KR20070093118A

KR20070093118A - 녹내장의 치료를 위한 혈청 아밀로이드 Ａ의 ＲＮＡｉ저해

Info

Publication number: KR20070093118A
Application number: KR1020077016521A
Authority: KR
Inventors: 아보트 에프. 클라크; 완-헝 왕; 로레타 멕네트
Original assignee: 알콘, 인코퍼레이티드
Priority date: 2004-12-23
Filing date: 2005-12-19
Publication date: 2007-09-17
Also published as: TW200634153A; MX2007007388A; CN101124322A; AR051848A1; CN102172407A; EP1831369B1; US20150225720A1; WO2006071691A8; PL1831369T3; TWI401316B; ZA200704936B; JP2015044858A; KR101311275B1; US20060172961A1; US20140357692A1; WO2006071691A2; CN101124322B; US20120122961A1; AU2005322228A1; BRPI0516378A

Abstract

SAA 발현이 수반되는 녹내장에 있어서 혈청 아밀로이드 A mRNA 발현의 저해용 RNA 간섭이 제공된다.

Description

녹내장의 치료를 위한 혈청 아밀로이드 Ａ의 ＲＮＡｉ저해 {RNAi INHIBITION OF SERUM AMYLOID A FOR TREATMENT OF GLAUCOMA}

본 발명은 녹내장, 특히 원발개방각녹내장(primary open angle glaucoma) 혈청 아밀로이드 A(SAA) 발현의 저해를 위한 간섭 RNA 조성물에 관한 것이다.

녹내장은 임의의 임상적 특징을 공유하는 시각 신경병증의 외생 그룹의 하나이다. 녹내장에 있어서, 시력 상실은 감각신경 망막 중의 망막 신경절 세포의 선택적인 사멸에 기인하며, 시각 분야, 신경 섬유 층의 결손, 및 시각 신경 해드(optic nerve head, ONH)의 진행성 함몰에 있어서의 특징적 변화에 의하여 임상적으로 진단된다. 녹내장 발생의 주요 위험 인자 중의 하나는 고안압증(ocular hypertension, 안내압의 증가, IOP)의 존재이다. 적당한 안내압은 안구의 모양 유지 및 무혈관의 각막 및 수정체로 방수(aqueous humor)가 흐르도록 하기 위한 압력 그래디언트를 제공하기 위하여 필요하다. IOP는 정상 IOP라고 종종 생각되는 것을 갖는 환자에서 정상압 녹내장의 발병기전에 수반되는 것으로도 보인다.

녹내장에 수반되는 IOP의 증가는 안구전방(ocular anterior chamber)의 홍채-각막 각(iris-corneal angle)에 위치하는 특화된 소형 조직인 소주망(trabecular meshwork, TM)에서의 방수 유출 저항성의 증가에 기인한다. TM에서의 녹내장성 변 화는 TM 세포의 손실 및 단백질성 플래이크-유사 물질(proteinaceous plaque-like material)을 포함하는 세포외 파편(extracellular debris)의 침전 및 축적을 포함한다. 또한, 녹내장성 ONH에서 발생하는 변화도 있다. 녹내장성 안구에서는, ONH 글리얼 세포의 형태 및 이동도에 변화가 있다. 상승된 IOP 및/또는 일과성 허혈발작(transient ischemic insult)에 대한 반응으로, ONH 세포외 매트릭스의 조성이 변화하고 글리얼 세포 및 망막 신경절 세포 액손 형태가 변화한다.

원발성 녹내장(primary glaucoma)는 해부학적으로 또는 생리학적 근거를 가지는 안구내액의 흐름의 방해에서 기인한다. 속발성 녹내장은 선재하던 질병 또는 안구의 상해 또는 손상의 결과 발생한다. 원발개방각녹내장 (POAG)은 만성 또는 단순 녹내장으로도 알려져 있으며, 모든 원발성 녹내장의 90%를 차지한다. POAG는 소주망의 퇴화를 특징으로 하며, 그 결과 안구로부터의 액의 유출에 대해 비정상적으로 높은 저항성을 갖게 된다. 이러한 저항성의 결과는 IOP에서의 증가이며, 이는 안구 전체에서 증가된 저항성에 의해 정상적으로 생산된 액을 이동시키는데 필요하다.

현재의 항-녹내장 치료법은 방수 형성의 억제제 또는 포도막 공막 유출(uveoscleral outflow)을 증가시키는 제제, 레이저 섬유주성형(laser trabeculoplasty), 또는 유출을 증진시키는 여과 수술인 섬유주절제(trabeculectomy)를 사용하여 IOP를 낮추는 것을 포함한다. 약제학적 항-녹내장 접근법은 바람직하지 않은 다양한 부작용을 나타낸다. 예를 들면, 축동제, 예컨대 필로카핀은 시력혼탁 및 기타 부정적인 시각 부작용을 일으킬 수 있다. 전신적으로 투여된 탄산탈수효소 억제제(carbonic anhydrase inhibito)는 구토, 소화불량, 피로 및 대사산증을 야기할 수 있다. 또한, 몇몇 베타-차단제는 폐 조직의 베타-2 수용체에 대한 그들의 영향에 기인하는 심각한 폐의 부작용과 더욱 관련된다. 교감신경성약(Sympathomimetics)은 빈맥(tachycardia), 부정맥(arrhythmia) 및 고혈압을 야기한다. 상기 부정적인 부작용은 환자 복약순응도를 감소시키거나 치료의 중단을 야기할 수 있다.

보다 중요한 것은, 현재 항-녹내장 치료법은 소주망, 시각 신경 및 망막 신경절 세포 및 액손의 손실의 약해지지 않고 계속되는 병리적 손상을 직접 표적하는 것이 아니라는 점이다. 녹내장의 중요성 및 기존 치료법의 결점의 관점에서, 그 진행의 근본적인 원인을 표적으로 하는 향상된 녹내장의 치료법이 바람직하다.

발명의 요약

본 발명은 직접 SAA mRNA을 표적하여 그에 의하여 SAA mRNA 발현을 저해하는 간섭 RNA에 관한 것이다. 본 발명의 간섭 RNA는 SAA-관련 녹내장의 치료에 유용하다.

본 발명의 구체예에서, 대상의 안구에서 혈청 아밀로이드 A mRNA의 발현을 약화시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 19 내지 49개 뉴클레오길이를 갖는 유효량의 간섭 RNA, 예컨대 이중-가닥(ds) siRNA 또는 단일-가닥 (ss) siRNA 및 약제학 적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상의 안구에 투여하는 것을 포함한다.

이중 가닥 siRNA는 센스 뉴클레오티드 서열, 안티센스 뉴클레오티드 서열 및 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 부위를 포함한다. 또한, 안티센스 서열은 SAA1, SAA2 및 SAA4를 코딩하는 DNA의 센스 서열인 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3 각각에 상응하는 mRNA 부분과 생리학적 조건하에서 하이브리드되며 (GenBank reference no. NM_000331, BC020795, 및 NM_006512), 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3에 각각 상응하는 하이브리드화 mRNA 부분과 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 부위를 갖는다. 상기 조성물의 투여는 대상의 안구의 혈청 아밀로이드 A mRNA의 발현을 약화시킨다.

간섭 RNA가 단일-가닥인 경우, 간섭 RNA는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3에 상응하는 하이브리드화 mRNA 부위와 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 부위를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명의 구체예에서, 안티센스 siRNA는 뉴클레오티드 230, 357, 362, 380, 447, 470, 527, 531, 548, 또는 557에서 시작하는 서열번호 1에 상응하는 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 표적화하도록 설계된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 안티센스 서열은 뉴클레오티드 43, 170, 175, 193, 260, 283, 339, 또는 370에서 시 작하는 서열번호 2에 상응하는 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 표적화하도록 설계된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 안티센스 서열은 뉴클레오티드 252, 271, 276, 325, 또는 343에서 시작하는 서열번호 2에 상응하는 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 표적화하도록 설계된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 안티센스 서열은 뉴클레오티드 153, 166, 222, 227, 251, 268, 297, 335, 356, 384, 390, 396, 406, 또는 423에서 시작하는 서열번호 3에 상응하는 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 표적화하도록 설계된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 치료를 요하는 대상에서 혈청 아밀로이드 A-관련 녹내장을 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 19 내지 49개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 유효량의 간섭 RNA 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물, 센스 뉴클레오티드 서열, 안티센스 뉴클레오티드 서열 및 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 부위를 포함하는 간섭 RNA를 대상의 안구에 투여하는 것을 포함한다. 안티센스 서열은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3에 상응하는 mRNA 부분과 생리학적 조건하에서 하이브리드되며, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3과 각각 상응하는 하이브리드화 mRNA부위와 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 부위를 갖는다. 혈청 아밀로이드 A-관련 녹내장은 이로써 치료된다.

"RNAi"라 명명되는 RNA 간섭은 소형 단일-또는 이중-가닥 RNA 분자에 의해 영향받는 표적 유전자의 발현을 감소시키는 방법이다. 간섭 RNA는 소형 간섭 RNA들을 포함하며, 이중-가닥 또는 단일-가닥(ds siRNAs 또는 ss siRNAs), microRNAs (miRNAs), 작은 헤어핀 RNAs(shRNAs) 등을 포함한다. 이론에 구애됨이 없이, RNA 간섭은 dsRNA 전구체가 약 20 내지 25개 뉴클레오티드의 길이의 작은 RNA로 절단(cleavage)되면서 생체내에서(in vivo) 일어나는 것으로 보인다. 절단은 RNaseIII-RNA 헬리카제 다이서(RNaseIII-RNA helicase Dicer)에 의해 수행된다. siRNA의 "센스"가닥, 즉, 표적 mRNA 서열과 정확하게 같은 서열을 갖는 가닥이 제거되고, mRNA의 발현을 감소시키는 기능이 있는 표적 mRNA에 대해 상보적인 "안티센스" 가닥이 남는다. siRNA의 안티센스 가닥은 mRNA에 대해 RISC (RNA-induced silencing complex)로 알려진 단백질 복합체를 유도하는 것으로 보이며, 이 복합체는 그 후 RISC의 아고노트(Argonaute) 단백질로 mRNA를 절단하며, 그로 인하여 mRNA에 의한 단백질의 생성이 감소한다. 간섭 RNA는 촉매성이 있고, mRNA의 발현의 감소는 mRNA와 관련이 있는 화학양론적 양의 간섭 RNA로 수행될 수 있다. mRNA 발현의 감소는 전사 및 번역 메커니즘을 경유하여 일어날 수도 있다.

