인 치환 (예, L-라이신 대신에 D-라이신) 을 더욱 안정한 펩티드를 발생시키기 위해 사용할 수 있다. 또한, 강요된 펩티드를 예를 들어, 펩티드를 고리화시키는 분자내 디술피드 다리를 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 첨가하여, 당업계에 공지된 방법 (Rizo et al., Annu. Rev. Biochem. 61: 387, 1992, 본원에 참조로서 인용됨) 에 의해 발생시킬 수 있다.
이러한 변형된 폴리펩티드는 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 생성될 수 있다. 대안적으로는, 이러한 펩티드는 화학적 방법에 의해 합성될 수 있다. 재조합 숙주 중의 이종 폴리펩티드의 발현 방법, 폴리펩티드의 화학적 합성, 및 시험관 내 번역은 당업계에 잘 공지되어 있고, 하기에 추가로 기재된다 (Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N. Y., 1989; Berger et al, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 91: 501, 1969; Chaiken, CRC Crit. Rev. Biochem. 11: 255, 1981; Kaiser et al, Science 243: 187, 1989; Merrifield, Science 232: 342, 1986; Kent, Annu. Rev. Biochem. 57: 957, 1988; 및 Offord, Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing, 1980, 이는 본원에 참조로서 인용된다).
폴리펩티드는 전형적으로는 직접 화학적 합성에 의해 제조될 수 있고, 헤테로중합체의 결합 부분으로서 사용된다. 펩티드는 N-말단 및/또는 C-말단에 공유 연결에 의해 부착된 비펩티드 부분을 가진, 변형된 펩티드로서 제조될 수 있다. 특정 바람직한 구현예에서, 카르복시-말단 또는 아미노-말단, 또는 모두는 화학적으로 변형된다. 말단 아미노 및 카르복실기의 가장 흔한 변형은 각각 아세틸화 및 아미드화이다. 아미노-말단 변형, 예컨대 아실화 (예를 들어, 아세틸화) 또는 알킬화 (예를 들어, 메틸화) 및 카르복시-말단 변형, 예컨대 아미드화 뿐 아니라, 고리화를 포함하는 기타 말단 변형은 시험 화합물의 다양한 구현예 내에 혼입될 수 있다. 중심 서열에 대한 특정 아미노-말단 및/또는 카르복시-말단 변형 및/또는 펩티드 확장은 유리한 물리적, 화학적, 생화학적 및 약물학적 특성, 예컨대 향상된 안정성, 증가된 잠재성 및/또는 효능, 혈청 프로테아제에 대한 내성, 바람직한 약동학적 특성 및 기타를 제공할 수 있다.
유전자도입 동물의 구축
하나의 양상에서, 본 발명은 그의 게놈이 비-인간 또는 인간 TLR2 유전자 또는 Scd1 유전자가 동물의 대식세포에서 기능적으로 발현되거나, 비-인간 또는 인간 TLR2 또는 Scd1 이 동물의 대식세포에서 기능 돌연변이의 획득하도록, 프로모터에 작동가능하게 연결된 TLR2 또는 Scd1 을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 동물을 제공한다. 본 발명은 추가로 동물의 대식세포 중의 비-인간 또는 인간 TLR2 또는 Scd1 을 발현하는 유전자도입 비-인간 동물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서 사용되는 유전자도입 동물은 예를 들어, 포유동물, 새, 파충류 또는 양서류일 수 있다. 본원에 기재된 용도를 위한 적합한 포유동물에는 설치류; 반추동물; 유제동물; 길들인 포유동물; 및 낙농 동물이 포함된다. 바람직한 동물에는 설치류, 염소, 양, 낙타, 소, 돼지, 말, 황소, 라마, 닭, 오리 및 칠면조가 포함된다. 바람직한 구현예에서, 비-인간 동물은 마우스이다.
유전자도입 동물의 다양한 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Watson, et al, "The Introduction of Foreign Genes Into Mice," in Recombinant DNA, 2d Ed., W. H. Freeman & Co., New York, pp. 255-272, 1992; Gordon, Intl. Rev. Cytol. 115: 171-229, 1989; Jaenisch, Science 240: 1468-1474, 1989; Rossant, Neuron 2: 323-334, 1990 참조). 유전자도입 돼지의 제조를 위한 예시적 프로토콜은 White and Yannoutsos, Current Topics in Complement Research: 64th Forum in Immunology, pp. 88-94; 미국 특허 제 5,523,226 호; 미국 특허 제 5,573,933 호; PCT 출원 WO93/25071; 및 PCT 출원 WO95/04744 에서 발견할 수 있다. 유전자도입 래트의 제조를 위한 예시적 프로토콜은 Bader et al, Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, Supp. 3: S81-S87, 1996 에서 발견할 수 있다. 유전자도입 소의 제조를 위한 예시적 프로토콜은 Transgenic Animal Technology, A Handbook, 1994, ed., Carl A. Pinkert, Academic Press, Inc 에서 발견할 수 있다. 유전자도입 양의 제조를 위한 예시적 프로토콜은 Transgenic Animal Technology, A Handbook, 1994, ed., Carl A. Pinkert, Academic Press, Inc 에서 발견할 수 있다. 여러 예시적 방법은 하기에 더욱 자세히 언급된다.
A. 전핵 내로의 주사
유전자도입 동물은 본 발명에 따른 핵산 구축물을 알 세포 내에 도입하여 제조할 수 있다. 결과 알 세포를 정상적인 태아 발달을 위해 암컷의 자궁 내에 이식한 다음, 발달시키고 이식유전자 (transgene) 를 갖는 동물을 이식유전자에 대한 이종접합체를 제조하기 위해 역교배시킨다. 다양한 발달 단계의 배아 표적 세포를 본 발명의 이식유전자를 도입하기 위해 사용한다. 상이한 방법을 배아 표적 세포(들) 의 발달 단계에 따라 사용한다. 이식유전자 도입의 예시적 방법에는 수정란 또는 접합체의 마이크로주사 (Brinster et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438-4442, 1985), 및 바이러스성 통합 (Jaenisch, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 1260-1264, 1976; Jahner et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6927-6931, 1985; Van der Putten et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6148-6152, 1985) 이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 배아 조작 및 마이크로주사를 위한 절차는 예를 들어, Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY., 1986, 이의 내용이 본원에 참조로서 인용됨) 에 기재되어 있다. 유사한 방법이 다른 유전자도입 동물의 제조를 위해 사용된다.
예시적 구현예에서, 유전자도입 마우스의 제조는 하기 단계를 사용한다. 명확한 근친교배 유전적 배경의 수컷 및 암컷 마우스를 교배시킨다. 교배된 암컷 마우스는 여포 성장을 유도하기 위해 임신한 암말 혈청 PMS, 및 배란을 유도하기 위해 인간 융모생식샘 자극호르몬, hCG 로 미리 처리한다. 교배 후, 암컷을 희생시키고, 수정란을 난관으로부터 제거한다. 이때, 전핵은 아직 융합되지 않았고, 이들을 광학 현미경을 사용하여 가시화하는 것이 가능하다. 대안적인 프로토콜에서, 배아는 다양한 발달 단계에서 수확될 수 있고, 예를 들어, 포배를 수확할 수 있다. 배아는 Dulbecco's 변형 인산염 완충 식염수 (DPBS) 로 회수되고, 10% 우태 혈청이 보충된 Dulbecco's 변형 필수 배지 (DMEM) 에서 유지된다.
그 다음 외부 DNA 또는 재조합 구축물 (예를 들어, TLR2 또는 Scd1 발현 구축물) 을 전핵 내에 마이크로주사한다 (알 당 100 내지 1000 개 분자). 발현 구축물의 마이크로주사는 현미경에 부착된 표준 마이크로 조작기를 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 배아는 마이크로주사되는 동안 오일 하에서 전형적으로는 DPBS 100 마이크로리터 방울 내에 유지된다. DNA 용액은 수컷 전핵 내로 마이크로주사된다. 성공적인 주사는 전핵의 팽윤에 의해 모니터링된다. 그 후 곧, 전핵의 융합 (암컷 전핵 및 수컷 전핵) 이 일부 경우에서 발생하고, 외부 DNA 는 (통상적으로) 수정란 또는 접합체의 하나의 염색체 내에 삽입된다. 하기 언급되는 바와 같이 제조된 재조합 ES 세포는 유사한 기술을 사용하여 포배 내에 주사될 수 있다.
B. 배아 줄기 세포
유전자도입 마우스의 또다른 제조 방법에서, 본 발명의 재조합 DNA 분자는 마우스 배아 줄기 (ES) 세포 내로 도입될 수 있다. 그 다음 결과 재조합 ES 세포는 이전 서브섹션에서 언급된 것들과 유사한 기술을 사용하여 마우스 포배 내로 마이크로주사된다.
ES 세포를 착상-전 배아로부터 수득하여, 시험관 내 배양시킨다 (Evans et al, Nature 292: 154-156, 1981; Bradley et al, Nature 309: 255-258, 1984; Gossler et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9065-9069, 1986; Robertson et al., Nature 322: 445-448, 1986). 표적 구축물의 생식선 전달을 야기하도록, 발달하는 배아의 생식선의 부분 내에 통합되고 일부가 될 수 있는 임의의 ES 세포주가 본원에서 사용하기에 적합하다. 예를 들어, ES 세포의 제조에 사용될 수 있는 마우스 주는 129J 주이다. 바람직한 ES 세포주는 쥣과 세포주 D3 (American Type Culture Collection catalog no. CRL 1934) 이다. ES 세포는 당업계에 공지되고 하기에 기재된 방법을 사용하여 DNA 삽입을 위해 배양되고 제조될 수 있다: Robertson, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. IRL Press, Washington, D.C., 1987, in Bradley et al., Current Topics in Devel. Biol. 20: 357-371, 1986 및 in Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1986 (이들의 내용은 본원에 참조로서 인용된다).
발현 구축물은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 본원에 그 내용이 참조로서 인용된 Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed., Cold Spring Harbor laboratory Press: 1989 에 기재된 방법들에 의해 ES 세포 내에 도입될 수 있다. 적합한 방법에는 전기천공, 마이크로주사, 및 칼슘 포스페이트 처리 방법이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. ES 세포 내로 도입되는 발현 구축물 (예를 들어, TLR2 또는 Scd1) 은 바람직하게는 선형이다. 선형화는 벡터 서열 내에만 있고 유전자 (예를 들어, TLR2 또는 Scd1 유전자) 내에 있지 않은 절단을 위해 선택된 적합한 제한 엔도뉴클레아제로 DNA 를 소화하여 달성할 수 있다.
발현 구축물의 도입 후, ES 세포를 구축물의 존재에 대해 스크리닝한다. 세포를 다양한 방법을 사용하여 스크리닝할 수 있다. 마커 유전자가 구축물 내에 사용되는 경우, 동물의 세포를 마커 유전자의 존재에 대해 시험할 수 있다. 예를 들어, 마커 유전자가 항생제 내성 유전자인 경우, 세포를 다르게는 치명적 농도의 항생제 (예를 들어, neo 에 대해 선별하기 위한 G418) 의 존재하에서 배양할 수 있다. 살아남는 이들 세포는 아마도 이식유전자 구축물에 통합되었을 것이다. 마커 유전자가 활성을 검출할 수 있는 효소를 코딩하는 유전자인 경우 (예, 베타-갈락토시다제), 효소 기질을 적합한 상태 하에서 세포에 첨가할 수 있고, 효소 활성을 분석할 수 있다. 대안적으로는, 또는 부가적으로는, ES 세포 게놈 DNA 를 직접 시험할 수 있다. 예를 들어, DNA 를 표준 방법을 사용하여 ES 세포로부터 추출할 수 있고, 그 다음 DNA 를 이식유전자에 특이적으로 혼성화하도록 고안된 탐침 또는 탐침들로 서던 블롯 (Southern blot) 상에서 탐침할 수 있다. 게놈 DNA 는 또한 표적화 구축물을 함유하는 이들 세포만이 적합한 크기의 DNA 단편을 발생시키도록, 이식유전자의 특정 크기 및 서열의 DNA 단편을 증폭시키기 위해 특이적으로 고안된 탐침으로 PCR 에 의해 증폭될 수 있다.
C. 이식
본 발명의 재조합 핵산 분자 (예를 들어, TLR2 또는 Scd1) 를 품고 있는 접합체는 정관절제된 수컷과 미리 교배되어 수득된 가-임신 암컷 마우스 내로 이식된다. 일반적 프로토콜에서, 수용자 암컷을 마취하고, 난관을 노출시키기 위해 허리근처 (paralumbar) 절제를 수행하고, 배아를 난관의 팽대 영역 내로 변형시킨다. 체벽을 봉합하고, 피부를 상처 클립으로 봉한다. 배아를 총 임신 주기 동안 발달시키고, 대리모는 잠재적으로 유전자도입 마우스를 분만한다. 최종적으로, 새롭게 태어난 마우스를 외부 또는 재조합 DNA 의 존재에 대해 시험한다. 주사된 알 중에서, 평균 10% 가 적합하게 발달하고 마우스를 생성한다. 태어난 마우스 중에서, 평균 4 분의 1 (25%) 이 전반적 효율 2.5% 로 유전자도입된다. 일단 상기 마우스가 사육되면, 이들은 마우스 염색체에 연결된 정상 (Mendelian) 방식으로 외부 유전자를 전달한다.
D. 유전자도입 구축물의 존재에 대한 스크리닝
유전자도입 동물은 표준 프로토콜에 의해 출생 후 확인될 수 있다. 꼬리 조직으로부터의 DNA 를 예를 들어, 서던 블롯 및/또는 PCR 을 사용하여 이식유전자 구축물의 존재에 대해 스크리닝할 수 있다. 그 다음 동질접합성 동물을 발생시키기 위해 이식유전자를 가진 것으로 여겨지는 경우, 모자이크인 것으로 보이는 자손을 서로 교차시킨다. 자손이 생식선 전달을 가질 것인지의 여부가 명확하지 않은 경우, 이들은 부모 또는 기타 주와 교차될 수 있고, 자손은 이종접합체성에 대해 스크리닝된다. 이종접합체는 서던 블롯 및/또는 DNA 의 PCR 증폭에 의해 확인된다. 그 다음 이종접합체는 동질접합성 유전자도입 자손을 발생시키기 위해 서로 교차시킬 수 있다. 동질접합체는 상기 교차의 생성물인 마우스, 뿐 아니라 공지된 이종접합체인 마우스 및 야생형 마우스로부터의 게놈 DNA 의 동등 량의 서던 블롯에 의해 확인될 수 있다. 서던 블롯을 스크리닝하기 위한 탐침은 인간 또는 비-인간 TLR2 또는 Scd1 유전자, 또는 마커 유전자, 또는 둘 다의 서열에 근거하여 고안될 수 있다.
유전자도입 자손의 확인 및 특성화의 기타 수단은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 웨스턴 블롯 (western blot) 은 유전자가 발현되는 곳에 도입된 유전자에 의해 코딩된 단백질 (예를 들어, 인간 또는 비-인간 TLR2 또는 Scd1 단백질) 에 대항하는 항체, 또는 마커 유전자 산물에 대항하는 항체로의 웨스턴 블롯을 탐침하여, 상기 자손의 다양한 조직 내에 도입된 유전자의 발현 수준을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
세포 고정 및 항체로의 표지화, 및/또는 자손으로부터의 다양한 세포, 예를 들어, 적혈구의 FACS (형광 활성화 세포 분류) 분석과 같은 제자리 분석을 이식유전자 산물의 존재 또는 부재를 찾기 위해 적합한 항체를 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 대식세포에서 TLR2 또는 Scd1 의 발현을 입증하기 위해, 유세포분석을 인간 TLR2 또는 Scd1 에 특이적인 항체를 사용하여 수행할 수 있고, 이것은 직접 공액되거나 형광발색단-공액되고, TLR2 또는 Scd1 에 대한 항체를 인지하는 2차 항체와 함께 사용된다. 상기 분석에서, 인간 적혈구는 양성 대조군으로서 사용될 수 있고, 정상 마우스 적혈구는 TLR2 또는 Scd1 의 존재에 대해 음성 대조군으로서 사용될 수 있다.
E. 복합적 이식유전자 또는 부가적 돌연변이를 함유하는 마우스
본원에 기재된 바와 같은 TLR2 또는 Scd1 을 발현하는 유전자도입 마우스는 a) 추가적 이식유전자(들) 을 포함하거나, b) 다른 유전자 중에 돌연변이를 함유하는 마우스와 교차될 수 있다. 각각의 돌연변이에 대해 이종접합성 또는 동질접합성인 마우스는 표준 교차번식 (crossbreeding) 절차를 사용하여 발생 및 유지될 수 있다. TLR2 또는 Scd1 이식유전자를 함유하는 마우스와 사육될 수 있는 마우스의 예에는 자가면역 질환에 더욱 걸리기 쉬운 마우스 주, 예컨대 루푸스에 대한 모델인 마우스 주, 예를 들어, 마우스 주 NZB/V, MRL+ 또는 SJL 이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 추가로 유전자도입 동물로부터 유래된 세포에 관한 것이다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 특정 변형이 일어날 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실, 부모 세포와 동일하지 않을 수 있으나, 여전히 본원에 사용된 바와 같은 용어의 범주 내에 포함된다.
재조합 핵산 기술
본 발명의 실시에 사용되는 핵산 (RNA, iRNA, 안티센스 핵산, cDNA, 게놈 DNA, 벡터, 바이러스 또는 그의 잡종) 은 유전적으로 조작된, 증폭된 및/또는 재조합적으로 발현된/발생된 다양한 공급원으로부터 단리될 수 있다. 상기 핵산으로부터 생성된 재조합 폴리펩티드는 개별적으로 단리 또는 클로닝 및 바람직한 활성에 대해 시험될 수 있다. 임의의 재조합 발현 시스템은 박테리아, 포유류, 효모, 곤충 또는 식물 세포 발현 시스템을 포함하여 사용할 수 있다.
대안적으로는, 상기 핵산은 예를 들어, Adams, J. Am. Chem. Soc. 105: 661, 1983; Belousov, Nucleic Acids Res. 25: 3440-3444, 1997; Frenkel, Free Radic. Biol. Med. 19: 373-380, 1995; Blommers, Biochemistry 33: 7886-7896, 1994; Narang, Meth. Enzymol. 68: 90, 1979; Brown Meth. Enzymol. 68: 109, 1979; Beaucage, Tetra. Lett. 22: 1859, 1981; 미국 특허 제 4,458,066 호에 기재된 바와 같이, 잘 공지된 화학적 합성 기술에 의해 시험관 내 합성될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 서열, 예를 들어, 본 발명의 예시적 서열의 서브서열 (subsequence) 을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 올리고뉴클레오티에는 예를 들어, 화학적으로 합성될 수 있는 단일 사슬 폴리-데옥시뉴클레오티드 또는 2 개의 상보적 폴리데옥시뉴클레오티드 가닥이 포함될 수 있다.
핵산 조작을 위한 기술, 예컨대, 예를 들어, 서브클로닝 (subcloning), 표지화 탐침 (예를 들어, Klenow 폴리머라아제를 사용하는 랜덤-프라이머 표지화, 틈 번역, 증폭), 서열분석, 혼성화 등이 과학적 및 특허 문헌에 잘 기재되어 있고, 예를 들어, Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), VoIs. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York, 1997; LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N. Y., 1993 을 참조한다.
핵산, 벡터, 캡시드, 폴리펩티드, 등을 당업자에게 잘 공지된 다수의 일반적 수단 중 임의의 것에 의해 분석 및 정량화할 수 있다. 이들에는 예를 들어, 분석적 생화학 방법, 예컨대 NMR, 분광광도법, 방사선촬영술, 전기영동, 모세관 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 박층 크로마토그래피 (TLC), 및 과확산 (hyperdiffusion) 크로마토그래피, 다양한 면역학적 방법, 예를 들어, 유액 또는 젤 침강소 반응, 면역확산, 면역-전기영동, 방사능면역검정법 (RIA), 효소-연결 면역흡착 검정법 (ELISA), 면역-형광 검정법, 서던 분석, 노던 분석, 닷-블롯 분석, 젤 전기영동 (예, SDS-PAGE), 핵산 또는 표적 또는 신호 증폭 방법, 방사능표지화, 섬광 계수 및 친화 크로마토그래피가 포함된다.
