KR20070117373A

KR20070117373A - 청피로부터 추출한 항암, 항염증 치료제 및 ｈｊ001의추출방법

Info

Publication number: KR20070117373A
Application number: KR1020060051571A
Authority: KR
Inventors: 정주호; 홍선표; 임성빈; 강민기; 홍미숙; 김학재; 박해정
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2006-06-08
Filing date: 2006-06-08
Publication date: 2007-12-12

Abstract

본 발명은 컬럼을 통과한 청피 분말을 물냉침비흡착법을 이용하여 분리 깔때기에서 부탄올(buthanol)층의 분획함으로써 항암 및 항염증 활성을 가지는 HJ001을 추출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 주요구성은 청피 분말을 물에 넣어 냉침하고 여과하는 단계와; 충진제를 넣은 칼럼을 세척한 다음, 청피 분말의 여과액을 칼럼에 통과시켜 흡착되지 않고 나온 액을 모으는 단계와; 비흡착액을 수포화시킨 에틸아세테이트와 혼합하여 에틸아세테이트층으로 이행시키는 단계와; 에틸아세테이트층과 물층이 층 분리가 형성되면, 물층을 분리하는 단계와; 분리된 물층을 수포화시킨 부탄올과 혼합하여 부탄올층과 물층으로 층 분리되면 부탄올층을 분리하는 단계와; 분리된 부탄올층을 TLC 실리카에 흡수시키는 단계와; TLC 좌 안에 전개용매를 채운 후, 한 쪽 면을 한지로 붙이는 단계와; 한지가 전개용매를 흡수한 후에 TLC판을 TLC좌 안에 넣고 전개시키는 단계와; TLC판을 건조시킨 후 구획으로 분리하는 단계와; 분리된 구역에 해당하는 티엘시의 실리카 부분을 분리하는 단계와; 분리된 실리카 부분을 부탄올에 녹인 후 여과하여 농축시키는 단계와; 농축된 여과액을 동결건조시켜 침착물인 Fr.1, Fr.2 물질을 수득하는 단계; 및 침착물 중에서 Fr.2 물질을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

청피, 항암물질, 항염증 치료제, HJ001, 부탄올층, 물냉침비흡착법

Description

청피로부터 추출한 항암, 항염증 치료제 및 ＨＪ001의 추출방법{Therapeutic agent for anticancer, antiinflammatory extracted from Citrus reticulata Blanco and Extract method of HJ001}

도 1은 본 발명에 따른 청피 추출물의 TLC 분석 사진.

도 2a 및 도 2b는 Fr.2의 NMR 분석 사진.

도 3은 위암세포(SUN 668) MTT의 평균값을 측정한 그래프.

도 4는 TUNEL 및 DAPI 염색의 염색사진.

도 5는 서방 블롯 분석(Western Blot Analysis)에 의한 발색 사진.

도 6은 항산화 생리활성(Free radical scavenging activity)을 도시한 그래프.

도 7은 DEVD 펩타이드-니트로아닐라이드 (pNA)를 넣어 그 활성도 그래프.

도 8은 항염증 관련 단백질 발현을 나타낸 칩사진.

도 9 내지 도 15는 Detection reagent를 이용하여 각각의 membrane들을 X-ray film에 발현 그래프.

본 발명은 청피(Citrus reticulata Blanco)로부터 항암 및 항염증 성분을 추출하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 컬럼을 통과한 청피 분말을 물냉침비흡착법을 이용하여 분리하고 깔때기에서 부탄올(buthanol)층을 분획함으로써 항암 및 항염증 활성을 가지는 HJ001을 추출하는 방법에 관한 것이다.

청피(靑皮; Citrus unshiu Marcovich or Citrus reticulata Blanco)는 운향과 귤의 어린 또는 미성숙 과피(果皮)로 소간파기(疏肝破氣), 산결소담(散結消痰)의 효능이 있어 소화불량, 상복부 동통 등으로 인한 소화기 및 간담(肝膽)계통 질환치료에 전통적으로 사용되어 온 약물이다[강병수 외, 본초학(2000)].