본 발명은 시각 장애에 있어서, 혈청 아밀로이드 A(SAA)의 발현을 저해하는 간섭 RNA의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 외인성으로 제공된 siRNA는 안구 구조의 SAA mRNA의 침묵에 영향을 준다. 본 발명의 발명자들은 이전에 혈청 아밀로이드 A(SAA) mRNA의 발현 및 단백질이 녹내장성 TM 조직 및 세포에서 현저하게 업레귤레이션되는 것을 보인 바 있다 (미국특허출원 USSN 60/530,430 계속 중, "녹내장의 진단 및 치료에 있어서의 혈청 아밀로이드 A 유전자의 용도 및 항-녹내장 약제의 확인" 2003년 12월 17일 파일됨). 본 발명의 발명자들은 아피메트릭(Affymetrix) 유전자 칩을 사용하여 실시간 정량 폴리머라제 체인 반응(real time quantitative polymerase chain reaction, QPCR)에 의하여 특이한 mRNA 발현을 보이는 것을 증명하였으며, SAA ELISA로 SAA 단백질 레벨의 증가를 증명하였다 (상기 언급한 미국 특허출원 계속중, 본 명세서에 참고문헌으로 언급됨).

본 명세서에 언급된 핵산 서열은 달리 지정하지 않는 한 5'에서 3'의 방향으로 명시하였다. 본 명세서의 "핵산"이라는 용어는 DNA 또는 RNA를 말하거나, 또는 그의 변형된 형태를 말하며 DNA에 존재하는 퓨린 또는 피리미딘 염기를 포함하거나 (아데닌은 "A," 사이토신은 "C," 구아닌은 "G," 티민은 "T"), 또는 RNA에 존재하는 퓨린 또는 피리미딘 염기를 포함한다(아데닌은 "A," 사이토신은 "C," 구아닌은 "G," 우라실은 "U"). 본 발명에서 제공되는 간섭 RNA는 비록 RNA에서 "T"염기가 자연발생적으로 생겨난 것이 아니라고 할지라도, 특히 3' 말단에 "T"염기를 포함할 수 있다. "핵산"은 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"라는 용어를 포함하며, 단일 가닥 분자 또는 이중 가닥 분자를 의미할 수 있다. 이중 가닥 분자는 A 및 T 염기사이, C 및 G 염기 사이, A 및 U 염기 사이의 왓슨-크릭 염기 접합에 의해 형성된다. 이중 가닥 분자의 가닥은 서로 부분적으로, 상당하게 또는 전체적으로 상보적일 수 있으며, 이중의 하이브리드를 형성할 것이며, 그 본딩의 강도는 염기 서열의 상보성의 본질 및 정도에 의존한다. mRNA 서열은 그들 대신 코딩되는 DNA의 센스 또는 안티센스 서열을 알면 쉽게 결정된다. 예를 들면, 서열번호 1은 혈청 아밀로이드 A1에 대한 mRNA에 상응하는 DNA의 센스 가닥 서열을 제공한다. mRNA의 서열은 "T" 염기가 "U" 잔기로 대체된 DNA의 센스 가닥의 서열과 동일하다. 그러므로, 혈청 아밀로이드 A1의 mRNA 서열은 서열번호 1로부터 알게되며 혈청 아밀로이드 A2의 mRNA 서열은 서열번호 2로부터, 혈청 아밀로이드 A4의 mRNA 서열은 서열번호 3으로부터 알게 된다.

혈청 아밀로이드 A mRNA:

인간 혈청 아밀로이드 A는 염색체 11의 짧은 암에 위치하는 유전자에 의해 코딩되는 많은 소형의, 특이하게 발현하는 아포지단백(apolipoproteins)을 포함한다. 여기에는 SAA의 네 가지 아형(isoform)이 있다. Ncbi.nlm.nih.gov의 생명과학 정보 내셔널 센터(National Center for Biotechnology Information)의 젠뱅크 데이타베이스(GenBank database)에서는 참조번호 NM_000331로서의 혈청 아밀로이드 A1의 mRNA에 상응하는 DNA 서열을 제공하고 있으며, 하기 서열번호 1로 제공된다. 혈청 아밀로이드 A1에 대한 코딩 서열은 뉴클레오티드 225-593로부터이다.

SAAl: 서열번호 1:

상기 언급한 SAA1 mRNA 서열의 동등체(equivalents)는 스플라이스(splice) 형태, 대립형질(allelic) 형태, 또는 그들과 동일기원(cognite)의 형태일 수 있다. 동일기원은 서열번호 1과 상동인 다른 포유류종으로부터의 혈청 아밀로이드 A1 mRNA이다. 서열번호 1과 관련된 SAA1 핵산 서열은 젠뱅크 접근 번호 NM_009117 (마우스로부터), NM_199161 (인간 전사 변이체 2, human transcript variant 2), BC007022.1, BG533276.1, BG567902.1, BQ691948.1, CD102084.1, M10906.1, M23698.1, X51439.1, X51441.1, X51442.1, X51443.1 및 X56652.1를 갖는 것들이다.

젠뱅크 데이타베이스는 참조번호 NM_ BC020795로서의 혈청 아밀로이드 A2의 mRNA에 상응하는 DNA 서열을 제공하고 있으며, 하기 서열번호 2로 제공된다. 혈청 아밀로이드 A2에 대한 코딩 서열은 뉴클레오티드 38-406로부터이다.

서열번호 2:

상기 언급한 SAA2 mRNA 서열의 동등체(equivalents)는 스플라이스(splice) 형태, 대립형질(allelic) 형태, 또는 그들과 동일기원(cognite)의 형태일 수 있다. 동일기원은 서열번호 2과 상동인 다른 포유류종으로부터의 혈청 아밀로이드 A2 mRNA이다. 서열번호 2와 관련된 SAA2 핵산 서열은 젠뱅크 접근 번호 NM_030754 (인간) BC058008.1, J03474.1, L05921.1, M23699.1, M23700.1, M26152.1, X51440.1, X51444.1, X51445.1, 및 X56653.1를 갖는 것들이다.

서열번호 1 및 서열번호 2 (SAA1 및 SAA2)의 단백질 생성물은 급성기 반응물질(acute phase reactants)로 알려져 있으며, C-반응성 단백질과 유사하고, 그들은 염증전 사이토카인(proinflammatory cytokine)에 의해 급격하게 업레귤레이션된다. SAA1 및 SAA2 단백질은 아미노산 레벨이 93.5% 동일하고, 유전자는 뉴클레오티드 레벨에서 96.7% 동일하다.

젠뱅크 데이타베이스는 참조번호 NM_006512로서의 혈청 아밀로이드 A4의 mRNA에 상응하는 DNA 서열을 제공하고 있으며, 하기 서열번호 3으로 제공된다. 혈청 아밀로이드 A4에 대한 코딩 서열은 뉴클레오티드 76 - 468로부터이다.

서열번호 3:

SAA4는 낮은 레벨의 구조적으로 발현된 유전자이다. 상기 언급한 SAA mRNA 서열의 동등체는 스플라이스(splice) 형태, 대립형질(allelic) 형태, 또는 그들과 동일기원(cognite)의 형태일 수 있다. 동일기원은 서열번호 3과 상동인 다른 포유류종으로부터의 혈청 아밀로이드 A4 mRNA이다. 서열번호 3와 관련된 SAA4 핵산 서열은 젠뱅크 접근 번호 BC007026, M81349.1, 및 S48983.1를 갖는 것들이다.

mRNA의 발현 약화:

본 명세서에 사용된 "mRNA의 발현을 약화시키는 것"이라는 표현은 세포내에서 표적 유전자의 전체 mRNA 전사 레벨을 감소시키는 결과를 줄 수 있는 양의 간섭 RNA를 투여하여 mRNA가 단백질로 전사되는 것을 스크램블된 서열(scrambled sequence)을 갖는 대조군 RNA에 비하여 감소시키는 것을 의미한다. mRNA의 발현의 감소는 보통 mRNA의 "녹-다운"으로 나타낸다. 여기에서, 50% 및 100%의 양을 포함하여 그 사이의 양의 발현의 녹-다운이 구체예로 예상된다. 그러나, 본 발명의 목적을 위해 수행되는 상기 녹-다운 레벨은 불필요하다. 또한, 간섭 RNA의 두 세트가 개별적으로 녹-다운에 약한 영향을 미칠 수 있으나, 함께 투여되는 경우 현저하게 더욱 유효할 수 있다. 하나의 구체예에서, 개개의 ds siRNA는 적어도 70%까지의 양에서 녹-다운되었을 때 유효하다. 또 다른 구체예에서, 두 개 이상의 ds siRNA는 적어도 70%까지의 양에서 녹-다운될 때 함께 유효하다.