본 발명의 방법을 실시하기 위해 사용된 핵산의 수득 및 조작은 게놈 샘플로부터 클로닝하고, 원한다면, 예를 들어, 게놈 클론 또는 cDNA 클론으로부터 단리 또는 증폭된 삽입물을 스크리닝 및 재-클로닝하여 수행할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 핵산 공급원에는 예를 들어, 포유류 인공 염색체 (MAC), 예를 들어, 미국 특허 제 5,721,118 호; 제 6,025,155 호 참조; 인간 인공 염색체, 예를 들어, Rosenfeld, Nat. Genet. 15: 333-335, 1997 참조; 효모 인공 염색체 (YAC); 박테리아 인공 염색체 (BAC); P1 인공 염색체, 예를 들어, Woon, Genomics 50: 306-316, 1998 참조; P1-유래 벡터 (PAC), 예를 들어, Kern, Biotechniques 23: 120-124, 1997 참조; 코스미드, 재조합 바이러스, 파지 또는 플라스미드에 함유된 게놈 또는 cDNA 라이브러리가 포함된다.
본 발명은 융합 단백질 및 이들을 코딩하는 핵산을 제공한다. Scd1 유전자 산물 또는 톨-유사 수용체 2 폴리펩티드는 예컨대 안정성을 증가시키거나 정제를 간단히 하는 바람직한 특성을 부여하는 N-말단 확인 펩티드와 같은 이종 펩티드 또는 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드는 또한 항체 및 항체-발현 B 세포 등을 확인 및 단리하기 위한 재조합적으로 합성된 펩티드를 더욱 쉽게 단리하기 위해 예를 들어, 더욱 면역원성인 펩티드를 제조하기 위해 그에 연결된 하나 이상의 추가적 도메인을 갖는 융합 단백질로서 합성 및 발현될 수 있다. 검출 및 정제를 용이하게 하는 도메인에는 예를 들어, 금속 킬레이트 펩티드, 예컨대 고정된 금속 상의 정제를 가능하게 하는 폴리히스티딘 트랙 및 히스티딘-트립토판 모듈, 고정된 면역글로불린 상의 정제를 가능하게 하는 단백질 A 도메인, 및 FLAGS 확장/친화성 정제 시스템에서 이용되는 도메인 (Immunex Corp, Seattle Wash.) 이 포함된다. 정제 도메인과 모티프-포함 펩티드 또는 폴리펩티드 사이의 인자 Xa 또는 엔테로키나아제 (Invitrogen, San Diego Calif.) 와 같은 분할가능 연결자 서열의 포함은 정제를 용이하게 한다. 예를 들어, 발현 벡터에는 티오레독신 및 엔테로키나아제 분할 부위 다음의 6 개의 히스티딘 잔기에 연결된 에피토프-코딩 핵산 서열이 포함될 수 있다 (예를 들어, Williams, Biochemistry 34: 1787-1797, 1995; Dobeli, Protein Expr. Purif 12: 404-414, 1998 참조). 히스티딘 잔기는 검출 및 정제를 용이하게 하며, 엔테로키나아제 분할 부위는 융합 단백질의 잔여부분으로부터 에피토프를 정제하기 위한 수단을 제공한다. 하나의 양상에서, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 번역된 폴리펩티드 또는 그의 단편의 직접 분비를 가능하게 하는 선도 서열과 함께 적합한 상으로 조합된다. 융합 단백질을 코딩하는 벡터에 속한 기술 및 융합 단백질의 적용은 과학적 및 특허 문헌에 잘 기재되어 있고, 예를 들어, Kroll, DNA Cell. Biol. 12: 441-53, 1993 을 참조한다.
A. 전사 조절 요소
본 발명의 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 프로모터는 핵산의 전사를 지도하는 핵산 조절 서열의 어레이 또는 하나의 모티프일 수 있다. 프로모터에는 전사의 시작 위치 부근에 필요한 핵산 서열, 예컨대, 폴리머라아제 II 유형 프로모터의 경우 TATA 요소가 포함될 수 있다. 프로모터에는 또한 임의로 전사의 시작 위치로부터 수 천 개의 염기 쌍만큼 위치할 수 있는 말단 향상인자 또는 억제인자 요소가 포함된다. "구조적" 프로모터는 대부분의 환경 및 발달 상태 하에서 활성인 프로모터이다. "유도성" 프로모터는 환경 또는 발달 조절 하의 프로모터이다. "조직 특이적" 프로모터는 유기체의 특정 조직 유형에서 활성이나, 동일한 유기체로부터의 기타 조직 유형에서는 활성이지 않다. 용어 "작동가능하게 연결된" 은 핵산 발현 조절 서열 (예컨대, 프로모터, 또는 전사 인자 결합 부위의 어레이) 과 두 번째 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 말하고, 여기서 발현 조절 서열은 두번째 서열에 상응하는 핵산의 전사를 지도한다.
B. 발현 벡터 및 클로닝 비히클
본 발명은 본 발명의 핵산, 예를 들어, 본 발명의 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 발현 벡터 및 클로닝 비히클을 제공한다. 본 발명의 발현 벡터 및 클로닝 비히클은 바이러스성 입자, 배큘로바이러스, 파지, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 포스미드, 박테리아 인공 염색체, 바이러스성 DNA (예를 들어, 우두, 아데노바이러스, 수두 바이러스, 광견병 및 SV40 의 유도체), P1-기재 인공 염색체, 효모 플라스미드, 효모 인공 염색체, 및 관심의 특이적 숙주 (예컨대, 바실러스, 아스페르길루스 및 효모) 에 특이적인 임의의 기타 벡터를 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터에는 염색체, 비-염색체 및 합성 DNA 서열이 포함될 수 있다. 다수의 적합한 벡터가 당업자에게 공지되어 있고 시판된다.
본 발명의 핵산은 원한다면 통상적 분자생물학 방법을 사용하여 다양한 벡터 중 임의의 것 내에 클로닝될 수 있다; 시험관 내 증폭된 핵산의 클로닝 방법은 예를 들어, 미국 특허 제 5,426,039 호에 기재되어 있다. 증폭된 서열의 클로닝을 용이하게 하기 위해, 제한 효소 부위는 PCR 프라이머 쌍 "내에 구축" 될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 및 펩티드를 코딩하는 발현 벡터의 라이브러리를 제공한다. 상기 핵산은 게놈 내에 또는 세포의 세포질 또는 핵 내에 도입되고, 과학적 및 특허 문헌에 잘 기재되어 있는 다양한 통상적인 기술에 의해 발현될 수 있다. 예를 들어, Roberts, Nature 328: 731, 1987; Schneider, Protein Expr. Purif. 6435: 10, 1995; Sambrook, Tijssen 또는 Ausubel 를 참조한다. 벡터는 이러한 공급원, 예컨대 ATCC 또는 GenBank 라이브러리로부터 수득된 천연 공급원으로부터 단리되거나, 합성 또는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵산은 세포 내에서 안정적으로 또는 일시적으로 발현되는 발현 카세트, 벡터 또는 바이러스에서 발현될 수 있다 (예, 에피좀성 발현 시스템). 선별 마커는 형질전환된 세포 및 서열 상에 선별가능한 표현형을 수여하기 위해 발현 카세트 및 벡터 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 선별 마커는 숙주 게놈 내로 통합이 필요하지 않은 것처럼 에피좀성 유지 및 복제에 대해 코딩될 수 있다.
하나의 양상에서, 본 발명의 핵산은 본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드의 제자리 발현을 위해 생체 내에서 투여된다. 핵산은 "노출 DNA" (예를 들어, 미국 특허 제 5,580,859 호 참조) 로서 또는 발현 벡터, 예를 들어, 재조합 바이러스의 형태로 투여될 수 있다. 핵산은 하기 기재되는 바와 같이, 주변- 또는 내부-종양성을 포함하여, 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 생체 내 투여되는 벡터는 바람직하게는 배큘로비리디아에 (baculoviridiae), 파르보비리디아에 (parvoviridiae), 피코르노비리디아에 (picornoviridiae), 헤르페스베리디아에 (herpesveridiae), 폭시이리다에 (poxyiridae), 아데노비리디아에 (adenoviridiae), 또는 피코르나비리디아에 (picornnaviridiae) 로부터 선택되는 재조합적으로 변형된 외피보유 또는 비-외피보유 DNA 및 RNA 바이러스를 포함하는 바이러스성 게놈으로부터 유도될 수 있다. 키메라성 벡터는 또한 각각의 모 벡터 특성의 유리한 장점을 활용하도록 사용할 수 있다 (예를 들어, Feng, Nature Biotechnology 15: 866-870, 1997 참조). 이러한 바이러스 게놈은 본 발명의 핵산을 포함하도록 재조합 DNA 기술에 의해 변형될 수 있고; 복제 결핍인, 조건적으로 복제되는 또는 복제 가능한 것으로 추가 조작될 수 있다. 대안적인 양상에서, 벡터는 아데노바이러스 (예, 인간 아데노바이러스 게놈으로부터 유래된 복제 불능 벡터, 예를 들어, 미국 특허 제 6,096,718 호; 제 6,110,458 호; 제 6,113,913 호; 제 5,631,236 호 참조); 아데노-관련 바이러스 및 레트로바이러스 게놈으로부터 유래된다. 레트로바이러스 벡터에는 쥣과 백혈병 바이러스 (MuLV), 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스 (GaLV), 원숭이 면역 결핍 바이러스 (SIV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 및 이의 조합에 근거한 것들이 포함될 수 있다; 예를 들어, 미국 특허 제 6,117,681 호; 제 6,107,478 호; 제 5,658,775 호; 제 5,449,614 호; Buchscher, J. Virol. 66: 2731-2739, 1992; Johann, J. Virol. 66: 1635-1640, 1992) 참조. 아데노-관련 바이러스 (AAV)-기재 벡터는, 예를 들어, 핵산 및 펩티드의 시험관 내 제조, 및 생체 내 및 생체 외 유전자 요법 절차에서 표적 핵산으로 세포를 자가면역 (adioimmun) 시키기 위해 사용될 수 있다; 예를 들어, 미국 특허 제 6,110,456 호; 제 5,474,935 호; Okada, Gene Ther. 3: 957-964, 1996 참조.
본원에서 사용되는 바와 같은 "발현 카세트" 는 이러한 서열과 양립할 수 있는 숙주 내의 구조적 유전자 (즉, 서열 코딩 단백질, 예컨대 본 발명의 폴리펩티드) 의 발현에 영향을 줄 수 있는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 발현 카세트에는 서열, 및 임의로, 기타 서열 예를 들어, 전사 종결 신호를 코딩하는 폴리펩티드와 작동가능하게 연결된 프로모터가 적어도 포함된다. 발현에 영향을 주는데 필요한 또는 도움을 주는 추가 인자는 예를 들어, 향상인자를 사용할 수 있다.
핵산은 또다른 핵산 서열과의 기능적 관계 내에 위치하는 경우 "작동가능하게 연결된다". 예를 들어, 프로모터 또는 향상인자는 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 전사 조절 서열과 관련해, 작동가능하게 연결되는 것은 연결된 DNA 서열이 인접하고, 2 개의 단백질 코딩 영역을 연결하기 위해 필요한 경우, 인접하고 해독 프레임 내에 있는 것을 의미한다. 스위치 서열에 대해, 작동가능하게 연결되는 것은 스위치 재조합에 영향을 줄 수 있다는 것을 나타낸다. 그러므로, 발현 카세트에는 또한 플라스미드, 발현 벡터, 재조합 바이러스, 재조합 "노출 DNA" 벡터의 임의의 형태, 등이 포함된다.
"벡터" 는 연결된 또다른 핵산을 이송할 수 있는 핵산 분자를 말하는 것으로 의도된다. 하나의 유형의 벡터는 "플라스미드" 이고, 이것은 부가적 DNA 분절이 라이게이션될 수 있는 환형 2중 가닥 DNA 루프를 말한다. 또다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터로서, 여기서 부가적 DNA 분절은 바이러스 게놈 내에 라이게이션될 수 있다. 특정 벡터는 도입되는 숙주 세포 내에서 자발적 복제가 가능하다 (예, 복제의 박테리아 기원을 갖는 박테리아 벡터 및 에피좀성 포유류 벡터). 기타 벡터 (예, 비-에피좀성 포유류 벡터) 는 숙주 세포 내로 도입시 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어, 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 게다가, 특정 벡터는 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지도할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 단순히, "발현 벡터") 로서 언급된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터" 는 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 벡터의 형태이기 때문에 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 이러한 기타 형태의 발현 벡터, 예컨대 바이러스 벡터 (예, 복제 결핍 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스) 가 포함되는 것으로 의도되고, 이것은 동등한 기능을 담당한다.
C. 숙주 세포 및 형질전환된 세포
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 서열, 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 서열, 또는 본 발명의 벡터를 포함하는 형질전환된 세포를 제공한다. 숙주 세포는 원핵 세포, 진핵 세포, 예컨대 박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포, 포유류 세포, 곤충 세포, 또는 식물 세포를 포함하여, 당업자에게 친숙한 숙주 세포 중 임의의 것일 수 있다. 예시적 박테리아 세포에는 E. coli, 스트렙토마이세스, 바실러스 서브틸리스, 살모넬라 티피뮤리움 및, 수도모나스, 스트렙토마이세스, 및 스타필로코쿠스 속에 포함되는 다양한 종이 포함된다. 예시적 곤충 세포에는 Drosophila S2 및 Spodoptera Sf9 가 포함된다. 예시적 동물 세포에는 CHO, COS 또는 Bowes 흑색종 또는 임의의 마우스 또는 인간 세포주가 포함된다. 적합한 숙주의 선별은 당업자의 능력 내에 있다.
벡터는 형질전환, 트랜스펙션, 형질도입, 바이러스 감염, 유전자 건 (gun), 또는 Ti-매개 유전자 전달을 포함하는 다양한 기술 중 임의의 것을 사용하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 특정 방법에는 칼슘 포스페이트 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 리포펙션, 또는 전기천공이 포함된다.
조작된 숙주 세포는 프로모터를 활성화시키고, 형질전환체를 선별하거나 본 발명의 유전자를 증폭시키기에 적합하도록 변형된 통상의 영양 배지에서 배양할 수 있다. 적합한 숙주 균주의 형질전환 및 적합한 세포 밀도로의 숙주 균주의 성장 후, 선별된 프로모터는 적합한 수단 (예, 온도 전이 또는 화학적 유도) 에 의해 유도될 수 있고, 세포는 바람직한 폴리펩티드 또는 그의 단편을 제조하는 것을 가능하게 하는 추가 기간 동안 배양될 수 있다.
세포는 원심분리에 의해 수확되고, 물리 또는 화학적 수단에 의해 붕괴되고, 수득된 미정제 추출물은 추가 정제를 위해 보유될 수 있다. 단백질 발현을 위해 사용된 미생물 세포는 냉-해동 사이클, 초음파분쇄, 기계적 붕괴, 또는 세포 용해제의 사용을 포함하는, 임의의 통상적인 방법에 의해 붕괴될 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 발현된 폴리펩티드 또는 단편은 암모늄 술페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 필요하다면 단백질 재접힘 단계를 폴리펩티드의 원심분리를 완료하는데 사용할 수 있다. 바람직한 경우, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 를 최종 정제 단계를 위해 사용할 수 있다.
다양한 포유류 세포 배양 시스템은 또한 재조합 단백질을 발현하기 위해 사용될 수 있다. 포유류 발현 시스템의 예에는 원숭이 신장 섬유모세포의 COS-7 주 및 양립가능 벡터로부터 단백질을 발현할 수 있는 기타 세포주, 예컨대 C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주가 포함된다.
숙주 세포 중의 구죽물은 재조합 서열에 의해 코딩되는 유전자 산물을 제조하기 위해 통상적인 방식으로 사용할 수 있다. 재조합 제조 절차에 사용되는 숙주에 따라, 벡터를 함유하는 숙주 세포에 의해 제조된 폴리펩티드가 글리코실화될 수 있거나 비-글리코실화될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드에는 최초 메티오닌 아미노산 잔기가 포함될 수 있거나 포함될 수 없다.
무-세포 번역 시스템은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용할 수 있다. 무-세포 번역 시스템은 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 DNA 구축물로부터 전사된 mRNA 를 사용할 수 있다. 일부 양상에서, DNA 구축물은 시험관 내 전사 반응을 수행하기 전에 선형화될 수 있다. 그 다음 전사된 mRNA 는 적합한 무-세포 번역 추출물, 예컨대 토끼 망상적혈구 추출물과 함께 인큐베이션시켜, 바람직한 폴리펩티드 또는 그의 단편을 제조한다.
발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포의 선별을 위한 표현형 특성, 예컨대 디히드로폴레이트 환원효소 또는 진핵 세포 배양물에 대한 네오마이신 내성, 또는 예컨대 E. coli 에서 테트라사이클린 또는 암피실린 내성을 제공하기 위한 하나 이상의 선별가능 마커 유전자를 함유할 수 있다.
D. 핵산의 증폭
본 발명의 실시에서, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 또는 변형된 핵산을 예를 들어, 증폭에 의해 재생할 수 있다. 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 증폭시키기 위한 증폭 프라이머 서열 쌍, 예를 들어, Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 서열, 또는 그의 서브서열을 포함하는 핵산 서열을 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍을 제공한다.
증폭 방법에는 예를 들어, 폴리머라아제 연쇄 반응, PCR (PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, N. Y., 1990 및 PCR STRATEGIES, 1995, ed. Innis, Academic Press, Inc., N. Y.), 리가아제 연쇄 반응 (LCR) (예를 들어, Wu, Genomics 4: 560, 1989; Landegren, Science 241: 1077, 1988; Barringer, Gene 89: 117, 1990 참조); 전사 증폭 (예를 들어, Kwoh, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173, 1989 참조); 및, 자가-유지된 서열 복제 (예를 들어, Guatelli, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874, 1990 참조); Q-베타 레플리카아제 증폭 (예를 들어, Smith, J. Clin. Microbiol. 35: 1477-1491, 1997 참조), 자동화 Q-베타 레플리카아제 증폭 검정법 (예를 들어, Burg, Mol. Cell. Probes 10: 257-271, 1996 참조) 및 기타 RNA 폴리머라아제 매개 기술 (예를 들어, NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario) 이 포함된다; 또한 Berger, Methods Enzymol. 152: 307-316, 1987; Sambrook; Ausubel; 미국 특허 제 4,683,195 호 및 제 4,683,202 호; Sooknanan, Biotechnology 13: 563-564, 1995 를 참조한다.
E. 핵산의 혼성화
본 발명은 엄격한 조건 하에서 본 발명의 예시적 서열, 예를 들어, Scd1 서열 또는 톨-유사 수용체 2 서열, 또는 그의 임의의 상보체, 또는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 혼성화되는 단리된 또는 재조합 핵산을 제공한다. 대안적인 양상에서, 엄격한 조건은 당업계에 공지되고 본원에 기재된 바와 같은 고도로 엄격한 조건, 중간 엄격한 조건 또는 낮은 엄격한 조건이다. 상기 방법은 본 발명의 핵산을 단리하기 위해 사용될 수 있다.
