JP2009514788A - 哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染を治療するための組成物及び方法 - Google Patents

哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染を治療するための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

哺乳動物対象におけるグラム陽性細菌感染を治療するための、組成物及び方法を提供する。哺乳動物対象におけるグラム陽性細菌皮膚感染を治療するための、組成物及び方法をさらに提供する。Ｓｃｄ１遺伝子発現を活性化するか、又はＳｃｄ１遺伝子産物を活性化する化合物の有効量を哺乳動物対象に投与することを含む、組成物及び方法をさらに提供する。

Description

政府支援の陳述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈからの交付番号第Ｕ５４−ＡＩ５４５２３による政府支援によりなされた。政府は、本発明において所定の権利を有する。
関連出願の相互参照
本願は、米国仮出願第６０／７０１，２１６号（２００５年７月２０日出願）及びＥｘｐｒｅｓｓ Ｍａｉｌ第ＥＶ ６７０６７２０６１ ＵＳによる、米国出願「ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＴＲＥＡＴＩＮＧ ＧＲＡＭ ＰＯＳＩＴＩＶＥ ＢＡＣＴＥＲＩＡＬ ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ ＩＮ Ａ ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ ＳＵＢＪＥＣＴ」（２００６年７月１９日出願）の優先権を主張し、これらの全体の開示を参照により組み込む。
分野
本発明は、全般的に、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染を治療するするための、組成物及び方法に関する。本発明はさらに、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌皮膚感染を治療するための組成物及び方法に関する。本組成物及び方法はさらに、哺乳動物対象に、Ｓｃｄ１遺伝子発現を活性化する、又はＳｃｄ１遺伝子産物を活性化する化合物の有効量を投与することを含む。
表面上皮は、病原体に対する防御の第一線を構成する。この防御は、バリア機能及び特異的な殺菌性エフェクター分子の両方に依存する。例えば、哺乳動物の皮膚は、高度に架橋したケラチンの層により被覆された、密に連結した細胞から構成されており、正常には細菌を浸透させないなどの理由から、物理的な保護を与える。ヒトにおいて、粘膜上皮異形成又は表皮水疱症などのいくつかの遺伝性疾患（これらは、様々なレベルで皮膚の上皮構造に影響を及ぼす。）は、易感染性が非常に高くなる。Ｖｉｄａｌら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １０：２２９−３４、２９９５；Ｗｉｔｋｏｐら、Ａｍ Ｊ Ｇｅｎｅｔ３１：４１４−２７、１９７９。しかし、皮膚は、その物理的完全性が破られた場合でも、殺菌活性を示す。皮膚は生物活性分子を保有しており、その中でも、ディフェンシン及びカテリシジンなどの抗菌性ペプチド（ＡＭＰｓ）は、微生物侵入に対する宿主防御に対して不可欠で重要なものである（Ｚａｓｌｏｆｆ、Ｎａｔｕｒｅ ４１５：３８９−９５、２００２；Ｚａｓｌｏｆｆ、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４７：１１９９−２００、２００２）。
ＡＭＰｓは最もよく研究されている皮膚防御分子であるが、一方、その他の保護システムもまた存在し得る。皮脂腺により産生されるモノ不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）はこの点に関して言及されており、いくつかのＭＵＦＡは殺菌性であることが知られている。Ｍｉｌｌｅｒら、Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １２４：２０９−１５、１９８８；Ｗｉｌｌｅ及びＫｙｄｏｎｉｅｕｓ、Ｓｋｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ａｐｐｌ Ｓｋｉｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ １６：１７６−８７、２００３。しかし、抗微生物防御に対するこれらの寄与はインビボでは認められておらず、その生合成が微生物刺激による制御に支配されることも分かっていない。当技術分野で、哺乳動物対象での微生物感染に対する反応における、先天性免疫反応を刺激する改良組成物及び方法の開発が必要とされている。さらに、哺乳動物対象におけるグラム陽性細菌感染及びグラム陽性細菌による皮膚感染を治療するための改良組成物及び方法を開発する必要がある。
本発明は、全般的に、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染を治療するするための、組成物及び方法に関する。哺乳動物対象においてグラム陽性細菌皮膚感染を治療するために、組成物及び方法がさらに提供される。ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素１（Ｓｃｄ１）遺伝子発現を活性化するか又はＳｃｄ１遺伝子産物、ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素を活性化する化合物の有効量を哺乳動物対象に投与することを含む、組成物及び方法がさらに提供される。
マウスにおける先天性免疫不全表現型は、モノ不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）合成に必須である酵素の構造に影響を与える突然変異であることが明らかにされている。Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＥＮＵ−誘導性の生殖細胞系列突然変異誘発を使用して、Ｆｌａｋｅ（ｆｌｋ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの劣性生殖細胞系列突然変異が単離、同定された。ｆｌｋ突然変異マウスは、トール様受容体２を活性化することにより先天性免疫反応を誘発する、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化膿連鎖球菌）及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）、グラム陽性病原体による皮膚感染を排除する点で障害がある。ポジショナルクローニング及び配列決定により、ｆｌｋがステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素１遺伝子（Ｓｃｄ１）の新規対立遺伝子であることが分かった。
Ｓｃｄ１遺伝子発現を活性化する化合物の有効量を対象に投与することを含む、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染を治療するための方法が提供される。ある態様において、本化合物はトール様受容体２のアゴニストである。別の態様において、本化合物は、小型の化学分子、抗体、アンチセンス核酸、短いヘアピンＲＮＡ又は短い干渉ＲＮＡである。グラム陽性細菌感染は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化膿連鎖球菌）感染又はＳｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）感染であり得る。さらなる態様において、本方法は、Ｓｃｄ１遺伝子において機能喪失又は機能低下の突然変異を有する対象を治療することを含む。
Ｓｃｄ１遺伝子産物を活性化する化合物の有効量を対象に投与することを含む、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染を治療するための方法が提供される。ある態様において、本化合物はトール様受容体２のアゴニストである。別の態様において、本化合物は、小型の化学分子、抗体、アンチセンス核酸、短いヘアピンＲＮＡ又は短い干渉ＲＮＡである。グラム陽性細菌感染は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化膿連鎖球菌）感染又はＳｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）感染であり得る。さらなる態様において、本方法は、Ｓｃｄ１遺伝子において機能喪失又は機能低下の突然変異を有する対象を治療することを含む。
モノ不飽和脂肪酸の有効量を対象に投与することを含む、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染を治療するための方法が提供される。モノ不飽和脂肪酸は、例えば、パルミトレイン酸又はオレイン酸であり得る。グラム陽性細菌感染は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化膿連鎖球菌）感染又はＳｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）感染であり得る。ある態様において、モノ不飽和脂肪酸の有効量の投与は、局所又は皮内である。別の態様において、モノ不飽和脂肪酸の有効量の投与は、筋肉内、皮下、腹腔内又は静脈内である。
Ｓｃｄ１生合成経路の産物である化合物の有効量を対象に投与することを含む、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染を治療する方法が提供される。ある態様において、本化合物はモノ不飽和脂肪酸である。モノ不飽和脂肪酸は例えば、パルミトレイン酸又はオレイン酸であり得る。グラム陽性細菌感染は例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化膿連鎖球菌）感染又はＳｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）感染であり得る。ある態様において、モノ不飽和脂肪酸の有効量の投与は、局所又は皮内である。別の態様において、モノ不飽和脂肪酸の有効量の投与は、筋肉内、皮下、腹腔内又は静脈内である。
細胞においてグラム陽性殺菌活性を調節する化合物を同定するための方法が提供され、この方法は、トール様受容体２を発現する細胞を含有する細胞に基づくアッセイ系と試験化合物を接触させることと、トール様受容体２シグナリングを活性化するのに有効であるように選択された量でこのアッセイ系にリガンドを提供することと（トール様受容体２シグナリングは、リガンドに対する反応性をシグナル化し、Ｓｃｄ１遺伝子発現を調節することができる。）、トール様受容体２シグナリングにおける、及びＳｃｄ１遺伝子発現の調節における、試験化合物の効果を検出することと（このアッセイにおける試験化合物の有効性はグラム陽性細菌殺菌活性であることを示す。）、を含む。ある態様において、リガンドは、内因性リガンド又は外因性リガンドである。詳細な態様において、外因性リガンドは、リポ多糖類、リピッドＡ、ジアシル化リポペプチド、トリアシル化リポペプチド、Ｓ−ＭＡＬＰ−２、Ｒ−ＭＡＬＰ−２、細菌性リポペプチド、Ｐａｍ２ＣＳＫ４、リポタイコ酸又はザイモサンＡである。さらなる詳細な態様において、外因性リガンドはＭＡＬＰ−２である。さらなる詳細な態様において、外因性リガンドは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ（サルモネラ・ミネソタ）由来のラフ型リポ多糖類、スムース型リポ多糖類又はリピッドＡである。詳細な態様において、外因性リガンドは、グラム陽性細菌の成分であるが、グラム陰性細菌の成分ではない。さらなる詳細な態様において、内因性リガンドは脂質である。本化合物は例えば、トール様受容体２経路シグナリングのアゴニストであり得る。
実施形態において、本方法は、細胞におけるＳｃｄ１遺伝子発現又はＳｃｄ１遺伝子産物の活性化を測定することをさらに含む（ここで、Ｓｃｄ１遺伝子発現又はＳｃｄ１遺伝子産物は、外因性リガンドと細胞との接触に反応して活性化される。）検出段階を含む。
さらなる実施形態において、検出段階が、化合物によるトール様受容体２へのリガンドの結合の促進を測定することをさらに含む方法が提供される。検出段階が、細胞アッセイにおいてＳｃｄ１遺伝子産物の増加を測定することをさらに含む方法が提供される。検出段階が、細胞アッセイにおいてＳｃｄ１遺伝子産物活性の上昇を測定することをさらに含む方法が提供される。検出段階が、細胞アッセイにおいてモノ不飽和脂肪酸合成の上昇を測定することをさらに含む方法が提供される。さらなる態様において、検出段階は、トール様受容体２に結合する標識化リガンドを測定することをさらに含む。標識化リガンドは例えば、放射性標識又は蛍光標識である。
さらなる態様において、本細胞アッセイは、例えば、マクロファージ細胞又は皮脂腺由来の細胞を含み得る。皮脂腺由来の細胞はセボサイト細胞であり得る。
実施形態において、本方法は、トール様受容体２をアッセイ系に提供することと、アッセイ系においてトール様受容体２シグナリングにおける試験化合物の効果（ここで、このアッセイにおける試験化合物の有効性は調節の指標である。）を検出することと、をさらに含む。
実施形態において、検出段階は、化合物によるトール様受容体２へのリガンドの結合の低下をもたらすことをさらに含む。さらなる実施形態において、検出段階は、化合物によるトール様受容体２へのリガンドの結合の上昇をもたらすことをさらに含む。さらなる実施形態において、検出段階は、細胞アッセイにおいてステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素１活性の上昇を測定することをさらに含む。さらなる実施形態において、検出段階は、細胞アッセイにおいてモノ不飽和脂肪酸合成の上昇を測定することをさらに含む。さらなる実施形態において、検出段階は、細胞アッセイにおいてグラム陽性細菌殺菌活性の上昇を測定することをさらに含む。
細胞又は組織を対象から採取することと、トール様受容体２に対する内因性リガンド又は外因性リガンドと細胞又は組織を接触させることと、リガンドと接触した細胞又は組織におけるＳｃｄ１遺伝子産物の産生を測定することと、哺乳動物対象におけるＳｃｄ１遺伝子産物の機能低下もしくは機能喪失を検出することと、を含む、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染に対するリスク因子を診断するための方法が提供される。細胞又は組織は、例えば、マクロファージ、セボサイト又は皮脂腺由来である。
ある態様において、Ｓｃｄ１遺伝子産物の機能低下又は欠如がグラム陽性細菌感染に対するリスクを上昇させるような方法が提供される。別の態様において、Ｓｃｄ１遺伝子産物の機能低下又は欠如により、細胞におけるモノ不飽和脂肪酸の合成が低下する。さらなる態様において、Ｓｃｄ１遺伝子産物の機能低下又は欠如により、グラム陽性細菌感染に対する炎症反応が低下する。詳細な態様において、Ｓｃｄ１遺伝子産物の機能低下又は欠如により、患者における損傷部位での炎症反応が低下する。さらなる態様において、Ｓｃｄ１遺伝子産物の欠如により、炎症が所望の防御機構である状態に対するリスクが上昇する。リガンドは例えば、外因性リガンド、リポタイコ酸（ＬＴＡ）、ジアシル化リポペプチド、トリアシル化リポペプチド、Ｓ−ＭＡＬＰ−２、細菌性リポペプチド、ペプチドグリカン、マンナン、非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ、フラジェリン又は１本鎖ＲＮＡであり得る。リガンドは例えば、内因性リガンド、脂質、脂肪、ステロール、リポタンパク質、脂肪酸、酸化ＬＤＬ、トロンボスポンジン又はβ−アミロイドであり得る。
したがって、哺乳動物対象から得られた、細胞試料、タンパク質試料又は核酸試料において、突然変異Ｓｃｄ１タンパク質又は突然変異Ｓｃｄ１タンパク質をコードする核酸の存在を調べることを含む（ここで、このようなタンパク質又は核酸の存在は、Ｓｃｄ１遺伝子機能喪失により誘発される疾患又はそれに対する遺伝性素因を示す。）、哺乳動物対象においてＳｃｄ１遺伝子機能喪失により誘発される疾患又は遺伝性素因を診断する方法が提供される。ある態様において、Ｓｃｄ１遺伝子機能喪失により誘発される疾患では、グラム陽性細菌感染に対する易感染性が高まる。
実施形態において、本方法は、タンパク質試料又は細胞試料を抗Ｓｃｄ１抗体に接触させることと、野生型又は突然変異Ｓｃｄ１タンパク質の存在を検出することと、をさらに含む。本方法の別の態様において、検出段階は、哺乳動物対象由来の単核食細胞又はマクロファージの蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析をさらに含む。別の態様において、本方法は、ハイブリダイズ条件下で突然変異Ｓｃｄ１遺伝子をコードする標識化ＤＮＡ又はＲＮＡ分子と核酸試料を接触させることと、ハイブリダイゼーション後、標識化ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を検出することと、をさらに含み、ここで、標識化ＤＮＡ又はＲＮＡの検出は、試料中での突然変異Ｓｃｄ１遺伝子をコードする核酸分子の存在を示す。さらなる態様において、本方法は、認識配列が突然変異Ｓｃｄ１遺伝子における突然変異により影響を受ける制限酵素と核酸試料を接触させることと、制限酵素との接触後、断片の有無又は核酸断片の変化があることを検出することと、を含む（制限酵素との接触後、断片の欠如又は核酸断片の変化があることは、試料中での突然変異Ｓｃｄ１遺伝子をコードする核酸分子の存在を示す。）。
異種の核酸を含むトランスジェニック非ヒト動物（この核酸は、Ｓｃｄ１遺伝子の機能喪失対立遺伝子を含有し、この動物は、野生型の表現型に対して、グラム陽性細菌感染に対する易感染性を含む表現型を示す。）が提供される。トランスジェニック非ヒト動物 Ｓｃｄ１突然変異動物の表現型は、例えば、皮脂腺が発育不全であること又はモノ不飽和脂肪酸を合成できないことを特徴とする。トランスジェニック非ヒト動物は、Ｓｃｄ１遺伝子における機能喪失対立遺伝子、例えば、Ｔ２２７Ｋでのアミノ酸置換を有し得る。本トランスジェニック非ヒト動物は、例えば、マウス又はラットであり得る。ある態様において、細胞又は細胞株は、トランスジェニック非ヒト動物由来であり得る。
トール様受容体２−シグナリング活性の調節因子に対するスクリーニングのインビトロ法が提供される（この方法は、トランスジェニック非ヒト動物由来であり得る細胞又は細胞株を試験化合物と接触させることと、細胞におけるモノ不飽和脂肪酸合成量、グラム陽性細菌感染に対する易感染性又はトール様受容体２誘導性のマクロファージ活性化活性の上昇又は低下を検出することと、それによりトール様受容体２誘導性マクロファージ活性化活性の調節因子として試験化合物を同定することと、を含む。）。トール様受容体２シグナリング活性の調節因子に対するスクリーニングのインビボ法が提供される（この方法は、トランスジェニック非ヒト動物由来であり得る細胞又は細胞株を試験化合物と接触させることと、細胞におけるモノ不飽和脂肪酸合成量、グラム陽性細菌感染に対する易感染性又はトール様受容体２誘導性のマクロファージ活性化活性の上昇又は低下を検出することと、それによりトール様受容体２誘導性マクロファージ活性化活性の調節因子として試験化合物を同定することと、を含む。）。
本発明は、全般的に、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染を治療するするための、組成物及び方法に関する。哺乳動物対象においてグラム陽性細菌皮膚感染を治療するために、組成物及び方法がさらに提供される。ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素１（Ｓｃｄ１）遺伝子発現を活性する、又はＳｃｄ１遺伝子産物、ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素を活性化する化合物の有効量を哺乳動物対象に投与することを含む、組成物及び方法がさらに提供される。モノ不飽和脂肪酸である化合物の有効量を対象に投与することを含む、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染を治療するための方法が提供される。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＥＮＵ−誘導性の劣性生殖細胞系列突然変異であるｆｌａｋｅ（ｆｌｋ）は、トール様受容体２（ＴＬＲ２）を活性化することにより先天性免疫反応を誘発する、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化膿連鎖球菌）及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）、グラム陽性病原体による皮膚感染を除去する点で障害がある。ポジショナルクローニング及び配列決定により、ｆｌｋがステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素１遺伝子（Ｓｃｄ１）の新規対立遺伝子であることが分かった。ｆｌａｋｅホモ接合体は、モノ不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）パルミトレイン酸（Ｃ１６：１）及びオレイン酸（Ｃ１８：１）を合成することができない（これらは両者とも、グラム陽性（しかし、グラム陰性ではない）生物に対して殺菌性がある。）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染マウスでの皮内ＭＵＦＡ投与により、細菌排除が促進される。正常なマウスにおいて、Ｓｃｄ１（そのプロモーターにおいて非常に多くのＮＦ−κＢエレメントを有する遺伝子）の転写は、ＴＬＲ２シグナリングにより強力かつ特異的に誘導される。同様に、ヒトセボサイトにおいて、Ｓｃｄ１遺伝子は、ＴＬＲ２シグナリングにより誘導される。これらの観察から、哺乳動物において、制御された、脂質に基づく抗菌エフェクター経路の存在が明らかとなり、グラム陽性細菌感染の治療又は予防に対する新しいアプローチが示唆される。
「患者」、「対象」、「脊椎動物」又は「哺乳動物」は、交換可能に使用され、ヒト患者及び非ヒト霊長類ならびに、ウサギ、ラット及びマウスなどの実験動物及びその他の動物といった哺乳動物を指す。動物には、例えば、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類及び爬虫類など、哺乳動物及び非哺乳動物といった全ての脊椎動物が含まれる。
「治療する」又は「治療」は、症状、合併症もしくは疾病の生化学的指標の発現を予防又は遅延させる、症状を緩和する、又は疾病、状態もしくは疾患（例えば、癌又は転移性の癌）のさらなる進行を抑制もしくは阻止するための、本発明の、抗体組成物、化合物及び物質の投与を含む。治療は、予防的なもの（疾病の発現を遅延させる、又はその臨床的もしくは亜臨床的症状の発現を予防するため）、又は疾患発現後の症状の治療的抑制もしくは緩和であり得る。
細胞におけるトール様受容体の「阻害因子」、「活性化因子」及び「調節因子」は、トール様受容体結合又はシグナリングに対するインビトロ及びインビボアッセイを用いて同定される、それぞれ、阻害する、活性化する、又は調節する分子、例えば、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト及びこれらのホモローグ及び摸倣体、を指すために用いられる。
「調節因子」には、阻害因子及び活性化因子が含まれる。阻害因子は、例えば、トール様受容体に対して、結合する、部分的又は全体的に、刺激をブロックする、活性化を低下、防御、遅延させる、不活性化する、感度を減じる、又はトール様受容体の活性を下方制御する作用物質であり、例えばアンタゴニストである。活性化因子は、例えば、トール様受容体に対して、結合する、刺激する、増加させる、開く、活性化する、促進する、活性化を強化する、感度を上昇させる、又はトール様受容体の活性を上方制御する作用物質であり、例えばアゴニストである。調節因子には、例えば、活性化因子又は阻害因子、受容体と結合するタンパク質とのトール様受容体の相互作用を変化させる作用物質が含まれ、これには、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物、多糖類もしくは上記のものの組み合わせ（例えばリポタンパク質、糖タンパク質など）が含まれる。調節因子には、一般に、天然に生じるトール様受容体リガンドの修飾体（例えば、活性が変化しているもの）、ならびに、天然に生じる、及び合成リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、小型の化学分子などが含まれる。阻害剤及び活性化剤に対する「細胞に基づくアッセイ」には、例えば、本明細書中に記載のように、トール様受容体を発現する細胞に調節因子化合物と推定されるものを適用し、次いで、トール様受容体シグナリングにおける機能的影響を調べることが含まれる。「細胞に基づくアッセイ」には、以下に限定されないが、哺乳動物対象由来のインビボの組織もしくは細胞試料又はインビトロの細胞に基づくアッセイが含まれ、このアッセイは、阻害の程度を調べるために、活性化因子、阻害因子又は調節因子候補で処理したトール様受容体を、阻害因子、活性化因子又は調節因子なしの対照と比較することを含む。対照試料（阻害因子で処理しないもの）の相対的トール様受容体活性値を１００％とし得る。対照に対するトール様受容体活性値が約８０％、場合によっては５０％又は２５から０％となる場合、トール様受容体の阻害となる。対照に対するトール様受容体活性値が１１０％、場合によっては１５０％、場合によっては２００から５００％又は１０００％から３０００％超となる場合に、トール様受容体の活性化となる。
例えば、リガンドと推定されるものがアッセイプレート上で免疫接着コートされたトール様受容体分子に結合する能力によって、分子がトール様受容体に結合する能力を調べることができる。非トール様受容体への結合と比較することにより、結合の特異性を調べることができる。
「試験化合物」は、Ｓｃｄ１又はトール様受容体２の調節因子として試験される何らかの化合物を指す。試験化合物は、何らかの小型の有機分子又はタンパク質などの生物学的存在、例えば、抗体もしくはペプチド、糖、核酸、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉもしくはリボザイムなど、又は脂質であり得る。あるいは、試験化合物は、Ｓｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質の遺伝子操作物である調節因子であり得る。通常、試験化合物は、小型の有機分子、ペプチド、脂質又は脂質類似体である。
ある実施形態において、リガンド又は受容体を固定化することの何れかにより、トール様受容体に結合する抗体をアッセイすることができる。例えば、アッセイには、Ｎｉ−活性化ＮＴＡレジンビーズ上でＨｉｓタグに融合させられたトール様受容体を固定化することが含まれ得る。適切な緩衝液中で抗体を添加し、ある一定温度にてある時間、ビーズをインキュベートし得る。未結合物質を除去するために洗浄した後、例えばＳＤＳ、高ｐＨの緩衝液などを用いて結合タンパク質を解離させ、分析し得る。
「シグナリング反応性」とは、トール様受容体、例えばトール様受容体２、を介したシグナリングを指す。シグナリング反応性は、例えば、トール様受容体２（ＴＬＲ２）及びＳｃｄ１により形成され、それを通じてシグナルが広がる、膜貫通複合体に依存しているＬＰＳ反応を指し得る。ＴＬＲ２シグナルは、直接又は間接的に、ＭＡＬＰ２誘導及びＳｃｄ１発現上昇を介してシグナルを送る。例えばマクロファージ又は皮脂腺細胞においてＴＬＲ２シグナリングが生じ得る。細胞に基づくアッセイにおける測定のためにシグナルを生じさせる化合物は、例えば、酵素又は蛍光物質との共役により生じさせることができる。標識として関心のある酵素は、第一に、加水分解酵素類、特にホスファターゼ、エステラーゼ及びグリコシダーゼ又はオキシダーゼ類、特にペルオキシダーゼである。蛍光化合物には、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが含まれる。化学発光化合物には、ルシフェリン及び２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールが含まれる。
「トール様受容体２シグナリングにおける試験化合物の影響の検出」とは、哺乳動物対象における、疾病、疾患の症状又は疾病の副作用の、軽減、排除又は予防などの、哺乳動物対象における治療的又は予防的効果を指し得る。「トール様受容体２シグナリングにおける試験化合物の影響の検出」とは、例えば、ＴＬＲ２シグナリングのＭＡＬＰ２刺激及びＳｃｄ１遺伝子発現の上方制御により測定されるような、診断アッセイなどの細胞に基づくアッセイにおいて効果を有する化合物を指し得る。Ｓｃｄ１遺伝子における機能喪失突然変異、例えばｆｌａｋｅ突然変異は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化膿連鎖球菌）及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）、トール様受容体２を活性化することにより先天性免疫反応を誘発するグラム陽性病原体による皮膚感染の除去に障害がある。ｆｌａｋｅホモ接合体は、モノ不飽和脂肪酸（ＭＵＦＡ）パルミトレイン酸（Ｃ１６：１）及びオレイン酸（Ｃ１８：１）を合成することができない（これらは両者とも、グラム陽性（しかし、グラム陰性ではない）生物に対して殺菌性がある。）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染マウスでの皮内ＭＵＦＡ投与により、細菌排除が促進される。
本発明が特定の方法、試薬、化合物、組成物又は生物学的系に限定されず、言うまでもなく、これらが様々であり得ることを理解されたい。また、本明細書中で使用される用語が特定の実施形態のみを説明する目的のものであり、限定するものではないことも理解されたい。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、内容によって他に明白に指示されない限り、複数形の意味が含まれる。したがって、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」に対する意味には、２以上の細胞の組み合わせなどが含まれる。
「約」という用語は、本明細書中で使用される場合、量、時間などの測定できる値を指すとき、変動が開示される方法を実施するのに適切であるように、具体的な値から、±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％及びさらにより好ましくは±０．１％の変動を包含するものとする。
他に定められない限り、本明細書中で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の試験に対する実施において本明細書中で述べられるものと同様又は同等であるあらゆる方法及び材料を使用することができるが、好ましい材料及び方法を本明細書中で述べる。本発明を説明し、主張することにおいて、次の技術用語を使用する。
ＳＣＤ１遺伝子発現又はＳＣＤ１遺伝子産物又はトール様受容体２の調節因子としての抗体
本明細書中で具体的に述べられる抗体及びその抗原−結合断片は、トール様受容体２（ＴＬＲ２）と特異的に結合する、及び／又は活性化するか、又はＳｃｄ１遺伝子発現もしくはＳｃｄ１遺伝子産物と特異的に結合するか、及び／又は活性化し、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染に対する先天性免疫反応を調節又は活性化し得る。
ＴＬＲ２に結合する抗体又はＳｃｄ１遺伝子産物に結合する抗体は、トール様受容体２経路を介した細胞におけるシグナリングを調節する化合物として有用である。例えば、Ｔａｋｅｄａ及びＡｋｉｒａ、Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５：１４３−１５３、２００３を参照のこと。
あるいくつかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、ハイブリドーマ細胞株により産生される抗体が選択的に結合する抗原に選択的に結合する（例えば、競合的結合又は同じエピトープへの結合、例えば立体構造又は線状エピトープ）。このように、エピトープは、抗体が結合する既知のエピトープに対して、空間的に近接近している、又は機能的に関連している、例えば、直線的配列もしくは立体配置空間において、重複又は隣接するエピトープであり得る。ペプチドスレッディングプログラムを使用して、コンピュータを用いて可能なエピトープを同定し、例えばトール様受容体２もしくはＳｃｄ１遺伝子産物の、突然変異体又は断片（例えば、トール様受容体２もしくはＳｃｄ１遺伝子産物のドメインの、突然変異体又は断片）への抗体の結合をアッセイすることによってなど、当技術分野で公知の方法を用いて確認することができる。
本明細書中に記載の抗体の配列を決定する方法は当技術分野で公知であり、例えば、ハイブリドーマ細胞株から抗体をコードするｃＤＮＡを単離し同定するために、公知の技術を使用することにより抗体の配列を決定することができる。ｃＤＮＡの配列を決定するための方法は当技術分野で公知である。
本明細書中に記載の抗体は通常、少なくとも１又は２個の重鎖可変領域（ＶＨ）及び少なくとも１又は２個の軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する。ＶＨ及びＶＬ領域は、さらに、超可変性の領域、いわゆる相補性決定領域（ＣＤＲ）に分けることができ、これらには、より保存性が高いフレームワーク領域（ＦＲ）が散在する。これらの領域は詳細に定義されている（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２，１９９１及びＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、１９８７を参照。）。１以上のフレームワーク領域を含有する抗体又は抗体断片もまた本発明において有用である。このような断片は、リポ多糖類により誘発されているトール様受容体２のドメインに特異的に結合する、及び、リポ多糖類により誘導されている細胞においてＳｃｄ１遺伝子産物活性を調節又は活性化する、又はグラム陽性細菌に対する先天性免疫反応を調節もしくは活性化する能力を有する。
本明細書中に記載の抗体は、重鎖及び／又は軽鎖定常領域を含み得（定常領域は通常、抗体と宿主組織又は因子との間の結合に介在し、免疫系のエフェクター細胞及び古典的な補体系の補体第一成分（Ｃ１ｑ）を含む。）、したがって、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖をそれぞれ形成することができる。例えば、抗体は四量体であり得る（２個の免疫グロブリン重鎖及び２個の免疫グロブリン軽鎖であり、これらは例えばジスルフィド結合により結合され得る。）。抗体は、重鎖定常領域の一部（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３と呼ばれる３個の重鎖ドメインのうち１個）、又は軽鎖定常領域の一部（例えば、ＣＬと呼ばれる領域の一部）のみを含有し得る。
抗原−結合断片もまた本発明に含まれる。このような断片は、（ｉ）Ｆａｂ断片（すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる１価断片）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（すなわち、ヒンジ領域でジスルフィド結合により連結されている２個のＦａｂ断片を含有する２価の断片）；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体のシングルアームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６、１９８９）（これは、ＶＨドメインからなる。）及び／又は（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）であり得る。
自動ペプチド合成機器において、又は、全長遺伝子もしくは遺伝子断片の発現によってなど、当技術分野で公知の方法を用いて、抗体の断片（上述のような抗原結合断片を含む。）を合成することができ、例えば、抗体分子のペプシン消化により、Ｓｃｄ１遺伝子産物Ｆ（ａｂ’）２断片を生成させることができ、Ｆａｂ断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を減少させることにより生成させることができる。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片を比較的速く同定できるように、Ｆａｂ発現ライブラリを構成することができる（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−８１、１９８９）。
その他の抗体及び抗体断片を作製する方法は当技術分野で公知である。例えば、Ｆｖ断片の２個のドメイン、ＶＬ及びＶＨは別個の遺伝子によりコードされているが、組み換え法又は、ＶＬ及びＶＨ領域が１価分子（１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている。）を形成するためにペアとなる単一のタンパク質鎖としてこれらが生成されることを可能にする合成リンカーを用いて、これらを連結することができる；例えばＢｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６、１９８８；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３、１９８８；Ｃｏｌｃｈｅｒら、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８０：２６３−８０、１９９９；及びＲｅｉｔｅｒ、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２：２４５−５２、１９９６を参照のこと。
１本鎖抗体を作製するための技術もまた、米国特許第４，９４６，７７８号及び同第４，７０４，６９２号に記載されている。このような１本鎖抗体は、抗体の「抗原結合断片」という用語内に包含される。当業者にとって公知の従来技術を用いてこれらの抗体断片を得て、インタクトな抗体をスクリーニングするのと同様にして、有用性についてこれらの断片をスクリーニングする。さらに、１本鎖抗体は、複合体又は多量体を形成することができ、それにより、同じ標的タンパク質の異なるエピトープに対して特異性を有する多価抗体となる。