녹-다운은 보통 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(Quantitative Polymerase Chain Reaction, QPCR) 증폭으로 mRNA 레벨을 결정하거나 또는 웨스턴 블랏 또는 효소 결합 면역흡수분석법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)으로 단백질의 레벨을 결정하여 측정된다. 단백질 레벨의 분석은 RNA 유도성 침묵 복합체(RNA Induced Silencing Complex (RISC))에 의한 mRNA 분해 뿐만 아니라 전사 저해의 결과를 제공한다. 또한, 녹-다운을 측정하는 기술로는 RNA 용액 하이브리드화, 뉴클레아제 보호, 노던 하이브리드화, 역전사, 마이크로어레이로의 유전자 발현 모니터링, 항체 결합, 표지면역검정(radioimmunoassay), 및 형광 활성화 세포 분석(fluorescence activated cell analysis)이 포함된다.

인간 또는 포유류에 있어서, SAA의 저해는 녹내장 증상의 발전 예컨대 안내압의 상승, 시야 손실(visual field loss)의 상승, 또는 시신경유두(optic nerve head)의 변화의 관찰에 의해 추론할 수 있다.

본 발명의 구체예의 간섭 RNA는 촉매성 매너로 작용하는데, 즉, 화학양론적 양의 간섭 RNA는 표적 mRNA의 저해에 영향을 줄 수 있다. 치료효과를 제공하기 위해 요구되는 간섭 RNA의 양은 안티센스 치료법에 비하여 현저하게 더 적다.

이중-가닥 간섭 RNA:

본 명세서 중의 이중 가닥 간섭 RNA (ds siRNA라고도 불림)은 센스 뉴클레오티드 서열 및 안티센스 뉴클레오티드 서열을 가지며, 센스 및 안티센스 서열은 적어도 19개 뉴클레오티드와 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 부위를 포함한다. 간섭 RNA의 길이는 19 내지 49개 뉴클레오티드이며, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 또는 49개 뉴클레오티드의 길이를 포함한다. ds siRNA의 안티센스 서열은 생리적 상태에서 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 서열번호 3의 부분과 하이브리드되며, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3 각각의 하이브리드화 부분과 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성을 갖는다.

siRNA의 안티센스 가닥은 안티센스 가닥이 세포 내에서 RISC 복합체에 결합하고, 결합된 복합체가 안티센스 RNA의 서열에 상보적인 서열에서 mRNA에 특이하게 결합하도록 유도함으로써, 결합된 복합체에 의해 mRNA가 순차적으로 절단이 되도록 하게 한다는 점에서 siRNA의 활성있는 유도 제제(guiding agent)이다.

siRNA에 대한 표적 서열을 선별하는 기술은 2004년 5월 6일 개정된 "The siRNA User Guide,"에서 Tuschl, T. 등에 의해 제공된 바 있으며, 록펠러 대학교 웹사이트에서 볼 수 있다. 또한, 엠비온 웹사이트(Ambion's web site)에 있는 Technical Bulletin #506, "siRNA Design Guidelines," Ambion Inc., min 35%, max 55% G/C 콘텐트를 사용하여 인비트로젠 웹사이트에서, 및 다마콘 웹사이트(Dharmacon web site)에서 제공하고 있다. 표적 서열은 mRNA의 코딩 부위 또는 5' 또는 3' 미전사 부위에 위치할 수 있다.

SAA1에 대한 DNA 표적 서열의 구체예는 서열번호 1의 뉴클레오티드 531 내지 549에 존재한다:

서열번호 4에 상응하는 mRNA 서열을 표적화하는 본 발명의 이중 가닥 siRNA 및 각 가닥상에 3'UU 오버행을 갖는 본 발명의 이중 가닥 siRNA는:

3' 오버행(overhang)은 많은 "U" 잔기를 가질 수 있으며, 예컨대, 2, 3, 4, 5, 및 6을 포함하여 이들 사이의 수의 "U" 잔기를 가질 수 있다. 5' 말단은 뉴클레오티드의 5' 오버행을 가질 수도 있다. 서열번호 4에 상응하는 mRNA 서열을 표적화 하고 각 가닥상에 3'TT 오버행을 갖는 본 발명의 이중 가닥 siRNA는:

이중-가닥 siRNA의 가닥은 하기와 같이 단일 가닥 siRNA를 형성하기 위하여 헤어핀 루프로 연결될 수 있으며:

N은 뉴클레오티드 A, T, C, G, U, 또는 이 기술분야의 공지기술로 알려진 변형된 형태이다. 뉴클레오티드 N의 개수는 3 및 23을 포함하여 3 내지 23개이거나, 5 및 15를 포함하여 5 내지 15개이거나, 7 및 13을 포함하여 7 내지 13개이거나, 4 및 9를 포함하여 4 내지 9개이거나, 9 및 11을 포함하여 9 내지 11개이며, 또는 뉴클레오티드 N의 갯수는 9개이다.

표 1은 본 발명의 siRNA가 상기 언급한 매너로 디자인된 것으로부터 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 SAA DNA 표적 서열의 예를 나타낸 것이다.

표 1. siRNA에 대한 SAA 표적 서열

상기 예에 나와 있는 바와 같이, 이 기술분야의 기술자는 표 1에 제공된 표적 서열 정보를 이용하여 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 서열 포지션을 참조하고, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3 각각에 대해 상보적이거나 거의 상보적인 뉴클레오티드를 첨가 또는 제거시킴으로써 표 1에 제공된 서열보다 짧거나 더 긴 길이를 갖는 간섭 RNA를 디자인할 수 있다.

이중 가닥 또는 단일 가닥 siRNA에 의해 유도되는 표적 RNA 절단 반응은 서열특이성이 매우 높다. 일반적으로, 표적 mRNA의 부분 및 센스 서열에 대해 정확히 상보적인 안티센스 부분과 동일한 센스 뉴클레오티드 서열을 함유하는 siRNA는 SAA mRNA의 저해를 위한 siRNA 구체예이다. 그러나, siRNA의 안티센스 가닥과 표적 mRNA 사이에 100% 서열 상보성은 본 발명을 실시하는 데 필수적이지는 않다. 따라서, 본 발명에서는 유전적 변이, 스트레인 다형성(strain polymorphism), 또는 진화적 차이에 기인하여 생길 수 있는 서열 다양성이 허용된다. 예를 들면, 표적 서열에 대하여 삽입, 제거, 또는 싱글 포인트 변이가 된 siRNA 서열은 저해에 유효하다.

본 발명의 임의의 구체예에서, 안티센스 서열은 CUUUGCCACUCCUGCCCCA (서열번호 37) 또는 UCGGAAGUGAUUGGGGUCU (서열번호 38)을 포함하며, 안티센스서열은 서열번호 1에 상응하는 mRNA 부분과 하이브리드화된다.

또한, 본 발명의 구체예에서, 안티센스 서열은

를 포함하며, 안티센스 서열은 서열번호 1에 상응하는 mRNA 부분 또는 서열번호 2에 상응하는 mRNA 부분과 하이브리드화된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 안티센스 서열은

를 포함하며, 서열번호 2에 상응하는 mRNA 부분과 하이브리드화된다.

상기 언급된 방법은 안티센스 서열이

을 포함하고, 안티센스 서열은 서열번호 3에 상응하는 mRNA 부분과 하이브리드화되는 방법을 포함한다.

siRNA의 안티센스 서열은 mRNA의 표적서열과 적어도 19개 뉴클레오티드와 거의-완벽한 인접 상보성을 갖는다. 본 명세서 중의 "거의-완벽한"은 siRNA의 안티센스 서열이 "실질적으로 상보적" 이고, siRNA의 센스 서열이 표적 mRNA의 부분과 적어도 "실질적으로 동일한"것을 의미한다. 이 기술분야에 통상적으로 알려진 바와 같이 "동일성"은 서열사이의 뉴클레오티드의 순서를 매칭시켜 측정된 뉴클레오티드 서열 사이의 서열 관련성의 정도이다. 일 구체예에서, 표적 mRNA 서열에 대하여 80% 및 80% 에서 100% 까지의 상보성을 갖는 안티센스 RNA는 거의-완벽한 상보성이 있다고 볼 수 있고, 본 발명에 사용될 수 있다. "완벽한" 인접 상보성은 인접하는 염기 쌍의 표준 왓슨-크릭 염기 접합이다. "적어도 거의-완벽한"인접 상보성은 "완벽한" 상보성을 포함하는 개념이다. 동일성 또는 상보성을 측정하기 위한 컴퓨터적 방법은 뉴클레오티드 서열의 매칭 정도가 매우 높은 것을 제공하기 위하여 디자인되며, 예컨대 BLASTP 및 BLASTN (Altschul, S.F., et al. (1990) J. MoI. Biol. 215:403-410), 및 FASTA를 들 수 있다.

서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 표적 서열은 mRNA의 5' 또는 3' 미전사 부위 뿐만 아니라 mRNA의 코딩 부위에 존재할 수 있다.

이중-나선 간섭 RNA의 한 가닥 또는 양 가닥은 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 또는 그의 혼합물일 수 있는 1 내지 6 뉴클레오티드의 3' 오버행을 가질 수 있다. 오버행의 뉴클레오티드는 염기-접합된 것이 아니다. 본 발명의 일구체예에서 간섭 ds RNA는 TT 또는 UU의 3' 오버행을 포함한다.

이중 나선 siRNA의 센스 및 안티센스 가닥은 상기 기재된 바처럼 두 단일 가닥이 이중 형성되어 존재할 수 있거나 상보성 부위가 염기-접합되고 헤어핀 또는 루프로 공유적으로 연결되어 단일 가닥을 형성하도록 단일분자로 존재할 수 있다. 헤어핀은 다이서(Dicer)로 명명된 단백질에 의해 세포간적으로 절단되어 두 개의 개개의 염기-접합된 RNA 분자의 간섭 RNA를 형성한다.