본 발명의 목적은 청피(Citrus reticulata Blanco)로부터 항암 및 항염증 활성을 가지는 추출물질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 컬럼을 통과한 청피 분말을 물냉침비흡착법을 이용하여 분리하고 깔때기에서 부탄올층을 분획함으로써 항암 및 항염증 활성을 가지는 추출물질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 청피로부터 항암 및 항염증 활성을 갖는 HJ001의 추출방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 항암, 항염증 활성을 갖는 추출물질은; 청피 분말을 물에 넣어 냉침하고 여과하는 단계와; 충진제를 넣은 칼럼을 세척한 다음, 상기 청피 분말의 여과액을 칼럼에 통과시켜 흡착되지 않고 나온 액을 모으는 단계와; 상기 비흡착액을 수포화시킨 에틸아세테이트와 혼합하여 에틸아세테이트층으로 이행시키는 단계와; 상기 에틸아세테이트층과 물층이 층 분리가 형성되면, 물층을 분리하는 단계와; 상기 분리된 물층을 수포화시킨 부탄올과 혼합하여 부탄올층과 물층으로 층 분리되면 부탄올층을 분리하는 단계와; 상기 분리된 부탄올층을 TLC 실리카에 흡수시키는 단계와; 상기 TLC 좌 안에 전개용매를 채운 후, 한 쪽 면을 한지로 붙이는 단계와; 상기 한지가 전개용매를 흡수한 후에 TLC판을 TLC좌 안에 넣고 전개시키는 단계와; TLC판을 건조시킨 후 구획으로 분리하는 단계와; 상기 분리된 구역에 해당하는 티엘시의 실리카 부분을 분리하는 단계와; 상기 분리된 실리카 부분을 부탄올에 녹인 후 여과하여 농축시키는 단계와; 상기 농축된 여과액을 동결건조시켜 침착물인 Fr.1, Fr.2 물질을 수득하는 단계; 및 상기 침착물 중에서 Fr.2 물질을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 본 발명의 구성을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

<청피로부터 항암물질(HJ001)의 추출>

1. 청피 200g를 20호 체로 거른 후 분말을 물 2.0ℓ에 넣어 30분간 냉침한다.

2. 냉침 후 냉침액을 4호, 2호 여과지로 각각 여과한다.

3. HP-20(Neoeriocitrin; C₆-C₃-C₆을 기본골격으로 하는 polyphenol 화합물) 충진제를 넣은 칼럼을 물로 2~3회 세척한 다음, 위 여과액을 칼럼에 통과시켜 흡착되지 않고 나온 액을 모은다.

4. 위 나온 액을 동결건조시켜 가루상태로 분말한다.

5. 분말 1g를 물 200㎖에 잘 녹인다.

6. 위의 현탁액을 수포화시킨 에틸아세테이트(Ethyl Acetate) 200㎖와 함께 분리 깔때기에 넣은 후 마구 흔들어주면서 현탁액을 에틸아세테이트층으로 이행시킨다.

7. 에틸아세테이트층과 물층이 층 분리가 된 후 아래쪽에 위치한 물층을 따로 모은다.

8. 위 모은 액을 다시 수포화시킨 부탄올 200㎖와 함께 분리깔때기에 넣은 후 마구 흔들어주면서 부탄올 층으로 이행시킨다.

9. 부탄올층과 물층이 층 분리가 된 후 아래쪽에 위치한 물층을 버리고, 부탄올층을 따로 모아 농축한 다음, 농축액을 보관한다.

10. 프리파라티브 실리카 티엘시판(Preparative silica TLC판)을 안정한 위치에 놓고, 부탄올층 농축액을 모세관을 이용하여 티엘시판 위에 여러 번 분사한다. 이때, TLC 실리카 부분에 충분히 흡수되도록 유의한다.

11. TLC좌 안에 클로로폼(Chloroform) : 메탄올 : 물 = 6 : 4 : 1로 이루어진 전개용매를 채운 후, 한 쪽 면을 한지로 붙인다.

12. 한지가 전개용매를 다 흡수한 후에 TLC판을 TLC좌 안에 넣고 전개시킨다.

13. 5시간이 지난 후 TLC판을 꺼내 말리고, 적외선램프 254㎚으로 확인 후 TLC판에 구획을 나눈다.

14. 스파툴라를 이용하여 구역에 해당되는 TLC의 실리카 부분을 긁어낸다.

15. Preparative silica TLC판을 긁은 부분을 부탄올에 녹인 후 2호 여과지로 여과한다.

16. 여과액을 취해 농축한 후 동결건조 하여 침착물인 Fr.1, Fr.2 물질을 수득한다(도 1 참조).