本明細書中に記載の抗体及びその一部は、モノクローナル抗体であり得、モノクローナル抗体から作製するか、又は当技術分野で公知の合成法により作製し得る。抗体を組み換え法により作製することができる（例えば、ファージディスプレイにより作製する、又は例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９１／１７２７１；ＷＯ９２／２０７９１；ＷＯ９２／１５６７９；ＷＯ９３／０１２８８；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／０９６９０；ＷＯ９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７２、１９９１；Ｈａｙら、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１−８５、１９９２；Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１、１９８９；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４、１９９３；Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６、１９９２；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８、１９９１；Ｇｒａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３５７６−３５８０、１９９２；Ｇａｒｒａｄら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７３−１３７７、１９９１；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７、１９９１；及びＢａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７９７８−７９８２、１９９１に記載のコンビナトリアル法による。）。
一例として、ＴＬＲ２ポリペプチド又はＳｃｄ１ポリペプチドもしくは断片を用いて（例えば、ＴＬＲ２４もしくはそのＳｃｄ１遺伝子産物由来の抗原性ペプチド断片（すなわち、その一部の配列を有する。））又はＴＬＲ２抗原もしくはＳｃｄ１抗原もしくはそれらの抗原性断片を発現する細胞を用いて、動物に対して免疫付与することにより、トール様受容体２に対する抗体又はＳｃｄ１遺伝子産物に対する抗体を作製することができる。ある実施形態において、本明細書中に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片は、精製されたＴＬＲ２又はＳｃｄ１遺伝子産物に結合することができる。ある実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、組織切片、全細胞（生きている細胞、細胞溶解又は分画化したもの）又は膜分画において、ＴＬＲ２又はＳｃｄ１遺伝子産物と結合することができる。マクロファージのＭＡＬＰ−２活性化によりＳｃｄ１遺伝子発現又はＳｃｄ１タンパク質活性の調節、活性化又は阻害を測定するなど、例えばインビトロ系において、抗体を試験することができる。
ＴＬＲ２又はＳｃｄ１遺伝子産物由来の抗原性ペプチドを使用する場合、これには通常、ＴＬＲ２又はＳｃｄ１遺伝子産物のドメインの少なくとも８（例えば１０、１５、２０、３０、５０、１００以上）の連続するアミノ酸残基が含まれる。ある実施形態において、抗原性ペプチドは、ＴＬＲ２又はＳｃｄ１遺伝子産物のドメイン全てを含む。生成された抗体は、ネイティブ型で（すなわち、直線又は立体構造エピトープを有する抗体は本発明内である。）、変性もしくは非ネイティブ型で、又は両方で、タンパク質のうち１つに特異的に結合し得る。例えば、コンピュータを利用した抗原性予想アルゴリズムによるものなど、当技術分野で公知の方法により、抗原性である可能性が高いペプチドを同定することができる。変性型ではなくそのネイティブ型でタンパク質に結合する抗体を同定することにより、立体構造エピトープを同定することができる場合もある。
場合によっては担体（すなわち、会合分子の免疫原性を安定化又は向上させる物質）に連結されている抗原を用いて、宿主動物（例えば、ウサギ、マウス、モルモット又はラット）に免疫付与することができ、場合によっては、アジュバントとともに投与できる（例えば、Ａｕｓｂｅｌら、前出を参照。）。典型的な担体は、キーホールリンペットへモシアニン（ＫＬＨ）及び典型的なアジュバントであり、これらは通常、フロイントアジュバント（完全又は不完全）、アジュバントミネラルゲル（例えば水酸化アルミニウム）、界面活性物質（リソレシチンなど）、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、ジニトロフェノール、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍなどを含め、宿主動物の種から選択される。ＫＬＨはまた、アジュバントと呼ばれる場合もある。例えば、アフィニティークロマトグラフィー法（ポリペプチド抗原又はその断片がレジン上に固定化されている。）により、宿主において産生された抗体を精製することができる。
抗原性ペプチドにより包含されるエピトープは通常、タンパク質の表面上（例えば親水性領域）又は抗原性の高い領域（このような領域は、電荷を有する多くの残基を含有することに基づいて主に選択することができる。）に位置する。タンパク質の表面に局在する可能性が特に高い領域を示すために、ヒトタンパク質配列のＥｍｉｎｉ表面確率分析を使用することができる。
抗体は完全ヒト抗体であり得る（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子（カッパ、ラムダ、アルファ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロン及びミュー定常領域遺伝子又は無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子のものなど、ヒト免疫グロブリン配列から抗体を産生するように遺伝子操作されているマウス又はその他の哺乳動物において作製された抗体）。あるいは、抗体は非ヒト抗体であり得る（例えば、げっ歯類（例えば、マウス又はラット）、ヤギ、ウサギ又は非ヒト霊長類（例えばサル）抗体）。
マウスではなくヒト免疫グロブリン遺伝子を担うトランスジェニックマウスにおいてヒトモノクローナル抗体を生成させることができる。ヒトタンパク質由来のエピトープに対する特異的親和性を有するヒトｍＡｂを分泌するハイブリドーマを作製するために、これらのマウスから得た脾臓細胞（関心のある抗原で免疫付与した後）を使用することができる（例えば、ＷＯ９１／００９０６、ＷＯ９１／１０７４１；ＷＯ９２／０３９１８；ＷＯ９２／０３９１７；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９、１９９４；Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７：１３−２１、１９９４；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５、１９９４；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３−４０、１９９３；Ｔｕａｉｌｌｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：３７２０−３７２４、１９９３；及びＢｒｕｇｇｅｍａｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：１３２３−１３２６、１９９１を参照。）。
抗−ＴＬＲ２抗体又は抗−Ｓｃｄ１抗体はまた、可変領域又はその一部（例えばＣＤＲ）が非ヒト生物（例えばラット又はマウス）において産生されるものでもあり得る。したがって、本発明は、キメラ、ＣＤＲ−移植、ヒト化抗体及び、非ヒト生物において産生され、次いで、ヒトにおいて抗原性を低下させるために（例えば、可変フレームワーク又は定常領域において）修飾された抗体を包含する。当技術分野で公知の組み換え技術により、キメラ抗体（すなわち、異なる部分が異なる動物種由来である抗体（例えば、マウスｍＡｂの可変領域及びヒト免疫グロブリンの定常領域）を作製することができる。例えば、マウスのＦｃをコードする領域を除去するためにマウス（又はその他の種）モノクローナル抗体分子のＦｃ定常領域をコードする遺伝子を制限酵素で消化することができ、ヒトＦｃ定常領域をコードする遺伝子の同等部分でそれを置換することができる（例えば、欧州特許出願第１２５，０２３号；同第１８４，１８７号；同第１７１，４９６号；及び同第１７３，４９４号を参照；またＷＯ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；Ｂｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３、１９８８；Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９−３４４３、１９８７；Ｌｉｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６、１９８７；Ｓｕｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２１４−２１８、１９８７；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５、１９８７；Ｗｏｏｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９、１９８５；Ｓｈａｗら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９、１９８８；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１、１９８４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４、１９８４；及びＴａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２、１９８４も参照のこと。）
ヒト化又はＣＤＲ移植抗体において、（免疫グロブリン重又は軽鎖の）レシピエントＣＤＲの少なくとも１又は２個、通常は３個全てがドナーＣＤＲで置き換えられる（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５、１９８６；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４、１９８８；及びＢｅｉｄｌｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０、１９８８を参照。）。トール様受容体２、Ｓｃｄ１遺伝子又はＳｃｄ１遺伝子産物に対するヒト化抗体の結合に必要なＣＤＲ数のみ置き換える必要がある。ドナーはげっ歯類抗体であり得、レシピエントはヒトフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークであり得る。通常、ＣＤＲを提供する免疫グロブリンは、「ドナー」と呼ばれ（げっ歯類のものであることが多い。）、フレームワークを提供する免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。アクセプターフレームワークは、天然に生じる（例えばヒト）フレームワーク、コンセンサスフレームワークもしくは配列又は少なくともそれと８５％（例えば、９０％、９５％、９９％）同じである配列であり得る。「コンセンサス配列」は、関連のある配列のファミリーにおいて最も高頻度に起こるアミノ酸（又はヌクレオチド）から形成されるものである（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ、Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ、Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１９８７を参照。）。コンセンサス配列における各位置には、そのファミリーのその位置において最も高頻度で起こるアミノ酸残基が来る（２種類のものが同じ頻度で起こる場合、何れも含まれ得る。）。「コンセンサスフレームワーク」とは、コンセンサス免疫グロブリン配列におけるフレームワーク領域を指す。特定のアミノ酸残基が置換されているか、欠失しているか、又は付加されている（例えば抗原結合を促進するためにフレームワーク領域において。）、トール様受容体２、Ｓｃｄ１遺伝子又はＳｃｄ１遺伝子産物に対するヒト化抗体を作製することができる。例えば、ヒト化抗体は、ドナーのものと同一の、又はレシピエントのフレームワーク残基のもの以外のアミノ酸レセプターと同一のフレームワーク残基を有する。このような抗体を作製するために、ヒト化免疫グロブリン鎖の選択された少数のアクセプターフレームワーク残基を対応するドナーアミノ酸により置換する。ＣＤＲに隣接して、又はＣＤＲと相互作用する領域で置換が行われ得る（米国特許第５，５８５，０８９号、特にカラム１２−１６を参照。）。ヒト化抗体のためのその他の技術は、ＥＰ５１９５９６Ａ１に記載されている。
上述のようにして、又は当技術分野で公知のその他の方法を用いて、トール様受容体２に対する抗体又はＳｃｄ１遺伝子産物に対する抗体をヒト化することができる。例えば、抗原結合に直接関与しないＦｖ可変領域の配列をヒトＦｖ可変領域由来の相当する配列で置換することにより、ヒト化抗体を作製することができる。ヒト化抗体を作製するための一般的な方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７、１９８５；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４、１９８６及びＱｕｅｅｎら（米国特許第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６１号及び同第５，６９３，７６２号）で与えられている。ＭＡＬＰ−２活性化によるマクロファージにおけるＳｃｄ１遺伝子発現又はＳｃｄ１タンパク質活性の調節、活性化又は阻害を測定する能力など、所望の機能を有するＴＬＲ２もしくはＳｃｄ１又はそれらの断片に対する抗体を産生するハイブリドーマから、これらの方法で必要とされる核酸配列を得ることができる。次いで、ヒト化抗体又はその断片をコードする組み換えＤＮＡを適切な発現ベクターへとクローニングすることができる。
ある一定の実施形態において、本抗体は、エフェクター機能を有し、補体結合することができるが、一方、その他においては、エフェクター細胞を補充することも補体結合もできない。本抗体はまた、Ｆｃ受容体結合能が殆ど又は全くない可能性もある。例えば、これは、アイソタイプもしくはサブタイプ又は断片又はＦｃ受容体に結合できないその他の突然変異体であり得る（例えば、本抗体は、突然変異（例えば欠失）Ｆｃ受容体結合領域を有し得る。）。Ｆｃ領域を欠く抗体は通常、補体結合できず、したがって、それらが結合する細胞の細胞死の原因である可能性はより少ない。
その他の実施形態において、治療薬（例えば、抗生物質）又は検出可能な標識などの異種物質に抗体をカップリングさせ得る。検出可能な標識には、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼ）、補欠分子族（例えば、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチン）又は蛍光、発光、生物発光又は放射活性物質（例えば、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド又はフィコエリスリン（これらは蛍光である。）、ルミノール（これは発光である。）、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリン（これらは生物発光である。）及び９９ｍＴｃ、１８８Ｒｅ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ又は３Ｈ（これらは放射活性である。）。）が含まれ得る。
トール様受容体２又はＳｃｄ１タンパク質又はこれらの断片（マクロファージのＭＡＬＰ−２活性化による、Ｓｃｄ１遺伝子発現又はＳｃｄ１タンパク質活性の、調節、活性化又は阻害に関連する断片など）を（例えば、アフィニティークロマトグラフィー又は免疫沈降により）単離するために、又は例えば細胞溶解液もしくは上清中で（例えばウエスタンブロッティング、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫アッセイなどによる。）又は組織切片において、それらを検出するために、本明細書中に記載の抗体（例えば、モノクローナル抗体）を使用することもできる。これらの方法により、特定のタンパク質の発現量及びパターンを調べることが可能となる。診断を行う、又は臨床試験もしくは治療の効果を評価することにおいて、この情報は有用であり得る。
本発明はまた、上述の抗体をコードする核酸及びベクター及びこれらを含有する細胞（例えば、ＣＨＯ細胞又はリンパ細胞などの哺乳動物細胞）（例えば、トール様受容体２又はＳｃｄ１タンパク質に特異的に結合する抗体をコードする核酸で形質転換された細胞）も含む。同様に、本発明は、本発明の抗体を産生する細胞株（例えばハイブリドーマ）及びこれらの細胞株を作製する方法を含む。
Ｓｃｄ１ポリペプチド又はトール様受容体２ポリペプチド及びこれらの調節因子の免疫学的検出
核酸ハイブリダイゼーション技術を用いたＳｃｄ１遺伝子又はトール様受容体２遺伝子及び遺伝子発現の検出に加えて、Ｓｃｄ１又はトール様受容体２タンパク質を検出するために免疫アッセイを使用することもできる。このようなアッセイは、Ｓｃｄ１又はトール様受容体２の調節因子に対するスクリーニングのために、ならびに治療及び診断適用のために有用である。Ｓｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質を定性的又は定量的に分析するために、免疫アッセイを使用することができる。適用可能技術の総括は、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１９８８で見出すことができる。
Ａ．抗体の作製
Ｓｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質と特異的に反応するポリクローナル及びモノクローナル抗体を作製する方法は、当業者にとって公知である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９１；Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ、前出；Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第２版、１９８６；及びＫｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７、１９７５を参照。）。このような技術には、ファージ又は同様のベクターにおける組み換え抗体ライブラリからの抗体の選択による抗体調製、ならびにウサギ又はマウスへの免疫付与によるポリクローナル及びモノクローナル抗体の調製が含まれる（例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１、１９８９；Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６、１９８９を参照。）。
Ｓｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質と特異的に反応する抗体を作製するために、Ｓｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質の一部を含有する多くの免疫原を使用することができる。例えば、組み換えＳｃｄ１タンパク質もしくはトール様受容体２タンパク質又はこれらの抗原性断片を本明細書中に記載のように単離することができる。上述のように真核又は原核細胞において、組み換えタンパク質を発現させ、上記で全般的に述べたように精製することができる。モノクローナル又はポリクローナル抗体の作製に対して、組み換えタンパク質は好ましい免疫原である。あるいは、本明細書中で開示された配列由来で担体タンパク質に共役された合成ペプチドを免疫原として使用できる。純粋な形態又は混合形態で、天然に生じたタンパク質もまた使用することができる。次に、抗体産生可能な動物に生成物を注入する。タンパク質を測定するための免疫アッセイにおいてその後使用するために、モノクローナル又はポリクローナル抗体の何れかを作製することができる。
ポリクローナル抗体の作製法は当業者にとって公知である。フロイントアジュバントなどの標準的アジュバント及び標準的な免疫付与プロトコールを使用し、タンパク質により近交系マウス（例えばＢＡＬＢ／Ｃマウス）又はウサギに対して免疫付与する。試験採血を行い、βサブユニットに対する反応性のタイターを調べることにより、免疫原調製物に対する動物の免疫反応を監視する。免疫原に対する抗体のタイターが適切に高くなったら、動物から採血し、抗血清を調製する。必要に応じて、タンパク質に対して反応性のある抗体を濃縮するために、抗血清をさらに分画化することができる（Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ、前出を参照。）。
当業者によく知られている様々な技術により、モノクローナル抗体を得ることができる。簡潔に述べると、通常は骨髄腫細胞との融合によって、所望の抗原により免疫付与した動物由来の脾臓細胞を不死化する（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９、１９７６参照。）。他の不死化の方法には、Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ（エプスタイン・バーウイルス）、癌遺伝子又はレトロウイルスでの形質転換又は当技術分野で周知のその他の方法が含まれる。抗原に対する所望の特異性及び親和性の抗体の産生について、１個の不死化細胞から生じたコロニーをスクリーニングし、脊椎動物宿主の腹腔への注入を含む様々な技術により、このような細胞により産生されたモノクローナル抗体の収率を向上させることができる。あるいは、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１、１９８９により概略が述べられている一般的プロトコールに従い、ヒトＢ細胞からのＤＮＡライブラリをスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体又はその結合断片をコードするＤＮＡ配列を単離することができる。
モノクローナル抗体及びポリクローナル血清を回収し、例えば固体支持体上に固定化された免疫原を用いた固相免疫アッセイなど、免疫アッセイにおいて免疫原タンパク質に対してタイターを調べる。通常、１０４以上のタイターを有するポリクローナル抗血清を選択し、競合結合免疫アッセイを用いて、非Ｓｃｄ１又はトール様受容体２タンパク質に対するその交差反応性について試験する。特異的ポリクローナル抗血清及びモノクローナル抗体は一般に、少なくとも約０．１ｍＭ、より一般的には少なくとも約１μＭ、好ましくは少なくとも約０．１μＭ又はそれより良い、最も好ましくは０．０１μＭ又はそれより良いＫｄで結合する。非ヒト哺乳動物などの種から他の交差反応オルソログを減ずることにより、ヒトＳｃｄ１タンパク質又はヒトトール様受容体２など、特定のＳｃｄ１オルソログ又はトール様受容体２オルソログに対してのみ特異的な抗体を作製することもできる。このようにして、Ｓｃｄ１又はトール様受容体２に対してのみ結合する抗体を得ることができる。
Ｓｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質に対する特異的抗体が入手可能となったら、様々な免疫アッセイ法によりタンパク質を検出することができる。さらに、Ｓｃｄ１遺伝子産物又はトール様受容体２の調節因子として治療的に抗体を使用することができる。免疫学的手法及び免疫アッセイ手法の概説に関しては、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｉｔｅｓ ＆ Ｔｅｒｒ編、第７版、１９９１）を参照のこと。さらに、いくつかの形態の何れかにおいて本発明の免疫アッセイを行うことができる（これらは、Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｍａｇｇｉｏ編、１９８０）；及びＨａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ、前出で幅広く概説されている。）。
Ｂ．免疫学的結合アッセイ
よく認識されている多くの免疫学的結合アッセイの何れかを用いて、Ｓｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質を検出、及び／又は定量することができる（例えば、米国特許第４，３６６，２４１号；同第４，３７６，１１０号；同第４，５１７，２８８号；及び同第４，８３７，１６８号を参照。）。一般的免疫アッセイの概説に関して、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌｕｍｅ３７（Ａｓａｉ編、１９９３）；Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｉｔｅｓ ＆ Ｔｅｒｒ編、第７版 １９９１）も参照のこと。免疫学的結合アッセイ（又は免疫アッセイ）は通常、選択したタンパク質又は抗原（この場合、Ｓｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質又はこれらの抗原性部分）に特異的に結合する抗体を使用する。当業者にとって周知である、及び上述のような多くの手法の何れかにより、抗体（例えば、抗Ｓｃｄ１遺伝子産物又は抗トール様受容体２）を作製することができる。
免疫アッセイではまた、抗体及び抗原により形成された複合体に特異的に結合するために、及びその複合体を標識するために、標識物質を使用することも多い。標識物質そのものは、抗体／抗原複合体を含む部分の１つであり得る。したがって、標識物質は、標識されたＳｃｄ１遺伝子産物又は標識されたトール様受容体２であり得る。あるいは、標識物質は、抗体／Ｓｃｄ１遺伝子産物又は抗体／トール様受容体２複合体に特異的に結合する、二次抗体などの、第三の部分であり得る（二次抗体は通常、一次抗体が由来する種の抗体に特異的である。）。プロテインＡ又はプロテインＧなど、免疫グロブリン定常領域に特異的に結合することができるその他のタンパク質を標識物質として使用することもできる。これらのタンパク質は、様々な種由来の免疫グロブリン定常領域と強い非免疫原性反応性を示す（例えば、Ｋｒｏｎｖａｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１１：１４０１−１４０６、１９７３；Ａｋｅｒｓｔｒｏｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：２５８９−２５４２、１９８５）。ビオチン（ストレプトアビジンなどの別の分子がこれに対して特異的に結合できる。）などの検出可能部分で、標識物質を修飾することができる。様々な検出可能部分が当業者にとって周知である。
アッセイを通じて、試薬の各組み合わせ後、インキュベート及び／又は洗浄段階が必要であり得る。インキュベート段階は約５秒から数時間、場合によっては約５分から約２４時間まで、様々であり得る。しかし、インキュベート時間は、アッセイ形式、抗原、溶液量、濃度などに依存する。通常、周囲温度にてアッセイを行うが、１０℃から４０℃などの温度範囲にわたりアッセイを行うことができる。
非競合アッセイ形式：試料中のＳｃｄ１遺伝子産物又はトール様受容体２を検出するための免疫アッセイは、競合的又は非競合的の何れかであり得る。非競合的免疫アッセイは、抗原量を直接測定するアッセイである。ある好ましい「サンドイッチ」アッセイにおいて、例えば、抗Ｓｃｄ１遺伝子産物又は抗トール様受容体２抗体を固定化する固体基板にこれらを直接結合させ得る。次に、これらの固定化抗体が、試験試料中に存在するＳｃｄ１遺伝子産物又はトール様受容体２を捕捉する。次に、Ｓｃｄ１遺伝子産物に対する二次抗体または標識を担うトール様受容体２に対する抗体などの標識物質により、このように固定化されたＳｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質を結合させる。あるいは、二次抗体は標識を欠き得るが、代わって、二次抗体が由来する種の抗体に特異的な標識された三次抗体を結合させることができる。検出可能部分を与えるために、二次又は三次抗体は通常、ビオチン（例えばストレプトアビジンなどの別の分子がこれに対して特異的に結合できる。）などの検出可能部分で修飾することができる。
競合的アッセイ形式：競合的アッセイにおいて、試料中に存在する未知のＳｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質により抗Ｓｃｄ１タンパク質又は抗トール様受容体２抗体から置き換えられた（競合し排除された）、既知の添加した（外来性の）Ｓｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質の量を測定することにより、試料中に存在するＳｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質の量を間接的に測定する。ある競合的アッセイにおいて、Ｓｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質の既知量を試料に添加し、次に、Ｓｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質に特異的に結合する抗体とその試料を接触させる。抗体に結合した外来性のＳｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質の量は、試料中に存在するＳｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質の濃度に反比例する。特に好ましい実施形態において、抗体を固体基板に固定化する。Ｓｃｄ１タンパク質／抗体複合体又はトール様受容体２タンパク質／抗体複合体中に存在するＳｃｄ１遺伝子産物又はトール様受容体２の量を測定するか、あるいは、残存する非複合体化タンパク質の量を測定するかの何れかにより、抗体に結合するＳｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質の量を測定することができる。標識されたＳｃｄ１タンパク質分子又はトール様受容体２分子を与えることにより、Ｓｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質の量を検出することができる。
ハプテン阻害アッセイは別の好ましい競合的アッセイである。このアッセイにおいて、既知のＳｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質を固体基板に固定化する。抗Ｓｃｄ１抗体又は抗トール様受容体２抗体の既知量を試料に添加し、次にこの試料を固定化したＳｃｄ１遺伝子産物又はトール様受容体２と接触させる。既知の固定化Ｓｃｄ１遺伝子産物又はトール様受容体２と結合した抗Ｓｃｄ１抗体又は抗トール様受容体２抗体の量は、試料中に存在するＳｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質の量と反比例する。同じく、抗体の固定化断片又は溶液中に残存する抗体の断片の何れかを検出することにより、固定化抗体の量を検出することができる。検出は、抗体が標識されている場合、直接的であり得、又は、上述のように、抗体に特異的に結合する標識部分を次いで添加することによる間接的なものであり得る。
交差反応性の決定：交差反応性を調べるために、競合的結合形式での免疫アッセイを使用することもできる。例えば、固体支持体にＳｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質を固定化することができる。固定化抗原への抗血清の結合に競合するアッセイに、タンパク質（例えば、Ｓｃｄ１遺伝子産物又はトール様受容体２及びホモローグ）を添加する。添加したタンパク質が固定化タンパク質への抗血清の結合に対して競合する能力を、Ｓｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質がそれ自身と競合する能力と比較する。標準的計算を用いて、上記タンパク質に対する％交差反応性を計算する。上記で挙げた添加タンパク質のそれぞれとの交差反応性が１０％未満である抗血清を選択し、プールする。交差反応抗体は、場合によっては、添加した考慮されるタンパク質、例えば遠縁のホモローグなど、を用いた免疫吸着により、プールした抗血清から除く
次に、おそらくＳｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質の対立遺伝子もしくは多型変異体であると考えられる第二のタンパク質を免疫原タンパク質と比較するために、上述のような競合的結合免疫アッセイにおいて、免疫吸着を行い、プールした抗血清を使用する。この比較を行うために、各タンパク質の広い範囲の濃度で２種類のタンパク質をそれぞれアッセイし、固定化タンパク質に対する抗血清の結合の５０％を阻害するのに必要な各タンパク質の量を決定する。結合の５０％を阻害するのに必要とされる第二のタンパク質の量が、結合の５０％を阻害するのに必要とされるＳｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質の量の１０倍未満である場合、第二のタンパク質は、Ｓｃｄ１遺伝子産物又はトール様受容体２免疫原に対して生成されたポリクローナル抗体に特異的に結合すると言われる。
その他のアッセイ形式：試料中のＳｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質の存在を検出及び定量するために、ウエスタンブロット（イムノブロット）分析を使用する。この技術には、通常、分子量に基づきゲル電気泳動により試料タンパク質を分離することと、分離したタンパク質を適切な固体支持体（ニトロセルロース膜、ナイロン膜又は誘導化ナイロン膜など）に転写することと、Ｓｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質に特異的に結合する抗体と試料をインキュベートすることと、が含まれる。抗Ｓｃｄ１タンパク質抗体又は抗トール様受容体２抗体は、固体支持体上でＳｃｄ１遺伝子産物又はトール様受容体２と特異的に結合する。これらの抗体を直接標識するか、あるいは、抗Ｓｃｄ１タンパク質抗体又は抗トール様受容体２抗体に特異的に結合する標識化抗体（例えば、標識されたヒツジ抗マウス抗体）を用いてその後に検出することができる。
その他のアッセイ形式には、リポソーム免疫アッセイ（ＬＩＡ）が含まれるが、これは、特異的な分子（例えば抗体）に結合するように設計したリポソームを使用し、封入された試薬又はマーカーを放出させる。次いで、標準的技術に従い、放出された化学物質を検出する（Ｍｏｎｒｏｅら、Ａｍｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｖ．５：３４−４１、１９８６）。
非特異的結合の低下：当業者にとって当然のことながら、免疫アッセイにおいて非特異的結合を最低限に抑えることが必要とされることが多い。特に、アッセイが固体基板に固定化された抗原又は抗体を含む場合、基板に対する非特異的結合の量を最低限に抑えることが望ましい。このような非特異的結合を低下させる手段は当業者にとって周知である。通常、この技術には、タンパク性組成物で基板を被覆することが含まれる。特に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脱脂粉乳及びゼラチンなどのタンパク質組成物が広く使用されるが、粉末乳が最も好ましい。
標識：アッセイで使用される特定の標識又は検出可能な基は、それがアッセイで使用される抗体の特異的結合を顕著に妨害しない限り、本発明の重大な態様ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的又は化学的特性を有する何らかの物質であり得る。このような検出可能な標識は、免疫アッセイの分野でよく開発されており、一般に、このような方法において有用である殆どのあらゆる標識を本発明に適用することができる。したがって、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的又は化学的手段により検出可能な何らかの組成物である。本発明における有用な標識には、磁気ビーズ（例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳＴＭ）、蛍光色素（例えば蛍光イソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ又は３２Ｐ）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びＥＬＩＳＡで一般に使用されるその他のもの）、化学発光標識及び金コロイドなど発色標識又は色ガラス又はプラスチックビーズ（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）が含まれる。
当技術分野で周知の方法に従い、アッセイの所望の成分と標識を直接又は間接的にカップリングさせることができる。上記で示されているように、広く様々な標識を使用することができ、必要とされる感度、化合物との共役の容易さ、安定性の条件、利用可能な機器及び処分の条件に依存して標識を選択する。
非放射活性標識は、間接的手段により連結されることが多い。一般に、リガンド分子（例えばビオチン）は、分子と共有結合する。次に、リガンドが別の分子（例えばストレプトアビジン）と結合するが、これは、本質的に検出可能であるか、又はシグナル系と共有結合するか（検出可能な酵素、蛍光化合物又は化学発光化合物など）、の何れかである。Ｓｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質を認識する抗体又は、抗Ｓｃｄ１タンパク質抗体もしくは抗トール様受容体２抗体を認識する二次抗体との何らかの適切な組み合わせでリガンド及びその標的を使用することができる。
例えば酵素又は蛍光色素分子と共役させることにより、シグナルを生じさせる化合物にに分子を直接共役させることもできる。標識として関心のある酵素は、主に、加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼ及びグリコシダーゼ、又はオキシダーゼ、特にペルオキシダーゼである。蛍光化合物には、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが含まれる。化学発光化合物には、ルシフェリン及び２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールが含まれる。使用することができる様々な標識又はシグナルを生じさせる系の概説として、米国特許第４，３９１，９０４号を参照のこと。
