KR20080024868A

KR20080024868A - 수분채널단백질인 아쿠아포린 및 이를 조절하는 여성의 질윤활제

Info

Publication number: KR20080024868A
Application number: KR1020060089576A
Authority: KR
Inventors: 박광성; 안규윤; 한호재
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2006-09-15
Filing date: 2006-09-15
Publication date: 2008-03-19

Abstract

본 발명은 아쿠아포린 발현 조절에 의한 여성의 질 윤활액 분비 촉진 및 이를 조절하는 여성의 질 윤활제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 아쿠아포린의 아형 중 아쿠아포린-1 내지 아쿠아포린-3 및 아쿠아포린-8이 암컷 쥐의 질 조직에서 발현됨을 확인함으로써 이들의 발현 조절을 통하여 여성의 질 윤활액 분비를 촉진할 수 있음을 밝히고, 상기 아쿠아포린-1 내지 아쿠아포린-3 및 아쿠아포린-8의 발현을 조절하는 여성의 질 윤활제에 관한 것이다.

Description

수분채널단백질인 아쿠아포린 및 이를 조절하는 여성의 질 윤활제{Aquaporins Water Channels and Vaginal lubrication for Modulating the Same}

여성의 성적각성은 질 윤활작용으로 나타난다. 질은 성적 흥분에 의해 혈류공급이 급격히 증가하고 동시에 정맥의 누출이 감소하여 질벽의 점막하 모세혈관망과 근육층의 혈관총이 확장되어 혈액이 충만하게 되고 질벽의 두께가 증가하여 음경이 삽입될 때 완충작용을 하게 된다. 질벽 점막하 모세혈관망이 울혈되면 모세혈관 내압이 증가하여 혈관 내 혈장액이 혈관 외부로 누출(transudate)되고 질 상피세포를 통하여 질벽에서 땀이 나듯 질 분비물을 분비하게 되어 윤활층이 형성된다. 그러나 질벽에서 누출액이 나오는 기전에 대해서는 잘 알려져 있지 않다.

질은 선 조직이 없는 편평 상피세포층이 평활근에 둘러싸여 있고 광범위한 혈관과 신경조직의 지배를 받는다. 질의 전방부와 후방부는 평소에 거의 맞닿아 있는데 기저질액(basal vaginal fluid, 1ml)에 의해 보통 분리된다. 월경기 사이(intermenstruum)에 질액은 여러 가지 분비물(peritoneal, follicular, tubal, uterine, cervical, vaginal, Bartholin's, Skene's glands)에 의해 섞여 있다. 그렇지만 질의 기저 분비액량은 성교 시 통증이 없는 음경진입에는 불충분하기 때문에 성교 시에는 윤활액의 분비가 필요하다.

아쿠아포린은 수분의 이동에 관여하는 단백질로 주로 신장에서 발현된다. 아쿠아포린은 27-30kD(260-340 아미노산)의 분자무게를 가진 일종의 수분 전달 통로 단백질(water channel proteins)로서, 세포의 파열을 방지하고 사람의 경우 신장과 적혈구 세포, 눈 수정체 및 뇌 등의 조직에서 수분 이동을 조절하는 기능을 한다. 따라서, 이 단백질에 결함이 발생하면 요붕증이나 청력 상실 등의 질병이 유발될 수 있다.

지금까지 13종류의 아쿠아포린(아쿠아포린-0 내지 아쿠아포린-12) 아형이 알려져 있는데, 아쿠아포린-1은 다양한 기관과 조직에 분포해 있다. 아쿠아포린-1은 대동맥의 혈관 평활근세포 세포막, 림프 내피, 쥐 소장의 모세관 및 내장 벽의 평활근에 존재한다고 알려져 있으며, 아쿠아포린-2는 신장에서 집합관 바소프레신(vasopressin) 의존성 수분채널로 수분이 투과성을 높이는 역할을 한다고 알려져 있다. 아쿠아포린-3은 신장, 피부, 결막 및 방광 등에 분포하고, 아쿠아포린-4는 뇌에서 발현되는 수분채널로 뇌척수액의 생성과 많은 관련이 있으며 눈의 각막, 땀샘 및 눈물샘 등의 기관에서 수분전달기능을 하고, 아쿠아포린-8은 간, 췌장, 장, 분비선, 고환 및 심장에 분포하는 것으로 알려져 있다.