<HJ001의 확인(TLC 확인법)>

마그네틱 원자핵 공명법 (nuclear magnetic resonance)을 이용하여 분자의 구조를 측정하여 도 2a 및 도 2b에 나타내었다.

도 2a의 ¹H-NMR Data(Solvent : Pyridine-d₅), 도 2b의 ¹³C-NMR Data( Solvent : Pyridine-d₅ )를 통해 분자구조를 확인한 결과 Fr.2의 HJ001의 구조가 Neoeriocitrin; C₆-C₃-C₆을 기본골격으로 하는 polyphenol 화합물임을 확인할 수 있었다.

<실시예 1> 항암효과의 검증에 대한 설명

(1) MTT법에 의한 항암세포 독성 검증

본 발명의 청피 추출물에 의해 실제로 세포가 사망하는지를 MTT 분석법을 이용하여 확인하였다. 티엘시에 의해 분획된 물질들을 사람 위암세포(SNU668)에 각각 10, 100, 200 ug/ml의 농도로 24시간 처치하였고 대조군에서는 동량의 생리식염수를 이용하였다. 먼저 대조군 세포 및 본 발명의 청피 추출물이 도입된 세포가 3×10⁴/웰의 농도로 존재하는 96-웰 플레이트의 각 웰에 15㎕의 염색용액(dye solution, 3-[4,5-dimethylthiaxol- 2yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide: MTT)을 첨가하여 37℃, CO₂ 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 반응을 정지시키기 위하여 100㎕씩의 정지용액(stop solution)을 각 웰에 첨가하고 다시 1시간 동안 37℃에 방치한 후 96-웰 플레이트를 ELISA 판독기(reader)에 옮겨 595 nm에서 OD 값을 측정하였다. 모든 실험들은 3회 반복처리하여 그 평균값을 측정하였다. 세포 생존율은 추출물이 나타내는 세포 독성의 효과로 확인하여 도 3의 그래프로 나타내었다.

도 3에 도시된 바와 같이, MLC 분획법에 의하여 얻어진 4개의 분획물을 위암세포를 이용하여 세포의 생존율을 확인하였더니 HJ001이 포함된 분획물 2에서 대조군과 비교하여 각각 89.168 ± 2.38%, 60.18 ± 3.38%, 51.79 ± 0.38 %로 가장 효과적인 세포 독성을 나타냄을 확인하였다.

<실시예 2> TUNEL 및 DAPI 염색을 이용한 세포사멸의 검증

세포사멸를 검증하기 위하여 TUNEL 염색과 DAPI 염색을 이용하였다.

[TUNEL 염색]

대장암세포(SUN668 cell)을 24웰에 분주 후 HJ001(200ug/ml)로 24시간 처리한 후 메디아를 제거 후 상등용액(PBS buffer)으로 실온에서 5분간 3번 씻어낸 다음 4% 포르말린고정용액으로 4℃에서 10분간 고정시켰다. 0.5% 용윤제(Triton x-100) in 0.1%(w/v) 소디움사이트레이트 용액(sodium citrate solution)으로 얼음 위에서 2분간 반응시켰다. 세척용액으로 씻어낸 후 다시 3% 과산화수소(H₂O₂) 실온에서 5분간 반응시켰다. 세척용액으로 세척 후 인시튜세포사멸분석세트(In Situ Cell Death Det. Kit, POD (Roche))에 있는 효소용액을 1시간, 뒤집어 사용하는(Converted-POD solution)용액을 30분 37℃ 항온기에서 반응시켰다. 발색용액(DAB solution)을 통해 염색시킨 후 슬라이드에 고정한 뒤 현미경으로 관찰하여 도 4의 D에 나타내었다.

[DAPI　염색(Staining)]

24웰 판에 슬라이드덮개(cover slide)를 넣고 위암세포(SUN668 cell)를 분주하여 HJ001(200ug/ml)을 24시간 처리하였다. 배양액를 제거한 다음 메탄올(methanol)에서 5분간 반응한 후 DAPI 활성용액(DAPI working solution)을 넣은 후 37℃ 에서 20분간 반응시켰다. 활성용액을 제거 후 유리판(Slide glass)에 유리판덮개(cover slide)를 뒤집어 붙인 후 형광현미경으로 관찰하여 도 4의 F에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 조직 안에서 세포사멸을 검출하고 정량하는데 가 장 보편적으로 쓰이는 턴넬(TUNEL)과 다피(DAPI) 염색법을 통해 형태학적, 생화학적 관찰을 한 결과 HJ001 모두 200ug/ml의 농도에서 아포프토시스적 특성을 나타냈다. 이때, A, C, E는 대조군이다.