간섭 RNA는 첨가, 제거, 치환 또는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 변형되어 자연발생적으로 생겨난 RNA와는 다를 수 있다. 비-뉴클레오티드(Non-nucleotide) 물질이 간섭 RNA에 결합할 수 있으며, 5' 말단, 3' 말단 또는 내부적으로 결합할 수 있다. 상기 변형은 간섭 RNA의 뉴클레아제 저항성을 증가시키기 위하여, 세포의 업테이크를 향상하기 위하여, 세포의 표적팅을 증진시키기 위하여, 간섭 RNA를 모사하는 것을 보조하기 위하여 또는 안정성을 더욱 증진시키기 위하여 흔히 디자인된다. 예컨대, 간섭 RNA는 오버행의 말단에 퓨린 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 피롤리딘 링커를 사용하여 이중가닥 siRNA 분자의 센스 가닥의 3' 말단에 콜레스테롤이 접합시키면, 예컨대 siRNA에 대해 안정성을 제공할 수도 있다. 추가적 변형으로는 예컨대 3' 종말 비오틴 분자, 세포-투과 특성을 갖는다고 알려진 펩티드, 펩티도미메틱, 형광 다이, 또는 덴드리머를 포함한다.

뉴클레오티드는 그들의 염기 부분, 그들의 당부분, 또는 분자의 인산염 부분이 변형될 수 있으며, 본 발명의 구체예에서 기능할 수 있다. 변형은 예컨대, 알킬, 알콕시, 아미노, 데아자(deaza), 할로, 히드록실, 티올 그룹, 또는 그들의 조합으로 치환된 것을 포함한다. 뉴클레오티드는 예컨대 U 대신 2' 데옥시-T로 치환하여 더 높은 안정성을 갖거나, 2'OH를 2' 아미노 또는 2' 메틸 그룹, 2' 메톡시에틸 그룹, 또는 2'-0, 4'-C 메틸렌 브릿지로 치환하는 당 변형을 갖는 아날로그로 치환될 수 있다. 뉴클레오티드의 퓨린 또는 피리미딘 아날로그의 예로 잔틴, 하이포잔틴, 아자퓨린, 메틸티오아데닌, 7-데아자-아데노신 및 O- 및 N-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 뉴클레오티드의 인산염 그룹은 인산염 그룹의 하나 또는 그 이상의 산소가 질소 또는 황으로 치환됨에 의해 변형될 수 있다 (포스포로티오에이트, phosphorothioates). 변형은 기능성을 향상시키는데 유용하여, 예컨대 안정성 또는 투과성의 증진 또는 국소화 또는 표적화에 유용하다.

서열번호 1의 부분에 상보적이지 않은 안티센스 siRNA의 부위가 존재할 수 있다. 비-상보적 부위는 상보적 부위의 3', 5' 또는 양 말단에 있을 수 있다.

간섭 RNA는 예컨대, 합성, 시험관내 전사, siRNA 발현 벡터, 또는 PCR 발현 카세트의 방법으로 생성될 수 있다. 형질감염된 siRNA로 잘 기능하는 간섭 RNA는 또한 생체내에서 발현되는 siRNA로서도 잘 기능한다.

간섭 RNA는 보호되는 리보뉴클레오사이드 포스포라미디트(ribonucleoside phosphoramidites) 및 통상의 DNA/RNA 합성기를 사용하여 화학적으로 합성되며, 예컨대 Ambion Inc. (Austin, Texas), Invitrogen (Carlsbad, CA), 또는 Dharmacon (Lafayette, Colo., USA)과 같은 상업적 공급원으로부터 얻을 수 있다. 간섭 RNA는 용매 또는 수지를 이용한 추출, 침강, 전기이동(electrophoresis), 크로마토그래피, 또는 그를 조합한 방법에 의해 정제된다. 또는, 샘플 프로세싱으로 인한 손실을 피하기 위한 정제법이 만약 있다면 간섭 RNA가 소량 사용될 수 있다.

간섭 RNA가 이 기술분야에 알려진 구조적 또는 유도성 프로모터, 예컨대 U6 또는 Hl RNA pol III 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, SP6, T3, 또는 T7 프로모터를 사용하여 재조합 플라스미드로부터의 발현에 의해 대상에게 제공될 수 있다. 예를 들면, InvivoGen (San Diego, CA)으로부터의 psiRNA™로는 세포 내에서 RNA pol III 프로모터로부터 siRNA를 생산할 수 있다. 재조합 플라스미드로부터 발현된 간섭 RNA는 표준 기술을 사용하여 분리할 수 있다.

간섭 RNA의 발현을 위한 바이러스성 벡터는 예컨대, 플라스미드에 대한 상기 기재된 프로모터를 사용하여 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 박시니아 바이러스(vaccinia virus), 레트로바이러스(예컨대, 렌티바이러스, 랍도바이러스, 루케미아 바이러스), 헤르페스 바이러스 또는 기타 등으로부터 유래할 수 있다. 바이러스성 벡터의 선택, 벡터에 의한 간섭 RNA를 발현하기 위한 방법 및 바이러스성 벡터를 전달하는 방법은 이 기술분야에 공지된 범위내에 있다.

간섭 RNA의 발현은 PCR에 의한 인간 H1, 인간 U6, 또는 마우스 U6 프로모터를 갖는 발현 카세트(SECs)를 경유하여 SILENCER EXPRESS™ (Ambion, Austin, Texas)을 사용하여 또한 제공될 수 있다. 침묵발현 카세트(Silencer expression cassettes)는 헤어핀 siRNA 주형의 측면에 위치하는 프로모터 및 터미네이터 서열(promoter and terminator sequences flanking a hairpin siRNA template)을 포함하는 PCR 생성물이다. 세포에 형질감염시킬 때, 헤어핀 siRNA는 PCR 생성물로부터 발현되며, 특이적 침묵을 유도한다.

생리적 상태에서의 하이브리드화:

"하이브리드화"는 단일-가닥 핵산(DNA 또는 RNA)가 상호작용하여 상보적이거나 거의-상보적인 염기 서열을 갖는 핵산들에 의해 하이브리드라 불리는 수소-결합된 복합체를 형성하게 하는 기술을 말한다. 하이브리드화 반응은 민감하고 선택성이 있어 중요한 특정 서열이 샘플중에서 낮은 농도로 존재하는 경우라도 감별할 수 있다. 하이브리드화의 선택성(즉, 엄격한, stringency)은 시험관내에서, 예를 들면 전하이브리드화(prehybridization) 및 하이브리드 용액 중의 염 또는 포름아미드의 농도에 의해 조절되며, 하이브리드화 온도 및 이 기술분야에 공지된 방법에 의해 조절된다. 특히, 엄격한(stringency)는 염의 농도가 감소하고 포름아미드의 농도가 증가함에 따라 또는 하이브리드화 온도가 증가함에 따라 증가한다.

예를 들면, 매우 엄격한 조건 (stringency condition)은 약 50% 포름아미드, 37℃ 내지 42℃에서 나타날 수 있다. 감소된 엄격한 조건은 약 35% 내지 25%의 포름아미드, 30℃ 내지 35℃에서 나타날 수 있다. 하이브리드화를 위한 엄격한 조건의 예는 Sambrook, J., 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y 에 나와있다. 또 다른 엄격한 하이브리드화 조건의 예로 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 50℃ 또는 70℃, 12-16 시간동안, 그 후 세척, 또는 IXSSC중에서 70℃에서 하이브리드화, 또는 IXSSC 중에서 50℃에서 하이브리드화, 50% 포름아미드 후 0.3XSSC 중에서 70℃에서 세척, 또는 4XSSC 중에서 70℃에서 하이브리드화 또는 4XSSC 중에서 50℃에서 하이브리드화, 50% 포름아미드 후 1XSSC 중에서 67℃에서 세척을 포함한다. 하이브리드화시 온도는 하이브리드의 녹는점(Tm) 이하인 약 5-10℃이며, Tm은 다음 식을 사용하여 19 및 49 염기 쌍의 길이 범위 사이에 있는 하이브리드에 대한 값이 결정된다: Tm℃ = 81.5 + 16.6(log₁₀[Na+]) + 0.41 (% G+C) - (600/N), 여기에서 N은 하이브리드 중의 염기의 개수이고, [Na+]는 하이브리드화 완충액 중의 소디움 이온의 농도이다.

본 발명의 구체예에서, 매우 엄격한 조건에서 시험관내 SAA mRNA와 하이브리드화된 간섭 RNA의 안티센스 가닥은 생체내에서 생리적 조건하에서 특이적으로 결합할 것이다. 매우 엄격한 조건에서 핵산과 하이브리드되지 않은 관련 핵산의 감별 또는 분리는 감소된 엄격한 조건에서 수행된다.

단일 가닥 간섭 RNA:

상기와 같이, 간섭 RNA는 궁극적으로 단일 가닥으로서 기능한다. 비록 이중-가닥 RNA보다 덜 효율적이기는 하나 단일 가닥 siRNA는 mRNA 침묵에 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 그러므로, 본 발명의 구체예에는 단일 가닥 siRNA를 투여하기 위해 제공되며, 단일 가닥 siRNA는 생리적 조건에서 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 부분과 하이브리드화되고, 하이브리드화된 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 부분을 갖는 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 부위를 갖는다. 단일 가닥 siRNA는 상기 이중 가닥 siRNA에 대해서 19 내지 49개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 단일 가닥 siRNA는 5'인산염을 갖거나 인 시츄(in situ) 또는 생체내에서 5' 포지션이 인산화되어 있다. "5' 인산화된"이라는 기재는 예를 들면 5' 당 (예컨대, 5' 리보스 또는 데옥시리보스, 또는 같은 아날로그)의 C5 히드록실과 에스터 결합으로 부착된 인산염 그룹을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타내는 데 사용된다. 단일 가닥 siRNA는 모노-, 디-, 또는 트리인산염 그룹을 가질 수 있다.