최근 아쿠아포린-1이 암컷 쥐 생식계의 난관와 질의 평활근세포에서 나타난다고 보고되었으며 혈관평활근에서 아쿠아포린-1이 발현되고 혈관세포막을 통해서 빠른 수분전달을 중개한다고 보고된 바 있다(Gannon BJ등 J Smooth Muscle Res 2000;36:155-167). 이때 Gannon 등은 아쿠아포린-1이 성적 흥분시 질의 풍선화(ballooning; 확장과 늘어남)에 관여할 것이라고 주장한바 있다. 그러나, 아쿠아포린-1이 여성의 질 윤활액 분비를 촉진한다는 사실은 지금까지 보고된 적이 없었다.

또한 신경성뇌하수체 호르몬의 일종으로 혈압상승과 항이뇨 작용이 있는 바소프레신(vasopressin)은 아쿠아포린-2 및 -3을 조절한다. 아쿠아포린-2는 바소프레신에 의한 수분 재흡수 조절에서 주요한 목표가 된다. 아쿠아포린-3은 바소프레신의 농도 변화에 의해 조절되는데, 내생의 바소프레신이 결핍된 Brattleboro 백서에서 아쿠아포린-3의 발현이 더 낮게 나타난다는 보고가 있다(Nielsen, S et al. Aquaporins in the kidney: from molecular to medicine. Physiol Rev 2002;82:205-44). 그러나, 아직까지 질 조직에서 발현되는 아쿠아포린의 발현 조절 인자에 대해서는 밝혀진 바가 없다.

이에 본 발명자들은 질을 구성하는 점막상피세포층, 점막하 혈관층과 평활근이 있어 성적 흥분시 질점막상피세포층하 혈관에 혈액이 충만하고 질 평활근이 이완되어 혈관에서 삼출된 수분을 포함한 액체가 질점막상피세포층을 통과하여 질강내로 분비되는데 이때 질 조직에 있는 아쿠아포린 수분채널이 발현되거나 작용하여 질 윤활액이 분비된다고 가정하고, 암컷 쥐의 질 조직에서 아쿠아포린 아형의 발현을 연구한 결과, 아쿠아포린-1 뿐만 아니라 아쿠아포린-2, 아쿠아포린-3 및 아쿠아포린-8이 발현됨을 최초로 밝혀내고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 아쿠아포린-1 내지 아쿠아포린-3 및 아쿠아포린-8의 발현을 조절함으로써 여성의 질 윤활액 분비를 촉진시키는 여성의 질 윤활제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 아쿠아포린-1 내지 아쿠아포린-3 및 아쿠아포린-8의 발현을 조절함으로써 여성의 질 윤활액 분비를 촉진시키는 여성의 질 윤활제를 제공한다.

지금까지 질 윤활작용의 기전에 대해서는 잘 알려진 바가 없다. 본 발명에서는 질 윤활작용에 수분채널(water channel) 단백질로 알려진 아쿠아포린이 관여한다는 연구결과를 토대로 아쿠아포린을 조절하는 물질을 함유하는 여성의 질 윤활제를 제공하고자 한다.

본 발명에서는 암컷 12주령의 SD(Sprague-Dawley) 백서에서 질 조직을 떼어내 면역조직화학 및 웨스턴 블랏(Western blot) 등을 시행한 결과, 아쿠아포린-1 내지 아쿠아포린-9 중 아쿠아포린-1, -2, -3 및 -8이 발현됨을 규명하였다.

질 조직에서 아쿠아포린 아형의 발현을 살펴보면, 아쿠아포린-1은 주로 질 조직의 모세혈관, 세정맥 및 평활근에서 면역반응을 나타내었고, 아쿠아포린-2 및 -8은 질 조직 상피세포질에서 발현되었으며, 아쿠아포린-3은 상피세포의 세포질막에서 면역반응을 보이는 반면, 상피세포질에서는 거의 발현되지 않음을 관찰한 바 있다. 따라서, 본 발명의 결과로 볼 때 아쿠아포린-1, -2, -3 및 -8은 여성의 질 윤활작용에 중요한 역할을 하리라 생각된다.

또한 본 발명에서는 질 조직에서 아쿠아포린의 역할이 성적 자극에 의한 질 윤활작용과 관련이 있는 지를 알아보기 위하여 암컷 쥐의 골반신경을 전기자극하여 성적인 자극과 비슷한 환경을 조성했을 때, 아쿠아포린-1, -2 및 -3이 질 조직의 세포질에서 세포막으로 이동하고 있음을 밝혀내 아쿠아포린-1, -2 및 -3이 질 윤활작용에 관여하고 있음을 규명하였다.