<실시예 3> 서방 분석(Western blot)을 이용한 세포사멸의 검증

서방블롯분석(Western Blot Analysis)

위암세포(SUN668 cell)에서 HJ001을 24시간 처리 후 단백질용해용액(protein lysis buffer)을 통해 단백질을 추출한 후 브레드포드방법(Bradford method)를 통해 단백질을 정량하였다. SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)을 전기영동하여 단백질을 크기별로 분리한 후 얇은 막 (Nitrocellulose membrane)에 전이하였다. 블로킹용액에 1시간 반응시킨 다음 1배 세척용액(1X TBST)로 세척하였다. 비시엘2(BCL2), 박스(BAX), 케스페이스3(CASP3)의 항체(antibody)를 1배 세척용액을 이용하여 1000:1로 희석하고, 1시간 동안 반응시켰다. 1배 세척용액으로 세척한 다음 각각 1차 항체를 인지하는 2차 항체를 희석한 후 30분 배양(incubation)하였다. 1배 세척용액으로 다시 세척한 후 발현증가약물 [enhanced chemiluminescence (R&D)]를 통해 발색하여 도 5에 나타내었다.

도 5에 도시된 바와 같이, 서방분석을 이용하여 단백질발현양상을 보았을 때 HJ001(200ug/ml)은 비시엘2(BCL2)의 단백질발현은 감소하였고 박스(BAX), 케스페이스3(CASP3)의 단백질발현은 증가하는 효과를 보여주었다. 이러한 결과는 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR)결과와 같은 양상을 확인할 수 있었다.

<실시예 4> 청피의 항산화 효과 검증

DPPH 항산화활성 반응(1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH) free radical scavenging activity)

맹검(Blank)과 대조(Control)에 에탄올 50ul을 HJ001에는 에탄올 40ul을 96웰(well)에 넣었다. 실험군은 HJ001을 1mg/ml, 100ug/ml의 농도로 각 10ul씩 각 웰에 넣고 에탄올에 들어있는 DPPH 1mM을 각 well에 50ul씩 넣는다. 양성 대조군으로 비타민C(10mM)를 사용하였고, 30분간 실온에서 반응한 뒤에 엘라이자(Elisa)로 540nm에서 측정하여 값을 구한 후 활성효과 백분율[Scavenging effect(%)=(1-A1/A0)×100(A0:Control 흡광도, A1:Sample흡광도)]를 이용하여 항산화 생리 활성 효과를 계산하여 도 6의 그래프에 나타내었다.

도 6의 그래프에 나타난 바와 같이, HJ001의 항산화 효과를 DPPH 항산화활성 반응[1,1-Diphenyl-2- picryl-hydrazyl(DPPH) free radical scavenging activity] 방법을 통해 엘라이자 파장 540nm에서 측정한 결과 양성대조군인 비타민C 에 비해 항산화생리활성도가 낮은 것으로 보아 항산화 효과는 없는 것으로 나타났다.

<실시예 5>

케스페이지 3(Caspase-3) 활성효과는 아폽토시스에서 중요한 역할을 하며, 케스페이지 3(caspase-3)의 활성화는 아폽토시스의 표지 인자로서 제안되고 있다. 따라서 HJ001의 처치가 사람 위암 세포에서 케스페이지 3을 활성화시키며 아폽토시 스를 일으키는지 알아보았다. 사람의 위암 세포에 HJ001이 처치되었고, 세포는 세포막제거용액에 의해 세포막을 제거하였다. 여기에 케스페이지 3의 기질인 DEVD 펩타이드-니트로아닐라이드(pNA)를 넣어 그 활성도를 측정하여 도 7의 그래프로 나타내었다. 이 기질이 케스페이지 3에 의해 잘려진 pNA의 흡광도 (405nm) 값으로 정량되었다.