단일 가닥 siRNA는 화학적으로 합성되거나 이중 가닥 siRNA에 대하여 벡터를 경유하여 합성된다. 5' 인산염 그룹은 키나제를 경유하여 첨가될 수 있거나, 5' 인산염은 RNA의 뉴클레아제 절단의 결과물일 수 있다. 전달은 이중 가닥 siRNA에 대해 일어난다. 한 구체예에서, 보호된 말단을 갖고 뉴클레아제 저항성 변형이 된 단일 가닥 siRNA는 침묵을 위해 적용된다. 단일 가닥 siRNA는 저장을 위해 건조되거나 액상 용액중에 용해될 수 있다. 용액은 어닐링(annealing)을 저해하기 위하여 또는 안정화를 위하여 완충액 또는 염을 포함할 수 있다.

헤어핀 간섭 RNA:

헤어핀 간섭 RNA는 단일-가닥이며, 센스 및 안티센스 서열을 한 가닥 내에 함유한다. DNA 벡터를 이용하여 발현하기 위해서, 센스 siRNA 서열에 상응하는 적어도 19-뉴클레오티드에 상응하는 DNA 올리고뉴클레오티드는 짧은 스페이서에 의해 그와 반대되는 상보성을 나타내는 안티센스 서열과 연결된다. 만약 선택된 발현 벡터를 위해 필요하다면, 3' 터미널 T'와 제한 사이트를 형성하는 뉴클레오티드가 첨가될 수 있다. 그 결과 생성된 RNA 전사는 그 자체 위에서 되접어 꺾어져(fold back) 스템-루프 구조를 형성한다.

투여 모드:

간섭 RNA는 시각 조직 주사, 예컨대 눈주위(periocular), 결막(conjunctival), 서브-테논(sub-Tenons), 앞방내(intracameral), 유리체강내(intravitreal), 망막하(sub-retinal), 눈뒤(retrobulbar) 또는 소관내(intracanalicular) 주사; 카테터 또는 다른 플레이스먼트 장치(placement device) 예컨대 망막 펠렛(retinal pellet), 안내 삽입(intraocular insert), 좌제 또는 다공성, 비다공성 또는 젤라틴성 물질을 포함하는 임플란트를 이용하여 안구에 직접 적용; 국소용 안구 드롭(topical ocular drops) 또는 연고; 쿨-데-삭(cul-de-sac)중의 또는 공막(sclera, (transsclerahl))에 인접하여 임플란트된 또는 안구내의 서방출형 장치를 통해 직접 안구로 전달할 수 있다. 앞방내(Intracameral) 주사는 각막을 통과하여 전방(anterior chamber)내로 주어 약제를 소주망에 다다르게 할 수 있다. 소관내(Intracanalicular) 주사는 정맥 콜렉터 채널 배농 쉴렘 캐널 (venous collector channels draining Schlemm's canal) 또는 쉴렘 캐널내로 줄 수 있다.

대상:

녹내장 또는 녹내장으로 발달할 위험이 있어 치료가 필요한 대상은 SAA의 활성 또는 발현, 즉, SAA-관련 녹내장과 관련된 상태를 나타낼 위험이 있거나 그러한 상태를 갖는 인간 또는 기타 포유류이다. 이러한 시각장애와 관련되어 있는 시각 구조에는 예를 들면, 망막, 맥락막(choroid), 수정체(lens), 각막(cornea), 소주망(trabecular meshwork), 홍채(iris), 시각신경유두(optic disc), 시신경유두(optic nerve head), 공막(sclea), 안구방상(aqueous chamber), 유리체방(vitreous chamber), 섬모체(ciliary body)를 포함할 수 있다.

제형(formulation) 및 제형(dosage):

약제학적 제형에는 생리학적으로 허용되는 눈의 담체 매질, 예컨대 물, 완충액, 생리식염수, 글리신, 히알유론산, 만니톨 기타 등과 혼합하여 중량의 99% 미만으로 본 발명의 간섭 RNA, 또는 그의 염이 포함된다.

본 발명의 간섭 RNA는 액제, 현탁제, 또는 유제로 투여된다. 다음은 본 발명에 따른 가능한 제형의 예이다.

보통, 본 발명의 구체예에서 유효량의 간섭 RNA의 세포 사이의 농도는 안구 부위에 20OpM 내지 100 nM 또는 1 nM 내지 50 nM, 5 nM 내지 약 25 nM이거나 이에 근접하는 농도를 포함한다. 국소용 조성물은 숙련된 임상의의 통상의 재량에 따라 하루에 1 내지 4회 안구의 표면으로 전달된다. 제형의 pH는 약 pH 4-9, 또는 pH 4.5 내지 pH 7.4이다.

정확한 투약계획은 임상의의 재량이지만, 간섭 RNA는 하루에 1 내지 4 회, 각 안구당 한 방울씩 적용함으로써, 또는 임상의에 의해 직접 투여될 수 있다. 유효량의 제형은 예컨대 대상의 나이, 인종, 및 성별, 또는 녹내장의 심각도와 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 한 구체예에서, 간섭 RNA는 국소적으로 안구에 전달되어 그 치료용량이 소주망, 망막 또는 안구의 신경 해드(optic nerve head)에 도달함으로써, SAA-관련 질병 과정을 개선시켜준다.

허용되는 담체:

눈에 허용되는 담체는 안구 자극성이 기껏해야 매우 적거나 없는 담체를 말하며, 만약 필요하다면 적절한 보존성(preservation)을 제공하고, 균일한 제형의 하나 이상의 본 발명의 간섭 RNA를 전달한다. 본 발명의 구체예에서 간섭 RNA의 투여를 위해 허용되는 담체는 미러스 트랜스IT®-TKO siRNA 가로절단 시약(Mirus TransIT®-TKO siRNA Transection Reagent, Mirus Corporation, Madison, Wisconsin), 리포펙틴®(LIPOFECTIN®), 리포펙타민(lipofectamine), 올리고펙타민^TM(OLIGOFECTAMINE™, Invitrogen, Carlsbad, CA), 셀펙틴®(CELLFECTIN®), 다르마펙트™(DHARMAFECT™, Dharmacon, Chicago, IL) 또는 폴리리신, 리포좀과 같은 다중양이온(polycations) 또는 콜레스테롤과 같은 지방-용해성 약제를 포함한다. 리포좀은 표준 전달체-형성 리피드 및 콜레스테롤과 같은 스테롤로부터 형성되며, 예컨대 내피세포 표면 항원에 결합 친화력을 갖는 모노클로날 항체와 같은 표적팅 분자를 포함할 수 있다. 또한, 리포좀은 폴리에틸렌글리콜화된 리포좀(PEGylated liposomes)일 수 있다.

안구 전달을 위하여, 간섭 RNA를 눈에 허용되는 방부제, 공동용매, 계면활성제, 점도 증강제, 투과 증강제(penetration enhancers), 완충액, 소디움 클로라이드, 또는 물과 혼합할 수 있으며, 액상, 멸균 점안 현탁액 또는 점안액을 만든다. 점안액 제형은 생리학적으로 허용되는 등장 액상 완충액중에 저해제를 용해시켜 제조될 수 있다. 또한, 점안액은 저해제 용해를 보조하기 위하여 눈에 허용되는 계면활성제를 포함할 수 있다. 예컨대 하이드록시메틸 셀룰로즈, 하이드록시에틸 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 기타 등의 점도 증강제(viscosity building agents)가 화합물의 체류를 증진시키기 위하여 본 발명의 조성물에 첨가될 수 있다.

멸균 안연고 제형을 제조하기 위하여 간섭 RNA를 예컨대 미네랄 오일, 액상 라놀린, 또는 백색 바셀린(white petrolatum)과 같은 적당한 전달체내에서 방부제와 혼합한다. 멸균 점안겔 제형은 친수성 염기중에서 간섭 RNA와 현탁되어 제조될 수 있으며, 친수성 염기는 다른 점안 제형에 대한 기술분야에 공지된 방법으로 예컨대 카보폴-940(CARBOPOL®-940, BF Goodrich, Charlotte, NC) 또는 기타 등과 혼합됨으로써 제조된다. 비스코트(VISCOAT®, Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, TX)는 예컨대 안내 주사로 이용될 수 있다. 본 발명의 다른 조성물은 간섭 RNA가 눈에 투과가 잘 안 될 경우, 예컨대 크레메포르(cremephor) 및 트윈 80(TWEEN® 80, polyoxyethylene sorbitan monolaureate, Sigma Aldrich, St. Louis, MO)과 같은 투과증진제(penetration enhancing agents)를 함유할 수 있다.

키트: 본 발명의 구체예에서 세포내에서 SAA mRNA의 발현을 약화시키기 위한 시약을 포함하는 키트가 제공된다. 키트는 두 개의 상이한 프로모터, 예컨대 T7 프로모터, T3 프로모터 또는 SP6 프로모터가 간섭 RNA에 상응하는 두 개의 상보적인 단일-가닥 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 주형을 함유한다. RNA는 DNA 주형으로부터 전사되며, 어닐링되어 표적 mRNA의 발현을 약화시키는 데에 유용한 이중-가닥 RNA를 형성한다. 키트는 RNA 합성을 위하여 DNA 주형 및 뉴클레오티드 삼인산(즉, ATP, GTP, CTP 및 UTP)으로부터 DNA 서열을 증폭시키기 위한 증폭 프라이머를 임의로 함유한다. 임의로, 키트는 각각이 DNA 주형상의 프로모터에 결합할 수 있고, 프로모터가 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열의 전사가 효과적일 수 있는 두 개의 RNA 폴리머라제, 예컨대 크기 배제 칼럼 (size exclusion column)과 같은 단일-가닥 RNA를 정제하기 위한 정제 칼럼, 단일-가닥 RNA를 어닐링하여 이중 가닥 RNA로 만드는 완충액과 같은 하나 이상의 완충액, 및 이중 가닥 RNA를 정제하기 위한 RNAse A 또는 RNAse T를 함유한다.