대안적인 양상에서, 엄격한 조건 하에서 혼성화되는 그들의 능력에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 핵산은 본 발명의 핵산의 약 5 개의 잔기에서 전장까지일 수 있다; 예를 들어, 이들은 길이가 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800 또는 그 이상의 잔기 또는, 유전자 또는 코딩 서열의 전장, 예를 들어, cDNA 일 수 있다. 전장보다 짧은 핵산이 또한 포함된다. 상기 핵산은 예를 들어, 혼성화 탐침, 표지화 탐침, PCR 올리고뉴클레오티드 탐침, iRNA, 안티센스 또는 항체 결합 펩티드를 코딩하는 서열 (에피토프), 모티프, 활성 부위 등으로서 유용할 수 있다.
"선별적으로 (또는 특이적으로) 혼성화한다" 는 서열이 복합체 혼합물 (예, 총 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA) 에 존재하는 경우 엄격한 혼성화 조건 하에서의 특정 뉴클레오티드 서열에 대한 분자의 결합, 이중화 또는 혼성화를 말하며, 여기서 특정 뉴클레오티드 서열은 배경 약 10 배 이상으로 검출된다. 하나의 구현예에서, 핵산은 엄격한 조건하에서 다르게 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 측정된 (예컨대 본원에 기재된 예시적 서열) 핵산에 혼성화되는 그의 능력에 의해 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 측정될 수 있다.
"엄격한 혼성화 조건" 은 탐침이 그의 유의한 양 (양성 신호 (예, 본 발명의 핵산의 확인) 는 배경 혼성화의 약 10 배이다) 으로 그의 표적 서브서열에, 전형적으로는 핵산의 복합 혼합물에 혼성화되나, 다른 서열에는 혼성화되지 않을 조건을 말한다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고, 상이한 환경에서 상이할 것이다. 더 긴 서열이 더 높은 온도에서 특이적으로 혼성화된다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 지침은 예를 들어, Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), VoIs. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York, 1997; LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, PART I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N. Y., 1993 에서 발견된다.
일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 pH 에서 특정 서열에 대한 열 융점 I 보다 약 5 내지 10℃ 낮도록 선택된다. Tm 은 평형시 표적에 상보적인 탐침의 50% 가 표적 서열에 혼성화하는 (표적 서열은 Tm 에서 과량으로 존재하고, 평형에서 탐침의 50% 가 차지하므로) 온도이다 (정의된 이온 강도, pH, 및 핵 농도 하에서). 엄격한 조건은 pH 7.0 내지 8.3 에서 염 농도가 약 1.0 M 미만 나트륨 이온, 전형적으로는 약 0.01 내지 1.0 M 나트륨 이온 농도 (또는 기타 염) 이고, 온도가 짧은 탐침 (예, 10 내지 50 개의 뉴클레오티드) 에 대해 약 30℃ 이상 및 긴 탐침 (예, 50 개 초과의 뉴클레오티드) 에 대해 약 60℃ 이상인 조건일 것이다. 엄격한 조건은 또한 Sambrook (하기 언급됨) 에서 기재되는 바와 같은 불안정화제, 예컨대 포름아미드의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 높은 엄격성 혼성화를 위해, 양성 신호는 배경의 2 배 이상, 바람직하게는 배경 혼성화의 10 배이다. 예시적 높은 엄격성 또는 엄격한 혼성화 조건에는, 50% 포름아미드, 5x SSC 및 1% SDS, 42℃ 에서 인큐베이션 또는 5x SSC 및 1% SDS, 65℃ 에서 인큐베이션, 65℃ 에서 0.2x SSC 및 0.1% SDS 에서 세척하는 것이 포함된다. 선택적 또는 특이적 혼성화를 위해, 양성 신호 (예, 본 발명의 핵산의 확인) 는 배경 혼성화의 약 10 배이다. 본 발명의 범주 내의 핵산을 확인하기 위해 사용되는 엄격한 혼성화 조건에는 예를 들어, 42℃ 에서 50% 포름아미드, 5x SSC, 및 1% SDS 를 포함하는 완충액 중에서의 혼성화, 또는 65℃ 에서 5x SSC 및 1% SDS 를 포함하는 완충액 중에서의 혼성화, 모두의 65℃ 에서 0.2x SSC 및 0.1% SDS 의 세척이 포함된다. 본 발명에서, 본 발명의 핵산을 포함하는 게놈 DNA 또는 cDNA 는 본원에 기재된 핵산 서열을 사용하여 엄격한 조건 하에서 표준 서던 블롯에서 확인할 수 있다. 이러한 혼성화를 위한 부가적인 엄격한 조건 (본 발명의 범주 내의 핵산을 확인하기 위해) 은 37℃ 에서 40% 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS 의 완충액 중의 혼성화가 포함되는 조건이다.
그러나, 혼성화 포맷의 선택은 결정적이지 않다 - 핵산이 본 발명의 범주 내에 있는 지의 여부를 결정하는 조건은 언급된 세척 조건의 엄격함이다. 본 발명의 범주 내의 핵산을 확인하기 위해 사용된 세척 상태에는 예를 들어, pH 7 에서 약 0.02 몰의 염 농도 및 적어도 약 50℃ 또는 약 55℃ 내지 약 60℃ 의 온도; 또는, 약 15 분 동안 72℃ 에서 약 0.15 M NaCl 의 염 농도; 또는 약 15 내지 약 20 분 동안 적어도 약 50℃ 또는 약 55℃ 내지 약 60℃ 의 온도에서 약 0.2X SSC 의 염 농도; 또는 혼성화 복합체를 15 분 동안 실온에서 0.1% SDS 를 함유하는 약 2X SSC 의 염 농도의 용액으로 2 회 세척한 다음, 15 분 동안 68℃ 에서 0.1% SDS 를 함유하는 0.1X SSC 로 2 회 세척하는 것; 또는 동등한 상태가 포함된다. SSC 완충액 및 동등한 상태의 기재에 대해 Sambrook, Tijssen and Ausubel 을 참조한다.
F. 올리고뉴클레오티드 탐침 및 이의 사용 방법
본 발명은 또한 TLR2- 또는 Scd1-신호 활성의 조정제인 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 확인하기 위한 핵산 탐침을 제공한다. 하나의 양상에서, 탐침은 본 발명의 핵산의 10 개 이상의 연속 염기를 포함한다. 대안적으로는, 본 발명의 탐침은 적어도 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 150 또는 약 10 내지 50, 약 20 내지 60, 약 30 내지 70 의, 본 발명의 핵산에서 언급되는 서열의 연속 염기일 수 있다. 탐침은 결합 및/또는 혼성화에 의해 핵산을 확인한다. 탐침은 본 발명의 어레이에서 사용될 수 있고, 하기 기재를 참조한다. 본 발명의 탐침은 또한 기타 핵산 또는 폴리펩티드를 단리하기 위해 사용될 수 있다.
G. 서열 일치성 정도의 측정
본 발명은 Scd1 폴리뉴클레오티드 또는 톨-유사 수용체 2 폴리뉴클레오티드에 대해 서열 일치성을 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 갖는 핵산을 제공한다. 본 발명은 Scd1 단백질 또는 톨-유사 수용체 2 단백질에 대해 서열 일치성을 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 갖는 폴리펩티드를 제공한다. 서열 일치성은 서열 비교 알고리즘으로의 분석에 의해 또는 시각 검사에 의해 측정할 수 있다. 단백질 및/또는 핵산 서열 일치성 (상동성) 은 당업계에 공지된 다양한 서열 비교 알고리즘 및 프로그램 중 임의의 것을 사용하여 평가할 수 있다.
서열 비교를 위해, 전형적으로는 하나의 서열은 시험 서열을 비교하는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터 내에 입력하고, 서브서열 좌표를 지정하며, 필요한 경우 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 디폴트 프로그램 파라미터를 사용할 수 있거나, 대안적 파라미터를 지정할 수 있다. 그 다음 서열 비교 알고리즘으로 프로그램 파라미터에 근거해, 참조 서열에 대한 시험 서열에 대한 % 서열 일치성을 계산한다. 핵산 및 단백질의 서열 비교를 위해, BLAST 및 BLAST 2.2.2. 또는 FASTA 버전 3.0t78 알고리즘 및 하기 기재된 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 "비교 창" 에는, 2 개의 서열을 최적으로 정렬된 후, 서열을 동일한 수의 인접 위치의 참조 서열과 비교할 수 있는, 20 내지 600, 통상적으로 약 50 내지 약 200, 더욱 통상적으로 약 100 내지 약 150 개로 이루어진 군으로부터 선택된 인접 위치의 갯수 중 임의의 하나의 분절에 대한 참조가 포함된다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어, Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981 의 국부적 상동성 알고리즘에 의해, Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970 의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444, 1988 의 유사성 방법에 대한 검색에 의해, 상기 알고리즘의 컴퓨터 계산된 실행 (FASTDB (Intelligenetics), BLAST (National Center for Biomedical Information), GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) 에 의해, 또는 수작업 정렬 및 시각 검사 (예를 들어, Ausubel et al., (1999 Suppl.), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y., 1987 참조) 에 의해 수행될 수 있다.
% 서열 일치성 및 서열 유사성을 측정하기에 적합한 알고리즘의 바람직한 예는 FASTA 알고리즘이고, 이것은 Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444, 1988 에 기재되어 있다. 또한 Pearson, Methods Enzymol. 266: 227-258, 1996 을 참조한다. % 일치성을 계산하기 위한 DNA 서열의 FASTA 정렬에서 사용된 바람직한 파라미터를 최적화한다: BL50 Matrix 15: -5, k-튜플 (tuple)= 2; 연결 패널티= 40, 최적화= 28; 갭 패널티 -12, 갭 길이 패널티= -2; 및 폭= 16.
% 서열 일치성 및 서열 유사성을 측정하기에 적합한 알고리즘의 또다른 바람직한 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이것은 Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402, 1977; 및 Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990 에, 각각 기재되어 있다. 본 발명의 핵산 및 단백질에 대한 % 서열 일치성을 측정하기 위해, 본원에 기재된 파라미터가 있는 BLAST 및 BLAST 2.0 을 사용한다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 을 통해 공개적으로 이용가능하다. 상기 알고리즘에는 첫 번째로 의문 서열 중의 길이 W 의 짧은 단어를 확인하여 높은 점수 서열 쌍 (HSP) 을 확인하는 것이 포함되며, 이것은 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어를 갖도록 정렬되는 경우 일부 양성-값 역치 점수 T 를 매치 또는 만족시킨다. T 는 이웃 단어 점수 역치로서 언급된다 (Altschul et al., supra). 상기 초기 이웃 단어 적중은 이를 함유하는 더 긴 HSP 를 찾기 위해 검색을 시작하기 위한 근원으로서 작용한다. 단어 적중은 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한, 각 서열에 따라 모든 방향으로 확장된다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열에 대해, 파라미터 M (매칭 잔기의 쌍에 대한 보상 점수; 항상 > 0) 및 N (미스매칭 잔기에 대한 패널티 점수; 항상 < 0) 을 사용하여 계산한다. 아미노산 서열에 대해, 점수 매트릭스는 누적 점수를 계산하기 위해 사용된다. 각 방향으로의 점수 적중의 확장은, 누적 정렬 점수가 최대 달성 값으로부터의 수량 X 에 의해 떨어지고; 하나 이상의 음성-점수 잔기 정렬의 축적으로 인해 누적 점수가 0 또는 미만이 되거나; 어느 한쪽의 서열의 말단이 닿는 경우 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X 는 정렬의 민감성 및 속력을 측정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열에 대해) 은 디폴트로서 단어 길이 (W) 11, 기대값 (E) 10, M=5, N=-4 및 두 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열에 대해, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 단어 길이 3, 및 기대값 (E) 10 을 사용하고, BLOSUM62 점수 매트릭스 (Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915, 1989 참조) 는 정렬 (B) 50, 기대값 (E) 10, M=5, N=-4, 및 두 가닥의 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘은 또한 2 서열 사이의 유사성의 통계 분석을 수행한다 (예를 들어, Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873-5787, 1993 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 하나의 유사성 측정은 최소 합 확률 (P(N)) 이고, 이것은 2 개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매치가 우연히 일어날 확률의 지표를 제공한다. 예를 들어, 핵산은 참조 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소 합 확률이 약 0.2 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우 참조 서열과 유사한 것으로 고려된다.
유용한 알고리즘의 또다른 예는 PILEUP 이다. PILEUP 는 관계 및 % 서열 일치성을 보여주기 위해 진행적, 쌍 방식 (pairwise) 정렬을 사용하여 관련 서열의 군으로부터 복합 서열 정렬을 만든다. 이것은 또한 정렬을 만들기 위해 사용되는 관계 클러스터링을 보여주는 나무 또는 수지상도 (dendogram) 를 플롯화한다. PILEUP 는 Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 351-360, 1987 의 진행적 정렬 방법의 간소화를 사용한다. 사용되는 방법은 Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989 에 의해 기재된 방법과 유사하다. 프로그램은 각각 5,000 개 뉴클레오티드 또는 아미노산의 최대 길이로 300 개까지의 서열을 정렬시킬 수 있다. 복합 정렬 절차는 2 개의 가장 유사한 서열의 쌍 방식 정렬로 시작하여, 2 개의 정렬된 서열의 클러스터를 생성한다. 그 다음 상기 클러스터를 다음 가장 관련된 서열 또는 정렬된 서열의 클러스터에 정렬시킨다. 서열의 2 개의 클러스터를 2 개의 개별 서열의 쌍 방식 정렬의 단순 확장에 의해 정렬시킨다. 최종 정렬은 일련의 진행적, 쌍 방식 정렬에 의해 달성된다. 프로그램은 서열 비교의 영역에 대등한 특정 서열 및 그의 아미노산 또는 뉴클레오티드를 지정하고, 프로그램 파라미터를 지정하여 실행한다. PILEUP 를 사용하여, 참조 서열을 하기 파라미터를 사용하여 % 서열 일치성 관계를 측정하기 위해 기타 시험 서열과 비교한다: 디폴트 갭 중량 (3.00), 디폴트 갭 길이 중량 (0.10), 및 중량을 잰 말단 갭. PILEUP 는 GCG 서열 분석 소프트웨어 패키지, 예를 들어, 버전 7.0 (Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12: 387-395, 1984) 으로부터 수득할 수 있다.
복합 DNA 및 아미노산 서열 정렬에 적합한 알고리즘의 또다른 바람직한 예는 CLUSTALW 프로그램 (Thompson et al., Nucl. Acids. Res. 22: 4673-4680, 1994) 이다. ClustalW 는 서열 그룹 간의 복합 쌍 방식 비교를 수행하고, 이들을 상동성에 근거한 복합 정렬로 집합시킨다. 갭 오픈 및 갭 확장 패널티는 각각 10 및 0.05 였다. 아미노산 정렬을 위해, BLOSUM 알고리즘을 단백질 중량 매트릭스로서 사용할 수 있다 (Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 10915-10919, 1992).
"서열 일치성" 은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 유사성의 측정을 말하고, 하기 기재된 방법과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다:
2 개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문맥에서 "일치하는" 또는 % "일치성" 은, 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 수작업 정렬 및 시각 검사에 의해 측정된 바와 같은 지정된 영역 또는 비교 창에 걸쳐 최대 상응성에 대해 정렬 및 비교된 경우, 동일한 (즉, 특이적 영역에 대해 60% 일치성, 바람직하게는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 그 이상의 일치성) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정 % 를 갖거나 동일한 2 개 이상의 서열 또는 서브서열을 말한다.
2 개의 핵산 또는 폴리펩티드의 문맥에서 "실질적으로 일치하는" 은, 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 또는 시각 검사에 의해 측정된 바와 같이, 최대 상응성에 대해 비교 및 정렬하는 경우, 적어도 60% 이상, 종종 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상 또는 95% 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 일치성을 갖는 2 개 이상의 서열 또는 서브서열을 말한다. 바람직하게는, 상당한 일치성이 길이 약 50 이상의 염기 또는 잔기인 서열 영역, 더욱 바람직하게는 약 100 이상의 염기 또는 잔기의 영역에 걸쳐 존재하고, 가장 바람직하게는 서열은 약 150 이상의 염기 또는 잔기에 걸쳐 실질적으로 일치한다. 가장 바람직한 구현예에서, 서열은 코딩 영역의 전체 길이에 걸쳐 실질적으로 일치한다.
2 개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문맥에서 "상동성" 및 "일치성" 은, 서열 비교 알고리즘 중 임의의 수를 사용하거나 수작업 정렬 및 시각 검사에 의해 측정된 바와 같은 지정된 영역 또는 비교 창에 걸쳐 최대 상응성에 대해 정렬 및 비교된 경우, 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정 % 를 갖거나 동일한 2 개 이상의 서열 또는 서브서열을 말한다. 서열 비교를 위해, 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 참조 서열 (Scd1 유전자 산물 또는 톨-유사 수용체 2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 예시적 서열) 로서 작용할 수 있다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 서브서열 좌표를 지정하고, 필요한 경우, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 디폴트 프로그램 파라미터를 사용할 수 있거나, 대안적 파라미터를 지정할 수 있다. 그 다음 서열 비교 알고리즘으로 프로그램 파라미터에 근거해, 참조 서열에 대한 시험 서열에 대한 % 서열 일치성을 계산한다.
본원에 사용된 바와 같은 "비교 창" 에는 인접 잔기의 수 중 임의의 하나의 분절에 대한 참조가 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 대안적 양상에서, 본 발명의 예시적 폴리펩티드 또는 핵산 서열, 예를 들어, Scd1 또는 톨-유사 수용체 2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 20 개에서 전장의 임의의 곳에 이르는 인접 잔기는, 2 개 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 수의 인접 위치의 참조 서열에 대해 비교된다. 참조 서열이 본 발명의 예시적 폴리펩티드 또는 핵산 서열에 필요한 서열 일치성, 예를 들어, Scd1 또는 톨-유사 수용체 2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 대한 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 일치성을 갖는 경우, 서열은 본 발명의 범주 내에 있다.
상기 프로그램을 사용하여 검출될 수 있는 모티프에는 류신 지퍼, 헬릭스-턴-헬릭스 모티프, 글리코실화 부위, 유비퀴틴화 부위, 알파 헬릭스, 및 베타 쉬트를 코딩하는 서열, 코딩된 단백질의 분비를 지도하는 신호 펩티드를 코딩하는 신호 서열, 전사 조절에 포함된 서열, 예컨대 호메오박스, 산성 스트레치, 효소 활성 부위, 기질 결합 부위, 및 효소 분할 부위가 포함된다.
H. 컴퓨터 시스템 및 컴퓨터 프로그램 산출물
서열 일치성, 구조적 상동성, 실리코 (silico) 중의 모티프 등을 측정 및 확인하기 위해, 컴퓨터에 의해 판독 및 접근될 수 있는 임의의 매체에 본 발명의 서열을 저장, 기록 및 조작할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 핵산 및 폴리펩티드 서열이 판독 또는 저장된 컴퓨터, 컴퓨터 시스템, 컴퓨터 판독가능 매체, 컴퓨터 프로그램 산출물 등을 제공한다. 본원에 사용되는 바와 같은, 단어 "판독" 및 "저장" 은 컴퓨터 매체에 정보를 저장하기 위한 과정을 말한다. 당업자는 쉽게 본 발명의 하나 이상의 핵산 및/또는 폴리펩티드 서열을 포함하는 제조품을 생성시키기 위해 컴퓨터 판독가능 매체에 정보를 기록하기 위한 임의의 공지된 방법을 채용할 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 본 발명의 하나 이상의 핵산 및/또는 폴리펩티드 서열이 기록된 컴퓨터 판독가능 매체이다. 컴퓨터 판독가능 매체에는 자기적 판독가능 매체, 광학적 판독가능 매체, 전기적 판독가능 매체 및 자기/광학 매개체가 포함된다. 예를 들어, 컴퓨터 판독가능 매체는 하드 디스크, 플로피 디스크, 자기 테이프, CD-ROM, Digital Versatile Disk (DVD), Random Access Memory (RAM), 또는 Read Only Memory (ROM) 뿐 아니라, 당업자에게 공지된 다른 유형의 다른 매개체일 수 있다
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "컴퓨터", "컴퓨터 프로그램" 및 "프로세서" 는 가장 넓은 일반적 문맥에서 사용되고, 모든 이러한 장치를 포함한다.
