KR20080021608A - 유전자류 도입 방법 - Google Patents

Abstract

표적 세포에 대한 유전자의 효율적인 도입법을 제공한다. 표적 세포 함유 조성물 또는 생체에 (A) 유전자류와 양이온성 물질로 이루어지는 정으로 하전된 복합체 및 (B) 가스 함유 미소 입자를 첨가 또는 투여 후, 저주파 초음파를 조사하는 것을 특징으로 하는 표적 세포에 대한 유전자류 도입 방법.

Description

유전자류 도입 방법{GENE TRANSFER METHOD}

본 발명은, 인비트로 및 인비보에 있어서, 표적 세포에 양호한 효율로 유전자류를 도입하는 방법 및 유전자류 도입용 키트에 관한 것이다.

표적 세포에 유전자류를 도입하는 방법으로는, 유전자류를 제 4 급 암모늄염 함유 리포솜에 봉입시켜 투여하는 방법 (비특허 문헌 1), 유전자류와 함께 프로타민 등을 투여하는 방법 (비특허 문헌 2) 등이 알려져 있다. 그러나, 이들의 수단에서는, 표적 세포에 대한 유전자류의 도입 효율은 아직도 만족할 수 있는 것은 아니었다.

한편, 알부민으로 이루어진 얇은 껍질 중에 옥타불화프로판 가스 등을 봉입한 마이크로 버블과 유전자류를 동시에 투여하고, 초음파를 조사하면, 내봉된 가스의 캐비테이션에 의해, 표적 세포에 대해서 유전자류를 도입할 수 있는 것이 알려져 있다 (비특허 문헌 3).

비특허 문헌 1 : Felgner P.L. Cationic liposome-mediated transfection with lipofection reagent, Meth.Mol.Biol 91-98, 1991

비특허 문헌 2 : Gao X and Huang L., A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells.Biochem.Biophys.Res.Commun 179 280-285, 1991

비특허 문헌 3 : Tachibana K, Uchida T, Ogawa K.Yamashita N.Tamura K., Induction of cell-membrane porosity by ultrasound.Lancet 353, 1409, 1999

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

그러나, 상기 마이크로 버블을 사용한 수단에 의해서도 그 유전자 도입 효율은 낮아, 도입 효율이 더욱 높은 방법이 요망되고 있었다.

과제를 해결하기 위한 수단

그래서 본 발명자는, 유전자류와 마이크로 버블을 그대로 사용하는 것이 아니라, 미리 유전자류와 양이온성 물질을 복합화시키고, 그 표면 가전을 정(正)으로 한 복합체로 하고, 이것과 마이크로 버블을 조합하여 초음파 조사하면, 표적 세포에 대한 유전자류의 도입 효율이 10 배에서 10000 배로 비약적으로 향상되는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은, 표적 세포 함유 조성물 또는 생체에, (A) 유전자류와 양이온성 물질로 이루어지는 정으로 하전된 복합체 및 (B) 가스 함유 미소 입자를 첨가 또는 투여 후, 저주파 초음파를 조사하는 것을 특징으로 하는 표적 세포에 대한 유전자류 도입 방법을 제공하는 것이다.

또 본 발명은, (A) 유전자류와 양이온성 물질로 이루어지는 정으로 하전된 복합체 및 (B) 가스 함유 미소 입자를 함유하는 표적 세포에 대한 유전자류 도입용 키트를 제공하는 것이다.