標識を検出する手段は当業者にとって周知である。したがって、例えば、標識が放射活性標識である場合、検出のための手段には、シンチレーションカウンタ又はオートラジオグラフィーにおけるような写真用フィルムが含まれる。標識が蛍光標識である場合、光の適切な波長で蛍光色素を励起し、結果として生じる蛍光を検出することにより、これを検出することができる。電荷結合素子（ＣＣＤ）又は光電子増倍管などの電気的検出器を使用することにより、視覚的に蛍光を検出することができる。同様に、酵素に対して適切な基質を与え、結果として生じる反応産物を検出することにより、酵素的標識を検出することができる。最後に、単純に標識に付随する色を観察することにより、単純な発色標識を検出することができる。したがって、様々な計量スティックアッセイにおいて、共役した金はピンクに見えることが多く、一方で、様々な共役ビーズはビーズの色に見える。
あるアッセイ形式では、標識した成分を使用する必要がない。例えば、標識抗体の存在を検出するために、凝集アッセイを使用することができる。この場合、標識抗体を含有する試料によって、抗原被覆された粒子が凝集する。この形式において、成分を標識する必要がなく、単純な目視によって標識抗体の存在を検出する。
Ｓｃｄ１遺伝子産物又はトール様受容体２の調節因子に対するハイスループットアッセイ
Ｓｃｄ１遺伝子産物又はトール様受容体２の調節因子として試験される化合物は、何らかの小型の有機分子又はタンパク質などの生物学的存在、例えば抗体もしくはペプチド、糖、核酸、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉもしくはリボザイム又は脂質であり得る。あるいは、調節因子は、Ｓｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質の遺伝子的に変更を加えられたものであり得る。通常、試験化合物は、小型の有機分子、ペプチド、脂質及び脂質類似体である。
基本的に、本発明のアッセイにおいて、調節因子又はリガンドの可能性があるものとして、何らかの化合物を使用することができるが、殆どの場合、水性又は有機（特にＤＭＳＯベース）溶液中で溶解できる化合物が使用される。本アッセイは、アッセイ段階を自動化し、何らかの都合のよいソースから化合物をアッセイに提供することにより、大型の化学ライブラリをスクリーニングするために設計されており、これは通常、平行して行われる（例えば、ロボット化アッセイでのマイクロタイタープレートにおけるマイクロタイター形式）。Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｋａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｂｕｃｈｓ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）など、化合物の多くの供給業者があることが認められるであろう。
ある好ましい実施形態において、ハイスループットスクリーニング法は、多数の治療的化合物候補（調節因子候補又はリガンド化合物候補）を含有する、コンビナトリアルな小型有機分子又はペプチドライブラリを提供することを含む。次に、所望の特徴のある活性を示すこのような「コンビナトリアル化学ライブラリ」又は「リガンドライブラリ」のメンバー（特に化学種又はサブクラス）を同定するために、このようなライブラリを本明細書中で記載のように、１以上のアッセイにおいてスクリーニングする。このように同定された化合物は、従来の「リード化合物」となり得るか、又はそれら自身が治療薬候補又は実際の治療薬として使用され得る。
コンビナトリアル化学ライブラリは、試薬などの多くの化学的「構成要素」を組み合わせることによって、化学合成又は生合成の何れかにより生成された、多岐にわたる化合物のコレクションである。例えば、ある一定の化合物の長さ（すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数）に対して全ての可能な方法において、化学的構成要素（アミノ酸）のセットを組み合わせることによって、ポリペプチドライブラリなどの直線的なコンビナトリアル化学ライブラリが形成される。化学的構成要素のこのようなコンビナトリアル混合によって、非常に多くの化合物を合成することができる。
コンビナトリアル化学ライブラリの作製及びスクリーニングは当業者にとって周知である。このようなコンビナトリアル化学ライブラリには、以下に限定されないが、ペプチドライブラリ（例えば、米国特許第５，０１０，１７５号、Ｆｕｒｋａ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．３７：４８７−４９３、１９９１及びＨｏｕｇｈｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８８、１９９１）が含まれる。化学的多様性ライブラリを作製するためのその他の化学もまた使用することができる。このような化学には、以下に限定されないが、ペプトイド（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１９７３５）、コードされたペプチド（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／２０２４２）、ランダムバイオオリゴマー（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン及びジペプチドなどのダイバーソマー（Ｈｏｂｂｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６９０９−６９１３、１９９３）、ビニル性ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８、１９９２）、グルコースの足場を有する非ペプチド性ペプチド模倣体（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２１７−９２１８、１９９２）、小型化合物ライブラリの類似有機合成（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２６６１、１９９４）、オリゴカルバメート（Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３、１９９３）及び／又はペプチジルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６５８、１９９４）、核酸ライブラリ（Ａｕｓｂｅｌ、Ｂｅｒｇｅｒ及びＳａｍｂｒｏｏｋ、全て前出を参照。）、ペプチド核酸ライブラリ（例えば、米国特許第５，５３９，０８３号を参照。）、抗体ライブラリ（例えばＶａｕｇｈｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：３０９−３１４、１９９６及びＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７を参照。）、炭水化物ライブラリ（例えば、Ｌｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：１５２０−１５２２、１９９６及び米国特許第５，５９３，８５３号を参照。）、小型有機分子ライブラリ（例えばベンゾジアゼピン、ＢａｕｍＣ ＥＮ、１月１８日、３３頁（１９９３）を参照；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジノン及びメタチアザノン、米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号及び同第５，５１９，１３４号；モルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン、同第５，２８８，５１４号など）が含まれる。
コンビナトリアルライブラリを作製するための機器が市販されている（例えば３５７ＭＰＳ、３９０ＭＰＳ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈ、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ ＫＹ、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ、Ｒａｉｎｉｎ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ、４３３Ａ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、９０５０ Ｐｌｕｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡを参照。）。さらに、多くのコンビナトリアルライブラリそれ自身が市販されている（例えばＣｏｍＧｅｎｅｘ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．、Ａｓｉｎｅｘ、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕ、Ｔｒｉｐｏｓ、Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＣｈｅｍＳｔａｒ、Ｌｔｄ、Ｍｏｓｃｏｗ、ＲＵ、３Ｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ、Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤなどを参照。）。
トール様受容体２／Ｓｃｄ１相互作用を含む経路を介したマクロファージのＭＡＬＰ−２誘導に関連する疾患を治療するための薬物を同定するために、候補化合物は、ストラテジーの一部として有用である。ＴＬＲ２又はＳｃｄ１に結合する試験化合物を候補化合物とみなす。
ＴＬＲ２もしくはＳｃｄ１に結合する、又はＴＬＲ２もしくはＳｃｄ１タンパク質もしくはポリペプチドもしくはこれらの生物学的に活性のある部分の活性を調節する、候補又は試験候補を同定するためのスクリーニングアッセイもまた本発明に含まれる。以下に限定されないが、生物学的ライブラリ；空間的に指定可能な平行固相もしくは液相ライブラリ；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法；「１ビーズ１化合物」ライブラリ法；及びアフィニティークロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリ法を含む当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリ法において多くのアプローチの何れかを用いて、試験化合物を得ることができる。例えばペプチドライブラリのために生物学的ライブラリアプローチを使用することができるが、一方で、その他の４種類のアプローチも、ペプチド、非ペプチドオリゴマー又は化合物の小型の化学分子ライブラリに対して適用可能である（Ｌａｍ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５、１９９７）。分子ライブラリの合成のための方法の例は、例えば、Ｄｅ Ｗｉｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９、１９９３；Ｅｒｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２、１９９４；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８、１９９４；Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３、１９９３；Ｃａｒｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９、１９９４；Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１、１９９４；及びＧａｌｌｏｐら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３、１９９４など、当技術分野において見出すことができる。ある実施形態において、試験化合物は、ＴＬＲ２又はＳｃｄ１の活性化変異体である。
化合物のライブラリは、溶液中（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１、１９９２）又はビーズ上（Ｌａｍ、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４、１９９１）、チップ（Ｆｏｄｏｒ、Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６、１９９３）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号、同第５，４０３，４８４号及び同第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９、１９９２）又はファージ上（Ｓｃｏｔｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０、１９９０；Ｄｅｖｌｉｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６、１９９０；Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６３７８−６３８２、１９９０；及びＦｅｌｉｃｉ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０、１９９１）で提示することができる。
例えば、試験化合物存在下でＴＬＲ２／Ｓｃｄ１複合体を形成する能力を監視することにより、試験化合物がＴＬＲ２もしくはＳｃｄ１又はこれらの生物学的活性部分の活性を調節する能力を調べることができる。トール様受容体２／Ｓｃｄ１相互作用を含む経路を介したマクロファージのＭＡＬＰ−２誘導を測定することにより、ＴＬＲ２もしくはＳｃｄ１又はこれらの生物学的活性部分の活性を調節することを調べることができる。トール様受容体２タンパク質がＳｃｄ１に結合する能力を監視することにより、トール様受容体２もしくはＳｃｄ１又はこれらの生物学的活性部分の活性を調節する試験化合物の能力を調べることもできる。結合アッセイは細胞に基づくもの又は無細胞系であり得る。
本明細書中に記載の方法又は直接結合を調べるための当技術分野で公知の方法の１つにより、トール様受容体２タンパク質が、Ｓｃｄ１に結合する又はＳｃｄ１と相互作用する能力を調べることができる。ある実施形態において、マクロファージのＭＡＬＰ−２誘導を監視することにより、トール様受容体２タンパク質が、Ｓｃｄ１に結合する又はＳｃｄ１と相互作用する能力を調べることができる。マクロファージのＭＡＬＰ−２誘導の検出は、ＦＬＡＧ配列又はルシフェラーゼなどの検出可能なマーカーもコードする組み換えＳｃｄ１の発現の検出を含み得る。このアッセイは、直接結合のアッセイに付加されるものであり得る。一般に、試験化合物が、トール様受容体２タンパク質のＳｃｄ１への結合又はＳｃｄ１タンパク質の活性化又はトール様受容体２による遺伝子発現に影響を与える能力を調べるために、このようなアッセイが使用される。
一般に、試験化合物がＳｃｄ１に結合し、トール様受容体２を介してシグナリングを妨害するか、又はマクロファージのＭＡＬＰ−２誘導に影響を与える能力を対照（結合又はマクロファージのＭＡＬＰ−２誘導を試験化合物なしで調べる。）と比較する。いくつかの場合において、前もって決定されている参照値を使用する。対照に対して、このような参照値を決定することができ、この場合、参照物と異なる試験試料は、化合物が関心のある分子に結合する（例えば、トール様受容体２）か、又は発現を調節する（例えば、ＭＡＬＰ−２により誘導されている細胞においてマクロファージを調節、活性化又は阻害するか、又はグラム陽性細菌感染に反応するマクロファージを調節、活性化又は阻害する。）。参照値はまた、標準を用いて観察される、結合又はマクロファージのＭＡＬＰ−２誘導の量を反映し得る（例えば、トール様受容体２に対する抗体の親和性又はＭＡＬＰ−２誘導によるＳｃｄ１発現の調節）。この場合、参照と同様である（例えば、等しいか又はそれ未満である）試験化合物は、その化合物が候補化合物であることを指す（例えば、参照抗体と同程度からそれを超える程度、トール様受容体２に結合する。）。
本発明はさらに、上述のスクリーニングアッセイにより同定される新規物質及び本明細書中に記載の治療のためのその使用に関する。
ある実施形態において、本発明は、Ｓｃｄ１遺伝子産物もしくはトール様受容体２タンパク質又は、天然に生じるかもしくは組み換えの、Ｓｃｄ１遺伝子産物もしくはトール様受容体２タンパク質を発現する細胞もしくは組織を使用した可溶性アッセイを提供する。別の実施形態において、本発明は、ハイスループット形式の固相のインビトロアッセイを提供するが、この場合、Ｓｃｄ１遺伝子産物もしくはトール様受容体２タンパク質又はそのリガンドを共有又は非共有相互作用を介して固相基板に結合させる。本明細書中に記載のアッセイの何れのものもハイスループットスクリーニングに適応させることができる。
本発明のハイスループットアッセイにおいて、可溶性又は固体状態の何れかで、１日で最大で数千個の様々な調節因子又はリガンドをスクリーニングすることができる。インビトロでＳｃｄ１遺伝子産物もしくはトール様受容体２タンパク質に対して、又は、Ｓｃｄ１遺伝子産物もしくはトール様受容体２タンパク質を含有する、細胞に基づく、もしくは膜に基づくアッセイに対して、この方法を使用することができる。特に、選択した調節因子候補に対して個別のアッセイを行うために、マイクロタイタープレートの各ウェルを使用するか、又は、濃度もしくはインキュベート時間の影響が見られる場合は、５から１０ウェルごとに１個の調節因子を試験することができる。したがって、１枚の標準的マイクロタイタープレートで約１００（例えば９６）個の調節因子をアッセイすることができる。１５３６ウェルプレートを使用する場合、約１００から約１５００種類の異なる化合物を１枚のプレートで容易にアッセイすることができる。１日に多くのプレートをアッセイすることができる；本発明の集積システムを使用して、最高で約６，０００、２０，０００、５０，０００又は１００，０００個を超える様々な化合物に対するアッセイスクリーニングが可能である。
固体状態の反応に対して、関心のあるタンパク質もしくはその断片、例えば細胞外ドメイン、又は、関心のあるタンパク質もしくはその断片を融合タンパク質の一部として含有する細胞もしくは膜を固体状態の成分に直接又は間接的に、共有又は非共有結合（例えばタグ）を介して結合させることができる。タグは、様々な成分の何れかであり得る。一般に、タグを結合する分子（タグ結合剤）を固体支持体に固定し、タグ及びタグ結合剤の相互作用により、タグを付加した関心のある分子を固体支持体に結合させる。
文献で詳細に記載されている既知の分子相互作用に基づき、多くのタグ及びタグ結合剤を使用することができる。例えば、タグが天然の結合剤を有する場合（例えばビオチン、プロテインＡ又はプロテインＧ）、適切なタグ結合剤（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、免疫グロブリンのＦｃ領域など）との結合において使用することができる。ビオチンなどの天然の結合剤を伴う分子に対する抗体もまた、広く利用可能であり、適切なタグ結合剤である（ＳＩＧＭＡ、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ １９９８カタログＳＩＧＭＡ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯを参照のこと。）。
同様に、タグ／タグ結合剤ペアを形成するために適切な抗体と組み合わせて、何らかのハプテン性又は抗原性化合物を使用することができる。数千種類の特異的抗体が市販されており、多くのさらなる抗体が文献に記載されている。例えば、ある一般的な形態において、タグは一次抗体であり、タグ結合剤は、一次抗体を認識する二次抗体である。抗体−抗原相互作用に加えて、受容体−リガンド相互作用もまたタグ及びタグ結合剤ペアとして適切である。例えば、細胞膜受容体のアゴニスト及びアンタゴニストである（例えば、トール様受容体、トランスフェリン、ｃ−ｋｉｔ、ウイルス受容体リガンド、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン受容体及び抗体、カドヘリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリーなどの細胞受容体−リガンド相互作用；例えば、Ｐｉｇｏｔｔ ＆ Ｐｏｗｅｒ、Ｔｈｅ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ Ｉ、１９９３を参照。）。同様に、毒素及び毒液、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、オピエート、ステロイドなど）、細胞内受容体（例えば、ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイド及びビタミンＤを含む、様々な小型のリガンドの影響を媒介するもの；ペプチド）、薬物、レクチン、糖、核酸（線状及び環状ポリマー構造の両方）、オリゴ糖、タンパク質、リン脂質及び抗体は全て、様々な細胞受容体と相互作用し得る。
ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド及びポリアセテートなどの合成ポリマーもまた、適切なタグ又はタグ結合剤を形成し得る。本開示を検討すると当業者にとって明らかとなるように、本明細書中に記載のアッセイ系において、多くのその他のタグ／タグ結合剤ペアもまた有用である。
ペプチド、ポリエーテルなどの一般的なリンカーもまたタグとなり得、これには、約５から２００アミノ酸の間のポリｇｌｙ配列などの、ポリペプチド配列が含まれる。このような柔軟性のあるリンカーは当業者にとって公知である。例えば、ポリエチレングリコールリンカーはＳｈｅａｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｉｎｃ．Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、Ａｌａｂａｍａから入手可能である。これらのリンカーは、場合によっては、アミド結合、スルフィドリル結合又はヘテロ官能性結合を有する。
現在利用可能な様々な方法の何れかを用いて固体基板にタグ結合剤を固定する。固体基板は、一般に、タグ結合剤の一部と反応性のある表面に化学基を固定する化学物質に基板の全て又は一部を曝露することにより、誘導化又は官能化されている。例えば、より長い鎖部分に連結させるのに適切な基には、アミン、ヒドロキシル、チオール及びカルボキシル基が含まれよう。ガラス面などの様々な表面を官能化するために、アミノアルキルシラン及びヒドロキシアルキルシランを使用することができる。このような固相バイオポリマーアレイの構築は、文献で詳細に記載されている。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４、１９６３（例えばペプチドの固相合成について述べている。）；Ｇｅｙｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．１０２：２５９−２７４、１９８７（ピン上での固相成分の合成について述べている。）；Ｆｒａｎｋ ＆ Ｄｏｒｉｎｇ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４４：６０３１−６０４０、１９８８（セルロースディスク上での様々なペプチド配列の合成について述べている。）；Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７−７７７、１９９１；Ｓｈｅｌｄｏｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：７１８−７１９、１９９３；及びＫｏｚａｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：７５３−７５９、１９９６（全て、固体基板に固定されたバイオポリマーのアレイについて述べている。）を参照のこと。タグ結合剤を基板に固定するための非化学的アプローチには、熱、ＵＶ照射による架橋などのその他の一般的な方法が含まれる。
Ｓｃｄ１及びトール様受容体２の調節因子としての二重特異性化合物
ある態様において、非ヒト動物の血清及び／又は循環において薬物の濃度を低下させる、二重特異性化合物の候補化合物又は試験化合物を同定するための方法が提供される。例えばヒト対象など、このような化合物の投与から恩恵を受ける対象を治療するために、本方法を用いて選択された、又は最適化された化合物を使用することができる。
本発明の方法の実施形態において試験することができる候補化合物は、二重特異性化合物である。本明細書中で使用される場合、「二重特異性化合物」という用語は、２つの異なる結合特異性を有する化合物を含む。典型的な二重特異性化合物には、例えば、二重特異性抗体、ヘテロポリマー及び抗原に基づくヘテロポリマーが含まれる。
本発明の実施形態において試験することができる二重特異性分子には、好ましくは、標的物質（例えば別個の抗体又は抗原）に対して特異的な第二の結合部分と架橋された、Ｓｃｄ１、好ましくはヒトＳｃｄ１に特異的な結合部分が含まれる。トール様受容体２に特異的な結合部分の例には、以下に限定されないが、トール様受容体２リガンド、例えばＭＡＬＰ−２又は、好ましい実施形態においては、トール様受容体２に対する抗体が含まれる。
別の実施形態において、そのトール様受容体２への結合能に基づいて、新規トール様受容体２結合分子を同定することができる。例えば、無細胞系の結合アッセイにおいて、化合物又は小型の化学分子のライブラリを試験することができる。例えば、ペプチド摸倣体、小型の化学分子又はその他の薬物などの試験化合物のあらゆる数を試験に対して使用することができ、生物学的ライブラリ；空間的に指定可能な平行固相もしくは液相ライブラリ；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法；「１ビーズ１化合物」ライブラリ法；及びアフィニティークロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリ法を含む、当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリ法における多数のアプローチの何れかを用いてこれらを得ることができる。生物学的ライブラリアプローチはペプチドライブラリに限定されるが、一方で、その他の４種類のアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー又は化合物の小型の化学分子ライブラリに対して適用可能である（Ｌａｍ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５、１９９７）。
調節物質及び天然の抽出物のライブラリを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、ある一定の時間で調べる調節物質の数を最大にするために、ハイスループットアッセイが必要とされる。精製又は半精製タンパク質とともに生成され得るような、無細胞系で行われるアッセイは、「第一の」スクリーニングとして好まれることが多く、ここでは、迅速に開発すること及び、試験調節物質により媒介される分子標的における変化を比較的容易に検出することを可能とするようにアッセイを作ることができる。さらに、細胞毒性の影響及び／又は試験調節物質のバイオアベイラビリティーは通常、インビトロ系では無視することができ、代わりに、このアッセイでは、上流又は下流エレメントとの結合親和性の変化を明白にできるように、分子標的における薬物の影響に主に焦点が当てられる。
別の実施形態において、新規ＴＬＲ２又はＳｃｄ１結合分子を同定するために、当技術分野で公知のファージディスプレイ技術を使用することができる。
ある実施形態において、本発明は、ＴＬＲ２もしくはＳｃｄ１又はそれらの生物学的活性部分に結合する、候補又は試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。
本発明の二重特異性化合物において使用するためのさらなる物質を同定するために、ＴＬＲ２又はＳｃｄ１に結合する分子を同定するための、細胞に基づくアッセイを使用することができる。例えば、スクリーニングアッセイにおいて、ＴＬＲ２又はＳｃｄ１を発現する細胞を使用することができる。例えば、ＴＬＲ２又はＳｃｄ１への結合において統計的に有意な変化を生じさせる化合物を同定することができる。
ある実施形態において、アッセイは、インビトロでのＴＬＲ２又はＳｃｄ１タンパク質へのその結合能に基づいてトール様受容体２結合分子が同定される無細胞系アッセイである。ＴＬＲ２又はＳｃｄ１タンパク質結合分子を提供することができ、直接結合を調べるための当技術分野で認められている方法を用いて、ＴＬＲ２又はＳｃｄ１タンパク質へのタンパク質の結合能を試験することができる。例えば、リアルタイム生体分子間相互作用分析（ＢＩＡ）などの技術を用いて、標的分子へのタンパク質の結合能を調べることができる。Ｓｊｏｌａｎｄｅｒら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５、１９９１及びＳｚａｂｏら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５、１９９５。本明細書中で使用される場合、「ＢＩＡ」は、反応体の何れも標識せずに、リアルタイムで生体特異的相互作用を調べるための技術である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ）。生体分子間のリアルタイム反応の指標として、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象の変化を使用することができる。
本発明の無細胞系アッセイは、タンパク質の可溶性及び／又は膜結合形態の両方に使用できる。膜結合形態のタンパク質が使用される無細胞系アッセイの場合、タンパク質の膜結合形態が溶液中で維持されるような可溶化剤を利用することが望ましいものであり得る。このような可溶化剤の例には、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（Ｒ）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（Ｒ）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（Ｒ）、イソトリデシポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）又はＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートなどの非イオン性界面活性剤が含まれる。
タンパク質−タンパク質相互作用を検出可能にする適切なアッセイが当技術分野で公知である（例えば、免疫沈降、２−ハイブリッドアッセイなど）。試験化合物の存在下及び非存在下でこのようなアッセイを行うことにより、本発明のタンパク質と標的分子との相互作用を調節（例えば阻害又は促進）する化合物を同定するために、これらのアッセイを使用することができる。
例えば直接結合により、タンパク質が、標的分子に結合するか又はこれと相互作用する能力を調べることができる。直接結合アッセイにおいて、複合体において標識されたタンパク質を検出することにより標的分子へのタンパク質の結合を調べることができるように、放射性同位体又は酵素標識とタンパク質をカップリングさせ得る。例えば、直接又は間接的に、の何れかで、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ又は３Ｈを用いてタンパク質を標識することができ、放射線放出を直接カウントすることにより、又はシンチレーションカウントにより、放射性同位体を検出する。あるいは、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はルシフェラーゼを用いて分子を酵素標識することができ、適切な基質から産物への変換を調べることにより、酵素標識を検出する。
通常、タンパク質の一方又は両方の非複合体形態からの複合体の分離を促進するために、ならびにアッセイの自動化を行うために、本発明のタンパク質又はその結合タンパク質の何れかを固定化することが望ましい。反応体を含有するのに適切な何らかの容器中で、候補物質の存在下及び非存在下での、上流又は下流結合エレメントへの結合を行うことができる。例としては、マイクロタイタープレート、試験管及び微小遠心管が挙げられる。ある実施形態において、タンパク質がマトリクスに結合するのを可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＴＬＲ２（ＧＳＴ／ＴＬＲ２）融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）又はグルタチオン誘導化マイクロタイタープレート上に吸着させることができ、次いでこれを細胞溶解液（例えば３５Ｓ−標識されたもの）及び試験調節物質と組み合わせ、複合体形成を促す条件下（例えば塩及びｐＨに対する生理的条件下）で混合物をインキュベートするが、僅かによりストリンジェントな条件を使用することができる。インキュベート後、非結合標識を除去するためにビーズを洗浄し、マトリクスを固定化し、放射性標識を直接（例えばビーズをシンチラント中に入れる。）、又は、続いて複合体を解離させた後、上清中で調べる。あるいは、マトリクスから複合体を解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、標準的な電気泳動技術を用いてビーズ分画で見出されるＴＬＲ２結合タンパク質のレベルをゲルから定量することができる。
本アッセイで使用するために、マトリクス上にタンパク質を固定化するためのその他の技術もまた利用可能である。例えば、当技術分野で周知の技術（例えば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ）を用いて、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）からビオチン化分子を調製し、ストレプトアビジン被覆した９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のウェル中で固定化することができる。
反応体の何れも標識することなく、ＴＬＲ２とＳｃｄ１との間の相互作用を化合物が調節する能力を調べることも本発明の範囲内である。例えば、タンパク質又は標的分子の何れも標識することなく、本発明のタンパク質とその標的分子との相互作用を検出するために、マイクロフィジオメーターを使用することができる。ＭｃＣｏｎｎｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：１９０６−１９１２、１９９２。本明細書中で使用される場合、「マイクロフィジオメーター」（例えばＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒ）は、光アドレス電位差滴定センサー（Ｌｌｉｇｈｔ−ａｄｄｒｅｓｓｓａｂｌｅ ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ ｓｅｎｓｏｒ、ＬＡＰＳ）を用いて、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。化合物と受容体との間の相互作用の指標として、この酸性化速度の変化を使用することができる。
本発明において試験することができる抗原に基づくヘテロポリマーは、好ましくは、自己抗体により認識される抗原と架橋された、ＴＬＲ２又はＳｃｄ１、好ましくはヒトＴＬＲ２又はＳｃｄ１に特異的である結合部分を含む。自己抗体により認識される抗原の例には、次の何れかのものが含まれるが限定されない：第ＶＩＩＩ因子（置換組み換え第ＶＩＩＩ因子による血友病の治療に関連する抗体）；筋肉アセチルコリン受容体（この抗体は、重症筋無力症疾病に関連する。）；カルジオリピン（狼瘡に関連する。）；血小板結合タンパク質（特発性血小板減少性紫斑病の疾病に関連する。）；シェーングレン症候群に関連する多重抗原；組織移植自己免疫応答の場合に関与する抗原；心筋で見られる抗原（自己免疫性心筋炎の疾病に関連する。）；免疫複合体介在性の腎臓疾患に関連する抗原；ｄｓＤＮＡ及びｓｓＤＮＡ抗原（ループス腎炎に関連する。）；デスモグレイン及びデスモプラキン（天疱瘡及び類天疱瘡に関連する。）;又は、特徴がよく分かっており、疾病病因に関連する何らかのその他の抗原。
本発明及びそれらをなす方法において試験するための、典型的なヘテロポリマー及び抗原に基づくヘテロポリマーは当技術分野で公知である。例えば、典型的なヘテロポリマーは、ＷＯ０３００７９７１Ａ１；Ｕ．Ｓ．２００２０１０３３４３Ａ１；米国特許第５，８７９，６７９号；米国特許第５，４８７，８９０号；米国特許第５，４７０，５７０号；ＷＯ９５２２９７７Ａ１；ＷＯ／０２０７５２７５Ａ３、ＷＯ／０２４６２０８Ａ２又はＡ３、ＷＯ／０１８０８８３Ａ１、ＷＯ／０１４５６６９Ａ１、ＷＯ９２０５８０１Ａ１、Ｌｉｎｄｏｒｆｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２４８：１２５、２００１；Ｈａｈｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：１０５７、２００１；Ｎａｒｄｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２１１：２１、１９９８；Ｋｕｈｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：５０８８、１９９８；Ｔａｙｌｏｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４５：１５２、１９９７；Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４０３５、１９９７；及びＴａｙｌｏｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２４６２、１９９２において教示されている。さらに、これらのヘテロポリマーの変異体を作製することができる。例えば、ある実施形態において、様々な結合化学を用いて作製された二重特異性分子の形態を使用することができる。二重特異性分子の成分を架橋するために使用することができる典型的な試薬には、ポリエチレングリコール、ＳＡＴＡ、ＳＭＣＣならびに当技術分野で公知であり利用可能なその他のもの、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのものが含まれる。試験することができる二重特異性分子の典型的な形態は、米国出願番号６０／４１１，７３１（２００２年９月１６日出願）に記載されており、この内容を参照により本明細書中に組み込む。