폴리펩티드 및 전사물의 발현 조정 또는 억제
본 발명은 본 발명의 핵산 서열에 상보적인 핵산 (예, 그에 대한 안티센스 서열) 을 추가로 제공한다. 안티센스 서열은 단백질-코딩 유전자, 예를 들어, TLR2- 또는 Scd1-코딩 핵산의 수송, 스플라이싱 또는 전사를 조절 또는 억제할 수 있다. 조정 또는 억제는 게놈 DNA 또는 전령자 RNA 의 표적화를 통해 영향을 받을 수 있다. 표적화된 핵산의 전사 또는 기능은, 예를 들어, 혼성화 및/또는 분할에 의해 억제될 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 특히 유용한 억제제 세트에는 유전자 또는 메세지에 결합할 수 있고, 양쪽 경우 단백질의 생성 또는 기능을 예방 또는 억제하는 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 회합은 서열 특이적 혼성화를 통해 이뤄질 수 있다. 또다른 유용한 계열의 억제제에는 단백질 메세지의 불활성화 또는 분할을 야기하는 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 올리고뉴클레오티드는 이러한 분할을 야기하는 효소 활성, 예컨대 리보자임을 가질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 상보적인 핵산을 분할시킬 수 있는 효소 또는 조성물을 화학적으로 변형시키거나 이에 공액될 수 있다. 원하는 활성을 갖는 것들에 대한 많은 상이한 이러한 올리고뉴클레오티드의 집단을 스크리닝할 수 있다.
유전자 발현을 제어하기 위한 안티센스, 리보자임 기술 및 RNAi 기술을 사용하는 일반적인 방법, 또는 상기 방식의 외인성 유전자의 발현을 위한 유전자 치료법은 당업계에 잘 공지된다. 각각의 이들 방법은 본 발명의 포스파타제 폴리펩티드의 안티센스 또는 리보자임 전사물을 코딩하는 시스템, 예컨대 벡터를 이용한다. 용어 "RNAi" 는 RNA 간섭을 의미한다. 상기 용어는 당업계에서 유전자를 침묵시킬 수 있는 RNA 분자를 사용하는 기술을 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, McManus, et al. Nature Reviews Genetics 3: 737, 2002 를 참조한다. 본 출원에서, 용어 "RNAi" 는 분자, 예컨대 짧은 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA (mRNA), 소형 일시적 RNA (stRNA) 를 포함한다. 일반적으로 말하면, RNA 간섭은 이중-가닥 RNA 와 유전자의 상호작용을 야기한다.
A. 안티센스 올리고뉴클레오티드
본 발명은 mRNA 표적화에 의해 폴리펩티드 활성을 억제할 수 있는 TLR2 또는 Scd1 전령자 RNA 에 결합할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 고안 전략은 과학적 및 특허 문헌에 잘 기재되어 있고, 당업자는 본 발명의 신규 시약을 사용하여 이러한 올리고뉴클레오티드를 고안할 수 있다. 예를 들어, 효과적인 안티센스 올리고뉴클레오티드를 스크리닝하기 위한 유전자 보행 (walking)/RNA 지도작성 프로토콜은 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들어, RNA 지도작성 검정법을 기재하고 있는 Ho, Methods Enzymol. 314: 168-183, 2000 을 참조하고, 이것은 잠재적 안티센스 서열 선택을 위한 쉽고 신뢰성 있는 방법을 제공하기 위해 표준 분자 기술에 근거한다. 또한 Smith, Eur. J. Pharm. Sci. 11: 191-198, 2000 을 참조한다.
자연 발생적 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 사용된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 임의의 길이의 것일 수 있고; 예를 들어, 대안적인 양상에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 약 5 내지 100, 약 10 내지 80, 약 15 내지 60, 약 18 내지 40 이다. 최적 길이는 정규적 스크리닝에 의해 측정될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 임의의 농도로 존재할 수 있다. 최적 농도는 정규적 스크리닝에 의해 측정될 수 있다. 상기 잠재적 문제를 해결할 수 있는 다양한 합성, 비-자연 발생적 뉴클레오티드 및 핵산 유사체는 공지되어 있다. 예를 들어, 비-이온성 백본을 함유하는 펩티드 핵산 (PNA), 예컨대 N-(2-아미노에틸) 글리신 단위가 사용될 수 있다. 포스포로티오에이트 연결을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 또한 WO 97/03211; WO 96/39154; Mata, Toxicol Appl Pharmacol. 144: 189-197, 1997; Antisense Therapeutics, ed. Agrawal, Humana Press, Totowa, N.J., 1996 에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 본 발명에 의해 제공된 합성 DNA 백본 유사체를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드에는 또한 상기 기재된 바와 같은 포스포로-디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포라미데이트, 알킬 포스포트리에스테르, 술파메이트, 3'-티오아세탈, 메틸렌(메틸리미노), 3'-N-카바메이트, 및 모르폴리노 카바메이트 핵산이 포함될 수 있다.
임의의 표적에 대한 적합한 결합 친화성 및 특이성을 갖는 특이적 올리고뉴클레오티드, 예컨대 본 발명의 센스 및 안티센스 폴리펩티드 서열에 대해 빠른 스크리닝을 가능하게 하는 다수의 올리고뉴클레오티드를 제작하기 위해 조합적 화학 방법론을 사용할 수 있다 (예를 들어, Gold, J. of Biol. Chem. 270: 13581-13584, 1995 참조).
B. siRNA
"소형 간섭 RNA" (siRNA) 는 RNA 간섭 (RNAi) 을 통해 단백질 발현을 특이적으로 간섭하는 능력에 따라 이름지어진 길이 약 10 내지 약 30 의 뉴클레오티드의 이중-가닥 RNA 분자를 말한다. 바람직하게는, siRNA 분자는 길이 12-28 의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 길이 15-25 의 뉴클레오티드, 더욱 더 바람직하게는 길이 19-23 의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 길이 21-23 의 뉴클레오티드이다. 그러므로, 바람직한 siRNA 분자는 길이 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 또는 29 의 뉴클레오티드이다.
RNAi 는 2-단계 메카니즘이다. Elbashir et al., Genes Dev., 15: 188-200, 2001. 먼저, 긴 dsRNA 를 Dicer 로 공지된 효소에 의해 21-23 리보뉴클레오티드 (nt) 단편으로 분할시키고, 소형 간섭 RNA (siRNA) 로 부른다. 그 다음, siRNA 를 상기 복합체를 상보적 mRNA 에 표적화시키는 리보뉴클레아제 복합체 (RISC: RNA Induced Silencing Complex 라고 부름) 와 회합시킨다. 그 다음 RISC 는 상보적 siRNA 와 마주하는 표적된 mRNA 를 분할하고, 이것은 mRNA 를 다른 RNA 분해 경로에 영향을 받기 쉽게 만든다.
본 발명의 siRNA 는 표적 리보뉴클레오티드 서열과 상호작용하도록 고안되고, 이것은 이들이 표적 서열에 결합하기에 충분히 표적 서열을 보완한다는 것을 의미한다. 또한 본 발명에는 뉴클레아제 분해에 대항해 증가된 안정성을 부여하나, 존재할 수 있는 표적 핵산에 결합할 수 있는 능력을 보유하기 위해 화학적으로 변형된 siRNA 분자가 포함된다.
C. 억제성 리보자임
본 발명은 mRNA 를 표적하여 폴리펩티드 활성을 억제할 수 있는 (예를 들어, TLR2 활성 또는 Scd1 활성, 예를 들어, TLR2-신호 활성을 갖는 폴리펩티드의 억제) 메세지에 결합할 수 있는 리보자임을 제공한다. 표적화를 위한 리보자임의 고안 및 단백질-특이적 안티센스 서열의 선택 전략은 과학적 및 특허 문헌에 잘 기재되어 있으며, 당업자는 본 발명의 신규 시약을 사용하여 이러한 리보자임을 고안할 수 있다.
리보자임은 표적 RNA 를 분할하는 RNA 의 효소적 부분에 가까운 근접성으로 유지되는, 리보자임의 부분에 결합하는 표적 RNA 를 통해 표적 RNA 에 결합하여 작용한다. 그러므로, 리보자임은 상보성 염기-쌍을 통해 표적 RNA 를 인지하고 이에 결합하며, 일단 올바른 위치에 결합하면, 표적 RNA 를 분할 및 불활성화하기 위해 효소적으로 작용한다. 이러한 방식의 표적 RNA 의 분할은 분할이 코딩 서열에서 발생하는 경우, 코딩된 단백질의 합성을 지도하는 능력을 파괴할 것이다. 리보자임이 그의 RNA 표적에 결합하고 이를 분할시킨 후, 이것은 전형적으로는 RNA 로부터 방출되어 새로운 표적에 반복적으로 결합하고 분할시킬 수 있다.
일부 환경에서, 리보자임의 효소적 특성은 치료적 치료에 효과를 주기에 필요한 유효한 농도의 리보자임이 안티센스 올리고뉴클레오티드의 것보다 더 낮을 수 있기 때문에 다른 기술, 예컨대 안티센스 기술 (여기서 핵산 분자는 핵산 표적에 단순히 결합하여 그의 전사, 번역 또는 또다른 분자와의 회합을 차단한다) 에 비해 유리할 수 있다. 본 잠재적 이점은 효소적으로 작용하는 리보자임의 능력을 반영한다. 그러므로, 단일 리보자임 분자는 표적 RNA 의 많은 분자를 분할할 수 있다. 또한, 리보자임은 전형적으로는 결합의 염기 쌍 메카니즘 뿐 아니라, 분자가 그것이 결합하는 RNA 의 발현을 억제하는 메카니즘에 따라 다른 억제 특이성을 갖는, 고도로 특이적인 억제제이다. 즉, 억제는 RNA 표적의 분할에 의해 야기되어, 특이성은 비-표적된 RNA 의 분할 비율에 대한 표적된 RNA 의 분할 비율의 비로서 정의된다. 상기 분할 메카니즘은 염기 짝지음에 포함된 것들에 부가적인 인자에 따라 다르다. 그러므로, 리보자임의 작용의 특이성은 동일한 RNA 부위에 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 것보다 더 클 수 있다.
효소적 리보자임 RNA 분자는 망치머리 (hammerhead) 모티프로 형성될 수 있으나, 또한 헤어핀의 모티프, 간염 델타 바이러스, 그룹 I 인트론 또는 RnaseP-유사 RNA (RNA 지침 서열과 관련됨) 의 형태일 수 있다. 이러한 망치머리 모티프의 예는 Rossi, Aids Research and Human Retroviruses 8: 183, 1992 에 의해; Hampel, Biochemistry 28: 4929, 1989, 및 Hampel, Nuc. Acids Res. 18: 299, 1990 에 의해 헤어핀 모티프; Perrotta, Biochemistry 31: 16, 1992 에 의해 간염 델타 바이러스 모티프; Guerrier-Takada, Cell 35: 849, 1983 에 의해 RnaseP 모티프; 및 Cech 미국 특허 제 4,987,071 호에 의해 그룹 I 인트론이 기재되어 있다. 상기 특이적 모티프의 상술은 제한되는 것으로 의도되지 않고, 당업자는 본 발명의 효소적 RNA 분자가 하나 이상의 표적 유전자 RNA 영역에 상보적인 특이적 기질 결합 부위를 가지고, 분자에 대해 RNA 분할 활성을 부여하는 기질 결합 부위 내에 또는 그를 둘러싸는 뉴클레오티드 서열을 갖는다는 것을 인지할 것이다.
처리 방법
본원에 또한 기재되는 것은 장애의 위험이 있는 (또는 그에 걸리기 쉬운) 대상 또는 바람직하지 않은 톨-유사 수용체 2 발현 또는 활성, 또는 Scd1 유전자 발현 활성 또는 Scd1 유전자 산물 활성과 관련된 장애를 갖는 대상을 치료하는 예방법 및 치료법 모두이다.
예방법
본 발명은 대상에게 톨-유사 수용체 2, Scd1 유전자 발현 활성, 또는 Scd1 유전자 산물 활성을 통해 신호를 조정하는 작용제를 투여하여, 바람직하지 않은 양의 톨-유사 수용체 2 발현 또는 활성, Scd1 유전자 발현 또는 Scd1 유전자 산물 활성과 관련된 질환 또는 상태를 대상에서 예방하는 방법에 관한 것이다. 톨-유사 수용체 2- 또는 Scd1-매개된 신호에 의해 야기되는 또는 기여되는 장애 또는 바람직하지 않은 증상에 대한 위험이 있는 대상은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 또는 당업계에 공지된 진단 또는 예후 검정법의 임의의 조합에 의해 확인될 수 있다. 일반적으로, 이러한 장애는 예를 들어, 그람 양성 박테리아 감염의 결과로서 선천적 면역계의 바람직하지 않은 활성화를 포함한다. 예방제로서 작용제는 작용제의 부재 하의 증상과 비교해 예방, 지연 또는 소멸되도록, 증상의 소견 전에 투여할 수 있다. 일부 구현예에서, 작용제는 Scd1 에 대한 톨-유사 수용체 2 의 결합을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 작용제는 Scd1 에 대한 톨-유사 수용체 2 에 대한 리간드 결합을 감소시킨다. 적합한 작용제는 본원에 기재된 스트리닝 검정법에 근거해 확인될 수 있다. 일반적으로, 이러한 작용제는 톨-유사 수용체 2 및/또는 Scd1 유전자 산물에 특이적으로 결합한다.
치료법
본 발명의 또다른 양상은 치료 목적을 위한 TLR2 활성 또는 Scd1 유전자 발현 또는 Scd1 유전자 산물 활성의 조정 또는 활성화 방법에 관한 것이다. 방법에는 세포를 세포와 관련된 톨-유사 수용체 2 의 활성 및/또는 Scd1 활성 중 하나 이상을 조정하는, 예를 들어, TLR2 또는 Scd1 에 특이적으로 결합하거나 톨-유사 수용체 2 를 통한 신호를 활성화시키는 작용제와 접촉시키는 것이 포함될 수 있다. 작용제는 톨-유사 수용체 2, Scd1 유전자, 또는 Scd1 유전자 산물에 특이적으로 결합하고, 지질다당류에 의해 유도되는 세포 중의 TLR2 활성을 선택적으로 활성화시키거나, 그람 양성 박테리아에 대한 대식세포 응답을 활성화시키는 화합물일 수 있다. 작용제는 항체 또는 단백질, 톨-유사 수용체 2 단백질의 자연 발생적 동족 리간드, 펩티드, 톨-유사 수용체 2 또는 Scd1 단백질 펩티드모방성, 소형 비-핵산 유기 분자, 또는 소형 무기 분자일 수 있다. 상기 조정 방법은 시험관 내 (예, 세포를 작용제와 배양하여) 또는, 대안적으로는, 생체 내 (예, 작용제를 대상에게 투여하여) 에서 수행될 수 있다.
본 발명은 톨-유사 수용체 2 단백질 활성, Scd1 유전자 발현, 또는 Scd1 유전자 산물 활성의 발현 또는 활성의 결핍을 특징으로 하는, 질환 또는 장애, 예를 들어, 그람 양성 박테리아 감염 또는 그람 양성 박테리아 피부 감염에 의해 영향을 받은 개인의 치료 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 방법은 치료제, 예컨대 단일불포화 지방산, 예를 들어, 팔미트올레에이트 (팔미트올레산) 또는 올레에이트 (올레산) 를 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 톨-유사 수용체 2 단백질 활성, Scd1 유전자 발현, 또는 Scd1 유전자 산물 활성의 발현 또는 활성의 결핍을 특징으로 하는, 질환 또는 장애에 의해 영향을 받은 개인의 치료 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 방법은 작용제 (예, 본원에 기재된 스크리닝 검정법에 의해 확인된 작용제), 또는 톨-유사 수용체 2 를 통한 신호를 증가시키거나 Scd1 유전자 발현 또는 Scd1 유전자 산물 활성을 증가키시는 작용제의 조합을 투여하는 것을 포함한다. 작용제에 의해 치료될 수 있는 상태에는 대상이 그람 양성 박테리아 감염에 대해 치료되는 것들이 포함된다.
신규 방법 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 다른 장애에는 진균 감염, 패혈증, 사이토메갈로바이러스 감염, 결핵, 나병, 뼈 흡수 (예, 치주 질환), 관절염 (예, 라임 질환과 관련됨), 및 바이러스 간염이 포함된다. 톨-유사 수용체 2 를 통한 신호를 활성화시키는 (예, Scd1 유전자 발현 또는 Scd1 유전자 산물 활성을 활성화시켜) 화합물은, 또한 그람 양성 박테리아 감염을 치료하는데 유용하다.
그람 양성 박테리아 감염과 관련된 장애의 성공적인 치료는 톨-유사 수용체 2, Scd1 유전자 발현 또는 Scd1 유전자 산물에 대한 결합의 활성화를 담당하는 기술에 의해 야기될 수 있다. 예를 들어, 음성 조정 활성을 나타나는 것으로 증명된 화합물, 예를 들어, 본원에 기재된 검정법을 사용하여 확인된 작용제, 예컨대 항체는, 바람직하지 않은 Scd1 유전자 산물 또는 톨-유사 수용체 2 활성에 의해 야기되는 장애의 증상을 예방 및/또는 개선하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 분자에는 펩티드, 포스포펩티드, 소형 유기 또는 무기 분자, 또는 항체 (예를 들어, 폴리클론, 단일클론, 인간화, 항-개체특이형, 키메라성 또는 단일 쇄 항체, 및 Fab, F(ab')2 및 Fab 발현 라이브러리 단편, scFV 분자, 및 그의 에피토프-결합 단편 포함) 가 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 특히, 톨-유사 수용체 2 에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 유도체 (예, 그의 항원-결합 단편) 는 지질다당류에 의해 유도된 세포에서 Scd1 활성 (Scd1 유전자 발현 또는 Scd1 유전자 산물) 을 조정 또는 활성화할 수 있거나, 그람 양성 박테리아 감염에 대한 대식세포 응답을 조정 또는 활성화할 수 있다.
키트
본 발명은 조성물, 예를 들어, 핵산, 발현 카세트, 벡터, 세포, 폴리펩티드 (예, Scd1 폴리펩티드 또는 톨-유사 수용체 2-신호 활성화 폴리펩티드) 및/또는 본 발명의 항체를 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 또한 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법론 및 용도를 교시하는 지시 물질을 함유할 수 있다.
치료적 적용
본 발명의 방법에 의해 확인된 화합물 및 조정제는 다양한 치료 방법에서 사용될 수 있다. 그러므로 본 발명은 감염성 질환, 그람 양성 박테리아 감염, 톨-유사 수용체 2 신호 결손, Scd1 유전자 돌연변이 또는 유전자 발현 결손 또는 Scd1 유전자 산물 결손의 치료용 조성물 및 방법을 제공한다.
예시적 감염성 질환에는, 그람 양성 박테리아 피부 감염, 예를 들어, S. pyogenes 또는 S. aureus 가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 그람 양성 구균 S. pyogenes 또는 S. aureus 는 인간 농가진, 셀룰라이트 및 상처 감염의 선도 작용제이다.
예시적 감염성 질환에는, 바이러스 또는 박테리아 질환이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 감염성 작용제를 치료 또는 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 증가시켜, 특히 B 및/또는 T 세포의 증식 및 분화를 증가시켜, 감염성 질환을 치료할 수 있다. 면역 반응은 존재하는 면역 반응을 증가시키거나, 새로운 면역 반응을 개시시켜 증가될 수 있다. 대안적으로는, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 또한 면역 반응의 필수적인 도출 없이, 감염성 작용제를 직접적으로 억제할 수 있다.