발명의 효과

본 발명 방법에 의하면, 인비트로 및 인비보 중 어느 것에 있어서도, 표적 세포에, 목적으로 하는 유전자류를 매우 양호한 효율로 도입할 수 있다. 따라서, 본 발명을 사용하면, 종래 도입 효율이 낮은 것이 원인으로 불가능했던 형질 전환 세포의 생성률이 향상된다. 또, 유전자 치료의 유효율도 비약적으로 향상된다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명은, (A) 유전자류와 양이온성 물질로 이루어지는 정으로 하전된 복합체를 사용하는 것을 특징으로 한다. 여기서, 유전자류로는, DNA, RNA, 안티센스 DNA, siRNA, 디코이, 치료용 올리고 뉴클레오티드 등을 들 수 있다. 또, 양이온성 물질로는, 프로타민, 폴리-L-리신, 폴리-L-아르기닌, 오르니틴 등의 양이온성 펩티드；폴리에틸렌이민, 양이온성 덴드리머, 키토산 등의 양이온성 폴리머 등을 들 수 있다. 이들 유전자류와 양이온성 물질로 이루어지는 복합체는, 예를 들어 이들을 정제수 중에서 혼합함으로써 제조할 수 있다. 용매에 따라서는 응집이 일어나므로 사전의 검토가 필요하다. 이 때, 얻어지는 복합체 전체의 하전을 정이 되도록 하는 것이 필요하다. 당해 하전은, 제타 전위로 ＋5∼＋20mV 가 되도록 조정하는 것이 바람직하다. 제타 전위는, 통상의 제타 전위 측정 장치로 측정할 수 있다.

또, 당해 복합체의 입자 직경은, 100∼300nm 정도로 하는 것이 유전자 도입 효율면에서 바람직하다. 이 입자 직경은 레이저 광산란 미립자 측정 장치에 의해 측정할 수 있다.

여기서 사용하는 유전자류와 양이온성 물질은, 중량비로 1:100∼100:1, 보다 바람직하게는 1:10∼10:1 의 비율로 혼합하는 것이 바람직하다.

한편, (B) 가스 함유 미소 입자로는, 종래부터 마이크로 버블로서 이용되고 있는 것, 예를 들어 알부민 소포 중에 가스를 봉입한 것 외에, 가스 봉입 리포솜을 사용할 수 있다. 여기서, 공지된 마이크로 버블로는, Alubunex (Molecular Biosystems), Levovist (Schering), Sonavist (Schhering), Echovist (Schhering), Sonazoid (Nycomed), Optison (Nycomed-Amersham), Definity (Du Pont Pharmaceutical), SonoVue (Bracco) 등을 들 수 있다.

가스 봉입 리포솜으로는, 내용적의 20∼80% 리포솜 현탁액을 함유하는 밀봉 용기의 공극부에 불화 가스 또는 질소 가스를 충전하고, 초음파 처리함으로써 얻어지는 가스 봉입 리포솜을 들 수 있다.

여기서 리포솜의 막 구성 성분으로서 사용되는 지질류로는, 인지질, 글리세로 당지질 및 스핑고 당지질 외에, 이들 지질에, 1 급 아미노기, 2 급 아미노기, 3 급 아미노기 또는 제 4 급 암모늄기가 도입된 양이온성 지질, 이들 지질에 폴리알킬렌글리콜이 도입된 지질, 추가로 각종 세포, 조직 등에 대한 리간드가 결합된 지질류를 들 수 있다.

인지질로는, 예를 들어 포스파티딜콜린 (대두 포스파티딜콜린, 난황 포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린 등), 포스파티딜에탄올아민 (디스테아로일포스파티딜에탄올아민 등), 포스파티딜세린, 포스파티딘산, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 리조포스파티딜콜린, 스핑고미에린, 난황 레시틴, 대두 레시틴, 수소 첨가 인지질 등의 천연 또는 합성의 인지질 등을 들 수 있다.

글리세로 당지질로는, 예를 들어 술폭시리보실글리세리드, 디글리코실디글리세리드, 디갈락토실디글리세리드, 갈락토실디글리세리드, 글리코실디글리세리드 등을 들 수 있다. 스핑고 당지질로는, 예를 들어 갈락토실세레브로시드, 락토실세레브로시드, 강글리오시드 등을 들 수 있다.

양이온성 지질로는, 상기 인지질, 글리세로 당지질 또는 스핑고 당지질에, 아미노기, 알킬아미노기, 디알킬아미노기, 트리알킬암모늄기, 모노아실옥시알킬-디알킬암모늄기, 디아실옥시알킬-모노알킬암모늄기 등의 제 4 급 암모늄기가 도입된 지질을 들 수 있다. 또, 폴리알킬렌글리콜 수식 지질로는, 상기 인지질, 글리세로 당지질, 스핑고 당지질에, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜 등이 수식된 지질, 예를 들어 디-C_{12 - 24}아실-글리세롤-포스파티딜에탄올아민-N-PEG 등을 들 수 있다.