別の実施形態において、二重特異性分子の様々な多量体の形態を作製することができる（例えば、二量体、三量体、四量体、五量体又はより高い多量体の形態）。別の実施形態において、例えば、米国出願番号６０／３８０，２１１（２００２年５月１３日出願）（この内容を参照により本明細書中に組み込む。）に記載のように、二重特異性分子の精製形態を試験することができる。
別の実施形態において、ヘテロポリマーの結合部分の１つが抗体である場合、様々なアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２（例えば、ＩｇＧ２ａ）、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はＩｇＭ）の抗体を使用することができる。別の実施形態において、結合部分の１つに対して、抗体分子の一部（例えばＦａｂ断片）を使用することができる。好ましい実施形態において、結合部分の少なくとも１つはＦｃドメインを含有する抗体である。ある実施形態において、抗体はマウス抗体である。
別の実施形態において、抗体に対する修飾の影響を試験することができ、例えば米国出願番号６０／４５８，８６９（２００３年３月２８日出願）に記載のように、例えば抗体の脱免疫（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）の影響を試験することができる。
本発明において提供される方法において、非ヒト動物の、血清、循環及び／又は組織中の物質（例えば病原体）の濃度を、少なくとも、例えば約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％又は約１００％低下させることができる。
別の実施形態において、対象の、血清、循環及び／又は組織中の物質の濃度を間接的に測定することができる。例えば、その動物由来の組織試料を調べることにより、例えば、血清及び／又は循環中にその物質が存在することによる病変を測定することができる。非ヒト動物の、血清、循環及び／又は組織中の物質の濃度の別の間接的測定は、その物質が非ヒト動物において感染を起こす能力を測定することである。例えば、臨床的徴候及び感染の症状における二重特異性化合物の影響を測定することができる。二重特異性化合物が感染の拡大（例えばある器官系から別のものへ、又はある個体から別の個体へ）を阻止する能力も試験することができる。
別の実施形態において、非ヒト動物において二重特異性化合物がＴＬＲ２又はＳｃｄ１を含む細胞に結合する能力を測定する。例えば、ある実施形態において、リアルタイム生体分子間相互作用分析（ＢＩＡ）などの技術を用いて、二重特異性化合物がＴＬＲ２又はＳｃｄ１標的分子に結合する能力を調べることもできる（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５、１９９１及びＳｚａｂｏら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５、１９９５）。本明細書中で使用される場合、「ＢＩＡ」は、反応体の何れも標識せずに、リアルタイムで生体特異的相互作用を調べるための技術である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ）。生体分子間のリアルタイム反応の指標として、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象の変化を使用することができる。
別の実施形態において、非ヒト動物における細胞による物質の破壊を測定する（例えばマクロファージによる殺滅）。
（本二重特異性化合物を投与されていない非ヒト動物で観察される濃度と比較した場合に）非ヒト動物の、血清及び／又は循環中の物質の濃度を低下させる化合物を選択することができる。
試験する化合物の複数の中から、本アッセイにおいて試験するための化合物を選択することができる。別の実施形態において、例えばインビトロアッセイにおいてＴＬＲ２又はＳｃｄ１を結合できるものとして、本アッセイにおいて試験するための二重特異性化合物が既に同定されている可能性があり、本アッセイを使用して、さらにこれを評価又は最適化することができる。このような場合、血清及び／又は循環中の物質の濃度を二重特異性化合物が低下させる能力を調べるために、血清及び／又は循環中の物質の濃度を二重特異性化合物が低下させる能力を、別の二重特異性化合物又は同じ化合物の非最適化型と比較することができる。
好ましい実施形態において、およそ１μｇ化合物／ｋｇ体重からおよそ１００μｇ化合物／ｋｇ体重の範囲で本発明の二重特異性化合物を投与する。本明細書中で定義される場合、二重特異性化合物の治療的有効量（すなわち有効量）の範囲は、約０．０１から５０００μｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１から５００μｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約２から８０μｇ／ｋｇ体重及びさらにより好ましくは約５から７０μｇ／ｋｇ、１０から６０μｇ／ｋｇ、２０から５０μｇ／ｋｇ、２４から４１μｇ／ｋｇ、２５から４０μｇ／ｋｇ、２６から３９μｇ／ｋｇ、２７から３８μｇ／ｋｇ、２８から３７μｇ／ｋｇ、２９から３６μｇ／ｋｇ、３０から３５μｇ／ｋｇ、３１から３４μｇ／ｋｇ又は３２から３３μｇ／ｋｇ体重である。熟練者にとって当然のことながら、以下に限定されないが、疾患もしくは疾病の重症度、以前の治療、全般的健康及び／又は対象の年齢及びその他の疾患の存在を含むある一定の因子が、対象を効果的に治療するのに必要な用量に影響し得る。さらに、タンパク質、ポリペプチド又は抗体の治療的有効量での対象の治療には、単回治療が含まれ得るか、又は好ましくは、一連の治療が含まれ得る。
好ましい例において、作用物質の静脈内（ｉｖ）注射後、約１から５００μｇ／ｋｇ体重の範囲の二重特異性化合物で動物を治療する。これも当然のことながら、特定の治療のコースにわたり、治療のために使用される二重特異性化合物の有効用量を増減させることができる。用量の変更は、本明細書中に記載のような診断アッセイの結果から生じ得、明らかになり得る。
試験化合物及び／又は作用物質の投与経路は、動物の循環系への静脈内（ｉｖ）注射であり得る。その他の投与経路には、以下に限定されないが、局所、非経口、皮下又は吸入によるものが含まれる。「非経口」という用語には、例えば皮下、静脈内又は筋肉内経路による注射が含まれ、また、局所投与（例えば疾病又は損傷の部位）も含まれる。移植物からの化合物の持続放出もまた当技術分野で公知である。当業者にとって当然のことながら、適切な用量は変化し、治療すべき疾患の性質、患者の体重、年齢及び全身状態及び投与経路などの因子に依存する。動物試験に従い、仮の用量を決定することができ、当技術分野で許容されている実務に従い、ヒトへの投与に対する用量の調整を行う。
用量範囲にわたり、動物に候補化合物及び作用物質を投与することができる。作用物質も動物に投与する場合、作用物質投与の前、同時、後、の何れかで候補化合物を投与することができる。
対象の血清及び／又は循環中に、自己抗体、感染物質又は毒素など、望ましくない作用物質が存在することに関連するヒトでの疾患又は疾病を治療するのに有用な候補化合物をスクリーニング又は評価するために、本発明のＴＬＲ２−又はＳｃｄ１−発現トランスジェニック動物（例えばマウス）を使用することができる。
本発明の二重特異性化合物が結合し得る典型的な標的物質には、血液感染性物質（次の何れかを含むが限定されない：ウイルス、ウイルス粒子、毒素、細菌、ポリヌクレオチド、抗体、例えば自己免疫疾患に関連する自己抗体）が含まれる。ある実施形態において、典型的な標的となるウイルス性物質には、次の何れかが含まれるが限定されない：サイトメガロウイルス、インフルエンザ、ニューキャッスル病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、単純ヘルペスウイルス、肝炎、アデノウイルス−２、ウシウイルス性下痢ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、デングウイルス、マルブルグウイルス、エプスタイン−バーウイルス。
典型的なグラム陽性細菌性標的は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化膿連鎖球菌）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ヒト結核菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎連鎖球菌）又はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）である。上述の方法及び組成物の何れかは、皮膚感染、地域感染型肺炎、上及び下気道感染、皮膚及び軟組織感染、院内感染の肺感染、骨及び関節感染、気道感染、急性細菌性中耳炎、細菌性肺炎、尿路感染、合併感染、非合併感染、腎盂腎炎、腹内感染、深在性膿瘍、細菌性敗血症、中枢神経系感染、菌血症、創傷感染、腹膜炎、髄膜炎、熱傷後感染、尿生殖路感染、胃腸管感染、骨盤炎症疾患、心内膜炎及びその他の血管内感染の治療に有用である。治療すべき感染は、グラム陽性細菌により起こり得る。これらには、以下に限定されないが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（表皮ブドウ球菌）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（大便連鎖球菌）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ（エンテロコッカス・フェシウム）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｔｆｒｉｎｇｅｎｓ（クロストリジウム・ペルフリンゲン）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（クロストリジウム・ディフィシル）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化膿連鎖球菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎連鎖球菌）、その他の連鎖球菌属及びその他のクロストリジウム属による感染が含まれる。より具体的には、グラム陽性球菌又は薬物耐性グラム陽性球菌により感染が起こり得る。典型的なグラム陽性球菌は、以下に限定されないが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｍ．ｃａｔａｒｈａｌｉｓ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ、クラミジア類及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（腸球菌）類である。
菌血症はグラム陰性又はグラム陽性細菌により引き起こされ得る。グラム陰性細菌は、ペプチドグリカンの単層及びリポ多糖、リポタンパク質及びリン脂質の外層からなる薄い壁のある細胞膜を有する。典型的なグラム陰性生物には、以下に限定されないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（エシェリキア属）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ（赤痢菌）、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ（エドワードシエラ属）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（サルモネラ菌）、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ（シトロバクター属）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（クレブシエラ菌）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ（エンテロバクター属）、Ｈａｆｎｉａ（ハフニア属）、Ｓｅｒｒａｔｉａ（セラシア属）、Ｐｒｏｔｅｕｓ（プロテウス属）、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ（モルガネラ属）、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ（プロビデンシア属）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ（エルシニア）、Ｅｒｗｉｎｉａ（エルビニア属）、Ｂｕｔｔｌａｕｘｅｌｌａ（バッチオークセラ）、Ｃｅｄｅｃｅａ（セデセア）、Ｅｗｉｎｇｅｌｌａ（ユーインゲラ属）、Ｋｌｕｙｖｅｒａ（クライベラ属）、Ｔａｔｕｍｅｌｌａ（テイタメラ）及びＲａｈｎｅｌｌａ（ラーネラ）からなる腸内細菌科が含まれる。腸内細菌科ではないその他の典型的なグラム陰性生物には、以下に限定されないが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（緑膿菌）、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ（ステノトロフォモナス・マルトフィリア）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ（ブルコルデリア）、Ｃｅｐａｃｉａ（セパシア菌）、Ｇａｒｄｅｎｅｒｅｌｌａ（ガーデネレラ）、Ｖａｇｉｎａｌｉｓ（バギナリス）及びＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ（アシネトバクター）属が含まれる。グラム陽性生物は、ペプチドグリカンの多層及びテイコ酸の外層からなる厚い細胞膜を有する。典型的なグラム陽性生物には、以下に限定されないが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）、凝固酵素陰性ブドウ球菌、連鎖球菌、腸球菌、コリネバクテリア及びバチルス属が含まれる。
ある実施形態において、標的となる病原体は、伝統的な治療に対して耐性があり、例えば抗生物質耐性である。
ある実施形態において、本発明のアッセイを行うことにおいて、二重特異性化合物の投与前、投与と同時に、又は投与後に、作用物質をトランスジェニック動物に投与する。
半減期を延長するために、本発明の二重特異性化合物又はその何らかの部分を修飾することができる。製薬産業において、鋳型ペプチドと類似する特性を有する非ペプチド薬として、ペプチド類似体が一般に使用される。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチドの模倣体（Ｐｅｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」又は「ペプチド模倣体（Ｐｅｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」と呼ばれ（Ｆａｕｃｈｅｒｅ、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９、１９８６；Ｖｅｂｅｒら、ＴＩＮＳ ｐ．３９２、１９８５；及びＥｖａｎｓら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ ３０：１２２９、１９８７、これらは、参照により本明細書中に組み込まれる。）、通常、コンピュータ化された分子モデリングにより開発される。同等の治療又は予防効果を得るために、治療に有用なペプチドと構造的に同様のペプチド摸倣体を使用することができる。一般に、ペプチド摸倣体は、抗原ポリペプチドなど模範のポリペプチド（すなわち、生物学的又は薬理学的活性を有するポリペプチド）と構造的に類似しているが、当技術分野で公知であり、次の文献でさらに述べられている方法により、−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シス及びトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−及び−−ＣＨ２ＳＯ−−からなる群から選択される結合により場合によっては置換されている、１以上のペプチド結合を有する：Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．編、Ｍｅｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐ．２６７、１９８３；Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｖｅｇａ Ｄａｔａ、Ｖｏｌ．１、Ｉｓｓｕｅ３、「Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ」、１９８３；Ｍｏｒｌｅｙ、Ｔｒｅｎｄｓ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ ｐｐ．４６３−４６８、１９８０；Ｈｕｄｓｏｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．１４：１７７−１８５、１９７９（−−ＣＨ２ＮＨ−−、ＣＨ２−−ＣＨ２−−）；Ｓｐａｔｏｌａら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．３８：１２４３−１２４９、１９８６（−−ＣＨ２−−Ｓ）；Ｈａｎｎ、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ．Ｔｒａｎｓ．１：３０７−３１４、１９８２（−−ＣＨ−−ＣＨ−−、シス及びトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８、１９８０（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２３：２５３３、１９８２（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｓｚｅｌｋｅら、欧州特許出願ＥＰ４５６６５ＣＡ：９７：３９４０５、１９８２（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；Ｈｏｌｌａｄａｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２４：４４０１−４４０４、１９８３（−−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；及びＨｒｕｂｙ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．３１：１８９−１９９、１９８２（−−ＣＨ２−−Ｓ−−）；これらのそれぞれを参照により本明細書中に組み込む。特に好ましい非ペプチド結合は−−ＣＨ２ＮＨ−−である。このようなペプチド摸倣体は、例えば、より経済的な産物である、化学安定性がより高い、薬理学的特性が強化されている（半減期、吸収、効能、効力など）、特異性が変化している（例えば、生物学的活性の広いスペクトラム）、抗原性が低下していることなどを含め、ポリペプチド実施形態を超える顕著な長所を有し得る。ペプチド摸倣体の標識は通常、定量的構造−活性データ及び／又は分子モデリングにより予想されるペプチド摸倣体の妨害しない位置に対する、直接又はスペーサー（例えばアミド基）を介した、１以上の標識の共有結合を含む。このような非妨害位置は通常、治療効果を生じさせるためにペプチド摸倣体が結合する巨大分子と直接の接触を形成しない位置である。ペプチド摸倣体の誘導化（例えば標識）は、ペプチド摸倣体の所望の生物学的又は薬理学的活性を実質的に妨害すべきではない。
より安定なペプチドを得るために、アミノ酸配列の１以上のアミノ酸の同じ型のＤ−アミノ酸との体系的な置換（例えばＬ−リシンの代わりにＤ−リシン）を使用することができる。さらに、例えば、ペプチドを環状化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を付加することによるなど、当技術分野で公知の方法により、非天然ペプチドを生じさせることができる（Ｒｉｚｏら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７、１９９２、参照により本明細書中に組み込む。）。
原核又は真核細胞においてこのような修飾されたポリペプチドを産生させることができる。あるいは、化学的方法により、このようなペプチドを合成することができる。組み換え宿主での異種ポリペプチドの発現、ポリペプチドの化学合成及びインビトロ翻訳のための方法は、当技術分野で周知であり、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９；Ｂｅｒｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ１５２、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９８７、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９１：５０１、１９６９；Ｃｈａｉｋｅｎ、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：２５５、１９８１；Ｋａｉｓｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１８７、１９８９；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３４２、１９８６；Ｋｅｎｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：９５７、１９８８；及びＯｆｆｏｒｄ、Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗｉｌｅｙ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９８０（参照により本明細書中に組み込む。）においてさらに述べられている。
通常、直接的化学合成によりポリペプチドを生成させ、ヘテロポリマーの結合部分として使用することができる。Ｎ末端及び／又はＣ末端へ共有結合により連結された非ペプチド部分を有する修飾ペプチドとしてペプチドを生成させることができる。ある好ましい実施形態において、カルボキシ末端もしくはアミノ末端の何れか又は両方が化学的に修飾される。末端アミノ基及びカルボキシル基の最も一般的な修飾は、それぞれアセチル化及びアミド化である。アシル化（例えばアセチル化）又はアルキル化（例えばメチル化）などのアミノ末端修飾及び、アミド化などのカルボキシ末端修飾ならびに、環状化を含むその他の末端修飾が、試験化合物の様々な実施形態に組み込まれ得る。ある種のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端修飾及び／又はコア配列に対するペプチド延長により、安定性の向上、効能及び／又は効力の向上、血清プロテアーゼに対する耐性、所望の薬物動態学的特性など、有利な物理的、化学的、生化学的及び薬理学的特性が得られる。
トランスジェニック動物の構築
ある態様において、本発明は、非ヒト又はヒトＴＬＲ２遺伝子又はＳｃｄ１遺伝子が、その動物のマクロファージで機能的に発現されるか、又は非ヒトもしくはヒトＴＬＲ２又はＳｃｄ１がその動物のマクロファージにおける機能獲得型突然変異であるように、プロモーターに操作可能に連結されたＴＬＲ２又はＳｃｄ１をコードするポリヌクレオチドをゲノムが含有する動物を提供する。本発明はさらに、その動物のマクロファージにおいて非ヒトもしくはヒトのＴＬＲ２又はＳｃｄ１を発現するトランスジェニック非ヒト動物を作製するための方法を提供する。
本発明の方法で使用されるトランスジェニック動物は、例えば、哺乳動物、鳥類、爬虫類又は両生類であり得る。本明細書中に記載の使用に対して適切な哺乳動物には、げっ歯類；反芻動物；有蹄動物；家畜化された哺乳動物及び乳畜が含まれる。好ましい動物には、げっ歯類、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、乳牛、ブタ、ウマ、雄牛、ラマ、ニワトリ、ガチョウ及びシチメンチョウが含まれる。好ましい実施形態において、非ヒト動物はマウスである。
トランスジェニック動物を作製する様々な方法が当技術分野で公知である（例えば、Ｗａｔｓｏｎら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ 第２版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐｐ．２５５−２７２、１９９２の、「Ｔｈｅ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｇｅｎｅｓ Ｉｎｔｏ Ｍｉｃｅ」；Ｇｏｒｄｏｎ、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９、１９８９；Ｊａｅｎｉｓｃｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１４６８−１４７４、１９８９；Ｒｏｓｓａｎｔ、Ｎｅｕｒｏｎ ２：３２３−３３４、１９９０を参照。）。トランスジェニックブタの作製についての典型的プロトコールは、Ｗｈｉｔｅ ａｎｄ Ｙａｎｎｏｕｔｓｏｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：６４ｔｈ Ｆｏｒｕｍ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｐｐ．８８−９４；米国特許第５，５２３，２２６号；米国特許第５，５７３，９３３号；ＰＣＴ出願ＷＯ９３／２５０７１；及びＰＣＴ出願ＷＯ９５／０４７４４で見出すことができる。トランスジェニックラットの作製のための典型的プロトコールは、Ｂａｄｅｒら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、Ｓｕｐｐ．３：Ｓ８１−S８７、１９９６で見出すことができる。トランスジェニック乳牛の作製のための典型的プロトコールは、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９４編、Ｃａｒｌ Ａ．Ｐｉｎｋｅｒｔ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．で見出すことができる。トランスジェニックヒツジの作製のための典型的プロトコールは、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９４編、Ｃａｒｌ Ａ．Ｐｉｎｋｅｒｔ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．で見出すことができる。いくつかの典型的方法を下記でより詳述に示す。
Ａ．前核への注入
卵細胞に本発明による核酸コンストラクトを導入することにより、トランスジェニック動物を作製することができる。正常な胎仔発生のために、得られた卵細胞を雌の子宮に移植し、次に、トランス遺伝子に対してヘテロ接合体であるものを得るために、発生し、トランス遺伝子を有する動物を戻し交配する。本発明のトランス遺伝子を導入するために、様々な発生段階での胚の標的細胞を使用する。胚の標的細胞の発生段階に依存して様々な方法が使用される。トランス遺伝子を導入するための典型的な方法には、以下に限定されないが、受精卵又は接合体のマイクロインジェクション（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４４３８−４４４２、１９８５）及びウイルス組み込み（Ｊａｅｎｉｓｃｈ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７３：１２６０−１２６４、１９７６；Ｊａｈｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６９２７−６９３１、１９８５；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２、１９８５）が含まれる。胚操作及びマイクロインジェクションに対する手順は、例えば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ．、１９８６、その内容を参照により本明細書中に組み込む。）に記載されている。その他のトランスジェニック動物の作製に対して同様の方法を使用する。
典型的な実施形態において、トランスジェニックマウスの作製は次の段階を要する。定められた同系交配の遺伝学的バックグラウンド由来の雄及び雌のマウスを交配させる。交配させる雌マウスは、卵胞の成長を誘導するために前もって妊馬血清ＰＭＳで、及び排卵を誘発するためにヒト絨毛性ゴナドトロピンｈＣＧで処理する。交配後、雌を屠殺し、その卵管から受精卵を取り出す。このとき、前核はまだ融合しておらず、光学顕微鏡を用いてそれらを目でみることができる。代替的プロトコールにおいて、様々な発生段階において、胚を回収することができ、例えば胚盤胞を回収することができる。ダルベッコの改変リン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）中で胚を回復させ、１０％ウシ胎仔血清を添加したダルベッコの改変最小必須培地（ＤＭＥＭ）で維持する。
次に、外来ＤＮＡ又は組み換えコンストラクト（例えばＴＬＲ２又はＳｃｄ１発現コンストラクト）の前核にマイクロインジェクションする（１００−１０００分子／卵）。顕微鏡に装着された標準的マイクロマニピュレーターを用いて、発現コンストラクトのマイクロインジェクションを行うことができる。例えば、通常、マイクロインジェクションの間、油下でＤＰＢＳの１００μＬの滴中で胚を固定する。雄性前核にＤＮＡ溶液をマイクロインジェクションする。前核を膨張させることにより、インジェクションが首尾よくできたことを監視する。その後すぐに、前核（雌性前核及び雄性前核）の融合が起こり、場合によっては、外来ＤＮＡを（通常は）受精卵又は接合体の１つの染色体に挿入する。同様の技術を用いて、下記で述べるように調製した組み換えＥＳ細胞を胚盤胞に注入することができる。
Ｂ．胚性幹細胞
トランスジェニックマウス作製の別の方法において、本発明の組み換えＤＮＡ分子をマウス胚性幹（ＥＳ）細胞に導入することができる。次に、前段落で述べたものと同様の技術を用い、得られた組み換えＥＳ細胞をマウス胚盤胞にマイクロインジェクションする。
移植前の胚からＥＳ細胞を得て、インビトロで培養する（Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４−１５６、１９８１；Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３０９：２５５−２５８、１９８４；Ｇｏｓｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９０６５−９０６９、１９８６；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：４４５−４４８、１９８６）。標的コンストラクトの生殖細胞系列伝達を生じさせるために、発生中の胚の生殖細胞系列の一部に入り、その一部となることができるＥＳ細胞株のいずれも、本明細書中での使用に適切である。例えば、ＥＳ細胞の作製に使用することができるマウス系統は、１２９Ｊ系統である。好ましいＥＳ細胞株は、マウス細胞株Ｄ３（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、カタログ番号ＣＲＬ１９３４）である。当技術分野で公知であり、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、１９８７、Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．２０：３５７−３７１、１９８６及びＨｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８６（これらの内容を参照により本明細書中に組み込む。）で述べられている方法を用いて、ＥＳ細胞を培養し、ＤＮＡ挿入のために調製することができる。
例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９（この内容を参照により本明細書中に組み込む。）で述べられているものなど、当技術分野で公知の方法により、発現コンストラクトをＥＳ細胞に導入することができる。適切な方法には、以下に限定されないが、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション及びリン酸カルシウム処理法が含まれる。ＥＳ細胞に導入するための発現コンストラクト（例えばＴＬＲ２又はＳｃｄ１）は、好ましくは線状である。ベクター配列内のみ切断し、遺伝子（例えばＴＬＲ２又はＳｃｄ１遺伝子）内では切断しないよう選択した適切な制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡを消化することにより、線状化を行うことができる。
発現コンストラクトの導入後、コンストラクトの存在についてＥＳ細胞をスクリーニングする。様々な方法を用いて、細胞をスクリーニングすることができる。マーカー遺伝子をコンストラクト中に入れる場合、マーカー遺伝子の存在について動物の細胞を試験することができる。例えば、マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子である場合、抗生物質（例えばｎｅｏに対して選択するためにＧ４１８）の致死濃度の存在下で、細胞を培養することができる。生存細胞は、トランス遺伝子コンストラクトを組み込んでいると思われる。マーカー遺伝子が、活性を検出できる酵素（例えばβ−ガラクトシダーゼ）をコードする遺伝子である場合、適切な条件下で細胞に酵素基質を添加することができ、酵素活性を分析できる。あるいは、又はさらに、ＥＳ細胞ゲノムＤＮＡを直接調べることができる。例えば、標準的方法を用いてＥＳ細胞からＤＮＡを抽出し、次に、トランス遺伝子に特異的にハイブリダイズするように設計されているプローブを用いてサザンブロットにおいてこのＤＮＡを調べることができる。標的コンストラクトを含有する細胞のみが適正サイズのＤＮＡ断片を生じるように、特定サイズ及びトランス遺伝子の配列のＤＮＡ断片を増幅させるために特異的に設計されているプローブを用いて、ＰＣＲによりゲノムＤＮＡを増幅させることもできる。
Ｃ．移植
精管切除術を行った雄と前もって交配することにより得た偽妊娠雌マウスに、本発明の組み換え核酸分子（例えばＴＬＲ２又はＳｃｄ１）を有する接合体を移植する。一般的プロトコールにおいて、レシピエント雌を麻酔し、パラルンバー切開を行って卵管を露出させ、胚を卵管の膨大部領域に移す。体壁を縫合し、皮膚を創傷クリップで閉じる。胚は、全妊娠期間、発生し、代理母がトランスジェニックマウスと思われる仔を出産する。最後に、外来又は組み換えＤＮＡの存在について新生マウスを試験する。注入を行った卵のうち、平均１０％が正常に発生し、マウスを産む。新生マウスのうち、２．５％の全体的効率に対して、平均で４匹に１匹（２５％）がトランスジェニックである。これらのマウスを繁殖させると、これらのマウスは、マウス染色体と連結された通常の（メンデルの法則）様式において、外来遺伝子を伝達する。
Ｄ．トランスジェニックコンストラクトの存在についてのスクリーニング
標準的プロトコールにより、生後、トランスジェニック動物を同定することができる。例えば、サザンブロット法及び／又はＰＣＲを用いて、トランス遺伝子コンストラクトの存在について、尾部組織から採取したＤＮＡをスクリーニングすることができる。次に、ホモ接合動物を得るために、それらがトランス遺伝子を有すると思われるならば、モザイクと思われる子孫を互いに交配する。子孫が生殖細胞系列伝達を有するか否かが不明瞭な場合、親又はその他の系統とそれらを交配し、その子孫のヘテロ接合性についてスクリーニングすることができる。ＤＮＡのサザンブロット及び／又はＰＣＲ増幅により、ヘテロ接合体を同定する。次に、ホモ接合体トランスジェニック子孫を得るために、このヘテロ接合体を互いに交配する。この交配で生まれたマウス、ならびにヘテロ接合体であることが分かっているマウス及び野生型マウスからのゲノムＤＮＡの当量のサザンブロッティングにより、ホモ接合体を同定することができる。ヒト又は非ヒトのＴＬＲ２もしくはＳｃｄ１遺伝子又はマーカー遺伝子又は両方の配列に基づき、サザンブロットをスクリーニングするためのプローブを設計することができる。
トランスジェック子孫を同定し、特徴を調べるその他の手段は当技術分野で公知である。例えば、導入された遺伝子によりコードされるタンパク質（例えば、ヒト又は非ヒトのＴＬＲ２又はＳｃｄ１タンパク質）に対する抗体又はマーカー遺伝子産物に対する抗体（この遺伝子が発現される場合）を用いてウエスタンブロットを調べることにより、これらの子孫の様々な組織において導入された遺伝子の発現レベルを評価するために、ウエスタンブロットを使用することができる。
トランス遺伝子産物の有無を調べるために、適切な抗体を用いて、細胞を固定し、抗体で標識することなどのインシトゥ分析、及び／又は子孫由来の様々な細胞（例えば赤血球細胞）のＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）分析を行うことができる。例えば、マクロファージにおけるＴＬＲ２又はＳｃｄ１の発現を確認するために、ヒトＴＬＲ２又はＳｃｄ１に特異的な抗体（直接共役しているか、又はフルオロフォアと共役しており、ＴＬＲ２又はＳｃｄ１に対する抗体を認識する二次抗体とともに使用される。）を用いてフローサイトメトリーを行うことができる。この分析において、ＴＬＲ２又はＳｃｄ１の存在に対して、陽性対照としてヒト赤血球を使用することができ、陰性対照として正常マウス赤血球を使用することができる。
Ｅ．複数のトランス遺伝子又はさらなる突然変異を含有するマウス
ａ）さらなるトランス遺伝子を有する、又はｂ）その他の遺伝子において突然変異を含有するマウスと、本明細書中に記載のような、ＴＬＲ２又はＳｃｄ１を発現するトランスジェニックマウスを交配させることができる。突然変異のそれぞれに対してヘテロ接合又はホモ接合であるマウスを作製し、標準的異種交配手法を用いて維持することができる。ＴＬＲ２又はＳｃｄ１トランス遺伝子を含有するマウス系統と交配することができるマウスの例には、以下に限定されないが、例えばマウス系統ＮＺＢ／Ｖ、ＭＲＬ＋又はＳＪＬなど、狼瘡のモデルであるマウス系統など、自己免疫疾患に対してより罹患しやすいマウス系統が含まれる。
本発明はさらに、トランスジェニック動物由来の細胞に関する。突然変異又は環境的影響の何れかによって続く世代においてある種の修飾が起こり得るので、実際、このような子孫は親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書中で使用される場合の用語の範囲内に含まれる。
組み換え核酸技術