유사하게는, 질환 또는 증상을 야기할 수 있고, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 의해 치료 또는 검출될 수 있는 박테리아 또는 진균 작용제에는 하기 그람-음성 및 그람-양성 박테리아 과 및 진균이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다: 악티노마이세탈레스 (Actinomycetales) (예, 코리네박테리움 (Corynebacterium), 마이코박테리움 (Mycobacterium), 노르카르디아 (Norcardia)), 아스페르길로시스 (Aspergillosis), 바실라세아에 (Bacillaceae) (예, 안트락스 (Anthrax), 클로스트리듐 (Clostridium)), 박테로이다세아에 (Bacteroidaceae), 블라스토마이코시스 (Blastomycosis), 보르데텔라 (Bordetella), 보렐리아 (Borrelia), 브루셀로시스 (Brucellosis), 칸디디아시스 (Candidiasis), 캄필로박테르 (Campylobacter), 코크시디오이도마이코시스 (Coccidioidomycosis), 크립토코코시스 (Cryptococcosis), 데르마토사이코세스 (Dermatocycoses), 엔테로박테리아세아에 (Enterobacteriaceae) (클렙시엘라 (Klebsiella), 살모넬라 (Salmonella), 세라티아 (Serratia), 예르시니아 (Yersinia)), 에리시펠로트릭스 (Erysipelothrix), 헬리코박테르 (Helicobacter), 레기노넬로시스 (Legionellosis), 렙토스피로시스 (Leptospirosis), 리스테리아 (Listeria), 마이코플라스마탈레스 (Mycoplasmatales), 네이세리아세아에 (Neisseriaceae) (예, 아시네토박테로 (Acinetobacter), 고노르헤아 (Gonorrhea), 메니고코칼 (Menigococcal)), 파스퇴렐라세아 인펙션 (Pasteurellacea Infections) (예, 악티노바실러스 (Actinobacillus), 헤아모필러스 (Heamophilus), 파스퇴렐라 (Pasteurella)), 슈도모나스 (Pseudomonas), 리케트시아세아에 (Rickettsiaceae), 플라마이디아세아에 (Chlamydiaceae), 사이필리스 (Syphilis), 및 스타필로코칼 (Staphylococcal). 상기 박테리아 또는 진균 과는 하기를 포함하나 이에 제한되지 않는 질환 또는 증상을 야기할 수 있다: 균혈증, 심내막염, 눈 감염 (결막염, 결핵, 포도막염), 치은염, 기회 감염 (예, AIDS 관련 감염), 손발톱주위염, 보철물-관련 감염, 라이터 (Reiter's) 질환, 기도 감염, 예컨대 백일해 또는 농흉, 패혈증, 라임 질환, 고양이-긁힘 질환, 이질, 주위장티푸스 열, 식중독, 장티푸스, 폐렴, 임질, 수막염, 클라미디아, 매독, 디프테리아, 나병, 주위결핵, 결핵, 루푸스, 보툴리눔독소증, 괴저, 파상풍, 농가진, 류마티스 열, 성홍열, 성매개 질환, 피부 질환 (예, 연조직염, 피부진균병 (dermatocycoses)), 임신중독증, 요로 감염, 상처 감염. 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 상기 증상 또는 질환 중 임의의 것을 치료 또는 검출하기 위해 사용될 수 있다.
게다가, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 의해 치료 또는 검출될 수 있는 질환 또는 증상을 야기하는 기생충 작용제에는 하기 과가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다: 아메비아시스 (Amebiasis), 바베시오시스 (Babesiosis), 코크시디오시스 (Coccidiosis), 스립토스포리디오시스 (Cryptosporidiosis), 디엔타모에비아시스 (Dientamoebiasis), 도우리네 (Dourine), 엑토파라시티크 (Ectoparasitic), 기아르디아시스 (Giardiasis), 헬민티아시스 (Helminthiasis), 레이스마니아시스 (Leishmaniasis), 테일레리아시스 (Theileriasis), 톡소플라스모시스 (Toxoplasmosis), 트리파노소미아시스 (Trypanosomiasis) 및 트리코모나스 (Trichomonas). 상기 기생충은 하기를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 질환 또는 증상을 야기할 수 있다: 옴, 털진드기유충증, 눈 감염, 장 질환 (예, 이질, 편모충증), 간 질환, 폐 질환, 기회 감염 (예, AIDS 관려됨), 말라리아, 임신 합병증, 및 톡소플라즈마증. 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 상기 증상 또는 질환 중 임의의 것을 치료 또는 검출하기 위해 사용할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 사용하는 치료는 유효량의 폴리펩티드를 환자에게 투여하여, 또는 환자로부터 세포를 제거하고, 세포에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 공급하고, 조작된 세포를 환자에게 돌려주어 (생체 외 요법) 이뤄질 수 있다. 게다가, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 감염성 질환에 대항하는 면역 반응을 일으키는 백신에서 항원으로서 사용될 수 있다.
약학 조성물의 제형 및 투여
본 발명은 본 발명의 핵산, 펩티드 및 폴리펩티드 (Ab 포함) 를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 상기 논의된 바와 같은, 본 발명의 핵산, 펩티드 및 폴리펩티드는 내인성 Scd1 유전자 또는 Scd1 폴리펩티드의 발현을 활성화하기 위해 사용할 수 있다. 세포 또는 비-인간 동물에서의 이러한 활성화는 감염성 질환 또는 그람 양성 박테리아 감염을 치료 또는 개선하기 위한 화합물을 확인하기 위한 스크리닝 양식을 발생시킬 수 있다. 대상에 대한 본 발명의 약학 조성물의 투여는 대상에서 관용원성 (toleragenic) 면역학적 환경을 발생시키기 위해 사용된다. 이것은 대상을 항원에 관용화시키기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 핵산, 펩티드 및 폴리펩티드는 약학적으로 허용가능한 담체 (부형제) 와 조합되어 약물학적 조성물을 형성할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물의 흡수 또는 제거율을 안정화, 또는 증가 또는 감소시키기 위한 작용을 하는 생리학적으로 허용가능한 화합물을 함유할 수 있다. 생리학적으로 허용가능한 화합물에는 예를 들어, 탄수화물, 예컨대 글루코오스, 수크로오스, 또는 덱스트란, 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 글루타티온, 킬레이트제, 저 분자량 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드의 제거 또는 가수분해를 감소시키는 조성물, 또는 부형제 또는 기타 안정화제 및/또는 완충제가 포함될 수 있다. 세제는 또한 리포좀성 담체를 포함하는, 약학 조성물의 흡수를 안정화 또는 증가 또는 감소시키기 위해 사용할 수 있다. 펩티드 및 폴리펩티드에 대한 약학적으로 허용가능한 담체 및 제형은 당업자에게 공지되어 있고, 과학적 및 특허 문헌에 상세히 기재되어 있으며, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton, Pa. ("Remington's") 의 최신판을 참조한다 .
기타 생리학적으로 허용가능한 화합물에는 습윤제, 유화제, 분산제 또는 미생물의 성장 또는 작용을 예방하는데 특히 유용한 방부제가 포함된다. 다양한 방부제는 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 페놀 및 아스코르브산이 포함된다. 당업자는 생리학적으로 허용가능한 화합물을 포함하는 약학적으로 허용가능한 담체의 선택이 예를 들어, 본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드의 투여 경로 및 특정 물리-화학적 특성에 따라 다를 것이라는 것을 인식할 것이다.
하나의 양상에서, 본 발명의 핵산, 펩티드 또는 폴리펩티드의 용액을 약학적으로 허용가능한 담체, 예를 들어, 조성물이 수용성인 경우 수성 담체 중에 용해한다. 장, 비경구 또는 경점막 약물 전달용 제형에 사용될 수 있는 수용액의 예에는 예를 들어, 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 행크 (Hank's) 용액, 링거 (Ringer's) 용액, 덱스트로스/식염수, 글루코오스 용액 등이 포함된다. 제형은 적합한 생리학적 상태에 필요한 약학적으로 허용가능한 보조 물질, 예컨대 완충제, 강장 조정제, 습윤제, 세제 등을 함유할 수 있다. 추가제에는 또한 추가 활성 성분, 예컨대 살균제 또는 안정화제가 포함될 수 있다. 예를 들어, 용액은 나트륨 아세테이트, 나트륨 락테이트, 나트륨 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 소르비탄 모노라우레이트 또는 트리에탄올아민 올레에이트를 함유할 수 있다. 상기 조성물은 통상적인, 잘-공지된 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있거나, 멸균 여과될 수 있다. 결과 수용액은 투여 전에 멸균 수용액과 조합된 동결건조 제제를, 그대로 또는 동결건조된 대로 사용하기 위해 패키지될 수 있다. 상기 제형 중의 펩티드의 농도는 매우 다양할 수 있고, 선택된 특정 투여 방식 및 환자의 필요에 따라 유액 부피, 점도, 체중 등에 일차적으로 근거해 선택할 것이다.
고체 제형은 장 (경구) 투여용으로 사용될 수 있다. 이들은 예를 들어, 알약, 정제, 분말 또는 캡슐로서 제형화될 수 있다. 고체 조성물용으로, 통상적인 무독성 고체 담체를 사용할 수 있으며, 여기에는 예를 들어, 약학 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 탈크, 셀룰로오스, 글루코오스, 수크로오스, 마그네슘 카르보네이트 등이 포함된다. 경구 투여를 위해, 약학적으로 허용가능한 무독성 조성물을 정상적으로 사용되는 부형제, 예컨대 이전에 열거된 담체들 중 임의의 것을, 일반적으로 활성 성분 (예, 펩티드) 의 10% 내지 95% 로 도입하여 형성한다. 비-고체 제형은 또한 장 투여용으로 사용될 수 있다. 담체는 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들, 예를 들어, 땅콩유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 포함하는 다양한 오일로부터 선택될 수 있다. 적합한 약학 부형제에는 예를 들어, 전분, 셀룰로오스, 탈크, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 쵸크, 실리카 겔, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 나트륨 클로라이드, 건조 분유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올이 포함된다.
경구로 투여되는 경우, 본 발명의 핵산, 펩티드 또는 폴리펩티드는 소화로부터 보호될 수 있다. 이것은 핵산, 펩티드 또는 폴리펩티드를 산성 및 효소 가수분해에 대해 저항성이 되게 하는 조성물과 복합체화하거나, 핵산, 펩티드 또는 폴리펩티드를 적합한 저항성 담체, 예컨대 리포솜 중에 패키징하여 달성할 수 있다. 소화로부터의 화합물의 보호 수단은 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 치료제의 경구 전달을 위한 지질 조성물을 기재하고 있는 Fix, Pharm Res. 13: 1760-1764, 1996; Samanen, J. Pharm. Pharmacol. 48: 119-135, 1996; 미국 특허 제 5,391,377 (리포좀성 전달이 더욱 상세히 논의되고 있음, infra) 를 참조한다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의할 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 투과되는 장벽에 대해 적합한 침투제가 제형 내에 사용될 수 있다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 경점막 투여를 위해, 담즙산 및 푸시딘산 (fusidic acid) 유도체가 포함된다. 또한, 세제는 투과를 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 경점막 투여는 코 스프레이를 통해 또는 좌약을 사용하여 이뤄질 수 있다. 예를 들어, Sayani, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 13: 85-184, 1996 을 참조한다. 국소, 경피 투여를 위해, 작용제는 연고, 크림, 고약, 분말 및 젤로 제형화된다. 경피 전달 시스템에는 또한 예를 들어, 패치가 포함될 수 있다.
본 발명의 핵산, 펩티드 또는 폴리펩티드는 또한 지속 전달 또는 지속 방출 메카니즘으로 투여될 수 있고, 이것은 제형을 내부에서 전달할 수 있다. 예를 들어, 펩티드의 지속 전달을 가능하게 하는 생분해성 미소구체 또는 캡슐 또는 기타 생분해성 중합체 형상이 본 발명의 제형 내에 포함될 수 있다 (예를 들어, Putney, Nat. Biotechnol. 16: 153-157, 1998 참조).
흡입을 위해, 본 발명의 핵산, 펩티드 또는 폴리펩티드는 건조 분말 에어로졸, 액체 전달 시스템, 에어 제트 분무기, 추진제 시스템 등을 포함하여, 당업계에 공지된 임의의 시스템을 사용하여 전달할 수 있다. 예를 들어, Patton, Biotechniques 16: 141-143, 1998; 예를 들어, Dura Pharmaceuticals (San Diego, Calif.), Aradigrn (Hayward, Calif.), Aerogen (Santa Clara, Calif.), Inhale Therapeutic Systems (San Carlos, Calif.) 등에 의한 폴리펩티드 거대분자용 제품 및 흡입 전달 시스템을 참조한다. 예를 들어, 약학 제형은 에어로졸 또는 분무의 형태로 투여될 수 있다. 에어로졸 투여를 위해, 제형은 계면활성제 및 추진제와 함께 미분된 형태로 공급될 수 있다. 또다른 양상에서, 호흡기 조직에 제형을 전달하기 위한 장치는 제형을 증발시키는 흡입기이다. 기타 액체 전달 시스템에는 예를 들어, 에어 제트 분무기가 포함된다.
본 발명의 제약 제조시, 약동학 및 생체분포를 변경하기 위해 다양한 제형 변형이 사용되고 조작될 수 있다. 약동학 및 생체분포를 변경하기 위한 다수의 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 방법의 예에는 단백질, 지질 (예를 들어, 리포솜, 하기 참조), 탄수화물, 또는 합성 중합체 (상기 논의됨) 와 같은 물질로 구성된 비히클 내의 본 발명의 조성물의 보호가 포함된다. 일반적인 약동학의 논의를 위해, 예를 들어, Remington's, Chapters 37-39 를 참조한다.
본 발명의 핵산, 펩티드 또는 폴리펩티드는 예를 들어, 전신적으로, 지역적으로, 또는 국부적으로 (예, 종양 내로 직접 또는 이에 대해); 동맥내, 경막내 (IT), 정맥내 (IV), 비경구, 능막 내 강, 국소, 경구 또는 국부 투여에 의해, 피하, 기관내 (예, 에어로졸에 의해) 또는 경점막 (예, 구강, 방광, 질, 자궁, 항문, 코 점막) 으로서, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 약학 조성물로서 또는 단독으로 전달될 수 있다. 투여가능한 조성물의 실제 제조 방법은 당업자에게 공지되거나 명백할 것이고, 과학적 및 특허 문헌에 기재되어 있으며, 예를 들어, Remington's 을 참조한다. "지역적 효과" 는 예를 들어, 특정 기관에 초점을 두고 있으며, 투여의 하나의 방식에는 예를 들어, 특정 기관, 예를 들어, 뇌 및 CNS 에 초점을 두기 위한 동맥내 또는 경막내 (IT) 주사가 포함된다 (예를 들어, Gurun, Anesth Analg. 85: 317-323, 1997 참조). 예를 들어, 본 발명의 핵산, 펩티드 또는 폴리펩티드를 뇌에 직접적으로 전달하는 것이 바람직한 경우 목동맥-내 주사가 바람직하다. 높은 전신 투여가 필요한 경우 비경구 투여가 바람직한 경로이다. 비경구로 투여가능한 조성물의 실제 제조 방법은 당업자에게 공지되거나 명백할 것이고, 예를 들어, Remington's 에 상세히 기재되어 있다. 또한, Bai, J. Neuroimmunol. 80: 65-75, 1997; Warren, J. Neurol. Sci. 152: 31-38, 1997; Tonegawa, J. Exp. Med. 186: 507-515, 1997 을 참조한다.
하나의 양상에서, 본 발명의 핵산, 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 약학 제형은 지질 단층 또는 이중층, 예를 들어, 리포솜에 혼입되고, 예를 들어, 미국 특허 제 6,110,490 호; 제 6,096,716 호; 제 5,283,185 호; 제 5,279,833 호를 참조한다. 본 발명은 또한 본 발명의 수용성 핵산, 펩티드 또는 폴리펩티드가 단층 또는 이중층의 표면에 부착되는 제형을 제공한다. 예를 들어, 펩티드는 히드라지드-PEG-(디스테아로일포스파티딜) 에탄올아민-함유 리포솜에 부착될 수 있다 (예를 들어, Zalipsky, Bioconjug. Chem. 6: 705-708, 1995 참조). 리포솜 또는 임의의 형태의 지질막, 예컨대 평면 지질막 또는 손상되지 않은 세포, 예를 들어, 적혈구의 세포막을 사용할 수 있다. 리포솜 제형은 정맥내로, 경피로 (예를 들어, Vutla, J. Pharm. Sci. 85: 5-8, 1996 참조), 경점막으로, 또는 구강으로의 투여를 포함하는 임의의 수단에 의할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산, 펩티드 및/또는 폴리펩티드가 마이셀 및/또는 리포솜 내에 혼입되는 약학 제제를 제공한다 (예를 들어, Suntres, J. Pharm. Pharmacol. 46: 23-28, 1994; Woodle, Pharm. Res. 9: 260-265, 1992 참조). 리포솜 및 리보솜 제형은 표준 방법에 따라 제조될 수 있고, 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, Remington's; Akimaru, Cytokines Mol. Ther. 1: 197-210, 1995; Alving, Immunol. Rev. 145: 5-31, 1995; Szoka, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467, 1980, 미국 특허 제 4, 235,871 호, 제 4,501,728 호 및 제 4,837,028 호를 참조한다.
하나의 구현예에서, 활성 화합물은 화합물을 체내로부터 빠른 배출에 대해 보호할 담체, 예컨대 이식물 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는, 제어 방출 제형과 함께 제조된다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물 (polyanhydrides), 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 물질은 또한 Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc 에서 시판되어 구입할 수 있다. 리포좀 현탁액 (바이러스 항원에 대한 단일클론 항체로 감염된 세포에 표적하는 리포솜을 포함) 은 또한 약학적으로 허용가능한 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 예를 들어, 미국 특허 제 4,522,811 호에 기재된 바와 같이, 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
투여의 용이함 및 투여량의 균일성을 위해 경구 또는 비경구 조성물을 투여 단위로 제형화하는 것이 유리하다. 본원에 사용되는 바와 같은 투여 단위 형태는 치료되는 대상에 대해 단위 투여량으로 맞춰진 물리적으로 분리된 단위를 말한다 (각각의 단위는 필요한 약학 담체과 함께 바람직한 치료 효과를 생성하기 위해 계산된 미리 결정된 활성 화합물의 양을 함유한다).
이러한 화합물의 독성 및 치료 효능은 예를 들어, LD50 (집단의 50% 에 치명적인 투여량) 및 ED50 (집단의 50% 에 치료적으로 유효한 투여량) 을 측정하기 위해, 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차에 의해 측정할 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이의 투여 비가 치료적 지표이고, 이것은 비율 LD50/ED50 으로서 표현될 수 있다. 높은 치료적 지표를 나타내는 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물을 사용할 수 있긴 하지만, 미감염된 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화하여, 부작용을 감소시키기 위하여 환부 조직에 이러한 화합물을 표적하는 전달 시스템을 고안하기 위해 주의를 기울여야만 한다.
세포 배양 검정법 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에서 사용하기 위한 투여량 범위를 제형화 하는데 사용할 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 없는 ED50 을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 사용되는 투여량 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 다르게 상기 범위 내에서 다양할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 임의의 화합물에 대해, 치료적으로 유효한 투여량은 처음에 세포 배양 검정법으로부터 추정될 수 있다. 투여량은 세포 배양에서 측정된 바와 같이, IC50 (즉, 증상의 절반-최대 억제를 달성하는 시험 화합물의 농도) 을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해, 예를 들어, 바람직하지 않은 염증을 포함하는 염증 또는 장애의 동물 모델에서 제형화할 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 투여량을 보다 정확하게 결정하기 위해 사용될 수 있다. 혈장에서의 수준은 예를 들어, 일반적으로 표지된 작용제의 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정할 수 있다. 연구, 예를 들어, 전임상 프로토콜에서 유용한 동물 모델은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 염증 장애에 대한 동물 모델, 예컨대 Sonderstrup (Springer, Sent. Immunopathol. 25: 35-45, 2003) 및 Nikula et al., Inhal. Toxicol. 4(12): 123-53, 2000) 에 기재된 것들, 및 예를 들어, 진균 감염, 패혈증, 사이토메갈로바이러스 감염, 결핵, 나병, 바이러스 간염, 및 감염 (예를 들어, 마이코박테리아에 의한) 에 대해 당업계에 공지된 것들이 있다.