또 필요에 따라 막안정화제로서 콜레스테롤류, 항산화제로서 토코페롤류, 스테아릴아민, 디세틸포스페이트, 강글리오시드를 사용해도 된다.

또, 표적 세포, 표적 조직, 표적 병소에 대한 리간드로는, 트랜스페린, 엽산, 히알루론산, 갈락토오스, 만노오스 등의 암 세포에 대한 리간드 등을 들 수 있다. 또, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체도 리간드로서 사용할 수 있다.

또, 미리 제작되는 리포솜의 내부에는, 수상이면 되지만, 유전자류 등을 함유해도 된다.

리포솜의 제조에는, 공지된 리포솜의 조제법을 적용할 수 있고, 예를 들어 밴검 (Bangham) 등의 리포솜 조제법［J.Mol.Biol., 13, 238 (1965)］, 에탄올 주입법［J.Cell.Biol., 66, 621 (1975)］, 프렌치 프레스법［FEBS Lett., 99, 210 (1979)］, 동결 융해법［Arch. Biochem. Biophys., 212, 186 (1981)］, 역상 증발법［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 4194 (1978)］등을 들 수 있다. 예를 들어, 지질류 등을 유기 용매에 용해시키고, 이것에 수성 용액을 첨가하고, 이어서, 초음파 처리하여 리포솜 현탁액을 얻는다. 이어서 필요에 따라 이것을 익스트루더 및/또는 멤브란 필터를 사용하여, 정립한다. 이 때, 입자 직경은, 1㎛ 이하, 더욱 100∼800nm, 특히 100∼600nm 로 정립하는 것이 바람직하다.

얻어진 리포솜 현탁액은 밀봉 용기에 주입한다. 이 때, 용기의 공극률은 내용적의 20∼80%, 더욱 30∼80%, 특히 50∼80% 로 하는 것이 바람직하다. 20% 미만에서는, 얻어지는 리포솜의 가스 도입률이 지나치게 낮다. 한편, 80% 를 초과하면 경제적이지 않다.

이 공극부에 불화물 가스 또는 질소 가스를 충전한다. 불화물 가스로는, 황화헥사플루오라이드, 퍼플루오로 탄화수소 가스, 예를 들어, CF₄, C₂F₆, C₃F₈, C₄F₁₀, C₅F₁₂, C₆F₁₄ 등을 들 수 있고, C₃F₈, C₄F₁₀, C₅F₁₂ 가 특히 바람직하다. 또, 질소 가스도 사용할 수 있다. 충전한 후의 압력은 1 기압 (게이지압) 이상, 특히 1∼1.5 기압이 바람직하다. 충전 수단으로는, 고무마개 등으로부터 주사기 등에 의해 주입하는 것이 간편하지만, 주입용 실린더를 사용해도 된다.

이어서 초음파 처리한다. 초음파 처리는, 예를 들어, 20∼50kHz 의 초음파를 1∼5 분 조사하면 된다. 당해 초음파 처리에 의해, 리포솜 내부의 수용액과 불화물 가스 또는 질소 가스가 치환되어, 가스 봉입 리포솜이 얻어진다. 얻어진 가스 봉입 리포솜의 입자 직경은, 원료 리포솜의 그것과 거의 동일하다. 따라서, 리포솜 조정시에 정립해 두면, 입자 직경이 일정 범위, 예를 들어 1㎛ 이하, 더욱 50∼800nm, 특히 100∼600nm 의 가스 봉입 리포솜이 간편하게 얻어진다.

또한, 불화물 가스 또는 질소 가스를 충전한 리포솜 현탁액 함유 밀봉 용기를 조제해 두고, 이것을 병원 등에 공급하면, 현장에서 초음파 처리하는 것만으로 용이하게 가스 봉입 리포솜을 얻을 수 있다.

이렇게 하여 얻어진 가스 봉입 리포솜은, 입자 직경이 작고, 그 입도 분포도 일정하게 할 수 있으므로, 미소 혈관, 심부 조직 등으로의 이행이 가능하다.