따라서, 아쿠아포린-1 내지 아쿠아포린-3 및 아쿠아포린-8의 발현을 조절함으로써 여성의 질 윤활액 분비를 촉진할 수 있으며, 이와 같이 아쿠아포린-1 내지 아쿠아포린-3 및 아쿠아포린-8의 발현을 조절하는 여성의 질 윤활제 역시 본 발명의 범주에 속한다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되어지는 것으로 해석되어져서는 아니된다.

[실시예 1] 암컷 쥐의 질 조직에서 아쿠아포린 활성 측정

1. 실험 동물(Experimental animals)

실험동물은 암컷 12주령의 SD(Sprague-Dawley) 백서를 대상으로 하였다. 백서를 케타민 하이드로클로라이드(ketamine hydrochloride) 50mg/kg와 크실라진(xylazine) 5mg/ml의 혼합액을 근육 주사하여 마취시킨 후 질 조직을 적출하였다.

2. 면역조직화학적 염색(Immunohistochemical stain)

면역조직화학염색은 ABC 키트(Vector Laboratories, Burlingame, USA)를 이용하였고, 일차 항체로는 각각 항-아쿠아포린-1, -2, -3, -4 및 -6 항체(Chemicon, USA), 항-아쿠아포린-5, -7, -8 및 -9 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA)를 사용하였다. 면역조직화학염색 과정을 간략히 살펴보면, 크실렌(xylene)과 순차적 농도의 에탄올로 탈 파라핀 과정을 거친 조직 절편을 내재성 퍼옥시다아제(peroxidase) 활성을 제거하기 위하여 60% 메탄올에 녹인 3% H₂O₂에 30분간 부치시킨 다음 PBS 완충액으로 세척하고 5% 정상 염소 혈청으로 1시간 반응시켜 주변부의 비특이적 반응을 억제하였으며 일차 항체에 4℃에서 16-18시간 동안 반응시켰다. 이때 대조군(Control)은 일차항체 대신 정상 염소 혈청을 사용하였다. 반응시킨 조직은 PBS로 세척하고 바이오틴화된 항-토끼 IgG(biotinylated anti-rabbit IgG)에 30분간 부치시킨 다음 아비딘 바이오틴화된 서양고추냉이 퍼옥시다아제 시약(avidin biotinylated horseradish peroxidase reagent)에 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 절편은 PBS로 세척한 후 3,3-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride)로 7분간 발색시킨 다음 탈수과정을 거친 후 생물용 마운트미디어(permount)로 봉입하여 광학현미경(Olympus, Japan)으로 관찰하여 사진을 찍었으며, 이를 도 1에 도시하였다.

도 1의 A는 아쿠아포린-1에 대한 면역조직화학으로 점막상피세포층하의 모세혈관, 정맥 및 평활근에서 갈색으로 아쿠아포린-1이 발현되는 것을 보여주고, B는 아쿠아포린-2에 대한 면역조직화학으로 점막상피세포질에서 갈색으로 아쿠아포린-2가 발현되는 것을 보여주며, C는 아쿠아포린-3에 대한 면역조직화학으로 점막상피세포막과 점막상피세포질에서 갈색으로 아쿠아포린-3이 발현되는 것을 보여주고, D는 아쿠아포린-8에 대한 면역조직화학으로 점막상피세포질에서 갈색으로 아쿠아포린-8이 발현되는 것을 보여주며, E는 아쿠아포린-4에 대한 면역조직화학으로 질점막상피세포층 및 상피세포층하 질 조직에서 아쿠아포린-4가 전혀 발현이 되지 않는 것을 보여준다.

상기 결과를 통하여 본 발명에 의한 아쿠아포린-1 내지 아쿠아포린-3 및 아쿠아포린-8이 여성의 질에서 수분의 이동통로를 담당하는 핵심단백질로서 질 윤활작용에 관여할 것으로 판단된다.