본원에 정의된 바와 같은, 치료적 유효량의 단백질 또는 폴리펩티드, 예컨대 항체 (즉, 유효 투여량) 는 약 0.001 내지 30 mg/kg 체중, 예를 들어, 약 0.01 내지 25 mg/kg 체중, 약 0.1 내지 20 mg/kg 체중, 또는 약 1 내지 10 mg/kg, 2 내지 9 mg/kg, 3 내지 8 mg/kg, 4 내지 7 mg/kg, 또는 5 내지 6 mg/kg 체중의 범위이다. 단백질 또는 폴리펩티드는 약 1 내지 10 주, 예를 들어, 2 내지 8 주, 약 3 내지 7 주, 또는 약 4, 5, 또는 6 주 동안 1 일 당 또는 1 주 당 1 회 또는 수회 투여될 수 있다. 일부 예에서, 투여량은 여러 주 또는 그 이상에 걸쳐 필요할 수 있다. 당업자는 질환 또는 장애의 중증도, 선행 치료, 대상의 일반적 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 기타 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는 특정 인자가, 대상을 효과적으로 치료하는데 필요한 투여량 및 타이밍에 영향을 미칠 수 있다는 것을 인식할 것이다. 게다가, 치료적 유효량의 작용제, 예컨대 단백질 또는 폴리펩티드 (항체 포함) 로의 대상의 치료에는 단일 치료가 포함될 수 있거나, 바람직하게는, 일련의 치료가 포함될 수 있다.
항체에 대해, 투여량은 일반적으로 0.1 mg/kg 체중 (예를 들어, 10 mg/kg 내지 20 mg/kg) 이다. 부분적 인간 항체 및 완전한 인간 항체는 일반적으로 다른 항체보다 인체 내에서 더 긴 반감기를 갖는다. 따라서, 더 적은 투여량 및 덜 빈번한 투여가 종종 가능하다. 섭취 및 조직 침투 (예, 뇌 내로) 를 향상시키기 위해 변형, 예컨대 지질화 (lipidation) 가 사용될 수 있다. 항체의 지질화 방법은 Cruikshank et al., J. Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology, 14: 193, 1997) 에 의해 기재되어 있다.
본 발명은 톨-유사 수용체 2 를 통한 신호를 조정하여 Scd1 유전자 발현 또는 Scd1 유전자 산물의 발현 또는 활성을 조정하는 작용제 또는 화합물을 포함한다. 작용제는 예를 들어, 소형 화학 분자일 수 있다. 이러한 소형 화학 분자에는 펩티드, 펩티드모방성 (예, 펩토이드), 아미노산, 아미노산 유사체, 분자량이 몰 당 약 10,000 그램 미만인 소형 비-핵산 유기 화합물 또는 무기 화합물 (즉, 헤테로유기 및 유기금속 화합물 포함), 분자량이 몰 당 약 5,000 그램 미만인 유기 또는 무기 화합물, 분자량이 몰 당 약 1,000 그램 미만인 유기 또는 무기 화합물, 분자량이 몰 당 약 500 그램 미만인 유기 또는 무기 화합물, 및 이러한 화합물의 염, 에스테르 및 기타 약학적으로 허용가능한 형태가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
예시적 투여량에는 대상 또는 샘플 중량 킬로그램 당 소형 화학 분자의 양 밀리그램 또는 마이크로그램 (예, 킬로그램 당 약 1 마이크로그램 내지 킬로그램 당 약 500 밀리그램, 킬로그램 당 약 100 마이크로그램 내지 킬로그램 당 약 5 밀리그램, 또는 킬로그램 당 약 1 마이크로그램 내지 킬로그램 당 약 50 마이크로그램) 이 포함된다. 게다가 적합한 소형 화학 분자의 투여량은 조정되는 발현 또는 활성과 관련한 소형 화학 분자의 잠재력에 따라 다르다는 것으로 이해된다. 하나 이상의 상기 소형 화학 분자를 본 발명의 폴리펩티드 또는 핵산의 발현 또는 활성을 조정하기 위해 동물 (예, 인간) 에게 투여하려는 경우, 내과 의사, 수의사 또는 연구자가 예를 들어, 처음에는 비교적 낮은 투여량을 처방하고 이어서 적합한 응답이 수득될 때까지 투여량을 증가시킬 수 있다. 또한, 임의의 특정 동물 대상에 대한 특이적 투여 수준은 사용되는 특이적 화합물의 활성, 대상의 연령, 체중, 일반적 건강, 성별, 및 식이, 투여 시기, 투여 경로, 배출률, 임의의 약물 조합, 및 조정되는 발현 또는 활성의 정도를 포함하는 다양한 인자에 따라 다를 것이라는 것으로 이해된다.
항체 또는 그의 단편은 예를 들어, 또다른 치료적 부분, 예컨대 치료제 또는 방사능 금속 이온에 공유적으로 및/또는 연결자로 연결되어, 공액체를 형성할 수 있다. 치료제에는 항생제 (예, 닥티노마이신 (이전의 악티노마이신), 블레오마이신, 미스라마이신, 및 안트라마이신 (AMC)) 이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 기재된 공액체는 제시된 생물학적 응답을 변형하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체에 결합된 부분은 바람직한 생물학적 활성을 소유하는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질에는 예를 들어, 독소, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 (Pseudomonas) 외독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예컨대 종양 괴사 인자, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 신경 성장 인가, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성제; 또는 생물학적 응답 변형제가 포함될 수 있다.
대안적으로는, 항체는 미국 특허 제 4,676,980 호의 Segal 에 의해 기재되는 바와 같이 두번째 항체에 공액되어 항체 헤테로공액체를 형성할 수 있다.
약학 조성물은 용기, 팩, 또는 디스펜서에 투여용 지침과 함께 포함될 수 있다.
본원에 기재된 화합물은 본원에 기재된 치료 방법 중 임의의 것에 사용하기 위한 의약의 제조를 위해 사용할 수 있다.
약학 조성물은 일반적으로 멸균의, 실질적으로 등장성이고, 미국 식약청의 모든 Good Manufacturing Practice (GMP) 규정에 어긋나지 않게 제형화된다.
치료 섭생: 약동학
본 발명의 약학 조성물은 투여 방법에 따라 다양한 단위 투여 형태로 투여될 수 있다. 전형적 핵산, 펩티드 및 폴리펩티드 약학 조성물에 대한 투여량은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 이러한 투여량은 전형적으로는 사실상 권고되고, 특정 치료적 정황, 환자 순응 등에 따라 다르게 조절된다. 이를 달성하기에 적합한 핵산, 펩티드 또는 폴리펩티드의 양이 "치료적으로 유효한 투여량" 으로서 정의된다. 상기 용도에 효과적인 투여 스케쥴 및 양, 즉, "투여 섭생" 은 질환 또는 상태의 단계, 질환 또는 상태의 중증도, 환자의 일반적 건강 상태, 환자의 신체 상태, 연령, 약학 제형 및 활성제의 농도 등을 포함하는 다양한 인자에 따라 다를 것이다. 환자에 대한 투여 섭생 계산 시, 투여 방식을 또한 고려한다. 투여 섭생은 또한 약동학, 즉, 약학 조성물의 흡수, 생체이용성, 대사, 제거 등의 비율을 고려해야만 한다. 예를 들어, 최신 Remington's; Egleton, Peptides 18: 1431-1439, 1997; Langer, Science 249: 1527-1533, 1990 을 참조한다.
치료 적용에서, 조성물을 자가면역 질환, 감염성 질환, 항원 제시 세포 결손 또는 CD4 세포 결손을 겪는 환자에게 상태 또는 질환 및/또는 그의 합병증을 적어도 부분적으로 저지하기에 충분한 양으로 투여한다. 예를 들어, 하나의 양상에서, 정맥내 (IV) 투여에 대한 가용성 펩티드 약학 조성물 투여량은 수 시간 (전형적으로는 1, 3, 또는 6 시간) 에 걸쳐 약 0.01 mg/hr 내지 약 1.0 mg/hr 으로 투여될 것이고, 이것은 간헐 사이클로, 수 주 동안 반복될 수 있다. 특히 약물을 혈류 내가 아닌 격리 부위, 예컨대 체강 내 또는 기관의 내강 내에, 예를 들어, 뇌척수액 (CSF) 에 투여하는 경우 고려할만하게 더 높은 투여량 (예를 들어, 약 10 mg/ml 까지의 범위에 이름) 이 사용될 수 있다.
본 발명을 수행하기 위한 특정 구현예의 하기 예시는 단지 예증의 목적을 위해 제공되며, 어떤 식으로도 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1
플레이크 ( Flake ): 면역결핍과 관련된 가시적 표현형변이체 ( Phenovariant ).
정상 면역 기능에 필요한 유전자를 확인하기 위해, 총 20,792 F1 및 33,202 F3 동물을 가시적 및 면역학적 표현형에 대해 ENU-유도 생식선 돌연변이로 스크리닝하였다. 이 중에서, "플레이크" (flk) 라고 부르는 열성 돌연변이가 진행 탈모증 및 만성 박탈성 피부염을 일으키는 것을 발견하였다. 이들 특성은 이유 연령에서 나타났고, 나이든 동물에서 더욱 두드러졌다 (도 1). 항생제 요법이 필요한 표피 완전성 (epidermal integrity) 의 가시적 분열 및 자발적 피부 감염은 상기 마우스에서의 선천적 면역 기능의 완전성을 시험하도록 촉구하였다.
도 1 은 플레이크 돌연변이체 마우스에서 관찰된 가시적 표현형을 보여준다. A. 6-주령 마우스. B. 8-개월령 마우스. C. 8-개월령 마우스에서의 눈 감염. D. 중증 피부염을 강조하는 B 에서 보여준 마우스의 확대
실시예 2
fik / flk 돌연변이체 마우스에서 지속성 화농성 연쇄구균 및 황색 포도상구균 피부 감염
그람-양성 cocci S. pyogenes 및 S. aureus 는 인간 농가진, 연조직염, 및 상처 감염의 선도 작용제이다. Guay, Expert. Opin. Pharmacother. 4: 1259-1275, 2003; Hedrick, Paediatr. Drugs 1:35-46, 2003. 쥣과 모델에서의 실험적 전체-두께 피부 감염은, 경피 (epicutaneous) 접종과 관련된 외상성 손상 및 열악한 감염력 및 재현성에 대한 필요조건을 극복하는, 가는-게이지 바늘로의 즉각 피하 주사에 의해 쉽게 달성할 수 있다. Bunce et al, Infect. Immun. 60:2636-2640, 1992; Kraft et al, Infect. Immun. 52:707-713, 1986; Nizet et al, Nature 414:454-457, 2001.
화농성 연쇄구균, 황색 포도상구균, 및 Escherichia coli 의 발광-태그된 균주를 이용하였고, 이들 각각은 Photorhabdus luminescens 로부터 유래된 박테리아 lux 오페론을 구조적으로 발현하였다. Kuklin et al, Antimicrob Agents Chemother 47:2740-8, 2003. 각각의 감염 진행을 마취된 마우스에서 16 일의 기간에 걸쳐 외부 조도측정 (luminometry) 에 의해 모니터링하였다. 도 2A 에서 예증되는 바와 같이, 정상 C57BL/6 마우스는 5 x 105 cfu 의 S. pyogenes 접종에 의해 성립된 피부 감염을 완전히 제거하는 데 8 일을 필요로 한다. flk/flk 돌연변이체는 접종 후 첫번째 6 일 동안은 유사한 미생물 제거 동역학을 보여주나, 그 이후에는 flk/flk 돌연변이체에서의 미생물 적재 (burden) 가 대조값으로부터 벗어나, 증가되어 실험 기간 동안 유지되는 정점 (plateau) 상태에 도달하였다. 발광은 천천히 감소하여 flk/flk 돌연변이체에서 접종 후 4 주에 배경 수준에 도달하였다.
S. pyogenes 에는 작은, 궤양 상처가 생성되고, 이것은 대조군 마우스에서 8 일까지 거의 완전히 치유된다. 궤양화는 생체 내 검출가능한 발광이 없음에도 불구하고, 감염 후 28 일까지 flk/flk 돌연변이체 마우스에서 여전히 관찰되었다. 발광 S. pyogenes 는 flk/flk 돌연변이체의 궤양을 배양하여 회수되었다. 그러므로, 실험 접종 후 심지어 4 주 후에도, flk/flk 돌연변이체 마우스는 S. pyogenes 으로 지속적으로 감염된 채로 남아있었다.
S. aureus 로의 감염 (도 2B) 은 상기 기재된 것들과 형식적으로 유사한 결과를 산출한다. 관찰 초기 기간 동안, flk/flk 돌연변이체 중의 박테리아 적재는 대조군의 것과 근접하게 매치되나, 대조군 동물에서 점차적인 제거가 달성되면서 (flk/flk 돌연변이체에서는 아님), 접종 후 7 일에 2 개 곡선에서의 이탈이 관찰되어, 2 주 내에 대조군의 완전한 회복을 야기한다. 대조적으로, 발광은 3 주 초과 동안 플레이크 마우스에서 강하게 검출가능하게 남아있고, 접종 후 4 주 이후에 배경 수준에 도달하였다.
반면, flk/flk 돌연변이체는 그람-음성 박테리아 Escherichia coli 로의 감염을 제거할 수 있었다 (도 2C). 게다가, 그람-양성 감염이 기타 경로 (예를 들어, L. monocytogenes 의 정맥내 접종, 또는 S. aureus 를 사용하는 폐내 접종) 에 의해 도입되는 경우, flk/flk 돌연변이체와 정상 대조군 사이에 차이가 발견되지 않았다. 상기 연구에서 인용된 모든 데이터에 근거하여, 하기와 같이 나타 난다: 1. flk/flk 돌연변이체 마우스는 그람-양성 피부 감염을 살균하는 능력이 악화된다; 2. 표현형은 모든 생물학적 구획으로 확장되지 않고, 아마도 피부에 한정된다; 3. 시험된 단일 그람-음성 감염은 돌연변이에 의해 구별되지 않았다; 및 4. E. coli 에 의해 유도된 피부 병변이 flk/flk 마우스에서 정상적으로 치유된다는 사실은 돌연변이가 단독으로 상처 치유에 영향을 주지 않고, 그보다는 병원체 제거에 대해 선택적인 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.
도 2 는 그람 양성 박테리아에 노출된 경우, 지속적 피부 감염이 발달하는 플레이크 돌연변이체 마우스를 보여준다. A. 대조군 (C57BL/6, n=4) 및 S. pyogenes 로 피하 감염된 돌연변이체 (플레이크/플레이크, n=4) 동물에서의 박테리아 성장의 시간-경과 분석. 상부 패널은 각 유전형의 4 마리 동물에서 발광 후 그래프 표현 (초기 접종물의 % 로 표현됨) 정량화를 보여준다. 하부 패널은 접종 후 1, 6, 8 및 14 일에 각 유전형에 대해 2 마리 대표적 마우스에 대한 사진의 오버레이 (overlay) 및 광 검출을 보여준다. B. S. aureus 로의 감염. 사진은 1, 6, 9 및 15 일에 감염된 동물을 보여준다. C. E. coli 로의 감염.
실시예 3
스테아로일 CoA 탈포화효소 1 유전자좌에 대한 flk 돌연변이의 지도작성.
flk 에 의해 부여된 가시적 표현형을 지도작성에 이용하고, 그 후 가시적 및 면역학적 표현형 사이의 일치를 이중교배된 Fl 마우스 뿐 아니라, 유전자좌의 기타 대립유전자 변이체의 잠재성을 시험하여 성립시켰다. flk 를 C3H/HeN 에 대항한 역교배로, 마우스 게놈을 통해 분포된 59 개 정보 마커의 패널을 사용하여 39 감수분열 (meioses) 시 염색체 19 에 대해 최초로 지도를 작성하였다. 표현형은 혼합된 배경에 대해 완전히 관통하였고, 돌연변이를 마커 D19Mit96 과 D19Mit17 사이에 두었다 (도 3A). 그 다음 12 내부 염색체 19 마커를 사용하여 자세한 지도작성을 수행하여, 283 감수분열 시, 돌연변이는 D19Mit11 및 D19Mit53 에 의해 한정된 2.6 Mbp 중요 영역에 제한되었다 (도 3B). Ensembl 데이터베이스 중의 상기 영역 내에 표시되는 43 개 유전자 중에서 (도 3C), asebia-J 및 asebia-2J 라고 불리는 2 개 돌연변이체 대립유전자가 이미 Scd1 에 대해 기재되어 있고, 두 경우에서, 돌연변이체 마우스는 flk 동질접합체에서 관찰되는 것과 유사한 "비늘형 피부" 로 묘사되는 피부 표현형을 나타내므로, 스테아로일 CoA 탈포화효소 1 (Scd1) 유전자를 유망 후보자로서 간주하였다. Sundberg et al., Am J Pathol 156:2067-75, 2000; Zheng et al, Nat Genet 23:268-70, 1999.
도 3 은 플레이크 돌연변이의 지도작성을 보여준다. A. 트랜스게놈 (Transgenomic) 로그 유망성 비율 (Lod 점수, Z) 분석은 마우스 염색체 19 상의 연결의 단일 피크를 보여준다. 총 59 개 정보 마커 (수평 축) 가 분석에 포함되었고, 39 감수분열 (19 야생형 및 17 돌연변이체 동물) 은 모든 마커에서 유전형화되었다. B. 염색체 19 의 말단 영역의 자세한 지도작성. 총 283 감수분열 (3 개 대표를 보여줌) 의 분석은 2.6 Mb 떨어진 2 개 인접 마커 사이의 플레이크 돌연변이의 구속을 야기한다. C. ENSEMBL 데이터베이스에 따른 플레이크 유전자좌에서의 유전자 구성. Scd1 유전자가 강조된다.
Scd1 의 6 엑손을 C57BL/6 대조군 마우스 및 flk/flk 돌연변이체 모두로부터 단리된 게놈 DNA 로부터 증폭시켰다. 엠플리콘의 직접적 서열분석은 엑손 5 에서 지점 돌연변이 (C 에서 A) 를 밝혔고, 이것은 cDNA 서열 중의 위치 #938 에 해당한다 (Accession Number BC055453, 도 4A 참조). 상기 ENU-유도 염기 전치 (transversion) 는 SCD1 내의 미스센스 돌연변이 (T227K) 를 야기할 것으로 예상된다. Scd2 및 Scd3 cDNAs 에서 돌연변이가 검출되지 않았다.
마이크로솜 효소 Scd1 은 6 개의 예상되는 막투과 도메인을 갖는 355 개 아미노산의 철-결합 41kDa 단백질이다. 이것은 그의 주요 산물로서 팔미트올레에이트 (C16:1) 및 올레에이트 (C18:1) 의 생합성을 야기하는, 장쇄 불포화 지방산의 Δ9-탈포화 (desaturation) 에 촉매 작용한다. 도 4B 에서 예증되는 바와 같이, 돌연변이된 단백질에서 중성 아미노산 (T) 의 전하 잔기 (K) 로 치환이, 예상되는 막투과 도메인 내에서 발생하고, SCD1 의 구조적 통합성을 파괴할 것으로 예상될 것이다.
도 4 는 플레이크 돌연변이의 분자 특성을 보여준다. A. 동질접합성 플레이크 돌연변이체 마우스 (위쪽 크로마토그램) 및 정상 동물 (아래쪽 크로마토그램) 로부터의 증폭된 게놈 DNA 의 추적 파일. B. SCD1 단백질의 개요적 표현 및 플레이크 돌연변이의 위치화. 파란색 상자는 SMART 분석에 의해 예상된 막투과 도메인에 해당한다.