또, 본 발명에 있어서는, 상기 복합체 (A) 는, 가스 함유 미소 입자 (B) 에 내봉되어 있어도 된다. 내봉 수단으로는, 가스 함유 미소 입자의 조제 단계에서 실시하는 방법, 및 가스 함유 미소 입자를 조제 후에 상기 복합체 (A) 를 첨가하여, 혼합하는 방법을 들 수 있다.

본 발명에 있어서는, 표적 세포 함유 조성물 또는 생체에, 상기 복합체 (A) 및 가스 함유 미소 입자 (B) 를 첨가 또는 투여한다. 여기서, 표적 세포 함유 조성물로는, 표적 세포 배양액을 들 수 있다. 한편, 생체로는, 인간을 포함하는 포유류, 조류, 어류, 파충류, 곤충, 식물 등을 들 수 있다. 표적 세포는 유전자를 도입하고자 하는 세포 또는 세포를 포함하는 조직이다.

여기서 인비트로의 경우에는, 표적 세포 배양액에, 상기 복합체 (A) 및 가스 함유 미소 입자 (B) 를 첨가 후, 저주파 초음파를 조사하면 된다. 한편, 인비보의 경우에는, 생체에 상기 복합체 및 가스 함유 미소 입자를 투여한 후, 진단용 초음파 (2∼6MHz) 를 조사하고, 표적 세포로의 이행을 확인한 후, 저주파 초음파를 조사하면 된다. 이 때의 투여법은, 국소 투여이어도 되고, 정맥 내 투여이어도 된다.

가스 함유 미소 입자 (B) 는, 0.5∼2MHz 의 공진 주파수를 포함하는 저주파 초음파를 조사하면, 미소 입자의 붕괴와 가스의 미소 기포에 의한 캐비테이션을 발생시킨다. 이 결과, 그 근방에 존재하는 상기 복합체 (A), 또는 가스 함유 미립자 중의 상기 복합체 (A) 는, 표적 세포에 대해서, 양호한 효율로 도입된다. 이 복합체 (A) 가, 표적 세포에 양호한 효율로 도입되는 이유는 분명하지 않지만, 정하전이기 때문에 세포 표면에 접촉하기 쉬운 상태가 되어 있기 때문인 것으로 생각된다.

다음에 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 조금도 이것에 한정되는 것은 아니다.

이하, 실시예에서 사용하는 약어는 다음과 같다.

DPPC： 디팔미토일포스파티딜콜린

DOPE ： 디올레오일포스파티딜에탄올아민

DOTAP ： 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판

실시예 1

(1) 루시페라아제를 코딩한 플라스미드 DNA 와 프로타민을 혼합하고, DNA-프로타민 복합체를 제작하여, 컴팩트한 사이즈로 하였다. 이 때, 복합체 전체의 하전을 정 (제타 전위로 ＋0.5 내지 ＋20mV) 이 되도록 하였다. 비교를 위해서 복합체 전체의 하전을 부 (제타 전위로 -7mV) 가 되도록 하였다.

(2) DPPC 리포솜

DPPC ： 콜레스테롤 (1：1 (m/m)) 의 지질을 클로로포름 ： 이소프로필에테르 (1：1v/v) 의 유기 용매에 용해시키고, 생리 식염수 등의 수용액 (또는 약물을 포함하는 수용액) 을 유기 용매의 1/2 용량을 첨가하고 (이 때, 클로로포름 ： 이소프로필에테르 ： 수용액=1：1：1v/v) 혼합하여 에멀션으로 하였다. 이것을 사용하여 역상 증발법 (REV 법) 으로 리포솜을 조제하였다. 익스트루더로 400nm, 200nm, 100nm 의 폴리카보네이트막을 통과시켜 입경을 동일하게 하였다.

(3) DOTAP 리포솜

DOTAP：DOPE=1：1w/w 를 클로로포름에 용해시키고, 이형(梨型) 플라스크 중에 넣고, 로터리 에버포레이트로 회전시키면서 유기 용매를 에버포레이트하여 지질이 얇은 막을 벽에 제작하였다 (lipid film 의 제작). 생리 식염수 등의 용매로 수화 (hydration) 시켜, 리포솜을 제작하였다. 초음파 처리에 의해 사이즈 를 작게 한다. 또는, 익스트루더로 400nm, 200nm, 100nm 의 폴리카보네이트막을 통과시켜 입경을 동일하게 하였다.