도 7에 도시된 바와 같이, 케스페이지 3의 활성은 HJ001의 처치로 현저하게 증가되는 것을 볼 수 있었다. 양성 대조군으로서 케스페이지 3이 사용되었으며, Ac-DEVD-CHO는 케스페이지 3 억제자로서 음성 대조군으로 사용되었다.

<실시예 6> 청피의 항염증 효과 검증

사람 위암 세포는 2시간 전에 혈청을 제거하였다. 실험군에는 HJ001이 200 μg/ml의 농도로 24시간 동안 처치되었으며, 대조군에는 동량의 생리식염수가 처치되었다. 24시간 후 세포의 배지를 채취하여 싸이토카인 항체 배열칩(RayBiotech, Inc.)를 이용하여 싸이토카인 칩를 실시하였다. 22 종류의 항체가 집적된 막은 비특이성 물질을 억제하기 위하여 억제용액(blocking buffer)으로 억제되었다. 억제액을 제거 후 채취된 배양액를 넣고 배양한 후, 바이오틴보체항체 (biotin conjugated antibody)를 각각의 막에 넣고 2 시간동안 배양하였다. 마지막으로 2차 보체항체 (HRP-conjugated streptavidin)를 넣어 2 시간 동안 배양하고, 판독시약(Detection reagent)를 이용하여 각각의 막들을 엑스레이 필름에 발현시켜 도 8 내지 도 15에 나타내었다

도 8에 나타난 바와 같이, 항염증 관련 단백질 발현이 나타난 것을 확인할 수 있었으며, 도 9 내지 도 14에 도시된 바와 같이, HJ001은 IL-3, IL-6, IL-12p40p7 0, IL-12p70, SCF과 같은 항염증 단백질을 감소시켰으며, IL-10, TNF와 같은 단백질은 증가시켰다. 이것은 점들(blot)의 농도를 측정하여 다시 한번 확인되었다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 청피로부터 분리한 우수한 항암 활성을 가지는 추출물질을 제공할 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명의 청피로부터 추출된 항암물질인 TLC에 의해 확인할 수 있었으며, HJ001은 아포프토시스적 특성을 확인하여 우수한 항암활성을 확인되었으므로, 효과적인 항암 성분으로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 청피로부터 추출된 HJ001 항염증과 관련된 단백질에서 우수한 항염증 효과가 있음을 확인하였음으로 항염증 성분으로 활용할 수 있다.

Claims

청피로부터의 추출물을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 항암, 항염증 치료제.
제 1 항에 있어서, 상기 청피로부터의 추출물은 HJ001인 것을 특징으로 하는 항암, 항염증 치료제.
청피 분말을 물에 넣어 냉침하고 여과하는 단계와;

충진제를 넣은 칼럼을 세척한 다음, 상기 청피 분말의 여과액을 칼럼에 통과시켜 흡착되지 않고 나온 액을 모으는 단계와;

상기 비흡착액을 수포화시킨 에틸아세테이트와 혼합하여 에틸아세테이트층으로 이행시키는 단계와;

상기 에틸아세테이트층과 물층이 층 분리가 형성되면, 물층을 분리하는 단계와;

상기 분리된 물층을 수포화시킨 부탄올과 혼합하여 부탄올층과 물층으로 층 분리되면 부탄올층을 분리하는 단계와;

상기 분리된 부탄올층을 TLC 실리카에 흡수시키는 단계와;

상기 TLC 좌 안에 전개용매를 채운 후, 한 쪽 면을 한지로 붙이는 단계와;

상기 한지가 전개용매를 흡수한 후에 TLC판을 TLC좌 안에 넣고 전개시키는 단계와;

TLC판을 건조시킨 후 구획으로 분리하는 단계와;

상기 분리된 구역에 해당하는 티엘시의 실리카 부분을 분리하는 단계와;

상기 분리된 실리카 부분을 부탄올에 녹인 후 여과하여 농축시키는 단계와;

상기 농축된 여과액을 동결건조시켜 침착물인 Fr.1, Fr.2 물질을 수득하는 단계;

상기 침착물 중에서 Fr.2 물질을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 HJ001의 추출방법.
제 3 항에 있어서, 상기 충진제는 HP-20인 것을 특징으로 하는 HJ001의 추출방법.
제 3 항에 있어서, 상기 전개용매는 클로로폼(Chloroform) : 메탄올 : 물이 6 : 4 : 1로 이루어진 것을 특징으로 하는 HJ001의 추출방법.