本発明を実施するのに使用される核酸は、ＲＮＡ、ｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ベクター、ウイルス又はそのハイブリッドであれ、遺伝子操作され、増幅され、及び／又は組み換えで発現／作製された、様々な源から単離することができる。これらの核酸から生成された組み換えポリペプチドを個別に単離又はクローニングし、所望の活性について試験することができる。細菌、哺乳動物、酵母、昆虫又は植物細胞発現系を含む、何らかの組み換え発現系を使用することができる。
あるいは、例えば、Ａｄａｍｓ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１、１９８３；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３４４０−３４４４、１９９７；Ｆｒｅｎｋｅｌ、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９：３７３−３８０、１９９５；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：７８８６−７８９６、１９９４；Ｎａｒａｎｇ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０、１９７９；Ｂｒｏｗｎ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９、１９７９；Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９、１９８１；米国特許第４，４５８，０６６号に記載のように、周知の化学合成技術により、インビトロでこれらの核酸を合成することができる。
本発明は、本発明の配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する（例えば、本発明の典型的配列の続き）。オリゴヌクレオチドには、例えば、１本鎖ポリデオキシヌクレオチド又は化学合成することができる２つの相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖が含まれる。
例えば、サブクローニング、標識プローブ（例えば、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ、ニック翻訳、増幅を用いたランダムプライマー標識）、配列決定、ハイブリダイゼーションなど、核酸の操作のための技術は科学及び特許文献で詳細に記載されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（第２版）、Ｖｏｌｓ．１−３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ａｕｓｂｅｌ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９７；ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ ＩＮ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ：ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＷＩＴＨ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＰＲＯＢＥＳ、Ｐａｒｔ Ｉ、Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、Ｔｉｊｓｓｅｎ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９９３を参照。）。
当業者にとって周知である多くの一般的手段に何れかにより、核酸、ベクター、キャプシド、ポリペプチドなどを分析し、定量することができる。これらには、例えば、ＮＭＲ、分光光度法、ラジオグラフィー、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）及びハイパー拡散（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー、様々な免疫学的方法、例えば液体又はゲル沈殿反応、免疫拡散法、免疫−電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫−蛍光アッセイ、サザン分析、ノザン分析、ドットブロット分析、ゲル電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、核酸又は標的又はシグナル増幅法、放射性同位元素標識法、シンチレーションカウント及びアフィニティークロマトグラフィーなど、分析生化学法が含まれる。
ゲノム試料からクローニングし、必要に応じて、例えばゲノムクローン又はｃＤＮＡクローンから単離又は増幅されたインサートをスクリーニングし、再クローニングすることにより、本発明の方法を実施するために使用される核酸を得て、操作することができる。本発明の方法において使用される核酸の源には、例えば、哺乳動物人工染色体（ＭＡＣ）（例えば、米国特許第５，７２１，１１８号；６，０２５，１５５号参照）；ヒト人工染色体（例えば、Ｒｏｓｅｎｆｉｅｌｄ、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：３３３−３３５、１９９７参照）；酵母人工染色体（ＹＡＣ）；細菌人工染色体（ＢＡＣ）；Ｐ１人工染色体（例えば、Ｗｏｏｎ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５０：３０６−３１６、１９９８参照）；Ｐ１由来ベクター（ＰＡＣ）（例えば、Ｋｅｒｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：１２０−１２４、１９９７参照）；コスミド、組み換えウイルス、ファージ又はプラスミドに含有される、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリが含まれる。
本発明は、融合タンパク質又は、これらをコードする核酸を提供する。安定性の向上又は精製の単純化などの所望の特徴を有するＮ−末端同定ペプチドなど、異種ペプチド又はポリペプチドに、Ｓｃｄ１遺伝子産物又はトール様受容体２ポリペプチドを融合させることができる。例えば、より免疫原性の強いペプチドを作製するために、より容易に組み換え合成ペプチドを単離するために、抗体及び抗体発現Ｂ細胞を同定し単離するためになど、本発明のペプチド及びポリペプチドを合成し、これらに連結される１以上のさらなるドメインとの融合タンパク質として発現させることもできる。検出及び精製を促進するドメインには、例えば、固定化された金属上での精製を可能にするポリヒスチジントラクト及びヒスチジン−トリプトファンモジュールなどの金属キレートペプチド、固定化された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン及び、ＦＬＡＧＳ拡張部／アフィニティー精製系（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｗａｓｈ）において利用されるドメインが含まれる。精製ドメインとモチーフ含有ペプチド又はポリペプチドとの間に第Ｘａ因子又はエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆ．）などの切断可能なリンカー配列を含むことにより、精製が容易になる。例えば、発現ベクターは、その後にチオレドキシン及びエンテロキナーゼ切断部位が続く６個のヒスチジン残基と連結された、エピトープをコードする核酸配列を含み得る（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１７８７−１７９７、１９９５；Ｄｏｂｅｌｉ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ １２：４０４−４１４、１９９８）。ヒスチジン残基は、検出及び精製を促進するが、一方、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質の残りの部分からエピトープを精製するための手段を提供する。ある態様において、翻訳されたポリペプチド又はその断片の分泌を支配することができるリーダー配列と、本発明のポリペプチドをコードする核酸を適切なフェーズでアセンブルする。融合タンパク質をコードするベクターに関する技術及び融合タンパク質の適用は、科学及び特許文献で詳細に記載されている（例えば、Ｋｒｏｌｌ、ＤＮＡ ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：４４１−５３、１９９３を参照。）。
Ａ．転写調節エレメント
本発明の核酸をプロモーターと操作可能に連結することができる。プロモーターは、核酸の転写を支配する、１つのモチーフ又は核酸調節配列の一続きであり得る。プロモーターは、転写の開始部位近くに必要な核酸配列を含む（例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合、ＴＡＴＡエレメント）。プロモーターはまた、場合によっては、転写の開始部位から数千塩基対ほど離れて位置し得る、遠位のエンハンサー又はリプレッサーエレメントも含む。「構成的な」プロモーターは、殆どの環境及び発生条件下で活性があるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境的又は発生的制御下にあるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、生物のある特定の組織タイプにおいて活性があるが、同じ生物由来のその他の組織タイプでは活性がない。「操作可能に連結された」とは、核酸発現調節配列（プロモーター又は転写因子結合部位の一続きなど）と第二の核酸配列との間の機能的な連結を指し、発現調節配列は、第二の配列に相当する核酸の転写を支配する。
Ｂ．発現ベクター及びクローニングビヒクル
本発明は、本発明の核酸（例えば、本発明のタンパク質をコードする配列）を含有する、発現ベクター及びクローニングビヒクルを提供する。本発明の発現ベクター及びクローニングビヒクルは、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、フォウルポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びＳＶ４０派生物）、Ｐ１を基にした人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体及び関心のある具体的な宿主に対して特異的な何らかのその他のベクター（バチルス、アスペルギルス及び酵母など）を含有し得る。本発明のベクターは、染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列を含み得る。多数の適切なベクターが当業者にとって公知であり、市販されている。
通常の分子生物学的方法を用いて、必要に応じて、様々なベクターの何れかに本発明の核酸をクローニングすることができ、インビトロで増幅された核酸のクローニングに対する方法は、例えば、米国特許第５，４２６，０３９号に記載されている。増幅配列のクローニングを促進するために、制限酵素部位をＰＣＲプライマーペアに「組み込む」ことができる。
本発明は、本発明のポリペプチド及びペプチドをコードする発現ベクターのライブラリを提供する。ゲノムに、又は細胞の細胞質又は核に、これらの核酸を導入し、様々な従来の技術により発現させることができ、これは、科学及び特許文献に詳細に記載されている。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｎａｔｕｒｅ ３２８：７３１、１９８７；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０、１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｔｉｊｓｓｅｎ又はＡｕｓｂｅｌを参照のこと。ＡＴＣＣ又はＧｅｎＢａｎｋライブラリなどから得られた天然の源からベクターを単離するか、又は合成もしくは組み換え法により調製することができる。例えば、細胞において安定に又は一時的に発現される、発現カセット、ベクター又はウイルスにおいて、本発明の核酸を発現させることができる（例えば、エピソーム発現系）。形質転換した細胞及び配列において選択可能な表現型を与えるために、発現カセット及びベクターに選択マーカーを組み込むことができる。例えば、選択マーカーは、宿主ゲノムへの組み込みが必要でないように、エピソーム維持及び複製のためにコードすることができる。
ある態様において、本発明のペプチド又はポリペプチドのインシトゥ発現のために、本発明の核酸をインビボで投与する。「裸の」（例えば、米国特許第５，５８０，８５９号）ＤＮＡとして、又は発現ベクターの形式で（例えば、組み換えウイルス）、本核酸を投与することができる。下記のように、腫瘍周辺又は腫瘍内を含む何らかの経路により、本核酸を投与することができる。インビボで投与されるベクターは、組み換え改変されたエンベロープのある、又はエンベロープのないＤＮＡ及びＲＮＡウイルスを含む、好ましくは、バキュロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科又はピコルナウイルス科から選択される、ウイルスゲノム由来であり得る。親ベクターの特性のそれぞれの長所を利用するキメラベクターを使用することもできる（例えば、Ｆｅｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：８６６−８７０、１９９７）。本発明の核酸を含むために、組み換えＤＮＡ技術により、このようなウイルスゲノムを改変することができ；複製欠損性、条件付き複製又は複製可能となるように、さらに操作することができる。他の態様において、ベクターはアデノウイルス（例えば、ヒトアデノウイルスゲノム由来の複製能力のないベクター、例えば、米国特許第６，０９６，７１８号；同第６，１１０，４５８号；同第６，１１３，９１３号；同第５，６３１，２３６号を参照。）；アデノ関連ウイルス及びレトロウイルスゲノム由来である。レトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びこれらの組み合わせを含み得る（例えば、米国特許第６，１１７，６８１号；同第６，１０７，４７８号；同第５，６５８，７７５号；同第５，４４９，６１４号；Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６６：２７３１−２７３９、１９９２；Ｊｏｈａｎｎ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６６：１６３５−１６４０、１９９２参照）。例えば、核酸及びペプチドのインビトロ産生において、及びインビボ及びエクスビボ遺伝子治療手段において、標的核酸を有する細胞をアディオ免疫（ａｄｉｏｉｍｍｕｎ）するために、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶＶ）に基づくベクターを使用することができる（例えば、米国特許第６，１１０，４５６号；同第５，４７４，９３５号；Ｏｋａｄａ、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：９５７−９６４、１９９６を参照）。
「発現カセット」とは、本明細書中で使用される場合、構造遺伝子（すなわち、本発明のポリペプチドなど、タンパク質をコードする配列）の発現に対して、このような配列と適合する宿主において、影響を与えることができるヌクレオチド配列を指す。発現カセットは、少なくとも、ポリペプチドコード配列と操作可能に連結されたプロモーターを含み、場合によっては、その他の配列（例えば、転写終結シグナル）をともに含む。発現を行うのに必要な、又は役立つさらなる因子（例えばエンハンサー）もまた使用できる。
核酸は、これが別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、「操作可能に連結」されている。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、これが配列の転写に影響を与える場合、コード配列と操作可能に連結されている。転写制御配列に関して、操作可能に連結される、とは、連結されているＤＮＡ配列が隣接し、２個のタンパク質コード領域をつなぐのに必要な場合、隣接し、リーディングフレームにあることを意味する。スイッチ配列に対して、操作可能に連結される、とは、その配列がスイッチ組み換えを実行することが可能であることを指す。このように、発現カセットはまた、プラスミド、発現ベクター、組み換えウイルス、組み換え「裸の」ＤＮＡベクターの何らかの形なども含む。
「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を移すことができる核酸分子を指すものとする。あるタイプのベクターは、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントをつなぐことができる環状の２本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、さらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにつなぐことができる。ある特定のベクターは、これらが導入される宿主細胞において自己複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムにその他のベクター（例えば、非エピソーム性の哺乳動物ベクター）を組み込むことができ、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクターは、これらが操作可能に連結されている遺伝子の発現を支配することができる。このようなベクターは、本明細書中で「組み換え発現ベクター」（又は簡単に「発現ベクター」）と呼ぶ。一般に、組み換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドは最もよく使用されるベクターの形態であるので、本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は交換可能に使用することができる。しかし、本発明は、ウイルスベクター（例えば複製欠損性レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス）など、発現ベクターのこのようなその他の形態を含むものとし、これらは、同等の機能を果たす。
Ｃ．宿主細胞及び形質転換した細胞
本発明はまた、本発明の核酸配列（例えば、本発明のポリペプチドをコードする配列又は本発明のベクター）を含有する、形質転換された細胞を提供する。宿主細胞は、原核細胞、真核細胞、例えば細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は植物細胞を含む、当業者にとってよく知られている宿主細胞の何れかであり得る。典型的な細菌細胞には、Ｅ．コリ、ストレプトミセス、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ネズミチフス菌）及び、シュードモナス属、ストレプトミセス属及びスタフィロコッカス属内の様々な種が含まれる。典型的な昆虫細胞には、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（ショウジョウバエ）Ｓ２及びスポドプテラＳｆ９が含まれる。典型的な動物細胞には、ＣＨＯ、ＣＯＳ又はＢｏｗｅｓメラノーマ又は何らかのマウスもしくはヒト細胞株が含まれる。適切な宿主の選択は、当業者の能力内である。
形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃又はＴｉ−介在遺伝子導入を含む様々な技術の何れかを用いて、宿主細胞にベクターを導入することができる。特定の方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション、リポフェクション又はエレクトロポレーションが含まれる。
プロモーターの活性化、形質転換体の選択又は本発明の遺伝子の増幅に対して適切であるように改変した従来の栄養培地において、操作した宿主細胞を培養することができる。適切な宿主株を形質転換し、適切な細胞密度まで宿主株を増殖させた後、適切な手段によって、選択したプロモーターを誘導することができ（例えば、温度変化又は化学誘導）、所望のポリペプチド又はその断片を産生させるために、さらなる期間、細胞を培養することができる。
遠心により細胞を回収し、物理的又は化学的手段により破壊することができ、さらなる精製のために、得られた未精製抽出物を確保する。凍結−融解の繰り返し、超音波破砕、機械的破壊又は細胞溶解剤の使用を含む何らかの従来の方法により、タンパク質の発現のために使用する微生物細胞を破壊することができる。このような方法は当業者にとって周知である。発現されたポリペプチド又は断片を回収し、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む方法により、組み換え細胞培養物から精製することができる。ポリペプチドの立体構造を完成することにおいて、必要に応じて、タンパク質再折りたたみ段階を使用することができる。必要に応じて、最終精製段階に対して、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を利用することができる。
組み換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳動物細胞培養系を利用することもできる。哺乳動物発現系の例には、サル腎臓繊維芽細胞のＣＯＳ−７株及び、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞株など、適合可能なベクターからタンパク質を発現させることができるその他の細胞株が含まれる。
組み換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生させるために、従来の様式で宿主細胞中のコンストラクトを使用することができる。組み換え産生手段において利用される宿主に応じて、ベクターを含有する宿主細胞により産生されるポリペプチドは、グリコシル化又は非グリコシル化の形であり得る。本発明のポリペプチドはまた、開始メチオニンアミノ酸残基を含んでいてもよいし、含まなくてもよい。
本発明のポリペプチドを産生させるために、無細胞の翻訳系を利用することもできる。無細胞の翻訳系は、ポリペプチド又はその断片をコードする核酸に操作可能に連結されたプロモーターを含有するＤＮＡコンストラクトから転写されたｍＲＮＡを使用し得る。ある態様において、インビトロ転写反応を行う前に、ＤＮＡコンストラクトを直線化することができる。次に、所望のポリペプチド又はその断片を産生させるために、ウサギ網赤血球抽出物などの適切な無細胞翻訳抽出物と転写されたｍＲＮＡをインキュベートする。
発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択に対して表現型特性を与えるために、真核細胞培養に対してジヒドロ葉酸還元酵素もしくはネオマイシン耐性など、又はＥ．コリにおいてテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性など、１以上の選択マーカー遺伝子を含有し得る。
Ｄ．核酸の増幅
本発明の実施において、例えば増幅により、本発明のポリペプチドをコードする核酸又は改変核酸を複製させることができる。本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸を増幅するための増幅プライマー配列ペア（例えば、Ｓｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２配列又はその部分配列を含有する核酸配列を増幅することができるプライマーペア）を提供する。
増幅法には、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲ（ＰＣＲ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ、Ａ ＧＵＩＤＥ ＴＯ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、Ｉｎｎｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、１９９０及びＰＣＲ ＳＴＲＡＴＥＧＩＥＳ、１９９５、Ｉｎｎｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｗｕ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０、１９８９；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７、１９８８；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ、Ｇｅｎｅ ８９：１１７、１９９０を参照。）；転写増幅（例えば、Ｋｗｏｈ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３、１９８９参照。）；及び自律的配列複製（例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４、１９９０）；Ｑ Ｂｅｔａレプリカーゼ増幅（例えば、Ｓｍｉｔｈ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：１４７７−１４９１、１９９７参照。）、自動化Ｑ Ｂｅｔａレプリカーゼ増幅アッセイ（例えば、Ｂｕｒｇ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ １０：２５７−２７１、１９９６参照。）及びその他のＲＮＡポリメラーゼが介在する技術（例えば、ＮＡＳＢＡ、Ｃａｎｇｅｎｅ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ）；Ｂｅｒｇｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３０７−３１６、１９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ；Ａｕｓｂｅｌ；米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号；Ｓｏｏｋｎａｎａｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：５６３−５６４、１９９５も参照のこと。）が含まれる。
Ｅ．核酸のハイブリダイゼーション
本発明は、例えば、Ｓｃｄ１配列もしくはトール様受容体２配列、又はその何らかの相補体、又は本発明のポリペプチドをコードする核酸などの本発明の典型的な配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、単離又は組み換え核酸を提供する。代替的な態様において、ストリンジェントな条件は、当技術分野で知られているように、及び本明細書中で述べられるように、非常にストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件又は低程度にストリンジェントな条件である。本発明の核酸を単離するために、これらの方法を使用することができる。
代替的な態様において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズできることを特徴とする本発明の核酸は、約５残基から本発明の核酸の全長の間であり得、例えば、それらは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００又はそれを超える残基長か、又は遺伝子もしくはコード配列（例えばｃＤＮＡ）の全長であり得る。全長よりも短い核酸も含まれる。これらの核酸は、例えばハイブリダイゼーションプローブ、標識プローブ、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプローブ、ｉＲＮＡ、アンチセンス又は、抗体結合ペプチド（エピトープ）、モチーフ、活性部位などをコードする配列として有用であり得る。
「選択的に（又は特異的に）ハイブリダイズする」とは、その配列が複雑な混合物（例えばトータル細胞又はライブラリＤＮＡもしくはＲＮＡ）中に存在する場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での、特定のヌクレオチド配列に対する分子の結合、２本鎖形成又はハイブリダイズを指し、この場合、バックグラウンドの少なくとも約１０倍で特定のヌクレオチド配列が検出される。ある実施形態において、ストリンジェントな条件下で、別に本発明の範囲内であることが調べられた核酸（本明細書中に記載の典型的な配列など）にハイブリダイズできることにより、本発明の範囲内にあることについて核酸を調べることができる。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、通常は核酸の複雑な混合物中でプローブがその標的部分配列にハイブリダイズするが、他の配列には顕著な量でハイブリダイズしない条件を指す（陽性のシグナル（例えば本発明の核酸の同定）は、バックグラウンドハイブリダイゼーションの約１０倍である。）。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、環境によって様々である。配列が長いほど、高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する詳しいガイドは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（第２版）、Ｖｏｌｓ．１−３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ａｕｓｂｅｌ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９７；ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ ＩＮ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ：ＨＩＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＷＩＴＨ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＰＲＯＢＥＳ、ＰＡＲＴ１、Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、Ｔｉｊｓｓｅｎ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９９３で見出すことができる。
一般に、定められたイオン強度ｐＨにおける具体的な配列に対する熱融点よりも約５から１０℃低くなるようにストリンジェント条件を選択する。Ｔｍは、標的と相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする（定められたイオン強度、ｐＨ及び核濃度での）温度である（標的配列が過剰に存在する場合、Ｔｍにおいてプローブの５０％が平衡状態で占有される。）。ストリンジェント条件は、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン未満、通常は、ｐＨ７．０から８．３で約０．０１から０．１Ｍナトリウムイオン濃度（又はその他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば１０から５０ヌクレオチド）の場合少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば５０ヌクレオチドを超えるもの）の場合少なくとも約６０℃であるものである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ（下記で引用）に記載されているようなホルムアミドなどの脱安定化剤の添加によってストリンジェント状態を達成することもできる。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションの場合、陽性のシグナルは、少なくともバックグラウンドの２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。典型的な高ストリンジェンシー又はストリンジェントハイブリダイゼーション条件には、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ及び１％ＳＤＳで４２℃にてインキュベートするか、又は５ｘＳＳＣ及び１％ＳＤＳで６５℃にてインキュベートし、０．２ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで６５℃にて洗浄することが含まれる。選択的又は特異的ハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナル（例えば本発明の核酸の同定）は、バックグラウンドハイブリダイゼーションの約１０倍である。本発明の範囲内の核酸を同定するために使用されるストリンジェントハイブリダイゼーション条件には、例えば、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ及び１％ＳＤＳを含有する緩衝液中で４２℃にてハイブリダイゼーションを行うか、又は５ｘＳＳＣ及び１％ＳＤＳを含有する緩衝液中で６５℃にてハイブリダイゼーションを行い、両方とも、０．２ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで６５℃にて洗浄することが含まれる。本発明において、本明細書中で開示される核酸配列を用いて、ストリンジェント条件下での標準的なサザンブロットにおいて、本発明の核酸を含有するゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを同定することができる。（本発明の範囲内の核酸を同定するための）このようなハイブリダイゼーションに対するさらなるストリンジェント条件は、４０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液中、３７℃でのハイブリダイゼーションを含むものである。
しかし、ハイブリダイゼーション形式の選択は重大なものではなく、これは、核酸が本発明の範囲内であるか否かを決定する条件を示す洗浄条件のストリンジェンシーである。本発明の範囲内の核酸を同定するために用いられる洗浄条件には、例えば、ｐＨ７での約０．０２モル濃度の塩濃度及び少なくとも約５０℃又は約５５℃から約６０℃の温度か；又は、７２℃での約０．１５Ｍ ＮａＣｌの塩濃度で約１５分間か；又は、少なくとも約５０℃又は約５５℃から約６０℃の温度にて約０．２ｘＳＳＣの塩濃度で約１５分から約２０分か；又は、室温にて１５分間、０．１％ＳＤＳを含有する約２ｘＳＳＣ塩濃度の溶液でハイブリダイゼーション複合体を２回洗浄し、次いで、６８℃にて１５分間、０．１％ＳＤＳを含有する０．１ｘＳＳＣにより２回洗浄するか；又は同等条件が含まれる。ＳＳＣ緩衝液及び同等条件の解説として、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｔｉｊｓｓｅｎ及びＡｕｓｂｅｌを参照のこと。
Ｆ．オリゴヌクレオチドプローブ及びこれらを使用するための方法
本発明は、ＴＬＲ２−又はＳｃｄ１シグナリング活性の調節因子であるポリペプチドをコードする核酸を同定するための核酸プローブも提供する。ある態様において、本プローブは、本発明の核酸の少なくとも１０個の連続した塩基を含有する。あるいは、本発明のプローブは、本発明の核酸において示されるような配列の、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１５０又は約１０から５０、約２０から６０、約３０から７０の連続した塩基であり得る。結合及び／又はハイブリダイゼーションにより、本プローブは核酸を同定する。一連の本発明において本プローブを使用することができる（下記考察を参照）。その他の核酸又はポリペプチドを同定するために、本発明のプローブを使用することもできる。
Ｇ．配列同一性の程度の決定
本発明は、Ｓｃｄ１ポリヌクレオチド又はトール様受容体２ポリヌクレオチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有する核酸を提供する。本発明は、Ｓｃｄ１タンパク質又はトール様受容体２タンパク質と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドを提供する。配列比較アルゴリズムを用いた分析により、又は目視により、配列同一性を決定することができる。当技術分野で公知の、様々な配列比較アルゴリズム及びプログラムの何れかを用いて、タンパク質及び／又は核酸配列同一性（ホモロジー）を評価することができる。
配列比較に対して、通常、１つの配列を参照配列とし、試験配列をこれと比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば、部分配列コーディネートを指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。初期プログラムパラメータを使用するか、又は代わりのパラメータを指定することができる。次に、プログラムパラメータに基づき、配列比較アルゴリズムにより、参照配列に対する試験配列の％配列同一性が計算される。核酸及びタンパク質の配列比較の場合、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．２．２．又はＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８アルゴリズム及び下記で考察する初期パラメータを使用することができる。
「比較ウィンドウ」は、本明細書中で使用される場合、２つの配列を最適になるようにアラインした後、隣接位置の同数の参照配列ともう一方の配列を比較することができる、２０から６００、一般的には約５０から約２００、より一般的には約１００から約１５０からなる群から選択される多くの隣接位置の何れか１つのセグメントへの言及を含む。比較のための配列のアラインメント方法は当技術分野で周知である。例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ，Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２、１９８１のローカルホモロジーアルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３、１９７０のホモロジーアラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ.８５：２４４４、１９８８の類似度法に対する検索により、これらのアルゴリズムのコンピューター化されたインプリメンテーション（ＦＡＳＴＤＢ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、のＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））により、又は手動アラインメント及び目視（例えば、Ａｕｓｂｅｌら、（１９９９ 補遺）、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ｉｎ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．、１９８７）により、比較のための配列の最適アラインメントを行うことができる。