(4) 시판되는 양이온성 리포솜으로 이루어지는 유전자 도입용의 시약으로서 이하의 시약을 사용하였다.

Lipofectin^TM (DOTMA：DOPE=1：1w/w)

LipofectACE^TM (DDAB：DOPE=1：1.25w/w)

(5) 퍼플루오로프로판 가스 봉입

바이알 병 (5mL, 10mL, 20mL 등) 에 용량의 30% (1.5mL, 3mL, 6mL) 에 상당하는 리포솜 수용액 (지질 농도는 5mg/mL) 을 넣고 퍼플루오로프로판 가스를 공기와 치환되도록 넣었다. 고무 마개를 하여 시일하고 고무 마개를 통해서 주사기로 추가로 퍼플루오로프로판을 첨가하였다. 퍼플루오로프로판은 전체량으로 내용적의 1.5 배로 1.5 기압 정도의 가압 상태로 하였다. 배스형 초음파 장치 (42kHz) 에 물을 채워 정치하고, 1 분간 조사 처리하였다.

(6) 48 웰의 플레이트에 AsPC-1 세포 (4×10⁴ 세포/웰) 배양하고, DNA-프로타민 복합체 (1μg DNA, lipid：DNA=12：1w/w) 와 가스 봉입 PEG-리포솜을 첨가하고, 1MHz 의 초음파를 3 초간 펄스 조사하여, 즉시 배양액을 3∼4 회 반복 세정하고, 배양액을 첨가하여 2 일간 배양하였다. 그 후, 루시페라아제 활성을 통상적인 방법에 의해 측정하였다. 얻어진 결과를 표 1 에 나타낸다.

결과로부터, 퍼플루오로프로판 가스 봉입 양이온성 리포솜과 정하전 상태의 DNA/프로타민 복합체에 대해서 저주파 초음파를 조사했을 경우에, 높은 발현량을 이 얻어졌다.

Claims (12)

1. 표적 세포 함유 조성물 또는 생체에, (A) 유전자류와 양이온성 물질로 이루어지는 정(正)으로 하전된 복합체 및 (B) 가스 함유 미소 입자를 첨가 또는 투여 후, 저주파 초음파를 조사하는 것을 특징으로 하는 표적 세포에 대한 유전자류 도입 방법.
2. 제 1 항에 있어서,

   표적 세포 함유 조성물이 표적 세포 배양액인 유전자류 도입 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   양이온성 물질이 양이온성 펩티드 또는 양이온성 폴리머인 유전자류 도입 방법.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

   가스 함유 미소 입자가 고분자 물질 또는 리포솜에 가스가 봉입된 소포체인 유전자류 도입 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,

   (A) 유전자류와 양이온성 물질로 이루어지는 정으로 하전된 복합체가 (B) 가 스 함유 미립자에 내봉되어 있는 유전자류 도입 방법.
6. (A) 유전자류와 양이온성 물질로 이루어지는 정으로 하전된 복합체 및 (B) 가스 함유 미소 입자를 함유하는 표적 세포에 대한 유전자류 도입용 키트.
7. 제 6 항에 있어서,

   표적 세포 함유 조성물에 (A) 유전자류와 양이온성 물질로 이루어지는 정으로 하전된 복합체 및 (B) 가스 함유 미소 입자를 첨가 후, 저주파 초음파를 조사 함으로써 사용되는 것인 키트.
8. 제 6 항에 있어서,

   생체에 (A) 유전자류와 양이온성 물질로 이루어지는 정으로 하전된 복합체 및 (B) 가스 함유 미소 입자를 투여하고, 이어서 표적 세포에 저주파 초음파를 조사함으로써 사용되는 것인 키트.
9. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서,

   표적 세포 함유 조성물이 표적 세포 배양액인 키트.
10. 제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,

    양이온성 물질이 양이온성 펩티드 또는 양이온성 폴리머인 키트.
11. 제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,

    가스 함유 미소 입자가 고분자 물질 또는 리포솜에 가스가 봉입된 소포체인 키트.
12. 제 6 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,

    (A) 유전자류와 양이온성 물질로 이루어지는 정으로 하전된 복합체가 (B) 가스 함유 미립자에 내봉되어 있는 키트.