상기 가정을 시험하기 위해, 박층 크로마토그래피 (TLC) 를 사용하여 대조군 및 flk/flk 마우스로부터의 피부 생검의 지질 조성을 분석하였다. 후자의 동물은 Scd1 KO 의 경우에서 보고된 바와 유사한 콜레스테롤 에스테르의 감소를 나타내 었고 (도 5A), 이것은 flk 표현형이 Scd1 의 관찰된 대립유전자 변이체에 의해 실제로 야기되었다는 것을 나타낸다.
도 5 는 야생형 및 플레이크 돌연변이체 마우스 중의 지질 함량의 박층 크로마토그래피 분석을 보여준다. A. 야생형 (B6) 또는 플레이크 (flk) 돌연변이체 마우스의 피부 생검으로부터 추출된 지질의 TLC. B. S. aureus 피하 감염 1 시간 또는 24 시간 후 야생형 마우스 (B6 +) 의 피부로부터 정제된 지질의 TLC. M: 마커. Cs : 콜레스테롤, TG : 트리글리세리드, CE : 콜레스테롤 에스테르.
실시예 4
팔미트올레에이트 및 올레에이트는 시험관 내 및 생체 내 고유 항박테리아 활성을 갖는다.
Scd1flk / flk 돌연변이체 마우스에서의 C18 및 C16 지방산 탈포화효소 활성의 부재는 올레에이트 및/또는 팔미트올레에이트의 부재가 상기 기재된 피부 면역결핍 표현형을 예기할 수 있는 지의 여부를 알아보도록 촉구하였다. 게다가, 여러 개의 보고서는 MUFA 가 생체 내 보호 효과를 발휘한다는 증거가 없음에도, MUFA 가 그람-양성 박테리아에 대항하는 항미생물 활성을 나타내는 것으로 지적하고 있다. Miller et al., Arch Dermatol 124:209-15, 1988; Wille and Kydonieus, Skin Pharmacol Appl Skin Physiol 16: 176-87, 2003. 연구 가설을 시험하기 위해, 먼저 일련의 시험관 내 실험을 수행하여, 각 지질의 효과를 S. pyogenes, S. aureus 및 E. coli 의 성장에 대해 측정하였다.
결과는 팔미트올레에이트 및 올레에이트 각각 모두가 S. pyogenes 및 S. aureus 에 대항하는 강한 살박테리아성 및 살균 활성을 갖는다는 것을 확인시켰다. S. pyogenes 에 대한 두 화합물의 최소 억제 농도 (MIC, 표 1 참조) 는 마이크로몰 범위이고, 쥣과 카텔리시딘 AMP (CRAMP) 에 대해 관찰된 것에 필적한다. 중량 기준으로, 그러므로 MUFA 는 카텔리시딘보다 대략 20 배 잠재성이 있다. MUFA 는 또한 S. aureus 에 대항해 활성인 반면, CRAMP 는 총체적으로 비활성이다. 반면, 살박테리아성 또는 살균 활성은 그람-양성 박테리아에 대항하는 특이적 효과에 일치하게, 심지어 밀리몰 MUFA 농도에서도 E. coli 에 대항하여 검출되지 않았다.
표 1. S. pyogenes 및 S. aureus 에 대해 카텔리시딘 항미생물 펩티드 (CRAMP), 올레산 및 팔미트올레산의 μ M 으로 표현된, 최소 억제 농도 ( MIC ) 및 최소 살균 농도 ( MBC )
MIC (μM) MBC (μM)
CRAMP 올레에이트 팔미트올레에이트 CRAMP 올레산 팔미트올레산
S. pyogenes 5.3 +/- 2.3 8.3 +/- 2.9 10 +/- 0.1 11.3 +/- 5.8 13.3 +/- 5.8 10 +/- 0.1
S. aureus 내성 ＞75 36.6 +/- 11.5 내성 nd 50 +/- 15
값은 3 회 실험의 평균을 나타냄. nd, 측정되지 않음.
상기 항미생물 활성의 생리학적 타당성을 조사하기 위해, 야생형 마우스를 S. aureus 로 접종하고, 감염된 동물을 감염 부위에 팔미트올레에이트 (DMSO 중의 100 μM 용액을 100 μl), 또는 DMSO 단독의 반복된 (매 2 일 마다) 피하 주사에 의해 치료하였다. 상기 실험의 결과를 도 6A 및 B 에 예증한다. 양쪽 그룹 의 마우스에 대해 (n=6 동물), 발광은 감염 후 24 시간에 측정된, 초기 접종물의 % 로 표현한다. S. aureus 접종 후 9 일에, 팔미트올레에이트-처리된 동물은 비히클-처리된 마우스와 비교해 발광의 90% 감소를 나타낸다. 개선된 S. aureus 제거의 결과로서, 지질-치료된 동물에서의 궤양성 상처의 직경 (9 일에 측정됨) 은 대조군에서 관찰된 것의 1/4 이다 (도 6C). 시험관 내 및 생체 내 MUFA 의 항박테리아 역량을 명백하게 예증하는 상기 데이터는 또한, 상기 지질-기재 방어 메카니즘이 정상 마우스에서 최대로 효과적이지 않다는 것을 밝힌다.
팔미트올레에이트 투여의 유사한 조건하에서, 플레이크 돌연변이체는 1 및 4 일 사이에 박테리아 성장의 현저한 감소 (또한 야생형 마우스에서 관찰됨) 를 나타냈지만, S. aureus 는 접종 2 주 후에 검출가능하게 남아있었다. 도 6D 및 E 에서 예증되는 바와 같이, 더 높은 투여량의 팔미트올레에이트 (75 mM 용액의 100 μl) 는 flk/flk 돌연변이체에서 박테리아 제거 및 수반된 궤양 치유를 적절하게 개선한다 (도 6F). 그러나, 표현형의 완전한 복구는 상기 약동학적 접근법에 의해 달성되지 않았다.
도 6 은 팔미트올레산이 생체 내 항박테리아 활성을 갖는다는 것을 보여준다. A. 팔미트올레에이트 주사는 야생형 마우스에서의 박테리아 제거를 가속화한다. S. aureus (0 일) 로 접종되고, 매 2 일 마다 비히클 (DMSO) 또는 팔미트올레에이트 주사에 의해 치료된 (화살표) 대조군 (C57BL/6) 마우스에서 발광 (초기 접종물의 % 로 표현됨) 을 측정하였다. B. S. aureus 감염 9 일 후 DMSO (위쪽) 또는 팔미트올레에이트 (아래쪽) 주사에 의해 치료된 대조군 (C57BL/6) 마 우스의 사진. C. DMSO 또는 팔미트올레에이트로 치료된 대조군 (B6) 마우스에서 감염 후 9 일에 측정된 병변의 크기를 보여주는 히스토그램. ** 는 P 값 <0.01 을 나타낸다. D. S. aureus-감염된 플레이크 마우스에서의 팔미트올레에이트 치료. 프로토콜은 팔미트올레에이트의 75 mM 용액의 100 μl 주사로 수행했던 것을 제외하면, A 에서와 유사하다. E. DMSO (위쪽) 또는 팔미트올레에이트 (아래쪽) 치료 후 12 일의 감염된 플레이크 마우스의 사진. F. DMSO 또는 팔미트올레에이트로 치료된 감염된 flk 돌연변이체에서의 병변의 크기 (12 일에 측정됨). * 는 P 값 <0.05 을 나타낸다.
실시예 5
Scd1 의 전사 활성화가 그람-양성 박테리아 감염 동안에 발생하고 TLR2 -의존적이다.
MUFA 의 뜻밖의 생체 내 항미생물 작용은 다른 효과기 분자, 예컨대 CRAMP 의 경우에서와 마찬가지로 그들의 합성이 면역 반응 동안 증가하는 지의 여부를 알아보도록 촉구하였다. Scd1 프로모터의 5 kb 단편을 분석하고, 여러 NF-κB 결합 부위의 존재를 명시하였다 (도 7A). 정상 또는 감염된 마우스로부터의 피부 생검 상에 반-정량적 RT-PCR 실험을 수행하였다. 도 7B 는 Scd1 mRNA 축적이 S. aureus 감염시 대조군 (C57BL/6) 마우스의 피부에서 강하게 유도되는 반면, E. coli 접종은 아무런 효과를 가져오지 않았다는 것을 예증한다. 게다가, Tlr2 유전자가 표적화 파괴된 마우스 (Tlr2-/-) 에서, Scd1 유전자는 그람-양성 박테리아 의 접종에 대해 반응하지 않는다. 그러나, Scd1 전사 유도는 또한 간접 메카니즘에 의해 야기될 수 있고, 감염과 RNA 단리 사이에 24 시간 지연을 제공한다.
도 7 은 마우스 중의 Scd1 유전자 발현의 감염- 및 TLR2-의존성 유도를 보여준다. A. Scd1 프로모터의 SignalScan 분석. NF-κB 및 ISRE (인터페론-자극된 조절 요소) 가 제시된다. B. 비-감염된 대조군 (C57BL/6, 레인 1) 및 Tlr2 -/- (레인 4) 동물의, 또는 S. aureus (레인 2 및 5) 또는 E. coli (레인 3) 에 의한 감염 후 피부 생검 중의 Scd1 및 β-액틴 전사물의 RT-PCR 검출. 30 및 40 회 사이클 후의 PCR 산물을 보여준다. M, 크기 표준. C. 2, 4, 8 및 18 시간 후 야생형 마우스로부터 단리된 대조군 (0) 및 MALP-유도 복막 대식세포 중의 Scd1 및 β-액틴 전사물의 RT-PCR 검출. D. Scd1/β-액틴 비율의 정량화.
TLR 신호를 연구하기 위한 이상적인 시스템을 나타내는 대식세포는 최근 보고된 바와 같이, 또한 Scd1 유전자를 발현한다. Uryu et al., Biochem Biophys Res Commun 303:302-5, 2003. 단리된 대식세포가 Scd1 을 상향조절할 수 있는지의 여부를 측정하기 위해, 그리고 응답 동역학을 측정하기 위해, 야생형 마우스로부터 단리된 복막 대식세포를 합성 대식세포-활성화 리포펩티드 (MALP-2, EMC microcollections GmbH, Germany) 인, 공지된 TLR2 작동제로 자극하였다. Takeuchi et al., J Immunol 164:554-7, 2000. 자극 후 2, 4, 8 및 18 시간에 단리된 RNA 샘플로 RT-PCR 에 의해 Scd1 발현을 조사하였다. 도 7C 및 D 에서 나타나는 바와 같이, Scd1 발현은 MALP 유도 후 2 시간에 증가하여, 18 시간 내에 4 배 증가에 도달한다. Scd1 의 상기 전사 유도는 감염된 동물의 피부에서 증 가된 지질 합성과 관련되었다 (도 5B 참조).
이전에 명시된 바와 같이, Scd1 은 피지선에서 주로 발현되고, 플레이크 뿐 아니라, asebia 및 Scd1 KO 마우스는 상기 구조의 위축을 나타낸다. 그람-양성 병원체에 대항하는 인간 피부 방어에서 유도가능한 Scd1 발현의 잠재적인 타당성을 확증하기 위해, MALP-2 의 효과를 불멸화 인간 피지세포 세포주 SZ95 에서 조사하였다. Zouboulis et al, J. Invest Dermatol. 113: 1011-1020, 1999. 먼저, MALP-2 (그러나 LPS 치료는 아님) 는 빠르고 강력한 염증 반응을 유도하였고, 증가된 IL-6 및 IL-8 생성에 의해 명백해진다 (도 8A 및 B). 그 다음, Scd1 전사가 또한 MALP-2 자극 후 4 시간에 상기 인간 세포주에서 상향 조절된다는 것을 관찰하였다 (도 8C 및 D). 상기 관찰은 지방산 탈포화효소2 (FADS2) 유전자의 발현을 모니터링하여 확장되었다. FADS2 는 Scd1 의 것과 유사한 효소적 특성을 갖는 단백질을 코딩하고, 최근 구순증, 팔 및 다리에 걸친 각화성 발진 및 회음 피부염 에 의해 명백해지는 중증 피부 상태를 겪는 환자에서 결핍되는 것으로 나타났다. Williard et al., J. Lipid Res. 42:501-508, 2001. 인간 피지세포에서, FADS2 는 MALP-2 자극 후 18 시간에 약간 그러나 특이적으로 유도된다.
도 8 은 MALP-2 로 자극받은 인간 피지세포가 염증 반응 및 Scd1 및 FADS2 유전자의 상향 조절을 나타낸다는 것을 보여준다. A. IL-6 생성은 MALP-2 치료 후 (50 ng/ml) SZ95 세포에서 유도된다. LPS 자극 (100 ng/ml) 은 최소 효과를 보여준다. B. A 에서와 동일한 상태에서의 IL-8 의 정량화. C. LPS 및 MALP-2 자극 후 4 및 18 시간에 SCD1 및 FADS2 발현의 RT-PCR 검출. GAPDH 발 현은 대조군으로서 사용되었다. D. GAPDH 신호로 정상화 후 2 개의 독립적 실험 (+/- s.e.m) 에서 측정된 SCD1 및 FADS2 신호의 정량화.
실시예 6
톨-유사 수용체 2-응답성 지질 효과기 경로가 그람-양성 박테리아 피부 감염에 대항하여 포유동물을 보호한다.
SCD1 은 MUFA, 즉 팔미트올레에이트 (C16:1) 및 올레에이트 (C18:1) 의 생합성을 담당하는 효소이다. Ntambi, Prog Lipid Res 34: 139-50, 1995. 이것은 탄소 사슬의 Δ9 cis 탈포화에 촉매 작용하고, 팔미토일-CoA 및 스테아로일-CoA 를 기질로서 사용한다. 지질 대사 중의 상기 효소의 기능은 집중적으로 연구되어 왔다. Ntambi and Miyazaki, Prog Lipid Res 43:91-104, 2004. Scd1-/- 마우스는 야생형 동물보다 두드러지게 마르고, 식이-유도된 비만증에 대해 저항성이며, 효과는 지방산 산화에 관여된 유전자의 증가된 발현에 의해 매개된다. 게다가, obese (ob) 및 Scd1 유전자의 형태저하 (hypomorphic) 돌연변이에 대한 화합물 동질접합체는 obese 표현형의 현저한 쇠약을 나타난다. Ntambi et al., Proc Natl Acad Sci 99: 11482-6, 2002. Scd1 이 ob 돌연변이체에서 과발현된다는 관찰은 렙틴의 대사 작용의 적어도 일부가 Scd1 의 억제로부터 기인한다는 것을 나타낸다. Cohen et al., Science 297:240-3, 2002. Scd1 의 2 가지 자발적 돌연변이체 대립유전자가 기재되어 있고, asebia (ab) -J 및 -2J 로 불린다. Sundberg et al., Am J Pathol 156:2067-75, 2000; Zheng et al, Nat Genet 23:268-70, 1999. 사소한 표현형 차이에도 불구하고, 이들 대립유전자의 각각에 대한 동종접합성은 위축 피지선, 탈모증 및 비늘형 피부와 관련되고, 상기 표현형은 또한 유전자의 표적된 파괴를 갖는 마우스에서 발견된다. Miyazaki et al., J Nutr 131:2260-8, 2001.
본 연구는, 고도로 선택적인 선천적 면역결핍 표현형을 갖는 돌연변이, 플레이크, 가시적 열성 표현형변이체를 제공하고, 이들은 피부로부터 그람-양성 (그러나 그람-음성은 아님) 유기체를 제거하는 것에 실패한다. 표현형-작동된 접근법을 사용하여, flk 돌연변이를 SCD1 단백질의 6 개의 막투과 도메인 중 4 개 내에 있는 미스센스 에러 (T227K) 에 대해 추적하였다. 이러한 영역 중의 전하된 잔기에 의해 중성 잔기를 대체하는 것은 대안적으로는 탈포화효소의 형태를 변형할 수 있고, 이것은 정상적으로 마이크로솜 막 내에 위치하거나, 효소적 활성에 필요한 철 원자의 배위에 영향을 준다. 메카니즘과 관계 없이, 플레이크 돌연변이체 마우스의 피부로부터의 지질 단리물 중의 콜레스테롤 에스테르 (MUFA 를 필요로 하는 생합성) 의 수준의 감소가 증명되고, 새로운 대립유전자가 기능저하임이 확인된다.
여기서, 그람-양성 박테리아에 대항하는 상피의 선천적 면역 중의 SCD1 및 그의 촉매적 활성의 산물이 관련이 있었다. 이전에 Scd1 결핍 마우스에 MUFA-풍부한 식이를 급이하는 것이 돌연변이체 표현형을 완화시키지 않는다는 것이 제시되었고, 이것은 피부의 정상 외양 및 기능을 위해 애초의 MUFA 의 합성이 필요하다는 것을 나타낸다. 그러므로, 시험관 내 관찰을 확장하기 위해, S. aureus-감 염된 마우스에 대한 팔미트올레에이트의 진피내 투여의 효과를 모니터링하였다. 상기 생체 내 실험은 팔미트올레에이트의 반복된 피하 주사는 박테리아 증식을 감소시키고, 궤양성 상처의 감소에 의해 증명된 바와 같이, 감염된 마우스의 회복을 유의하게 개선한다는 것을 보여주었다. 그러나, 팔미트올레산의 상기 유리한 효과는 플레이크 돌연변이체에서 더 높은 투여량의 팔미트올레에이트의 반복된 주사에도 불구하고, 덜 두드러졌다. Scd1 돌연변이체에서 관찰되는 과-활성화된 지질 분해 대사는 주사된 지질의 더 짧은 반감기를 야기할 수 있을 것이고, 상기 불일치를 설명할 수 있을 것이다. 그럼에도 불구하고, 레티노이드 (이것은 피지선의 위축을 유도한다) 로 여드름 치료받은 인간이 부작용으로서 재발성 S. aureus 피부 감염을 겪을 수 있다는 것이 명시되었다. Leyden et al., J Invest Dermatol 86:390-3, 1986. 눈의 그람-양성 박테리아 감염이 또한 이러한 환자에서 명시되어 있다. Egger et al., Ophthalmologe 92:17-20, 1995. 게다가, 눈 감염은 또한 Scd1 KO 마우스에 대해 이전에 명시된 바와 같이 플레이크 돌연변이체에서 관찰되었다 (도 1C 참조). Miyazaki et al., J Nutr 131:2260-8, 2001. flk/flk 마우스로부터의 데이터는 국부 선천적 면역 반응에서 피지선 뿐 아니라, 눈꺼풀의 특수화된 마이봄 (Meibomian) 선을 포함하는 다른 지질-생성 기관의 필수적인 역할을 강조한다.
MUFA 가 선별적으로 그람 양성 박테리아를 용해시키는 메카니즘은 측정되어야 할 것으로 남아있다. 탄소 쇄의 길이 및/또는 불포화 수준은 효율의 중요한 결정 인자일 수 있다. 게다가, 지질 및 AMP 간의 상승작용을 또한 시험할 수 있다. 플레이크/CRAMP 이중 녹-아웃 (knock-out) 마우스는 상기 주제를 연구하기 위한 유용한 도구로 입증될 것이다. 실험은 그들의 항미생물 활성 외에도, 팔미트올레에이트 및 올레에이트가 간접적으로 내성을 촉진할 수 있을 것이라는 가능성을 배재하지 않는다. 단백질 변형을 통한 신호 전달의 조정은 이러한 메카니즘 중 하나일 수 있다. 보고된 바와 같이, 질량 분석법으로 src 상동 도메인 3 키나아제 Fyn 의 기타 번역-후 변형 중에서 팔미트올레에이트를 확인하였고, 이것은 최근 근육 세포에서 인슐린 신호에 대해 제시된 바와 같이, 면역 세포 활성화에 영향을 줄 수 있다. Liang et al., J Biol Chem 279:8133-9, 2004; Rahman et al., Proc Natl Acad Sci 100: 11110-5, 2003.