％配列同一性及び配列類似性に適切であるアルゴリズムの好ましい例は、ＦＡＳＴＡアルゴリズムであり、これは、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４、１９８８に記載されている。Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７−２５８、１９９６も参照のこと。％同一性を計算するためのＤＮＡ配列のＦＡＳＴＡアラインメントにおいて使用される好ましいパラメータが最適化される、ＢＬ５０マトリクス１５：−５、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２；ジョイニングペナルティー＝４０、最適化＝２８；ギャップペナルティー−１２、ギャップ長ペナルティー＝−２；及び幅＝１６。
％配列同一性及び配列類似性を調べるのに適切であるアルゴリズムの別の好ましい例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、１９７７；及びＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、１９９０に記載されている。本発明の核酸及びタンパク質に対する％配列同一性を調べるために、本明細書中に記載のパラメータとともに、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０を使用する。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公開されている。このアルゴリズムは、調べたい配列における長さＷの短い文字列を同定することにより、高スコアの配列ペア（ＨＳＰ）を最初に同定することを含むが、この文字列は、データベース配列において同じ長さの文字列とアラインする場合、いくつかの正の値の閾値スコアＴとマッチするか又は満たすかの何れかである。Ｔは、隣接文字列スコア（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ）閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）と呼ばれる。これらの最初の隣接文字列（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ）のヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを発見するための検索を開始するためのきっかけとなる。累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に文字列ヒットを延長する。ヌクレオチド配列の場合はパラメータＭ（マッチする残基のペアに対する報酬スコア；常に＞０）及びＮ（ミスマッチの残基に対するペナルティースコア；常に＜０）を用いて、累積スコアを計算する。アミノ酸配列の場合、累積スコアを計算するために、スコアリングマトリクスを使用する。累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘ低下した場合；１以上の負のスコアリング残基アラインメントの蓄積により、累積スコアが０以下になった場合；又はいずれかの配列の最後に到達した場合、各方向の文字列ヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラム（ヌクレオチド配列に対して）は、初期値として文字列長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期値として、文字列長３、期待値（Ｅ）１０及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５、１９８９を参照）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を使用する。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７、１９９３）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより与えられる、ある類似性の測定は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間のマッチが偶然起こる確率の指標を与える。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較において最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満及び最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸を参照配列と類似しているとみなす。
有用なアルゴリズムの別の例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、関係及び％配列同一性を示すために、累進的なペアワイズアルゴリズムを用いて関連配列の群から多数の配列アラインメントを作成する。これはまた、アラインメントを作成するために使用されるクラスタリング関係を示す、ツリー又はデンドグラムも構成する。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０、１９８７の累進法の単純化を使用する。使用される方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３、１９８９により述べられている方法と同様である。このプログラムは、最長で各５，０００ヌクレオチド又は、最大で３００のアミノ酸の配列をアラインすることができる。多重アラインメント法は、２つの最も類似している配列のペアワイズアラインメントで開始し、アラインメントを行った２つの配列のクラスターを生成する。次に、このクラスターを次の最も近い配列又はアラインした配列のクラスターとアラインする。２つの個別の配列のペアワイズアラインメントの単純な延長により、配列の２つのクラスターをアラインする。一連の累進的なペアワイズアラインメントにより、最終アラインメントを行う。配列比較の領域に対して具体的な配列及びこれらのアミノ酸又はヌクレオチドコーディネートを指定することにより、及び、プログラムパラメータを指定することにより、このプログラムを行う。次のパラメータを用い（初期ギャップウェイト（３．００）、初期ギャップ長ウェイト（０．１０）及び加重エンドギャップ）、％配列同一性関係を調べるために、ＰＩＬＥＵＰを用いて、参照配列をその他の試験配列と比較する。ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージ（例えば、バージョン７．０（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５、１９８４））からＰＩＬＥＵＰを得ることができる。
多重ＤＮＡ及びアミノ酸配列アラインメントに適切なアルゴリズムの別の好ましい例は、ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラムである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０、１９９４）。ＣｌｕｓｔａｌＷは、配列の群間で多重ペアワイズ比較を行い、ホモロジーに基づきこれらを多重アラインメントにアセンブルする。ギャップオープン及びギャップ延長ペナルティーはそれぞれ１０及び０．０５であった。アミノ酸アラインメントの場合、タンパク質重みマトリクスとして、ＢＬＯＳＵＭアルゴリズムを使用することができる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９、１９９２）。
「配列同一性」とは、アミノ酸又はヌクレオチド配列間の類似性の程度を指し、下記に記載のものなど、当技術分野で公知の方法を用いて測定することができる。
２以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈において「同一」又は％「同一性」とは、同じであるか、又は、比較ウィンドウにわたって、又は次の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、又は手動アラインメント及び目視により測定した場合に指定した領域にわたって、最大の一致に対して比較しアラインした場合、定められた領域にわたり同じである、アミノ酸残基もしくはヌクレオチドの定められた％を有する（すなわち６０％同一、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一）、２以上の配列又は部分配列を指す。
２つの核酸又はポリペプチドの文脈における「実質的に同一」とは、次の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、又は目視により測定したときに、最大の一致に対して比較し、アラインした場合、少なくとも６０％、多くは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％又は少なくとも９５％のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基同一性を少なくとも有する、２以上の配列もしくは部分配列を指す。好ましくは、少なくとも約５０塩基又は残基長の領域にわたり、より好ましくは少なくとも約１００塩基又は残基の領域にわたり、実質的な同一性が存在し、最も好ましくは配列は、少なくとも約１５０塩基又は残基にわたり実質的に同一である。最も好ましい実施形態において、コード領域の全長にわたり配列が実質的に同一である。
２以上の核酸又はポリペプチドの文脈における「ホモロジー」及び「同一性」とは、同じであるか、又は、配列比較アルゴリズムのいくつかを使用して、又は手動アラインメント及び目視により測定したとき、比較ウィンドウ又は指定された領域にわたる最大の一致に対して比較し、アラインした場合、同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの定められた％を有する、２以上の配列もしくは部分配列を指す。配列比較の場合、ある配列を、試験配列を比較する参照配列とすることができる（Ｓｃｄ１遺伝子産物又はトール様受容体２ポリヌクレオチド又はポリペプチドの典型的配列）。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば、部分配列コーディネートを指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。初期プログラムパラメータを使用するか、又は代わりのパラメータを指定することができる。次に、プログラムパラメータに基づき、配列比較アルゴリズムにより、参照配列に対する試験配列の％配列同一性が計算される。
「比較ウィンドウ」は、本明細書中で使用される場合、多くの隣接残基の何れか１つのセグメントを指すことを含む。例えば、本発明の代替的な態様において、２個の配列を最適になるようにアラインした後、本発明の典型的なポリペプチド又は核酸配列（例えば、Ｓｃｄ１もしくはトール様受容体２ポリヌクレオチド又はポリペプチド）の２０から全長の何処かに及ぶ隣接残基を同数の隣接位置の参照配列と比較する。参照配列が本発明の典型的なポリペプチド又は核酸配列と必要な配列同一性を有する場合、例えば、Ｓｃｄ１又はトール様受容体２ポリヌクレオチド又はポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有する場合、その配列は本発明の範囲内である。
上記プログラムを用いて検出できるモチーフには、ロイシンジッパー、へリックス−ターン−へリックスモチーフ、グリコシル化部位、ユビキチン化部位、αへリックス及びβシートをコードする配列、コードされるタンパク質の分泌を支配するシグナルペプチドをコードするシグナル配列、ホメオボックス、酸性ストレッチ、酵素活性部位、基質結合部位及び酵素切断部位などの転写制御に関係する配列が含まれる。
Ｈ．コンピュータシステム及びコンピュータプログラム製品
コンピュータ内で配列同一性、構造ホモロジー、モチーフなどを調べ、同定するために、コンピュータで読み、アクセスすることができる何らかの媒体上で本発明の配列を保存し、記録し、操作することができる。したがって、本発明は、コンピュータ、コンピュータシステム、コンピュータで読み取ることが可能な媒体、コンピュータプログラム製品などを提供し、そこに本発明の核酸及びポリペプチド配列を記録又は保存する。本明細書中で使用される場合、「記録する」及び「保存する」という用語は、コンピュータ媒体上に情報を保存するためのプロセスを指す。当業者は、本発明の核酸及び／又はポリペプチド配列の１以上を含有する製品を作製するために、コンピュータで読み取り可能な媒体上に情報を記録するための何らかの公知の方法を容易に採用することができる。
本発明の別の態様は、少なくとも１つの、本発明の核酸及び／又はポリペプチド配列がそこに記録されている、コンピュータで読み取り可能な媒体である。コンピュータで読み取り可能な媒体には、磁気読み取り可能な媒体、光学的に読み取り可能な媒体、電子的に読み取り可能な媒体及び磁気／光学媒体が含まれる。例えば、コンピュータで読み取り可能な媒体は、ハードディスク、フロッピー（登録商標）ディスク、磁気テープ、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）又は読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）ならびに、当業者にとって公知のその他のタイプのその他の媒体であり得る。
本明細書中で使用される場合、「コンピュータ」、「コンピュータプログラム」及び「プロセッサ」という用語は、これらの最大の一般的文脈において使用され、全てのこのような装置を組み込む。
ポリペプチド及び転写産物の発現の調節又は阻害
本発明はさらに、本発明の核酸配列と相補的な（例えばそのアンチセンス配列）核酸を提供する。アンチセンス配列は、タンパク質コード遺伝子、例えばＴＬＲ２−又はＳｃｄ１コード核酸の、輸送、スプライシング又は転写を調節又は阻害することができる。ゲノムＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡの標的化によって、調節及び阻害が行われ得る。例えば、ハイブリダイゼーション及び／又は切断により、標的とされる核酸の転写又は機能を阻害することができる。本発明により提供される特に有用なある一連の阻害剤には、タンパク質の産生もしくは機能を妨害又は阻害する何れかの場合、遺伝子又はメッセージに結合することができるオリゴヌクレオチドが含まれる。結合は、配列特異的ハイブリダイゼーションを通したものであり得る。阻害剤の別の有用なクラスには、不活性化又はタンパク質メッセージの切断を引き起こすオリゴヌクレオチドが含まれる。このオリゴヌクレオチドは、リボザイムなど、このような切断を生じさせる酵素活性を有し得る。このオリゴヌクレオチドは、化学的に修飾されているか、又は酵素に結合しているものであるか、又は相補的核酸を切断することができる組成物であり得る。所望の活性を有するものについて、多くの様々なこのようなオリゴヌクレオチドのプールをスクリーニングすることができる。
遺伝子発現を調節するための、アンチセンス、リボザイム技術及びＲＮＡｉ技術の使用又はこのような様式での外来遺伝子の発現のための遺伝子治療法の一般的方法は、当技術分野で周知である。これらの方法のそれぞれは、本発明のホスファターゼポリペプチドのアンチセンス又はリボザイム転写産物の何れかをコードする、ベクターなどのシステムを利用する。「ＲＮＡｉ」という用語は、ＲＮＡ干渉を意味する。この用語は、当技術分野で、遺伝子を静止させることができるＲＮＡ分子を使用する技術を包含するものと理解される。例えば、ＭｃＭａｎｕｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：７３７、２００２を参照のこと。この適用において、「ＲＮＡｉ」という用語は、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、小さなテンポラルＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）などの分子を包含する。一般的に言って、ＲＮＡ干渉は、遺伝子と２本鎖ＲＮＡの相互作用によるものである。
Ａ．アンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明は、ｍＲＮＡを標的とすることによりポリペプチド活性を阻害することができる、ＴＬＲ２又はＳｃｄ１メッセンジャーＲＮＡに結合できるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計するためのストラテジーは科学及び特許文献に詳細に記載されており、当業者は、本発明の新規物質を用いてこのようなオリゴヌクレオチドを設計することができる。例えば、効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチドに対してスクリーニングを行うための遺伝子歩行／ＲＮＡマッピングプロトコールは当技術分野で周知である（例えば、ＲＮＡマッピングアッセイについて述べている、Ｈｏ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１４：１６８−１８３、２０００、（これは、有力なアンチセンス配列選択に対する容易で信頼度が高い方法を提供するための標準的分子技術に基づく。）を参照のこと。）。Ｓｍｉｔｈ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１１：１９１−１９８、２０００も参照のこと。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとして天然に生じる核酸を使用する。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、あらゆる長さのものであり得、例えば、代替的な態様においてアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約５から１００、約１０から８０、約１５から６０、約１８から４０である。通常のスクリーニングにより、最適な長さを決定することができる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドはあらゆる濃度で存在し得る。通常のスクリーニングにより、最適濃度を決定することができる。この潜在的な問題に焦点を当てることができる、幅広い様々な合成、非天然のヌクレオチド及び核酸類似体が知られている。例えば、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位などのペプチド核酸（ＰＮＡ）含有非イオン性骨格を使用することができる。ＷＯ９７／０３２１１；ＷＯ９６／３９１５４；Ｍａｔａ、Ｔｏｘｉｃｏｌ Ａｐｐｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４４：１８９−１９７、１９９７；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ａｇｒａｗａｌ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．，１９９６に記載のように、ホスホロチオエート結合を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することもできる。本発明により提供される合成ＤＮＡ骨格類似体を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドにはまた、上述のように、ホスホロ−ジチオエート、メチルホスホネート、ホスホールアミデート、アルキルホスホトリエステル、スルファメート、３’−チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、３’−Ｎ−カルバメート及びモルホリノカルバメート核酸も含まれる。
本発明のセンス及びアンチセンスポリペプチド配列など、何らかの標的に対する適切な結合親和性及び特異性を有する特異的オリゴヌクレオチドについて迅速にスクリーニングすることができる多数のオリゴヌクレオチドを作製するために、コンビナトリアル化学の方法を使用することができる（例えば、Ｇｏｌｄ、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３５８１−１３５８４、１９９５を参照。）。
Ｂ．ｓｉＲＮＡ
「小さな干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）とは、それらがＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により特異的にタンパク質発現を干渉することができることから名付けられた約１０から約３０ヌクレオチド長の２本鎖ＲＮＡ分子を指す。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、１２−２８ヌクレオチド長、より好ましくは１５−２５ヌクレオチド長、さらにより好ましくは１９−２３ヌクレオチド長及び最も好ましくは２１−２３ヌクレオチド長である。したがって、好ましいｓｉＲＮＡ分子は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８又は２９ヌクレオチド長である。
ＲＮＡｉは、２段階の機構である。Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１５：１８８−２００、２００１。第一に、Ｄｉｃｅｒとして知られている酵素により、小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる２１−２３リボヌクレオチド（ｎｔ）断片に長いｄｓＲＮＡを切断する。次に、ｓｉＲＮＡが、リボヌクレアーゼ複合体（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体、略してＲＩＳＣと呼ばれる。）と会合し、相補的ｍＲＮＡへとこの複合体を向かわせる。次に、ＲＩＳＣが、相補的ｓｉＲＮＡに相対する標的とされるｍＲＮＡを切断し、これにより、ｍＲＮＡが他のＲＮＡ分解経路の影響を受けやすくなる。
本発明のｓｉＲＮＡは、標的リボヌクレオチド配列と相互作用するように設計されていおり、これは、それらが、標的配列に結合するのに十分に標的配列と相補的であることを意味する。本発明はまた、ヌクレアーゼ分解に対する安定性が向上するが、存在し得る標的核酸に結合する能力を維持する、化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ分子も含む。
Ｃ．阻害リボザイム
本発明は、例えば、ＴＬＲ２活性又はＳｃｄ１活性（例えば、ＴＬＲ２−シグナリング活性）を有するポリペプチドの阻害など、ｍＲＮＡを標的化することにより、ポリペプチド活性を阻害し得るメッセージを結合することができるリボザイムを提供する。リボザイムを設計し、標的化のためにタンパク質−特異的アンチセンス配列を選択するためのストラテジーは、科学及び特許文献に詳細に記載されており、本発明の新規試薬を用いて、当業者はこのようなリボザイムを設計することができる。
リボザイムは、標的ＲＮＡを切断するＲＮＡの酵素部分と近接近にあるリボザイムの標的ＲＮＡ結合部分を介して標的ＲＮＡに結合することにより作用する。したがって、このリボザイムは、相補的塩基対形成を介して標的ＲＮＡを認識し、結合し、正しい位置に結合した後、標的ＲＮＡを酵素切断し、不活性化するように作用する。このような形式での標的ＲＮＡの切断により、切断がコード配列で起こった場合は、コードされるタンパク質の合成を支配する能力が破壊される。リボザイムがそのＲＮＡ標的に結合し、これを切断した後、通常は、そのＲＮＡから解放され、繰り返し、新しい標的と結合し、切断し得る。
ある状況において、リボザイムの酵素的性質は、治療処置を達成するのに必要なリボザイムの有効濃度がアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度よりも低いものであり得るため、アンチセンス技術（核酸分子が、核酸標的の転写、翻訳又は別の分子との会合を阻止するために、単純に核酸標的に結合する。）などの他の技術よりも有利であり得る。この潜在的長所は、リボザイムが酵素的に作用する能力を反映する。このように、１個のリボザイム分子が標的ＲＮＡの多くの分子を切断することができる。さらに、リボザイムは通常、非常に特異性の高い阻害剤であり、結合の塩基対形成機構だけでなく、リボザイム分子が結合するＲＮＡの発現をそのリボザイム分子が阻害する機構にも依存する阻害特異性を有する。つまり、ＲＮＡ標的の切断により阻害が起こり、このため、特異性は、非標的ＲＮＡの切断速度に対する標的ＲＮＡの切断速度の比として定義される。この切断機構は、塩基対形成に関与するものに対するさらなる因子に依存する。このように、リボザイムの作用の特異性は、同じＲＮＡ部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用よりも強いものであり得る。
ハンマーヘッドモチーフにおいて酵素的リボザイムＲＮＡ分子を形成することができるが、ヘアピン、デルタ肝炎ウイルス、グループＩイントロン又はＲｎａｓｅＰ−様ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列との会合において）のモチーフにおいても形成することもできる。このようなハンマーヘッドモチーフの例は、Ｒｏｓｓｉ、Ａｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ８：１８３、１９９２により記載されており；ヘアピンモチーフは、Ｈａｍｐｅｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８：４９２９、１９８９、及びＨａｍｐｅｌ、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：２９９、１９９０により；デルタ肝炎ウイルスモチーフは、Ｐｅｒｒｏｔｔａ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：１６、１９９２により；ＲｎａｓｅＰモチーフは、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋｅｄａ、Ｃｅｌｌ ３５：８４９、１９８３により；グループＩイントロンは、Ｃｅｃｈ、米国特許第４，９８７，０７１号により記載されている。これらの特異的モチーフの列挙に制限されることはなく、当業者は、本発明の酵素的ＲＮＡ分子が、標的遺伝子ＲＮＡ領域の１以上に相補的な特異的基質結合部位を有し、分子に対するＲＮＡ切断活性を与えるその基質結合部位内又はその周囲のヌクレオチド配列を有することを認識するであろう。
治療方法
望ましくないトール様受容体２発現もしくは活性又はＳｃｄ１遺伝子発現活性もしくはＳｃｄ１遺伝子産物活性と関連する疾患のリスクがある（罹患しやすい）か、又は罹患している対象を治療する、予防及び治療方法の両方も本明細書中に記載される。
予防方法
本発明は、トール様受容体２、Ｓｃｄ１遺伝子発現活性又はＳｃｄ１遺伝子産物活性を介したシグナリングを調節する作用物質を対象に投与することによる、トール様受容体２発現又は活性、Ｓｃｄ１遺伝子発現又はＳｃｄ１遺伝子産物活性の望ましくない量に関連する、疾病又は状態を対象において予防するための方法に関する。例えば、本明細書中に記載の、又は当技術分野で公知である、診断又は予後アッセイの組み合わせの何れかにより、トール様受容体２−又はＳｃｄ１介在シグナリングにより起こるか、又はこれが関与する疾患又は望ましくない症状に対するリスクのある対象を同定することができる。一般に、このような疾患は、例えばグラム陽性細菌感染の結果としての、先天性免疫系の望ましくない活性化を含む。本作用物質を投与しない場合の症状と比較して、症状が予防されるか、遅延されるか又は軽減するように、症状の発現前に予防薬として本作用物質の投与を行うことができる。ある実施形態において、本作用物質は、トール様受容体２のＳｃｄ１への結合を低下させる。ある実施形態において、本作用物質は、トール様受容体２へのＳｃｄ１へのリガンド結合を低下させる。本明細書中に記載のスクリーニングアッセイに基づき、適切な作用物質を同定することができる。一般に、このような作用物質は、トール様受容体２及び／又はＳｃｄ１遺伝子産物に特異的に結合する。
治療方法
本発明の別の態様は、治療目的のために、ＴＬＲ２活性又はＳｃｄ１遺伝子発現又はＳｃｄ１遺伝子産物活性を調節又は活性化する方法に関する。本方法は、細胞と関連するトール様受容体２及び／又はＳｃｄ１活性の１以上を調節する、例えば、ＴＬＲ２又はＳｃｄ１に特異的に結合するか、又はトール様受容体２を介したシグナリングを活性化する作用物質と細胞を接触させることを含み得る。本作用物質は、トール様受容体２、Ｓｃｄ１遺伝子又はＳｃｄ１遺伝子産物と特異的に結合し、リポ多糖類により誘導されている細胞におけるＴＬＲ２活性を選択的に活性化するか、又はグラム陽性細菌に反応性のあるマクロファージを活性化する化合物であり得る。本作用物質は、抗体又はタンパク質、トール様受容体２タンパク質の天然に生じる同種リガンド、ペプチド、トール様受容体２又はＳｃｄ１タンパク質ペプチド摸倣体、小型の非核酸分子又は小型の無機分子であり得る。インビトロ（例えば、細胞を本作用物質とともに培養することによる。）又はインビボ（例えば、対象に本作用物質を投与することによる。）でこれらの調節法を行うことができる。
本発明は、例えば、トール様受容体２タンパク質活性、Ｓｃｄ１遺伝子発現又はＳｃｄ１遺伝子産物活性の発現又は活性の欠如を特徴とする、グラム陽性細菌感染又はグラム陽性細菌皮膚感染などの、疾病又は疾患に罹患している個体を治療するための方法を提供する。ある実施形態において、本方法は、例えば、パルミトレエート（パルミトレイン酸）又はオレエート酸（オレイン酸）といったモノ不飽和脂肪酸などの治療薬を投与することを含む。
本発明は、トール様受容体２タンパク質活性、Ｓｃｄ１遺伝子発現又はＳｃｄ１遺伝子産物活性の発現又は活性の欠如を特徴とする、疾病又は疾患に罹患している個体を治療するための方法を提供する。ある実施形態において、本方法は、作用物質（例えば、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイにより同定される作用物質）又は、トール様受容体２を介したシグナリングを向上させる、又はＳｃｄ１遺伝子発現もしくはＳｃｄ１遺伝子産物活性を向上させる作用物質の組み合わせを投与することを含む。本作用物質により治療することができる状態には、グラム陽性細菌感染に対して対象が治療を受けるものが含まれる。
新規方法及び組成物により治療することができるその他の疾患には、真菌感染、敗血症、サイトメガロウイルス感染、結核、ハンセン病、骨再吸収（例えば歯周病）、関節炎（例えばライム病に伴う。）及びウイルス性肝炎が含まれる。トール様受容体２を介してシグナリングを活性化する化合物（例えば、Ｓｃｄ１遺伝子発現又はＳｃｄ１遺伝子産物活性を活性化することによる。）もまた、グラム陽性細菌感染を治療するのに有用である。
トール様受容体２への結合、Ｓｃｄ１遺伝子発現又はＳｃｄ１遺伝子産物を活性化するために役立つ技術により、グラム陽性細菌感染に関する疾患の治療の成功をもたらすことができる。例えば、望ましくないＳｃｄ１遺伝子産物又はトール様受容体２活性により生じる疾患の症状を予防及び／又は改善するために、負の調節活性を示すことが分かっている化合物、例えば、本明細書中に記載のアッセイを用いて同定される作用物質（抗体など）、を使用することができる。このような分子には、以下に限定されないが、ペプチド、ホスホペプチド、小型有機もしくは無機分子又は抗体（例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ又は１本鎖抗体及びＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦａｂ発現ライブラリ断片、ｓｃＦＶ分子及びそのエピトープ結合断片を含む。）が含まれる。特に、トール様受容体２に特異的に結合し、リポ多糖類により誘導されている細胞においてＳｃｄ１活性（Ｓｃｄ１遺伝子発現又はＳｃｄ１遺伝子産物）を調節又は活性化することができる、又はグラム陽性細菌感染に対するマクロファージ反応を調節又は活性化することができる、抗体及びその派生体（例えばその抗原結合断片）である。
キット
本発明は、組成物、例えば核酸、発現カセット、ベクター、細胞、ポリペプチド（例えば、Ｓｃｄ１ポリペプチド又はトール様受容体２−シグナル活性化ポリペプチド）及び／又は本発明の抗体を含むキットを提供する。本キットはまた、本明細書中に記載のように本発明の方法及び使用を教示する説明書も含有する。
治療適用
治療の様々な方法において、本発明の方法により同定される化合物及び調節因子を使用することができる。このように、本発明は、感染疾患、グラム陽性細菌感染、トール様受容体２シグナリング障害、Ｓｃｄ１遺伝子突然変異又は遺伝子発現障害又はＳｃｄ１遺伝子産物障害を治療するための組成物及び方法を提供する。
典型的な感染疾患には、以下に限定されないが、グラム陽性細菌皮膚感染、例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化膿連鎖球菌）又はＳ．ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）が含まれる。グラム陽性球菌Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ又はＳ．ａｕｒｅｕｓは、ヒト膿痂疹、蜂巣炎及び創傷感染の主要な病原体である。
典型的な感染疾患には、以下に限定されないが、ウイルス性又は細菌性疾患が含まれる。感染性病原体を治療又は検出するために、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドを使用することができる。例えば、免疫反応を増強することにより、特にＢ及び／又はＴ細胞の増殖及び分化を向上させることにより、感染疾患を治療することができる。既存の免疫反応を促進するか、又は新しい免疫反応を開始させるかの何れかにより、免疫反応を増強することができる。あるいは、必ずしも免疫反応を誘導することなく、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドが感染性病原体を直接阻害することもできる。
同様に、疾病又は症状を引き起こすことができ、本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドにより治療又は検出され得る、細菌又は真菌病原体には、次のグラム陰性及びグラム陽性細菌科及び真菌が含まれるが限定されない：放線菌目（例えば、コリネバクテリア、ミコバクテリア、ノルカルディア）、アスペルギルス症、バチルス科（例えば、炭疽菌、クロストリジウム）、バクテロイデス科、ブラストミケス症、ボルデテラ、ボレリア、ブルセラ症、カンジダ症、カンピロバクター、コクシジオイデス症、クリプトコッカス症、ダーマトシコス（Ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ）、腸内細菌科（クレブシエラ菌、サルモネラ、セラチア、エルシニア）、エリジペロスリックス科、ヘリコバクター、レジオネラ症、レプトスピラ症、リステリア、マイコプラズマ目、ナイセリア科（例えば、アシネトバクター、淋病、髄膜炎菌）、パスツレラ感染（例えば、アクチノバチルス、ヘモフィルス、パスツレラ属）、シュードモナス、リケッチア科、クラミジア科、梅毒及びブドウ球菌が含まれる。これらの細菌又は真菌科は、以下の疾病又は症状を引き起こし得る（次のものが含まれるが限定されない。）：菌血症、心内膜炎、眼感染（結膜炎、結核、ブドウ膜炎）、歯肉炎、日和見感染（例えばＡＩＤＳ関連感染）、爪周囲炎、プロテーゼ関連感染、ライター病、百日咳又は蓄膿症などの気道感染、敗血症、ライム病、猫ひっかき病、赤痢、パラチフス、食中毒、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎、クラミジア、梅毒、ジフテリア、ハンセン病、パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、しょう紅熱、性感染症、皮膚疾患（例えば、蜂巣炎、皮膚毛瘡（Ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ））、毒血症、尿路感染、創傷感染。これらの症状又は疾病の何れかを治療又は検出するために、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドを使用することができる。
さらに、本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドにより治療又は検出できる疾病又は症状を引き起こす寄生病原体には、次の科が含まれるが限定されない：アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症、媾疫、外部寄生虫、ランブル鞭毛虫症、蠕虫病、リーシュマニア症、タイレリア症、トキソプラズマ病、トリパノソーマ病及びトリコモナス症。これらの寄生物は、疥癬、ツツガムシ病、眼感染、腸疾患（例えば、赤痢、ランブル鞭毛虫症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染 （例えばＡＩＤＳ関連）、マラリア、妊娠合併症及びトキソプラズマ病を含むが限定されない、様々な疾病又は症状を引き起こし得る。これらの症状又は疾病の何れかを治療又は検出するために、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドを使用することができる。
好ましくは、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドを用いた治療は、ポリペプチドの有効量を投与すること又は患者から細胞を採取し、本発明のポリヌクレオチドを細胞に供給し、操作した細胞を患者に戻すこと（エクスビボ治療）の何れかによるものであり得る。さらに、感染疾患に対する免疫反応を生じさせるために、ワクチン中の抗原として本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドを使用することができる。
医薬組成物の処方及び投与