SAA 간섭 RNA의 예를 들면 인간 소주망(TM) 세포에서의 내생 SAA 발현 레벨을 녹다운시키는 능력은 하기와 같이 실행된다. GTM3 또는 HTM-3가 지정된 형질전환된 인간 TM 세포주의 트랜스펙션은 시험관내에서 여기에 언급된 SAA 가간LIㅅPO서섭 RNA (100 nM)의 농도 및 AMINE™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California)가 1:1 (w/v) 비율인 스탠다드를 사용하여 수행된다. 스크램블된 라민 A/C siRNA (Dharmacon)가 대조군으로 사용되었다.

QPCR TAQMAN® 정방향(forward) 및 역전사 프라이머 및 표적 부위가 함축된 프루브 세트가 mRNA 절단의 정도를 평가하는 데 사용되었다. 상기 프라이머/프루브 세트는 예컨대, ABI(Applied Biosystems, Foster City, CA)에 의해 합성될 수 있다.

비-특이성의 기회, 표적화를 벗어나는 효과(off-target effect), SAA mRNA 발현을 저해하기 위한 가장 낮은 가능성의 siRNA 농도를 감소시키기 위하여 siRNA에 대해 측정되었다. SAA mRNA 녹-다운은 적절한 프라이머/프루브 세트를 사용하여 QPCR 증폭에 의해 평가된다. GTM3 세포에 있어서 SAA siRNA의 용량 반응을 예컨대 siRNA를 0, 1, 3, 10, 30, 및 100 nM 의 용량범위로 처치한 후 24시간 뒤에 GTM3 세포에서 관찰하였다. 데이타는 그래프패드 프리즘 4 소프트웨어를 사용하여 가변 슬로프(variable slope), 시그모이덜 용량 반응 알고리즘(sigmoidal dose response algorithm) 및 100%의 톱 컨스트레인트(top constraint)로 피팅되었다(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). IC₅₀은 테스트된 특정한 siRNA에 대해 얻어졌다.

도1은 SMARTPOOL® siRNA 표적화 SAA mRNA로 트랜스펙션된 NTM 765 정상 ㅅ소주망 세포에서 내생 SAA mRNA에 대한 siRNA의 영향을 시험하기 위하여 A2 mRNA/18s rRNA 비율을 QPCR 분석한 것을 도시한 것이다. 소주망 세포는 24시간 동안 세 가지의 다른 농도의 Dharmafect #1 시약을 사용하여 100 nM의 siRNA로 트랜스펙션되었다: 대조군; 0.05 μl/lOOμl 웰은 처치 1; 0.2 μl/lOOμl 웰은 처치 2; 0.4 μl/100μl 웰은 처치 3.

도2는 SMARTPOOL® siRNA 표적화 SAA mRNA로 트랜스펙션된 GTM686 녹내장성 소주망 세포에서 siRNA의 내생 SAA mRNA에 대한 영향을 시험하기 위하여 SAA2 mRNA/18s rRNA 비율을 QPCR 분석한 것을 도시한 것이다. 소주망 세포는 24시간 동안 세 가지의 다른 농도의 Dharmafect #1 시약을 사용하여 100 nM의 siRNA로 트랜 스펙션되었다: 대조군; 0.05 μl/lOOμl 웰은 처치 1; 0.2 μl/lOOμl 웰은 처치 2; 0.4 μl/100μl 웰은 처치 3. * : p<0.05 vs. 대조군 및 처치 1은 원-웨이 아노바(one-way ANOVA) 이후 뉴만-쿨 멀티플 비교 테스트(Newman-Keuls Multiple Comparison Test)를 하였다.

도3은 정상 (NTM 765-04) 및 녹내장성 (GTM 686-03) 소주망 세포의 성장 및 형태에 SAA siRNA 처치가 미치는 영향을 실시간 전자 모니터링(real time electronic monitoring, RE-CES™)하여 도시한 것이다. 세포를 48시간동안 서로 다른 세 농도의 Dharmafect #1 시액을 사용하여 100 nM의 SMARTPOOL® siRNA 표적화 SAA mRNA로 트랜스펙션시켰다: T1: 0.05 μl/lOOμl 웰; T2: 0.2 μl/lOOμl 웰; T3: 0.4 μl/lOOμl 웰.

도4는 siRNA-처치한 NTM765 정상 소주망 세포 용해물(lysate)에 있어서의 내생 SAA 단백질의 레벨에 대한 ELISA 어세이 결과를 도시한 것이다. 세포를 48시간동안 세 가지 다른 농도의 Dharmafect #1 시액을 사용하여 100nM의 SAA SMARTPOOL® siRNA 표적화 SAA mRNA로 트랜스펙션시켰다: 처치1은 0.05 μl/lOOμl 웰; 처치 2는 0.2 μl/lOOμl 웰; 처치 3은 0.4 μl/lOOμl 웰.

도5는 siRNA-처치한 GTM686 녹내장성 소주망 세포 용해물(lysate)에 있어서의 내생 SAA 단백질의 레벨에 대한 ELISA 어세이 결과를 도시한 것이다. 세포를 48시간동안 세 가지 다른 농도의 Dharmafect #1 시액을 사용하여 100nM의 SAA SMARTPOOL® siRNA 표적화 SAA mRNA로 트랜스펙션시켰다: 처치 1은 0.05 μl/lOOμl 웰; 처치 2는 0.2 μl/lOOμl 웰; 처치 3은 0.4 μl/lOOμl 웰. * : p<0.05; **: p<0.01 vs. ANOVA에 의해 조절되고 본페로니의 멀티플 비교 테스트(Bonferroni's Multiple Comparison Test)를 수행.

실시예 1

소주망 세포에 있어서 침묵 SAA를 위한 간섭 RNA

본 연구는 정상 및 녹내장성 인간 소주망 세포내의 내생 SAA 발현 레벨을 녹-다운시키기 위한 SAA 간섭 RNA의 능력을 측정하는 것이다.

정상 (NTM765-04-OD, p5) 및 녹내장성 (GTM686-03-OS, p6) TM 세포주의 트랜스펙션이 SMARTPOOL® SAA-간섭 RNA 풀 (100 nM) 농도 및 DHARMAFECT® #1 트랜스펙션 시약(Dharmacon Research Inc., Chicago, IL)을 스탠다드로 사용하여 시험관내에서 수행되었다. SMARTPOOL® SAA-간섭 RNA는 서열 식별자(sequence identifiers) 서열번호 11, 서열번호 18, 서열번호 19, 및 서열번호 20을 갖는 SAA mRNA를 표적화하도록 설계된 네 가지 동족의, 이중-가닥 siRNA를 포함하며, 24시간 또는 48시간 동안, 3회, 세 가지 다른 농도로 사용되었다 (처치 1: 0.05μ l/100μl 웰; 처치 2: 0.2μl/100μl 웰; 처치 3: 0.4 μl/lOOμl 웰). 대조군은 아무 처리도 하지 않았다.

mRNA 레벨에의 영향:

SAA mRNA의 QPCR 분석을 위하여, 총 RNA를 RNAqueous-4™ PCR (Ambion, Austin, TX)을 사용하여 24시간 처리한 세포로부터 추출하고, cDNA를 TaqMan® 역전사 제제 (PE Biosystems, Foster City, CA)로 합성하였다. QPCR이 TaqMan® 유니버설 PCR 마스터 믹스 및 7700 SDS (PE Biosystems)를 사용하여 3회 수행되었다. 리보솜 RNA (18s rRNA, PE Biosystems)가 멀티플렉스 QPCR에서 정상화 대조군으로 사용되었다. QPCR 분석이 두 가지 세트의 TaqMan® 프루브/프라이머 (PE Biosystems)를 사용하여 수행되었다. 처음 세트 (P423)은 SAA cDAN 서열을 코딩하는 부위를 표적화하며, 두번째 세트 (P428)은 코딩하지 않는 부위(non-coding region)를 표적화한다.

도1에 도시한 바와 같이, P423 프라이머 세트를 사용하여 처치 3의 상태하에 siRNA 처리된 NTM765-04 정상 세포에서 18s rRNA에 대하여 SAA mRNA가 약 35% 저해되는 것으로 나타났다.

도2에 도시한 바와 같이, P423 프라이머 세트를 사용하여 처치 3의 상태하에 siRNA 처리된 GTM686-03 녹내장성 세포에서 18s rRNA에 대해 SAA mRNA가 약 41% 저 해되는 것으로 나타났다. 유사한 결과가 프라이머 세트 P428를 사용한 경우에도 얻어졌다.

SAA 단백질 레벨에 미치는 영향:

48시간 처리한 세포로부터 준비한 세포 용해물중에서 내생 SAA 단백질의 레벨을 측정하기 위하여 ELISA 어세이가 사용되었다.

처치1, 처치2, 및 처치3 siRNA 처리된 GTM 686 녹내장성 세포 모두에서 SAA 단백질이 약 66% 감소하는 것으로 나타났으나 (도5), NTM765 세포에서는 그렇지 않았다 (도4). 내생 SAA 단백질 레벨이 소주망 세포주, 특히 NTM765 정상 세포주 모두에서 매우 낮았다.

세포 성장 및 형태에 대한 영향:

TM 세포 형태에 미치는 SAA siRNA의 영향을 모니터하기 위하여 실시간 전자 센싱 시스템(real time electronic sensing system, RT-CES™, ACEA Biosciences, Inc., San Diego, CA)을 사용하였다. 도3에 도시한 바와 같이, siRNA 처리로 인한 TM 세포에 미치는 성장 또는 형태에의 독성은 관찰되지 않았다.

본원에 참조되고 있는 참조문헌은 예시적 과정 또는 다른 상세한 보조적 사항들을 제공하기 위한 정도로 본원에 참조로 인용되고 있는 것이다.