SCD1 전사는 TLR2-의존적 방식으로 마우스 및 인간 세포에서 강하게 상향조절된다. 드문 피부 장애, 예컨대 무모증 및 광선공포증이 있는 여포성 어린선 증후군 (IFAP 증후군, OMIM 308205) 의 인간 환자는 위축 피지선을 소유하고, 동시에 플레이크 (Flake) 표현형을 연상하게 하는 탈모증 및 재발성 피부 감염을 겪는다 (Alfadley et al., Pediatr. Dermatol. 20:48-51, 2003 에 검토됨). TLR2 및 6 이 인간 피지세포에서 발현된다는 새로운 인식과 함께 (Zouboulis et al., 준비중), 결과는 피부 선천적 면역 방어에서 두드러지고 예기치 않은 피지선의 역할에 초점을 둔다. 모두 함께, 데이터는 피부 중의 유도가능 지질-기재 살균 효과기 경로의 존재를 나타내고, 지질 대사 및 선천적 면역 사이의 명백한 기능적 연결이 성립된다.
실시예 7
물질 및 방법
마우스. N-에틸-N-니트로소우레아 (ENU) 를 사용하는 생식선 돌연변이유발은 Hoebe et al., J Endotoxin Res 9:250-5, 2003 에 기재되어 있다. 동물을 The Scripps Research Institute 의 Immunology Department 의 동물 보호 시설에서 병원체가 없는 상태로 유지하였다. 실험에 사용된 모든 마우스는 8-12 주령이였다. 마우스의 취급 및 실험 절차는 동물 관리 및 이용에 관한 지침에 따라 수행하였다.
박테리아. S. aureus Xen8.1 (모 균주 8325-4), S. pyogenes Xen20 (혈청형 M49 로부터 유래됨, 균주 591) 및 E. coli Xen14 (EPEC WS2572 로부터 유래됨) 를 Xenogen (Carnbury, NJ) 로부터 수득하였다.
세포 배양. SZ95 피지세포를 10% 열 불활성화 FCS, 5 ng/ml 인간 표피 성장 인자, 1 mM CaCl2, 10-5 M 팔미트산, 50 μg/ml 젠타마이신이 보충된 HSG-Med (Sebomed, Berlin, Germany) 에서 50 ng/ml MALP-2 또는 100 ng/ml LPS 의 유무에 대해 2, 4, 8 및 18 시간 동안 유지시키고, 상청액을 ELISA 에 의한 IL6 및 IL8 평가를 위해 수집하였다. RNA 를 RNeasy Midi kit (Qiagen, Hilden, Germany) 에 의해 4- 및 18-시간 샘플로부터 단리하고, RT-PCR 를 위해 RNase-Free DNase 세트 (Qiagen) 로 정제하였다.
시약. 팔미토올레산 및 올레산을 Sigma 에서 구입하였다. S. minesota Re595 LPS 를 Alexis (Carlsbad, CA) 로부터, MALP-2 를 EMC microcollections GmbH (Tubingen, Germany) 로부터 수득하였다.
피부 감염. 기하급수적인 성장 단계의 박테리아 배양물을 원심분리하고, 펠렛을 담체로서 사용된 비활성 Cytodex 비이드 (Sigma) 10 mg/ml 을 함유하는 10 부피의 PBS 중에 재현탁시킨다. 100 μl 중의 대략 5x105 c.f.u 의 발광 박테리아를 마취된 동물의 등에 피하로 주사하였다. 접종 전 화학적 탈모에 의해 모발을 제거하였다. CCD 카메라 (동물 5 분 노출) 로 발광을 매일 모니터링하고, Xenogen 의 IVIS 프로그램으로 정량화를 수행하였다.
박층 크로마토그래피. 클로로포름/메탄올에 의해 피부 생검으로부터 추출한 총 지질을 실리카 겔 TLC 에 의해 분리하였다. 헥산/디에틸 에테르/아세트산 (70:30:1) 을 전개 용매로서 사용하였고, 지질을 프리멀린 (primuline) 용액 (100 ml 아세톤/물, 80/20 중의 5 mg) 을 분사한 후 UV 램프 하에서 가시화하였다.
반-정량적 RT - PCR . 야생형 및 Tlr2-/- 돌연변이체 마우스의 털을 뽑고, S. aureus 또는 E. coli (5 X 105 pfu) 의 경피 주사에 의해 감염시켰다. 24 시간 후, 감염 영역의 피부를 절개하고, Trizol (Gibco) 방법에 의해 총 RNA 를 추출하였다. oligodT-프라이머된 cDNA (Retroscript™, Ambion) 를 합성하기 위해 1 μg 의 RNA 를 사용하였고, 이것은 그 다음 Scd1 (게놈 및 cDNA 증폭 사이의 구별을 가능하게 하는, 엑손 5 중의 3'-ctctatggatatcgcccctacgacaagaacattc-5' 및 엑손 6 중의 3'-gaagctaggaacaaggagggatgtattcaggagg-5') 또는 β-액틴 유전자에 대해 특이적인 프라이머를 사용하는 PCR 반응 중의 주형으로서 담당한다. 4 μ l 의 PCR 반응물을 아가로오스 젤에 적재하였다. 복막 대식세포의 단리 및 자극은 다른 곳에 기재되어 있다. Hoebe et al., J Endotoxin Res 9:250-5, 2003. hSCD1 및 hFADS2 발현 SZ95 피지세포를 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하는 반-정량적 RT-PCR 에 의해 측정하였다:
Figure 112008012768859-PCT00001
글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소 (GAPDH) 발현을 대조군으로서 사용하였다.
본 명세서에 언급된 모든 공개 및 특허 출원은 각 개별 공개 또는 특허 출원이 모든 목적을 위해 참조로서 인용되는 것으로 특이적으로 및 개별적으로 표시된 경우 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로서 본원에 인용된다.
상기 발명이 이해의 명확성을 목적으로 예증 및 예시의 방식으로 일부 상세히 기재되었지만, 당업자에게는 본 발명의 교시의 견지에서, 청구의 범위의 취지 또는 범주로부터 벗어남 없이 특정 변화 및 변형이 이뤄질 수 있다는 것이 쉽게 명백해질 것이다.

Claims (68)

  1. 대상에게 Scd1 유전자 발현을 활성화시키는 유효량의 화합물을 투여하는 것을 포함하는 포유류 대상에서의 그람 양성 박테리아 감염의 치료 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 화합물이 톨-유사 수용체 2 의 작용제인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 화합물이 소형 화학 분자, 항체, 안티센스 핵산, 짧은 헤어핀 RNA, 또는 짧은 간섭 RNA 인 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 그람 양성 박테리아 감염이 화농성 연쇄구균 감염 또는 황색 포도상구균 감염인 방법.
  5. 제 2 항에 있어서, 대상이 Scd1 유전자에서 기능의-손실 또는 감소된 기능 돌연변이를 갖는 방법.
  6. 대상에게 Scd1 유전자 산물을 활성화시키는 유효량의 화합물을 투여하는 것을 포함하는 포유류 대상에서의 그람 양성 박테리아 감염의 치료 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 화합물이 톨-유사 수용체 2 의 작용제인 방법.
  8. 제 6 항에 있어서, 화합물이 소형 화학 분자, 항체, 안티센스 핵산, 짧은 헤어핀 RNA, 또는 짧은 간섭 RNA 인 방법.
  9. 제 6 항에 있어서, 그람 양성 박테리아 감염이 화농성 연쇄구균 감염 또는 황색 포도상구균 감염인 방법.
  10. 제 7 항에 있어서, 대상이 Scd1 유전자에서 기능의-손실 또는 감소된 기능 돌연변이를 갖는 방법.
  11. 대상에게 유효량의 단일불포화 지방산을 투여하는 것을 포함하는 포유류 대상에서의 그람 양성 박테리아 감염의 치료 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 단일불포화 지방산이 팔미트올레에이트 또는 올레에이트인 방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 그람 양성 박테리아 감염이 화농성 연쇄구균 감염 또는 황색 포도상구균 감염인 방법.
  14. 제 11 항에 있어서, 유효량의 단일불포화 지방산의 투여가 국소 또는 진피내 인 방법.
  15. 제 11 항에 있어서, 유효량의 단일불포화 지방산의 투여가 근육내, 피하, 복강내, 또는 정맥내인 방법.
  16. 대상에게 Scd1 생합성 경로의 산물인 유효량의 화합물을 투여하는 것을 포함하는 포유류 대상에서의 그람 양성 박테리아 감염의 치료 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 화합물이 단일불포화 지방산인 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 단일불포화 지방산이 팔미트올레에이트 또는 올레에이트인 방법.
  19. 제 16 항에 있어서, 그람 양성 박테리아 감염이 화농성 연쇄구균 감염 또는 황색 포도상구균 감염인 방법.
  20. 제 16 항에 있어서, 유효량의 단일불포화 지방산의 투여가 국소 또는 진피내인 방법.
  21. 제 16 항에 있어서, 유효량의 단일불포화 지방산의 투여가 근육내, 피하, 복 강내, 또는 정맥내인 방법.
  22. 톨-유사 수용체 2 를 발현하는 세포를 포함하는 세포-기재 검정법 시스템과 시험 화합물을 접촉시키는 것,
    톨-유사 수용체 2 신호는 리간드에 대한 응답성 (responsiveness) 에 신호를 주고 Scd1 유전자 발현 조정을 할 수 있는, 톨-유사 수용체 2 신호를 활성화시키기에 유효한 것으로 선택된 양으로 리간드를 검정법 시스템에 제공하는 것, 및
    검정법에서 시험 화합물의 유효성은 그람 양성 살균 활성의 지표인, 톨-유사 수용체 2 신호 및 Scd1 유전자 발현 조정에 대한 시험 화합물의 효과를 검출하는 것을 포함하는,
    세포에서의 그람 양성 살균 활성을 조정하는 화합물의 확인 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 리간드가 내인성 리간드 또는 외인성 리간드인 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 외인성 리간드가 지질다당류, 지질 A, 디-아실화 리포펩티드, 트리-아실화 리포펩티드, S-MALP-2, R-MALP-2, 박테리아 리포펩티드, Pam2CSK4, 리포테이코산, 또는 지모산 A 인 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 외인성 리간드가 S-MALP-2 또는 R-MALP-2 인 방법.
  26. 제 23 항에 있어서, 외인성 리간드가 거친 지질다당류, 매끈한 지질다당류, 또는 살모넬라 미네소타로부터의 지질 A 인 방법.
  27. 제 23 항에 있어서, Scd1 유전자 발현 또는 Scd1 유전자 산물은 세포와 외인성 리간드와의 접촉에 대한 반응으로 활성화되는, 검출 단계가 세포에서 Scd1 유전자 발현 또는 Scd1 유전자 산물의 활성화를 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 외인성 리간드가 그람 양성 박테리아 구성성분이나, 그람 음성 박테리아의 구성성분은 아닌 방법.
  29. 제 23 항에 있어서, 내인성 리간드가 지질인 방법.
  30. 제 22 항에 있어서, 화합물이 톨-유사 수용체 2 경로 신호의 작용제인 방법.
  31. 제 22 항에 있어서, 검출 단계가 화합물에 의해 톨-유사 수용체 2 에 대한 리간드의 향상된 결합을 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  32. 제 22 항에 있어서, 검출 단계가 세포 검정법에서 증가된 Scd1 유전자 산물을 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  33. 제 22 항에 있어서, 검출 단계가 세포 검정법에서 증가된 Scd1 유전자 산물 활성을 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  34. 제 22 항에 있어서, 검출 단계가 세포 검정법에서 증가된 단일불포화 지방산 합성을 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  35. 제 22 항에 있어서, 세포 검정법이 대식세포를 추가로 포함하는 방법.
  36. 제 22 항에 있어서, 세포 검정법이 피지선으로부터의 세포를 추가로 포함하는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 세포 검정법이 피지세포를 추가로 포함하는 방법.
  38. 제 22 항에 있어서, 검출 단계가 톨-유사 수용체 2 에 대한 표지된 리간드 결합을 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 표지된 리간드가 방사능표지 또는 형광표지된 방법.
  40. 제 22 항에 있어서, 톨-유사 수용체 2 를 검정법 시스템에 제공하는 것, 및 검정법에서 시험 화합물의 유효성은 조정의 지표인, 검정법 시스템에서 톨-유사 수 용체 2 신호에 대한 시험 화합물의 효과를 검출하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  41. 제 22 항에 있어서, 검출 단계가 화합물에 의해 톨-유사 수용체 2 에 대한 리간드의 감소된 결합에 영향을 주는 것을 추가로 포함하는 방법.
  42. 제 22 항에 있어서, 검출 단계가 화합물에 의해 톨-유사 수용체 2 에 대한 리간드의 증가된 결합에 영향을 주는 것을 추가로 포함하는 방법.
  43. 제 22 항에 있어서, 검출 단계가 세포 검정법에서 스테아로일 CoA 탈포화효소 1 활성의 증가를 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  44. 제 43 항에 있어서, 검출 단계가 세포 검정법에서 증가된 단일불포화 지방산 합성을 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  45. 제 22 항에 있어서, 검출 단계가 세포 검정법에서 그람 양성 살균 활성의 증가를 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  46. 대상으로부터 세포 또는 조직을 제거하는 것,
    세포 또는 조직을 톨-유사 수용체 2 에 대한 내인성 리간드 또는 외인성 리간드와 접촉시키는 것,
    리간드에 의해 접촉된 세포 또는 조직 중의 Scd1 유전자 산물의 생성을 측정하는 것, 및
    포유류 대상에서 Scd1 유전자 산물의 감소된 기능 또는 기능 상실을 검출하는 것을 포함하는,
    포유류 대상에서의 그람 양성 박테리아 감염에 대한 위험 인자의 진단 방법.
  47. 제 46 항에 있어서, 세포 또는 조직이 대식세포, 피지세포, 또는 피지선으로부터인 방법.
  48. 제 46 항에 있어서, Scd1 유전자 산물의 감소된 기능 또는 부재가 그람 양성 박테리아 감염에 대한 위험을 증가시키는 방법.
  49. 제 46 항에 있어서, Scd1 유전자 산물의 감소된 기능 또는 부재가 세포에서 단일불포화 지방산의 합성을 감소시키는 방법.
  50. 제 46 항에 있어서, Scd1 유전자 산물의 감소된 기능 또는 부재가 그람 양성 박테리아 감염에 대한 염증 반응을 감소시키는 방법.
  51. 제 50 항에 있어서, Scd1 유전자 산물의 감소된 기능 또는 부재가 환자에서 손상 부위에서 염증 반응을 감소시키는 방법.
  52. 제 46 항에 있어서, Scd1 유전자 산물의 부재가 염증이 바람직한 방어 메카니즘인 상태에 대한 위험을 증가시키는 방법.
  53. 제 46 항에 있어서, 리간드가 외인성 리간드, 리포테이코산 (LTA), 디-아실화 리포펩티드, 트리-아실화 리포펩티드, S-MALP-2, 박테리아 리포펩티드, 펩티도글리칸, 만난, 비메틸화 CpG DNA, 플라겔린, 또는 단일-가닥 RNA 인 방법.
  54. 제 46 항에 있어서, 외인성 리간드가 S-MALP-2 인 방법.
  55. 제 46 항에 있어서, 리간드가 내인성 리간드, 지질, 지방, 스테롤, 지단백질, 지방산, 산화 LDL, 트롬보스폰딘, 또는 β-아밀로이드인 방법.
  56. 단백질 또는 핵산의 존재가 Scd1 유전자 기능의-손실-유도 장애 또는 그에 대한 유전적 소인의 표지인, 포유류 대상으로부터 수득된 세포 샘플, 단백질 샘플 또는 핵산 샘플 중의 돌연변이된 Scd1 단백질 또는 돌연변이된 Scd1 단백질을 코딩하는 핵산의 존재를 측정하는 것을 포함하는, 포유류 대상에서의 Scd1 유전자 기능의-손실-유도 장애 또는 그에 대한 유전적 소인의 진단 방법.
  57. 제 56 항에 있어서, Scd1 유전자 기능의-손실-유도 장애가 그람 양성 박테리 아 감염에 감염되기 쉬움을 증가시키는 방법.
  58. 제 56 항에 있어서, 단백질 샘플 또는 세포 샘플을 항-Scd1 항체와 접촉시키는 것, 및 야생형 또는 돌연변이된 Scd1 단백질의 존재를 검출하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  59. 제 58 항에 있어서, 검출 단계가 포유류 대상으로부터 단핵 식세포 또는 대식세포의 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석을 추가로 포함하는 방법.
  60. 제 56 항에 있어서, 표지된 DNA 또는 RNA 의 검출이 샘플에서 돌연변이된 Scd1 유전자를 코딩하는 핵산 분자의 존재의 지표인, 핵산 샘플을 혼성화 조건 하에서 돌연변이된 Scd1 유전자를 코딩하는 표지된 DNA 또는 RNA 분자와 접촉시키는 것, 및 혼성화 후 표지된 DNA 또는 RNA 분자를 검출하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  61. 제 56 항에 있어서, 제한 효소와 접촉된 후 단편의 부재 또는 핵산의 변경된 단편의 존재가 샘플 중의 돌연변이된 Scd1 유전자를 코딩하는 핵산 분자의 존재의 표지인, 핵산 샘플을 인식 서열이 돌연변이된 Scd1 유전자 중의 돌연변이에 의해 영향을 받는 제한 효소와 접촉시키는 것, 및 제한 효소와 접촉된 후 단편의 존재 또는 부재 또는 핵산의 변경된 단편의 존재를 검출하는 것을 추가로 포함하는 방 법.
  62. 핵산이 Scd1 유전자의 기능의-손실 대립유전자를 포함하고, 동물이 야생형 표현형에 비해 그람 양성 박테리아 감염에 감염되기 쉬운 것을 포함하는 표현형을 나타내는, 이종 핵산을 포함하는 유전자도입 비-인간 동물.
  63. 제 62 항에 있어서, Scd1 돌연변이체 동물의 표현형이 단일불포화 지방산을 합성하지 못하는 능력 또는 위축성 (hypotrophic) 피지선을 특징으로 하는 유전자도입 비-인간 동물.
  64. 제 62 항에 있어서, Scd1 유전자 중의 기능의-손실 대립유전자가 T227K 에서의 아미노산 치환인 유전자도입 비-인간 동물.
  65. 제 62 항에 있어서, 동물이 마우스 또는 래트인 유전자도입 비-인간 동물.
  66. 제 62 항에 따른 유전자도입 비-인간 동물로부터 유래된 세포 또는 세포주.
  67. 제 66 항에 따른 세포 또는 세포주를 시험 화합물과 접촉시키는 것, 및 세포에서 단일불포화 지방산 합성의 양의 증가 또는 감소, 그람 양성 박테리아 감염에 감염되기 쉬움, 또는 톨-유사 수용체 2-유도 대식세포 활성화 활성을 검출하여, 톨 -유사 수용체 2-유도 대식세포 활성화 활성의 조정제로서 시험 화합물을 확인하는 것을 포함하는, 톨-유사 수용체 2-신호 활성의 조정제에 대한 시험관 내 스크리닝 방법.
  68. 제 62 항에 따른 유전자도입 동물을 시험 화합물과 접촉시키는 것, 및 세포에서 단일불포화 지방산 합성의 양의 증가 또는 감소, 그람 양성 박테리아 감염에 감염되기 쉬움, 또는 톨-유사 수용체 2-유도 대식세포 활성화 활성을 검출하여, 톨-유사 수용체 2-유도 대식세포 활성화 활성의 조정제로서 시험 화합물을 확인하는 것을 포함하는, 톨-유사 수용체 2-신호 활성의 조정제에 대한 생체 내 스크리닝 방법.
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