本発明は、本発明の核酸、ペプチド及びポリペプチド（Ａｂｓを含む。）を含有する医薬組成物を提供する。上記で考察したように、内在性Ｓｃｄ１遺伝子又はＳｃｄ１ポリペプチドの発現を活性化するために、本発明の核酸、ペプチド及びポリペプチドを使用することができる。細胞又は非ヒト動物でのこのような活性化により、感染疾患又はグラム陽性細菌感染を治療又は改善するための化合物を同定するためのスクリーニング法が得られる。対象において耐性を生じさせるような免疫学的環境を生じさせるために、本発明の医薬組成物の対象への投与を使用する。抗原に対して対象を耐性化するためにこれを使用することができる。
医薬組成物を形成するために、医薬的に許容可能な担体（賦形剤）と本発明の核酸、ペプチド及びポリペプチドを組み合わせることができる。医薬的に許容可能な担体は、例えば、安定化させるか、又は本発明の医薬組成物の吸収もしくはクリアランス速度を増減させるように作用する、生理的に許容可能な化合物を含有し得る。生理的に許容可能な化合物には、例えば、炭水化物、（グルコース、スクロース又はデキストランなど）、抗酸化剤（アスコルビン酸又はグルタチオンなど）、キレート剤、低分子量タンパク質、ペプチドもしくはポリペプチドのクリアランスもしくは加水分解を低下させる組成物又は賦形剤又はその他の安定化剤及び／又は緩衝液が含まれ得る。安定化する、又は医薬組成物の吸収を増減させるために、リポソーム性担体を含む界面活性剤を使用することもできる。ペプチド及びポリペプチドに対する、医薬的に許容可能な担体及び処方は、当業者にとって公知であり、科学及び特許文献で詳細に記載されており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ」）の最新版を参照のこと。
その他の生理的に許容可能な化合物には、湿潤剤、乳化剤、分散剤又は、微生物の増殖もしくは作用を防ぐために特に有用な防腐剤が含まれる。様々な防腐剤が周知であり、これには、例えば、フェノール及びアスコルビン酸が含まれる。当業者にとって当然のことながら、生理的に許容可能な化合物を含む医薬的に許容可能な担体の選択は、例えば、本発明のペプチド又はポリペプチドの投与経路及びその特定の物理−化学的性質に依存する。
ある態様において、組成物が水溶性である場合、医薬的に許容可能な担体（例えば水性担体）中で、本発明の核酸、ペプチド及びポリペプチドの溶液を溶解する。腸溶性、非経口又は経粘膜性薬物送達のための処方において使用することができる水溶液の例には、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ハンクス液、リンガー液、デキストロース／食塩水、グルコース溶液などが含まれる。この処方は、緩衝剤、張性調整剤、湿潤剤、界面活性剤など、生理的状態に近付けるために、必要に応じて、医薬的に許容可能な補助物質を含有し得る。添加物にはまた、殺菌剤又は安定化剤など、さらなる活性成分が含まれ得る。例えば、この溶液は、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート又はトリエタノールアミンオレエートを含有し得る。従来の周知の安定化技術によりこれらの組成物を安定化することができるか、又は濾過滅菌することができる。そのまま又は凍結乾燥物（凍結乾燥製剤は、投与前に滅菌水溶液と混合する。）として使用するために、得られた水溶液を包装することができる。これらの処方物中のペプチドの濃度は広く変化し得、選択された特定の投与様式及び患者の必要性に従い、液量、粘度、体重などに主に基づいて選択される。
腸溶（経口）投与のために固体処方物を使用することができる。例えば、ピル、錠剤、粉末又はカプセルとして、これらを処方することができる。固体組成物の場合、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含む、従来の無毒性の固体担体を使用することができる。経口投与の場合、既に挙げた担体など、通常使用される賦形剤の何れかを、通常、活性成分（例えばペプチド）の１０％から９５％組み込むことにより、医薬的に許容可能な無毒性組成物を形成する。腸内投与のために、非固体処方物を使用することもできる。石油、動物、植物又は合成起源のものを含む様々な油、例えば、ピーナツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などから担体を選択することができる。適切な医薬賦形剤には、例えば、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールが含まれる。
経口投与する場合、本発明の核酸、ペプチド又はポリペプチドの消化を防ぐことができる。核酸、ペプチドもしくはポリペプチドが酸及び酵素による加水分解に耐性となるようにこれらを組成物と混合するか、又はリポソームなどの適切な耐性のある担体中に納めるかの何れかにより、これを達成することができる。化合物の消化を防ぐ手段は当技術分野で周知であり、例えば、Ｆｉｘ、Ｐｈａｒｍａ Ｒｅｓ．１３：１７６０−１７６４、１９９６；Ｓａｍａｎｅｎ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４８：１１９−１３５、１９９６；米国特許第５，３９１，３７７号（治療剤の経口送達のための脂質組成物が記載されている。）を参照のこと（リポソーム送達は下記でさらに詳細に考察する。）。
全身投与はまた、経粘膜又は経皮手段によるものでもあり得る。経粘膜又は経皮投与の場合、浸透させるべき障壁に適切な浸透剤を処方中で使用することができる。このような浸透剤は一般に当技術分野で公知であり、これには、例えば、経粘膜投与の場合、胆汁塩及びフシジン酸誘導体が含まれる。さらに、浸透を促進するために、界面活性剤を使用することができる。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーを介して、又は坐薬を使用して行うことができる。例えば、Ｓａｙａｎｉ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．１３：８５−１８４、１９９６を参照のこと。局所、経皮投与の場合、物質を軟膏、クリーム、サルブ、粉末及びゲルに処方する。経皮送達系には、例えばパッチも含まれ得る。
徐放（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ又はｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）機構で本発明の核酸、ペプチド又はポリペプチドを投与することもでき、これにより、処方物を内服により送達することができる。例えば、生体分解性ミクロスフェアもしくははカプセル又は、ペプチドの徐放送達が可能なその他の生体分解性ポリマー形状が本発明の処方物中に含まれ得る（例えば、Ｐｕｔｎｅｙ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：１５３−１５７、１９９８）。
吸入の場合、乾燥粉末エアロゾル、液体送達系、空気ジェット噴霧器、高圧ガス系などを含む、当技術分野で公知の何らかの系を用いて、本発明の核酸、ペプチド又はポリペプチドを送達することができる。例えば、Ｐａｔｔｏｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １６：１４１−１４３、１９９８；例えば、Ｄｕｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、Ａｒａｄｉｇｒｎ（Ｈａｙｗａｒｄ、Ｃａｌｉｆ．）、Ａｅｒｏｇｅｎ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆ．）、Ｉｎｈａｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、Ｃａｌｉｆ．）などによる、製品及びポリペプチド巨大分子用の吸入送達系を参照のこと。例えば、エアロゾル又は噴霧の形態で製剤処方を投与することができる。エアロゾル投与の場合、界面活性剤及び高圧ガスとともに微粉化した形態で処方物を供給することができる。別の態様において、呼吸組織に処方物を送達するための装置は、処方物を気化させる吸入器である。その他の液体送達系には、例えば空気ジェット噴霧器が含まれる。
本発明の医薬品を調製する場合、様々な処方改善を使用し、薬物動態及び生体内分布を変更するように操作することができる。薬物動態及び生体内分布を変更するための多くの方法が当業者にとって公知である。このような方法の例には、タンパク質、脂質（例えばリポソーム、以下参照）、炭水化物又は合成ポリマー（上記で考察）などの物質からなる小胞中での本発明の組成物の保護が含まれる。薬物動態の一般的考察については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ、３７−３９章を参照のこと。
本発明の核酸、ペプチド又はポリペプチドを単独で、又は、例えば全身的、部分的もしくは局所的に（例えば腫瘍内へ直接又は腫瘍に向けて）；動脈内、髄腔内（ＩＴ）、静脈内（ＩＶ）、非経口、胸腔内、局所、経口又は局所（ｌｏｃａｌ）投与（皮下）、気管内（例えばエアロゾルによるもの）又は経粘膜（例えば、頬、膀胱、膣、子宮、直腸、鼻粘膜）など、当技術分野で公知の何らかの手段により医薬組成物として送達することができる。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者にとって公知であるか又は明らかであり、科学及び特許文献で詳細に記載されている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓを参照のこと。）。例えば、具体的な器官に焦点を当てるための「局所的効果」に対して、ある投与形式には、例えば具体的な器官（例えば脳及びＣＮＳ）に焦点を当てるための、動脈内又は髄腔内（ＩＴ）注射が含まれる（例えば、Ｇｕｒｕｎ、Ａｎｅｔｈ Ａｎａｌｇ．８５：３１７−３２３、１９９７を参照。）。例えば、本発明の核酸、ペプチド又はポリペプチドを直接脳に送達するのが望ましい場合は、好ましければ、頸動脈内注射を行う。全身の高用量が必要とされる場合、非経口投与は好ましい送達経路である。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者にとって公知であるか又は明らかであり、科学及び特許文献（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ）に詳細に記載されており、また、Ｂａｉ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．８０：６５−７５、１９９７；Ｗａｒｒｅｎ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１５２：３１−３８、１９９７；Ｔｏｎｅｇａｗａ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：５０７−５１５、１９９７も参照のこと。
ある態様において、本発明の核酸、ペプチド又はポリペプチドを含有する製剤処方は、脂質単層又は二層、例えば、リポソームに組み込まれる（例えば、米国特許第６，１１０，４９０号；同第６，０９６，７１６号；同第５，２８３，１８５号；同第５，２７９，８３３号を参照。）。本発明はまた、水溶性の、本発明の核酸、ペプチド又はポリペプチドが単層又は二層の表面に接着されている処方物も提供する。例えば、ペプチドをヒドラジド−ＰＥＧ−（ジステアロイルホスファチジル）エタノールアミン含有リポソームと接着させることができる（例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．６：７０５−７０８、１９９５を参照。）。リポソーム又は脂質膜の何らかの形態、例えば平面の脂質膜又はインタクトな細胞の細胞膜（例えば赤血球細胞）などを使用することができる。リポソーム処方物は、静脈内投与、経皮投与（例えば、Ｖｕｌｔａ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８５：５−８、１９９６）、経粘膜投与又は経口投与を含む、何らかの手段によるものであり得る。本発明はまた、本発明の核酸、ペプチド及び／又はポリペプチドがミセル及び／又はリポソーム内に組み込まれる医薬品を提供する（例えば、Ｓｕｎｔｒｅｓ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６：２３−２８、１９９４；Ｗｏｏｄｌｅ、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．９：２６０−２６５、１９９２を参照。）。標準的方法に従いリポソーム及びリポソーム処方物を調製することができ、これも、当技術分野で周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ；Ａｋｉｍａｒｕ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１：１９７−２１０、１９９５；Ａｌｖｉｎｇ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１４５：５−３１、１９９５；Ｓｚｏｋａ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７、１９８０、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号及び同第４，８３７，０２８号を参照。）。
ある実施形態において、インプラント及びマイクロカプセル化送達系を含む、放出制御製剤など、化合物が身体から急速に排出されることを防ぐ担体を用いて活性化合物を調製する。エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸など、生体内分解される生体適合性ポリマーを使用することができる。このような処方物を調製するための方法は、当業者にとって明らかである。この材料はまた、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販されている。医薬的に許容可能な担体として、リポソーム懸濁液（ウイルス性抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞に向けられたリポソームを含む。）を使用することもできる。例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載のように、当業者にとって公知の方法に従い、これらを調製することができる。
投与の容易さ及び投薬の均一性のために、経口又は非経口組成物を投与単位形態で処方することが都合が良い。本明細書中で使用される場合、投与単位形態とは、治療を受けるべき対象に対して単位用量として適切である物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる医薬担体と合わせて所望の治療効果を生み出すように計算された活性化合物の予め定められた量を含有する。
例えば、ＬＤ５０（集団の５０％が致死となる用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療効果が得られる用量）を決定するための、細胞培養又は実験動物における標準的な医薬手順により、このような化合物の毒性及び治療効果を調べることができる。毒性と治療効果との間の用量比は治療指数であり、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性のある副作用を示す化合物を使用することができるが、一方、非感染細胞への潜在的な損傷を最小限に抑え、それにより副作用を軽減するために、罹患組織の部位へこのような化合物を向ける送達系の設計に注意を払うべきである。
ヒトでの使用のための用量範囲を処方することにおいて、細胞培養アッセイ及び動物実験から得たデータを使用することができる。このような化合物の用量は、好ましくは、殆ど又は全く毒性のないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。この用量は、使用する投与形態及び利用する投与経路に依存してこの範囲内で変化し得る。本発明の方法において使用される何らかの化合物の場合、細胞培養アッセイから最初に治療的有効量を見積もることができる。細胞培養で調べた場合のＩＣ５０（すなわち、症状の最大値の半分の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、例えば、炎症又は望ましくない炎症を含む疾患の動物モデルにおいて用量を処方することができる。ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために、このような情報を使用することができる。例えば、一般に標識物質の高速液体クロマトグラフィーにより、血漿中のレベルを測定することができる。例えば前臨床プロトコールなどの実験に有用な動物モデルは当技術分野で公知である（例えば、Ｓｏｎｄｅｒｓｔｒｕｐ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２５：３５−４５、２００３）及びＮｉｋｕｌａら、Ｉｎｈａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．４（１２）：１２３−５３、２０００）に記載のものなどの炎症疾患に対する動物モデル及び、例えば、真菌感染、敗血症、サイトメガロウイルス感染、結核、ハンセン病、ウイルス性肝炎及び感染（例えばミコバクテリアによるもの）に対する当技術分野で公知のもの）。
本明細書中で定義される場合、抗体などのタンパク質又はポリペプチドの治療的有効量（すなわち有効用量）は、約０．００１から３０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．０１から２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１から２０ｍｇ／ｋｇ体重又は約１から１０ｍｇ／ｋｇ、２から９ｍｇ／ｋｇ、３から８ｍｇ／ｋｇ、４から７ｍｇ／ｋｇ又は５から６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。１日又は１週間に１回又は数回、約１週間から１０週間、例えば２週間から８週間、約３週間から４週間又は約４、５もしくは６週間、このタンパク質又はポリペプチドを投与することができる。ある例において、数ヶ月以上にわたり投与が必要とされ得る。当業者にとって当然のことながら、以下に限定されないが、疾病もしくは疾患の重症度、以前の治療、全般的健康及び／又は対象の年齢及び存在するその他の疾患を含むある一定の因子が、対象を効果的に治療するために必要とされる用量及びタイミングに影響を与え得る。さらに、タンパク質又はポリペプチド（抗体を含む。）などの物質の治療的有効量による対象の治療には、単回治療が含まれ得るか、又は、好ましくは、一連の治療が含まれ得る。
抗体の場合、用量は一般に、０．１ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、１０ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ）である。部分的ヒト抗体及び完全ヒト抗体は通常、ヒト体内において他の抗体よりも半減期が長い。したがって、投与量を低く、投与頻度を少なくすることが可能であることが多い。抗体を安定化し、取り込み及び組織浸透（例えば脳に）を促進するために、脂質付加などの修飾を使用することができる。抗体の脂質付加の方法は、Ｃｒｕｉｋｓｈａｎｋら、Ｊ．Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ、１４：１９３、１９９７により述べられている。
本発明は、トール様受容体２を介してシグナリングを調節することにより、Ｓｃｄ１遺伝子発現又はＳｃｄ１遺伝子産物の発現又は活性を調節する、物質又は化合物を包含する。物質は、例えば小型の化学分子であり得る。このような小型の化学分子には、以下に限定されないが、１モルあたり約１０，０００グラム未満の分子量である、ペプチド、ペプチド摸倣体（例えばペプトイド）、アミノ酸、アミノ酸類似体、小型の非核酸有機化合物又は無機化合物（すなわち、ヘテロ有機化合物及び有機金属化合物を含む。）、１モルあたり約５，０００グラム未満の分子量である、有機又は無機化合物、１モルあたり約１，０００グラム未満の分子量である、有機又は無機化合物、１モルあたり約５００グラム未満の分子量である、有機又は無機化合物及びこのような化合物の、塩、エステル及び医薬的に許容可能な形態が含まれる。
典型的な投与量は、対象又は試料重量キログラムあたりの小型の化学分子のミリグラム又はマイクログラム量を含む（例えば、１キログラムあたり約１マイクログラムから１キログラムあたり約５００ミリグラム、１キログラムあたり約１００マイクログラムから１キログラムあたり約５ミリグラム又はキログラムあたり約１マイクログラムから１キログラムあたり約５０マイクログラム）。調節される発現又は活性に関して、小型の化学分子の適切な投与量がその小型の化学分子の効力に依存することがさらに理解される。本発明のポリペプチド又は核酸の発現又は活性を調節するために、これらの小型の化学分子の１以上を動物（例えばヒト）に投与する場合、医師、獣医師又は研究者は、例えば、最初に比較的低用量を処方し、続いて、適切な反応が得られるまで用量を増やすことができる。さらに、何らかの特定の動物対象に対する具体的な用量レベルが、使用する具体的化合物の活性、対象の、年齢、体重、全般的な健康、性別及び食事、投与の時間、投与経路、排出速度、何らかの薬物の組み合わせ及び調節されるべき発現又は活性の程度を含む様々な因子に依存することが理解される。
共役物を形成させるために、治療薬又は放射活性金属イオンなどの別の治療部分と抗体又はその断片を、例えば共有結合及び／又はリンカーによって連結することができる。治療薬には、以下に限定されないが、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン及びアントラマイシン（ＡＭＣ））が含まれる。
ある種の生体反応を調節するために、本明細書中に記載の共役物を使用することができる。例えば、抗体に結合する部分は、所望の生物学的活性を保持する、タンパク質又はポリペプチドであり得る。このようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素又はジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子などのタンパク質；又は生体反応調節因子が含まれ得る。
あるいは、Ｓｅｇａｌ、米国特許第４，６７６，９８０号に記載のように、抗体のヘテロ共役物を形成させるために、二次抗体と抗体を共役させることができる。
本医薬組成物は、投与のための説明書とともに、容器、パック又はディスペンサーに含まれ得る。
本明細書中に記載の治療方法の何れかでの使用に対する薬剤の調製のために、本明細書中に記載のような化合物を使用することができる。
本医薬組成物は、一般に、無菌の実質的に等張の、Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎの全てのＧｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＭＰ）規制に完全に準拠したものとして処方される。
治療計画：薬物動態
投与方法に依存して、様々な単位投与形態で本発明の医薬組成物を投与することができる。典型的な核酸、ペプチド及びポリペプチド医薬組成物のための投与は、当業者にとって周知である。このような用量は通常、実際は推奨であり、特定の治療状況、患者の耐性などに依存して調整される。これを遂行するのに適した核酸、ペプチド又はポリペプチドの量は、「治療的有効用量」として定義される。この用途に効果的な投与スケジュール及び量、すなわち「投与計画」は、疾病又は状態の段階、疾病又は状態の重症度、患者の健康の全般的な状況、患者の身体的状況、年齢、製剤処方及び活性物質の濃度などを含む様々な因子に依存する。患者に対する投与計画を判断することにおいて、投与形式も考慮に入れる。投与計画にはまた、薬力学、すなわち、医薬組成物の吸収速度、バイオアベイラビリティー、代謝、排出なども考慮に入れる。例えば、最新のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ；Ｅｇｌｅｔｏｎ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １８：１４３１−１４３９、１９９７；Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３、１９９０を参照のこと。
治療適用において、少なくとも部分的に状態又は疾病及び／又はその合併症を阻止するのに十分な量で、自己免疫疾患、感染疾患、抗原提示細胞障害又はＣＤ４細胞障害に罹患している患者に組成物を投与する。例えば、ある態様において、静脈内（ＩＶ）投与のための可溶性ペプチド医薬組成物の用量は、約０．０１ｍｇ／時から約１．０ｍｇ／時であり、数時間にわたり投与され（通常１、３又は６時間）、間欠的サイクルで数週間、これを繰り返すことができる。特に、隔離された部位に、血流ではなく（体腔又は器官の内腔、例えば脳脊髄液（ＣＳＦ）など）薬物を投与する場合、非常に高い用量（例えば約１０ｍｇ／ｍＬ以下の範囲）を使用することができる。
本発明を実行するための具体的な実施形態の次の実施例は、ただ説明目的のために与えるものであり、本発明の範囲を何ら制限するものではない。
典型的な実施形態
ｆｌａｋｅ：結合免疫不全の目に見えるフェノバリアント（ｐｈｅｎｏｖａｒｉａｎｔ）
正常な免疫機能に必要な遺伝子を同定するための取り組みにおいて、目に見える、及び免疫学的な表現型について、ＥＮＵ−誘導性生殖細胞系列突然変異により、全部で２０，７９２匹のＦ１及び３３，２０２匹のＦ３動物をスクリーニングした。これらの中で、「ｆｌａｋｅ（ｆｌｋ）」と呼ばれる劣性突然変異が、進行性の円形脱毛症及び慢性剥脱性皮膚炎を引き起こすことが分かった。これらの特性は、離乳時期に現れ、齢が進んだ動物ほど顕著になった（図１）。表皮の完全性の目に見える崩壊及び自然発生的な皮膚感染が抗生物質治療を必要とすることから、発明者らは、これらのマウスでの先天性免疫機能の完全性を調べることにした。
図１は、ｆｌａｋｅ突然変異マウスで観察される、目に見える表現型を示す。Ａ．６週齢マウス、Ｂ．８ヶ月齢マウス、Ｃ．８ヶ月齢マウスにおける眼の感染、Ｄ．Ｂで示されるマウスの拡大図で、重症の皮膚炎を強調して示す。
ｆｌｋ／ｆｌｋ突然変異マウスにおける、持続感染性の、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化膿連鎖球菌）及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）皮膚感染
グラム陽性球菌Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ及びＳ．ａｕｒｅｕｓは、ヒト膿痂疹、蜂巣炎及び創傷感染の主要な病原体である。Ｇｕａｙ、Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．４：１２５９−１２７５、２００３；Ｈｅｄｒｉｃｋ、Ｐａｅｄｉｔｒ．Ｄｒｕｇｓ １：３５−４６、２００３。外傷性損傷及び低感染性及び経皮摂取に関する再現性に対する必要条件を克服して、細いゲージの針を用いて皮膚直下に注射することにより、マウスモデルにおける実験的な全層皮膚感染を確実に確立することができる。Ｂｕｎｃｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：２６３６−２６４０、１９９２；Ｋｒａｆｔら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５２：７０７−７１３、１９８６；Ｎｉｚｅｔら、Ｎａｔｕｒｅ ４１４：４５４−４５７、２００１。
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化膿連鎖球菌）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）の発光タグ付加の株を利用したが、このそれぞれが、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ由来の細菌性ｌｕｘオペロンを構成的に発現した。Ｋｕｋｌｉｎら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４７：２７４０−８、２００３。麻酔したマウスにおいて１６日間にわたり、外からの発光度により、各感染の進行を監視した。図２Ａで示されるように、正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの５ｘ１０５ｃｆｕの接種により確立された皮膚感染が完全になくなるまで８日を要した。ｆｌｋ／ｆｌｋ突然変異は、接種後最初の６日間は微生物排除の同様の動態を示すが、その後、ｆｌｋ／ｆｌｋ突然変異体における微生物負荷量は、対照値とは離れ、上昇してプラトーに達し、実験期間を通して維持される。ｆｌｋ／ｆｌｋマウスにおいて、発光はゆっくりと下降し、接種後４週間でバックグラウンドレベルに到達する。
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓは、小さな潰瘍性の創傷を生じさせ、これは、対照マウスにおいて第８日までにほぼ完全に回復する。インビボで検出可能な発光はないが、潰瘍形成は、感染後２８日までｆｌｋ／ｆｌｋ突然変異マウスで観察される。ｆｌｋ／ｆｌｋ突然変異体の潰瘍を培養することにより、発光Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓを回収した。したがって、実験接種後４週間でさえ、ｆｌｋ／ｆｌｋ突然変異マウスはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに持続的に感染したままである。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓによる感染（図２Ｂ）は、上記のものと形式上同様の結果をもたらす。観察の最初の期間中、ｆｌｋ／ｆｌｋ突然変異体の細菌負荷量は、対照とほぼ一致するが、接種後７日には、この２つの曲線が離れるのが観察され、対照動物では徐々に排除されていき（しかし、ｆｌｋ／ｆｌｋ突然変異体では異なる。）、２週間以内に対照は完全に回復する。対して、ｆｌａｋｅマウスでは、発光が３週間を超えて依然として強く検出可能であり、接種後４週間を過ぎてからバックグラウンドレベルとなった。
一方、ｆｌｋ／ｆｌｋ突然変異体は、グラム陰性細菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）による感染から回復することができた（図２Ｃ）。さらに、グラム陽性感染が他の経路により導入された場合（例えばＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの静脈内接種又はＳ．ａｕｒｅｕｓを用いた肺内接種による。）、ｆｌｋ／ｆｌｋ突然変異体と正常対照との間の差は観察されなかった。これらの研究において挙げられる全てのデータに基づき、次のことが考えられる：１．ｆｌｋ／ｆｌｋ突然変異マウスは、グラム陽性皮膚感染を殺菌する能力に障害がある；２．表現型は全ての生体区画に広がらず、おそらく皮膚に限定される；３．調べた１つのグラム陰性感染は突然変異でも差はない；及び４．Ｅ．コリにより誘発された皮膚損傷がｆｌｋ／ｆｌｋマウスにおいて正常に治癒するという事実から、この突然変異が創傷治癒それ自体に影響しないが、むしろ、病原体排除に選択的な影響がある。
図２は、グラム陽性細菌に曝露された場合、ｆｌａｋｅ突然変異マウスが持続的皮膚感染を発症することを示す。Ａ．Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓで皮下感染させた、対照（Ｃ５７ＢＬ／６、ｎ＝４）及び突然変異（ｆｌａｋｅ／ｆｌａｋｅ、ｎ＝４）動物における細菌増殖の経時的解析。上のパネルは、各遺伝子型の４匹の動物における発光（最初の接種のパーセンテージとして表す。）定量後のグラフ表示を示す。下のパネルは、接種から１、６、８及び１４日後の各遺伝子型に対する２匹の典型的マウスに対する、写真及び光検出を重ねたものを示す。Ｂ．Ｓ．ａｕｒｅｕｓによる感染。写真は、第１、６、９及び１５日の、感染動物を示す。Ｃ．Ｅ．コリによる感染。
ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素１遺伝子座に対するｆｌｋ突然変異のマッピング
マッピングンにおいてｆｌｋにより与えられる目に見える表現型を利用し、交差交配したＦ１マウスの子孫ならびにこの遺伝子座のその他の対立遺伝子多型を調べることにより、目に見える表現型と免疫学的表現型との間の一致を後に確立した。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮに対する戻し交配において、マウスゲノムを通じて分布される５９種類の有益なマーカーのパネルを用いて、３９の減数分裂において、１９番染色体にｆｌｋを最初にマッピングした。混合されたバックグラウンドにおいて表現型は完全に浸透し、この突然変異は、マーカーＤ１９Ｍｉｔ９６とＤ１９ＭＭ７との間に置かれた（図３Ａ）。次に、１２種類の１９番染色体内部マーカーを用いて細かいマッピングを行い、２８３減数分裂において、この突然変異は、Ｄ１９Ｍｉｔ１１及びＤ１９Ｍｉｔ５３により範囲が定められた２．６Ｍｂｐの不可欠な領域に限定された（図３Ｂ）。Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースにおいてこの領域内で示される４３種類の遺伝子の中で（図３Ｃ）、ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素１（Ｓｃｄ１）遺伝子は、２つの突然変異対立遺伝子（アセビア−Ｊ及びアセビア−２Ｊと呼ばれる。）がＳｃｄ１に対して既に記載されており、ｆｌｋホモ接合体で観察されるものと同様に、両ケースにおいて突然変異マウスが「うろこ状の皮膚」として説明される皮膚の表現型を示すので、これは可能性の高い候補と考えられた。Ｓｕｎｄｂｅｒｇら、Ａｍ Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ １５６：２０６７−７５、２０００；Ｚｈｅｎｇら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２３：２６８−７０、１９９９。
図３は、ｆｌａｋｅ突然変異のマッピングを示す。Ａ．トランスゲノム対数尤度比（Ｌｏｄスコア、Ｚ）分析から、マウスの１９番染色体においてリンケージの１個のピークが示される。この分析には全部で５９種類の有益なマーカー（水平軸）が含まれ、３９の減数分裂（野生型１９及び突然変異動物１７）を全てのマーカーにおいて遺伝子型に分けた。Ｂ．１９番染色体の末端領域の染色体の細かいマッピング。全部で２８３（典型的なもの３つを示す。）減数分裂の分析により、２．６Ｍｂ離れた２個の隣接マーカー間にｆｌａｋｅ突然変異が限定された。Ｃ．ＥＮＳＥＭＢＬデータベースによる、ｆｌａｋｅ遺伝子座における遺伝子組成。Ｓｃｄ１遺伝子を強調して示す。
Ｃ５７ＢＬ／６対照マウス及びｆｌｋ／ｆｌｋ突然変異体の両方から単離したゲノムＤＮＡから、Ｓｃｄ１の６個のエクソンを増幅した。増幅物の直接配列決定から、エクソン５における点突然変異（ＣからＡ）が明らかとなったが、これは、ｃＤＮＡ配列の９３８番の位置に対応する（受入番号ＢＣ０５５４５３、図４Ａ参照））。このＥＮＵ誘導性の塩基転換は、Ｓｃｄ１内でミスセンス突然変異（Ｔ２２７Ｋ）を引き起こすと予想される。Ｓｃｄ２及びＳｃｄ３のｃＤＮＡでは突然変異は検出されなかった。
ミクロソーム酵素Ｓｃｄ１は、６個の膜貫通ドメインがあると予想される、３５５アミノ酸の、鉄結合性の４１ｋＤａのタンパク質である。これは、長鎖不飽和脂肪酸のΔ９−不飽和化を触媒し、その主要産物として、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１）及びオレイン酸（Ｃ１８：１）の生合成へと導く。図４Ｂで説明されるように、突然変異タンパク質における中性アミノ酸（Ｔ）の電荷を有する残基（Ｋ）に対する置換が、予想される膜貫通ドメイン内で起こり、これにより、Ｓｃｄ１の構造の完全性が破壊されると予想される。
図４は、ｆｌａｋｅ突然変異の分子の特徴を示す。Ａ．ホモ接合体ｆｌａｋｅ突然変異マウス（上のクロマトグラム）及び正常動物（下のクロマトグラム）からの、増幅されたゲノムＤＮＡのトレースファイル。Ｂ．Ｓｃｄ１タンパク質の概略図及びｆｌａｋｅ突然変異の位置決定。青いボックスは、ＳＭＡＲＴ分析により予想される膜貫通ドメインに相当する。
この仮説を調べるために、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を行い、対照及びｆｌｋ／ｆｌｋマウスからの皮膚生検の脂質組成を分析した。後者の動物は、Ｓｃｄ１ ＫＯの場合に報告されているものと同様に、コレステロールエステルの低下を示し（図５Ａ）、このことから、Ｓｃｄ１の観察された対立遺伝子多型によりｆｌｋ表現型が実際に生じることが示される。
図５は、野生型及びｆｌａｋｅ突然変異マウスにおける脂質コンテンドの薄層クロマトグラフィー分析を示す。Ａ．野生型（Ｂ６）又はｆｌａｋｅ（ｆｌｋ）突然変異マウスの皮膚生検から抽出された脂質のＴＬＣ。Ｂ．Ｓ．ａｕｒｅｕｓ皮下感染から１時間又は２４時間後の野生型マウス（Ｂ６＋）の皮膚から精製された脂質のＴＬＣ。Ｍ：マーカー。Ｃｓ：コレステロール、ＴＧ：トリグリセリド、ＣＥ：コレステロールエステル。
パルミトレイン酸及びオレイン酸は、インビトロ及びインビボにおいて内在的な抗菌活性を有する。
Ｓｃｄ１ｆｌｋ／ｆｌｋ突然変異マウスにおいてＣ１８及びＣ１６脂肪酸不飽和化酵素活性が欠如していることから、発明者らは、オレイン酸及び／又はパルミトレイン酸の欠如が上述の皮膚の免疫不全表現型に対する説明となり得るか否かを調べることにした。実際に、ＭＵＦＡがインビボにおいて保護効果を及ぼすという証拠はないが、いくつかの報告において、ＭＵＦＡがグラム陽性細菌に対して抗菌活性を示すことが示されている。Ｍｉｌｌｅｒら、Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １２４：２０９−１５、１９８８；Ｗｉｌｌｅ及びＫｙｄｏｎｉｅｕｓ、Ｓｋｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ａｐｐｌ Ｓｋｉｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ １６：１７６−８７、２００３。この作業仮説を調べるために、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＥ．コリの増殖に対する各脂質の影響を測定するという、一連のインビトロ実験を最初に行った。