3. 웨스턴 블랏(Western blot) 분석

질 조직을 분리하여 인산 완충액(10mM 인산 완충액, pH 7.4; 150mM Nacl; 1mM 패닐메틸술포닐플루오라이드(phenylmethylsulfonylfluoride), 25ug/ml 아프로티닌(aprotinin) 및 25ug/ml 류펩틴(leupeptin))에서 균질화하였다. 조직 추출물 (50ug)을 10% SDS-PAGE에서 전기영동시켜 단백질을 분리하여 PVDF 전이막(transfer membrane; Amersham Bioscience. UK)에 100V에서 90분 동안 전이시켰다. 이 막은 5% 밀크-TBS-T(pH 7.2, 0.1% 트윈-20)으로 차단한 후 α-아쿠아포린-1, -2 및 -3(Chemicon, USA), 및 -8(Santa Cruz Biotechnology, USA)로 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 실온에서 1시간동안 HRP-컨쥬게이트(conjugate) 2차 항체를 붙인 다음 1% TBS-T(pH 7.2, 0.1% 트윈-20)로 5분씩 5번 세척하였다. ECL 어드밴스드 키트(ECL advanced kit; Amersham Bioscience)를 이용하여 발색시킨 후 필름에 현상하였다.

도 2는 쥐의 질에서 아쿠아포린(AQP)-1, 아쿠아포린-2, 아쿠아포린-3 및 아쿠아포린-8의 면역블랏팅 결과를 보여준다. 항-AQP 항체들은 각각 비-글리코실레이트된(nonglycosylated) 및 글리코실레이트된(glycosylated) 아쿠아포린에 대응하는 27∼29kDa 및 35∼50kDa 밴드들을 인지한다. 항-액틴 항체는 42kDa 밴드를 인지한다.

상기 결과를 통하여 본 발명에 의한 아쿠아포린-1 내지 아쿠아포린-3 및 아쿠아포린-8의 분자량이 27-30kDa(260-340 아미노산) 사이에 있음을 확인하였다.

[실시예 2] 성적 자극에 의한 질 윤활작용에서 아쿠아포린의 기능 확인

성적 자극에 의한 질 윤활작용에 아쿠아포린의 활성이 관련이 있는 지를 알아보기 위하여, 암컷 쥐의 골반신경을 전기자극하여 성적인 자극과 비슷한 환경(7V, 0.8msec, 16Hz, 60초간 자극)을 조성한 다음 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 아쿠아포린-1의 활성을 측정하였으며, 그 결과를 도 3과 도 4에 나타내었다.

도 3과 도 4의 결과, 신경자극 후 세포질 내에 존재하던 아쿠아포린-1 및 -2가 단백질이 세포막으로 이동하는 것이 관찰되었고, 이러한 현상은 신경자극 후(흥분 시) 질 분비물이 증가되는 기전을 설명해 준다. 즉, 상기 결과는 본 발명에 의한 아쿠아포린-1 및 -2가 단백질이 여성의 성적 자극에 의한 질 윤활작용에 관여함을 증명한 것이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 아쿠아포린의 아형 중 아쿠아포린-1 내지 아쿠아포린-3 및 아쿠아포린-8이 암컷 쥐의 질 조직에서 발현됨을 확인함으로써 이들의 발현 조절을 통하여 여성의 질 윤활액 분비를 촉진할 수 있음을 밝히고, 상기 아쿠아포린-1 내지 아쿠아포린-3 및 아쿠아포린-8의 발현을 조절하는 여성의 질 윤활제를 제공할 수 있었다.

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도 1은 쥐의 질에서 아쿠아포린-1(AQP1), 아쿠아포린-2(AQP2), 아쿠아포린-3(AQP3), 아쿠아포린-8(AQP8) 및 아쿠아포린-4(AQP4)의 발현 결과를 보여준다(A;AQP1, B;AQP2, C;AQP3, D;AQP8 및 E;AQP4).

도 2는 쥐의 질에서 아쿠아포린-1(AQP1), 아쿠아포린-2(AQP2), 아쿠아포린-3(AQP3) 및 아쿠아포린-8(AQP8)의 면역블랏팅 결과를 보여준다.

도 3은 골반신경자극 후 아쿠아포린-1(AQP1)의 발현양상의 변화를 보여준다.

도 4는 골반신경자극 후 아쿠아포린-2(AQP2)의 발현양상의 변화를 보여준다.

Claims

아쿠아포린-1, 아쿠아포린-2, 아쿠아포린-3 및 아쿠아포린-8로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수분채널단백질 활성을 조절함으로써 여성의 질 윤활액 분비를 촉진하는 여성의 질 윤활제.