당업자라면, 본원에 개시된 것들을 이해하여 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 본원에 기재된 구체예의 자명한 정도의 변형은 할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 본원에 개시된 모든 구체예는 개시내용에 비추어 볼 때 실험을 거치지 않고 만들거나 수행될 수 있다. 본원의 전체 보호범위는 개시 내용 및 그 균등범위를 포함한다. 본 상세한 설명의 기재내용은 본 발명의 전체 보호범위를 좁히는 것으로 해석되지 않아야 한다.

달리 언급이 없는 한, 단수는 "하나의", "적어도 하나의" 또는 "하나 이상의"를 의미한다.

SEQUENCE LISTING <110> Alcon, Inc. <120> RNAi INHIBITION OF SERUM AMYLOID A FOR TREATMENT OF GLAUCOMA <130> 34576.44 <150> 60/638,706 <151> 2004-12-23 <160> 69 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 722 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aaggctcagt ataaatagca gccaccgctc cctggcaggc agggacccgc agctcagcta 60 cagcacagat caggtgagga gcacaccaag gagtgatttt taaaacttac tctgttttct 120 ctttcccaac aagattatca tttcctttaa aaaaaatagt tatcctgggg catacagcca 180 taccattctg aaggtgtctt atctcctctg atctagagag caccatgaag cttctcacgg 240 gcctggtttt ctgctccttg gtcctgggtg tcagcagccg aagcttcttt tcgttccttg 300 gcgaggcttt tgatggggct cgggacatgt ggagagccta ctctgacatg agagaagcca 360 attacatcgg ctcagacaaa tacttccatg ctcgggggaa ctatgatgct gccaaaaggg 420 gacctggggg tgcctgggct gcagaagtga tcagcgatgc cagagagaat atccagagat 480 tctttggcca tggtgcggag gactcgctgg ctgatcaggc tgccaatgaa tggggcagga 540 gtggcaaaga ccccaatcac ttccgacctg ctggcctgcc tgagaaatac tgagcttcct 600 cttcactctg ctctcaggag atctggctgt gaggccctca gggcagggat 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Claims

대상의 안구에서 혈청 아밀로이드 A mRNA의 발현을 약화시키는 방법으로서, 19 내지 49개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는 유효량의 간섭 RNA 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상의 안구에 투여하는 것을 포함하되, 여기에서 간섭 RNA는 센스 뉴클레오티드 서열, 안티센스 뉴클레오티드 서열, 및 센스 및 안티센스 서열 사이에 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 부위를 가지며;

안티센스 서열은 생리적 상태에서 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3에 상응하는 mRNA 부분과 하이브리드화되고, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3에 각각 상응하는 하이브리드화 mRNA 부분과 함께 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 부위를 갖는 방법.
제 1 항에 있어서, 대상이 녹내장인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 대상이 녹내장으로 발달될 위험에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 안티센스 서열이 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3에 상응하는 mRNA의 하이브리드화 부분과 함께 적어도 21 내지 23개 뉴클레오티드 의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 부위를 가지며 각 센스 및 안티센스 서열 3' 말단에 추가의 TT 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 센스 뉴클레오티드 서열 및 안티 뉴클레오티드 서열이 루프 뉴클레오티드 서열로 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 조성물이 국소적, 유리체내(intravitreal), 또는 경공막(transcleral) 경로를 통하여 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 안티센스 서열이 뉴클레오티드 230, 357, 362, 380, 447, 470, 527, 531, 548, 또는 557에서 시작하는 서열번호 1에 상응하는 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 표적화하여 설계되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 안티센스 서열이 뉴클레오티드 43, 170, 175, 193, 260, 283, 339, 또는 370에서 시작하는 서열번호 2에 상응하는 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 표적화하여 설계되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 안티센스 서열이 뉴클레오티드 252, 271, 276, 325, 또는 343에서 시작하는 서열번호 2에 상응하는 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 표적화하여 설계되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 안티센스 서열이 뉴클레오티드 153, 166, 222, 227, 251, 268, 297, 335, 356, 384, 390, 396, 406, 또는 423에서 시작하는 서열번호 3에 상응하는 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 표적화하여 설계되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 안티센스 서열이

를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 간섭 RNA가 염기 부분, 당 부분, 또는 인산염 부분상의 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 19 내지 49개 뉴클레오티드의 길이를 갖고, 센스 뉴클레오티드 서열, 안티센스 뉴클레오티드 서열 및 센스 및 안티센스 서열 사이에 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 상보성 부위를 갖는 제 2 간섭 RNA를 대상의 안구에 투여하는 것을 추가로 포함하되, 여기에서 제 2 간섭 RNA의 안티센스 서열은 생리학적 조건하에서 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 서열번호 3에 상응하는 mRNA의 제 2 부분과 하이브리드화되며, 안티센스 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 서열번호 3에 각각 상응하는 제 2 하이브리드화된 mRNA 부분과 함께 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 조성물은 유효량의 19 내지 49개 뉴클레오티드 길이를 갖는 적어도 네 가지 간섭 RNA의 혼합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하되, 각각의 간섭 RNA는 센스 뉴클레오티드 서열, 안티센스 뉴클레오티드 서열, 및 각각의 네 가지 간섭 RNA의 센스 및 안티센스 서열 사이에 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 연속 상보성 부위를 가지며, 여기에서 혼합물의 안티센스 서열 은 생리학적 조건에서 각각 뉴클레오티드 175, 252, 276, 및 325에서 시작하는 서열번호 2에 상응하는 mRNA 부분과 하이브리드화되며, 뉴클레오티드 175, 252, 276, 및 325에서 시작하는 서열번호 2에 상응하는 하이브리드화 mRNA 부분과 함께 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 부위를 갖는 방법.
대상의 안구에 19 내지 49개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 유효량의 간섭 RNA 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 투여하여 혈청 아밀로이드 A mRNA의 발현을 약화시키는 방법으로서, 간섭 RNA는 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 서열번호 3에 상응하는 mRNA의 하이브리드화 부분과 함께 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 부위를 갖는 것을 포함하며, 여기에서 혈청 아밀로이드 A mRNA의 발현이 이에 의해 약화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서, 조성물이 국소, 유리체내, 또는 경공막 경로를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서, 간섭 RNA는 뉴클레오티드 230, 357, 362, 380, 447, 470, 527, 531, 548, 또는 557에서 시작하는 서열번호 1에 상응하는 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 표적화하여 설계되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서, 간섭 RNA는 뉴클레오티드 43, 170, 175, 193, 260, 283, 339, 또는 370에서 시작하는 서열번호 2에 상응하는 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 표적화하여 설계되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서, 간섭 RNA는 뉴클레오티드 252, 271, 276, 325, 또는 343에서 시작하는 서열번호 2에 상응하는 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 표적화하여 설계되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서, 간섭 RNA는 뉴클레오티드 153, 166, 222, 227, 251, 268, 297, 335, 356, 384, 390, 396, 406, 또는 423에서 시작하는 서열번호 3에 상응하는 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 표적화하여 설계되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서, 19 내지 49개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 제 2 간섭 RNA를 대상의 안구에 투여하는 방법으로서, 여기에서 제 2 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 서열번호 3에 상응하는 제 2 하이브리드화 mRNA 부분과 함께 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 부위를 포함하는 방법.
제 15 항에 있어서, 조성물은 유효량의 19 내지 49개 뉴클레오티드 길이를 갖는 적어도 네 가지의 간섭 RNA의 혼합물을 포함하되, 각각의 간섭 RNA는 19 내지 49개 뉴클레오티드의 길이를 가지고, 혼합물은 각각 뉴클레오티드 175, 252, 276, 및 325에서 시작하는 서열번호 2에 상응하는 하이브리드화된 mRNA 부분과 함께 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 부위를 갖는 제 1, 제 2, 제 3, 및 제 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
19 내지 49개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는 유효량의 간섭 RNA 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상의 안구에 투여하는 것을 포함하여, 치료를 요하는 대상에서 혈청 아밀로이드 A-관련 녹내장을 치료하는 방법으로서, 여기에서 간섭 RNA는 센스 뉴클레오티드 서열, 안티센스 뉴클레오티드 서열, 및 센스 및 안티센스 서열 사이에 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 부위를 가지며;