この結果から、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ及びＳ．ａｕｒｅｕｓに対して、パルミトレイン酸及びオレイン酸両方がそれぞれ強い静菌及び殺菌活性を有することが確認された。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにおける両化合物の最小阻害濃度（ＭＩＣ、表１参照）は、マイクロモラー範囲であり、マウスカテリシジンＡＭＰ（ＣＲＡＭＰ）に対して観察されるものに匹敵するものであった。したがって、重量ベースで、ＭＵＦＡはカテリシジンの効力のおよそ２０倍であった。ＭＵＦＡはまた、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対しても活性があり、一方でＣＲＡＭＰは完全に不活性であった。一方、グラム陽性細菌に対する特異的な効果と一致して、Ｅ．コリに対しては、ミリモーラーのＭＵＦＡ濃度でも静菌又は殺菌活性は検出されなかった。
Figure 2009514788
この抗菌活性の生理学的関連性を調べるために、野生型マウスにＳ．ａｕｒｅｕｓを接種し、パルミトレイン酸（ＤＭＳＯ中１００μＭ溶液を１００μＬ）又はＤＭＳＯのみを感染部位に繰り返し（２日ごと）皮下注射することにより感染動物を処置した。この実験の結果を図６Ａ及びＢで説明する。マウスの両群（ｎ＝６匹の動物）に対して、最初の接種のパーセンテージとして発光を表し、感染から２４時間後に調べる。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ接種から９日後、パルミトレイン酸−処置動物は、ビヒクル処置マウスと比較して、発光が９０％低下した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ排除が向上した結果として、脂質処置動物における潰瘍性の損傷の直径（第９日に測定）は、対照で観察されるものの四分の一である（図６Ｃ）。これらのデータから、インビトロ及びインビボでのＭＵＦＡの抗菌能を明白に説明されるが、また、この脂質に基づく防御機構が正常マウスでは最大限に有効とはならないことも明らかである。
パルミトレイン酸投与の同様の条件下で、ｆｌａｋｅ突然変異体では、第１日と第４日との間で細菌増殖が顕著に減少した（野生型マウスでも観察される。）が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは接種から２週間後に検出可能なままであった。図６Ｄ及びＥで説明されるように、パルミトレイン酸の高用量（７５ｍＭ溶液１００μＬ）では、ｆｌｋ／ｆｌｋ突然変異体における細菌排除がある程度向上し、続いて潰瘍が治癒した（図６Ｆ）。しかし、この薬理学的アプローチにより、表現型の完全なレスキューは達成されなかった。
図６は、パルミトレイン酸がインビボで抗菌活性を有することを示す。Ａ．パルミトレイン酸注入により、野生型マウスで細菌排除が加速される。Ｓ．ａｕｒｅｕｓを接種し、２日ごと（矢印）にビヒクル（ＤＭＳＯ）又はパルミトレイン酸注射により処置した対照（Ｃ５７ＢＬ／６）マウス（第０日）において、発光（最初の接種のパーセンテージとして表される。）を測定した。Ｂ．ＤＭＳＯ（上）又はパルミトレイン酸（下）処置した、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染から９日後の対照（Ｃ５７ＢＬ／６）マウスの写真。Ｃ．ＤＭＳＯ又はパルミトレイン酸で処置した対照（Ｂ６）マウスにおける、感染から９日後に測定した損傷の大きさを示すヒストグラム。＊＊は、Ｐ値＜０．０１を示す。Ｄ．Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染ｆｌａｋｅマウスにおけるパルミトレイン酸処置。このプロトコールは、パルミトレイン酸の７５ｍＭ溶液の１００μＬ注射を行ったことを除き、Ａと同様である。Ｅ．ＤＭＳＯ（上）又はパルミトレイン酸（下）処置から１２日後の感染ｆｌａｋｅマウスの写真。Ｆ．ＤＭＳＯ又はパルミトレイン酸処置した、感染ｆｌｋ突然変異体における損傷の大きさ（第１２日に調べた。）。＊は、Ｐ値＜０．０５を示す。
グラム陽性細菌感染中にＳｃｄ１の転写活性化が起こり、これはＴＬＲ２依存性である。
ＭＵＦＡのインビボでの抗菌機能が疑いないことから、発明者らは、ＣＲＡＭＰなどのその他のエフェクター分子の場合のように、これらの合成が免疫反応中に増加するか否かを調べることにした。Ｓｃｄ１プロモーターの５ｋｂ断片を分析し、いくつかのＮＦ−κＢ結合部位の存在に注目した（図７Ａ）。正常又は感染マウスからの皮膚生検に対して半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験を行った。図７Ｂは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染時の対照（Ｃ５７ＢＬ／６）マウスの皮膚において、Ｓｃｄ１のｍＲＮＡ蓄積が強く誘導されることを説明するが、一方、Ｅ．コリ接種では何の影響もない。さらに、Ｔｌｒ２遺伝子（Ｔｌｒ２−／−）の標的化破壊があるマウスにおいて、Ｓｃｄ１遺伝子は、グラム陽性細菌の接種に無反応である。しかし、Ｓｃｄ１転写誘導はまた、感染とＲＮＡ単離との間に２４時間の遅れがある場合、間接的な機構によっても引き起こされ得る。
図７は、マウスにおけるＳｃｄ１遺伝子発現の、感染−及びＴＬＲ２−依存性誘導を示す。Ａ．Ｓｃｄ１プロモーターのシグナルスキャン分析。ＮＦ−κＢ及びＩＳＲＥ（インターフェロン−刺激性調節エレメント）を示す。Ｂ．非感染対照（Ｃ５７ＢＬ／６、レーン１）及びＴｌｒ２−／−（レーン４）動物又は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓによる感染（レーン２及び５）又はＥ．コリによる感染（レーン３）後の、皮膚生検におけるＳｃｄ１及びβ−アクチン転写のＲＴ−ＰＣＲ検出。３０及び４０サイクル後のＰＣＲ産物を示す。Ｍ、サイズ標準。Ｃ．対照（０）及び、２、４、８及び１８時間後に野生型マウスから単離したＭＡＬＰ−誘発腹膜マクロファージにおける、Ｓｃｄ１及びβ−アクチン転写のＲＴ−ＰＣＲ検出。Ｄ．Ｓｃｄ１／及びβ−アクチン比の定量。
ＴＬＲシグナリングを研究するために理想的な系を表すマクロファージはまた、最近報告されたように、Ｓｃｄ１遺伝子も発現する。Ｕｒｙｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３０３：３０２−５、２００３。単離されたマクロファージがＳｃｄ１を上方制御することが可能であるか否かを調べるために、及び反応の動態を調べるために、野生型マウスから単離した腹膜マクロファージに対して合成マクロファージ−活性化リポペプチド（ＭＡＬＰ−２、ＥＭＣ ｍｉｃｒｏｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、既知のＴＬＲ２アゴニストで刺激した。Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：５５４−７、２０００。刺激から２、４、８及び１８時間後に単離したＲＮＡ試料においてＲＴ−ＰＣＲによりＳｃｄ１発現を調べた。図７Ｃ及びＤで見られるように、Ｓｃｄ１発現は、ＭＡＬＰ誘導から２時間後に増大し、１８時間以内に４倍上昇した。このＳｃｄ１の転写誘導は、感染動物の皮膚における脂質合成の増加と相関した（図５Ｂ参照）。
既に記したように、皮脂腺においてＳｃｄ１が主に発現され、ｆｌａｋｅならびにアセビア及びＳｃｄ１ ＫＯマウスでは、これらの構造が萎縮する。グラム陽性病原体に対するヒト皮膚防御での誘導性Ｓｃｄ１発現の潜在的な関連性を裏付けるために、不死化ヒトセボサイト細胞株ＳＺ９５においてＭＡＬＰ−２の効果を調べた。Ｚｏｕｂｏｕｌｉｓら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１３：１０１１−１０２０、１９９９。最初に、ＭＡＬＰ−２（ＬＰＳ処置なし）は、急速で強力な炎症反応を誘発した（ＩＬ−６及びＩＬ−８産生増加により明らかになる。）（図８Ａ及びＢ）。次に、ＭＡＬＰ−２刺激から４時間後にこのヒト細胞株でＳｃｄ１転写がまた、上方制御されることも観察された（図８Ｃ及びＤ）。脂肪酸不飽和化酵素２（ＦＡＤＳ２）遺伝子の発現を監視することによりこれらの観察が広がった。ＦＡＤＳ２は、Ｓｃｄ１と同様の酵素特性を有するタンパク質をコードし、口角症、腕及び足及び会陰部の皮膚炎を覆う過剰に角化した発疹を呈する重症の皮膚状態になっている患者において欠損していることが最近示された。Ｗｉｌｌｉａｒｄら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４２：５０１−５０８、２００１。ヒトセボサイトにおいて、ＦＡＤＳ２は、ＭＡＬＰ−２刺激から１８時間後に、僅かであるが特異的に誘導される。
図８は、ＭＡＬＰ−２で刺激されたヒトセボサイトが、炎症反応及びＳｃｄ１及びＦＡＤＳ２遺伝子の上方制御を示すことを示す。Ａ．ＭＡＬＰ−２処理（５０ｎｇ／ｍＬ）後、ＳＺ９５細胞においてＩＬ−６産生が誘導される。ＬＰＳ刺激（１００ｎｇ／ｍＬ）は、最小効果を示す。Ｂ．Ａと同じ条件でのＩＬ−８の定量。Ｃ．ＬＰＳ及びＭＡＬＰ−２刺激から４及び１８時間後のＳＣＤ１及びＦＡＤＳ２発現のＲＴ−ＰＣＲ検出。ＧＡＰＤＨ発現を対照として使用した。Ｄ．ＧＡＰＤＨシグナルで正規化した後の、２回の独立した実験で測定した、ＳＣＤ１及びＦＡＤＳ２シグナルの定量（±ｓ．ｅ．ｍ）。
トール様受容体２−反応性脂質エフェクター経路はグラム陽性細菌による皮膚感染から哺乳動物を保護する。
ＳＣＤ１は、ＭＵＦＡ、主にパルミトレイン酸（Ｃ１６：１）及びオレイン酸（Ｃ１８：１）の生合成に関与する酵素である。Ｎｔａｍｂｉ、Ｐｒｏｇ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ３４：１３９−５０、１９９５。これは、炭素鎖のΔ９シス不飽和化を触媒し、パルミトイル−ＣｏＡ及びステアロイル−ＣｏＡを基質として使用する。脂質代謝におけるこの酵素の機能が熱心に研究されてきた。Ｎｔａｍｂｉ及びＭｉｙａｚａｋｉ、Ｐｒｏｇ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ４３：９１−１０４、２００４。Ｓｃｄ１−／−マウスは、野生型動物よりも顕著に痩せており、食餌により誘発される肥満症に抵抗性があるが、この影響には脂肪酸酸化に関連する遺伝子の発現増加が介在する。さらに、肥満（ｏｂ）及びＳｃｄ１遺伝子の矮小体型突然変異に対する複合ホモ接合体は、肥満表現型が著しく減衰している。Ｎｔａｍｂｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１４８２−６、２００２。ｏｂ突然変異体においてＳｃｄ１が過剰発現されるという観察から、レプチンの代謝作用の少なくとも一部がＳｃｄ１の阻害に起因することが示される。Ｃｏｈｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７：２４０−３、２００２。Ｓｃｄ１の２種類の自然発生突然変異対立遺伝子が記載されており、アセビア（ａｂ）−Ｊ及び−２Ｊと呼ばれている。Ｓｕｎｄｂｅｒｇら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５６：２０６７−７５、２０００；Ｚｈｅｎｇら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２３：２６８−７０、１９９９。表現型の違いは小さいにもかかわらず、これらの対立遺伝子のそれぞれに対するホモ接合性は、萎縮した皮脂腺、脱毛症、うろこ状の皮膚に関連しており、この表現型は、この遺伝子が標的化破壊されているマウスでも観察される。Ｍｉｙａｚａｋｉら、Ｊ Ｎｕｔｒ １３１：２２６０−８、２００１。
本研究は、突然変異、ｆｌａｋｅ（高選択性の先天性免疫不全表現型であり、目に見える劣性のフェノバリアント（ｐｈｅｎｏｖａｒｉａｎｔ）で、グラム陽性（グラム陰性ではない。）生物の皮膚からの排除機能不全がある。）を提供する。表現型主導のアプローチを用いて、Ｓｃｄ１タンパク質の６個の膜貫通ドメインの４番目内にあるｆｌｋ突然変異をミスセンスエラー（Ｔ２２７Ｋ）まで追跡した。あるいは、このような領域での電荷のある残基による中性残基の置換は、不飽和化酵素（これは、通常はミクロソーム膜内に存在する。）の構造を修飾するか、又は酵素活性に必要な鉄原子の配位に影響を与える。機構が何であれ、ｆｌａｋｅ突然変異マウスの皮膚から分離された脂質におけるコレステロールエステル（この生合成はＭＵＦＡを必要とする。）のレベルが低下し、このことから、新しい対立遺伝子が機能低下性であることが確認される。
本明細書中で、ＳＣＤ１及び、グラム陽性細菌に対する上皮の固有の免疫におけるその触媒活性の産物が関連した。Ｓｃｄ１欠損マウスにＭＵＦＡに富む餌を与えることで突然変異表現型が軽減されないことが以前に示されており、このことから、皮膚の正常な外見及び機能にはＭＵＦＡのデノボ合成が必要であることが示される。したがって、インビトロの観察を拡大するために、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染マウスへのパルミトレイン酸の皮内投与の影響を監視した。これらのインビボ実験から、パルミトレイン酸を繰り返し皮下注射することにより、細菌増殖が低下し、潰瘍損傷が軽減することから証明されるように、感染マウスの回復が顕著に向上することが分かった。しかし、パルミトレイン酸のこの有益な効果は、パルミトレイン酸のより高い用量を繰り返し注射したにもかかわらず、ｆｌａｋｅ突然変異体においてはこれほど顕著ではなかった。Ｓｃｄ１突然変異体で脂質異化が過剰活性化されることが観察されることにより、注射された脂質の半減期がより短くなり、この矛盾を説明し得る。それにもかかわらず、にきびの問題に対してレチノイド（皮脂腺の萎縮を誘導する。）で治療を受けたヒトは、副作用として、再発性のＳ．ａｕｒｅｕｓ皮膚感染に罹患し得ることが知られている。Ｌｅｙｄｅｎら、Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ８６：３９０−３、１９８６。このような患者において、眼のグラム陽性細菌感染もまた知られている。Ｅｇｇｅｒら、Ｏｐｈｔｈａｍｏｌｏｇｅ ９２：１７−２０、１９９５。実際に、Ｓｃｄ１ ＫＯマウスに対して以前から知られているように、ｆｌａｋｅ突然変異体において眼の感染もまた観察された（図１Ｃ参照。）。Ｍｉｙａｚａｋｉら、Ｊ Ｎｕｔｒ １３１：２２６０−８、２００１。ｆｌｋ／ｆｌｋマウスからのデータにより、局所の先天性免疫反応における、皮脂腺ならびにその他の脂質産生器官（おそらく、目蓋の特別なマイボーム腺を含む。）の不可欠な役割が強調される。
ＭＵＦＡが選択的にグラム陽性細菌を溶解する機構はまだ分かっていない。炭素鎖の長さ及び／又は不飽和度は、効率の重要な決定因子であり得る。さらに、脂質とＡＭＰとの間の相乗効果もまた調べられ得る。Ｆｌａｋｅ／ＣＲＡＭＰの二重ノックアウトマウスが、この問題を研究するのに有用なツールであることが分かるであろう。この実験は、その抗菌活性に加えて、パルミトレイン酸及びオレイン酸が間接的に耐性を促進し得る可能性を除外しない。タンパク質修飾を介したシグナル伝達の調節は、ある１つのこのような機構であり得る。報告されているように、マススペクトロメトリーにより、ｓｒｃホモロジードメイン３キナーゼＦｙｎ（これは、筋肉細胞でのインスリンシグナリングに対して最近示されたように、免疫細胞活性化に影響し得る。）のその他の翻訳後修飾の中でパルミトレイン酸が同定された。Ｌｉａｎｇら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９：８１３３−９、２００４；Ｒａｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：１１１１０−５、２００３。
ＴＬＲ２に依存する形式で、マウス及びヒト細胞においてＳＣＤ１転写が強く上方制御される。無毛及び羞明を伴う毛包性魚鱗癬症候群などの稀な皮膚疾患のヒト患者（ＩＦＡＰ症候群、ＯＭＩＭ３０８２０５）は、皮脂腺が萎縮しており、同時的に、ｆｌａｋｅ表現型を思い起こさせる、円形脱毛症及び再発性の皮膚感染に罹患している（Ａｌｆａｄｌｅｙら、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０：４８−５１、２００３で概説されている。）。ＴＬＲ２及び６がヒトセボサイトで発現されるという新しい認識により（Ｚｏｕｂｏｕｌｉｓら、準備中）、この結果から、皮膚の先天性免疫防御における皮脂腺の卓越した、予想しなかった役割が指摘される。要するに、このデータにより、皮膚における誘導性の脂質を基にした殺菌エフェクター経路の存在が示され、脂質代謝と先天性免疫との間の明白な機能的リンクが確立される。
材料及び方法
マウス。Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）を用いた生殖細胞系列突然変異生成は、Ｈｏｅｂｅら、Ｊ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｓ ９：２５０−５、２００３に記載されている。Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔの動物飼育施設において無菌状態で動物を維持した。実験で用いたマウスは全て、８から１２週齢であった。マウスのハンドリング及び実験手順は動物飼育及び使用に対する研究所のガイドラインに従って行った。
細菌。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｘｅｎ８．１（親株８３２５−４）、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｘｅｎ２０（血清型Ｍ４９由来、５９１株）及びＥ．コリ Ｘｅｎ１４（ＥＰＥＣ ＷＳ２５７２由来）をＸｅｎｏｇｅｎ（Ｃａｒｎｂｕｒｙ、ＮＪ）から得た。
細胞培養。５０ｎｇ／ｍＬ ＭＡＬＰ−２又は１００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ存在下／非存在下で、１０％熱不活性化ＦＣＳ、５ｎｇ／ｍＬヒト上皮増殖因子、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１０−５Ｍパルミチン酸、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加したＨＳＧ−Ｍｅｄ（Ｓｅｂｏｍｅｄ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で、２、４、８及び１８時間、ＳＺ９５セボサイトを維持し、ＥＬＩＳＡによるＩＬ６及びＩＬ８の測定のために上清を回収した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により４時間及び８時間の試料からＲＮＡを単離し、ＲＮａｓｅ不含のＤＮａｓｅセット（Ｑｉａｇｅｎ）によりＲＴ−ＰＣＲ用に精製した。
試薬。Ｓｉｇｍａよりパルミトレイン酸及びオレイン酸を購入した。Ｓ．ｍｉｎｅｓｏｔａ Ｒｅ５９５ＬＰＳをＡｌｅｘｉｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から入手し、ＭＡＬＰ−２をＥＭＣ ｍｉｃｒｏｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ＧｍｂＨ（Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。
皮膚感染。指数増殖期の細菌培養物を遠心分離し、担体として用いる不活性Ｃｙｔｏｄｅｘビーズ（Ｓｉｇｍａ）１０ｍｇ／ｍＬを含有するＰＢＳ １０倍量でペレットを再懸濁した。１００μＬ中の発光細菌約５ｘ１０５ｃ．ｆ．ｕ．を麻酔したマウスの背中に皮下注射した。接種前に化学物質を用いて除毛した。ＣＣＤカメラ（動物を５分間曝露）で発光を毎日監視し、ＸｅｎｏｇｅｎからのＩＶＩＳプログラムで定量を行った。
薄層クロマトグラフィー。クロロホルム／メタノールにより皮膚生検から抽出した全脂質をシリカゲルＴＬＣにより分離した。展開溶媒としてヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（７０：３０：１）を使用し、プリムリン溶液（１００ｍＬ アセトン／水、８０／２０中５ｍｇ）を噴霧した後、ＵＶランプ下で脂質を可視化した。
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ。野生型及びＴｌｒ２−／−突然変異マウスを除毛し、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ又はＥ．コリ（５×１０５ｐｆｕ）の皮下注射により感染させた。２４時間後、感染領域の皮膚を切り取り、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ）法によりトータルＲＮＡを抽出した。オリゴｄＴを付加したｃＤＮＡ（ＲｅｔｒｏｓｃｒｉｐｔＴＭＡｍｂｉｏｎ）を合成するためにＲＮＡ１μｇを使用し、次いで、Ｓｃｄ１に特異的なプライマー（ゲノムＤＮＡ増幅とｃＤＮＡ増幅との間の区別を可能にする、エクソン５における、３’−ｃｔｃｔａｔｇｇａｔａｔｃｇｃｃｃｃｔａｃｇａｃａａｇａａｃａｔｔｃ−５’及び、エクソン６における、３’−ｇａａｇｃｔａｇｇａａｃａａｇｇａｇｇｇａｔｇｔａｔｔｃａｇｇａｇｇ−５’）又はβ−アクチン遺伝子に特異的なプライマーを使用してＰＣＲ反応におけるテンプレートとしてこれを使用した。ＰＣＲ反応物の４μＬをアガロースゲルに載せた。腹腔マクロファージの単離及び刺激は他に記載されている。Ｈｏｅｂｅら、Ｊ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｓ ９：２５０−５、２００３。次のオリゴヌクレオチドを用いて、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによりｈＳｃｄ１及びｈＦＡＤＳ２発現ＳＺ９５セボサイトを測定した。
Figure 2009514788
グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）発現を対照として用いた。
本明細書中で引用する全ての公表物及び特許出願は、各個別の公表物又は特許出願が、全ての目的に対して参照により組み込まれることが具体的かつ個別に指示されるように、全ての目的に対して、その全体において、本明細書中に参照により組み込まれる。
前述の発明を明快な理解の目的のための説明及び実施例により詳細に述べてきたが、添付の特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく、本発明に対してある一定の変化及び変更がなされ得ることは、本発明の教示に照らして、当業者にとって容易に明らかとなろう。
図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄは、ｆｌａｋｅ突然変異マウスにおいて観察される目で見られる表現型を示す。 図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃは、グラム陽性細菌に曝露された際に、ｆｌａｋｅ突然変異マウスが持続性の皮膚感染を発現することを示す。 図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃは、ｆｌａｋｅ突然変異のマッピングを示す。 図４Ａ及び４Ｂは、ｆｌａｋｅ突然変異の分子的特徴を示す。 図５Ａ及び５Ｂは、野生型及びｆｌａｋｅ突然変異マウスにおける脂質のコンテンド（ｃｏｎｔｅｎｄ）の薄層クロマトグラフィー分析を示す 図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ及び６Ｆは、パルミトレイン酸がインビボで抗細菌作用を有することを示す。 図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ及び７Ｄは、マウスにおけるＳｃｄ１遺伝子発現の、感染−及びＴＬＲ−２依存性誘導を示す。 図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ及び８Ｄは、ＭＡＬＰ−２により刺激を受けたヒトセボサイトを示し、これは、炎症反応及び、Ｓｃｄ１及びＦＡＤＳ２遺伝子の上方制御を示す。 図９は、Ｓｃｄ１生合成経路による不飽和脂肪酸の生合成を示す。

Claims (68)

  1. Ｓｃｄ１遺伝子発現を活性化する化合物の有効量を対象に投与することを含む、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染を治療するための方法。
  2. 化合物がトール様受容体２のアゴニストである、請求項１に記載の方法。
  3. 化合物が、小型の化学分子、抗体、アンチセンス核酸、短いヘアピンＲＮＡ又は短い干渉ＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
  4. グラム陽性細菌感染が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化膿連鎖球菌）感染又はＳｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）感染である、請求項１に記載の方法。
  5. 対象が、Ｓｃｄ１遺伝子における機能喪失又は機能低下突然変異を有する、請求項２に記載の方法。
  6. Ｓｃｄ１遺伝子産物を活性化する化合物の有効量を対象に投与することを含む、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染を治療するための方法。
  7. 化合物がトール様受容体２のアゴニストである、請求項６に記載の方法。
  8. 化合物が、小型の化学分子、抗体、アンチセンス核酸、短いヘアピンＲＮＡ又は短い干渉ＲＮＡである、請求項６に記載の方法。
  9. グラム陽性細菌感染が、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）感染又は黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）感染である、請求項６に記載の方法。
  10. 対象が、Ｓｃｄ１遺伝子における機能喪失又は機能低下突然変異を有する、請求項７に記載の方法。
  11. モノ不飽和脂肪酸の有効量を対象に投与することを含む、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染を治療するための方法。
  12. モノ不飽和脂肪酸が、パルミトレイン酸又はオレイン酸である、請求項１１に記載の方法。
  13. グラム陽性細菌感染が化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）感染又は黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）感染である、請求項１１に記載の方法。
  14. モノ不飽和脂肪酸の有効量の投与が、局所又は皮内である、請求項１１に記載の方法。
  15. モノ不飽和脂肪酸の有効量の投与が、筋肉内、皮下、腹腔内又は静脈内である、請求項１１に記載の方法。
  16. Ｓｃｄ１生合成経路の産物である化合物の有効量を対象に投与することを含む、哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染を治療するための方法。
  17. 化合物がモノ不飽和脂肪酸である、請求項１６に記載の方法。
  18. モノ不飽和脂肪酸が、パルミトレイン酸又はオレイン酸である、請求項１７に記載の方法。
  19. グラム陽性細菌感染が化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）感染又は黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）感染である、請求項１６に記載の方法。
  20. モノ不飽和脂肪酸の有効量の投与が、局所又は皮内である、請求項１６に記載の方法。
  21. モノ不飽和脂肪酸の有効量の投与が、筋肉内、皮下、腹腔内又は静脈内である、請求項１６に記載の方法。
  22. 細胞においてグラム陽性細菌殺菌活性を調節する化合物を同定するための方法（該方法は、
    トール様受容体２を発現する細胞を含有する細胞に基づくアッセイ系と試験化合物を接触させることと、
    トール様受容体２シグナリングを活性化するのに有効であるように選択された量でアッセイ系にリガンドを提供することと（トール様受容体２シグナリングは、リガンドに対する反応性をシグナル化し、Ｓｃｄ１遺伝子発現を調節することができる。）、
    トール様受容体２シグナリングにおける、及びＳｃｄ１遺伝子発現の調節における、試験化合物の効果を検出することと（このアッセイにおける試験化合物の有効性はグラム陽性細菌殺菌活性であることを示す。）、
    を含む。）。
  23. リガンドが、内因性リガンド又は外因性リガンドである、請求項２２に記載の方法。
  24. 外因性リガンドが、リポ多糖類、リピッドＡ、ジアシル化リポペプチド、トリアシル化リポペプチド、Ｓ−ＭＡＬＰ−２、Ｒ−ＭＡＬＰ−２、細菌性リポペプチド、Ｐａｍ２ＣＳＫ４、リポタイコ酸又はザイモサンＡである、請求項２３に記載の方法。
  25. 外因性リガンドが、Ｓ−ＭＡＬＰ−２又はＲ−ＭＡＬＰ−２である、請求項２４に記載の方法。
  26. 外因性リガンドが、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ（サルモネラ・ミネソタ）由来の、ラフ型リポ多糖類、スムース型リポ多糖類又はリピッドＡである、請求項２３に記載の方法。
  27. 検出段階がさらに、細胞においてＳｃｄ１遺伝子発現又はＳｃｄ１遺伝子産物の活性化を測定することを含み、Ｓｃｄ１遺伝子発現又はＳｃｄ１遺伝子産物が、外因性リガンドと細胞との接触に反応して活性化される、請求項２３に記載の方法。
  28. 外因性リガンドが、グラム陽性細菌の成分であり、グラム陰性細菌の成分ではない、請求項２７に記載の方法。
  29. 内因性リガンドが脂質である、請求項２３に記載の方法。
  30. 化合物が、トール様受容体２経路シグナリングのアゴニストである、請求項２２に記載の方法。
  31. 検出段階が、化合物によるトール様受容体２へのリガンドの結合の促進を測定することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
  32. 検出段階が、細胞アッセイにおいてＳｃｄ１遺伝子産物の増加を測定することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
  33. 検出段階が、細胞アッセイにおいてＳｃｄ１遺伝子産物活性の上昇を測定することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
  34. 検出段階が、細胞アッセイにおいてモノ不飽和脂肪酸合成の上昇を測定することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
  35. 細胞アッセイが、マクロファージ細胞をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
  36. 細胞アッセイが、皮脂腺由来の細胞をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
  37. 細胞アッセイが、セボサイト細胞をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 検出段階が、トール様受容体２に結合する標識化リガンドを測定することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
  39. 標識化リガンドが、放射性標識又は蛍光標識されている、請求項３８に記載の方法。
  40. トール様受容体２をアッセイ系に提供することと、アッセイ系においてトール様受容体２シグナリングにおける試験化合物の効果（このアッセイでの試験化合物の有効性は調節の指標である。）を検出することと、をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
  41. 検出段階が、化合物によるトール様受容体２へのリガンドの結合の低下をもたらすことをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
  42. 検出段階が、化合物によるトール様受容体２へのリガンドの結合上昇をもたらすことをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
  43. 検出段階が、細胞アッセイにおいてステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素１活性の上昇を測定することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
  44. 検出段階が、細胞アッセイにおいてモノ不飽和脂肪酸合成の上昇を測定することをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 検出段階が、細胞アッセイにおいてグラム陽性細菌殺菌活性の上昇を測定することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
  46. 哺乳動物対象においてグラム陽性細菌感染に対するリスク因子を診断するための方法（該方法は、
    細胞又は組織を対象から採取することと、
    トール様受容体２に対する内因性リガンド又は外因性リガンドと細胞又は組織を接触させることと、
    リガンドと接触した細胞又は組織におけるＳｃｄ１遺伝子産物の産生を測定することと、
    哺乳動物対象におけるＳｃｄ１遺伝子産物の機能低下又は機能喪失を検出することと、
    を含む。）。
  47. 細胞又は組織が、マクロファージ、セボサイト又は皮脂腺由来である、請求項４６に記載の方法。
  48. Ｓｃｄ１遺伝子産物の機能低下又は欠如がグラム陽性細菌感染に対するリスクを上昇させる、請求項４６に記載の方法。
  49. Ｓｃｄ１遺伝子産物の機能低下又は欠如が細胞におけるモノ不飽和脂肪酸合成を低下させる、請求項４６に記載の方法。
  50. Ｓｃｄ１遺伝子産物の機能低下又は欠如がグラム陽性細菌感染に対する炎症反応を低下させる、請求項４６に記載の方法。
  51. Ｓｃｄ１遺伝子産物の機能低下又は欠如が患者の損傷部位での炎症反応を低下させる、請求項５０に記載の方法。
  52. Ｓｃｄ１遺伝子産物の欠如が、炎症が所望の防御機構である状態に対するリスクを上昇させる、請求項４６に記載の方法。
  53. リガンドが、外因性リガンド、リポタイコ酸（ＬＴＡ）、ジアシル化リポペプチド、トリアシル化リポペプチド、Ｓ−ＭＡＬＰ−２、細菌性リポペプチド、ペプチドグリカン、マンナン、非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ、フラジェリン又は１本鎖ＲＮＡである、請求項４６に記載の方法。
  54. 外因性リガンドがＳ−ＭＡＬＰ−２である、請求項４６に記載の方法。
  55. リガンドが、内因性リガンド、脂質、脂肪、ステロール、リポタンパク質、脂肪酸、酸化ＬＤＬ、トロンボスポンジン又はβ−アミロイドである、請求項４６に記載の方法。
  56. 哺乳動物対象において、Ｓｃｄ１遺伝子機能喪失により誘発される疾患又はそれに対する遺伝性素因を診断する方法（該方法は、哺乳動物対象から得られた、細胞試料、タンパク質試料又は核酸試料において、突然変異Ｓｃｄ１タンパク質又は突然変異Ｓｃｄ１タンパク質をコードする核酸の存在を調べることを含み、かかるタンパク質又は核酸の存在は、Ｓｃｄ１遺伝子機能喪失により誘発される疾患又はそれに対する遺伝性素因の指標である。）。
  57. Ｓｃｄ１遺伝子機能喪失により誘発される疾患が、グラム陽性細菌感染に対する易感染性の上昇である、請求項５６に記載の方法。
  58. タンパク質試料又は細胞試料を抗Ｓｃｄ１抗体に接触させることと、野生型又は突然変異Ｓｃｄ１タンパク質の存在を検出することと、をさらに含む、請求項５６に記載の方法。
  59. 検出段階が、哺乳動物対象からの単核食細胞又はマクロファージの蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析をさらに含む、請求項５８に記載の方法。
  60. ハイブリダイズ条件下で突然変異Ｓｃｄ１遺伝子をコードする標識化ＤＮＡ又はＲＮＡ分子と核酸試料を接触させることと、ハイブリダイゼーション後、標識化ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を検出することと、をさらに含み、標識化ＤＮＡ又はＲＮＡの検出が、試料中の突然変異Ｓｃｄ１遺伝子をコードする核酸分子の存在の指標である、請求項５６に記載の方法。
  61. 認識配列が突然変異Ｓｃｄ１遺伝子における突然変異により影響を受ける制限酵素と核酸試料を接触させることと、制限酵素との接触後、断片の有無又は核酸断片の変化があることを検出することと、をさらに含み、制限酵素との接触後の、断片の欠如又は核酸断片の変化があることが、試料中の突然変異Ｓｃｄ１遺伝子をコードする核酸分子の存在の指標である、請求項５６に記載の方法。
  62. 異種の核酸を含むトランスジェニック非ヒト動物（該核酸は、Ｓｃｄ１遺伝子の機能喪失対立遺伝子を含有し、該動物は、野生型の表現型に対して、グラム陽性細菌感染に対する易感染性を含む表現型を示す。）。
  63. Ｓｃｄ１突然変異動物の表現型が、皮脂腺が発育不全であること又はモノ不飽和脂肪酸を合成できないことを特徴とする、請求項６２に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
  64. Ｓｃｄ１遺伝子における機能喪失対立遺伝子がＴ２２７Ｋでのアミノ酸置換である、請求項６２に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
  65. 動物がマウス又はラットである、請求項６２に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
  66. 請求項６２に記載のトランスジェニック非ヒト動物由来の細胞又は細胞株。
  67. トール様受容体２−シグナリング活性の調節因子に対するスクリーニングのインビトロ法（該方法は、請求項６６に記載の細胞又は細胞株を試験化合物と接触させることと、細胞におけるモノ不飽和脂肪酸合成量、グラム陽性細菌感染に対する易感染性又はトール様受容体２誘導性のマクロファージ活性化活性の上昇又は低下を検出することと、それによりトール様受容体２誘導性マクロファージ活性化活性の調節因子として試験化合物を同定することと、を含む。）。
  68. トール様受容体２シグナリング活性の調節因子に対するスクリーニングのインビボ法（該方法は、請求項６２に記載のトランスジェニック動物を試験化合物と接触させることと、細胞におけるモノ不飽和脂肪酸合成量、グラム陽性細菌感染に対する易感染性又はトール様受容体２誘導性のマクロファージ活性化活性の上昇又は低下を検出することと、それによりトール様受容体２誘導性マクロファージ活性化活性の調節因子として試験化合物を同定することと、を含む。）。
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