안티센스 서열은 생리적 상태에서 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3에 상응하는 mRNA 부분과 하이브리드화되고, 서열번호 1서열번호 2 또는 서열번호 3에 상응하는 하이브리드된 mRNA 부분과 함께 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 부위를 갖는 것을 특징으로 하는 혈청 아밀로이드 A-관련 녹내장을 치료하는 방법.
제 23 항에 있어서, 조성물이 국소, 유리체내 또는 경공막 경로를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 23 항에 있어서, 간섭 RNA가 뉴클레오티드 230, 357, 362, 380, 447, 470, 527, 531, 548, 또는 557에서 시작하는 서열번호 1에 상응하는 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 표적화하여 설계되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 23 항에 있어서, 간섭 RNA가 뉴클레오티드 43, 170, 175, 193, 260, 283, 339, 또는 370에서 시작하는 서열번호 2에 상응하는 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 표적화하여 설계되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 23 항에 있어서, 간섭 RNA가 뉴클레오티드 252, 271, 276, 325, 또는 343에서 시작하는 서열번호 2에 상응하는 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 표적화하여 설계되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 23 항에 있어서, 간섭 RNA가 뉴클레오티드 153, 166, 222, 227, 251, 268, 297, 335, 356, 384, 390, 396, 406, 또는 423에서 시작하는 서열번호 3에 상응하는 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 표적화하여 설계되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 23 항에 있어서, 19 내지 49개 뉴클레오티드의 길이를 갖고, 센스 뉴클레오티드 서열, 안티센스 뉴클레오티드 서열 및 센스 및 안티센스 서열 사이에 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 상보성 부위를 갖는 제 2 간섭 RNA를 대상의 안구에 투여하는 것을 추가로 포함하되, 여기에서 제 2 간섭 RNA의 안티센스 서열은 생리학적 조건하에서 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 서열번호 3에 상응하는 mRNA의 제 2 부분과 하이브리드화되며, 안티센스 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 서열번호 3에 각각 상응하는 제 2 하이브리드화된 mRNA 부분과 함께 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 23 항에 있어서, 조성물은 유효량의 적어도 네 가지 간섭 RNA의 혼합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하되, 각각의 간섭 RNA는 적어도 19 내지 49개 뉴클레오티드의 길이를 가지며, 각각의 간섭 RNA는 센스 뉴클레오티드 서열, 안티센스 뉴클레오티드 서열, 및 각각의 네 가지 간섭 RNA의 센스 및 안티센스 서열 사이에 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 연속 상보성 부위를 가지고, 여기에서 혼합물의 안티센스 서열은 생리학적 조건에서 각각 뉴클레오티드 175, 252, 276, 및 325에서 시작하는 서열번호 2에 상응하는 mRNA 부분과 하이브리드화되며, 뉴클레오티드 175, 252, 276, 및 325에서 시작하는 서열번호 2에 상응하는 하이브리드화된 mRNA 부분과 함께 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 부위를 갖는 방법.
대상의 안구에 19 내지 49개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 유효량의 간섭 RNA 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 투여하여, 혈청 아밀로이드 A mRNA의 발현을 약화시키는 방법으로서, 간섭 RNA는 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 서열번호 3에 상응하는 mRNA의 하이브리드화된 부분과 함께 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 부위를 갖는 것을 포함하는 혈청 아밀로이드 A-관련 녹내장의 치료 방법.
제 31 항에 있어서, 조성물이 국소, 유리체내 또는 경공막 경로를 통하여 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 31 항에 있어서, 간섭 RNA가 뉴클레오티드 230, 357, 362, 380, 447, 470, 527, 531, 548, 또는 557에서 시작하는 서열번호 1에 상응하는 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 표적화하여 설계된 것을 특징으로 하는 방법.
제 31 항에 있어서, 간섭 RNA가 뉴클레오티드 43, 170, 175, 193, 260, 283, 339, 또는 370에서 시작하는 서열번호 2에 상응하는 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 표적화하여 설계된 것을 특징으로 하는 방법.
제 31 항에 있어서, 간섭 RNA가 뉴클레오티드 252, 271, 276, 325, 또는 343에서 시작하는 서열번호 2에 상응하는 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 표적화하여 설계된 것을 특징으로 하는 방법.
제 31 항에 있어서, 간섭 RNA가 뉴클레오티드 153, 166, 222, 227, 251, 268, 297, 335, 356, 384, 390, 396, 406, 또는 423에서 시작하는 서열번호 3에 상응하는 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 표적화하여 설계된 것을 특징으로 하는 방법.
제 31 항에 있어서, 19 내지 49개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 제 2 간섭 RNA를 대상의 안구에 투여하는 것을 추가로 포함하며, 제 2 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3에 상응하는 제 2 하이브리드화 mRNA 부분과 함께 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 부위를 갖는 방법.
제 31 항에 있어서, 조성물이 유효량의 적어도 네 가지 간섭 RNA의 혼합물을 포함하며, 각각의 간섭 RNA는 19 내지 49개 뉴클레오티드의 길이를 가지고, 상기 혼합물은 각각 뉴클레오티드 175, 252, 276, 및 325에서 시작하는 서열번호 2에 상응하는 하이브리드화 mRNA 부분과 함께 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 부위를 갖는 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
대상의 안구에서 혈청 아밀로이드 A mRNA의 발현을 약화시키기 위한 약제를 제조하는데 있어서, 19 내지 49개 뉴클레오티드 길이를 갖는 유효량의 간섭 RNA 및

약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물의 용도로서, 간섭 RNA는 센스 뉴 클레오티드 서열, 안티센스 뉴클레오티드 서열, 및 센스 및 안티센스 서열 사이에 적어도 19개 뉴클레오티드와 적어도 거의 완벽한 인접 상보성 부위를 포함하며; 여기에서, 안티센스 서열은 생리학적 조건에서 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 서열번호 3에 상응하는 mRNA의 부분과 하이브리드화되며, 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 서열번호 3에 상응하는 mRNA의 하이브리드화 부분과 함께 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의 완벽한 인접 상보성 부위를 갖는 것을 특징으로 하는 용도.
제 39 항에 있어서, 안티센스 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 서열번호 3에 상응하는 mRNA의 하이브리드화 부분과 함께 적어도 21 내지 23개 뉴클레오티드와 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 부위를 가지며, 각각의 센스 및 안티센스 서열의 3' 말단에 추가의 TT 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 39 항에 있어서, 센스 뉴클레오티드 서열 및 안티센스 뉴클레오티드 서열이 루프 뉴클레오티드 서열에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 39 항에 있어서, 조성물이 국소, 유리체내, 경공막 경로를 통해 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 39 항에 있어서, 안티센스 서열은 뉴클레오티드 230, 357, 362, 380, 447, 470, 527, 531, 548, 또는 557에서 시작하는 서열번호 1에 상응하는 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 표적화하여 설계되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 39 항에 있어서, 안티센스 서열은 뉴클레오티드 43, 170, 175, 193, 260, 283, 339, 또는 370에서 시작하는 서열번호 2에 상응하는 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 표적화하여 설계되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 39 항에 있어서, 안티센스 서열은 뉴클레오티드 252, 271, 276, 325, 또는 343에서 시작하는 서열번호 2에 상응하는 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 표적화하여 설계되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 39 항에 있어서, 안티센스 서열은 뉴클레오티드153, 166, 222, 227, 251, 268, 297, 335, 356, 384, 390, 396, 406, 또는 423에서 시작하는 서열번호 3에 상응하는 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 표적화하여 설계되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 39 항에 있어서, 안티센스 서열이

를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 39 항에 있어서, 간섭 RNA가 염기 부분, 당 부분, 또는 인산염 부분상의 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 39 항에 있어서, 조성물이 19 내지 49개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 제 2 간섭 RNA를 추가로 포함하되,

센스 뉴클레오티드 서열, 안티센스 뉴클레오티드 서열 및 센스 및 안티센스 서열 사이에 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 상보성 부위를 포함하며,

여기에서 제 2 간섭 RNA의 안티센스 서열은 생리학적 조건하에서 서열번호 1 , 서열번호 2, 또는 서열번호 3에 상응하는 mRNA의 제 2 부분과 하이브리드화되고, 안티센스 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 서열번호 3에 각각 상응하는 제 2 하이브리드화 mRNA 부분과 함께 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 39 항에 있어서, 조성물이 유효량의 적어도 네 개의 간섭 RNA의 혼합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하되, 각각의 간섭 RNA는 19 내지 49개 뉴클레오티드의 길이를 가지며, 각각의 간섭 RNA는:

센스 뉴클레오티드 서열, 안티센스 뉴클레오티드 서열 및 각각의 네 개의 간 섭 RNA의 센스 및 안티센스 서열 사이에 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 부위를 포함하며;

여기에서 혼합물의 안티센스 뉴클레오티드 서열은 각각 뉴클레오티드 175, 252, 276, 및 325에서 시작하는 서열번호 2에 상응하는 mRNA의 부분과 생리학적 조건에서 하이브리드화되고, 각각 뉴클레오티드 175, 252, 276, 및 325에서 시작하는 서열번호 2에 상응하는 하이브리드화 mRNA의 부분과 함께 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 부위를 갖는 것을 특징으로 하는 용도.
대상의 안구에서 혈청 아밀로이드 A mRNA의 발현을 약화시키기 위한 약제의 제조에 있어서, 19 내지 49개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 유효량의 간섭 RNA 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물의 용도로서, 간섭 RNA는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3에 상응하는 하이브리드화 mRNA 부분과 함께 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 상보성 부위를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 51 항에 있어서, 조성물이 국소, 유리체내 또는 경공막 경로를 통해 투여용으로 제조되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 51 항에 있어서, 간섭 RNA가 뉴클레오티드 230, 357, 362, 380, 447, 470, 527, 531, 548, 또는 557에서 시작하는 서열번호 1에 상응하는 mRNA의 뉴클레 오티드 서열을 표적화하여 설계되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 51 항에 있어서, 간섭 RNA가 뉴클레오티드 43, 170, 175, 193, 260, 283, 339, 또는 370에서 시작하는 서열번호 2에 상응하는 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 표적화하여 설계되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 51 항에 있어서, 간섭 RNA가 뉴클레오티드 252, 271, 276, 325, 또는 343에서 시작하는 서열번호 2에 상응하는 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 표적화하여 설계되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 51 항에 있어서, 간섭 RNA가 뉴클레오티드 153, 166, 222, 227, 251, 268, 297, 335, 356, 384, 390, 396, 406, 또는 423에서 시작하는 서열번호 3에 상응하는 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 표적화하여 설계되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 51 항에 있어서, 조성물이 19 내지 49개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 제 2 간섭 RNA를 추가로 포함하되, 제 2 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3에 상응하는 제 2 하이브리드화 mRNA 부분과 함께 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 상보성 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 51 항에 있어서, 조성물이 각각 19 내지 49개 뉴클레오티드를 갖는 유효량의 적어도 네 개의 간섭 RNA의 혼합물을 포함하되, 혼합물은 각각 뉴클레오티드 175, 252, 276, 및 325에서 시작하는 서열번호 2에 상응하는 하이브리드화 mRNA 부분과 함께 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 상보성 부위를 갖는 제 1, 제 2, 제 3 및 제 4 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 39 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 혈청 아밀로이드 A-관련 녹내장을 갖는 것을 특징으로 하는 용도.